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  • SILVIA TEREZA AZDO LOUREIRO

    CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA - PERNAMBUCO

    QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE

    RECIFE

    2002

  • 2

    SILVIA TEREZA AZDO LOUREIRO

    CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA - PERNAMBUCO

    QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE

    Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao

    em Biologia de Fungos da Universidade Federal de

    Pernambuco, para obteno de Ttulo de Mestre.

    Orientadora: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz

    Cavalcanti.

    Recife

    2002

  • 3

    CARACTERIZAO DE LEVEDURAS ISOLADAS DAS PRAIAS DE CASA CAIADA E BAIRRO NOVO, OLINDA PERNAMBUCO

    QUANTO A FATORES DE PATOGENICIDADE

    Dissertao de mestrado aprovada pela banca examinadora em 26 de fevereiro de 2002 Examinadores: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti ( orientadora Depto. de Micologia UFPE) Dr. Walderez Gambale (Depto. de Microbiologia USP) Dr. Jos Zanon de Oliveira Passavante (Depto. de Oceanografia UFPE)

  • 4

    DEDICO

    A DEUS

    Presente em todos os momentos, principalmente os mais difceis, concedendo

    oportunidades de aprendizado, revelando seu poder e glria a cada instante de minha

    vida.

    A minha me,

    Terezinha Azdo Loureiro, pelo incentivo, apoio, compreenso e amor, sem este apoio

    eu nada seria.

    A minha filha

    Carolina Tereza Azdo de Arajo, pela compreenso e amor.

    A minha sobrinha

    Joanalice Azdo que me ajudou nessa trajetria, to importante da minha vida.

    Aos meus colegas, pessoas que me ajudaram no transcorrer desta pesquisa, acreditando

    na seriedade do meu trabalho.

  • 5

    AGRADECIMENTOS

    Ao Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa do

    Prof. Dr. Francisco Cordeiro Neto, pelas facilidades concedidas, viabilizando a

    realizao desta pesquisa.

    Coordenao do Programa de Ps-Graduao em Biologia de Fungos da

    Universidade Federal de Pernambuco, na pessoa da Profa Neiva Tinti de Oliveira, pelas

    facilidades concedidas e estmulos recebidos durante a realizao desta pesquisa.

    A Secretaria de Educao do Estado de Pernambuco pela dispensa concedida.

    Profa Dra. Maria Auxiliadora Cavalcanti pela valiosa orientao, dedicao e

    incentivos no decorrer de todo o curso e principalmente no desenvolvimento desta

    pesquisa.

    Ao Prof. Dr. Jos Zanon de Oliveira Passavante, do Departamento de Oceanografia da

    Universidade Federal de Pernambuco, pela dedicao, incentivo e sugestes no

    transcorrer desta pesquisa.

    Doutoranda Rejane Pereira Neves pela colaborao na identificao das espcies

    isoladas.

    minha me Terezinha Azdo pelo apoio dado em todos os momentos difceis na

    elaborao desta pesquisa.

    minha famlia que sempre me apoiou e incentivou durante a minha vida acadmica.

    Companhia Pernambucana de Controle da Poluio Ambiental e Administrao de

    Recursos Hdricos ( CPRH) pelo fornecimento da Anlise da gua das praias de casa

    Caiada e Bairro Novo, Olinda, Pernambuco.

  • 6

    Aos meus amigos de curso que participaram desta etapa de minha vida acadmica e

    pessoal dando um timo suporte afetivo e a todos que contriburam direta ou

    indiretamente para a realizao deste pesquisa.

  • 7

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1 Mapa da rea de estudo ( Olinda-PE) situando as reas de coletas nas praias

    de Casa Caiada e Bairro Novo .............................................................................25

    Figura 2 Frequncia de ocorrncia de espcies de leveduras isoladas nas praias de Casa

    Caiada e Bairro Novo (Olinda, Pernambuco) .................................................... 50

    Figura 3 Leveduras isoladas no perodo de vero nas praias de Casa Caiada e Bairro

    Novo, Olinda, Pernambuco...................................................................................51

    Figura 4 Leveduras isoladas no perodo de inverno nas praias de Casa Caiada e Bairro

    Novo, Olinda, Pernambuco...................................................................................52

    Figura 5 Dendrograma de similaridade das espcies isoladas nas praias de Casa Caiada

    e Bairro Novo, nos perodos de vero e inverno..............................................46

    Figura 6 .............Expresso da atividade fosfolipsica positiva de Rhodotorula minuta, evidencia

    da pela formao de halo () ..............................................................................56

    Figura 7 Expresso da atividade protesica positiva de Candida diddensiae, evidenciada

    pela formao de halo ( ) .................................................................................... 56

  • 8

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1 Leveduras isoladas da praia de Casa Caiada no perodo de vero. ...................37

    Tabela 2 Leveduras isoladas da praia de Casa Caiada no perodo de inverno ...............38

    Tabela 3 Leveduras isoladas da praia de Bairro Novo no perodo de vero.................... 39

    Tabela 4 Leveduras isoladas da praia de Bairro Novo no perodo de inverno ................ 40

    Tabela 5 Dados de colimetria das praias de Casa Caiada e Bairro Novo durante os

    perodos de coletas .............................................................................................41

    Tabela 6 Unidades formadoras de colnias de leveduras isoladas nas praias de Casa

    Caiada e Bairro Novo, durante os perodos de vero e inverno......................42

    Tabela 7 Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados do

    solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo, Olinda- Pernambuco ............ 49

    Tabela 8 Caractersticas de patogenicidade detectadas nas amostras de leveduras

    isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo.........................................53

  • 9

    RESUMO

    Com o objetivo de isolar, identificar e caracterizar amostras de leveduras

    quanto a fatores de patogenicidade, foram coletadas 16 amostras de solo e 16 amostras

    de gua nos meses de dezembro/2000 e fevereiro/2001, correspondendo ao perodo de

    vero e junho e julho/2001, correspondendo ao perodo de inverno, considerando a

    baixa-mar e preamar. As amostras foram coletadas em superfcie e profundidade,

    sendo 20 cm para o solo e 1m para a gua. Foi utilizado 50g de solo e suspenso em 90

    ml de gua destilada esterilizada. Dessa suspenso 0,5 ml foram semeados em triplicata

    em Sabouraud extrato de levedura, acrescido de cloranfenicol, contidos em placas de

    Petri. Nas mesmas condies de semeio foram utilizados 0,5ml de gua. Foram isoladas

    58 amostras de leveduras distribudas em 4 gneros e 31 espcies: Candida (19),

    Brettanomyces (3), Rhodotorula (4) e (5) de Trichosporon. A frequncia de ocorrncia

    demonstrou que Brettanomyces bruxellensis pode ser considerada abundante em solo

    de superfcie na praia de Casa Caiada. Para as caractersticas de patogenicidade

    observou-se que das 58 amostras testadas 44 cresceram a 37C, apresentando bom

    crescimento, tanto quanto temperatura ambiente; na deteco da atividade

    fosfolipsica e protesica 7 e 3 amostras apresentaram atividade enzimtica positiva,

    respectivamente.

  • 10

    ABSTRACT

    The objetive was to isolate, to identify and to distinguish samples of yeast by

    pathogenic fators. The authn collected 16 samples of sand and 16 of water in

    december/2000 and february/2001, summer time and june and july/2001, winter time.

    The samples were collected from the surface (20cm) and profundity depth (1m). It was

    used 50g of sound in 90ml of esterilized destilled water from where was removed 0,5ml

    seed three times on Petri`s plaque with Sabouraud and choranphenicol at the same

    condition the water was seed. The frequency of the occurrence demonstrated that

    Brettanomyces bruxellensis can be considered plentiful for soud of the shore of Casa

    Caiada beach. From 58 (fifty eight) samples 44 presented a good growth on 37C

    either on ambiental temperature for pathogenic characteristics. 7 samples showed

    phospholipasic activity and 3 proteasic one.

