________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Introdução

Câncer: conceitos básicos

Câncer é o nome dado para um grupo de mais de uma centena de

doenças caracterizadas pela perda do mecanismo de controle que governa a

proliferação celular e a diferenciação, podendo ocorrer em diferentes células do

corpo. No caso de tumores sólidos, a proliferação descontrolada das células

forma tumores locais que podem comprimir ou invadir tecidos vizinhos normais.

Uma pequena população de células dentro do tumor pode ser descrita como

células-tronco. Elas mantêm a sua habilidade de sofrer repetidos ciclos de

proliferação, como também migrar a distantes partes do corpo, colonizando

vários órgãos, em um processo conhecido como metástase (American Cancer

Society, 2009).

O processo pelo qual células normais transformam-se progressivamente

em células malignas requer a ocorrência de mutações sequenciais que surgem

como consequência de um dano no DNA. Este pode ser resultado de um

processo endógeno, tal como erros na replicação do DNA, instabilidade química

intrínseca de certas bases de DNA ou ataques por radicais livres gerados

durante o metabolismo. Danos no DNA podem também surgir como resultado de

interações com agentes exógenos, tal como radiação ionizante, radiação

ultravioleta, carcinogênicos químicos e biológicos. As células normalmente

reparam estes danos, mas, por várias razões, erros ocorrem e alterações

permanentes no genoma são introduzidas. Algumas mutações ocorrem em

genes responsáveis pela manutenção da integridade do genoma, facilitando,

assim, a ocorrência de mutações adicionais (American Cancer Society, 2009).

Existem três tratamentos disponíveis para o câncer: cirurgia, radioterapia

e quimioterapia., embora existam tratamentos alternativos, como por exemplo,

o transplante de medula em mieloma múltiplos. Metade dos pacientes de câncer

não pode utilizar cirurgia nem radioterapia como alternativas de tratamento

devido às próprias características do tumor, como o tamanho, a localização e a

resistência à radioterapia, restando apenas à quimioterapia como opção de

tratamento. Entretanto, mesmo a quimioterapia apresenta dificuldades e a

maior delas é a resistência do câncer aos quimioterápicos utilizados atualmente

(American Cancer Society, 2009; ULLAH, 2008).

98

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosResistência a múltiplas drogas (MDR)

A resistência aos quimioterápicos é o maior obstáculo no sucesso de uma

terapia antineoplásica. Alguns tumores são intrinsecamente resistentes ao

tratamento, enquanto outros adquirem progressivamente resistência múltipla a

uma grande variedade de fármacos estruturalmente e funcionalmente não

relacionados, tais como a antraciclinas, alcaloides da Vinca, epipodofilotoxinas,

taxanos e actinomicina D (ULLAH, 2008; TEODORI et al., 2006). Os problemas

relacionados a essa resistência e o modo de superá-los ou mesmo explorá-los,

constituem uma área de grande interesse dos oncologistas e profissionais de

áreas afins (MOLNÁR et al., 2006).

Os oncologistas foram os primeiros a observarem que cânceres tratados

com várias drogas antineoplásicas tendem a desenvolver uma resistência

cruzada para agentes citotóxicos, eliminando, com isso, a possibilidade de curar

esses tumores com quimioterapia. Esta observação sugere que a resistência a

múltiplas drogas (MDR) é, em muitos casos, resultante de mudanças

hereditárias nas células cancerosas, causando alterações nos níveis de proteínas

específicas, ou proteínas mutantes, que permitem às células cancerosas

sobreviverem na presença de vários agentes citotóxicos diferentes.

As alterações genéticas que conferem resistência aos agentes neoplásicos

podem afetar o ciclo celular, a susceptibilidade das células a apoptose, a

captação e efluxo de drogas, a armazenagem intracelular das drogas ou o

reparo de danos induzidos pelas drogas (normalmente no DNA).

O mecanismo melhor estudado de MDR envolve a superexpressão de uma

bomba de efluxo de muitas drogas dependente de energia, conhecida como

transportador de muitas drogas ou P-glicoproteína (P-gp), atualmente

denominada ABCB1. Esta proteína pertence à super família de transportadores

ABC (ATP Binding Cassete) que contêm uma sequencia altamente conservada,

que é ligadora de ATP. A P-gp (figura 29) é uma proteína da membrana

plasmática de 170 –180 kDa e é codificada pelo gene MDR1 (ULLAH, 2008).

Atualmente, sabe-se que outras proteínas de membrana participam deste

mecanismo de resistência, tais como a MRP (Multidrug Resistance-Associated

Protein) e a BCRP (Breaster Cancer Resistance Protein).

