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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
CANAIS ATIVADOS POR ATP EXTRACELULAR EM
CÉLULAS DE LEYDIG DE CAMUNDONGOS
Ligia Subitoni Antonio
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como pré-requisito
para obtenção do título de Mestre em Fisiologia.
Orientador: Prof. Dr. Wamberto Antonio Varanda
Ribeirão Preto
2008
Livros Grátis
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FICHA CATALOGRÁFICA
Antonio, Ligia Subitoni Canais ativados por ATP extracelular em células de
Leydig de camundongos. Ribeirão Preto, 2008. 95 p. : il. ; 3 cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Fisiologia.
Orientador: Varanda, Wamberto Antonio. 1. Receptores Purinérgicos. 2. ATP. 3. Células de
Leydig 4. Western Blot. 5. Imunofluorescência. 6. Eletrofisiologia.
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Data da defesa: 16/05/2008
Banca Examinadora
Prof. Dr. Wamberto Antonio Varanda
Julgamento:__________________________Assinatura:_________________________
Prof. Dr. Aldo Rogelis Aquiles Rodrigues
Julgamento:__________________________Assinatura:_________________________
Prof. Dr. Patrícia Castelucci
Julgamento:__________________________Assinatura:_________________________
4
"A ciência humana de maneira nenhuma
nega a existência de Deus. Quando
considero quantas e quão maravilhosas
coisas o homem compreende, pesquisa e
consegue realizar, então reconheço
claramente que o espírito humano é obra de
Deus, e a mais notável.”
(Galileu Galilei)
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Aos meus pais e amigos,
Alice e Carlinhos,
Por todo apoio e carinho.
A minha irmã, Dedéa,
Por me animar nos momentos difíceis.
Ao meu avô, Maurício,
Pelos conselhos valiosos.
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Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Dr. Wamberto Antonio Varanda, pela preocupação em
enriquecer a minha formação cientifica e intelectual, pelo conhecimento transmitido e
pelas constantes críticas que me fizeram amadurecer. É um privilégio aprender com um
brilhante cientista.
Ao Prof. Dr. Aldo Rogelis Aquiles Rodrigues por ser um grande incentivador ao
meu ingresso no Laboratório de Biofísica de Membranas e por contribuir no ajuste fino
desse trabalho.
A Profa. Dra. Patrícia Castelucci por aceitar gentilmente fazer parte da minha
Banca e pelas valiosas observações sobre os experimentos de imunofluorescência.
Aos meus pais, Alice e Carlinhos, por serem meus alicerces, exemplos de
dignidade e perseverança. Mãe, o que seria de mim sem o seu otimismo. Pai, o que
seria de mim sem a sua persistência. E por patrocinarem a minha vida acadêmica. Amo
muito vocês!
A minha irmã, Dedéa, pelos esforços intermináveis para me tornar uma pessoa
mais baladeira e por me divertir com seu lado rabugento. Você me faz muita falta,
Bebê!
Ao meu querido amigo, Fernandinho, por não medir esforços para me ajudar.
Por todos os ensinamentos, “pulos do gato” e ruídos vencidos.
A amiga Roberta, por toda ajuda e paciência nas sessões intermináveis de
microscopia confocal.
Ao meu namorado e melhor amigo, Daniel, pelo imenso apoio, pelos
ensinamentos de conhecimentos gerais e por me tornar uma pessoa mais paciente.
Amo você! Agradeço também ao meu amigo de penas, Fourier, o comedor de alpiste
mais inteligente que conheço.
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A minha melhor amiga, Renata, pelo companheirismo, pela paciência e por todos os
conselhos. Rê, a pós não seria a mesma sem você!
Ao meu avô, Maurício, pela hospitalidade e carinho de sempre. E por participar
ativamente do patrocínio da minha pós-graduação.
Aos meus familiares, Aninha, Bebel, Celso, Cláudia, Fer e Rick, pelo apoio e
pela alegria dos fins de semana.
Ao amigo André, pelas conversas valiosas desde eletrofisiologia até desabafos
emocionais e pelo auxílio operacional em minhas mudanças de apartamento.
Ao amigo Ernane, por me ouvir pacientemente e se preocupar com minha
felicidade.
Aos queridos amigos, Adri e Eduardo, pelos conselhos, pelos momentos de
alegria e pelo apoio logístico nas minhas mudanças de apartamento.
Aos amigos Fernanda e Jabá, pelos divertidos almoços.
As amigas de república, Danúbia, Fabi, Miriam e Valéria, pelo companheirismo
em todos os momentos, desde saudáveis caminhadas até visitas noturnas à sorveteria.
Aos colegas eletrofisiologistas Artur, Cadu, Daniela, Renato, Prof. Dr. Ricardo
Leão e Tiago, pela amizade e pelos momentos de descontração.
Aos colegas do Depto. de Fisiologia, Alex, Augusto, Beto, Daniel, Dawit,
Eduardo, Evelin, Felipe, Fernandinha, Giu, Glauber, Guillermo, Jalile, João Paulo,
Lílian, Lisandra, Lys, Marcelo, Márcio, Marina, Mateus, Ricardo, Ricardo Kusuda,
Renato e Roberta.
A amiga e fisioterapeuta particular, Ana Patrícia.
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Aos amigos de Botucatu, Dizordi, Cruj, Kero, Kutuba, Luciana, Madileine e
Prumo, pelas nostálgicas visitas à Ribeirão Preto.
Ao Prof. Dr. Marcelo Damário Gomes pela colaboração nos experimentos.
Aos amigos do Depto. de Bioquímica e Imunologia, Adriana, Ana Letícia, Felipe,
Rosana e Sami.
Ao pessoal da secretaria do Depto. de Fisiologia, Carlos, Cláudia, Elisa e
Fernandinho.
Aos técnicos do Depto. de Fisiologia, Eduardo, Léo e Rubinho.
Ao CNPq, FAPESP e FAEPA, pelo apoio financeiro.