  • 11

    SUMRIO

    AGRADECIMENTOS

    LISTA DE FIGURAS

    LISTA DE TABELAS

    RESUMO

    ABSTRACT

    1. INTRODUO..................................................................................13

    2. REVISO DE LITERATURA .........................................................15

    2.1. Ocorrncia de leveduras de ambientes marinhos ................................ 15

    2.2. Caracterizao de leveduras quanto a fatores de patogenicidade ........18

    3. DESCRIO DA REA DE ESTUDO ............................................22

    4. MATERIAL E MTODOS .............................................................. 26

    4.1.Coleta do solo.....................................................................................26

    4.2. Coleta da gua ................................................................................... 26

    4.3. Meios de cultura utilizados ...............................................................26

    4.4. Isolamento e purificao dos fungos ................................................. 30

    4.5. Identificao dos fungos do solo e da gua ........................................31

    4.6. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados

    do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo.............................. 31

    4.6.1. Altura das mars ............................................................................. 31

    4.6.2. Salinidade da gua. .........................................................................31

    4.6.3. pH ( potencial hidrogeninico do solo e da gua)............................32

    4.6.4 Temperatura do solo e da gua........................................................32

    4.7. Pluviometria .....................................................................................32

    4.8. Colimetria da gua ...........................................................................32

    4.9. Deteco de caractersticas de patogenicidade ..................................32

    4.9.1 Crescimento a 37C ........................................................................32

    4.9.2 Deteco de fosfolipase ..................................................................33

  • 12

    4.9.3 Deteco de protease ....................................................................... 33

    4.10. Frequncia de ocorrncia ................................................................ 33

    4.11. Anlise de similaridade.....................................................................34

    5. RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................35

    5.1. Isolamento e identificao das leveduras do solo e da gua, durante os

    perodos de vero e inverno nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo..

    .........................................................................................................35

    5.2. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e dados

    do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo.............................. 44

    5.3. Frequncia de ocorrncia de leveduras isoladas nas praias de Casa

    Caiada e Bairro Novo ....................................................................... 44

    5.4. Anlise de similaridade entre as espcies isoladas..............................45

    5.5. caracterizao de fatores de patogenicidade de amostras de leveduras

    isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo..............................47

    6. CONCLUSES ................................................................................... 57

    7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................. 58

  • 13

    1. INTRODUO

    As leveduras so microrganismos eucariontes, quimiorganotrficos,

    pertencentes ao Reino Fungi. No possuem mecanismos de locomoo e so

    aclorofilados. So predominantemente unicelulares, reproduzem-se sexuadamente por

    ascosporos e assexuadamente por brotamento, cissiparidade ou a combinao desses

    dois processos. Alguns gneros caracterizam-se por apresentar apenas blastocondios,

    enquanto outros, alm de blastocondios, formam pseudo-hifas e hifas rudimentares. As

    leveduras so filogeneticamente heterogneas, pertencendo as divises: Deuteromycota

    (Fungi Imperfect), classe Blastomycetes, (reproduo assexuada), Ascomycota e

    Basidiomycota, onde o mecanismo de reproduo sexuado (Lacaz et al.,1991).

    Alguns representantes das leveduras so importantes porque podem causar

    enfermidades em plantas e animais incluindo o homem (Rose & Harrison, 1970;

    Lodder, 1970; Kreger-van Rij, 1984); outros refletem importncia como agentes

    biodeterioradores de produtos naturais (frutas, sucos, doces), ou industrializados como

    papel, medicamentos, vinhos, carnes (Cook, 1958; Frazier, 1976). Em contra partida, a

    biotecnologia tem utilizado as leveduras nos processos de biodegradao atravs da

    indstria de alimentos e medicamentos, assim como nos processos de degradao de

    materiais e substncias poluentes do solo e de ambientes aquticos (Cook, 1958; Rose e

    Harrison, 1970).

    O continente brasileiro que em sua maior parte est situado na regio tropical

    desponta um grande interesse em ampliar os conhecimentos sobre fungos de ambiente

    marinho no Brasil, uma vez que poucas so as espcies referidas para o nosso pas

    (Pinto et al., 1992).

    No Brasil os estudos de leveduras isoladas da gua do mar foi iniciado em

    Florianpolis por Faraco & Faraco (1960) e posteriormente em Recife por Queiroz

    (1972). Paula et al., (1983), em So Paulo revelaram a possibilidade de espcies de

    Candida serem um novo indicador de poluio em guas de esturios marinhos.

    Alguns autores mencionam que a habilidade de certos fungos crescerem a 37C e

    de produzirem determinadas enzimas como por exemplo: fosfolipase, protease e outras,

    pode estar associada a patogenicidade (Hanel, 1988; Samuels et al., 1989).

    A fosfolipase expressa, teoricamente, aspectos relacionados com fatores de

    virulncia em espcies de Candida. Vrias espcies de Candida de importncia mdica

  • 14

    secretam uma proteinase, que sugerida como fator de virulncia; entretanto, esta

    enzima parece no atuar no fator de virulncia especfico, porm est envolvida com a

    propagao

    do fungo no hospedeiro, causando conseqentemente o processo invasivo, atravs de

    degradao da pele ou mucosa (Samaranayake et al.,1984).

    As praias de Bairro Novo e Casa Caiada em Olinda Pernambuco, foram

    escolhidas para realizao desta pesquisa, em virtude de serem praias frequentadas por

    turistas e banhistas locais. De acordo com a literatura pesquisada, no existe para a

    cidade de Olinda Pernambuco, estudos referentes ao isolamento, e caracterizao de

    leveduras do solo e gua de reas das referidas praias.

    Considerando a importncia de espcies de leveduras como agentes de micoses,

    justificou-se o isolamento desses microfungos com a caracterizao das espcies

    quanto a fatores de patogenicidade; crescimento a 37C e produo de enzimas,

    fosfolipase e protease.

  • 15

    2. REVISO DE LITERATURA

    2.1 Ocorrncia de leveduras em ambientes marinhos

    A ocorrncia de leveduras saprbias e potencialmente patognicas em

    diferentes habitats aquticos ou associadas aos mesmos est se tornando assunto de

    grande interesse, considerando que estes organismos esto presentes em rios,lagos,

    mares, guas profundas e relacionados fauna e flora desses ambientes, bem como em

    reas costeiras destinadas ao lazer. Neste sentido, h informaes que enfatizam a

    existncia de leveduras importantes na patologia humana e animal (Fell & van Udem,

    1963; Volz et al., 1974 e Brisou, 1975).

    Fell & van Uden (1963) e Meyers & Ahearn (1974) referem que guas do mar

    no sul da Flrida, altamente poludas por resduos domsticos tem um grande nmero

    de espcies de Candida, Trichosporon, Torulopsis e Rhodotorula. Por outro lado,

    Ahearn et al., (1962) e Morris (1968) citam espcies de Rhodotorula e Torulopsis como

    usualmente encontradas em todo ambiente marinho.

    Ahearn et al., (1968), confirmaram a alta incidncia de Candida em guas do

    mar poludas por esgotos domsticos no sul da Flrida.

    Considerando que as leveduras so abundantes em guas costeiras (Cooke et al.,

    1960; Spencer et al., 1970 e Ahearn, 1973) informaram que este fato pode estar

    relacionado ao arrasto da terra pelos rios e canais, bem como de resduos domsticos e

    industriais que aumentam os nutrientes para gua do mar.

    A maior parte dos trabalhos em isolamento de leveduras de guas de esturio e

    locais prximos a costa marinha tem sido feitos na Europa e Amrica do Norte (Fell et

    al., 1960; Ahearn et al., 1968).

    Ahearn et al., 1968, informaram que nas regies costeiras da Flrida ocorrem

    principalmente Rhodotorula, Candida e Debaryomyces. A distribuio de leveduras em

    ambiente marinho parece ser limitada pelas condies do ambiente devido a fatores

    como: temperatura, pH e baixa concentrao de nutrientes.

    Candida albicans tem sido isolada de gua do mar em praias recreacionais no

    sudeste da Califrnia (U.S.A.) (Dabrowa et al., 1964 e Kishimoto et al., 1969).