99

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Figura 29: Desenho esquemático da P-gp (SORRENTINO, 2002)

Produtos naturais como fonte de medicamentos

Os produtos naturais têm desempenhado um importante papel no

tratamento de enfermidades, desde os tempos mais remotos da história da

humanidade. No início do século XX, 80 % dos medicamentos eram de origem

natural (raízes, folhas e cascas) ou eram inspirados em substâncias presentes

nestas partes vegetais. Atualmente, os produtos naturais continuam sendo uma

importante fonte de fármacos e protótipos, responsável por 60% dos

antitumorais e 75% antimicrobianos, por exemplo, (HARVEY, 2008). A tabela 14

abaixo mostra diferentes fármacos de origem natural que estão em diferentes

estágios de desenvolvimento.

Tabela14: Origem de fármacos baseados em produtos naturais em diferentes estágios de desenvolvimentoEstágio de desenvolvimento

Vegetal

Bacteriano

Fúngico

Animal Semi-sintético

Total

Pré-clínico 46 12 7 7 27 99Fase I 14 5 0 3 8 30Fase II 41 4 0 10 11 66Fase III 5 4 0 4 13 26Pré-registro 2 0 0 0 2 4Total 108 25 7 24 61 225

Sendo assim, pode-se concluir que os produtos naturais continuam

ocupando um relevante papel na descoberta de novos agentes terapêuticos.

Produtos naturais como fonte de agentes antitumorais

100

(HARVEY, 2008)

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosAs plantas têm sido uma importante fonte de agentes antitumorais para

uso clínico. Dentre estes, se podem citar a vimblastina, vincristina, camptotecina

e derivados, topotecano, irotecano, etoposideo e paclitaxel (figura 30) (CRAGG

et a.l, 2005).

Figuras 30 – Antitumorais de origem natural

101

VIMBLASTINA (R = CH3)VINCRISTINA (R = CHO)

TAXOL

IRINOTECANO CAMPTOTECINA

ETOPOSÍDEO TOPOTECANO

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosAtualmente, mais de 30 novas substâncias de origem natural

estão em diferentes fases de teste clínico no tratamento de diferentes

cânceres. Como exemplo, tem-se ixabepilona, romidepsina, ECO-4601 e

curcumina (figura 31) (GORDALIZA, 2007).

Figura 31- Novos antitumorais de origem natural

Desta forma, a busca de novos agentes antitumorais de origem natural

mostra-se viável e encorajadora, sendo este outro objetivo da presente

dissertação.

Flavonoides como agentes antitumorais

102

IXABEPILONA ROMIDEPSINA

ECO-4601 CURCUMINA

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Os flavonoides têm um largo espectro de atividades biológicas (Tabela

15). Um número significativo de flavonóides tem apresentado ação antitumoral

em vários modelos animais. Atualmente, existe um considerável interesse por

estas substâncias, devido aos seus efeitos benéficos nos diversos mecanismos

envolvidos na patogênese do câncer. As propriedades antioxidantes foram às

primeiras características estudadas nos flavonoides, em particular aquelas

relacionadas aos efeitos protetores contra doenças cardiovasculares (CAZAROLLI

et al., 2008).

Estas substâncias têm mostrado uma notável eficiência na eliminação de

radicais livres, que são agentes causadores de danos no DNA, os quais podem

acarretar a promoção de tumores. Vários flavonoides (quercetina e apigenina,

por exemplo) revelaram possuir ação antiinflamatória, atuando na inibição da

ciclooxigenase 2 (COX-2) e induzindo a óxido nítrico sintase. A inflamação

crônica desenvolve um importante papel na etiologia de diversos cânceres e

inibidores de COX-2 estão sendo estudados como agentes preventivos

(CAZAROLLI et al., 2008).

Outra característica que tem sido demonstrada para vários flavonoides é

a sua capacidade de inibir o crescimento de diversas linhagens de câncer

humano. Em tumores estrógenos-dependentes, este efeito inibitório tem sido

relacionado às propriedades antiestrogênicas de certos flavonoides

(isoflavonoides e quercetina, por exemplo). Em outros modelos in vitro, os

flavonoides têm também demonstrado afetar a sinalização celular e o ciclo

celular de progressão. Por exemplo, certos chás contendo flavonoides inibem o

sinal de transdução mediada pelo fator de crescimento epidermal e o fator de

crescimento plaquetário, favorecendo, assim, a inibição da angiogênese

(CAZAROLLI et al., 2008). Genisteína e quercetina inibem a tirosina quinase,

envolvida na proliferação celular. Finalmente, foi demonstrado que apigenina,

luteolina e quercetina causam apoptose por um mecanismo dependente de p-

53. Em síntese, múltiplos mecanismos antineoplásicos têm sido relacionados aos

flavonoides (CAZAROLLI et al., 2008).