9
Sumário
1 Resumo .....................................................................................................................11
2 Abstract.....................................................................................................................17
3 Introdução.................................................................................................................19
3.1 Células de Leydig ................................................................................................20
3.2 Receptores Purinérgicos......................................................................................21
3.3 Arranjos Homoméricos dos Receptores P2X.......................................................23
3.4 Arranjos Heteroméricos dos Receptores P2X .....................................................33
3.5 Canais para Potássio Ativados por Cálcio ...........................................................36
4 Objetivos ...................................................................................................................38
5 Material e Métodos ...................................................................................................39
5.1 Animais ................................................................................................................39
5.2 Isolamento de Células de Leydig.........................................................................39
5.2.1 Extração por Dispersão Mecânica.................................................................39
5.2.2 Purificação por Choque Osmótico.................................................................40
5.2.3 Identificação das Células por Marcação da Enzima 3ß HSD ........................41
5.2.4 Extração por Dispersão Mecânica com Colagenase e Purificação por
Gradiente Descontínuo de Percoll.................................................................43
5.3 “Western Blot”......................................................................................................45
5.4 Imunofluorescência..............................................................................................49
5.5 Captação de Corantes Fluorescentes..................................................................51
5.6 Eletrofisiologia .....................................................................................................52
5.6.1 Experimentos em “whole-cell” .......................................................................53
5.6.2 Experimentos em “cell attached”...................................................................54
5.7 Soluções e Substâncias Químicas ......................................................................54
5.8 Análise estatística ................................................................................................56
6 Resultados ................................................................................................................57
6.1 Marcação da Enzima 3ß HSD..............................................................................57
6.2 “Western Blot”......................................................................................................58
10
6.3 Imunofluorescência..............................................................................................61
6.4 Captação de Corantes Fluorescentes..................................................................64
6.5 Eletrofisiologia .....................................................................................................66
6.5.1 Configuração “whole-cell”..............................................................................66
6.5.2 Configuração “cell-attached” .........................................................................71
7 Discussão .................................................................................................................77
8 Conclusões ...............................................................................................................87
9 Referências Bibliográficas ......................................................................................88
11
Lista de Abreviaturas
aßmeATP - aßmetileno ATP
ß-NAD - enzima ß-nicotinamida adenina dinucleotídeo
ßγmeATP - ßγ-metileno ATP
[Ca2+]i - concentração de cálcio intracelular
2meATP - 2-metiltio ATP
3ß-HSD - enzima 3ß hidroxi esteróide desidrogenase
A - aminoácido alanina
Ac - anticorpo
AL - amarelo de Lúcifer
AMF - microscopia de força atômica
AMPc - adenosina 3’, 5’-monofosfato cíclico
Ap4A - P1, P4-tetrafosfato de diadenosina
Ap5A - P1, P5-pentafosfato de diadenosina
Ap6A - P1, P6-hexafosfato de diadenosina
ATP - 5’-trifosfato de adenosina
ATPγS - adenosina 5’-O-(3-tiotrifosfato)
BE - brometo de etídio
BKCa - canais para potássio dependentes de cálcio de alta condutância
BSA - albumina de soro bovino
BzATP - 3’-O-(4-benzoil)benzoil ATP
C - aminoácido cisteína
-C ou –COOH - região carboxiterminal
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CA - solução de pipeta para configuração “cell-attached”
D - ácido aspártico
DAG - diacilglicerol
DAPI - 4’,6’-diamidino-2-fenilindol
DMSO - dimetilssulfóxido
E - ácido glutâmico
EC50 - concentração de agonista que causa metade da ativação máxima
F - aminoácido fenilalanina
G - aminoácido glicina
H - aminoácido histidina hCG - hormônio gonadotrofina coriônica humana
HEK 293 - linhagem de células em cultura originárias de rim de embrião humano
I - aminoácido isoleucina
IgG - imunoglobulina G
IKCa - canais para potássio dependentes de cálcio de condutância intermediária
IP3 - 1,4,5 trifosfato de inositol
IVM - ivermectina
K - aminoácido lisina
KCa - canais para potássio dependentes de cálcio
L - aminoácido leucina
LH - hormônio luteinizante
M - aminoácido metionina
MOC - coeficiente de sobreposição de Manders
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N - aminoácido asparagina
-N ou –NOOH - região aminoterminal
NBT - nitro blue tetrazolium
NPo - Imédia/Icanal unitário
P - aminoácido prolina
P1 - receptor para adenosina
P2 - receptor para nucleotídeos
P2X - receptor para ATP ionotrópico
P2Xx - receptor para ATP ionotrópico homomérico
P2Xx/y - receptor para ATP ionotrópico heteromérico
P2Y - receptor para ATP metabotrópico
PC - peptídeo cognato
PC12 - linhagem de células em cultura originárias da glândula adrenal de ratos
PFA - paraformaldeído
PPADS - ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2’,4’-dissulfônico
Q - aminoácido glutamina
R - aminoácido arginina
RE - retículo endoplasmático
S - aminoácido serina
SKCa - canais para potássio dependentes de cálcio de baixa condutância
SNC - sistema nervoso central
SNP - sistema nervoso periférico
StAR - proteína reguladora da esteroidogênese aguda
T - aminoácido treonina
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TM1 - segmento transmembrana 1 do receptor para ATP ionotrópico
TM2 - segmento transmembrana 2 do receptor para ATP ionotrópico
V - aminoácido valina
W - aminoácido triptofano
WC - solução de pipeta para configuração “wholw-cell”
Y - aminoácido tirosina
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1 Resumo
Nos últimos anos, o ATP tem sido alvo de estudo em vários aspectos ligados à
sinalização intercelular. Há evidências de que ele possa atuar tanto exercendo a função
de mediador de eventos rápidos, como na neurotransmissão, como também em
processos celulares de longo prazo, envolvendo mecanismos ligados à proteína G. A
ação do ATP na membrana celular se dá por meio de receptores purinérgicos do tipo
P2X (canais iônicos ativados por ligantes) e P2Y (receptores acoplados à proteína G).
Até o momento, já foram identificados e clonados sete subtipos de receptores P2X
(P2X1 - P2X7). O influxo de cálcio (Ca2+) por esses canais justifica em parte o aumento
da concentração de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) observado em algumas situações
fisiológicas, o que evidencia que esta é uma importante via envolvida nas respostas
mediadas por receptores P2X “in vivo”. O tratamento de células de Leydig de ratos e
camundongos, com ATP, causa aumento na [Ca2+]i e na secreção de testosterona,
reforçando a hipótese de que a sinalização via Ca2+ pode contribuir para o controle da
secreção de testosterona nessas células. Os receptores purinérgicos descritos em
células de Leydig de camundongos apresentam perfil farmacológico e eletrofisiológico
característico do subtipo P2X2. Além disso, existem evidências de que o influxo de Ca2+
(gerado pela abertura do receptor P2X) ativa canais para K+ de alta condutância (BKCa)
e que estes podem influenciar o decurso temporal da dessensibilização dos receptores
P2X nessas células. Dessa forma, o presente estudo objetivou identificar os subtipos
de receptores purinérgicos P2X em células de Leydig de camundongos adultos,
analisando propriedades moleculares e eletrofisiológicas dessas células, e observar se
16
há interação entre estes e a atividade de canais para K+ ativados por Ca2+ de alta
condutância (BKCa). Experimentos de “Western Blot” e Imunofluorescência mostraram a
presença de receptores purinérgicos dos subtipos P2X2, P2X4, P2X6 e P2X7 nas células
de Leydig. Registros eletrofisiológicos, utilizando a técnica de "patch clamp" sugerem a
presença de receptores heteroméricos, possivelmente P2X2/4/6, que exibem perfil
farmacológico dominante para a subunidade P2X2 e indicam que há interação entre os
canais BKCa e o influxo de Ca2+ decorrente da ativação de receptores P2X. O aumento
de atividade dos canais BKCa após o influxo de Ca2+ por abertura de canais P2X é
dose-dependente e reversível. Os resultados de captação de corantes fluorescentes
mostram que os receptores P2X7 não são funcionais nessas células.