    Spencer et al., 1970, estudando guas de ambientes marinhos no sul dos U.S.A,

    argumentaram que o nmero de leveduras torna-se rapidamente elevado aps o despejo

  • 16

    de resduos domsticos nas guas, fato que pode est correlacionado com o aumento de

    coliformes fecais.

    Morris (1968, Morris 1975) e Meyers & Ahearn, 1974 postularam que a alta

    densidade de leveduras em guas costeiras dos U.S.A. constituda por leveduras de

    vrios gneros, dentre eles, Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula,

    Debaryomyces, Pichia, Hansenula e Rhodosporidium.

    Muitas espcies de leveduras so patgenas ao homem e animais ( Gentles e La

    Touche, 1969). Algumas dessas espcies, principalmente Candida tropicalis, Candida

    pseudotropicalis, Candida parapsilosis, Trichosporon cutaneum e Rhodotorula

    mucilaginosa foram encontradas em reas costeiras na Europa.

    Candida lusitaniae frequente no trato digestivo de animais domsticos, sendo

    detectada em secrees respiratrias e urina humana. Como um saprbio de vida livre

    tem sido isolada em guas costeiras na Flrida U.S.A. ( Lodder, 1970).

    Vrias espcies de leveduras so encontradas em ambientes aquticos com

    poluio domstica, especialmente Candida krusei, Candida tropicalis, Candida

    parapsilosis e Candida guilliermondii e estas espcies so frequentemente isoladas de

    fontes humana e animal ( Gentles & La Touche, 1969; Woollett & Hendrick, 1970).

    A habilidade para sobreviver em diferentes habitats uma caracterstica comum

    a certas leveduras, como Candida parapsilosis, C. laurentii, Pichia kudriavzevi, P.

    guilliermondii, Rhodotorula glutinis, R. rubra, Cryptococcus albidus e Hansenula

    anomala, podem fazer parte da micobiota transitria do homem, animais e outros

    habitats. (Stenderup, 1980).

    Lodder (1970), informou que Pichia kudriavzevii, P. guilliermondii, Candida

    tropicalis, C. parapsilosis e C. mambranaefaciens possuem uma diversidade de

    habitats, e podem ocorrer em tecido humano e de animais, bem como em fezes,

    material intestinal de peixes, resduos industriais e em gua do mar no sul da Flrida

    U.S.A.

    Algumas espcies de leveduras isoladas da gua do mar poluda na Europa, so

    patgenas oportunistas dentre elas: Candida tropicalis, C. parapsilosis, C.

    guilliermondii, C. krusei, Torulopsis glabrata e Rhodotorula rubra (Gentles & La

    Touche, 1969 Lodder, 1970).

    A maior parte das leveduras sem levar em conta o habitat do qual foram isoladas

    capaz de crescer com concentraes iguais ou superiores as concentraes de cloreto

    de sdio da gua do mar e geralmente crescem com o dobro dessas concentraes. Isto

  • 17

    indica que a alta tolerncia ao sal importante na seleo natural de leveduras de

    ambiente marinho (Lodder, 1970 e Goto et al., 1972).

    Leveduras basidiomicticas que predominam em gua doce e salgada na Flrida

    como Rhodotorula spp., e Cryptococcus spp., so encontradas em guas de esturio no

    poludo e sedimentos no Brasil ( Fell et al., 1960; e Hagler e Ahearn, 1987 e Pagnocca

    et al., 1989).

    Piontelli & Toro (1985) pesquisaram leveduras em zona seca e zona intertidal de

    uma praia no Chile. A maior parte das espcies isoladas cosmopolita em sua

    distribuio. Os resultados sugerem a utilizao de espcies de Candida como um dos

    indicadores de contaminao fecal em praias de lazer.

    Nunes (1984) e Barbosa (1989) estudando amostras de gua do rio Formosa na

    regio sul de Portugal detectaram uma diminuio no nmero de microrganismos

    mesoflicos em locais prximos a mar aberto. Esta diminuio pode est relacionada

    com diferentes fatores biticos e abiticos que exercem qualquer efeito negativo,

    separadamente ou por sinergismo nos microrganismos alctonos de ambiente marinho

    (Gauthier, 1980 e Borrego et al., 1983).

    Borrego (1984), referiu que a contaminao microbiolgica por bactrias e

    Candida albicans em guas do rio Formosa (Portugal) provocada por despejo de

    esgotos domsticos.

    Microrganismos terrestres so lanados em ambiente aqutico principalmente

    por despejos de esgotos, que so a principal fonte de poluio fecal em ambiente

    marinho (Borrego e Figueiras, 1997).

    Queiroz (1972), isolou leveduras mitospricas de algas marinhas da praia de

    Piedade, Pernambuco Brasil dentre elas, Candida guilliermondii, C. tropicalis,

    Trichosporon sp., Torulopsis versatilis. A levedura ascosporada esteve representada

    por Saccharomyces florentinus. A presena de leveduras ascosporadas foi muito baixa,

    em relao ao nmero bem representativo de leveduras assexuadas.

    Em guas do mar poludas do Rio de Janeiro, Candida apresentou boa

    correlao com coliformes fecais, seguindo um padro de distribuio similar aos

    coliformes fecais, sendo Candida citada como um bom indicador de poluio em

    ambiente marinho (Hagler, 1978).

    Hagler et al.,(1979) isolaram espcies de leveduras da gua do mar poluda com

    resduos domsticos no Rio de Janeiro. As espcies mais frequentemente isoladas

    foram Rhodotorula rubra e Candida krusei, enquanto outras espcies de Candida,

  • 18

    Torulopsis, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Hanseniaspora tambm foram

    isoladas.

    Paula (1978) isolou com maior frequncia em guas do mar poludas na Baixada

    Santista-SP, Candida albicans, C. parapsilosis, Torulopsis glabrata, informando que

    Cryptococcus foi o gnero predominante em guas no poludas.

    Hagler & Mendona Hagler (1979) estudando espcies de leveduras isoladas de

    esturio marinho poludo do Rio de Janeiro concluram que a exigncia de vitaminas como

    fator estimulante do crescimento, aparentemente no interfere na distribuio de leveduras

    na gua do mar poluda. Entretanto, essa exigncia como fator essencial, pode ser

    importante no estabelecimento da poluio de guas marinhas. Em 1981 Hagler e

    Mendona-Hagler relataram Candida, Rhodotorula, Torulopsis e Trichosporon como

    gneros mais freqentemente isolados em guas de esturio poludo no Rio de Janeiro.

    Hagler et al., (1982) estudando sedimento de um esturio poludo no Rio de Janeiro

    encontraram espcies de Candida krusei e Pichia mambranaefaciens como predominantes

    nesses sedimentos e Rhodotorula rubra sendo encontrada em menor freqncia.

    A ocorrncia de Trichosporon spp. sobretudo T. cutaneum, em sedimento de reas

    de esturio do Rio de Janeiro pode est relacionada com a poluio (Hagler & Mendona

    Hagler, 1981). Porm, espcies desse gnero tem sido encontradas em substratos como

    madeira, solo, areia de praia e gua do mar ( Hurley et al., 1987).

    Paula et al., (1983) isolaram leveduras de praias da regio sul do estado de So

    Paulo num total de 500 colnias de leveduras, distribudas em 9 gneros: Candida,

    Rhodotorula, Cryptococcus, Torulopsis, Trichosporon, Debaryomyces, Hansenula, Pichia

    e Sporobolomyces. Os resultados revelaram a possibilidade de Candida ser um novo

    indicador de poluio em guas de esturio, estando corroborados com outros trabalhos (

    Fell & van Uden 1963; Ahearn et al., 1968; Meyers & Ahearn 1974, Queiroz, 1972).

    As colnias de leveduras em guas poludas do mar de regies do Brasil, so

    tipicamente dominadas por associaes com hospedeiros, e as espcies mais importantes

    so Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. intermedia, C. krusei,

    Trichosporon cutaneum, e Saccharomyces cerevisiae, esta, usada na fermentao e

    indstria de alimentos (Hagler et al., 1986).

