CARACTERIZAÇÃO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS ?· aclorofilados. São predominantemente unicelulares,…

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<ul><li><p>SILVIA TEREZA AZDO LOUREIRO </p><p>CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA - PERNAMBUCO </p><p>QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE </p><p>RECIFE </p><p>2002 </p></li><li><p> 2</p><p>SILVIA TEREZA AZDO LOUREIRO </p><p>CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA - PERNAMBUCO </p><p>QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE </p><p>Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao </p><p>em Biologia de Fungos da Universidade Federal de </p><p>Pernambuco, para obteno de Ttulo de Mestre. </p><p>Orientadora: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz </p><p>Cavalcanti. </p><p>Recife </p><p>2002 </p></li><li><p> 3</p><p>CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA PERNAMBUCO </p><p>QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE </p><p>Dissertao de mestrado aprovada pela banca examinadora em 26 de fevereiro de 2002 Examinadores: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti ( orientadora Depto. de Micologia UFPE) Dr. Walderez Gambale (Depto. de Microbiologia USP) Dr. Jos Zanon de Oliveira Passavante (Depto. de Oceanografia UFPE) </p></li><li><p> 4</p><p>DEDICO </p><p>A DEUS </p><p>Presente em todos os momentos, principalmente os mais difceis, concedendo </p><p>oportunidades de aprendizado, revelando seu poder e glria a cada instante de minha </p><p>vida. </p><p>A minha me, </p><p>Terezinha Azdo Loureiro, pelo incentivo, apoio, compreenso e amor, sem este apoio </p><p>eu nada seria. </p><p>A minha filha </p><p>Carolina Tereza Azdo de Arajo, pela compreenso e amor. </p><p>A minha sobrinha </p><p>Joanalice Azdo que me ajudou nessa trajetria, to importante da minha vida. </p><p>Aos meus colegas, pessoas que me ajudaram no transcorrer desta pesquisa, acreditando </p><p>na seriedade do meu trabalho. </p></li><li><p> 5</p><p>AGRADECIMENTOS </p><p>Ao Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa do </p><p>Prof. Dr. Francisco Cordeiro Neto, pelas facilidades concedidas, viabilizando a </p><p>realizao desta pesquisa. </p><p> Coordenao do Programa de Ps-Graduao em Biologia de Fungos da </p><p>Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa da Profa Neiva Tinti de Oliveira, pelas </p><p>facilidades concedidas e estmulos recebidos durante a realizao desta pesquisa. </p><p>A Secretaria de Educao do Estado de Pernambuco pela dispensa concedida. </p><p> Profa Dra. Maria Auxiliadora Cavalcanti pela valiosa orientao, dedicao e </p><p>incentivos no decorrer de todo o curso e principalmente no desenvolvimento desta </p><p>pesquisa. </p><p>Ao Prof. Dr. Jos Zanon de Oliveira Passavante, do Departamento de Oceanografia da </p><p>Universidade Federal de Pernambuco, pela dedicao, incentivo e sugestes no </p><p>transcorrer desta pesquisa. </p><p> Doutoranda Rejane Pereira Neves pela colaborao na identificao das espcies </p><p>isoladas. </p><p> minha me Terezinha Azdo pelo apoio dado em todos os momentos difceis na </p><p>elaborao desta pesquisa. </p><p> minha famlia que sempre me apoiou e incentivou durante a minha vida acadmica. </p><p> Companhia Pernambucana de Controle da Poluio Ambiental e Administrao de </p><p>Recursos Hdricos ( CPRH) pelo fornecimento da Anlise da gua das praias de casa </p><p>Caiada e Bairro Novo, Olinda, Pernambuco. </p></li><li><p> 6</p><p>Aos meus amigos de curso que participaram desta etapa de minha vida acadmica e </p><p>pessoal dando um timo suporte afetivo e a todos que contriburam direta ou </p><p>indiretamente para a realizao deste pesquisa. </p></li><li><p> 7</p><p>LISTA DE FIGURAS </p><p>Figura 1 Mapa da rea de estudo ( Olinda-PE) situando as reas de coletas nas praias </p><p>de Casa Caiada e Bairro Novo .............................................................................25 </p><p>Figura 2 Frequncia de ocorrncia de espcies de leveduras isoladas nas praias de Casa </p><p> Caiada e Bairro Novo (Olinda, Pernambuco) .................................................... 