Outro caso promissor é o flavopiridol (figura 4), uma flavona semi-

sintética análoga da rohitukina, uma substância antitumoral oriunda de uma

espécie vegetal indiana. Flavopiridol inibe quinases dependentes de ciclina

(CDKs), apresentando propriedade antitumoral inédita. É o primeiro inibidor de

CDKs a ser avaliado em testes clínicos em humanos pela Aventis Pharma e pelo

Instituto Nacional do Câncer (NCI) no tratamento de câncer. Testes iniciais com

103

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosinfusão de flavopiridol mostraram um efeito benéfico deste derivado em alguns

pacientes com linfoma non-Hodgkin’s, câncer de rins, de próstata, de cólon e

gástrico (REN et al, 2003).

Tabela 15: Flavonoides com atividade antitumoral em diferentes linhagens

celulares de câncer

Câncer Célula Flavonoide

Cancer oral humano

HSC-2, HSG, SCC-25

Flavavonas, isoflavanas, EGC, chalconas, EGCG, curcumina, genisteína, ECG, quercetina, cisplatina

Cancer de mama humano

MCF-7Flavavonas, daidzeína,genisteína, quercetina, luteolina

Cancer de tireóide humano

ARO, NPA, WROGenisteína, apigenina, kaempferol, crisina, luteolina, biochanina A

Cancer de fígado humano

SK-LU1, SW900, H441, H661, haGo-K-1, A549

Flavona, quercetina

Cancer de próstata humano

LNCaP, PC3, DU145

Catequina, epicatequina, quercetina, kaempferol, luteolina, genisteína, apigenina, miricetina, silimarina

Cancer de colo humano

Caco-2, HT-29, IEC-6, HCT-15

Flavona, quercetina, genisteína, antocianina

Leucemia humano

HL-60, K562, Jurkat

Apigenina, quercetina, miricetina, chalconas

Parte Experimental I

104

Figura 32 – Estrutura do flavopiridol

(REN et al. 2006)

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

O presente estudo foi realizado sob a orientação da Profa. Dra. Márcia A.

M. Capella no laboratório de Fisiologia Renal (Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho).

Células e condições de cultura

Células utilizadas

Neste estudo foram utilizadas as seguintes linhagens celulares:

Melan-A – melanócito murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz

Monteiro, Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ.

B16F10: melanoma murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz Monteiro.

K-562: leucemia humana, que não expressa o fenótipo MDR, e é sensível

ao quimioterápico vincristina (VCR). Cedido pela Profa. Vivian Rumjanek,

Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ

K-562 – Lucena-1: leucemia humana, que possui o fenótipo MDR,

resistente à vincristina, Cedido pela Prof.a Vivian Rumjanek.

Reagentes e equipamentos

Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino foram

obtidos da Invitrogen do Brasil (São Paulo, Brasil).

Kit de dosagem de desidrogenase láctica (DHL) adquirido da Doles

(Goiânia, Brasil).

Soluções

105

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos O meio de cultura de células (DMEM, baixa glicose) foi preparado em

água ultra pura (miliQ), sendo posteriormente filtrado através de membranas de

0,2 μm. Soro fetal bovino foi adicionado em concentração final de 10% na hora

do uso.

A solução salina com tampão fosfato PBS (NaCl 137 mM; Na2PO4 8,1 mM;

KH2PO4 1,5 mM; KCl 2,7 mM) foi preparada em água MiliQ e esterilizada em

autoclave.

Cultura de Células

Melan-A e B16 F10

As linhagens celulares Melan-A e B16F10 foram cultivadas em DMEM

suplementado com 10% de soro fetal bovino (SBF) a 37°C. À Melan A era

adicionado 1 μl de PMA (miristato-acetato de forbol) a 10-6 M, um agente

mitógeno

As passagens foram realizadas a cada dois ou três dias ou assim que as

células atingissem a confluência. Para os procedimentos de subcultivo, retirava-

se o meio de cultura, sendo as células lavadas duas vezes com 5 ml de PBS

estéril para retirada de proteínas e células mortas. Em seguida adicionava-se 1

ml de tripsina 0,5g/l (diluída em PBS). Posteriormente, as células eram então

incubadas em estufa por cerca de 10 minutos, tempo suficiente para que as

células se soltassem da garrafa. O processo era então interrompido com adição

de um volume equivalente de meio de cultura com soro. Após dissociação

mecânica de quaisquer grumos de células remanescentes, aproximadamente

4/5 da suspensão de células era transferida para um tubo do tipo Falcon,

enquanto o restante era usado na manutenção da garrafa de cultura. As células

eram, então, contadas em microscópio invertido, com o uso de uma câmara de

Neubauer para que a quantidade apropriada de células fosse destinada à cultura

em placas, de acordo com o experimento planejado. As placas eram incubadas

na estufa de cultura.