    2.2 Caracterizao de leveduras quanto a fatores de patogenicidade

    A habilidade dos fungos na produo de enzimas extracelulares vem sendo

    associada com a patogenicidade e virulncia dos mesmos, devido relao fungo-

  • 19

    hospedeiro. Vrias espcies patgenas incluindo Candida krusei e C. tropicalis fazem

    parte da densidade populacional de leveduras de ambiente marinho poludo (Hagler e

    Ahearn, 1987).

    A habilidade de Candida albicans em produzir enzimas citolticas como as

    proteinases (Macdonald, & Odds, 1980; Ruchel et al., 1982) e fosfolipases (Louria et al.,

    1963; Costa, et al., 1968) pode estar associada com a patogenicidade desses fungos.

    Para a determinao da atividade enzimtica de diversas enzimas extracelulares,

    geralmente so utilizadas tcnicas de difuso em gar cup plate com uso de meios

    slidos sendo os resultados expressados pela formao de halos resultantes da hidrlise dos

    substratos especficos ou pela mudana de cor do indicador contido no meio de cultura

    (Hankin e Anagnostakis, 1975; Price et al., 1982).

    Entre vrios fatores predisponentes extrnsecos ao hospedeiro, existem

    determinadas caractersticas envolvendo fungos, indicativas de patogenicidade. Entre estas

    podem ser mencionadas crescimento a 37C e produo de enzimas como urease, protease,

    fosfolipase e outras. A urease foi previamente estudada em fungos por Hankin e

    Anagnostakis (1975) sugerindo um meio com uria para a deteco da atividade

    enzimtica.

    O termo produo de enzimas entendido como sntese e atividade da enzima pelo

    fungo no meio de produo. Assim, alguns fungos produzem um grande nmero de

    enzimas enquanto outros produzem poucas enzimas sob as mesmas condies de teste

    (Hankin & Anagnostakis, 1975).

    A temperatura um dos parmetros ambientais mais importantes influenciando

    todas as atividades de microrganismos ( Rose & Harrison, 1987).

    Segundo Hanel (1988) e Samuels et al., (1989) a habilidade de certos fungos em

    produzir enzimas como proteases, fosfolipases, podem estar associadas com a

    patogenicidade desses fungos. Como conseqncia ainda dessa relao parasito-

    hospedeiro, vrios estudos tm sido dirigidos relacionando a habilidade dos fungos na

    produo das enzimas como processo de patogenicidade e virulncia (Samaranayake, et

    al., 1984; Mago, Khuller, 1990).

    Fosfolipases so enzimas hidrolticas que degradam os fosfolipdeos em quatro

    stios diferentes, dependendo de ao da enzima sobre o substrato, sendo encontrados

    fazendo parte da estrutura da membrana celular de animais, plantas e clulas de

    microrganismos (Price & Cawson, 1977).

  • 20

    Fosfolipases extracelulares so produzidas por vrias bactrias e fungos e esto

    implicadas na patogenicidade destes por causar danos s membranas do tecido hospedeiro

    (Rose & Harrison, 1987; Lacaz et al., 1991; Kwon Chung & Bennet, 1992; Chen et al.,

    1997).

    Entretanto, esta enzima parece no atuar no fator de virulncia especifico, porm

    pode estar envolvida com a propagao do fungo no hospedeiro, causando

    consequentemente invaso, atravs de degradao da pele ou mucosa (Ruchel et al., 1986,

    Homma et al., 1992).

    A presena da atividade fosfolipsica em Candida albicans, foi primeiramente

    detectada por crescimento do fungo em meio contendo gema de ovo (Werner, 1966; Costa

    et al., 1967 a ) e lecitina (Costa et al., 1967 b).

    Pugh e Cawson (1975) demonstraram a localizao da atividade fosfolipsica em

    clulas de Candida albicans em meio de cultura atravs de um mtodo citoqumico.

    Posteriormente, a deteco quantitativa da atividade fosfolipsica em Candida albicans por

    um mtodo em placa foi descrita por Price et al., (1982) os quais demonstraram grande

    variao na atividade fosfolipsica, encontrada em isolados clnicos de C. albicans. A

    fosfolipase secretada por C. albicans poderia fazer parte da invaso do tecido do

    hospedeiro.

    Price & Cawson (1977) divulgaram um mtodo que permitiu a determinao

    quantitativa da atividade fosfolipsica em um grande nmero de amostras atravs de meio

    contendo gema de ovo e clcio.

    Price & Cawson (1977) quando usaram meio com substrato puro de lecitina,

    revelaram a presena de fosfolipase A e lisofosfolipase, em amostras de Candida albicans,

    entretanto no detectaram fosfolipase B.

    Samaranayake et al., (1984) demonstraram que a atividade fosfolipsica secretada

    por Candida albicans pode ser considerada como fator determinante de virulncia.

    Proteases so enzimas capazes de hidrolisar peptdeos. Estas enzimas consistem de

    dois grupos: as protenases e as peptidases (Sumner, 1951).

    Lodder e Kreger van Rij (1952) relataram vrias espcies de leveduras incluindo

    Candida lipolytica e C. pseudotropicalis, que peptonizam o leite. Peptonizao do leite

    tem sido observada tambm, por Candida punicea e C. curiosa (Komagata e Nakase,

    1965).

    Estudos realizados com leveduras de origem aqutica (Meyers et al., 1967),

    indicaram que determinadas espcies em geral produzem uma protenase extracelular.

  • 21

    A maioria das proteases normalmente detectada, qualitativamente utilizando-se

    como substratos meios slidos contendo casena, gelatina e outras protenas. A atividade

    proteoltica pode ser evidenciada pela observao de halos de hidrlise em torno de

    colnias do microrganismo (Aunstrup, 1974).

    A casena, em condies habituais, insolvel. Quando hidrolisada por uma enzima

    extracelular, transformada em produtos solveis por um processo denominado

    peptonizao. A presena dessa enzima evidenciada facilmente pela inoculao na

    superfcie de gar leite com o microrganismo em estudo. Nesses casos, observa-se em

    torno das colnias zonas claras, em contraste com o resto do meio que permanece turvo

    (Neder, 1992).

    Protease uma enzima sugerida como fator de virulncia de muitas amostras de

    Candida albicans de importncia mdica, porm pode estar mais envolvida com a

    propagao do fungo no hospedeiro durante o processo invasivo do que na atuao como

    fator de virulncia propriamente dito (Jimnez, 1993).

  • 22

    3. DESCRIO DA REA DE ESTUDO

    O municpio de Olinda est compreendido entre os paralelos 7 57'30'' e 8'

    0230 de latitude sul e os meridianos 39 49'41'' e 39 55'00'' de longitude W. Gr,

    perfazendo cerca de 40,83 km2. Limita-se ao norte com o municpio de Paulista, ao

    leste com o oceano Atlntico, a oeste e ao sul com a cidade de Recife (Beltro et al.,

    1995).

    Olinda est geologicamente localizada na Faixa Sedimentar Cretcea

    Paleocnica a qual caracterizada por apresentar, ao norte e ao sul de Recife,

    comportamento diferente tanto no sentido litolgico (tipo de rochas), como no

    cronolgico (idade). Este fato levou os estudiosos da rea a subdividir esta faixa em

    dois domnios distintos, de acordo com os conceitos atuais: a Faixa Vulcano -

    Sedimentar sul de Pernambuco e a Faixa Sedimentar norte de Pernambuco (Beltro et

    al., 1995).

    A rede de drenagem que compreende o municpio de Olinda parte integrante

    das bacias Hidrogrficas dos rios Beberibe e Paratibe.

    O rio Beberibe nasce no municpio de So Loureno da Mata e seu curso

    desenvolve-se numa extenso de aproximadamente 16,5km. Sua bacia de drenagem

    possui aproximadamente 78,71km2 dos quais 17,8% (cerca de 14km2) pertence ao

    municpio de Olinda. Destacando-se na rea estudada os afluentes: Canal de Peixinhos,

    Riacho do Abacaxi (Canal Lava Tripas) e Canal da Malria, possuindo esses ltimos

    nascentes localizados no municpio de Olinda.

