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Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências Pós Graduação em Psicobiologia Caracterização de Subpopulações de Interneurônios Imunorreativos Para Proteínas Ligantes de Cálcio no Córtex Pré-Frontal do Sagui (Callithrix jacchus): Distribuição e Morfologia. Joanilson Guimarães Silva Natal, Rio Grande do Norte 2011

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Page 1: Caracterização de Subpopulações de Interneurônios ... · 1.1 Neurônios excitatórios 1 1.2 Neurônios inibitórios 3 1.3 Proteínas ligantes de cálcio e sua função sistema

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências

Pós Graduação em Psicobiologia

Caracterização de Subpopulações de Interneurônios

Imunorreativos Para Proteínas Ligantes de Cálcio no Córtex

Pré-Frontal do Sagui (Callithrix jacchus): Distribuição e

Morfologia.

Joanilson Guimarães Silva

Natal, Rio Grande do Norte

2011

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Joanilson Guimarães Silva

Caracterização de Subpopulações de Interneurônios Imunorreativos Para

Proteínas Ligantes de Cálcio no Córtex Pré-Frontal do Sagui (Callithrix

jacchus): Distribuição e Morfologia.

Tese apresentada ao programa Pós-Graduação em

Psicobiologia do centro de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito

para o Titulo de doutor em Psicobiologia.

Área de concentração: Psicobiologia Fisiológica.

Orientador: Prof. Dr. Sidarta Tollendal Gomes Ribeiro.

Co-orientador: Dr. Marco Aurélio de Moura Freire

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Silva, Joanilson Guimarães. Caracterização de subpopulações de interneurônios imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no córtex pré-frontal do Sagui (Callithrix jacchus): distribuição e morfologia / Joanilson Guimarães Silva. – Natal, RN, 2011. 100 f. : Il.

Orientador: Prof. Dr. Sidarta Tollendal Gomes Ribeiro. Coorientador: Prof. Dr. Marco Aurélio de Moura Freire. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.

1. Callithrix jacchus – Tese 2. Córtex pré-frontal Sagui – Tese. 3. Interneurônios – Tese. I. Ribeiro, Sidarta Tollendal Gomes. II. Freire, Marco Aurélio de Moura. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 599.821

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“Toda decisão acertada é proveniente de experiência. E toda experiência é proveniente

de uma decisão não acertada.”

Albert Einstein

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Agradecimentos

Dedico esse trabalho a todos que diretamente ou indiretamente ajudaram na realização

do mesmo, em particular ao professor Sidarta Ribeiro, pela oportunidade de fazer parte

de sua equipe e pelo conhecimento repassado ao longo desses anos.

Agradeço aos meus pais Maria Selma e Manoel Norman, pelo carinho e apoio durante

todos esses longos anos.

Agradeço aos meus irmãos Roberto, Lely e Joci pela amizade e companheirismo.

Agradeço ao meu grande amigo Marco Aurélio pela amizade e confiança durante todos

esses anos de convivência.

Agradeço a todos os amigos e companheiros do IINN-ELS, pela amizade e pela

construção de um sonho para o nosso progresso cientifico.

Agradeço ao CNPq , FINEP e AASDAP, pelo apoio financeiro e científico.

Por ultimo agradeço a minha grande amiga, companheira, cúmplice e amante Lanna

Patrícia por toda a paciência, o amor e dedicação.

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i

Sumário

Sumario

Lista de Figuras

i

iv

Lista de Tabelas v

Lista de Histogramas vi

Lista de Abreviaturas vii

Resumo viii

Abstract ix

1 Introdução 1

1.1 Neurônios excitatórios 1

1.2 Neurônios inibitórios 3

1.3 Proteínas ligantes de cálcio e sua função sistema nervoso central 4

1.4 Córtex pré-frontal 7

1.5 Razões para a escolha do sagui como animaleExperimental 10

2 Objetivos 13

2.1 Objetivo Geral 13

2.2 Objetivos Específicos 13

3 Material e Métodos 14

3.1 Espécime 14

3.2 Perfusão, craniotomia e microtomia 14

3.3 Coloração de Nissl 16

3.4 Imunohistoquímica para as proteínas ligantes de cálcio 16

3.5 Montagem das lâminas com os cortes histológicos 18

3.6 Sistema de microscopia automática e programas para análise morfométrica e estereológica

18

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ii

3.7 Análise Qualitativa 19

3.8 Análise Quantitativa 19

3.8.1 Quantificação estereológica para a distribuição dos grupos de interneurônios 19

3.8.2 Ferramenta estereológica: O Fracionador Óptico 20

3.8.3 Análise estatística para estimativa do número de células através do Fracionador Óptico

23

3.9 Análise morfométrica dos interneurônios imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio

25

4 Resultados 26

4.1 Caracterização laminar das regiões do córtex pré-frontal do sagui 26

4.2 Distribuição laminar dos grupos imunorreativos para as Proteínas ligantes de cálcio

26

4.3 Distribuição laminar e características morfológicas dos neurônios imunorreativos para calbindina.

30

4.4 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos para calretinina.

34

4.5 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos para parvalbumina.

38

4.6 Perfis morfométricos dos grupos celulares imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio.

42

4.7 Análise quantitativa da estimativa celular entre os grupos CB, CR e PV no córtex pré-frontal do sagui.

45

4.8 Análise de variância (ANOVA) entre áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal em relação ao número estimados de células imunorreativas para CB, CR e PV.

55

5 Discussão 58

5.1 Considerações sobre a utilização de marcadores neuroquímicos no estudo da heterogeneidade das populações de interneurônios no córtex cerebral.

58

5.2 Imunorreatividade para as proteínas ligantes de cálcio entre os diferentes tipos morfológicos de interneurônios no córtex pré-frontal do sagui.

60

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iii

5.3 Implicações funcionais das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio no processamento cortical

64

5.4 Contextualizando os diferentes padrões da arborização dendrítica. 67

5.5 Considerações sobre o emprego de ferramentas estereológicas na estimativa numérica dos grupos neuronais imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no córtex pré-frontal do Sagui.

70

5.6 Homogeneidade versus heterogeneidade da arquitetura inibitória cortical. 73

6 Conclusão 79

7 Referências Bibliográficas 80

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iv

Lista de Figuras

Figura 1 - Sagui comum (Callithrix jacchus), espécie objeto de estudo do presente trabalho.

Figura 2 - Representação do método de contagem utilizado pelo fracionador óptico,

mostrando a distribuição de caixas de contagem através de grades com distâncias uniformes

que cobrem homogeneamente a área de interesse.

Figura 3 - Divisão citoarquitetônica e distribuição laminar das proteínas ligantes de cálcio

nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal.

Figura 4 - Células imunorreativas para CB no córtex pré-frontal do sagui.

Figura 5 - Reconstrução de células imunorreativas para CB.

Figura 6 - Células imunorreativas para CB com dendritos e axônios reconstruídos.

Figura 7 - Células imunorreativas para CR no córtex pré-frontal do sagui.

Figura 8 - Reconstruções a partir de células imunorreativas para CR.

Figura 9 - Reconstrução de células imunorreativas para CR.

Figura 10 - Células imunorreativas para PV.

Figura 11 - Células multipolares imunorreativas para PV, com árvores dendríticas

completamente reconstruídas localizadas na camada V.

Figura 12 - Terminais imunorreativos para PV.

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v

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Distribuição laminar das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio

nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal.

Tabela 2 -Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos

para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal.

Tabela 3 –Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos

para proteínas ligantes de cálcio descrito no córtex pré-frontal.

Tabela 4 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV

(ΣQ), na região medial do córtex pré-frontal.

Tabela 5 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB, CR e PV (N) com

coeficiente de erro para a região medial do córtex pré-frontal.

Tabela 6 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB (ΣQ),

na região dorsolateral do córtex pré-frontal.

Tabela 7 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente

de erro para região dorsolateral do córtex pré-frontal.

Tabela 8 - Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV

(ΣQ), na região orbital do córtex pré-frontal.

Tabela 9 - Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente de

erro para região orbital do córtex pré-frontal.

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vi

Lista de Histogramas

Histograma 1 - Distribuição laminar das proteínas ligantes de cálcio (CaBPs) nas regiões

dorsal, medial e orbital do córtex pré-frontal.

Histograma 2 - com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para

CB, CR PV na região medial do córtex pré-frontal.

Histograma 3 - Com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para

CB, CR PV na região dorsolateral do córtex pré-frontal.

Histograma 4 - com média e desvio padrão entre os grupos celulares imunorreativos para

CB, CR PV na região orbital do córtex pré-frontal.

Histograma 5 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas

para PV entre os as regiões do córtex pré-frontal.

Histograma 6 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas

para CB entre os as regiões do córtex pré-frontal.

Histograma 7 - Com média e desvio padrão do número estimado de células imunorreativas

para CR entre os as regiões do córtex pré-frontal

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vii

Lista de Abreviaturas

Asf – (do inglês) area sampling fraction

CaBPS – proteínas ligantes de cálcio

CB - calbindina

CR – calretinina

CE - coeficiente de Scheaffer

CV- coeficiente de variação

CVB – coeficiente de variação biológica

DAB – diaminobenzidina

DP – desvio padrão

GABA - ácido -aminobutírico

PV- parvalbumina

SNC- sistema nervoso central

Ssf – (do inglês) section sampling fraction

TFS – tampão fosfato salina

Tsf – (do inglês) tissue sampling fraction

V2 – córtex visual secundário

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viii

Resumo

Os interneurônios do córtex cerebral são caracterizados por suas diferentes propriedades

morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, atuando como moduladores da atividade

excitatória cortical dos neurônios piramidais, por exemplo. Vários estudos revelaram

diferenças na distribuição e densidade deste grupo celular ao longo de diferentes áreas

corticais em diversas espécies. Uma classe particular de interneurônios intimamente

relacionada à modulação cortical é revelada pela imunohistoquímica para as proteínas

ligantes de cálcio calbindina (CB), calretinina (CR) e parvalbumina (PV). Em que pese a

quantidade crescente de estudos focando nas proteínas ligantes de cálcio, o córtex pré-

frontal de primatas ainda permanece relativamente pouco explorado, especialmente no que

se refere a um melhor entendimento da organização do circuito inibitório ao longo de suas

subdivisões. No presente estudo caracterizamos a morfologia e a distribuição desse grupo

neuronal nas regiões medial, orbital e dorso-lateral do córtex pré-frontal do sagui

(Callithrix jacchus). Utilizando parâmetros morfométricos e técnicas estereológicas,

evidenciamos que os neurônios reativos a CR (especialmente células em duplo-buquê e

bipolares) possuem arborização dendrítica mais complexa quando comparados aos

neurônios reativos a CB (neurônios de tufos duplos e células em cesto) e PV (células em

candelabro). A densidade dos neurônios reativos a CB e CR é mais elevada nas camadas

supragranulares (II/III), enquanto os neurônios reativos a PV se concentram

predominantemente nas camadas infragranulares (V/VI). Os neurônios reativos a CR foram

o grupo predominante nas três regiões avaliadas, sendo mais prevalente na região

dorsolateral. Nossos achados apontam para diferenças cruciais no circuito inibitório ao

longo das diferentes áreas do córtex pré-frontal do sagui.

Palavras chave: Calbindina, calretinina, parvalbumina, córtex pré-frontal, interneurônios,

morfometria, estereologia.

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Abstract

Cortical interneurons are characterized by their distinct morphological, physiological and

biochemical properties, acting as modulators of the excitatory activity by pyramidal

neurons, for example. Various studies have revealed differences in both distribution and

density of this cell group throughout distinct cortical areas in several species. A particular

class of interneuron closely related to cortical modulation is revealed by the

immunohistochemistry for calcium binding proteins calbindin (CB), calretinina (CR) and

parvalbumin (PV). Despite the growing amount of studies focusing on calcium binding

proteins, the prefrontal cortex of primates remains relatively little explored, particularly in

what concerns a better understanding of the organization of the inhibitory circuitry across

its subdivisions. In the present study we characterized the morphology and distribution of

neurons rich in calcium-binding proteins in the medial, orbital and dorsolateral areas of the

prefrontal cortex of the marmoset (Callithrix jacchus). Using both morphometric and

stereological techniques, we found that CR-reactive neurons (mainly double bouquet and

bipolar cells) have a more complex dendritic arborization than CB-reactive (bitufted and

basket cells) and PV-reactive neurons (chandelier cells). The neuronal densities of CR- and

CB-reactive cells are higher in the supragranular layers (II/III) whilst PV-reactive neurons,

conversely, are more concentrated in the infragranular layers (V/VI). CR-reactive neurons

were the predominant group in the three regions evaluated, being most prevalent in

dorsomedial region. Our findings point out to fundamental differences in the inhibitory

circuitry of the different areas of the prefrontal cortex in marmoset.

Keywords: Calbindin, calretinin, parvalbumin, prefrontal cortex, interneurons,

morphometry, stereology.

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1 - INTRODUÇÃO

Desde os estudos pioneiros do neuroanatomista espanhol Santiago Ramón y Cajal

no século XIX, sabe-se que existem dois tipos principais de neurônios no córtex cerebral

dos mamíferos são classificados de acordo com seu aspecto morfológico em piramidais e

não piramidais (DeFelipe & Jones, 1988). Os neurônios não piramidais, por sua vez, são

subdivididos em dois outros grupos: células espinhosas estelares e células lisas ou

parcialmente espinhosas – também denominadas de interneurônios. De acordo com suas

propriedades fisiológicas, os neurônios piramidais assim como os estelares são

classificados como ‘excitatórios’ ou de projeção, tendo o glutamato como seu

neurotransmissor principal, perfazendo cerca de 80% da totalidade dos neurônios

corticais. Já os interneurônios englobam os 20% restantes e são denominados de

neurônios ‘inibitórios’, por utilizarem o ácido γ-aminobutírico (GABA) como

neurotransmissor (DeFelipe, 2002a). Os neurônios inibitórios são conhecidos como

‘neurônios de circuito local’, uma vez que normalmente atuam como

inibidores/moduladores da atividade cerebral (veja Somogyi et al., 1998 para revisão).

Não obstante, cerca de 1% dos neurônios de projeção também são imunorreativos para

GABA (Gonchar et al., 1995).

1.1. Neurônios excitatórios

Dentre as células excitatórias, os neurônios piramidais constituem cerca de 80%

do total, formando a maioria das conexões corticais entre diferentes áreas (DeFelipe &

Fariñas, 1992). Constituem um grupo celular bastante particular, com corpo celular

grande e em formato triangular (piramidal), com arborização dendrítica que em geral se

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estende perpendicularmente à base do corpo, alcançando distâncias variáveis. Possuem

também um dendrito apical proeminente que, na maioria dos casos, alcança a camada I

do córtex, onde se ramifica em diversos colaterais divergentes (Valverde, 2002). Uma

característica bastante interessante dos neurônios piramidais é a presença de pequenos

apêndices ao longo de seus prolongamentos denominadas espinhas dendríticas, as quais

aumentam consideravelmente a superfície receptora desses prolongamentos, sendo

formadas em sua maioria por um pequeno espessamento em formato esférico de 1 a 3 µm

de diâmetro unido por uma haste fina ao prolongamento celular (Valverde, 2002). A

‘cabeça’ da espinha dendrítica é a região que recebe a grande maioria das terminações

axonais, formando as sinapses (Valverde, 2002).