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2 Abstract
In recent years, a large amount of studies were dedicated to understand the role
of ATP as an intercellular signaling agent. Several evidences confirm its function as a
mediator and/or modulator of both fast events, like the neurotransmission, as well as of
long term cellular processes, involving G proteins. ATP acts on cellular membrane by
interacting with purinergic receptors P2X (ligand-gated ion channels) and P2Y (G
protein-coupled receptors). Until now, seven subtypes of P2X receptors were identified
and cloned (P2X1 - P2X7). Calcium influx through these channels is in part responsible
for the increase in intracellular [Ca2+] observed in a number of physiological situations,
indicating an important role for P2X receptors in vivo. ATP treatment of Leydig cells
from mice and rats, leads to an increase in [Ca2+]i and testosterone secretion,
supporting the hypothesis that Ca2+ signaling contributes to the process of testosterone
secretion in these cells. The purinergic receptors described in mouse Leydig cells have
a pharmacological and biophysical profile similar to the P2X2 subtype. Moreover,
evidences indicate that Ca2+ influx (elicited by P2X opening) is able to activate high
conductance calcium-activated potassium channels (BKCa). In this work we aimed at
identifying the subtypes of P2X purinergic receptors present in mouse Leydig cells by
analyzing their molecular and electrophysiological properties. “Western blot” and
Immunofluorescence experiments show the presence of P2X2, P2X4, P2X6 and P2X7
subunits of purinergic receptors in mouse Leydig cells. Using the patch clamp technique
we also analyzed ATP-activated ionic currents in single isolated cells. The functional
results support the hypothesis that heteromeric receptors, probably P2X2/4/6, with a
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pharmacological profile mainly determined by the P2X2 subunit, are present in Leydig
cells. Besides this, P2X7 receptors are present, but certainly non-functional. Our results
also show that activation of P2X receptors leads to an increase in the activity of BKCa
channels coupled to the calcium influx observed in these circumstances.
19
3 Introdução
A produção de hormônios esteróides é indispensável para a homeostase do
organismo e para o sucesso da função reprodutiva. Esses hormônios são produzidos
na glândula adrenal, gônadas, placenta e cérebro e atuam de duas formas: aguda,
estimulando a mobilização do colesterol para o interior da mitocôndria para posterior
metabolização, e crônica, aumentando a transcrição e tradução de genes relacionados
às enzimas esteroidogênicas (Miller, 1988). A proteína reguladora da esteroidogênese
aguda (StAR) é responsável pelo transporte de colesterol para o interior da mitocôndria
(Caron et al., 1997) e se responsabiliza por aproximadamente 85% do processo de
síntese de esteróides (Manna et al., 2001). Dessa forma, o funcionamento da proteína
StAR pode ser visto como um passo limitante no processo esteroidogênico e sua
expressão é influenciada por múltiplos sinais intracelulares, tais como adenosina 3’,5’-
monofosfato cíclico (AMPc), cálcio (Ca2+) e metabólitos de ácido aracdônico (Manna et
al., 2003). A estimulação aguda da esteroidogênese pelo hormônio Luteinizante (LH)
ocorre por meio de receptores metabotrópicos, tendo o AMPc como um importante
segundo mensageiro. Porém, outros sistemas de sinalização intracelular são capazes
de potenciar a resposta esteroidogênica, como 1,4,5 trifosfato de inositol (IP3),
diacilglicerol (DAG), ácido aracdônico, leucotrienos, Ca2+ e cloreto (Cooke, 1999). Além
deste, outros estudos têm mostrado que o ATP pode atuar como um modulador do
processo esteroidogênico em vários tipos celulares (Filipini et al., 1994; Loir et al.,
1999; Tai et al., 2001; Nishi et al., 2002).
20
3.1 Células de Leydig
As células de Leydig encontram-se no espaço intersticial dos testículos, entre os
túbulos seminíferos. Junto às células de Leydig estão os vasos sanguíneos, vasos
linfáticos, tecidos conectivos e macrófagos. Essas células dispõem-se de forma
agrupada ao longo dos vasos sanguíneos e sua distribuição é semelhante nas
diferentes espécies animais. Todos os andrógenos testiculares são produzidos e
secretados pelas células de Leydig. Nelas, os estoques de colesterol aparecem em
forma de gotículas, que são consumidas com o aumento da síntese de andrógenos. A
testosterona é o principal hormônio esteróide masculino produzido nessas células e a
modulação deste processo se dá por interações endócrinas através do eixo
hipotálamo-hipófise-testículos. Essas interações envolvem os hormônios LH e
Gonadotrofina Coriônica - hCG (na fase intrauterina), e também processos de
sinalização parácrina e autócrina entre as outras células testiculares. Há comunicação
intercelular entre células de Leydig e entre células de Sertoli e Leydig, resultado da
presença de junções comunicantes (Saez, 1994). Foi descrito a presença de conexina
43 em células de Leydig e o seu importante papel na comunicação entre células de
Leydig, possivelmente como modulador de secreção hormonal (Varanda & de
Carvalho, 1994; Goldenberg et al., 2003).
Estimulação de células de Leydig de camundongos por ATP induz um aumento
na [Ca2+]i e produção e secreção de testosterona (Foresta et al., 1996; Perez-
Armendariz et al., 1996). Janszen e colaboradores (1976), estudando células de Leydig
de ratos, observaram que a diminuição da [Ca2+] no meio extracelular (banho) causa
uma redução significativa na produção de testosterona estimulada por LH/hCG. Por
21
outro lado, quando há aumento de Ca2+ extracelular a secreção de testosterona pode
ser duplicada (Meikle et al., 1991). Dada a presença de canais iônicos ativados por
ATP extracelular em células de Leydig (Poletto-Chaves et al., 2006) pode-se sugerir
que estes se constituem em uma das possíveis vias de entrada dos íons Ca2+.
3.2 Receptores Purinérgicos
Em 1978, Burnstock agrupou os receptores purinérgicos em dois grandes
grupos, de acordo com o modo de ativação dos mesmos: P1 para aqueles sensíveis a
adenosina e P2 aos sensíveis a nucleotídeos. Por meio de experimentos
farmacológicos, os receptores P2 foram novamente divididos em dois grupos: P2Y,
receptores acoplados à proteína G (metabotrópicos) e P2X, canais iônicos ativados por
ligantes (ionotrópicos) (Burnstock & Kennedy, 1985). Atualmente oito subtipos de
receptores P2Y já foram clonados e caracterizados funcionalmente (Burnstock, 2004).
Da mesma forma, sete subunidades de receptores P2X foram também clonadas e
caracterizadas em vertebrados: P2X1 a P2X7. Todas estas subunidades apresentam a
mesma estrutura básica, compondo-se de 379 (P2X6) a 595 (P2X7) aminoácidos (aa)
(Valera et al., 1994; Brake et al., 1994; Chen et al., 1995; Wang et al., 1996; Garcia-
Guzman et al., 1996; Collo et al., 1996; Surprenant et al., 1996; North, 2002). A
ativação dos receptores P2X faz-se em milisegundos, pois a ligação do ATP a seu sítio
está diretamente associada à abertura de um canal iônico. Esse fato proporciona
modulação de processos de sinalização rápida a pequenas distâncias (North &
Barnard, 1997; Khakh, 2001).