K-562 e K-562–Lucena-1

106

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos As linhagens celulares K-562 e K562-Lucena-1 cresceram em suspensão

em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino em

garrafas plásticas de 50 ml na estufa a 37°C por três dias. Sendo que a linhagem

K-562-Lucena-1 era mantida na presença de VCR 60 nM.

Para os procedimentos de subcultivo, retirava-se o meio de cultura com

as células, colocando-os em um tubo tipo Falcon e centrifugando em seguida

para retirada de proteínas e células mortas. Após a centrifugação, descartava-se

o meio e ressuspendia-se as células em 4 ml de meio com soro. Após esse

procedimento, 3/4 desse volume era colocado em um tubo Falcon, enquanto o

restante era usado na manutenção da garrafa de cultura. As células eram,

então, contadas em microscópio invertido, conforme procedimento mencionado

para as linhagens B16F10 e Melan A.

Medida da Viabilidade Celular – Dosagem de LDH (lactato desidrogenase)

Para a avaliação da viabilidade celular, utilizou-se um ensaio que se

baseia na redução de um sal de tetrazólio (fenanzina metossulfato) e

conseqüente formação de formazana no meio em suspensão. O teste de LDH é

um marcador de membrana integra. A enzima desidrogenase láctica está

presente em todo o citoplasma celular, e quando a membrana é danificada há

um contato com o meio externo. Este teste detecta a presença da LDH no meio

indiretamente devido à reação de redução do sal de tetrazólio (fenanzina

metossulfato) que depende do LDH para que a reação ocorra. Esta enzima pode

ser detectada pela ação catalítica e indireta de conversão do sal de tetrazólio

em outro corante solúvel em água. Sendo assim, o LDH permite analisar o

numero total de células viáveis, isto correlacionado com a proliferação das

mesmas.

Após 24 horas de incubação com as frações a serem testadas, uma

alíquota de 50 µl de sobrenadante de cada poço foi retirada e colocada em outro

poço de outra placa de 96 poços. Em seguida, adicionava-se um volume de 100

µl em cada poço de uma solução de alumen férrico e substrato (lactato) na

proporção de 1:16, deixando, logo após, a placa na estufa a 37 °C por três

minutos. Posteriormente, adicionava-se aos poços um volume de 100 µl de uma

solução de fenanzina metosulfato (FMS) + NAD, na proporção de 1:20 em água,

e a seguir, colocava-se a placa na estufa de 37°C por nove minutos. Ao término

107

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosdeste tempo, procedia-se com a leitura da densidade ótica de cada poço em

leitor de ELISA (Benchmark, BioRad) no comprimento de onda de 510 nm.

Análise estatística

Excetuando os ensaios preliminares de citotoxicidade, os demais

experimentos foram analisados através do teste de análise de variância (one-

way ANOVA), usando intervalo de confiança de 95% e 99%. A magnitude das

diferenças foi verificada com os pós-testes de Dunnet.

Ensaios de CitotoxicidadeENSAIOS DE CITOTOXICIDADE

Determinação da faixa de concentração citotóxica

Objetivo

Com o objetivo de determinar a faixa de concentração em que as quatro

linhagens celulares apresentassem maior susceptibilidade às frações de acetato

de etila, KT1 e KT2, procedeu-se com o presente experimento, descrito abaixo.

Procedimento Experimental IA

As células foram cultivadas em placas de 96 poços (200µl/poço) em uma

concentração de 2x104 céls/poço e incubadas a 37ºC. Após 24 horas iniciaram-se

os experimentos.

As células foram tratadas inicialmente com as frações acetato de etila,

KT1 e KT2 nas concentrações de 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml. As frações KT1 e KT2,

como visto anteriormente, são oriundas da fração acetato de etila. Os

experimentos foram realizados com um n = 2, não sendo, por isso, realizados

testes estatísticos.