Tais estruturas foram inicialmente descritas e batizadas por Santiago Ramón y

Cajal em 1888, quando este trabalhava em Barcelona, ao avaliar o tecido nervoso

impregnado pela prata (coloração de Golgi) (DeFelipe, 2002b). Suas observações e as de

seus contemporâneos, Retzius (1891) e Schaffer (1892), levaram-no a propor que tais

estruturas desempenhariam um papel preponderante na fisiologia deste grupo celular. As

conclusões de Cajal foram amplamente aceitas e o estudo das espinhas dendríticas se

tornou um campo proeminente de pesquisa (Nimchinsky et al., 2002; Sabatin & Svoboda,

2000; Yasuda et al., 2003) uma vez que estas são estruturas altamente plásticas e também

o principal sítio de sinapses excitatórias no córtex cerebral (Valverde, 2002; veja também

DeFelipe, 2002b).

Recentemente vem sendo demonstrado que existem diferenças interessantes na

morfologia dos neurônios piramidais entre as distintas áreas corticais tanto dentro da

mesma espécie quanto entre espécies distintas (Jacobs et al., 2001; Elston & Rockland,

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3

2002; Benavides-Piccione et al., 2002; Ballesteros-Yanez et al., 2006; veja Elston &

DeFelipe, 2002 para detalhes).

Em conjunto, as evidências sugerem a existência de relevantes especificidades

celulares nos circuitos corticais cerebrais. O estudo das diferenças celulares nos

diferentes córtices e entre áreas homólogas entre espécies distintas poderá contribuir

significativamente para um melhor entendimento dos processos que regem as diferentes

fisiologias. Por exemplo, em animais que utilizam mais uma modalidade sensorial que

outra, existem diferenças significativas na morfologia dendrítica que expliquem tais

diferenças? Esta é uma questão importante que pode e deve ser investigada em detalhes.

1.2. Neurônios inibitórios

Dentre os neurônios não piramidais, um grupo chama a atenção por possuir um

número bastante reduzido de espinhas dendríticas, chegando mesmo à completa ausência

dessas estruturas. Estas células são denominadas neurônios não piramidais lisos ou

parcialmente espinhosos, ou simplesmente ‘interneurônios’. Em geral os interneurônios

possuem axônios curtos distribuídos ao longo da camada celular ou em camadas acima

ou abaixo da localização de seu corpo celular (Lund & Lewis, 1993).

Para Santiago Ramón y Cajal, a ‘célula de axônio curto’ (interneurônio) seria um

“condensador ou acumulador de energia nervosa” (veja DeFelipe, 2002a para detalhes).

Ramón y Cajal intuiu que este grupo celular participaria ativamente na regulação do

fluxo de informação entre as diferentes regiões do sistema nervoso central (SNC). Ramón

y Cajal descreveu neurônios corticais camada a camada em diversas regiões do SNC,

especialmente no humano, gato e rato (DeFelipe & Jones, 1988), encontrando uma

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4

grande variedade de tipos morfológicos distintos de interneurônios, especialmente no que

se refere ao padrão das arborizações axonais e dendríticas. Suas observações, juntamente

com suas acuradas ilustrações, representam a base dos estudos atuais de organização

cortical (DeFelipe & Jones, 1988; veja DeFelipe, 2002b e Freire, 2006 para revisão).

Um problema persistente no estudo de microcircuitos corticais é a dificuldade

para classificar interneurônios, em que pese os avanços recentes neste campo. Isto se

deve em grande parte à enorme gama de aspectos morfológicos, fisiológicos e

bioquímicos distintos encontrados. Além disso, grupos celulares com morfologias

distintas podem possuir o mesmo padrão de conectividade (Kisvárday, 1992) ou mesmo

padrões bioquímicos similares (DeFelipe, 1993; 1997). Mesmo com tais dificuldades,

certos interneurônios são facilmente caracterizados por suas características morfológicas

únicas, ou podem ser agrupados em grupos mais gerais com bom grau de acurácia tendo

como base seus padrões de arborização axonal ou características bioquímicas (DeFelipe,

1997).

Com o advento de técnicas imunohistoquímicas e histoquímicas, o método de

classificação químico tornou-se um dos mais utilizados, uma vez que se pode definir um

grupo celular pelo seu conteúdo de neurotransmissores ou enzimático, contribuindo para

um melhor entendimento dos circuitos corticais. Um dos avanços importantes na

caracterização química dos interneurônios é a demonstração da marcação

imunohistoquímica destes pelas chamadas ‘proteínas ligantes de cálcio’ (DeFelipe, 1993;

1997; Kubota et al., 1994; Meskenaite, 1997).

1.3 Proteínas ligantes de cálcio e seu papel funcional no sistema nervoso central

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5

As proteínas ligantes de cálcio são aceptores do cálcio intracelular pertencente a

duas famílias distintas: as proteínas EF hand e as proteínas anexinas. As anexinas formam

uma família de proteínas do tipo não-EF hand que se ligam à membrana fosfolipídica na

presença de cálcio, enquanto que a família EF hand é formada por proteínas

caracterizadas por apresentar o domínio EF hand com uma alta afinidade a este íon

(Andressen et al., 1993).

Os sítios das proteínas EF hand se caracterizam por uma região continua de 29

aminoácidos (Kawasaki & Kretsinger, 1994), que contém duas α-hélices dispostas

perpendicularmente uma em relação à outra, flanqueando uma alça curta, em cujo interior

se localizam os resíduos dos aminoácidos aspartato e glutamato, ambos negativamente

carregados, responsáveis pela ligação dos íons cálcio carregados positivamente (Marsden

et al., 1990). As duas α-hélices têm a função de ancorar a alça de maneira correta e

comunicar as demais porções da molécula às mudanças de conformação geradas pela

ligação dos íons.

A organização espacial das α-hélices e da alça no sítio assemelha-se à disposição

de uma mão direita com o indicador estendido apontando para o alto, correspondendo à

primeira hélice (formada por 9 aminoácidos), o dedo médio dobrado, correspondendo à

alça (formada por 12 aminoácidos), e o polegar estendido, correspondendo à hélice de

saída (formada por 8 aminoácidos). Esta representação foi sugerida a partir da

caracterização da estrutura da parvalbumina, de onde se originou o termo ‘EF hand’

(Kretsinger & Nockolds, 1973).

A família EF hand apresenta em torno de 40 proteínas associadas à regulação dos

níveis de cálcio intracelular, muitas das quais são encontradas em terminações axonais e

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estruturas pré e pós-sinápticas, sugerindo um papel chave dessas proteínas na transmissão

sináptica. A ação das proteínas EF hand pode estar associada como um fator chave

iniciando a cascata de reações dependentes de cálcio ou funcionando como tampões,

diminuindo a concentração citoplasmática desse íon (Hof et al., 1999). Um exemplo do

protótipo da proteína “disparadora” é a calmodulina, responsável por ativar mais de vinte

enzimas diferentes (Bainmbridge & Rogers, 1992). As proteínas “tampão”, como a

calbindina (CB), calretinina (CR) e a parvalbumina (PV), representam um sistema

passivo responsável pelo decréscimo da amplitude na sinalização do cálcio (Hof et al.,

1999).

A PV foi originalmente purificada de extratos de músculo de peixes e está

presente em altos níveis no SNC, onde pode ser encontrada em uma grande população de

neurônios (Celio, 1999). A CB foi extraída do duodeno de aves, onde facilita o transporte

do cálcio através da mucosa, sendo em seguida encontrada e mapeada no SNC (Hof et al.,

1999). A CR é a proteína ligante de cálcio descrita mais recentemente, sendo encontrada

exclusivamente no SNC e apresentando algumas sequências de aminoácidos homólogas a

CB (Jacobwitz & Winsky, 1991).

A revelação dessas proteínas ligantes de cálcio através de técnicas

imunohistoquímicas se tornou uma excelente ferramenta nos estudos evolutivos das

distintas vias funcionais que formam o SNC (DeFelipe et al., 1999; Hof et al., 1999;

Letinic & Kostovic, 1998). No córtex cerebral essas proteínas representam poderosos

marcadores para o estudo da grande heterogeneidade dos sistemas GABAérgicos, onde

cada um dos três ligantes é geralmente co-localizado com o GABA em subpopulações

distintas de interneurônios (Clemo et al., 2003; DeFelipe et al., 1999; DeFelipe, 2002;

Gonchar & Bukhalter, 1997; Zaitsev et al., 2005; Zaitsev et al., 2008).

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Estudos têm revelado diferentes padrões morfológicos e de distribuição regional

nos neurônios corticais que expressam CB, CR e PV intra-espécies, mas em alguns casos

também a nível interespécies (DeFelipe, 1997; Hof et al., 1996). Essas diferenças

morfológicas e no padrão da distribuição podem representar traços consistentes que

podem ser interpretados através de um contexto filogenético (Hof et al., 1996).

Uma das características mais interessantes dos neurônios GABAérgicos que

expressam as proteínas ligantes de cálcio é o alto grau de co-expressão com outros

neuromoduladores tais como a somatostatina, o neuropeptídeo Y e o óxido nítrico

(Markram et al., 2004; Gonchar et al., 2008; Gonzalez-Albo et al., 2001). Alguns estudos

têm demonstrado que esses marcadores neuroquímicos exibem padrões na distribuição

laminar provavelmente relacionados às suas funções nos circuitos corticais (Clemo et al.,

2003; Gonchar et al., 2008).

As proteínas ligantes de cálcio CB, CR e PV apresentam um grande interesse do

ponto de vista neuroanatômico, pois elas podem ser observadas em subpopulações bem

definidas de neurônios ao longo de diferentes sistemas sensoriais em um grande número

de espécies, tais como roedores (Park et al., 2002; Cellerino et al., 1992; Lüth et al.,

1993; Lee et al., 2004), lagomorfos (Park et al., 2000), carnívoros (Hogan & Berman,

1994; Jeon and Park, 1997; Gao et al., 2000), primatas não humanos (Hendrickson et al.,

1991; DeFelipe et al., 1999; Elston & Gonzales-Albo, 2003) e humanos (Leuba et al.,

1998; Gonzalez-Albo et al., 2001).

1.4 Córtex Pré-frontal

Em primatas o córtex pré-frontal compreende entre 10% e 30% do volume do

lobo frontal (Fuster, 1997), apresentando uma organização altamente heterogênea e

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8

definida como uma região de associação convencionalmente definida através de critérios

citoarquitetônicos e conectivos, caracterizada em todos os mamíferos por apresentar uma

camada granular bem desenvolvida e um padrão de conexões recíprocas com os núcleos

talâmicos (Petrides & Pandya, 1999; Fuster, 2002).

Enquanto a homologia do neocórtex em diferentes espécies de mamíferos é

indiscutível, o córtex pré-frontal em particular apresenta algumas controvérsias.

Evidências descritas através de estudos comparativos e a investigação de espécies já

extintas demonstram que, no curso da evolução, o córtex pré-frontal apresentou um

aumento desproporcional de seu volume em relação a outras áreas corticais (Fuster, 1997;

Fuster et al., 2000). De acordo com Brodmann (1909) o córtex pré-frontal ocupa cerca de

3,5% da totalidade da área cortical em felinos, 12,5% em caninos, 11,5% a 17% em

primatas não humanos e 29% em humanos (veja Fuster, 2002 para revisão). Esse

aumento no volume apresentado pelo córtex pré-frontal pode estar relacionado com a

evolução dos processos cognitivos observados especialmente nos primatas (Fuster, 2002).

O córtex pré-frontal é descrito como um recipiente de informações sensoriais,

recebendo aferências de diferentes áreas corticais visuais, auditivas, somestésicas,

gustativas, olfativas e motoras (Barbas & Pandya, 1987; Barbas & Pandya, 1989; Fuster,

1997). Baseando-se nesse contexto, o córtex pré-frontal é importante para funções

cognitivas e para a organização do comportamento (Miller, 2000), incluindo a função

mnemônica e no planejamento motor que são necessárias para a interação com o meio

(Ramnani & Owen, 2004). Investigações têm demonstrado que indivíduos com lesões no

córtex pré-frontal apresentam alterações na sua personalidade, com dificuldade para

manter a atenção, organizar tarefas e tomar decisões, muitas vezes agindo por impulso

sem levar em conta as consequências futuras (Miller et al., 2002).

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A anatomia do córtex pré-frontal sugere que essa região pode ter um papel

‘executor’ no cérebro, sintetizando informações de diferentes áreas cerebrais e exercendo

forte influência no controle comportamental (Miller et al., 2002). O grupo de áreas que

compõem o córtex pré-frontal estabelece interconexões com áreas que processam

informações relacionadas ao meio externo (estruturas corticais e subcorticais que

compõem os sistemas sensoriais e motor), bem como informações internas (áreas do

mesencéfalo e sistema límbico envolvidas na memória e emoção) (Fuster, 1995; veja

Miller & Cohen, 2001 para revisão). De modo correspondente, os neurônios do córtex

pré-frontal apresentam um padrão altamente multimodal e codificam diferentes tipos de

informações nos diferentes estágios de percepção (Fuster, 1995; Barbas et al., 2005a).

Em particular, o córtex pré-frontal de primatas apresenta conexões com todas as

áreas corticais (Yeterian et al., 2011). As regiões lateral, medial e orbital são conectadas

reciprocamente com diferentes núcleos do tálamo, enquanto as regiões medial e orbital

são conectadas com o hipotálamo e com a formação hipocampal, sendo que algumas

dessas conexões são indiretas, passando antes pelo tálamo. A região lateral faz conexões

com os gânglios da base. Além disso, o córtex pré-frontal estabelece inúmeras conexões

com os córtices associativos das regiões occipital, temporal e parietal (Fuster, 1997;

Fuster, 2002; Barbas et al., 2005a; 2005b).

O papel das conexões do córtex pré-frontal não está totalmente esclarecido, mas

podemos inferir o papel funcional das estruturas que estão conectadas com esta região.

Em termos gerais, as conexões entre o córtex pré-frontal e o sistema límbico estão

envolvidas com o controle comportamental, enquanto que as conexões pré-frontal e

estriatal estão envolvidas com o controle motor (Fuster, 2002). As conexões recíprocas

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entre o córtex pré-frontal lateral e o hipocampo com os córtices de associação também

podem estar relacionadas aos aspectos cognitivos do comportamento. No entanto o papel

dessas conexões nos processos cognitivos (por exemplo, a consolidação da memória)

ainda continua um tanto incompreendido (Fuster, 2002).