    Quanto ao rio Paratibe, ressalta-se que este corpo d'gua, cujas nascentes

    localizam-se nos municpios de Recife, Paulista e So Loureno percorre uma extenso

    de 16km e abrange uma rea de 118,54km2 dos quais 18,6% (cerca de 22,08km2) est

    inserida no municpio de Olinda. Dentre os principais afluentes que cortam o municpio

    de Olinda, destacam-se: o rio Fragoso, o Canal do Matadouro (Canal Preto) e Canal do

    rio Morto (Canal Bultrins/Fragoso), possuindo os dois primeiros, nascentes na Zona

    Rural de Olinda (Beltro et al., 1995).

    Segundo a classificao geral de Kppen (SUDENE, 1974), o clima que

    caracteriza o municpio de Olinda do tipo AS', ou seja, tropical quente e mido, com

    chuvas de outono e inverno, distribudas de maro a agosto, com temperatura do ms

    mais frio superior a 18C e temperatura mdia anual de 27C.

  • 23

    Os meses de maior incidncia de chuvas so os de maio (224,4mm) e junho

    453,3mm) totalizando precipitao anual de 1.000 a 2.000mm (Beltro et al.,1995).

    O municpio de Olinda est situado do ponto de vista fitogeogrfico dentro da

    Zona da Mata. A cobertura vegetal da rea originalmente, era constituda pela Floresta

    Atlntica, do tipo Ombrfila Densa, e seus ecossistemas associados: manguezais e

    restingas (Beltro et al., 1995).

    Caractersticas ambientais das Praias de Casa Caiada e Bairro

    Novo

    Praia de Casa Caiada

    A Praia de Casa Caiada, juntamente com a Praia de Rio Doce, compreende o

    trecho entre a Rua Dr. Manuel Ramos Lima at a foz do rio Paratibe, possuindo

    extenso aproximada de 4,5km, apresenta praias de areia com alguns trechos que so

    totalmente imersos pela gua durante o perodo de preamar. No alto da praia, verifica-

    se a existncia da Av. Beira Mar, que se estende at as imediaes do Hotel Quatro

    Rodas. Este trecho muito utilizado para banho, prtica de futebol e esportes de

    contato (wind surf, natao, vela, remo, etc), bem como para pesca e captura de

    moluscos. Seus principais problemas ambientais so: lanamento de guas pluviais

    praia, disposio de esgotos domsticos, lanamento de resduos slidos (barracas de

    praia, vendedores ambulantes, populao em geral, etc.), ocupao de faixa de areia

    pelas barracas distribudas de forma desordenada, alm do aspecto indesejvel,

    atentando contra a esttica e a paisagem, ocupao da faixa de praia por embarcaes

    de lazer, dificultando utilizao pelos banhistas, presena de animais na praia, falta de

    periodicidade do sistema.

    Casa Caiada uma praia urbana, possui guas calmas e recifes artificias e

    juntamente com Bairro Novo so consideradas as praias mais frequentadas de Olinda, e

    muito procuradas por banhistas e visitantes.

    Praia de Bairro Novo

    A Praia de Bairro Novo juntamente com a Praia do farol compreende o trecho

    Rua do Farol com imediaes da Rua Dr. Manuel Ramos Lima, com extenso

    aproximada de 2km, possui obras de proteo ao litoral (cerca de 36 espiges), com

  • 24

    comprimento aproximado de 50m e eqidistantes de 50m, construdos

    perpendicularmente praia, alm de enrocamento lanado em todo permetro para

    proteo costa contra a ao das ondas. Ressalta-se que estas praias so bastante

    freqentadas por banhistas, em especial, em seu tero inicial. Possui alguns problemas

    ambientais, tais como: eroso marinha, lanamento de guas pluviais praia,

    disposio de esgotos domsticos (residncias e bares), lanamento de resduos slidos,

    gua imprpria para banhos em alguns trechos e esportes

    de contato. Pode ser utilizada para turismo, recreao, lazer, pesca artesanal, prticas

    desportivas (Beltro et al., 1995) (Figura 1).

    4. MATERIAL E MTODOS

    4.1. Coleta do solo

    Foram obtidas concomitantemente amostras de solo e gua nas praias de Bairro

    Novo e Casa Caia da, Olinda, Pernambuco, nos meses de dezembro/2000;

    fevereiro/2001 referentes ao perodo seco, junho e julho/2001, referentes ao perodo

    chuvoso. Foram realizadas 16 coletas de solo e 16 coletas de gua. As praias de Casa

    Caiada e Bairro Novo foram denominadas de ponto-1 e ponto-2, respectivamente.

    As coletas tanto do solo, quanto da gua, foram procedidas em baixa-mar e

    preamar. A coleta do solo em cada ponto foi realizada com o auxlio de uma p de

    jardinagem, na regio do mdio litoral a 1m da linha da mar, na superfcie e a 20cm de

    profundidade, as quais foram acondicionadas em sacos plsticos devidamente

    etiquetadas e mantidas a temperatura ambiente, sendo transportados ao Departamento

    de Micologia da UFPE para o manuseio.

    4.2. Coleta da gua

    A coleta da gua em cada ponto foi realizada superfcie e a 1m de

    profundidade, utilizando-se tubos de ensaio esterilizados e etiquetados. Para tal, no

    momento da coleta, quando o tubo de ensaio na profundidade de 1m os tampes foram

    retirados, e retamponados logo em seguida.

    As amostras foram mantidas a temperatura ambiente e transportadas ao

    Departamento de Micologia da UFPE para serem manuseadas.

  • 25

    4.3. Meios de cultura utilizados

    Para isolamento e purificao dos fungos.

    gar Sabouraud + 5% de extrato de leveduras + 100 mg de cloranfenicol (SAB +

    YE + C).

    Peptona de carne ( DIFCO) .................................... 10g

    Extrato de levedura ( DIFCO) ..................................5g

    Dextrose ( VETEC).................................................40g

    Cloranfenicol ......................................................100 mg

    gar ( VETEC) ........................................................ 20g

    gua destilada q.s.p. ........................................ 1.000 ml

    pH = 6,5

    gar Sabouraud + 5% de extrato de levedura + 100 mg de cloranfenicol + 50 mg de

    Rosa de Bengala ( SAB + YE + C + RB).

    Peptona de carne ( DIFCO) .................................... 10g

    Extrato de levedura ( DIFCO) ..................................5g

    Dextrose ( VETEC).................................................40g

    Cloranfenicol .......................................................100mg

    Rosa de Bengala ( VETEC) ................................ 50 mg

    gar ( VETEC) .......................................................20 g

    gua destilada q.s.p. .........................................1.000ml

    pH = 6,5

    Para identificao

    gar Sabouraud + 0,5% de extrato de levedura ( SAB + YE )

    Peptona de carne ( DIFCO)...................................10g

    Extrato de levedura ( DIFCO)..................................5g

    Dextrose ( VETEC) ................................................ 40g

    gar ( VETEC).......................................................20g

    gua destilada q.s.p......................................... 1.000 ml

    pH = 6,5

    gua bile de boi

  • 26

    Bile de boi ( MICROMED).....................................20g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    Sabouraud lquido

    Peptona de carne ( DIFCO).....................................10g

    Extrato de levedura ( DIFCO) ...................................5g

    Dextrose ( VETEC) .................................................40g

    gua destilada q.s.p. .........................................1.000 ml

    Meio a base de carbonato de clcio ( CaCO3)

    Extrato de levedura ( DIFCO) ...................................5g

    Dextrose ( VETEC) .................................................50g

    Carbonato de clcio ( CINTICA) ...........................5g

    gar ( VETEC)........................................................ 20g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    Meio de Gorodkowa

    Peptona de carne ( DIFCO).....................................10g

    Extrato de carne ( DIFCO) .....................................10g

    Cloreto de sdio ( VETEC).......................................5g

    Dextrose ( VETEC) .................................................40g

    gar .........................................................................20g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    gar uria de Christensen

    (I) Dextrose ( VETEC)................................................ 1g

    Peptona de carne ( DIFCO) ........................................ 1g

    Cloreto de sdio ( NaCl) ( VETEC) .........................5g

    Fosfato de Potssio monobsico ( KH2 PO4)