22
A proteína que compõe o receptor P2X apresenta dois domínios
transmembrana: TM1 e TM2 (figura 1). Ambos são segmentos hidrofóbicos e estão
relacionados com a formação do poro do canal (Egan et al., 1998; Jiang et al., 2001). O
segmento TM2 também regula propriedades específicas do canal, como condutância
(Nakazawa et al., 1998), permeabilidade (Migita et al., 2001) e fluxo de Ca2+ (Egan &
Khakh, 2004). Os receptores P2X são canais seletivos a cátions com permeabilidades
semelhantes aos íons sódio e potássio e maior ao íon Ca2+. Caracterizam-se, ainda,
por conduzir correntes de entrada mais facilmente que correntes de saída, ou seja,
comportam-se como retificadores de entrada (Evans et al., 1996). As porções amino (-
N) e carboxi (-C) -terminal são intracelulares e o sítio de ligação com o ATP localiza-se
na extensa alça extracelular (Torres et al., 1998). Os sete subtipos de receptores P2X
apresentam homologia nos aa que os compõem, variando de 39,2% (P2X6 – P2X7, em
ratos) a 55,4% (P2X4 – P2X5, em humanos) (North, 2002).
Figura 1: Esquema ilustrativo da estrutura molecular de receptores P2X2. Na figura podemos observar a extensa alça extracelular, os segmentos transmembrana TM1 e TM2 e as porções terminais intracelulares (Modificado de North, 2002).
extracelular
intracelular
23
Nicke e colaboradores (1998) mostraram que o elemento estrutural essencial
dos receptores P2X são complexos formados pelo agrupamento de três subunidades
idênticas do receptor. Em 2004, Aschrafi e colaboradores descreveram a arquitetura
estrutural trimérica como característica exclusiva dos receptores P2X funcionais tanto
homoméricos, formados por subunidades idênticas, como heteroméricos, formados por
subunidades diferentes.
3.3 Arranjos Homoméricos dos Receptores P2X
O conhecimento sobre os receptores P2X foi aprofundado em meados dos anos
90 por meio de estudos de clonagem molecular e caracterização dos sete subtipos.
Evans e colaboradores (1995) estudando receptores purinérgicos do músculo liso da
bexiga de humanos, e de células de feocromocitoma de ratos (PC12), transfectados em
oócitos e células HEK 293, observaram diferentes perfis de resposta aos agonistas.
Nas células que expressavam o DNA complementar (DNAc) de receptores do músculo
liso da bexiga o ATP mostrou-se mais potente e houve resposta para os análogos aß-
metileno ATP (aßmeATP) e ßγ-metileno ATP (ßγmeATP). Já nas células que
expressavam o DNAc de receptores de células PC12, esses análogos do ATP não
provocaram resposta. Posteriormente, Mackenzie e colaboradores (1999) identificaram
três grupos distintos de receptores homoméricos P2X considerando-se suas
características farmacológicas. O primeiro grupo responde à estimulação por aßmeATP
de forma semelhante à estimulação por ATP. Além disso, os receptores pertencentes a
esse grupo exibem dessensibilização rápida. Já o segundo grupo de receptores P2X
caracteriza-se por não exibir respostas à estimulação pelo aßmeATP e apresentar
24
dessensibilização lenta. A distinção do receptor do terceiro grupo se dá pelo fato de
que, após estimulação prolongada, a abertura do canal é seguida pela permeabilização
da membrana plasmática. A figura 2 apresenta as correntes macroscópicas
características de cada um dos receptores homoméricos P2X com exceção do subtipo
P2X6. Os subtipos de receptores homoméricos P2X1 e P2X3 fazem parte do primeiro
grupo descrito, como podemos observar pela cinética das correntes (figura 2). Já os
receptores P2X2, P2X4 e P2X5 pertencem ao segundo grupo (figura 2). O terceiro grupo
descrito refere-se ao receptor P2X7. Estudos de clonagem molecular feitos com a
subunidade P2X6 foram dificultados, pois esta subunidade havia sido descrita como
incapaz de formar receptores homotriméricos funcionais (Torres et al., 1999).
Recentemente, mostrou-se que as subunidades P2X6 somente são capazes de formar
um receptor funcional após serem glicosiladas. Quando expresso, o receptor P2X6
responde à estimulação por aßmeATP e apresenta dessensibilização lenta (Jones et
al., 2004) (figura 2).
A descrição dos subtipos de receptores homoméricos P2X será feita de acordo
com a classificação destes nos grupos acima citados.
25
Figura 2: Correntes de receptores P2X homoméricos de ratos, expressos em células HEK. As correntes mostram dessensibilização rápida para os receptores P2X1 e P2X3 e lenta para os outros cinco tipos de receptores purinérgicos, após aplicação de ATP (30 M, exceto 100 µM para o receptor P2X6 e 1 mM para o receptor P2X7) (Modificado de North, 2002, Bo et al., 2003 e Jones et al., 2004).
Receptores P2X1
O receptor homomérico P2X1 foi primeiramente clonado a partir de células
musculares lisas do ducto deferente de ratos. Nessas células, identificou-se um
receptor com estrutura molecular de 399 aa, com extensa alça extracelular e dois
domínios transmembrana. Considerando-se a estrutura peculiar, os receptores
purinérgicos foram identificados como uma nova classe de receptores ativados por
ligantes (Valera et al., 1994).
P2X6 P2X5
0,5 nA 5 s
A
B C
26
O receptor P2X1 responde à estimulação pelos agonistas aßmeATP e 3’-O-(4-
benzoil)benzoil ATP (BzATP) e apresenta dessensibilização rápida, características
compartilhadas com o receptor P2X3 (Valera et al., 1994; Garcia-Guzman et al., 1997;
Bianchi et al., 1999). Porém, a estimulação com ßγmeATP evoca respostas cerca de 40
vezes mais potentes nos receptores P2X1 (Evans et al., 1995; Garcia-Guzman et al.,
1997). Os polifosfatos de diadenosina também exibem diferentes papéis como
agonistas de receptores purinérgicos. O composto P1,P4-tetrafosfato de diadenosina
(Ap4A) atua como agonista parcial em receptores P2X1 e é cerca de 10 vezes mais
seletivo a estes, quando comparado a outros receptores P2X. Já em receptores P2X3,
atua como agonista mais potente que o ATP, assim como o P1,P5-pentafosfato de
diadenosina (Ap5A) e o P1,P6-hexafosfato de diadenosina (Ap6A) (Wildman et al.,
1999).
Os receptores P2X1 são bloqueados por compostos análogos da Suramina
(antagonista não-seletivo de receptores P2), NF449 e NF864, recentemente descritos
como antagonistas altamente seletivos de receptores P2X1 (Rettinger et al., 2005). Um
estudo recente caracterizou o composto RO-1 como antagonista de receptores P2X1,
visto que a sua seletividade é cerca de 30 vezes maior aos receptores P2X1 quando
comparado a outros receptores P2X (Jaime-Figueroa et al., 2005).
Uma das funções fisiológicas conhecidas para os receptores P2X1 é a
modulação do componente purinérgico na estimulação nervosa simpática e
parassimpática da contração muscular lisa. Essa função foi observada em diferentes
tecidos, tais como, bexiga urinária e ducto deferente (Vial et al., 2000; Mulryan et al.,
2000). Esses receptores também estão presentes em plaquetas e sua ativação
27
ocasiona alterações na conformação e no agregamento das mesmas (Erhardt et al.,
2003; Hechler et al., 2003).