Pelo exposto acima, o córtex pré-frontal apresenta-se como uma região altamente

heterogênea, composta por uma serie de subáreas que variam de acordo com sua estrutura

e interconexões com diferentes áreas corticais e subcorticais (Rempel-Clower & Barbas,

2000). A variação entre as conexões apresentada pelo córtex pré-frontal pode explicar os

papéis funcionais distintos atribuídos a esta região (Barbas et al., 2005a).

1.5 Razões para a escolha do sagui como animal experimental

Atualmente, o Instituto do Cérebro da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte (IC-UFRN) e o Instituto Internacional de Neurociências de Natal Edmond e Lily

Safra (IINN-ELS) têm como uma de suas linhas de investigação principais o estudo

comportamental de um pequeno primata do Novo Mundo, o sagui (Callithrix jacchus)

(Figura 1), especialmente no que se refere às suas vocalizações (Simões et al., 2010). Tal

animal foi escolhido como modelo por pelo menos quatro razões principais: 1. É uma

espécie abundante na região e de fácil reprodução; 2. É de pequeno porte (com peso entre

350 e 450 gramas no adulto), portanto de fácil manipulação; 3. Adapta-se facilmente ao

cativeiro e; 4. Possui o cérebro lisencefálico, livre de giros e circunvoluções que

dificultam o acesso às regiões de interesse. Tais características elegem o sagui como um

excelente modelo para estudos no SNC, além do fato de ser uma espécie evolutivamente

próxima à espécie humana, o que por si só já se constitui em um atrativo.

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Figura 1 - Sagui comum (Callithrix jacchus), espécie objeto de estudo do presente trabalho

O sagui é uma espécie de primata bastante valiosa para a Neurociência. Seu

pequeno tamanho e sua boa adaptação a testes comportamentais laboratoriais são ideais

para investigações neuroquímicas, assim com caracterização citoarquitetônica das

estruturas corticais e subcorticais (Roberts et al., 2007). Essa espécie de primata também

é bastante utilizada em estudos que avaliam a modulação neuroquímica na emoção e

cognição, com o propósito de investigar novas drogas para futuras terapias utilizadas nos

transtornos psiquiátricos (Roberts et al., 2007).

Desde a criação do Centro de Primatologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN), coordenado pelo Departamento de Fisiologia, diversos

projetos de pesquisa envolvendo o sagui deram origem a uma gama importante de

publicações a respeito da base circadiana dos ritmos biológicos e do sistema visual desta

espécie (Costa & Brito, 1997; Costa et al., 1999; Cavalcante et al., 2002; Cavalcante et

al., 2005). Aspectos gerais de conectividade, organização topográfica e fisiologia de

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alguns córtices sensoriais do sagui são alvos de estudo por grupos de pesquisa ao redor

do mundo (córtex auditivo: de la Mothe et al., 2006; Wang et al., 1995; Wang & Kadia

2001; córtex somestésico: Krubitzer & Kaas, 1990; Krubitzer et al., 1999; córtex visual:

McLoughlin & Schiessl, 2006; Zinke et al., 2006; Bourne et al., 2007).

Além das áreas corticais supracitadas, a organização morfofuncional do córtex

pré-frontal vem merecendo atenção especial. A citoarquitetura desta região no sagüi foi

originalmente descrita por Brodmann em 1909 e posteriormente por Pendin e Von Bonin

em 1947. Subsequentemente outros estudos têm examinado as conexões dessa área

(Brysch et al., 1990; Burman et al., 2006; Roberts et al., 2007). Apesar disso, a complexa

organização cortical ainda permanece relativamente pouco explorada (Roberts et al.,

2007).

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2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Caracterizar as subpopulações de interneurônios que expressam proteínas ligantes

de cálcio (CB, CR e PV) nos campos corticais pré-frontais do sagui, considerando seus

aspectos morfológicos, bem como seus padrões de distribuição e densidade, descrevendo

as semelhanças e diferenças intrínsecas dos sistemas inibitórios que compõem a área

supracitada.

2.2 Específicos

1). Descrever o padrão de expressão das proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e

PV) nas áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal do sagui;

2). Investigar o padrão de distribuição e densidade dos interneurônios

imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e PV);

3). Quantificar a morfologia celular dos neurônios que expressam as diferentes

proteínas ligantes de cálcio (CB, CR e PV) revelados pela imunohistoquímica, utilizando

parâmetros morfométricos.

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3. Materiais e Métodos

Saguis machos (Callithrix jacchus) (n=3) foram obtidos junto ao Instituto

Brasileiro do Meio Ambiente e de Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) (autorização

SISBIO-24231-1). Os espécimes foram submetidos a um período de quarentena no

Biotério do IINN-ELS localizado em Macaíba/RN, onde tratados antes de serem

disponibilizados para fins científicos.

Procurou-se realizar o trabalho com o mínimo de espécimes possível e todas as

providências necessárias foram tomadas de modo a evitar dor e sofrimento dos animais

durante os procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas internacionais

estabelecidas pelo National Institutes of Health - NIH (Guide for the Care and Use of

Laboratory Animals) e pelo comitê de ética e pesquisa em animais do IINN-ELS (licença

09-2010).

3.1 Perfusão, craniotomia e microtomia.

Os animais foram inicialmente submetidos à indução anestésica por via

respiratória através de uma mistura de oxigênio e isofluorano 5% (Cristália Produtos

Farmacêuticos Ltda., Brasil). A seguir os animais foram profundamente anestesiados por

via intramuscular com uma mistura de cloridrato de ketamina (86mg/kg) e cloridrato de

xilazina (13mg/kg). Os reflexos corneano e de aversão à dor pelo movimento de deflexão

da pata foram testados antes do início dos procedimentos experimentais, para a

averiguação do grau de anestesia. Após atingirem anestesia profunda os animais foram

posicionados em decúbito dorsal com os membros imobilizados. Foi feita uma incisão

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longitudinal ao longo da linha média abdominal, seguida de duas incisões oblíquas

através das costelas, na direção da cabeça do úmero, de modo a expor completamente o

coração.

Após estes procedimentos os animais foram perfundidos através do ventrículo

esquerdo com solução salina heparinizada (0,9%) aquecida a 37ºC, seguida por

paraformaldeído a 4% (4ºC) em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2-7,4) por intermédio de

uma bomba peristáltica (Mity Flex 913, USA).

Após a perfusão, os cérebros foram cuidadosamente removidos da caixa craniana,

sendo em seguida acondicionados em uma cubeta de vidro contendo tampão fosfato 0,1

M (pH 7,2-7,4) por 12 horas. Após este procedimento os cérebros foram transferidos para

solução crioprotetora (sacarose a 30%) até submergirem por completo, sendo

posteriormente separados em três blocos distintos (anterior, médio e posterior).

Os blocos anteriores contendo o córtex pré-frontal foram embebidos em Tissue

Tek (Sakura Finetek Inc., USA), congelados em mistura de gelo seco e álcool absoluto e

fatiados em secções coronais seriadas de 40 µm de espessura obtidas com auxílio de um

micrótomo de congelamento (Carl Zeiss Micron HM 550, Germany), sendo

posteriormente submetidas à análise histológica e colocalização imunohistoquímica.

Todas as secções obtidas no criostato foram montadas diretamente em lâminas dotadas de

carga eletrica (SuperFrost Plus Microslides, VWR - USA) durante a microtomia. Após

este procedimento as lâminas foram armazenadas à temperatura de -80ºC em freezer

especial para este fim (Thermo Electron Corporation, USA), até serem utilizadas para os

procedimentos histológicos.

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3.2 Coloração de Nissl

Algumas secções foram coradas através da técnica de Nissl de modo a definir

citoarquitetonicamente a localização das áreas de interesse.

As lâminas com o tecido histológico foram retiradas do freezer e mantidas à

temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida foram banhadas em uma solução de

água destilada/ácido acético (300 ml/50 µl) por 6 minutos, sendo em seguida imersas em

uma solução de cresil violeta à temperatura ambiente por 8 minutos, seguido por uma

bateria de álcool com um gradiente crescente de concentração (70%, 80%, 90% e 100%,

um minuto cada). Por fim, as lâminas foram imersas em xileno por 1 minuto. Ao final da

coloração as lâminas foram visualizadas ao microscópio óptico para exame do padrão de

coloração. Caso o mesmo fosse satisfatório, as secções eram montadas com o auxílio de

um meio de inclusão (Entellan, Merck).

3.3 Imunohistoquímica para ligantes de cálcio (CB, CR e PV)

a. As secções (40µm) foram retiradas do freezer e mantidas em temperatura

ambiente por 30 minutos, sendo em seguida imersas por 20 minutos em ácido bórico (pH

9.0) aquecido em banho maria a 55°C. A temperatura foi mantida constante neste

período. Em seguida permitiu-se que as secções resfriassem por 25 minutos imersas na

própria solução, tempo após o qual as secções foram submetidas ao protocolo para

imunohistoquímica.

b. Após o pré-tratamento as secções foram incubadas em peróxido de

hidrogênio/metanol (1 ml de H2O2/250 ml de metanol) por 30 minutos.

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c. As secções foram lavadas em TFS/Tween 0,1% (Sigma Company, USA) por 3

vezes de 3 minutos.

d. Os epítopos inespecíficos foram bloqueados com soro normal do animal que

produziu o anticorpo secundário por 1 hora. No caso dos anticorpos para os ligantes de

cálcio CB, CR e PV, foi utilizado o soro normal de cavalo 10% (Chemicon, USA).

e. Após o bloqueio, o excesso do soro foi retirado e as secções foram incubadas

em anticorpo monoclonal de camundongo anti-CB (1:500) (Santa Cruz, USA), anti-CR

(1:500) (Santa Cruz, USA) e anti- PV (1:500) (Santa Cruz, USA) durante 24 horas a

18°C.

f. As secções foram lavadas em TFS/Tween por 3 vezes durante 3 minutos.

g. As secções foram incubadas no anticorpo secundário biotinilado cavalo anti-

camundongo (Vector, USA) por 2 horas.

h. As secções foram lavadas em TFS/Tween por 3 vezes durante 3 minutos.

i. As secções foram incubadas no complexo avidina-biotina-peroxidase (kit ABC,

Vector) por 45 minutos (uma gota da solução A + uma gota da solução B em 5 ml de

PBS por 30 minutos antes da incubação).

j. Por fim, as secções foram retiradas da solução de ABC, lavadas em TF por 5

minutos e reagidas em uma solução de diaminobenzidina (DAB) a 0,05% com 125µl de

H2O2 para revelação do cromógeno. A intensidade da reação foi monitorada com auxílio

de um microscópio até que o padrão de marcação se apresentasse satisfatório.

De modo a certificar a especificidade da marcação, o anticorpo primário foi

substituído pelo soro normal em algumas secções-teste, escolhidas aleatoriamente.

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3.4 Desidratação e montagem dos cortes

Após serem submetidas aos processos imuhistoquímicos supracitados, as secções

foram desidratadas em cubetas de vidro em uma bateria de álcool etílico em diferentes

concentrações (50%, 70%, 80%, 90% e 100%); dois minutos cada, e imersas em xileno

por três minutos. Em seguida as lâminas foram cobertas com lamínula utilizando-se um

meio de inclusão (Entellan, Merck). A coleção de lâminas obtida foi limpa para a retirada

do excesso do meio de inclusão e submetida à inspeção microscópica para posterior

análise qualitativa e quantitativa.

3.5 Sistema de microscopia automática e programas para análise morfometrica e

estereológica

As análises microscópicas foram realizadas com auxílio de um sistema de

microscopia automática equipado com um microscópio binocular Nikon Eclipse 80i

acoplado a uma placa motorizada (MBF Bioscience Inc., USA) e um sistema de captura

de imagens digitais CX9000 (MBF Bioscience Inc., USA).

Para a reconstrução e análise morfométrica dos neurônios reativos para as

proteínas ligantes de cálcio foi utilizado o programa de morfometria automática

Neurolucida (MBF Bioscience Inc., USA). A distribuição e a densidade dos neurônios

imunorreativos para os diferentes marcadores nas áreas corticais de interesse foram

realizadas utilizando-se o pacote Stereo Investigator 8.0 (MBF Bioscience Inc., USA).

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3.6 Análise qualitativa

A análise do padrão de marcação da neurópila reativa para as proteínas ligantes de

cálcio CB, CR e PV, assim como a distribuição dos diferentes grupos de interneurônios

ao longo das áreas corticais de interesse foi realizada utilizando-se objetivas de menor

aumento (4x). O contorno das regiões corticais e dos limites das camadas em geral foi

desenhado com o auxilio do programa Neurolucida (MBF Bioscience Inc., USA), sendo

assinalada a posição dos interneurônios para ilustrar sua localização ao longo dessas

regiões.

3.7 Análise quantitativa

3.7.1 Quantificação estereológica para a distribuição dos interneurônios

Para estimar a distribuição e a densidade dos grupos neuronais imunorreativos

para os diferentes marcadores foi utilizado o protocolo fracionador óptico do pacote

Stereo Investigator 8.0, o qual estima o número de células imunorreativas em uma área

previamente determinada. Para calcular essa área foi necessário levar em consideração o

número de secções e sua espessura. A distribuição e o número de células em cada um dos

grupos neuronais imunorreativos para os diferentes marcadores foram estimadas em 5

secções seriadas, com um intervalo de 12 secções com uma espessura de 40µm cada.

Comparações entre os diferentes grupos de valores foram feitas através da análise de

variância (ANOVA, teste Newman-Keuls a posteriori - nível de significância de 95%).

Os valores obtidos foram expressos como média ± desvio padrão.

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3.7.2 Ferramenta estereológica: o fracionador óptico.

A contagem do número de células em uma determinada região é um problema de

difícil resolução pelo fato de não ser possível isolar fisicamente as células. Assim se faz

necessário fatiar o tecido em secções e estimar o número de células a partir dessas

secções. No entanto é preciso levar em consideração que, ao fatiar um determinado

volume de um tecido em secções, haverá inevitavelmente o corte das células que

compõem o tecido, de forma que uma mesma célula estará representada em secções

adjacentes. Segue-se que a contagem do número de células fragmentadas será maior que

o número real das células que compõem o tecido. Por essa razão, estimar o número de

células com base somente na contagem das células fragmentadas leva inexoravelmente a

um resultado errôneo.

A estereologia é um método que permite resolver esse problema, a partir de

amostras sistemáticas que fornecem um dado quantitativo sem viés. As técnicas

estereológicas tem o poder de estimar o número total dos objetos contidos em uma dada

região de interesse através de coleta de informação aleatória e sistemática, multiplicando-

se o número de elementos de interesse registrados pelos valores de probabilidade da

amostra (West, 2002). A estereologia é um ferramenta de contagem que elimina os vieses

amostrais ou seja utiliza sistemas de amostragens que são independentes das propriedades

do tecido, no qual as dimensões da sonda amostral e os parâmetros amostrais a ela

associados são definidos a priori, desprezando-se a coleta de dados acerca do tamanho,

forma e orientação espacial da área a ser investigada (Glaser and Glaser, 2000).