    (VETEC)..................................................................... 2g

    Vermelho de fenol ( MERCK).............................0,012g

    gar destilada q.s.p. ..........................................1.000 ml

    (II) Uria ( DIFCO) a 20% .........................................29g

  • 27

    pH = 6,8

    Prova de Assimilao de hidratos de carbono e fontes de nitrognio

    Meio bsico C ( assimilao de fontes de carbono)

    Sulfato de amnio (NH4)2 SO4 (VETEC) ...............5g

    Fosfato de potssio monobsico KH2 PO4

    (VETEC) ...................................................................1g

    Sulfato de magnsio (VETEC) .............................. 0,5g

    gar (VETEC) ........................................................ 20 g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    Meio bsico N ( assimiliao de fontes de nitrognio)

    Fosfato de potssio monobsico ( KH2 PO4)

    ( VETEC) ..................................................................1g

    Sulfato de magnsio MgSO4 . 7H2O ( VETEC) .. 0,5g

    Dextrose ( VETEC) .................................................20g

    gar ( VETEC)........................................................ 20g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    Prova de fermentao de acares

    gua Peptonada

    Peptona de carne ( DIFCO).................................... 2,5g

    Extrato de levedura ( DIFCO) ................................ 0,5g

    gua destilada q.s.p.............................................100 ml

    Soluo de car

    Acar .......................................................................4g

    gua peptona a 2,5% ...........................................100 ml

    Todos os meios foram preparados segundo Lacaz et al., 1991.

    Para deteco de caractersticas de patogenicidade

    Para crescimento a 37C

    gar Sabouraud

  • 28

    Peptona de carne ( DIFCO).....................................10g

    Dextrose ( VETEC) .................................................40g

    gar ( VETEC)........................................................ 20g

    gua destilada q.s.p..........................................1.000 ml

    Para deteco da atividade fosfolipsica ( Price et al., 1982) Modificado

    gar Sabouraud + gema de ovo

    Dextrose ( VETEC) ...............................................40g

    Peptona ( DIFCO)...................................................10g

    Gema de ovo (02 gemas)........................................ 20g

    Cloreto de sdio ( NaCl) (VETEC) ......................1 M

    Cloreto de Clcio (CaCl2) (VETEC) ...............0,005M

    gar (VETEC) ........................................................ 20g

    gua destilada q.s.p......................................... 1.000 ml

    pH = 6,5

    Para deteco da atividade protesica

    Meio de casena ( Lacaz et al., 1991)

    (1) Leite desnatado ( marca Molico) ......................10g

    gua destilada q.s.p.............................................100 ml

    (2) gar ( VETEC) ...................................................2g

    gua destilada q.s.p.............................................100 ml

    pH = 6,1

    Soluo acidificada de cloreto de mercrio ( Fraizer, 1926)

    Cloreto de mercrio (HgCl2) (VETEC) .................12g

    cido clordrico concentrado (HCl)

    ( CINTICA) ........................................................ 16 ml

    gua destilada ...................................................... 80ml

    Todos os meios foram preparados segundo Lacaz et al., (1991) e Price et al., (1982)

    modificado, substituindo a lecitina de ovo ( Difco) por duas gemas de ovo natural.

  • 29

    4.4. Isolamento e purificao dos fungos (Pinto et al., 1992)

    De cada amostra do solo foi feita uma suspenso de 50g de solo em 90ml de

    gua destilada esterilizada, onde retirou-se 0,5ml da suspenso para o semeio. Cada

    amostra foi semeada em triplicata, usando-se pipeta esterilizada de 1ml e placas de

    Petri de 9cm de dimetro, contendo o meio Sabouraud dextrose gar, extrato de

    levedura acrescido de cloranfenicol.

    Para o isolamento dos fungos da gua foi retirado 0,5ml para o semeio, o qual

    foi feito em triplicata, sendo tambm semeados em placas de Petri contendo

    Sabouraud-dextrose gar, extrato de levedura acrescido de cloranfenicol. Aps o

    semeio as placas foram incubadas a temperatura ambiente (28C) e a partir do

    aparecimento das primeiras colnias, foram as mesmas repicadas para tubos contendo

    meio Sabouraud-dextrose gar, extrato de levedura.

    Para a purificao das amostras fngicas, foram preparadas suspenses em 2ml

    de gua destilada esterilizada ( ADE), contendo 50mg de cloranfenicol /l. De cada

    suspenso, 0,2ml foram semeadas por esgotamento na superfcie de gar Sabouraud,

    extrato de levedura acrescido de cloranfenicol. As colnias surgidas isoladamente, foram

    repicadas para tubos de ensaio contendo Sabouraud destrose gar e extrato de levedura.

    4.5. Identificao dos fungos do solo e da gua

    As identificaes dos fungos foram efetuadas atravs da observao das

    caractersticas macroscpicas (cor, aspecto) e microscpicas, das culturas.

    Para a identificao das espcies de leveduras foram utilizados os meios de

    cultura especficos para as provas fisiolgicas e bioqumicas, consultando bibliografias

    especficas como: Lodder, 1970; Kreger van Rij, 1984; Barnett et al., 1990.

    4.6. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e

    dados do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo, Olinda -

    PE

  • 30

    4.6.1. Altura das mars

    As amostras foram coletadas durante as baixa-mares e preamares de sizigia,

    baseadas nas tbuas de mars contidas em Brasil (1999), para o porto do Recife (PE).

    4.6.2. Salinidade da gua

    A salinidade da gua foi determinada atravs de um refrotmetro manual de

    marca ATAGO.

    4.6.3. pH (potencial Hidrogeninico) do solo e da gua

    Para determinao do pH do solo e da gua foi empregado o pHmetro digital

    Hanna.

    4.6.4. Temperatura do solo e da gua

    As temperaturas do solo e da gua foram registradas atravs de um termmetro

    digital - Hanna.

    4.7. Pluviometria

    Os dados pluviomtricos da cidade de Olinda, Pernambuco, foram fornecidos pela

    Empresa Pernambucana de Pesquisas Agropecurias (IPA) e Secretria de Recursos

    Hdricos de Pernambuco (SRH).

    O clima que caracteriza o municpio de Olinda do tipo As ou seja, quente e

    mido, com chuvas de outono e inverno, distribudas de maro a agosto, com temperatura

    do ms mais frio superior a 18C.

  • 31

    4.8. Colimetria da gua

    A anlise colimtrica da gua foi fornecida pela Companhia Pernambucana de

    Controle da Poluio Ambiental e da Administrao dos Recursos Hdricos (CPRH). O

    parmetro fornecido foi o n mero mais provvel (NMP) de bactrias coliformes fecais,

    segundo a classificao regulamentada pela resoluo 274/00 do CONAMA.

    4.9. Deteco de caractersticas de patogenicidade

    4.9.1. Crescimento a 37C

    As amostras foram semeadas em gar-Sabouraud extrato de levedura em

    duplicata para cada condio de crescimento, dois tubos foram incubados a 37C e dois

    mantidos temperatura ambiente (28C 1C) para controle. O crescimento das

    culturas foi acompanhado entre 48 e 72h.

    4.9.2. Deteco de enzimas/fosfolipase

    Os testes para deteco de fosfolipase e protease, em placas, foram realizados da

    seguinte maneira: o semeio foi realizado com alquota da colnia de levedura no centro

    dos referidos meios de cultura contidos em placas de Petri. As placas foram mantidas a

    temperatura ambiente.

    As culturas foram observadas quanto a formao de halos ao redor das colnias,

    na produo de fosfolipase e protease num perodo de 07 a 10 dias.

    Depois de semeadas no meio para deteco de fosfolipase, as culturas foram

    observadas quanto ao crescimento e a formao de halos. A atividade foi detectada

    seguindo o mtodo descrito por Price et al., (1982), modificado, substituindo a lecitina

    de ovo por gema de ovo natural.

    4.9.3. Deteco de enzimas/protease

    A atividade enzimtica foi testada atravs da hidrlise de casena em meio gar-

    leite. Depois de semeadas, as amostras foram observadas quanto ao crescimento e

  • 32

    atividade enzimtica, atravs da formao de halo. Quando positivas para atividade

    protesica houve a formao de halo transparente ao redor das colnias. A ausncia de

    halo indicou no produo da protease.