Receptores P2X3
Chen e colaboradores (1995) clonaram o gene correspondente à proteína do
receptor P2X3 a partir de neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal de ratos. Este
subtipo de receptor apresenta estrutura molecular com 397 aa e é o único canal iônico
ativado por ligante presente em neurônios sensoriais (Lewis et al., 1995; Chen et al.,
1995).
Além do agonistas ßγmeATP, Ap4A e Ap5A, outros fármacos podem ser
utilizados com o intuito de diferenciar os receptores P2X1 e P2X3. O Azul de Cibacron
atua como modulador da resposta dos receptores P2X3 ao ATP, potenciando-a
(Alexander et al., 1999). Do mesmo modo, o Etanol pode aumentar a corrente evocada
nesses receptores de maneira dose-dependente (Davies et al., 2005).
O composto A-317491 foi identificado como antagonista não-nucleotídico
altamente seletivo de receptores que expressem a subunidade P2X3 (Jarvis et al.,
2002). Um estudo recente descreveu a inibição de correntes de receptores P2X3
humanos, tanto homoméricos ou heteroméricos, por RO-3 (Ford et al., 2006).
Os receptores P2X3 localizam-se predominantemente em neurônios sensoriais
do gânglio da raiz dorsal, trigeminal e nodoso (Bradbury et al., 1998; Dunn et al., 2001).
Estudos sobre a função desses receptores indicam modulação da neurotransmissão
sensorial, das respostas mecano- e quimio-sensoriais e da liberação pré-sináptica de
glutamato (Nakatsuka et al., 2003; Fu et al., 2004; Wang et al., 2005).
28
Receptores P2X2
A clonagem dos receptores P2X2 foi feita por Brake e colaboradores (1994) a
partir de células PC12. Diferentemente dos receptores do primeiro grupo descrito por
Mackenzie e colaboradores (1999), os receptores P2X2 não exibem resposta ao
análogo do ATP aßmeATP e possuem dessensibilização lenta (King et al., 1996). A
potência dos agonistas a esse receptor segue a ordem:
ATP>ou=2meSATP=ATPγS>>>BzATP (King et al., 1996; King et al., 1997). Não há
resposta à estimulação por outros nucleotídeos (King et al., 1997). A corrente dos
receptores P2X2 é potenciada pela acidificação do meio extracelular (pH 6,5), o que o
diferencia dos outros receptores P2X (King et al., 1996; King et al., 1997; Stoop et al.,
1997; Miller et al., 1998; Wildman et al., 2002). Já a alcalinização reduz as correntes do
receptor P2X2. Estes são bloqueados por PPADS e Suramina (Evans et al.,1995; King
et al., 1997). Não foi descrito até o momento nenhum antagonista seletivo a receptores
P2X2.
O receptor P2X2 está presente no sistema nervoso central (SNC) e periférico
(SNP). No SNC, sua função está relacionada com a transmissão sináptica mediada por
ATP, influenciando a regulação de diversos processos tais como memória e
aprendizado, função motora, coordenação autonômica e integração sensorial (Kidd et
al., 1995; Kanjhan et al., 1996; Scheibler et al., 2004). Já no SNP, esses receptores
parecem atuar, por exemplo, na modulação da sensibilidade do trato gastro-intestinal
(Castelucci et al., 2002; Castelucci et al., 2003). Além das células neuronais outros
tipos celulares apresentam receptores P2X2, tais como, células da medula da glândula
adrenal, células endoteliais, epiteliais, musculares lisas e cardíacas. O papel desses
29
receptores em células não-neuronais parece estar relacionado com funções
desempenhadas pelo ATP extracelular tais como, regulação autócrina e parácrina da
liberação de hormônios, exocitose e endocitose, contratilidade dos músculos lisos e
atividade do marcapasso (Vulchanova et al., 1996; King et al., 1998; Hansen et al.,
1999; Hansen et al., 1999b; Lee et al., 2000)
Receptores P2X4
Os receptores P2X4 foram clonados pela primeira vez por Bo e colaboradores
(1995) a partir do cérebro de ratos. Estes se assemelham aos receptores P2X2 por
apresentarem insensibilidade ao aßmeATP e dessensibilização lenta. Porém, exibem
respostas distintas quando analisados em diferentes organismos (Bo et al., 1995; Buell
et al., 1996; Garcia-Guzman et al., 1997). Da mesma forma que os receptores P2X2,
são insensíveis à ativação por ßγmeATP (Buell et al., 1996). Contudo, diferenciam-se
pelos efeitos da variação do pH e após incubação com Ivermectina. (Stoop et al., 1997;
Khakh et al., 1999). Há inibição da corrente dos receptores P2X4 em condições de pH
ácido (6,3-6,5), porém pHs alcalinos não exercem efeito sobre os mesmos. A
Ivermectina influencia a cinética da corrente dos receptores P2X4 atuando em dois
sítios de ligação distintos: no sítio de alta afinidade leva ao aumento da condutância do
canal; no sítio de baixa afinidade há indícios de aumento da afinidade ao ATP,
permitindo que o canal permaneça aberto de forma estável (Priel & Silberberg, 2004).
Há controvérsias quanto às respostas evocadas por receptores P2X4 na
presença de antagonistas. Estudos em ratos descrevem que esses receptores são
insensíveis aos antagonistas Suramina e PPADS (Soto et al., 1996; Buell et al., 1996).
30
Townsend-Nicholson e colaboradores (1999) observaram que em camundongos
ocorre, ao invés de inibição, potenciação da corrente de receptores P2X4 por Suramina,
PPADS e Azul de Cibacron. Porém, foi descrito que receptores P2X4 de humanos e
camundongos são bloqueados por PPADS (Garcia-Guzman et al., 1997; Jones et al.,
2000). O receptor P2X4 é inibido por altas concentrações de etanol (Xiong et al., 2005).
Dentre os receptores P2X o subtipo P2X4 parece ser o mais extensamente
distribuído. Está presente em diferentes regiões cerebrais, além da medula espinhal,
gânglios autonômicos e sensoriais, músculo liso arterial, rins, pulmão, coração entre
outros (Wang et al., 1996; Bo et al., 2003).
Receptores P2X5
Garcia-Guzman e colaboradores (1996) clonaram os receptores P2X5 a partir do
coração de ratos. O receptor apresenta 455 aa em sua estrutura e está presente no
coração, cérebro, medula espinhal e glândula adrenal (Garcia-Guzman et al., 1996).
Assemelha-se aos receptores P2X2 e P2X4 por não ser ativado por aßmeATP e
apresentar dessensibilização lenta. Receptores P2X5 são ativados igualmente por ATP
e 2meSATP e não respondem ao ßγmeATP, assim como os receptores P2X2 e P2X4
(Collo et al., 1996; Bo et al., 2003).
Os antagonistas Suramina e PPADS são efetivos contra os receptores P2X5 (Bo
et al., 2000; Garcia-Guzman et al., 1996). Esse perfil farmacológico é semelhante aos
receptores P2X2, porém parcialmente distinto dos receptores P2X4. A diminuição do pH
extracelular leva a diminuição da corrente dos receptores P2X5 e o seu aumento não
exerce efeito sobre a corrente, diferenciando os receptores P2X5 dos receptores P2X2
31
(Wildman et al., 2002). A ação da Ivermectina sobre os receptores P2X4 os distingue
dos receptores P2X5 (Khakh et al., 1999).