Utilizando essa metodologia, os números estimados a partir da amostragem podem ser

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expressos em valores relativos ou absolutos indicando volume, número, distribuição

espacial assim como o tamanho das estruturas biológicas, sem ter conhecimento prévio

da geometria celular ou do tecido a ser investigado (West, 2002; Schmitz and Hof, 2005).

Entre as ferramentas utilizadas para se estimar o número total de células, o

fracionador óptico é um dos métodos estereológicos mais usados nas ciências

biomédicas. O fracionador óptico é um desenho baseado em métodos de amostragem

sistemática utilizado para estimar o número de células em uma região especifica de um

órgão, quando a população é demasiada grande para contar exaustivamente (Glaser &

Wilson, 1998), pois combina as propriedades da sonda tri-dimensional para contagem dos

elementos de interesse (disecador óptico) com o sistema de amostragem sistemática e

aleatória (fracionador), evitando vieses amostrais assim como pressuposições (West et

al., 1991).

Utilizando esse método pode-se estimar o número de objetos em qualquer volume

trimensional. As contagens são imparciais na medida em que não são influenciadas pelo

tamanho, forma, orientação espacial das células em estudo. O fracionador óptico utiliza

secções de pequena espessura e estima o número total de células a partir de uma

contagem de células em amostras aleatórias (systematic randomly sampled, SRS). Esse

método utiliza caixas de contagem virtuais, as quais são distribuídas de uma maneira

aleatória por toda a região de interesse, com uma distância uniforme entre as mesmas nas

direções dois eixos X, Y e Z (Figura 2). O fracionador óptico não requer medidas de

densidade para estimar o número de células, tornando esse método de fácil

implementação. Além disso, o método do fracionador óptico não é afetado pela retração

tecidual que ocorre durante o processamento histológico.

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O princípio do fracionador óptico define que se tomarmos uma amostra aleatória

(x) de uma fração (f) conhecida da população, então a estimativa sem viés da população

(X) é o valor da amostra divido pela fração:

X = x/f

onde X representa o número de objetos de interesse, x é o valor medido ou estimado da

amostra e f é a fração amostral. É importante ressaltar que essa estimativa de X será sem

viés somente quando f for aleatória e sistemática. O valor de f é definido pelo

experimentador e depende de um equilíbrio entre a quantidade de trabalho que necessita

ser feito e a precisão da estimativa a ser obtida. Quando f for igual a 1, significa que toda

a população foi contada.

Figura 2 – Representação do método de contagem utilizado pelo fracionador óptico, mostrando a

distribuição de caixas de contagem através de grades com distâncias uniformes que cobrem

homogeneamente a área de interesse.

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3.7.3 Análise estatística para estimativa do número de células através do

fracionador óptico

Para obter um número estimado de células utilizando o fracionador óptico,

multiplicamos o número de células contadas em todos os espaços de contagem pelos

valores recíprocos de probabilidade de cada amostra, o qual é determinado levando-se em

conta três variáveis:

1- Número de secções investigadas em relação ao número de secções da região

de interesse (ssf).

2- Área do espaço de contagem em relação à área matriz de contagem (asf)

3- Altura do espaço de contagem em relação à média da espessura da secção

levando em consideração a retração tecidual que ocorre durante o

processamento histológico (stf).

As três variáveis são integradas na fórmula:

N = ΣQ * 1/ssf * 1/asf * 1/tsf

N- número total de células.

ΣQ – número total de células contadas.

ssf - section sampling fraction – número de secções contadas/ número total de

secções.

asf – area sampling fraction – área do espaço de contagem/área da matriz de

contagem.

tsf – tissue sampling fraction – espessura do espaço de contagem/espessura da

secção.

Para estimar o coeficiente de erro em relação ao método empregado na

quantificação, aplicamos procedimento sistemático amostral de um estágio denominado

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24

Coeficiente de Scheaffer (CE), previamente validado por Galser & Wilson, 1998 o qual

estabelece a precisão da metodologia aplicada. Em termos práticos a metodologia é

julgada apropriada para a coleta de dados quando CE ≤ 0.05 pois significa que a variância

introduzida pelo procedimento contribui pouco para a variância observada para cada

grupo de contagem. Aplicando o coeficiente de Scheaffer podemos determinar a área de

grade e as dimensões dos espaços de contagem a serem empregados para a quantificação

do número de células, A razão entre o coeficiente de erro intrínseco à metodologia (CE) e

o coeficiente de variação para as estimativas (CV) não deve ultrapassar 0.5 (Slomianka

and West, 2005). O coeficiente de variação biológica foi um segundo parâmetro estimado

sistematicamente usado na escolha do método de quantificação empregado, expresso em

valor percentual do coeficiente de variação o qual estabelece que a sua contribuição deve

ser sempre maior que 50% para que se minimize os erros intrínsecos do processo

amostral. O coeficiente de variação biológica é definido pela fórmula:

CVB2 = CV2 - CE2

CVB - variação biológica,

CV – coeficiente de variação,

CE – coeficiente de erro.

Para as comparações entre os números estimados das populações imunorreativas

para proteínas ligantes de cálcio nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-

frontal, aplicamos a análise de variância (ANOVA) com teste de Newman-Keuls a

posteriori com nível de significância de 95%.

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25

3.7.3 Análise morfométrica dos interneurônios imunoreativos para as proteínas

ligantes de cálcio

A análise morfométrica foi realizada com o auxílio do programa Neurolucida

(MBF Bioscience Inc., USA). Dois critérios principais foram utilizados para a escolha

das células a serem reconstruídas: integridade da árvore dendrítica (células que

aparentaram ter dendritos artificialmente cortados não foram incluídas) e a posição

relativa do corpo celular – para uma célula ser considerada ‘supragranular’, o corpo

celular deveria estar totalmente localizado nas camadas supragranulares (definidas pela

coloração de Nissl), o mesmo se aplicando às células das camadas infragranulares.

Para avaliação morfométrica foram reconstruídas em média 60 células para cada

grupo imunorreativo. As células foram reconstruídas segundo os parâmetros descritos

acima em grades de 600µm x 600µm. Seis grades foram fixadas em cada região do córtex

pré-frontal (medial, dorsolateral e órbito-frontal), sendo três grades fixadas nas camadas

supragranulares e três grades nas camadas infragranulares. Para cada célula reconstruída

foram analisados os seguintes parâmetros morfométricos:

• Comprimento dendrítico

• Superfície de campo dendritico

• Volume dendrítico

• Área de corpo celular

• Número de dendritos

• Ordem dendrítica

• Número de terminações dendríticas

• Número de bifurcações dendríticas

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26

4. RESULTADOS

4.1 Caracterização laminar das regiões do córtex pré-frontal do sagui

Para efeito de caracterização do córtex pré-frontal do sagui, o mesmo foi

parcelado em três regiões distintas considerando suas características citoarquitetônicas.

Cada região foi subdivida em grupos laminares e as camadas foram facilmente

distinguidas em todas as regiões. As camadas II/III foram incluídas em um único grupo,

assim como as camadas V/VI. A camada IV foi um ponto chave na caracterização das

regiões. A região medial foi caracterizada pela quase ausência da camada IV (Robert et

al., 2004), enquanto que as demais camadas apresentam uma expansão em seu padrão

laminar, levando à classificação da região medial como agranular. A região orbitofrontal

foi caracterizada como tendo uma estreita camada IV e foi classificada como região

disgranular, enquanto que a região dorsolateral foi caracterizada por apresentar todas as

seis camadas celulares distintas, sendo assim classificada como região eulaminar (Figura

3)

As células imunorreativas para CB, CR e PV apresentaram padrões distintos de

distribuição laminar nas três regiões do córtex pré-frontal do sagui examinadas (Figura3).

A imunohistoquímica para CB e CR revelou uma alta densidade celular nas camadas

II/III e uma redução expressiva nas V/VI, nas regiões medial, dorsolateral e orbital.

Enquanto que PV revelou uma alta densidade celular nas camadas V/VI quando

comparadas com os grupos CB e CR (Histograma 1, Tabela 1).

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27

Figura 3 - Caracterização citoarquitetônica e distribuição laminar dos grupos celulares

imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio na região medial (A-D), dorsolateral (E-

H) e orbital (I-M) do córtex pré-frontal do sagui. Escala - 500µm.

Calbindina

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Histograma 1 – Distribuição laminar das CaBPs, nas regiões dorsal, medial e orbital do córtex pré-frontal. Cada barra representa o número com média (± DP) para cada CaBPs. (Detalhes estatísticos na tabela 1).

PFC MEDIAL

0 50 100 150

V/VI CB

V/VI CR

V/VI PV

II/III CB

II/III CR

II/III PV

I CB

I CR

I PV

número de células

CaBPs

PFC DORSOLATERAL

0 50 100 150 200

V/VI CB

V/VI CR

V/VI PV

IV CB

IV CR

IV PV

II/III CB

II/III CR

II/III PV

I CB

I CR

I PV

número de células

CaBPs

PFC ORBITOFRONTAL

0 50 100 150

V/VICB

IV/VICR

V/VI PV

IV CB

IV CR

IV PV

II/IIICB

II/IIICR

II/III PV

I CB

I CR

I PV

número de células

CaBPs

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Tabela 1. Distribuição laminar das células imunorreativas para proteínas ligantes de cálcio

nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão

representados pela média ± desvio padrão. Valores que não apresentam a mesma letra ou

apresentam diferenças significativas com p<0.05 (Newman-Keuls).

Medial

Camada I II/III IV V/VI Significância

CB 1a 108 ± 15

b - 27 ± 2.5c F = 134.8

p<0.0001

CR 0a 132 ± 12b - 38 ± 5

c F = 258.9

p<0.0001

PV 0a 77 ± 11

b - 56 ± 6c F = 85.3

P<0.0001

Dorsolateral

CB 0a 101 ± 1.5

b 24 ± 5.1

c 34 ± 5.2

c F = 118.1

p<0.0001

CR 1a

147 ± 17b

38 ± 4c 47 ± 9

c F = 143.1

p<0.0001

PV 1a 91 ± 6.6b 55 ± 3.2c 62 ± 4.2c F = 51.7

p<0.0001

Orbitofrontal

CB 0a 86 ± 10

b 24 ± 3.6

c 22 ± 2.4c F =216.4

P<0.0001

CR 1a

124 ± 61b

33 ± 47c 38 ± 3.2

c F = 133.1

p<0.0001

PV 1a

85 ± 11b

47 ± 7.4c 55 ± 6.1

c F = 51.4

P<0.0001

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30

4.3 Distribuição laminar e características morfológicas dos neurônios

imunorreativos para calbindina

A maioria das células imunorreativas para CB apresentou características

morfológicas típicas de interneurônios, com dendritos curtos e lisos e ausência de um

dendrito apical evidente. Essas células foram caracterizadas por corpos celulares com

formato ovalar, esférico ou fusiforme e dendritos curtos formando árvores dendríticas

com arranjos bipolares e multipolares (Figura 4). As células bipolares foram

caracterizadas por corpos fusiformes ou ovalares com alto padrão reativo e dendritos

curtos pouco reativos, orientados verticalmente apresentando bifurcações próximas ao

corpo celular. Essas células apresentaram arranjos axonais horizontais emergindo do

corpo celular ou de dendritos primários com colaterais verticais extensos os quais

atravessavam as camadas celulares vizinhas (Figura 6 e 7). Esse tipo celular foi

encontrado principalmente nas camadas supragranulares II/III e em menor número na

camada IV e camadas infragranulares V/VI. Nas camadas III e IV foram encontradas

células bipolares com longos dendritos que alcançavam as camadas vizinhas (Figura5).

Essas células foram caracterizadas por dendritos primários verticais que se bifurcavam

distante do corpo celular. As células multipolares reativas para CB foram caracterizadas

por corpos celulares com forte reatividade, apresentando em média três a quatro dendritos

primários curtos pouco reativos (Figura 3). Tal tipo morfológico apresentou uma maior

concentração nas camadas supragranulares.

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Figura 4 - Células CB-ir no córtex pré-frontal do sagui, caracterizadas por corpos celulares

altamente reativos e dendritos finos com um padrão de reatividade mais acentuado. Barra de

escala: 30µm.

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Figura 5 – Reconstrução de células CB-ir . Em A, reconstrução de uma célula bipolar com

axônio vertical descendente emergindo (seta) do corpo celular. Em B, célula bipolar com arranjos

dendriticos em duplo tufo e axônios verticais descendentes (seta) com inúmeros colaterais

emergindo de um dendrito primário. Escala 40 µm.

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Figura 6 – Reconstrução total de células CB-ir. As células bipolares fomaram o grupo

morfológico predominante entre as células CB-ir, caracterizadas por dendritos bifurcados

formando arranjos em duplos tufos, com axônios horizontais (setas) caracterizados por inúmeros

colaterais (A e B) ou axônios descendentes (setas) (C e D) que emergiam do corpo celular

alcançando as camadas vizinhas.

A B

D C

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34

4.4 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos

para calretinina

As células imunorreativas para calretinina (CR) foram descritas em todas as

camadas celulares do córtex pré-frontal, com uma maior concentração nas camadas

supragranulares II/III (histograma1, tabela1). As células apresentavam características

morfológicas típicas de interneurônios, com dendritos curtos e lisos, corpo celular

pequeno e ausência de dendrito apical. Em geral essas células apresentavam corpos

altamente reativos, e dendritos finos pouco reativos (figura7). A imunohistoquímica CR

revelou dois grupos morfológicos distintos. O primeiro agrupou células bipolares

verticais, caracterizadas por corpos celulares fusiformes ou ovalares, apresentando

dendritos primários que se bifurcavam próximo ao corpo e feixes axonais verticais que se

projetavam a partir do soma ou do dendrito primário, caracterizados por colaterais que se

ramificam próximo ao corpo (figura 8). A morfologia bipolar foi o tipo predominante

entre as células imunorreativas para CR, sendo encontradas em todas as camadas

celulares, com uma maior concentração nas camadas supragranulares II/III. .

Terminações axonais imunorreativas para CR foram descritas nas camadas

supragranulares III e IV. Essas terminações foram caracterizadas por processos verticais

com feixes estreitamente entrelaçados. (figura 7).

As células multipolares formaram o segundo grupo celular, em geral

caracterizadas por corpos celulares esféricos ou ovalares com um forte padrão de

reatividade. Essas células apresentaram em média de três a quatro dendritos primários

que se bifurcavam próximo ao corpo celular formando árvores dendríticas complexas,

geralmente apresentando um axônio ascendente que se projetava para as camadas

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35

adjacentes (figura 8). Tal tipo morfológico foi descrito principalmente nas camadas

supragranulares II/III e IV.