    4.10. Freqncia de ocorrncia

    A freqncia de ocorrncia dos fungos foi calculada pela frmula a seguir e os

    resultados so emitidos em porcentagem.

    Fo = Ta . 100/ TA

    onde: Ta = nmero de amostras que o txon ocorreu.

    TA = nmero total de amostras.

    O clculo da freqncia de ocorrncia das espcies foi obtido, considerando-se o

    nmero de amostras em que o fungo ocorreu em relao ao nmero total de amostras,

    segundo o critrio abaixo, modificado de Dajoz (1983).

    Sendo considerada a seguinte classificao:

    < 10% = Rara

    10 25% = Pouco freqente

    25 < 35% = Freqente

    35 < 50% = Abundante

    > 50% = Muito abundante

  • 33

    4.11. Anlise de similaridade

    Foi feita uma anlise de similaridade baseada na matriz de dados de presena

    ausncia, tendo-se retirado as amostras onde no ocorreram espcies. Utilizou-se o

    coeficiente de Jaccard (1908) cuja frmula :

    a

    (a+b+c)

    onde, a = co-ocorrcia das espcies nas amostras (anlise por coluna) ou das amostras

    nas

    espcies (anlise por linha).

    b = a ocorrncia da espcie em uma amostra ou da amostra em uma espcie.

    c = a ocorrncia na outra amostra ou na outra espcie.

    Na anlise por coluna se evidencia as amostras que esto associadas entre si, e na

    anlise por linhas as espcies que tm requerimentos ecolgicos semelhantes.

    O mtodo de ligao da matriz triangular foi o do peso no proporcional (UPGMA)

    gerando um dendrograma. Foram feitas uma anlise cofentica e uma de comparao de

    matrizes para verificar o bom ajuste dos dados.

  • 34

    5. RESULTADOS E DISCUSSO

    5.1. Isolamento e identificao de leveduras do solo e da gua, durante os

    perodos de vero e inverno nas praias de Casa Caiada e Bairro

    Novo.

    Das 32 coletas realizadas do solo e da gua durante os meses de dezembro/2000 e

    fevereiro, junho e julho/2001, em superfcie e profundidade, na baixa-mar e preamar nas

    praias de Casa Caiada e Bairro Novo, foram isoladas 31 espcies de leveduras. Na praia de

    Casa Caiada a maioria das espcies pertence a Candida com (10) espcies seguido de

    Trichosporon, Rhodotorula e Brettanomyces com (5), (3) e (3) espcies, respectivamente.

    Na praia de Bairro Novo foram isoladas 15 espcies. A maioria das espcies tambm

    pertence a Candida com (12) espcies , seguido de Rhodotorula e Brettanomyces com (2) e

    (1) espcie, respectivamente (Tabelas 1,2,3 e 4). Candida e Trichosporon ocorreram com maior nmero de espcies, 19 e 5

    respectivamente. So tambm referidas por Fell & van Udem (1963) em ambiente marinho

    na Flrida. Trichosporon ocorreu com maior nmero de espcies (5) em solo na praia de

    Casa Caiada. Na Baixada Santista (So Paulo). Paula et al., (1983) relataram a baixa

    adaptao gua do mar por espcies de Trichosporon isoladas de ambiente marinho.

    Candida, Rhodotorula e Trichosporon ocorreram na praia de Casa Caiada, confirmando o

    citado por Meyers & Ahearn (1974), Hagler e Mendona-Hagler (1981) os quais referem,

    que em guas de ambiente marinho poludas por esgotos domsticos h grande nmero de

    espcies de Candida, Rhodotorula e Trichosporon. Candida, Rhodotorula e Bretanomyces

    ocorreram na praia de Bairro Novo, este ltimo com maior assinalamento. Piontelli &

    Toro (1985) referem que este gnero foi isolado com maior freqncia em solo de praia no

    Chile.

    Existe a possibilidade de que as leveduras detectadas nas praias de Casa Caiada e

    Bairro Novo, tenham sido carreadas no s pela lixiviao do solo e pelas descargas

    pluviais, como tambm pelas descargas fluviais prximas rea e de esgotos

    domsticos que so lanados ao longo da praia.

  • 35

    Deve-se levar em conta o fluxo e refluxo das mars e a atividade de banhistas

    locais. A precipitao pluviomtrica em ecossistemas terrestre e aqutico influencia de

    maneira significativa na quantidade de fungos isolados, visto que, aps um perodo de

    chuva, a quantidade de fungos maior que no perodo de estiagem. (Pinto et al., 1992).

    Em Olinda, a precipitao pluviomtrica foi de 260,9mm e 206,3mm nos meses de

    junho e julho respectivamente. A quantidade de isolados no perodo de vero foi maior

    do que no inverno, que teve precipitao de 43,25mm e 180,5mm nos meses de

    dezembro e fevereiro, respectivamente.

    O processo das mars faz com que os propgulos de fungos encontrados na

    gua sejam depositados no solo e os do solo sejam dispersados na gua (Pinto et. al.,

    1992). Os resultados obtidos demonstraram ser possvel tal afirmativa, visto que a

    maioria das espcies isoladas foi comum aos dois substratos.

    Segundo os resultados de colimetria fornecidos pela Companhia Pernambucana

    de Controle da Poluio e da Administrao dos Recursos Hdricos (CPRH) e contidos

    na Tabela 5, as praias de Casa Caiada e Bairro Novo nos perodos das coletas foram

    consideradas prprias para a balneabilidade, com exceo de Bairro Novo no perodo

    de fevereiro que foi considerada imprpria. Entretanto, na praia de Bairro Novo onde

    ocorre despejos de esgoto domstico o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC)

    foi inferior8 ao da praia de Casa Caiada (Tabela 6).

    As espcies Brettanomyces bruxellensis e Candida fennica apresentaram maior

    nmero de unidades formadoras de colnias ocorrendo em solo nas praias de Casa Caiada

    e Bairro Novo, respectivamente.

    Morris (1968), Queiroz (1972), Meyers e Ahearn (1974) e Paula et al., (1983)

    postularam que as grandes densidades de leveduras em guas costeiras so constitudas

    por vrios gneros; os mais importantes dentre eles, Candida, Trichosporon,

    Rhodotorula, Cryptococcus, Debaryomyces, Pichia, dos quais os trs primeiros, foram

    isolados nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo.

    Candida parapsilosis possui grande ocorrncia em tecido humano, fezes de

    animais, produtos alimentcios, e bebidas. Seu isolamento no perodo de inverno sugere

    uma origem marinha causada por contaminao fecal. Esta espcie tambm registrada

    em diferentes casos clnicos de micoses. ( Marrie et al., 1984).

    Foi isolada apenas uma amostra de Candida albicans na praia de Casa Caiada

    no perodo de vero a uma temperatura de 29.4C. Anderson (1979) relatou que a

    temperatura um fator que influencia no crescimento de determinadas espcies de

  • 36

    Candida isoladas de ambiente marinho. Esse dado corrobora com os achados de

    Meyers et al., (1967), Fell e van Uden (1963) e Buck (1977), os quais referem que a

    temperatura um fator importante para o isolamento de Candida albicans em ambiente

    marinho.

    5.2. Parmetros hidrolgicos, pH, temperatura e salinidade da gua e

    dados do solo das praias de Casa Caiada e Bairro Novo.

    De acordo com os dados inseridos na Tabela 7 a temperatura da gua nas praias de

    Casa Caiada e Bairro Novo ficou entre 24.3C e 29.4C, ocorrendo em dezembro e

    fevereiro respectivamente. No perodo de inverno a temperatura da gua teve mnima de

    25.3C e mxima de 28.2C, ambas ocorrendo no ms de julho. A temperatura do solo no

    perodo de vero nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo, teve mnima de 25.7C e

    mxima de 29.4C, ocorrendo nos meses de dezembro e fevereiro, respectivamente. A

    temperatura do solo no perodo de inverno ficou entre 24.4C e 28.8C, ambas ocorrendo

    no ms de julho.