Os receptores P2X5 estão presentes no cérebro, coração, olhos e estudos
recentes mostram sua presença nas células em diferenciação, tais como músculo
esquelético, células epiteliais da mucosa nasal, bexiga e ureter, e pele (Collo et al.,
1996; Groschel-Stewart et al., 1999; Lee et al., 2000; Ruppelt et al., 2001; Ryten et al.,
2002; Gayle et al., 2005). Há indícios de que os receptores P2X5 possam desempenhar
importante papel como reguladores da proliferação e diferenciação de células
cancerígenas (Greig et al., 2003; Calvert et al., 2004).
Receptores P2X7
O receptor P2X7, anteriormente conhecido como receptor P2Z, foi clonado a
partir do cérebro de ratos (Surprenant et al., 1996). Sua estrutura, composta por 595
aa, é homóloga a dos outros receptores P2X, exceto pela presença de uma porção
terminal -COOH mais extensa. Foi descrito como o primeiro receptor purinérgico que
permite a passagem de moléculas de grande peso molecular (<900 KDa) (Surprenant
et al., 1996; Chessell et al., 1998). O agonista mais potente dos receptores P2X7 é o
BzATP, sendo que o ATP é menos potente nesse receptor quando comparado aos
outros P2X (Rassendren et al., 1997; Hibell et al., 2000). Os receptores P2X7 exibem
resposta de baixa magnitude ou ausência de resposta à estimulação por aßmeATP,
2meSATP e ßγmeATP (Chessell et al., 1998).
Estudos mostram que as correntes evocadas por receptores P2X7 são
bloqueadas por PPADS e que a Suramina atua como um agonista fraco ou ineficaz
32
nesses receptores. Porém, há diferenças no perfil farmacológico das correntes de P2X7
em relação às diferentes espécies (Hibell et al., 2001; Duan et al., 2003). A modulação
do pH sobre o canal deste receptor é negativa, tanto para valores menores de pH
quanto para valores maiores (Michel et al., 1999). Gargett e colaboradores (1997)
descreveram um potente agonista seletivo de receptores P2X7. Esse composto,
nomeado KN-62, é uma isoquinolina derivada da tirosina e bloqueia tanto as correntes
do receptor P2X7 quanto a entrada de corantes de grande peso molecular por dilatação
do poro desse receptor. Outros dois compostos têm sido estudados como inibidores
seletivos de receptores P2X7: AZD9056 e A-74003 (Gever et al., 2006; Honore et al.,
2006).
Torres e colaboradores (1999) descreveram a subunidade P2X7 como sendo
somente capaz de formar arranjos homoméricos, sem exibir interação com outras
subunidades. Porém, estudos recentes mostram a formação de um receptor
heteromérico envolvendo as subunidades P2X4 e P2X7 (Guo et al., 2007).
Foram descritos receptores P2X7 em diversos tipos celulares pertencentes ao
sistema imune e à glia do SNC e periférico (Collo et al., 1997; Hu et al., 2001; Franke et
al., 2001; Bulanova et al., 2005). Estudos têm demonstrado a possível atuação desses
receptores na neurodegeneração e inflamação do SNC bem como nos processos de
apoptose celular (Lê Feuvre et al., 2003; Parvathenani et al., 2003; Wang et al., 2004;
Franke et al., 2006; Franke e Illes, 2006).
Receptores P2X6
A expressão de receptores P2X6 foi inicialmente dificultada pelo fato de que
estes seriam incapazes de ser expressos na membrana celular e de formar arranjos
33
homoméricos (Lê et al., 1998; Torres et al., 1999). Recentemente, foi descrito que as
subunidades P2X6 somente são expressas na membrana celular quando estão
parcialmente glicosiladas, e após extensa glicosilação são capazes de formar canais
funcionais (Jones et al., 2004). Caso não ocorra o processo de glicosilação, foi relatado
que as subunidades P2X6 formam tetrâmeros ao invés de trímeros, e ficam retidas no
interior do retículo endoplasmático (RE) (Aschrafi et al., 2004).
O receptor P2X6 distingue-se dos receptores P2X2 e P2X4 por ser mais sensível
ao ATP e ao aßmeATP e por não exibir diminuição das correntes na presença do
antagonista Suramina. Porém, semelhante a esses receptores, o P2X6 é bloqueado
pelo antagonista PPADS (Jones et al., 2004).
A expressão da subunidade P2X6 ocorre em diversas regiões do SNC, como
cerebelo e hipocampo (Collo et al., 1996; Rubio & Soto et al., 2001; Bobanovic et al.,
2002).
3.4 Arranjos Heteroméricos dos Receptores P2X
A expressão de diferentes receptores P2X, concomitantemente, resulta em
diferentes fenótipos de receptores heteroméricos. Atualmente, são conhecidos sete
receptores P2X que formam heterotrímeros. Dentre eles, o primeiro receptor
caracterizado foi o P2X2/3 (Lewis et al., 1995). Sua função fisiológica parece estar
envolvida com os processos de transdução mecano-sensorial na bexiga, respostas de
neurônios sensoriais nodosos, dor inflamatóri e sinalização gustatória (Roberts et al.,
2006).
34
Um outro receptor heteromérico, P2X1/5, foi descrito em 1998 por Torres e
colaboradores. Há indícios de que sua função associa-se à modulação dos potenciais
de junção excitatórios de junções neuro-efetoras arteriais (Torres et al., 1998).
Lê e colaboradores (1998) caracterizaram o receptor heteromérico P2X4/6,
presente de forma abundante no SNC. Este estudo sugeriu a sua participação na
regulação da liberação de neurotransmissores excitatórios nas sinapses sensoriais
centrais.
O quarto receptor heteromérico descrito, P2X2/6, também é encontrado de forma
abundante no SNC (King et al., 2000). Tanto o heteromultímero P2X4/6, quanto o P2X2/6
apresentam características distintas dos receptores homoméricos P2X4 e P2X2,
respectivamente. Considerando-se o fato de que as subunidades do tipo P2X6 são
incapazes de formar homotrímeros sem que haja o processo de glicosilação, sugere-se
que in vivo essas subunidades desempenhem funções primárias como
heteromultímeros, combinando-se com outros tipos de subunidade, possivelmente
P2X2 e P2X4 por serem expressos nas mesmas regiões do SNC (Gever et al., 2006).
O heteromultímero P2X1/2 foi descrito como o quinto receptor recombinante por
Brown e colaboradores (2002). Este receptor apresenta sensibilidade peculiar às
variações de pH, quando comparado aos receptores homoméricos P2X1 e P2X2.
Também apresenta um perfil farmacológico incomum em relação aos agonistas de
receptores P2X1 (Brown et al., 2002). Há indícios de que a transmissão purinérgica
pode ser facilitada em ambientes ácidos, após estimulação desses receptores, e está
associada à exocitose de neurotransmissores ou inflamação tecidual (King et al., 1997).