Figura 7 – Células CR-ir no córtex pré-frontal do sagui. A imunohistoquímica para CR

revelou grandes células bipolares caracterizadas por apresentarem uma orientação vertical

(figuras A,B e E), células multipolares (C e D). Escala 30µm.

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36

Figura 8 – Reconstruções a partir de células imunorreativas para CR. Célula bipolar em A

caracterizadqa por um axônio delgado descendente (seta) emergindo do corpo celular com

inúmeros colaterais. Célula multipolar em B com axônio delgado vertical ascendente (seta)

emergindo de um dendrito primário. As cabeças de seta indicam longos arranjos axônais verticais

imunorreativos formando espécies de colunas. Escala 40µm.

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Figura 9 – Reconstrução total de células CR-ir. A morfologia predominante para CR foi

caracterizada por células bipolares verticais, que apresentavam geralmente dendritos que se

bifurcavam próximo ao corpo celular formando tufos em polos opostos do corpo celular. Essas

células foram caracterizadas por axônios verticais descendentes ou ascendentes que emergiam do

corpo celular ou de um dos dendritos primários (setas em A e C), ou axônios horizontais que

emergiam do corpo celular formando colaterais com arranjos ascendentes e descendentes (setas

em B e D).

A B

D C

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38

4.5 Distribuição laminar e caracterização morfológica dos neurônios imunorreativos

para parvalbumina.

As células imunorreativas para parvalbumina (PV) apresentaram morfologia típica

de interneurônios, com dendritos curtos e lisos e ausência do dendrito apical, sendo

caracterizadas por corpo celular arredondado ou ovalar. O grupo PV-ir apresentou uma

distribuição mais homogênea quando comparadas com a CB e CR, com uma grande

densidade de células na camada média IV e nas camadas V/VI.

Dois grupos celulares com morfologias distintas foram descritos para PV. O

primeiro grupo foi caracterizado por células bipolares verticais, descritas principalmente

nas camadas supragranulares II/III e V. Nessas camadas foram descritas grandes células

bipolares fusiformes com orientação vertical, apresentando dendritos primários finos que

se bifurcavam longe do corpo celular e se estendiam ao longo de toda a camada na qual o

corpo celular estava localizado (Figuras 10 e 11). Na camada V foram descritas células

bipolares com corpo celular arredondado e dendritos longos que alcançavam a camada

VI. Células multipolares foram descritas nas camadas infragranulares, as quais

apresentavam um alto padrão reativo, com corpos arredondados e dendritos primários que

se ramificavam formando árvores dendríticas complexas (Figuras 10 e 11). A PV também

revelou pequenos terminais axonais verticais próximos ao corpo celular, (Figura 12), no

entanto não conseguimos identificar seus segmentos iniciais.

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39

Figura 10 – Grandes células multipolares (A, B e C), foram reveladas para PV, caracterizadas por

corpos celulares altamente reativos e dendritos longos pouco reativos formando grandes árvores

dendríticas horizontais. Grandes células bipolares verticais (D) imunorreativas para PV foram

localizadas nas camadas supragranulares. Escala 30µm

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40

Figura 11 – Células multipolares imunorreativas para PV, com árvores dendríticas completamente

reconstruídas localizadas na camada V. Essas células foram caracterizadas por corpos celulares

esféricos ou ovalares e arranjos dendriticos horizontais. Os números romanos indicam a camada

onde a célula estava localizada. Escala 40µm.

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Figura 12 – Terminais axonais PV-ir, indicados pelas setas. Geralmente esses terminais se

localizavam próximo ao corpo celular apresentando orientação vertical (setas). Escala 100 µm em

A e 30 µm em B.

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42

4.6 Perfis morfométricos dos grupos celulares imunorreativos para proteínas

ligantes de cálcio.

Com intuito de caracterizarmos a heterogeneidade morfológica entre os grupos

celulares imunorreativos para CB, CR, e PV, quantificamos a morfologia a partir de

medidas morfométricas relacionadas a árvore dendrítica assim como ao corpo celular. As

células foram agrupadas em duas classes, considerando a disposição e o número de

dendritos: células bipolares e células multipolares.

Entre os três grupos imunorreativos caracterizados, as células bipolares CR-ir

apresentaram árvores dendríticas com maior grau de complexidade quando classificamos

o segmento dendritico por ordem (Tabela 2). As árvores dendriticas associadas as células

CR apresentaram maior número de bifurcações assim como o número de terminações

(Tabela 2). Em relação ao comprimento e superfície da árvore dendrítica, o grupo CR

apresentou as maiores medidas topológicas em relação aos grupos CB e PV (Tabela 2),

no entanto as árvores dendríticas não apresentaram diferenças de volume entre os grupos.

Em relação ao corpo celular, as células imunorreativas para CB apresentaram uma maior

área quando comparadas aos grupos imunorreativos para CR e PV (tabela 2).

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Tabela 2. Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão representados pela média (±DP). Valores que não apresentam a mesma letra subscrita apresentam diferenças significativas p<0.05 (Anova-Newman Keuls)

Entre as células multipolares, o grupo imunorreativo para CR apresentou o maior

número de segmento dendritico por ordem (Tabela 3), assim como os maiores números

de bifurcações e terminações quando comparadas aos grupos imunorreativos para CB e

PV (Tabela 3). As células CR apresentaram maiores superfícies dendríticas quando

comparadas com os grupos CB e PV, no entanto os grupos não apresentaram diferenças

em relação ao comprimento dendritico (Tabela 3). Quando consideramos o volume

dendritico, as células PV apresentaram maiores parâmetros em relação aos grupos CR e

Bipolares

CB CR PV Significância

Bifurcações 4 ± 2a 7 ± 3b 3 ± 1c F = 16.8 p<0.0001

Terminações 4 ±2a 6 ± 3b 5 ± 1c F = 7.4 p<0.001

2 ordem 4 ± 2a 4 ± 2a 4 ± 1a F = 0.5p>0.05

3 ordem 3 ± 2a 6 ± 2b 3 ± 1a F = 21.3 p<0.0001

4 ordem 2 ± 1a 5 ± 2b 2 ± 1a F = 30.6 p<0.0001

5 ordem 2 ± 1a 3 ± 1b 2 ± 1a F= 8.3 p<0.01

Superfície 272 ± 11µm3a 398 ± 18 µm3b 317 ± 30 µm3c F = 6.7 p<0.001

Comprimento 177 ± 23 µma 206 ± 53 µmb 140 ± 34 µmc F = 3.8 p<0.05

Volume 73 ± 38a 110 ± 57a 83 ± 52a F = 2.8 p>0.05

Área do soma 102 ± 18 µm2b 79 ± 18 µm2a 79 ± 23 µm2a F = 11.6 p<0.001

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44

CB (Tabela 3). As células CR apresentaram a menor área de corpo celular entre os grupos

analisados.

Tabela 3. Comparações dos perfis morfométricos entre os diferentes grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio descritos no córtex pré-frontal do sagui. Os valores estão representados pela média (±DP). Valores que não apresentam a mesma letra subscrita apresentam diferenças significativas p<0.05 (Anova-Newman Keuls)

Multipolares

CB CR PV

Bifurcações 5 ± 1a 6 ± 2b 4 ± 1a F = 9.0 p<0.001

Terminações 8 ± 2a 10 ± 3b 7 ± 1a F = 14.5 p<0.0001

1 ordem 4 ± 2a 5 ± 1b 4 ± 1a F = 34.3 p<0.0001

2 ordem 6 ± 2a 8 ± 3b 8 ± 2b F = 10.5 p<0.0001

3 ordem 3 ± 1a 6 ± 2b 4 ± 1a F = 35.6 p<0.0001

4 ordem 3 ± 1a 4 ± 2b 2 ± 1c F = 28.5 p<0.0001

5 ordem 2 ± 1a 3 ± 1b 2 ± 1a F = 5.2 p<0.01

Superfície 220 ± 78 µm3a 285 ± 10 µm3b 89± 30 µm3c F= 39.7 p<0.0001

Comprimento 130 ±31µma 129 ± 29µm a 136 ± 28µma F = 1.3 p>0.05

Volume 57 ± 21µm3a 65 ± 30 µm3a 81 ± 32 µm3b F = 6.5 p<0.002

Área do soma 102 ± 24 µm2a 77 ± 17 µm2b 102 ± 27 µm2a F = 10.0 p<0.001

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45

4.7 Análise quantitativa da estimativa celular entre os grupos CB, CR e PV no

córtex pré-frontal do sagui.

Para fins de contagem celular, o córtex pré-frontal foi parcelado em três grandes

regiões: medial, dorsolateral e orbital. Esse parcelamento segue o mesmo estabelecido

por Burman e colaboradores (2006) e Robert e colaboradores (2007).

Os grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir não apresentaram uma homogeneidade numérica

quando comparamos a densidade celular através de pareamentos entre os grupos, onde foi

encontrado diferenças nas regiões do córtex pré-frontal caracterizadas

citoarquitetonicamente. Contudo essas relativas diferenças na densidade dos grupos CB-

ir, CR-ir e PV-ir nas regiões do córtex pre-frontal variaram de acordo a reatividade das

proteínas ligantes de cálcio assim o padrão citoarquitetônico de cada região analisada

como demostrado a seguir.

Na região dorsalateral, caracterizada por apresentar as cinco camadas celulares

bem definadas também denominada de região eulaminada, o grupo CR-ir apresentou uma

densidade celular ((123.646 ± 5.293 células/mm3) duas vezes maior quando comparada a

densidade celular do grupo PV-ir (59.425 ± 5.192 células/ mm3) ou quando comparada a

densidade celular do grupo CB-ir (79.781 ± 11.010 células/ mm3) (Anova F = 27,18

p<0.001). No entanto não foi encontrada diferenças estatísticas significativas quando os

grupos CB-ir e PV-ir foram pareados (p>0.05). Dados compilados no histograma 2.

As tabelas 4 e 5 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a

contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na

região dorso-lateral do córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de

variação biológica para cada grupo celular.

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46

Tabela 4. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB (ΣQ), na região dorsolateral do córtex pré-frontal do sagui.

Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções

Animais a (caixa) (µm)2

A (X, Y) (µm)2

asf tsf ssf N de caixas

N de secções

ΣQ

Animal1

CB

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 226 5 83345

Animal2

CB

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 203 5 88570

Animal3

CB

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 215 5 76897

Animal1

CR

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 231 5 127310

Animal2

CR

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 203 5 135584

Animal3

CR

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 215 5 107905

Animal1

PV

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 195 5 54588

Animal 2

PV

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 210 5 65146

Animal3

PV

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 203 5 69543

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47

Tabela 5. Estimativa do número de células imunorreativas para CB (N) com coeficiente de erro para região dorsolateral do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e estimativa individual (Média, N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e médios (CE).

CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.

Calbindina

Espessura N CE

Animais

1 32 83345 0,06

2 31,8 88570 0,05

3 31,5 67430 0,06

Média 31,7 79781 0,06

D.P 11011

CV2=(D.P/Média)

2 0,0190

CE2

0,0361

CE2/CV

2 0,1889

CVB2

0,0154

CVB2(% de CV

2) 81,1%

Calretina

Espessura N CE

Animais

1 32 127390 0,06

2 31 135584 0,05

3 31,6 107655 0,06

Média 31,5 123646 0,06

D.P 14185

CV2=(D.P./Média)

2 0,0131

CE2 0,0036

CE2/CV2 0,2735

CVB2 0,0095

CVB2(% de CV2) 63,6%

Parvalbumina

Espessura N CE

ANIMAIS

1 31,7 54588 0,06

2 32 65146 0,06

3 31,6 59425 0,06

Média 31,7 59425 0,06

D.P 15534

CV2=(D.P/Média)

2 0,0080

CE2

0,0036

CE2/CV

2 0,4468

CVB2

0,0044

CVB2(% de CV

2) 55,3%

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48

Histograma 2 - Na região dorsolateral do córtex pré-frontal, o grupo CR-ir apresentou

uma maior densidade celular quando comparado ao grupo PV-ir (ANOVA –Newman Keuls

p<0.001) ou ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.01). Por outro lado a densidade

celular entre os grupos PV-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas significativas

quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05)

Na região orbital também caracterizada como uma região disgranular por

apresentar a camada celular IV rudimentar, assim como caracterizado na região

dorsolateral, o grupo CR-ir apresentou uma alta densidade celular (91.200 ± 4.663

células/mm3) quando comparada a densidade celular do grupo CB-ir (55.850 ± 5.142

células/mm3) ou em relação a densidade celular do grupo PV-ir (44.840 ± 8.168

cells/mm3) (Anova F = 45.88 p<0.001). Por outro lado a densidade celular entre os

grupos CB-ir e PV-ir não apresentaram diferenças estatísticas significativas (Anova

p>0.05). Resultados compilados no histograma 3.

As tabelas 6 e 7 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a

contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na

PFC DORSOLATERAL

CB CR PV

0

50000

100000

150000

número de celulas/mm

3

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49

região dorso-lateral do córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de

variação biológica para cada grupo celular.

Tabela 6. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV

(ΣQ), na região medial do córtex pré-frontal do sagui.

Animais a (caixa) (µm)2

A (X, Y) (µm)2

asf tsf ssf N de caixas

N de secções

ΣQ

Animal1

CB

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 133 5 76126

Animal2

CB

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 141 5 57034

Animal3

CB

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 136 5 63456

Animal1

CR

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 138 5 76217

Animal2

CR

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 120 5 85774

Animal3

CR

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 130 5 69675

Animal1

PV

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 145 5 52376

Animal 2

PV

500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 132 5 37736

Animal3

PV

500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 142 5 42567

Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções

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50

Tabela 7. Estimativa do número de células imunorreativas para CB, CR e PV (N) com

coeficiente de erro para a região medial do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e

estimativa individual (Média,N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e

médios (CE).

Calbindina

Espessura N CE

Animais

1 32,1 76217 0,06

2 32 85774 0,06

3 30,5 69675 0,06

Média 31,87 72225 0,06

D.P 8094

CV2=(D.P/Média)

2 0,0109

CE2

0,0036

CE2/CV

2 0,3274

CVB2

0,0073

CVB2(% de CV

2) 67,25%

Calretina

Espessura N CE

Animais

1 32,2 76120 0,06

2 32,1 57034 0,05

3 31,5 63456 0,06

Média 31,8 65538 0,06

D.P 9714 CV

2=(D.P./Média)

2 0,0219 CE

2 0,0036

CE2/CV

2 0,1638

CVB2

0,0183

CVB2(% de CV

2) 83,6%

Parvalbumina

Espessura N CE

ANIMAIS

1 32,1 52376 0,05

2 31,9 37736 0,07

3 32 42567 0,06

Média 32 44226 0,06

D.P 7459

CV2=(D.P/Média)2 0,0284

CE2 0,0036

CE2/CV2 0,1265

CVB2 0,0248

CVB2(% de CV2) 87,3%

CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.