50 </p><p>Figura 3 Leveduras isoladas no perodo de vero nas praias de Casa Caiada e Bairro </p><p>Novo, Olinda, Pernambuco...................................................................................51 </p><p>Figura 4 Leveduras isoladas no perodo de inverno nas praias de Casa Caiada e Bairro </p><p>Novo, Olinda, Pernambuco...................................................................................52 </p><p>Figura 5 Dendrograma de similaridade das espcies isoladas nas praias de Casa Caiada </p><p>e Bairro Novo, nos perodos de vero e inverno..............................................46 </p><p>Figura 6 .............Expresso da atividade fosfolipsica positiva de Rhodotorula minuta, evidencia </p><p>da pela formao de halo () ..............................................................................56 </p><p>Figura 7 Expresso da atividade protesica positiva de Candida diddensiae, evidenciada </p><p>pela formao de halo ( ) .................................................................................... 56 </p></li><li><p> 8</p><p>LISTA DE TABELAS </p><p>Tabela 1 Leveduras isoladas da praia de Casa Caiada no perodo de vero. ...................37 </p><p>Tabela 2 Leveduras isoladas da praia de Casa Caiada no perodo de inverno ...............38 </p><p>Tabela 3 Leveduras isoladas da praia de Bairro Novo no perodo de vero.................... 39 </p><p>Tabela 4 Leveduras isoladas da praia de Bairro Novo no perodo de inverno ................ 40 </p><p>Tabela 5 Dados de colimetria das praias de Casa Caiada e Bairro Novo durante os </p><p>perodos de coletas .............................................................................................41 </p><p>Tabela 6 Unidades formadoras de colnias de leveduras isoladas nas praias de Casa </p><p>Caiada e Bairro Novo, durante os perodos de vero e inverno......................42 </p><p>Tabela 7 Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados do </p><p>solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo, Olinda- Pernambuco ............ 49 </p><p>Tabela 8 Caractersticas de patogenicidade detectadas nas amostras de leveduras </p><p> isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo.........................................53 </p></li><li><p> 9</p><p>RESUMO </p><p>Com o objetivo de isolar, identificar e caracterizar amostras de leveduras </p><p>quanto a fatores de patogenicidade, foram coletadas 16 amostras de solo e 16 amostras </p><p>de gua nos meses de dezembro/2000 e fevereiro/2001, correspondendo ao perodo de </p><p>vero e junho e julho/2001, correspondendo ao perodo de inverno, considerando a </p><p>baixa-mar e preamar. As amostras foram coletadas em superfcie e profundidade, </p><p>sendo 20 cm para o solo e 1m para a gua. Foi utilizado 50g de solo e suspenso em 90 </p><p>ml de gua destilada esterilizada. Dessa suspenso 0,5 ml foram semeados em triplicata </p><p>em Sabouraud extrato de levedura, acrescido de cloranfenicol, contidos em placas de </p><p>Petri. Nas mesmas condies de semeio foram utilizados 0,5ml de gua. Foram isoladas </p><p>58 amostras de leveduras distribudas em 4 gneros e 31 espcies: Candida (19), </p><p>Brettanomyces (3), Rhodotorula (4) e (5) de Trichosporon. A frequncia de ocorrncia </p><p>demonstrou que Brettanomyces bruxellensis pode ser considerada abundante em solo </p><p>de superfcie na praia de Casa Caiada. Para as caractersticas de patogenicidade </p><p>observou-se que das 58 amostras testadas 44 cresceram a 37C, apresentando bom </p><p>crescimento, tanto quanto temperatura ambiente; na deteco da atividade </p><p>fosfolipsica e protesica 7 e 3 amostras apresentaram atividade enzimtica positiva, </p><p>respectivamente. </p></li><li><p> 10 </p><p>ABSTRACT </p><p>The objetive