35
O receptor P2X1/4, sexto receptor heteromérico descrito, apresenta propriedades
cinéticas similares aos receptores homoméricos P2X4 e perfil farmacológico
semelhante aos receptores homoméricos P2X1. Sugere-se que esse receptor
heteromérico possa atuar como moduladores da resposta ao aßmeATP em neurônios
do gânglio cervical superior (Nicke et al., 2005).
O mais recente receptor heteromérico descoberto é o P2X4/7. Sugere-se que
esse receptor desempenhe importante função na sinalização da dor (Guo et al., 2007).
Os diferentes fenótipos de receptores heteroméricos descritos, na maior parte
das vezes, exibem características distintas dos receptores homoméricos das
subunidades que os compõem. A modulação da expressão das diferentes subunidades
pode levar à alteração na estequiometria dos receptores heteroméricos, sugerindo que
a formação desses receptores possa ser um processo dinâmico e ajustável a diferentes
situações fisiológicas (Barrera et al., 2005).
Os resultados de Poletto-Chaves e colaboradores (2006) mostram que os
receptores purinérgicos P2X presentes em células de Leydig de camundongos são o
ponto de partida do processo de estimulação da esteroidogênese por ATP, por permitir
a entrada de Ca2+ ao intracelular. Sabe-se que o íon Ca2+ é o mediador da estimulação
da expressão de proteína StAR em células de Leydig tumorais LTC-1 de camundongos
(Manna et al., 1999). Os experimentos farmacológicos de Poletto-Chaves e
colaboradores (2006) sugeriram ainda que os receptores presentes em células de
Leydig de camundongos são os homoméricos P2X2. Dessa forma, o estudo detalhado
desses receptores em células de Leydig é de extrema importância para a elucidação
das funções celulares exercidas por eles.
36
3.5 Canais para Potássio Ativados por Cálcio
A variação da [Ca2+] citosólica em resposta à estimulação por ATP pode
participar do controle das condutâncias iônicas através da membrana plasmática.
Estudos da década de 70 mostraram que o aumento de Ca2+ intracelular em neurônios
de Aplysia era seguido de aumento da condutância da membrana plasmática. Além
disso, o potencial de reversão observado era função da concentração externa de
potássio (K+) (Meech & Strumwasser, 1970; Meech, 1972). A partir desses estudos,
foram descritos os canais para K+ dependentes de Ca2+ (KCa) e sugeriu-se que sua
principal função era associar o metabolismo celular com a condutância da membrana
(Meech, 1978). Esses canais podem ser divididos em três grupos de acordo com a sua
condutância: BKCa para os de alta condutância, SKCa para os de baixa condutância e
IKCa para os de condutância intermediária (Blatz & Magleby, 1987).
Em células da granulosa de humanos foi descrita a participação dos canais BKCa
no processo de esteroidogênese (Kunz et al., 2002). Esse estudo mostrou que a
ativação desses canais por acetilcolina e ocitocina modula a ação estimulatória do
hormônio hCG na esteroidogênese. Em experimentos com a técnica de “patch clamp”
(Hamill et al., 1981), em células de Leydig de camundongos com baixas [Ca2+]i, as
despolarizações mostraram ativar uma condutância para K+ dependente de Ca2+
(Kawa, 1987). Com o uso da mesma técnica, Carnio & Varanda (1995) observaram a
presença de canais para K+ em células de Leydig de camundongos e determinaram
que variações na [Ca2+] intracelular aumentam tanto a probabilidade de aparecimento,
como o tempo médio de abertura destes canais. Foi observada uma condutância de
37
202 pS sugerindo a presença de canais BKCa. Demonstraram, ainda, que o tratamento
das células de Leydig com hCG ou AMPc induz um grande aumento na freqüência de
abertura, concomitantemente com uma redução no tempo médio de fechamento sem
afetar o tempo médio de abertura do canal, sendo que ambos os tratamentos requerem
Ca2+ extracelular para suas ações. Assim sendo, a especulação da possível interação
entre o influxo de Ca2+ por receptores P2X após estimulação por ATP e a alteração de
atividade dos canais BKCa em células de Leydig é crucial para o melhor entendimento
do funcionamento do processo esteroidogênico nessas células.
38
4 Objetivos
Na tentativa de ampliar e reforçar as evidências quanto à presença e papel
fisiológico dos receptores P2X em células de Leydig, este estudo teve por objetivo:
• Estudar os possíveis subtipos de receptores purinérgicos presentes nas células de
Leydig investigando propriedades moleculares e eletrofisiológicas dessas células;
• Observar alterações decorrentes da entrada de íons Ca2+ nas células de Leydig, por
estimulação dos receptores P2X, na ativação dos canais BKCa, utilizando a técnica
de “patch-clamp” na variante “cell-attached”;
39
5 Material e Métodos
5.1 Animais
Os protocolos experimentais utilizados estão de acordo com as normas
estabelecidas pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP/USP,
tendo sido por ela aprovados (Protocolo # 030/2005).
Foram utilizadas células de Leydig de camundongos pertencentes à linhagem
Swiss, com cerca de 50 dias (~40 gramas). Estes animais foram mantidos em um ciclo
claro/escuro de 12 horas com água e alimentação ad libitum.
5.2 Isolamento de Células de Leydig
5.2.1 Extração por Dispersão Mecânica
Após o sacrifício dos animais por deslocamento cervical, a remoção dos
testículos foi feita de forma rápida, desprezando-se toda a gordura e retirada a túnica
albugínea. As células foram então isoladas por processo de dispersão mecânica
(aspiração/sucção) com solução de Hank’s e semeadas sobre lamínulas de vidro
(Carnio & Varanda, 1995). Essa preparação de células pôde ser utilizada até 3 a 4
horas após o isolamento. Após este período o sucesso na obtenção de selos de alta
resistência torna-se bastante reduzido (Poletto-Chaves et al., 2006).
40
5.2.2 Purificação por Choque Osmótico
Como nos experimentos de imunofluorescência é de interesse que se tenha uma
população de células mais homogênea, desenvolvemos um método de purificação
relativa com o uso de choque osmótico associado ao tratamento prévio da preparação
com colagenase. Observamos que as células de Leydig são resistentes ao choque
osmótico padronizado, diferentemente das hemáceas e das outras células presentes
na preparação, as quais interferem na pureza da preparação. O processo de
purificação ocorreu da seguinte forma:
• Dois testículos foram descapsulados e colocados em 6 ml de Hank’s + 0,1% de
BSA com colagenase (3,428 mg);
• A solução foi infundida nos testículos (processo mecânico) por várias vezes,
sem despedaçá-los;
• A suspensão resultante foi transferida para um tubo falcon e agitada por 5
minutos entre as velocidades número 3 e 4 (Mesa Agitadora, Tecnal, Piracicaba,
SP, Brasil);
• Após a agitação foi utilizada uma pipeta de Pasteur de plástico (boca larga) para
soltar os túbulos seminíferos sem danificá-los em demasia (processo mecânico);
• A suspensão foi filtrada em nytex (80 µm) e lavada com 1 ml de Hanks + 0,1%
BSA (volume total de 7 ml) para retirada dos túbulos seminíferos da preparação;
• Após a divisão da suspensão em 2 tubos de falcon (3,5 ml/tubo) o volume foi
completado com Hanks + 0,1% BSA (15 ml). Este procedimento teve o intuito de
lavar a enzima colagenase da solução, evitando danos às células;
41
• A suspensão foi centrifugada (Centrífuga Excelsa, FANEM, Guarulhos, SP,
Brasil) a 1500 rpm por 3 min;
• Os dois precipitados de células foram ressuspendidos em 15 ml de Hank’s +
0,1% BSA e centrifugados novamente a 1500 rpm por 3 min;
• O precipitado de células foi ressuspendido em 4,5 ml de água destilada por 20
segundos, gerando um choque osmótico para lise de hemáceas e outras células
e conseqüente purificação da preparação;
• Após o período de 20 segundos foram adicionados 0,5 ml de Hank’s
concentrado 10 vezes e a solução foi agitada;
• Após 3 min (para que as células recuperassem seu volume basal) foi
adicionado 9 ml de Hanks + 0,1% BSA ao tubo e este foi então centrifugado a
3000 rpm por 5 min;
• O precipitado de células foi ressuspendido em 1 ml de Hank’s;
• As células foram semeadas sobre lamínulas de vidro previamente tratadas com
Biobond (Biobond-Tissue Adhesive, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA,
USA).