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51

Histograma 3 - Na região orbito-frontal do córtex pré-frontal, o grupo CR-ir apresentou

uma maior densidade celular quando comparado ao grupo PV-ir (ANOVA –Newman Keuls

p<0.001) ou ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.001). Por outro lado a

densidade celular entre os grupos PV-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas

significativas quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05).

A região medial caracterizada pela ausência da camada IV denominada como

região agranular, difere das outras duas regiões que formam o córtex pré-frontal, quando

analisamos a densidade celular entre os grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir. O grupo PV-ir

apresentou apresentou a menor densidade celular (44.230 ± 7.460 celulas/mm3) quando

comparado a densidade celular do grupo CB-ir (65.540 ± 9.715 células/mm3) ou

comparada a densidade celular do grupo CR-ir (77.200 ± 8.096 células/mm3) (Anova F =

11.69 p<0.01), no entanto a densidade celular entre os grupos CB-ir e CR-ir não

demonstraram diferença estatística significativa (p>0.05). Resultados compilados no

histogtograma 4

As tabelas 8 e 9 descrevem respectivamente os parâmetros adotados para a

contagem e os números estimados das células imunorreativas para CB, CR e PV na

PFC ORBITOFRONTAL

CB CR PV

0

20000

40000

60000

80000

100000

número de celulas/mm

3

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52

regiãomedialdo córtex pré-frontal indicando o coeficiente de erro e coeficiente de

variação biológica para cada grupo celular.

Histograma 4 - Na região medial do córtex pré-frontal, o grupo PV-ir apresentou uma

menor densidade celular quando comparado ao grupo CB-ir (ANOVA –Newman Keuls

p<0.05) ou ao grupo CR-ir (ANOVA –Newman Keuls p<0.01). Por outro lado a densidade

celular entre os grupos CR-ir e CB-ir não mostraram diferenças estatísticas significativas

quando comparadas (ANOVA –Newman Keuls p>0.05).

PFC MEDIAL

CB CR PV

0

20000

40000

60000

80000

100000

número de celulas/mm

3

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53

Tabela 8. Parâmetros experimentais e número de células imunorreativas para CB, CR e PV

(ΣQ), na região orbital do córtex pré-frontal do sagui.

Animais a (caixa) (µm)2

A (X, Y) (µm)2

asf tsf ssf N de caixas

N de secções

ΣQ

Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 141 5 56793

Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 125 5 60455

Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 155 5 50302

Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 142 5 87983

Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 124 5 96551

Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 145 5 89076

Animal1 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 147 5 58000

Animal2 500x500 600x600 0,67 0,93 1/12 123 5 38217

Animal3 500x500 600x600 0,67 0,95 1/12 132 5 42457

Área da caixa de contagem, a(caixa); dimensões de X,Y; A(X,Y); asf, fração amostral da área de grade,[a(caixa)/A(X,Y); tsf , fração amostral da espessura da secção calculada como a razão entre a altura da caixa divida pela espessura da secção: h/espessura da secção; ssf, fração amostral do número de seções.

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54

Tabela 9. Estimativa do número de células imunorreativas (N) para CB, CR e PV com

coeficiente de erro para região orbital do córtex pré-frontal do sagui. Média do grupo e

estimativa individual (Média, N); Desvio padrão (DP) e coeficiente de erro individuais e

médios (CE).

.

Calbindina

Espessura N CE

Animais

1 32,1 54105 0,06

2 31,7 36080 0,06

3 30,5 42457 0,06

Média 31,4 44213 0,06

D.P 9139

CV2=(D.P/Média)

2 0,0427

CE2

0,0036

CE2/CV

2 0,0842

CVB2

0,0391

CVB2(% de CV

2) 91,6%

Calretina

Espessura N CE

Animais

1 32,2 54103 0,06

2 31,9 36080 0,06

3 31,5 42457 0,06

Média 31,9 44213 0,06

D.P 8284

CV2=(D.P./Média)

2 0,0088

CE2 0,0032

CE2/CV

2 0,3637

CVB2

0,0056

CVB2(% de CV

2) 63,6%

Parvalbumina

Espessura N CE

Animais

1 32,1 56793 0,06

2 31,9 60455 0,06

3 32 50302 0,06

Média 32 55850 0,06

D.P 5141

CV2=(D.P/Média)

2 0,0084

CE2

0,0036

CE2/CV

2 0,4247

CVB2

0,0048

CVB2(% de CV

2) 57,5%

CBV2= CV2-CE2 (CE, coeficiente de erro; CV coeficiente de variação biológica), DP desvio padrão.

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55

4.8 Análise de variância (ANOVA) entre áreas medial, dorsolateral e orbitofrontal

em relação ao número estimados de células imunorreativas para CB, CR e PV

Após observamos que o número estimado dos grupos celulares pode variar em

uma determinada região, passamos a investigar se o número estimado dos diferentes

grupos celulares poderiam apresentar diferenças entre as diferentes áreas investigadas.

Dessa maneira pareamos as três regiões do córtex pré-frontal considerando a média do

número estimado para cada grupo imunorreativo.

Quando comparamos a densidade celular dos grupos imunorreativos, entre as

diferentes regiões do córtex pré-frontal caracterizadas citoarquitetonicamente

encontramos diferenças para o grupo CR-ir (F= 17,69 p<0.01), assim como para o grupo

CB (F= 5,38 p<0.05), que podem traçadas com diferenças significativas entre as região

eulaminada e a região agranular para o grupo CR-ir, (p<0.01) assim como entre a região

eulaminada e a região disgranular (p<0.01), no entanto a densidade celular do grupo CR-

ir não apresentou diferença significativa entre a região agranular e a região disgranular

(p>0.05). Resultados compilados no histograma 5

Histograma 5 – O grupo CR-ir demonstrou variação na sua densidade entre a região

dorsolateral e a região medial (p<0.01), assim quando comaparada com a região

orbitofrontal (p<0.01), no entanto a densidade celular não apresentou diferenças estatísticas

significativas entre as regiões medial e orbitofrontal (p>0.05)

PFC CR

MED. DORSLAT. ORBITOFRONT.

0

50000

100000

150000

número de celulas/mm

3

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56

A região agranular assim como a região disgranular apresentram uma baixa

densidade celular para o grupo CB-ir quando comparadas com densidade celular da

região eulaminada (F = 5.38 p<0.05), enquanto que a densidade celular para o grupo CB-

ir entre as regiões disgranular e agrnular não apresentaram diferenças estatísticas

significativas (p>0.05). Dados compilados no histograma 6.

Histograma 6 – A densidade celular para o grupo CB-ir apresentou diferença significativa

apenas entre as regiões dorslateral e orbitofrontal (p<0.05), enquanto que as outros

possíveis pareamentos entre as regiões não apresentaram diferenças estatísticas

significativas (p>0.05)

Em contraste aos grupos CB-ir e CR-ir, o grupo PV-ir apresentou uma relativa

uniformidade na sua densidade celular através das diferentes regiões do córtex pré-frontal

PFC CB

MED. DORSLAT. ORBITOFRONT

0

20000

40000

60000

80000

100000

número de celulas/mm

3

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57

Histograma 7- O grupo PV-ir apresentou uma densidade celular relativamente homogênea

entre as diferentes regiões do córtex pré-frontal em relação aos outros grupos celulares

analisados (p>0.05)

PFC PV

MED. DORSLAT. ORBITOFRONT.

0

20000

40000

60000

80000

número de celulas/mm

3

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58

5 Discussão

5.1 Considerações sobre a utilização de marcadores neuroquímicos no estudo da

heterogeneidade das populações de interneurônios no córtex cerebral.

Muitos estudos têm descrito a grande diversidade dos neurônios GABAérgicos,

considerando suas características neuroquímicas, eletrofisiológicas e morfológicas

(DeFelipe, 2002; Druga, 2009; Markram et al 2004). Essa população neuronal altamente

heterogênea está relacionada a diferentes funções que incluem sincronização das

atividades oscilatórias corticais e plasticidade sináptica (Druga, 2009; Markram et al.,

2004). Além disso, estudos recentes têm demonstrado que grupos de neurônios

GABAérgicos distintos coordenam a atividade das grandes populações de neurônios

piramidais (Markram et al., 2004). A caracterização dos diferentes subtipos de neurônios

GABAérgicos é particularmente importante para o entendimento das funções cerebrais.

Um dos grandes problemas no estudo dos neurônios GABAérgicos, se dá pela

falta de uma classificação padronizada no que tange a grande diversidade dessa

população. Atualmente o emprego da classificação neuroquímica é utilizada

principalmente no estudo da grande heterogeneidade GABAérgica. No entanto um

determinado marcador neuroquímico pode ser expresso em diferentes grupos

morfológicos, assim como um determinado grupo morfológico pode expressar diferentes

marcadores. Além disso, diferentes marcadores neuroquímicos podem ser co-expressos

em neurônios individuais. Mesmo apresentando limitações, a análise baseada na

caracterização neuroquímica tem méritos inegáveis.

A introdução da imunohistoquímica nos anos 1970 e 1980 representou uma das

maiores inovações para o entendimento dos circuitos corticais. A utilização dessa

ferramenta possibilitou a investigação dos padrões sinápticos entre diferentes grupos

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59

celulares, permitindo inferir aspectos gerais dos circuitos corticais. Um importante

avanço na caracterização dos interneurônios e nos estudos de novos aspectos dos

circuitos corticais foi a demonstração de que certos grupos de interneurônios

morfologicamente identificados podem expressar proteínas ligantes de cálcio (Condé et

al., 1999; DeFelipe, 1993;1997; 2002; Gabbot & Bacon, 1996).

A vantagem da marcação imunohistoquímica em relação a outras técnicas como a

coloração de Golgi e a marcação por injeção intracelular de corantes é que, ao contrário

dessas técnicas, a marcação através da imunohistoquímica é mais replicável e

homogênea, revelando consistentemente detalhes finos da distribuição dos grupos

celulares (DeFelipe, 1997; 1999; 2002). A imunohistoquímica permite a investigação da

densidade e distribuição dos terminais axonais de diferentes grupos celulares, bem como

a análise das conexões sinápticas entre os grupos celulares (DeFelipe, 1997; 1999; 2002;

Gabbot & Bacon, 1996)

Outra grande vantagem no emprego dos marcadores neuroquímicos é a

compatibilidade com a análise quantitativa. Uma vez que a imunomarcação pode revelar

uma grande massa de neurônios GABAérgicos, o emprego dessa metodologia permite

uma estimativa precisa do número e/ou densidade desses subtipos neuronais em regiões

específicas do cérebro (Jino & Kosaka, 2006). Os marcadores neuroquímicos são

bastante úteis não apenas na investigação da organização anatômica, mas também podem

estimar mudanças patológicas associadas a algumas doenças e desordens como a

epilepsia e a isquemia (Arabadzisz & Freund, 1999; Arellano et al., 2004; Cobos et al.,

2005).

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60

5.2 Imunorreatividade para as proteínas ligantes de cálcio entre os diferentes tipos

morfológicos de interneurônios no córtex pré-frontal do sagui.

Os interneurônios perfazem cerca de 20% da população neuronal cortical, com

cerca de doze variedades morfológicas distintas encontradas em quase todas as espécies

de mamíferos (Douglas & Martin, 2004, 2009). No entanto a proporção desses grupos

celulares pode variar entre as áreas corticais de uma determinada espécie ou até mesmo

entre espécies (DeFelipe, 2003; Douglas & Martin, 2009; Hof, 1999; Lund & Wu, 1997;

Kawaguchi & Kubota, 1997).

Apesar de constituírem numericamente o menor grupo entre os neurônios

neocorticais, os interneurônios desempenham importantes funções modulatórias nos

circuitos corticais, respondendo a alterações dinâmicas nas atividades excitatórias,

exercendo controle sobre uma vasta gama de aferências que chegam ao córtex cerebral,

desempenhando atividade sincronizadora e exercendo uma influência direta na escala de

tempo de disparo dos neurônios piramidais (Markram et al., 2004). As funções exercidas

pelos interneurônios são determinadas pelo perfil morfológico, neuroquímico e molecular

característico de cada grupo. Uma classificação mais abrangente levando em

consideração diferentes aspectos morfofisiológicos para a grande diversidade dos

interneurônios é um passo crucial no entendimento da organização dos circuitos corticais.

A pesquisa dos interneurônios corticais foi primeiramente orientada através de

suas características somatodendriticas e axonal, através do emprego de técnicas

modificadas da “reazione nera” de Golgi. Mais tarde com a introdução da microscopia

eletrônica foi possível demonstrar características ultraestruturais e sinápticas desses

elementos. Mais recentemente com o emprego marcadores moleculares e investigações

eletrofisiológicos, dados valiosos tem sido gerados indicando uma grande diversidade

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61

fenotípica associada aos interneurônios corticais. Tradicionalmente, as classificações da

heterogeneidade dos interneurônios foram baseadas em descrições apoiadas em critérios

qualitativos não padronizados. Portanto as classificações aplicadas à grande diversidade

morfológica e eletrofisiológica desses grupos muitas vezes diferem entre si (DeFelipe,

1997; Markram et al., 2004), e não estabelecem claramente os padrões mais relevantes

para o que se determina ser uma classe específica de interneurônios. A heterogeneidade

estrutural dos interneurônios reflete diferenças funcionais, mas seu significado permanece

não totalmente esclarecido.

No presente trabalho, caracterizamos os diferentes grupos imunorreativos para

CB, CR e PV no córtex pré-frontal do sagui, considerando os parâmetros morfométricos

somatodendriticos associados à caracterização de suas projeções axonais e os padrões de

distribuição laminar e regional. Parâmetros morfométricos somatodendriticos têm sido

usado exaustivamente na caracterização das grandes populações de neurônios piramidais

em diferentes áreas corticais de primatas e roedores (Elston et al., 1997, 2002, 2006a,

2006b, Benevides-Piccione et al., 2002, 2006) No entanto o perfil somatodendritico tem

sido pouco utilizado na caracterização dos grupos de interneurônios Freire et al., 2010).

Acreditamos que esse tipo de análise, em conjunto com a caracterização das projeções

axonais, fornece um bom arcabouço na classificação de grupos neuronais GABAérgicos.

Diversos estudos têm utilizado amplamente as proteínas ligantes de cálcio

(calbindina, calretinina e parvalbunia) para subdividir os células GABAérgicos em

grupos neuronais distintos, considerando perfis axonais, eletrofisiológios e moleculares

expressos por diferentes grupos. A imunohistoquímica para proteínas ligantes de cálcio

tem revelado padrões axonais característicos para as diferentes classes de interneurônios,

permitindo a identificação e classificação dessas células em grupos neuronais distintos.

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62

No entanto muitos autores têm negligenciado a morfologia dendrítica, caracterizando-a

superficialmente, enfocando quase sempre padrões axonais já consagrados na

identificação dos diferentes grupos que compõem a população dos neurônios

GABAérgicos.