Resultados

108

AcOEt

KT1

KT2

Melan-A

AcOEt

KT1

KT2

B16F10

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Linhagens de melanoma e melanócito: B16F10 e Melan A

Neste experimento, as linhagens celulares utilizadas apresentaram

relevante sensibilidade frente às três frações testadas na concentração mais

elevada (0,1 mg/ml).

A fração de acetato de etila apresentou citotoxicidade praticamente

semelhante em ambas as linhagens (em torno de 40% de morte celular). Da

mesma forma, a fração KT1 apresentou citotoxicidade semelhante nas duas

linhagens (em torno de 45% de morte celular). Por último, a fração KT2

apresentou citotoxicidade ligeiramente maior na linhagem B16F10 (em torno de

40% de morte), mostrando-se mais susceptível que a Melan-A.

109

Figura 33: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre Melan-A. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.

AcOEt

KT1

KT2

AcOEt

KT1

KT2

K-562

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Linhagens leucêmicas: K-562 e Lucena

A análise dos experimentos referentes às linhagens leucêmicas K-562 e

Lucena permitiu averiguar que ambas apresentaram morte celular aparente

significativa na concentração mais elevada (0,1 mg/ml) em todas as frações

testadas.

A fração de acetato de etila foi mais tóxica para Lucena (em torno de

38% de morte celular). Já a fração KT1 apresentou alta toxicidade para K-562

(em torno de 60% de morte celular). Por fim, a fração KT2 foi mais tóxica para K-

562 (em torno de 40% de morte celular).

110

Figura 34: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre B16F10. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.

Figura 35: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre Lucena. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata.

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Conclusões parciais

Assim como nas linhagens estudadas anteriormente, os resultados

apresentados para estas linhagens favorecem a continuação dos ensaios, tendo

em vista a susceptibilidade das mesmas na concentração de 0,1 mg/ml. Uma

nova faixa de concentração mais ampla será estabelecida, devendo está

compreendida entre 0,01 a 0,1 mg/ml. Por meio desta será possível obter uma

curva de dose-resposta para cada linhagem, obtendo-se com isso, um perfil de

responsividade para cada fração testada, assim como um perfil de

susceptibilidade.

É importante ressaltar que a inexistência de um tratamento estatístico dos

dados obtidos nestes experimentos não invalida o perfil de susceptibilidade das

linhagens frente às frações testadas. Todavia, não serve para comparar os perfis

de susceptibilidade entre si, tendo em vista que em alguns casos os valores

ficaram próximos e podem sofrer desvios.

Curva de dose-resposta – Perfil de susceptibilidade

Objetivo

Com o objetivo de determinar a curva dose-resposta das frações KT1,

KT2 e do flavonóide KTA (corniculatusina 3-O-β-glucopiranosídeo), realizou-se o

experimento com as linhagens celulares utilizadas nas experimentações

anteriores, em uma faixa de concentração compreendida entre 0,01-0,1 mg/ml.

111

Figura 36: efeito das subfrações: acetato de etila, KT1 e KT2 sobre K-562. Células tratadas com as subfrações nas concentrações: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em e triplicata.

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosOutro objetivo do ensaio foi determinar o perfil de susceptibilidade das linhagens

e compará-las entre si, ou seja, Lucena versus K-562 e B16F10 versus Melan A.

Procedimento Experimental IB

Baseando-se nos resultados obtidos previamente, trabalhou-se com as

seguintes concentrações: 0,01; 0,025; 0,05; 0,075 e 0,1 mg/ml.

As células foram cultivadas em placas de 96 poços (200 µl/poço) em uma

concentração de 2x104 células/poço e incubadas a 37ºC na estufa. Após 24

horas iniciaram-se os experimentos.

Estes experimentos foram realizados com um n representativo de 3 para

a Melan-A, K-562, Lucena e um n de 2 para a B16F10, devido a problemas de

ordem técnica, devendo ser complementado posteriormente. Sendo assim,

somente nos experimentos com a linhagem B16F10 não foram realizados os

testes estatísticos.

Resultados e Discussão

Os resultados obtidos a partir das diferentes frações testadas serão

apresentados a seguir, seguido de suas respectivas discussões.discussões.

112

Melan A – KT1

B16F10 – KT1

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosEnsaios realizados com a fração KT1

Linhagens de melanoma e melanócitos: B16F10 e Melan A

Resultados em Melan-A

Neste experimento constatou-se uma relação dose-resposta para a fração

KT1 na faixa de 0,01-0,1 mg/ml. Observaram-se crescentes taxas de morte

celular em concentrações crescentes. Na concentração mais elevada (0,1mg/ml)

obteve-se uma taxa de morte de aproximadamente 40%. Esta linhagem de

melanócitos murino, neste ensaio, atua como grupo controle de células sadias e

normais.