was to isolate, to identify and to distinguish samples of yeast by </p><p>pathogenic fators. The authn collected 16 samples of sand and 16 of water in </p><p>december/2000 and february/2001, summer time and june and july/2001, winter time. </p><p>The samples were collected from the surface (20cm) and profundity depth (1m). It was </p><p>used 50g of sound in 90ml of esterilized destilled water from where was removed 0,5ml </p><p>seed three times on Petri`s plaque with Sabouraud and choranphenicol at the same </p><p>condition the water was seed. The frequency of the occurrence demonstrated that </p><p>Brettanomyces bruxellensis can be considered plentiful for soud of the shore of Casa </p><p>Caiada beach. From 58 (fifty eight) samples 44 presented a good growth on 37C </p><p>either on ambiental temperature for pathogenic characteristics. 7 samples showed </p><p>phospholipasic activity and 3 proteasic one. </p></li><li><p> 11 </p><p>SUMRIO </p><p>AGRADECIMENTOS </p><p>LISTA DE FIGURAS </p><p>LISTA DE TABELAS </p><p>RESUMO </p><p>ABSTRACT </p><p>1. INTRODUO..................................................................................13 </p><p>2. REVISO DE LITERATURA .........................................................15 </p><p>2.1. Ocorrncia de leveduras de ambientes marinhos ................................ 15 </p><p>2.2. Caracterizao de leveduras quanto a fatores de patogenicidade ........18 </p><p>3. DESCRIO DA REA DE ESTUDO ............................................22 </p><p>4. MATERIAL E MTODOS .............................................................. 26 </p><p>4.1.Coleta do solo.....................................................................................26 </p><p>4.2. Coleta da gua ................................................................................... 26 </p><p>4.3. Meios de cultura utilizados ...............................................................26 </p><p>4.4. Isolamento e purificao dos fungos ................................................. 30 </p><p>4.5. Identificao dos fungos do solo e da gua ........................................31 </p><p>4.6. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados </p><p>do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo.............................. 31 </p><p>4.6.1. Altura das mars ............................................................................. 31 </p><p>4.6.2. Salinidade da gua. .........................................................................31 </p><p>4.6.3. pH ( potencial hidrogeninico do solo e da gua)............................32 </p><p>4.6.4 Temperatura do solo e da gua........................................................32 </p><p>4.7. Pluviometria .....................................................................................32 </p><p>4.8. Colimetria da gua ...........................................................................32 </p><p>4.9. Deteco de caractersticas de patogenicidade ..................................32 </p><p>4.9.1 Crescimento a 37C ........................................................................32 </p><p>4.9.2 Deteco de fosfolipase ..................................................................33 </p></li><li><p> 12 </p><p>4.9.3 Deteco de protease ....................................................................... 33 </p><p>4.10. Frequncia de ocorrncia ................................................................ 33 </p><p>4.11. Anlise de similaridade.....................................................................34 </p><p>5. RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................35 </p><p>5.1. Isolamento e identificao das leveduras do solo e da gua, durante os </p><p>perodos de vero e inverno nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo.. </p><p> .........................................................................................................35 </p><p>5.2. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados </p><p>do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo.............................. 44 </p><p>5.3. Frequncia de ocorrncia de leveduras isoladas nas praias de Casa </p><p>Caiada e Bairro Novo ....................................................................... 44 </p><p>5.4. Anlise de similaridade entre as espcies isoladas..............................45 </p><p>5.5. caracterizao de fatores de patogenicidade de amostras de leveduras </p><p> isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo..............................47 </p><p>6. CONCLUSES ................................................................................... 57 </p><p>7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................. 58 </p></li><li><p> 13 </p><p>1. INTRODUO </p><p>As leveduras so microrganismos eucariontes, quimiorganotrficos, </p><p>pertencentes ao Reino Fungi. No possuem mecanismos de locomoo e so </p><p>aclorofilados. So predominantemente unicelulares, reproduzem-se sexuadamente por </p><p>ascosporos e assexuadamente por brotamento, cissiparidade ou a combinao desses </p><p>dois processos. Alguns gneros caracterizam-se por apresentar apenas blastocondios, </p><p>enquanto outros, alm de blastocondios, formam pseudo-hifas e hifas rudimentares. As </p><p>leveduras so filogeneticamente heterogneas, pertencendo as divises: Deuteromycota </p><p>(Fungi Imperfect), classe Blastomycetes, (reproduo assexuada), Ascomycota e </p><p>Basidiomycota, onde o mecanismo de reproduo sexuado (Lacaz et al.,1991). </p><p> Alguns representantes das leveduras so importantes porque podem causar </p><p>enfermidades em plantas e animais incluindo o homem (Rose &amp; Harrison, 1970; </p><p>Lodder, 1970; Kreger-van Rij, 1984); outros refletem importncia como agentes </p><p>biodeterioradores de produtos naturais (frutas, sucos, doces), ou industrializados como </p><p>papel, medicamentos, vinhos, carnes (Cook, 1958; Frazier, 1976). Em contra partida, a </p><p>biotecnologia tem utilizado as leveduras nos processos de biodegradao atravs da </p><p>indstria de alimentos e medicamentos, assim como nos processos de degradao de </p><p>materiais e substncias poluentes do solo e de ambientes aquticos (Cook, 1958; Rose e </p><p>Harrison, 1970). </p><p> O continente brasileiro que em sua maior parte est situado na regio tropical </p><p>desponta um grande interesse em ampliar os conhecimentos sobre fungos de ambiente </p><p>marinho no Brasil, uma vez que poucas so as espcies referidas para o nosso pas </p><p>(Pinto et al., 1992). </p><p>No Brasil os estudos de leveduras isoladas da gua do mar foi iniciado em </p><p>Florianpolis por Faraco &amp; Faraco (1960) e posteriormente em Recife por Queiroz </p><p>(1972). Paula et al., (1983), em So Paulo revelaram a possibilidade de espcies de </p><p>Candida serem um novo indicador de poluio em guas de esturios marinhos. </p><p>Alguns autores mencionam que a habilidade de certos fungos crescerem a 37C e </p><p>de produzirem determinadas enzimas como por exemplo: fosfolipase, protease e outras, </p><p>pode estar associada a patogenicidade (Hanel, 1988; Samuels et al., 1989). </p><p>A fosfolipase expressa, teoricamente, aspectos relacionados com fatores de </p><p>virulncia em espcies de Candida. Vrias espcies de Candida de importncia mdica </p></li><li><p> 14 </p><p>secretam uma proteinase, que sugerida como fator de virulncia; entretanto, esta </p><p>enzima parece no atuar no fator de virulncia especfico, porm est envolvida com a </p><p>propagao </p><p>do fungo no hospedeiro, causando conseqentemente o processo invasivo, atravs de </p><p>degradao da pele ou mucosa (Samaranayake et al.,1984). </p><p>As praias de Bairro Novo e Casa Caiada em Olinda Pernambuco, foram </p><p>escolhidas para realizao desta pesquisa, em virtude de serem praias frequentadas por </p><p>turistas e banhistas locais. De acordo com a literatura pesquisada, no