No presente estudo observamos diferenças entre os perfis somatodendríticos entre

os grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio. A CR agrupou células as

quais apresentaram os perfis somatodendrícos com os maiores graus de complexidade.

Nas camadas supragranulares a CR revelou células multipolares com quatro a cinco

dendritos as quais apresentavam grandes números de bifurcações formando dendritos

altamente ramificados de grandes comprimentos e superfícies. Geralmente essas células

apresentavam um axônio ascendente que se projetava para a camada I. As características

morfológicas desse grupo revelaram semelhanças com as características morfológicas das

células de Martinotti, descritas em outras espécies de primatas e roedores (MacGarry et

al., 2010). Geralmente as células de Martinotti são descritas nas camadas II e V,

caracterizadas por árvores dendríticas elaboradas quando comparadas outros tipos de

interneurônios (Markram et al, 2004), Esse tipo celular geralmente apresenta axônios

com plexos ascendentes os quais estabelecem sinapses com dendritos distais localizados

na camada I (DeFelipe, 2001, MacGarry et al., 2010).

O segundo grupo imunorreativo para CR apresentou células caracterizadas por

dendritos orientados verticalmente. Podemos dividir esse grupo em dois subgrupos. O

primeiro subgrupo apresentou longos dendritos primários que emergiam em cada um dos

polos do corpo celular e se ramificavam em dendritos de segunda ordem. O segundo

subgrupo exibia dendritos primários que emergiam em cada um dos polos do corpo

bifurcando-se e dando origem a um grande número de ramificações. Cada árvore

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63

dendrítica formava arranjos proeminentes semelhantes a tufos. Esse segundo tipo celular

foi preferencialmente localizado nas camadas I/III e camada V. Essas células

apresentavam feixes axonais verticais que se projetavam a partir do soma ou de um

dendrito primário. Normalmente os axônios apresentavam colaterais que se ramificam

junto ao corpo celular. Com base nessas características, essas células parecem ser células

duplo buquê descritas no córtex pré-frontal de outras espécies de primatas (Condé et al.,

1994; Lund & Lewis, 1993, Zaitsev et al., 2005). A identificação das células CR como

células duplo buquê é apoiada pelas observações de terminações axonais imunorreativas

para CR. Essas terminações foram caracterizadas por processos verticais com feixes

estreitamente entrelaçados. Normalmente esses feixes apresentaram numerosas dilatações

em forma de botões e um número variável de curtas ramificações. Os terminais axonais

descritos aqui têm sido encontrados no neocórtex tanto de humanos como de macacos

(DeFelipe, 2002; DeFelipe et al, 1990; 1999; DeFelipe & Jones, 1992, Elston &

Gonzalez-Albo, 2003). DeFelipe e colaboradores (1999) demostraram que células duplo

buquê podem apresentar uma distribuição heterogênea em distintas áreas corticais,

apresentando uma alta densidade no córtex temporal inferior, e uma baixa densidade em

no córtex visual secundário (V2).

A CB revelou principalmente grupos de células bipolares com tufos duplos,

caracterizadas por axônios verticais que emergiam do corpo celular, e se projetavam

verticalmente através das camadas celulares. Células bipolares caracterizadas por

axônios verticais descendentes ou ascendentes também foram reveladas com a

imunohistoquímica para CB. No que tange a classificação morfológica esses tipos

celulares constituem grupos distintos.

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64

O grupo PV-ir foi caracterizado células multipolares, apresentando de 3 a 4

dendritos de primeira ordem que se bifurcavam próximo ao soma, formando árvores

dendríticas com um grande número de ramificações de segunda ordem.

Frequentemente tem sido descrito que a PV pode ser expressa nas células em

candelabros encontradas em diferentes regiões do córtex de primatas (DeFelipe, 1997;

2003; DeFelipe et al., 1985; 1989; 1999; del Rio et al., 1994). As células em candelabro

são caracterizadas por dendritos multipolares e axônios verticais altamente ramificados

em torno do corpo celular com alta densidade de botões. Os terminais axonais são

caracterizados por fileiras de botões que lembram candelabros. Essas células estabelecem

sinapses com regiões proximais dos axônios das células piramidais (Markram et al.,

2004). No córtex pré-frontal do sagui conseguimos visualizar terminais axonais verticais

semelhantes aos descritos por DeFelipe e colaboradores (1999) nas áreas visuais de

primatas, entretanto, não conseguimos identificar se essas terminações emergiam das

células imunorreativas para parvalbumina. A PV também revelou feixes axonais

horizontais esparsos e com poucos botões que formavam uma trama complexa de

terminações; no entanto também não fomos capazes de identificar suas origens.

5.3 Implicações funcionais das células imunorreativas para proteínas ligantes de

cálcio no processamento cortical

A CB, CR e PV tem sido co-localizadas com GABA em diferentes regiões

corticais em distintas espécies de primatas (Condé et al., 1994; Hendry et al., 1989;

Defelipe, 1997; 1999; Gonzales Albo et al., 2001, Pouget et al, 2009; Zaitsev et al.,

2009). A identificação no presente estudo dessas proteínas em classes específicas de

interneurônios no córtex pré-frontal do sagui pode levar a uma maior compreensão sobre

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a organização dos circuitos intrínsecos do córtex pré-frontal dos primatas. Nossos

resultados corroboram observações prévias de que, em uma dada área cortical,

populações específicas de interneurônios podem modular diferentes populações de

neurônios piramidais (DeFelipe et al, 1999). Por exemplo, diferentes subpopulações de

neurônios piramidais são implicadas em projeções ascendentes, descendentes e calosas, e

a distribuição laminar dessas subpopulações de neurônios varia de acordo com o tipo de

projeção. Portanto é provável que a diferença na distribuição laminar dos interneurônios

imunorreativos para CB, CR e PV reflita diferenças na circuitaria cortical, por sua vez

relacionada a diferentes formas de processamento cortical descrito nas áreas pré-frontais.

O perfil funcional das subpopulações neuronais é determinado em parte pela

microanatomia e pela organização da microcircuitaria local, dentro de cada área. Assim é

altamente compreensível que existam diferenças substanciais na capacidade de cada

grupo neuronal em integrar aferências.

Inúmeros estudos têm mostrado que os interneurônios imunorreativos para PV no

córtex pré-frontal dos primatas formam grupos fisiológicos homogêneos, os quais

compartilham propriedades similares com as células PV imunorreativas descritas no

córtex frontal de ratos. Os interneurônios PV estabelecem conexões inibitórias com o

segmento inicial dos axônios das células piramidais (DeFelipe, 1997, Somogyi, 1998,

Zaitsev et al., 2005). Essas aferências inibitórias proximais promovem potenciais

inibitórios pós-sinápticos (IPSPs), com cinéticas rápidas de grande amplitude, quando

comparados com aferências distais (Beirlein et al, 2003; Markram et al., 2004; Zaitsev et

al., 2009). Essas propriedades fornecem uma alta fidelidade temporal assim como um

poderoso controle inibitório sobre os potenciais de ação, que tipicamente ocorre nos

compartimentos proximais dos axônios das células piramidais (Beierlein et al., 2003;

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66

Druga, 2009 Markran et al., 2004; Zaitsev et al., 2005; 2009). Esse tipo de integração

sináptica estabelecida entre os neurônios piramidais e os interneurônios está envolvido na

geração de oscilações neuronais sincrônicas, mecanismo através do qual regiões cerebrais

específicas estabelecem redes funcionais transitórias para percepção, cognição e ação

(Freund, 2003; Freund & Ketona, 2007; Makram et al., 2004; Tarczy-Homoch et al.,

1998; Zaitsev et al., 2005; Varela et al., 2001).

Funcionalmente, as células imunorreativas para CB e CR apresentam

propriedades fisiológicas similares, mas diferem nos seus padrões conectivos com

elementos pré e pós-sinápticos (DeFelipe, 2002; DeFelipe et al., 1999; Druga, 2009).

Numerosas células imunorreativas para CB e CR apresentam um padrão dendritico e

axonal com orientação vertical, provavelmente estabelecendo um sistema inibitório

colunar (DeFelipe, 2002). Não obstante, interneurônios imunorreativos para CB

frequentemente estabelecem sinapses com terminações distais de células piramidais na

camada I. Esse fato sugere que, em uma coluna cortical, os interneurônios imunorreativos

para CB estabelecem contatos sinápticos com processos dendriticos distais, modulando o

processamento dendrítico e a integração das aferências sinápticas das células piramidais,

afetando fortemente a relação dos neurônios piramidais com aferências sinápticas

oriundas das camadas supra e infragranulares. (DeFelipe, 1997; 2002; del Rio &

DeFelipe, 1997; Markram et al., 2004). Assim os interneurônios imunorreativos para CB

são muito bem posicionados para modular seletivamente as interações entre as aferências

oriundas das diferentes camadas corticais.

Células imunorreativas para CR estabelecem conexões sinápticas

preferencialmente com dendritos de outros neurônios GABAérgicos. Em um estudo

realizado por Melchitzky e Lewis (2001) no córtex pré-frontal dorsolateral de macacos,

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67

foi demonstrado que neurônios imunorreativos para CR recebem uma menor densidade

de sinapses excitatórias, em comparação com dendritos imunorreativos para PV.

Tomadas em conjunto, essas evidências sugerem que os interneurônios imunorreativos

para CR constituem um sistema cuja atividade pode mediar uma rede global de

desinibição (Zeitsev et al., 2005).

5.4 Contextualizando os diferentes padrões da arborização dendrítica.

A arborização dendrítica dos neurônios recebe milhares de sinapses, com efeitos

excitatórios ou inibitórios, rápidos ou lentos, ionotrópicos ou metabotrópicos. Os

dendritos formam uma unidade integrativa funcional e estruturalmente complexa. Os

padrões de ativação das entradas sinápticas determinam se um neurônio disparará um

potencial de ação e como ele responderá a outras ativações sinápticas no futuro (Yuste &

Tank 1996).

A eferência da maioria dos neurônios é expressa como frequência de disparos de

potencias de ação e depende do valor da corrente que alcança o soma. Por outro lado, tal

corrente depende da somação das correntes de eventos sinápticos individuais e de

diversos fatores que influenciam nessa somação: se o dendrito é passivo ou ativo, se as

sinapses são proximais ou distais.

Uma importante questão é de que forma centenas de milhares de sinapses

interagem na arborização dendrítica, afetando sua saída. Alguns aspectos dependem da

estrutura dos neurônios. A influência de uma única entrada sináptica é particularmente

dependente dos dendritos, enquanto que a saída é dependente das distribuições setoriais

do axônio.

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Recentes avanços em métodos de aquisição da morfologia neuronal digitalizada

em 3D têm permitido medidas quantitativas precisas da complexidade dendrítica. A

disponibilidade desses dados tem levado a uma renovação do interesse por identificar

parâmetros morfológicos capazes de elucidar de que forma a complexidade dendrítica

influencia nas funções neuronais (Rothine et al., 2005) .

Diferenças no tamanho e no grau de complexidade das árvores dendríticas podem

influenciar a capacidade computacional dos neurônios a nível celular e subcelular (Elston

2003; Jacobs and Scheibel, 2002; Spruston, 2008), assim como o número de ramificações

influencia diretamente na capacidade de compartimentalização do processamento

dendrítico (Elston, 2003; Jelinek et al., 2005; Mel, 1999; Rall et al., 1992; Segev, 1998;

Spruston et al., 1999; Stuart et al., 1997).

As diferenças estruturais entre as camadas corticais podem refletir diferenças no

processamento da informação que chega ao córtex (Elston, 2003). Por exemplo,

neurônios corticais caracterizados por pequenas árvores dendríticas têm a capacidade de

integrar aferências em menores áreas, quando comparados às grandes células. Além

disso, a integração das aferências leva à compartimentalização do processamento nas

árvores dendríticas. Como resultado, distintos padrões de ramificações podem mediar

diferentes formas de processamento na árvore dendrítica antes que o sinal chegue ao

corpo celular. Portanto há maior potencial para compartimentalização em camadas que

apresentam células com alta complexidade dendrítica, em comparação com camadas que

apresentam células com menor grau de complexidade ( Benavides et al., 2005; Eslton,

2003)

Diferenças nos parâmetros morfológicos como comprimento dendrítico, volume e

número de ramificações estão intimamente relacionadas com as propriedades

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eletrofisiológicas dos neurônios (Rothnie et al., 2006). Além disso, diferenças na

distribuição e configuração espacial das aferências na árvore dendrítica podem

influenciar tanto a capacidade funcional dos neurônios como o armazenamento de

memorias dos circuitos corticais (Elston et al., 2003; Stepanyants et al., 2002).

Estudos recentes têm relacionado o potencial de retro-propagação com o

fenômeno da plasticidade sináptica, o qual age como um mecanismo de detecção de

coincidência temporal entre a atividade pré-sináptica e os potenciais de ação pós-

sinápticos (Rothine et al., 2006). A coincidência temporal das aferências sinápticas com o

potencial de ação pós-sináptico pode disparar uma mudança na eficácia sináptica análoga

a lei de Hebb ( Yuste & Denk, 1996).

Estudos de modelagem têm demonstrado diferenças na eficácia da retro-

propagação em diferentes tipos neuronais que podem ser atribuídas a variações da

morfologia dendrítica (Segev & London, 2000; Vetter et al., 2001). Em particular, a

presença de bifurcações e a complexidade das ramificações podem influenciar da

extensão da retro-propagação através das árvores dendríticas (Vetter et al., 2001). Células

com grandes diâmetros dendríticos que apresentem um número reduzido de ramificações

podem apresentar retro–propagação rápida resultando potencias de ação em série

(Krichmar et al., 2002).

As respostas eletrofisiológicas neuronais em resposta a uma despolarização são

correlacionadas com a complexidade da árvore dendrítica, assim células com pequenos

campos dendriticos necessitaria uma menor corrente de despolarização para sair do seu

estado de repouso (Krichmar et al., 2002). A morfologia dendrítica também pode

influenciar no padrão de disparo apresentado pela célula (Krichmar et al, 2002), assim

como na transição entre padrões de disparos (Krichmar et al., 2002).

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Em conjunto, esses estudos têm demonstrado o papel crucial da distribuição da

massa dendrítica e da complexidade da arborização dendrítica na integração neuronal,

plasticidade sináptica e padrão de disparos que definem a função neuronal.

5.5 Considerações sobre o emprego de ferramentas estereológicas na estimativa

numérica dos grupos neuronais imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio no

córtex pré-frontal do sagui.

No presente trabalho estimamos o número de células imunorreativas para

calbindina, calretina e parvalbumina nas regiões medial, dorsolateral e orbital do córtex

pré-frontal do sagui, através de métodos estereológicos. A maioria dos métodos de

contagem utilizando a microscopia de luz se baseia em princípios geométrico-estáticos.