Resultados em melanoma B16F10

Com a linhagem B16F10 (melanoma murino), observou-se para a fração

KT1 uma resposta semelhante à observada no experimento com a Melan A. As

crescentes concentrações foram acompanhadas de crescentes taxas de morte

célula, sendo a maior observada em 0,1 mg/ml, em torno de 40%.

113

Figura 37 efeito da fração, KT1 sobre Melan A. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%.

K-562 – fração KT1

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Linhagens Leucêmicas: K-562 e Lucena

Resultados em linhagem leucêmica K-562

Neste experimento, a K-562 respondeu às crescentes concentrações de

KT1, alcançando na concentração de 0,1mg/ml uma taxa de morte de

aproximadamente 45%. Por meio deste ensaio averiguou-se a susceptibilidade

desta linhagem frente à fração testada.

.

Resultados em linhagem leucêmica Lucena

114

Figura 38: efeito da fração, KT1 sobre B16F10. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média.

Figura 39: efeito de KT1 sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

Lucena –fração KT1

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos O presente resultado confirma os resultados prévios obtidos com a

Lucena utilizando esta fração. Observa-se também neste ensaio um crescente

aumento da susceptibilidade celular em maiores concentrações de KT1,

chegando a um percentual de morte de aproximadamente 48% em 0,1 mg/ml.

Os bufadienolidos são esteróides cardioativos, conhecidos desde os

tempos mais remotos. Podem ser oriundos de fontes animais, tais como sapos

do gênero dos Bufonidae, como em plantas. No reino vegetal foram encontrados

em 6 familías: Crassulaceae, Hyacinthaceae, Iridaceae, Melianthaceae,

Ranunculaceae e Santalaceae (KRENN e KOPP, 1997).

Na famíla Crassulaceae estão presentes em diferentes espécies (STEYNE

et al., 2006). Até o momento, existem alguns estudos sobre as atividades

antitumorais de bufadienolidos. Na espécie Kalanchoe hybrida foram descritos

os bufadienolidos acetato de 3-bersaldegenina, acetato de 3-daigredorinenina,

assim como as kalanhibrinas A, B e C. Todos estes apresentaram atividade

citotóxica para as linhagens tumorais MCF-7, NCI-H460 e SF-268 (KUO et al.,

2008). Outros relatos mostram a ação citotóxica de kalanchosidos A, B e C,

oriundos de Kalanchoe gracilis para as linhagens celulares: KB (carcinoma

humano epidermóide), A-549 (câncer de pulmão), 1A9 (câncer de ovário), PC-3

(câncer de próstata) (WU et al., 2006).

Em relação aos bufadienolidos presentes em K. tubiflora, existem relatos

na literatura de citotoxicidade da briofilina A, também denominada briotoxina C

115

Figura 40: efeito da subfração, KT1 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

B16F10 – KT2

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos(YAMAGISHI et al., 1988) frente às linhagens de células tumorais KB, A-549

(adenocarcinoma humano de pulmão), HCT-8 (carcinoma de cólon humano), P-

388 (leucemia linfocítica de murinos) e L-1210 (leucemia de ratos) e com

briofilina B (YAMAGISHI et al., 1989) frente à linhagem KB.

Os resultados apresentados no presente trabalho evidenciam a

citotoxicidade da fração KT1 (rica em bufadienolidos) para todas as linhagens

testadas, inclusive em células sadias como Melan-A. Até o presente momento

não existem relatos de estudos destes bufadienolidos com estas linhagens

celulares na literatura.

Estudos de estrutura-atividade demonstram a importância do grupo orto-

acetato na atividade antitumoral contra a linhagem leucêmica P-388 e propõe

que os bufadienolidos exercem sua ação modulando reguladores do ciclo celular,

tais como a proteína cinase C (LIAL et al., 2009).

Por fim, frente ao exposto, os resultados obtidos são de grande

importância, para o conhecimento desta espécie e na bioprospecção de agentes

antitumorais.

As evidências de citotoxicidade destas substâncias frente estas linhagens

celulares, encorajam a continuação dos estudos, visando o isolamento dos

bufadienolidos e avaliação do seus respectivos perfis de citotoxicidade.