existe para a </p><p>cidade de Olinda Pernambuco, estudos referentes ao isolamento, e caracterizao de </p><p>leveduras do solo e gua de reas das referidas praias. </p><p> Considerando a importncia de espcies de leveduras como agentes de micoses, </p><p>justificou-se o isolamento desses microfungos com a caracterizao das espcies </p><p>quanto a fatores de patogenicidade; crescimento a 37C e produo de enzimas, </p><p>fosfolipase e protease. </p></li><li><p> 15 </p><p>2. REVISO DE LITERATURA </p><p>2.1 Ocorrncia de leveduras em ambientes marinhos </p><p>A ocorrncia de leveduras saprbias e potencialmente patognicas em </p><p>diferentes habitats aquticos ou associadas aos mesmos est se tornando assunto de </p><p>grande interesse, considerando que estes organismos esto presentes em rios,lagos, </p><p>mares, guas profundas e relacionados fauna e flora desses ambientes, bem como em </p><p>reas costeiras destinadas ao lazer. Neste sentido, h informaes que enfatizam a </p><p>existncia de leveduras importantes na patologia humana e animal (Fell &amp; van Udem, </p><p>1963; Volz et al., 1974 e Brisou, 1975). </p><p>Fell &amp; van Uden (1963) e Meyers &amp; Ahearn (1974) referem que guas do mar </p><p>no sul da Flrida, altamente poludas por resduos domsticos tem um grande nmero </p><p>de espcies de Candida, Trichosporon, Torulopsis e Rhodotorula. Por outro lado, </p><p>Ahearn et al., (1962) e Morris (1968) citam espcies de Rhodotorula e Torulopsis como </p><p>usualmente encontradas em todo ambiente marinho. </p><p>Ahearn et al., (1968), confirmaram a alta incidncia de Candida em guas do </p><p>mar poludas por esgotos domsticos no sul da Flrida. </p><p>Considerando que as leveduras so abundantes em guas costeiras (Cooke et al., </p><p>1960; Spencer et al., 1970 e Ahearn, 1973) informaram que este fato pode estar </p><p>relacionado ao arrasto da terra pelos rios e canais, bem como de resduos domsticos e </p><p>industriais que aumentam os nutrientes para gua do mar. </p><p>A maior parte dos trabalhos em isolamento de leveduras de guas de esturio e </p><p>locais prximos a costa marinha tem sido feitos na Europa e Amrica do Norte (Fell et </p><p>al., 1960; Ahearn et al., 1968). </p><p>Ahearn et al., 1968, informaram que nas regies costeiras da Flrida ocorrem </p><p>principalmente Rhodotorula, Candida e Debaryomyces. A distribuio de leveduras em </p><p>ambiente marinho parece ser limitada pelas condies do ambiente devido a fatores </p><p>como: temperatura, pH e baixa concentrao de nutrientes. </p><p>Candida albicans tem sido isolada de gua do mar em praias recreacionais no </p><p>sudeste da Califrnia (U.S.A.) (Dabrowa et al., 1964 e Kishimoto et al., 1969). </p><p>Spencer et al., 1970, estudando guas de ambientes marinhos no sul dos U.S.A, </p><p>argumentaram que o nmero de leveduras torna-se rapidamente elevado aps o despejo </p></li><li><p> 16 </p><p>de resduos domsticos nas guas, fato que pode est correlacionado com o aumento de </p><p>coliformes fecais. </p><p>Morris (1968, Morris 1975) e Meyers &amp; Ahearn, 1974 postularam que a alta </p><p>densidade de leveduras em guas costeiras dos U.S.A. constituda por leveduras de </p><p>vrios gneros, dentre eles, Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula, </p><p>Debaryomyces, Pichia, Hansenula e Rhodosporidium. </p><p>Muitas espcies de leveduras so patgenas ao homem e animais ( Gentles e La </p><p>Touche, 1969). Algumas dessas espcies, principalmente Candida tropicalis, Candida </p><p>pseudotropicalis, Candida parapsilosis, Trichosporon cutaneum e Rhodotorula </p><p>mucilaginosa foram encontradas em reas costeiras na Europa. </p><p>Candida lusitaniae frequente no trato digestivo de animais domsticos, sendo </p><p>detectada em secrees respiratrias e urina humana. Como um saprbio de vida livre </p><p>tem sido isolada em guas costeiras na Flrida U.S.A. ( Lodder, 1970). </p><p>Vrias e

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