Desse modo, para a obtenção de resultados consistentes é necessário um grande número

de determinações, com um grande consumo de tempo. Em tecidos biológicos como o do

cérebro, geralmente os grupos celulares são extensos e esparsos, fazendo-se necessário o

fracionamento da região em secções seriadas, de modo a obter um mapeamento completo

da região de interesse. Através de contagem celular nessas secções podemos estimar o

tamanho real da população. No entanto, estimar o número dessas grandes populações

através de contagens extensivas se torna pouco prático. Nesses casos, uma abordagem

amplamente aceita para estimar o tamanho de uma determinada população celular se faz

pelo uso de técnicas estatísticas estereológicas.

A estereologia é um método que utiliza amostras sistemáticas para fornecer um

número estimado sem viés. Através de abordagens estereológicas podemos obter um

número fidedigno de células não subestimado, o que poderia ocorrer se utilizássemos

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métodos convencionais (Mandarin Lacerda, 2003). A aplicação de contagens sistemáticas

diminui a necessidade de contagens exaustivas, reduzindo o número total de células

contadas necessárias para se fazer uma estimativa precissa do tamanho de uma

determinada população celular (Glaser & Wilson, 1998). Em outras palavras, aplicando

amostragens sistemáticas, podemos estimar de uma maneira robusta o número real de

uma população celular em uma determinada área de interesse, a partir do número total de

células contadas em determinados espaços de contagem, e da probabilidade amostral

(Schmitz & Hof, 2005).

Os métodos estereológicos desenvolvidos nas ultimas décadas têm revolucionado

as estimativas quantitativas das grandes populações celulares no cérebro, fazendo com

que sua utilização seja aplicada sempre que dados tridimensionais precisem ser extraídos

a partir de medições em secções (Jelsing et al, 2006). O fracionamento óptico é um

método estereológico sem viés, o qual tem seu principio em amostragens uniformes,

sistemáticas e aleatórias que permitem inferir de maneira robusta, a partir do número total

de partículas contadas, o número de células de uma população (Gundersen, 1986;

Gurdesen et al., 1988). A estimativa fornecida pelo emprego do fracionamento óptico

apresenta vantagens do ponto de vista estatístico e de esforço empreendido em relação a

outras metodologias estereológicas (Schmitz & Hof, 2005).

Na estereologia a precisão do tamanho estimado de uma população celular

baseada no fracionamento óptico é aferida pela estimativa do coeficiente de erro (CE).

Um estudo realizado por Glaser e Wilson (1998) através de simulações computacionais

revelou que o coeficiente de Scheaffer relacionado a uma estimativa populacional através

do fracionamento óptico é o que mais se aproxima de um coeficiente de erro real. O

coeficiente de Scheaffer representa o grau de incerteza relacionado com potenciais erros

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metodológicos, sendo esperado que esse coeficiente contribua menos que 50% para a

variação total (CE2/CV2 <0.5). Na metodologia aplicada no presente trabalho, o

coeficiente de erro para todas as estimativas foi menor 0.5, evidenciando que os

potenciais erros metodológicos empregados nas contagens foram mínimos.

O coeficiente de variação biológica foi outro parâmetro utilizado para avaliar a

metodologia aplicada na estimativa dos grupos celulares. A variação biológica consiste

na variação natural, de ocorrência fisiológica, independente de variáveis pré-analíticas.

Esse coeficiente é dado pela formula matemática (CVB2 = CV2 – CE2). Para considerar a

metodologia aplicada adequada, é preciso que a variação biológica contribua com mais

de 50% para o coeficiente de variação global. Desse modo o coeficiente de erro é

adequado sempre que esse contribuir menos que a variação biológica para o coeficiente

de variação global.

Quando comparamos o número estimado de células imunorreativas para as três

proteínas ligantes de cálcio por região entre os indivíduos de cada grupo, observamos

uma diferença de 21% na região medial, 15% na região dorsolateral e de 12% na região

orbitofrontal para CB. Para CR, observamos uma diferença de 15% na região medial,

14% na região dorsolateral e de 8% na região orbitofrontal entre os indivíduos do grupo.

No caso da PV, a diferença entre os indivíduos para a região medial foi de 23%, 12%

para a região dorsolateral e de 30% para a região orbitofrontal. Essas diferenças podem

ser explicadas pela variação biológica entre os indivíduos, assim como por variações

relacionadas ao processamento do material biológico. Entre as variáveis mais comuns

podemos exemplificar a fixação do tecido durante o processo de perfusão ou as etapas de

criproteção às quais o tecido foram submetidos. Essas variáveis podem influenciar

diretamente o processo imunohistoquímico. Pequenas variações na espessura das secções

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teciduais podem acarretar diferenças na penetração dos anticorpos, constituindo outra

variável que se deve levar em consideração para explicar a diferença do número de

células imunorreativas entre os animais. Desse modo, se houver uma baixa penetração do

anticorpo no tecido, consequentemente haverá um baixo padrão de reatividade revelada

pelo cromógeno, no nosso caso o DAB. Assim muitas vezes a célula reativa ficará

mascarada pelo padrão reativo da neuropila, fazendo com a mesma não seja identificada

durante a contagem. Devemos considerar também a diferença de idade entre os

indivíduos. No nosso caso os animais foram cedidos pelo IBAMA como animais adultos

jovens, mas sem uma estimativa exata da faixa etária.

5.6 Homogeneidade versus heterogeneidade da arquitetura inibitória cortical.

A imunohistoquímica para as proteínas ligantes de cálcio tem sido usada para

parcelamento de áreas corticais (Bourne et al., 2007; Ding et al., 2009; Ongur et al.,

2003; Nimchinsky et al., 1997). Entretanto, existem poucos estudos quantitativos que

examinem a distribuição dos interneurônios GABAérgicos no córtex pré-frontal de

primatas (Condé et al., 1999; DeFelipe et al., 1999; Dombrowski et al., 2001; Elston &

Gonzales-Albo, 2003; Sherwood et al., 2010).

No presente trabalho, observamos que os grupos imunorreativos para as diferentes

proteínas ligantes de cálcio podem apresentar diferenças em relação a densidade celular

de acordo com as características citoarquitetonicas de cada região investigada. Desse

modo as regiões que compõe o córtex pré-frontal apresentam distintos perfis de

densidade celular e citoarquitetura, os quais podem ser descritos de uma maneira

quantitativa. Considerando esses distintos perfis, identificamos a região dorsolateral

como uma região granular caracterizada pela presença das seis camadas celulares bem

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definidas. Essa região apresentou uma alta densidade celular para o grupo CR-ir quando

comparada a densidade celular apresentada pelo grupo na região orbital a qual foi

caracterizada como uma região disgranular assim como a região medial caracterizada

como região agranular caracterizada pela ausência da camada celular IV. Por outro lado a

densidade celular dos grupos CB-ir e PV-ir se mantiveram homogênea através das três

regiões analisadas.

Quando comparmos a densidade celular entre os grupos imunorreativos, grupo

CR-ir monstrou uma densidade celular duas vezes maior quando comparado a densidade

do grupo CB-ir assim como do grupo PV-ir. Essas diferenças foram mais evidentes

quando comparamos a densidade celular entre os grupos nas região dorsolateral granular

e na região orbito-frontal disgranular. Entretanto a região medial agranular foi

caracterizada por uma certa homogeneadade para a densidade celular entre os grupos.

Considerando a análise estereológicas para os grupos celulares imunorreativos para as

proteínas ligantes de cálcio, o córtex pré-frontal pode ser fracionado em três regiões

distintas levando em consideração o perfil citoarquitetônico característico de cada região,

assim como a densidade celular dos grupos CB-ir, CR-ir e PV-ir em cada uma das regiões

analisadas.

Diferenças regionais para a densidade celular dos grupos neuronais

imunorreativos para as proteínas ligantes de cálcio têm sido descritas em diferentes

espécies primatas (DeFelipe et al., 1999, Dombrowski et al., 2001; Elston e Albo, 2003;

Kritzer et al., 1992). Quando comparamos os resultados descritos em diferentes trabalhos

aos nossos achados, encontramos algumas diferenças dignas de nota entre as espécies no

que tange à distribuição dos grupos neuronais imunorreativos para CB, CR e PV.

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Resultados descritos por Elston e Gonzalez-Albo (2003) foram caracterizados por

diferenças na densidade celular dos grupos imunorreativo para CB entre a região

dorsolateral granular e a região orbital disgranular no córtex pré-frontal do macaco da

noite (Aotus trivirgatus). Por outro lado os grupos PV-ir e CR-ir, não apresentam

diferenças significativas, sendo o grupo CB-ir apresentou uma maior densidade celular

entre os grupos analisados.

Dombrowski e colaboradores (2001) demonstraram que as áreas dorsolaterais

granulares do córtex pré-frontal do Rhesus apresentam uma alta densidade celular para

PV, quando comparada as regiões medias agranulares e as regiões orbitais disgranulares.

Enquanto o grupo CB-ir apresentou uma maior densidade na região órbito-frontal,

quando comparada as regiões dorsais e orbitais. Por outro lado, o grupo CR-ir apresentou

uma distribuição homogênea entre as áreas analisadas. Múltiplas comparações entre as

áreas demonstraram que grupo PV-ir apresentou uma densidade celular duas vezes maior

em relação a densidade celular do grupo CB-ir e ao grupo CR-ir em todas as regiões do

córtex pré-frontal analisadas.

O estudo realizado por Condé e colaboradores (1999) no córtex pré-frontal do

macaco cynomolgus (Macaca fascicularis) demonstrou uma distribuição homogênea

entre grupos imunorreativos para as proteínas ligantes cálcio nas diferentes regiões

corticais. No refererido estudo, análises quantitativas demonstraram que grupos CR-ir,

CB-ir e PV-ir não se diferenciam em relação as suas densidades celulares entre as

regiões granulares e regiões agranulares analisadas. No entanto a análise de variância

revelou diferenças sutis na densidade celular entre os grupos analisados. As análises,

demonstraram que o grupo CR-ir, apresentou uma densidade celular aproximadamente

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duas vezes maior, quando comparado aos grupos CB-ir e PV-ir em todas as áreas

analisadas.

Comparações entre áreas de diferentes modalidades corticais tem demonstrado

uma densidade de interneurônios imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio

aproximadamente duas vezes maior nas áreas do córtex pré-frontal quando comparadas

com as outras áreas corticais, refletindo especializações regionais na circuitaria dos

interneurônios (Eslton e Gonzalez-Albo, 2003). Por outro lado, as diferenças regionais

da densidade celular entre os grupos imunorreativos para proteínas ligantes de cálcio

pode variar de acordo com o antígeno. Por exemplo, a CR apresentou uma diminuição

progressiva nas regiões órbito-frontal e medial, enquanto que os grupos CB e PV

apresentaram diminuições sutis entre as regiões.

Como mencionado acima, a variação quantitativa nos diferentes estudos pode ser

atribuída a diferentes fatores, como espécies utilizadas como modelo, fatores que

interferem nas técnicas aplicadas como retração tecidual, penetração do anticorpo, assim

como a diferenças metodológicas aplicadas na estimativa do número de células. Além

dos fatores descritos, alguns dos estudos mapearam a distribuição dos grupos de celulares

exclusivamente em regiões disgranulares ( Elston & Gonzalez Albo,2003) ou em regiões

eulaminadas (Condé et al., 1999; Elston & Gonzalez-Albo, 2003).

De que forma surgem as características celulares e moleculares específicas nas

diferentes regiões do córtex pré-frontal? Os padrões de proliferação celular, duração do

ciclo celular, migração e eliminação neuronal apresentam papeis fundamentais na

formação do córtex cerebral (para revisão Caviness et al., 1995; McConnell, 1991),

podendo ser responsáveis pelos distintos perfis das diferentes áreas que formam o córtex

pré-frontal. De acordo com as estimativas de Canviness e colaboradores (1995), durante a

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fase inicial do desenvolvimento cortical, a duração do ciclo celular é mais longa sendo

que poucas células migram para o córtex, sugerindo que as áreas do córtex pré-frontal

medial agranular que apresentam uma menor densidade celular completam seu

desenvolvimento em um período mais curto que áreas eulaminadas. Nossos dados

demonstram que a densidade celular foi aproximadamente equivalente nas camadas

profundas em todas as regiões do córtex pré-frontal, enquanto que as camadas superiores

apresentaram diferenças sutis entre as regiões, de sorte que a região medial agranular

apresentou um número menor de células em relação as áreas dorsolaterais eulaminadas.

Essa evidencia é consistente com a fase inicial uniforme do desenvolvimento cortical

descrito por Rakic (1988), sugerindo que o período de desenvolvimento pode ser

prolongado nas regiões eulaminadas. A alta densidade celular na região dorsolateral pode

ser explicada pela alta densidade nas camadas II/III, que são formadas após as camadas

mais profundas de acordo com o padrão de desenvolvimento “inside-out” apresentado

pelo córtex (Rakic, 2009).

Nossos dados demonstram que os números de neurônios imunorreativos para CB

e PV não diferem nas distintas áreas do córtex pré-frontal, revelando certas características

comuns na organização neurobiológica do córtex dos primatas. No entanto algumas

características regionais da população dos neurônios GABAérgicos pode ser relacionada

com o perfil específico do processamento cortical de cada área. Em particular a inibição

intracolunar por neurônios GABAérgicos tem sido implicada aos padrões temporais de

atividade das assembleias neuronais (Markram et al., 2004), dessa forma, especializações

dos circuitos inibitórios podem contribuir para as diferenças no processamento entre as

modalidades sensórias. Similarmente nossos resultados sugerem que certos processos

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computacionais das áreas do córtex pré-frontal do sagui são preferencialmente

relacionados a padrões citoarquitetônicos específicos.

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79

6 Conclusão

A imunohistoquímica para CB, CR e PV revelou detalhes da morfologia

somatodendritica e axonal de subpopulações neuronais, permitindo estudo

morfofuncional detalhado. A maioria das células imunorreativas apresentaram

características de interneurônios, caracterizados por diferentes padrões dendríticos e

axonais. No entanto fomos capazes de classificar cada grupo celular através de

características morfológicas. Juntamente com a caracterização axonal, a caracterização

através de parâmetros morfométricos das árvores dendríticas nos fornece um ótimo

arcabouço para a classificação morfofuncional dos diferentes grupos de interneurônios.

A aplicação das técnicas de imunohistoquímica juntamente com a aplicação de

ferramentas estereológicas nos permitiu caracterizar a distribuição dos grupos celulares

de acordo com o perfil citoarquitetonico cada região analisada no córtex pré-frontal do

sagui. Dessa maneira fomos capazes de fracionar o córtex pré-frontal em três regiões

distintas apoiadas na densidade e distribuição celular de cada cada grupo imunorreativo

associada ao perfil citoarquitetônico de cada uma, revelando semelhanças e as diferenças

intrínsecas na organização dos circuitos inibitórios.

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