Ensaios realizados com a fração KT2

Linhagens de melanoma e melanócito: B16F10 e Melan-A

Resultados em melanoma B16F10

Neste ensaio pode-se observar uma gradual susceptibilidade da

linhagem frente a crescentes concentrações da fração KT2, chegando a uma

taxa de morte de aproximadamente 42 % na concentração de 0,1mg/ml.

116

Melan A – KT2

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Resultados em linhagem Melan-A

Os resultados obtidos neste estudo apontam para uma resposta linear de

Melan A frente a crescentes concentrações de KT2. Esta fração apresenta um

perfil de toxicidade nesta linhagem, alcançando um percentual de morte de 40%

na concentração mais elevada (0,1 mg/ml).

Linhagens leucêmicas: K-562 e Lucena

Resultados em linhagem leucêmica K-562

117

Figura 41: efeito da fração, KT2 sobre B16F10. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de dois experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média.

Figura 42: efeito da fração, KT2 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

K-562 – KT2

Lucena – KT2

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos Neste ensaio pode-se observar uma responsividade linear em crescentes

concentrações de KT2. Na maior concentração (0,1mg/ml), observou-se uma

taxa de morte de aproximadamente 35%.

Resultados em linhagem leucêmica Lucena

Neste ensaio pode-se observar uma responsividade a KT2 aparentemente

maior que a observada para K-562. Observou-se também um comportamento

linear frente a crescentes concentrações de KT2, alcançando uma taxa de morte

de aproximadamente 42% na concentração mais alta (0,1mg/ml).

118

Figura 43: efeito da fração, KT2 sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicos

Em todos os resultados obtidos com as quatro linhagens, observou-se

ação citotóxica da fração KT2. No capítulo II, a análise de CLAE evidenciou a

presença de pelo menos 6 flavonóides nesta fração. Acredita-se que a ação

citotóxica observada pode está ocorrendo ou pela ação de um único flavonóoide

presente na mistura ou pela ação conjunta de dois ou mais flavonóides

(sinergismo).

Nos ensaios com as linhagens B16F10 e Melan A, a ação citotóxica foi

observada para ambas as linhagens. A Melan A foi utilizada como referencial de

células normais e sadias. Aparentemente, os resultados obtidos não são

promissores, visto a toxicidade observada. Entretanto, como KT2 é constituída

de uma mistura de flavonóoides, tornam-se necessários estudos posteriores com

os flavonóides isolados, a fim de descobrir a ação de cada um ou daqueles que

são majoritários. Desta forma, ainda são prematuros e inconclusivos os

resultados obtidos até aqui.

Na literatura são encontradas algumas citações de efeitos citotóxicos de

flavonóoides para a linhagem B16F10, como por exemplo: tangeretina, rutina

(um derivado diglicosilado do flavonol quercetina), e diosmina (CONESA et al.,

2005), luteolina, baicaleina e quercetina (YÁÑEZ et al., 2004), entre outros. Para

Melan-A existem menos relatos. Dentre os existentes, cita-se a ação dos

flavonóides

miricetina e baicaleina. O ácido fenólico – ácido gálico – também revelou

atividade citostática (MARTINEZ et al., 2006).

Os resultados obtidos com as linhagens leucêmicas são promissores,

pois para ambas as linhagens foram observadas susceptibilidade a KT2.

Constatou-se ainda, uma maior susceptibilidade da linhagem resistente a

múltiplas drogas (Lucena) quando comparada à linhagem não resistente (K-562).

119

Figura 44: efeito da fração KT2 sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. a – representa um intervalo de confiança de 99%. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

K-562 – Flavonide KTA

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosOs resultados atuais encorajam o estudo e isolamento de flavonóoides desta

fração. Uma discussão mais aprofundada dos resultados com flavonóides será

feita mais adiante, ao final dos ensaios com o flavonóoide KTA.

Ensaios realizados com o flavonóoide KTA (Corniculatusina 3-O-β-glucopiranose)

Resultados e discussões

Linhagens leucêmicas K-562 e Lucena

Resultados em linhagem K-562

Neste ensaio observou-se o efeito citotóxico do flavonóoide KTA

(corniculatusina 3-O-β-glucopiranosídeol) sobre a linhagem K-562. Verificou-se a

responsividade desta linhagem a concentrações crescentes de KTA, mostrando-

se susceptível. Uma taxa de morte 37% é observada na concentração de 200

µM.