    O pH de todas as amostras foi ligeiramente alcalino, oscilando entre 7.6 a 8.2. A

    salinidade da gua e do solo na praia de Casa Caiada ficou entre 38 e 39 nos

    perodos de vero e inverno, respectivamente. Na praia de Bairro Novo a salinidade da

    gua e do solo ficou entre 40 e 20 nos perodos de inverno e vero, respectivamente.

    Em Bairro Novo a salinidade do solo chegou a 15 , na baixa-mar.

    5.3. Freqncia de ocorrncia de leveduras isoladas nas praias de Casa

    Caiada e Bairro Novo.

    Brettanomyces bruxellensis teve maior freqncia de ocorrncia com 43,75%

    considerada abundante nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo. Candida fennica, C.

    catenulata e Rhodotorula mucilaginosa tiveram ocorrncia de 18,75%, consideradas pouco

    freqentes. Candida rhagii, C. melibiosica, C. sake, C. parapsilosis, C. rugopelliculosa e

    trichosporon dulcitum com 12,75%, consideradas pouco freqentes. Candida

    pseudolambica, C. diddensiae, C. vaccinii, C. palmioleophila, C. bombicola, C. geochares,

    C. saitoana, C. intermedia, C. maltosa, C. blankii, C. milleri, C. albicans, Rhodotorula

    ingeniosa, R. glutinis, R. minuta, Trichosporon lutetiae, T. beigelli, T. adeninovorans, T.

  • 37

    aquatile, Brettanomyces anomalus e B. custersianus, todas com 6,25% de ocorrncia rara

    (Figura 2).

    Foram de ocorrncia comum as praias de Casa Caiada e Bairro Novo; Candida

    catenulata, C. fennica, C. sake, Brettanomyces bruxellensis e Rhodotorula mucilaginosa.

    O maior nmero de isolamentos verificou-se tanto no vero como no inverno em solo de

    superfcie nas baixa-mars. Na gua a ocorrncia foi bem menor do que no solo destacando

    gua em profundidade na preamar nos perodos de vero e inverno ( Figuras 3 e 4 ) .

  • 38

    5.4. Anlise de similaridade entre as espcies isoladas

    A anlise cofentica da similaridade das espcies apresentou um r = 0,96, com dados bem ajustados, indicando diferena entre as espcies. Foram evidenciados 4 grupos de espcies. O grupo 1 associou Brettanomyces anomalus, Thichosporon beigelli, Brettanomyces bruxellensis, Candida maltosa e Rhodotorula minuta. O grupo 2 foi o maior com 8 espcies, associando Brettanomyces custersianus, Candida rugopelliculosa, Thichosporon adeninovarans, Thichosporon aquatile Candida sake, Candida parapsilosis, Rhodotorula glutinis, e Thichosporon dulcitum. O grupo 3 associou entre as espcies. Candida bambicola, Candida mi lleri, Candida catenulata, Candida fennica, Candida intermedia, Candida rhagii e Candida melibiosica. O grupo 4 asssociou Cndida pseudolambica, Rhodotorula ingeniosa e Rhodotoryla mucilaginosa (Figura 5).

    No grupo 1 foram associadas espcies isoladas na praia de Casa Caiada no perodo de inverno, com exceo de Brettanomyces bruxellensis que ocorreu nos dois perodos, inverno e vero. O grupo 2 associou 8 espcies que ocorreram na praia de Casa Caiada nos perodos de vero e inverno. No grupo 3 foram associadas 7 espcies isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo nos perodos de vero e inverno. O grupo 4 associou apenas 3 espcies que ocorreram na praia de Bairro Novo no perodo de vero e inverno. As espcies que no entraram na associao ocorreram uma nica vez, sendo retiradas, para no constar alteraes no resultado da anlise.

  • 39

    Figura 5 Dendrograma de similaridade das espcies isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro

    Novo, nos perodos de vero e inverno.

    0,50

    0,75

    0,25

    0,00

    1,00

    B.anomalus T.beigelli

    B.bruxellensis

    C.maltosa

    R.minuta B.custersianus

    C.rugopelliculosa T.adeninovorans

    Taquatile . C.sake

    C.parapsilosis R.glutinis

    T.dulcitum

    C.bombicola C.milleri C.catenulata

    1

    2

    3

    4 C.fennica

    C.rhagii C.intermedia

    C.melibiosica C.pseudolambica

    R.rigeniosa R.mucilaginosa

    C.saitoana

    T.lutetiae

    C.vaccinii

    C.diddensiae C.blankii

    C.albicans

  • 40

    5.5. Caracterizao quanto a fatores de patogenicidade das amostras

    de leveduras isoladas nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo.

    Das 58 amostras de leveduras testadas, observou-se que a maioria das amostras

    cresceu a 37C. (Tabela 8).

    Kwon-Chung et al., (1985) e Hanel (1988) referem que o crescimento de

    espcies de leveduras a 37C pode est relacionado a fatores de patogenicidade.

    Das amostras testadas, apenas (7) apresentaram atividade fosfolipsica positiva,

    dentre elas Candida sake (1), Brettanomyces bruxellensis (2), B. custersianus (1),

    Rhodotorula ingeniosa (1), R. minuta (1) e R. mucilaginosa (1) (Tabela 8).

    As amostras de Rhodotorula, Brettanomyces e Candida que apresentaram

    atividade fosfolipsica positiva cresceram a 37C, com exceo de R. ingeniosa.

    (Tabela 8 e Figura 6 ).

    Algumas espcies como Rhodotorula glutinis, R. minuta e R. mucilaginosa que

    apresentam atividade fosfolipsica positiva e crescimento a 37C, so referidas como

    patognicas ao homem por Barnett et al., 1990.

    Samaranayake et. al., (1984) no detectaram atividade fosfolipsica em

    espcies de Candida tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis, consideradas espcies

    patgenas ao homem ( Barnett et al., 1990). Candida parapsilosis com ocorrncia no

    solo da praia de Casa Caiada, tambm no apresentou atividade fosfolipsica.

    Peter et. al., (1996) detectaram atividade fosfolipsica em amostras de

    Rhodotorula rubra em meio contendo gema de ovo. Segundo os autores leveduras

    como agentes oportunistas podem apresentar atividade fosfolipsica positiva.

    A fosfolipase teoricamente, considerada como fator de virulncia em espcies

    de Candida segundo Samaranayake et al., (1984).

    A atividade protesica positiva foi detectada em amostras de Candida e

    Rhodotorula (Tabela 8 e Figura 7 ).

    Das amostras testadas apenas Candida diddensiae (1), Rhodotorula ingeniosa

    (1) e R. Glutinis (1) apresentararam atividade protesica positiva.

    Os resultados esto de acordo com (Meyers et al., 1967, Ahearn et al., (1968);

    Hagler e Ahearn, (1981) que demonstraram atividade protesica em algumas espcies

    isoladas de ambiente marinho.

  • 41

    Cryptococcus, Debaryomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Pichia ( Ahearn et al.,

    1968). Meyers et al., (1967) testaram a atividade protesica em isolados de ambiente

    marinho indicando que algumas espcies como Candida punicea, C. pseudotropicalis,

    C. curiosa e C. lipolytica apresentaram atividade protesica positiva.

    Os resultados obtidos quanto a atividade protesica de R. glutinis esto de

    acordo com Vazquez et. al., (1993) que demonstraram atividade protesica em espcies

    de Rhodotorula rubra e R. glutinis em isolados de peixes.

  • 42

    6. CONCLUSES

    Espcies de Candida, Rhodotorula, Brettanomyces e Trichosporon ocorrem em solo e gua de ambiente marinho no Brasil;

    Candida vaccinii, citada pela primeira vez em ambiente marinho no Brasil;

    Maior nmero de isolamentos ocorre em solo de superfcie;

    Brettanomyces bruxellensis apresentou maior freqncia de ocorrncia em solo nas praias de Casa Caiada e Bairro Novo;

    Leveduras isoladas de ambiente marinho no demonstram resultados satisfatrios para atividade protesica.

  • 43

    7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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