Resultados em linhagem Lucena

Neste ensaio pode-se observar linearidade na taxa de morte de Lucena ao

aumento da concentração do flavonóoide KTA, evidenciando a susceptibilidade

da mesma. Significativa taxa de morte celular (42%) foi observado na

120

Figura 45: efeito de KTA sobre K-562. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

Lucena – Flavonoide KTA

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosconcentração de 200 µM. Pode-se constatar também uma maior sensibilidade de

Lucena a KTA que K-562, igualmente observado para a fração KT2.

Resultados e discussões

Sobre o gênero Kalanchoe existem alguns estudos realizados com

enfoque em bioprospecção de agentes imunomoduladores. Os flavonóoides

testados apresentam em sua maioria ação inibitória sobre linfócitos, justificando

a ação imunossupressora observada em diferentes extratos de Kalanchoe

(COSTA et al., 2008).

Com relação às linhagens tumorais em estudo, existem alguns relatos na

literatura referente à ação citotóxica de diferentes flavonóides. Sobre as

linhagens leucêmicas existem alguns relatos da ação citotóxica. Os flavonóides

gossipina (BABU et al., 2003), tilirosídeo (SOUZA et al., 2002), genisteína

(CONSTANTINOU E HUBERMN, 1995). vitexicarpina (WANG et al., 2005),

apigenina, quercetina, miricetina, e chalconas (REN at al., 2003) mostraram

citotoxicidade frente à linhagem K-562.

Efeitos citotóxicos de flavonóoides frente à linhagem K-562-Lucena-1 não

foram relatados até o presente momento na literatura, segundo o levantamento

121

Figura 46: efeito de KTA sobre Lucena. Células tratadas em diferentes concentrações. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas depois. Média de três experimentos em triplicata. Barras representam o erro padrão da média. b – representa um intervalo de confiança de 95%.

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosbibliográfico realizado nas bases de dados disponíveis. Desta forma, o presente

trabalho é o primeiro com este enfoque.

Os resultados com KTA apresentados mostram que a linhagem resistente

a muitas drogas (Lucena) foi mais susceptível a linhagem K-562 - não possui

fenótipo de resistência - o que ressalta a importância desses resultados, tendo

em vista que a maioria das celulares tumorais desenvolve ou já demonstra

resistência a muitas drogas.

Fica evidente também que a citotoxicidade de KT2 (mistura de

flavonóides) e a de KTA estão muito próximas. Tal fato permite sugerir que

outros flavonóides presentes em KT2, além de KTA, atuam sinergicamente em

sua ação citotóxica.

Conforme foi dito no capítulo I, este é o primeiro relato do flavonóide KTA

para o gênero Kalanchoe e, até o momento, nenhuma atividade biológica foi

relatada na literatura. Em vista disso, os resultados apresentados são inéditos e

promissores, justificando estudos posteriores.

Futuramente, o flavonóide KTA será testado nas linhagens Melan-A e

B16F10, visto que estas linhagens se mostraram susceptíveis à fração KT2, da

qual se isolou KTA. Adicionalmente, experimentos complementares devem ser

realizados, para averiguar a toxicidade de KTA em células sadias, como

leucócitos, por exemplo,

Conclusão final

Os resultados apresentados confirmam a ação citotóxica da subfração

KT1 para as quatro linhagens estudadas, sendo o seu efeito justificado pela

presença de bufadienolidos - conhecidamente tóxicos (LEE, et al. 1989) -

discutida no capítulo I. Futuramente, esta fração será purificada, objetivando a

obtenção de bufadienolidos puros para que possam ser testados nas linhagens

tumorais utilizadas neste estudo e em outras também.

Os ensaios realizados com KT2 evidenciaram a sua ação citotóxica nas

quatro linhagens estudadas. Sabendo-se que diferentes constituintes

flavonoídicos estão presentes nesta subfração, acredita-se que a ação

observada seja resultado de um sinergismo dos flavonóides presentes na

mistura.

Os ensaios com o flavonóide KTA (corniculatusina 3-O-β-

glucopiranosídeo)l, oriundo de KT2, revelaram considerável citotoxicidade, o que

indica a sua participação na ação citotóxica observada para KT2.

122

________________________________________________________________ __Capítulo III

Ensaios biológicosEstudos posteriores devem ser realizados com linfócito humanos para

averiguar a sua toxicidade em células sadias. Ensaios com as linhagens Melan-A

e B16F10 serão realizados baseando-se nos resultados promissores obtidos com

KT2.

Por fim, é importante ressaltar a importância dos resultados inéditos

obtidos neste trabalho, os quais contribuem para uma melhor compreensão da

espécie Kalanchoe tubiflora, assim como para a bioprospecção de agentes

antitumorais.

Bibliografia

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