5.2.3 Identificação das Células por Marcação da Enzima 3 HSD
Para avaliar esse método de purificação de células foram feitos experimentos de
marcação da enzima 3ß-hidroxi-esteróide-desidrogenase. Esta enzima atua no
processo de síntese do hormônio testosterona, sendo responsável por transformar
pregnenolona em progesterona, e dessa forma pode ser utilizada como instrumento de
42
marcação das células de Leydig, produtoras desse hormônio. O seguinte protocolo foi
utilizado:
• As lamínulas foram preparadas previamente com Biobond, 2% em acetona;
• Foi adicionado um volume de 70 µl de suspensão de células para cada lamínula
redonda de 13 mm de diâmetro;
• As lamínulas foram deixadas sobre uma mesa aquecida à temperatura de 30º –
35º C para secarem;
• As lamínulas já secas foram cobertas com 200 µl de solução de marcação,
A + B, e mantidas a 35º C por 90 min:
A: 1 mg de nitro blue tetrazolium (NBT) dissolvido em 0,6 ml de 1 mg/ml de
etiocolan em DMSO;
B: 8 mg ß-NAD em 7,6 ml de Hanks’;
• As lamínulas foram então lavadas com água destilada e fixadas com 4% de
paraformaldeído (PFA) em Hank’s adicionado de 5% de sacarose (pH 7,4);
• Novamente as lamínulas foram lavadas com água destilada e o verso destas foi
secado com papel absorvente;
• As lamínulas foram montadas com Fluoromount (Fluoromount G, Electron
Microscopy Sciences, Washington, PA, USA) e seladas com esmalte base para
unha (Wet’n’Wild, AM Cosmetics,Milano, NY, USA).
O protocolo de extração de células por colagenase e purificação por choque
osmótico é inédito e mostrou-se eficiente quando se deseja uma pequena quantidade
de células, tendo sido utilizado para os experimentos de Imunofluorescência.
43
5.2.4 Extração por Dispersão Mecânica com Colagenase e Purificação
por Gradiente Descontínuo de Percoll
Já para os experimentos feitos com a técnica de “Western Blot”, que exigem
uma quantidade maior de material com alto grau de pureza, as células de Leydig foram
extraídas com o uso da enzima colagenase e purificadas por meio de um gradiente
descontínuo de percoll (modificado de Schumacher et al., 1978), associado à
purificação prévia por choque osmótico, compreendendo as seguintes etapas:
• Após serem retirados os testículos de 10 a 12 camundongos, estes foram
descapsulados e colocados em 35 ml de solução de Hank’s + 0,1% BSA. Este
procedimento foi realizado à temperatura de 0 oC;
• Usando pipetas de Pasteur (boca larga), a suspensão foi agitada para soltar os
túbulos seminíferos, sem danificá-los em demasia (processo mecânico);
• A suspensão foi então colocada em um tubo falcon de 50 ml adicionada de 20
mg de colagenase Tipo II e agitada (Mesa Agitadora, Tecnal, Piracicaba, SP,
Brasil) durante 10 min;
• A suspensão foi filtrada duas vezes em nytex (80 µm) e lavada com 10 ml de
Hank’s + 0,1% BSA;
• Dividiu-se então a suspensão em 8 tubos falcon que foram centrifugados
durante 10 min a 3000 rpm;
• O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 14 ml de
Hank’s + 0,1% BSA. Esse processo foi repetido por mais duas vezes;
44
• O precipitado de células foi ressuspendido em 4,5 ml de água destilada por 20
segundos, gerando um choque osmótico para purificação da preparação;
• Após os 20 segundos adicionou-se 0,5 ml de Hank concentrado 10 vezes e a
suspensão foi agitada;
• Após 3 min (para que as células recuperassem seu volume basal) foi
adicionado 9 ml de Hanks + 0,1% BSA ao tubo e este foi então centrifugado a
3000 rpm por 5 min;
• Após ressuspender os precipitados em Hanks + 0,1% BSA estes foram somados
em um tubo falcon de 15 ml;
• O tubo de falcon foi centrifugado a 3000 rpm por 5 min;
• O precipitado foi ressuspendido em 6 ml;
• Para cada gradiente descontínuo de percoll foi utilizado um volume de 6 ml de
suspensão de células;
• O gradiente de percoll foi preparado em um tubo de centrífuga de 50 ml com as
seguintes soluções: 6 ml de solução de Hank + BSA (0,1%), 8 ml de solução 20
% de Percoll, 8 ml de solução 35 % de Percoll, 8 ml de solução 43 % de Percoll,
8 ml de solução 68 % de Percoll e 4 ml de solução 90 % de Percoll (as diluições
do percoll foram feitas adicionando-se solução de Hank + BSA 0,1%);
• Por último, a suspensão de células foi adicionada ao gradiente descontínuo de
percoll;
• O tubo foi centrifugado por 30 min a 800 x g (1,92 mil rpm) a 25º C;
45
• As células retiradas do tubo de centrífuga entre as bandas de Percoll 43% e
68% são as células de Leydig. Estas foram então transferidas para uma solução
de Hank’s e centrifugadas por 15 min a 3000 rpm;
• O sobrenadante foi descartado e o processo repetido por duas vezes;
• Após o último descarte do sobrenadante, o precipitado foi ressuspendido em 200
µl de tampão de lise, para lise das membranas celulares, adicionado de
inibidores de proteases e fosfatases.
TBS: Tris (1 M, pH 7,5), NaCl (5 M);
Ripa: NaCl (750 mM), Tris (250 mM, pH 7,5), NP-40 (5%), deoxicolato de sódio
(2,5%), SDS (0,5%), Triton (0,5%);
Inibidores de proteases: Benzamidina, Leupeptina, Pepstatina, Soybean, PMSF
e EDTA;
Inibidores de fosfatases: Ortovanato e NaF.
O lisado de células foi utilizado para os experimentos de “Western Blot” ou
congelado a –70º C;
5.3 “Western Blot”
Os experimentos de “Western Blot” foram realizados para os sete subtipos de
receptores purinérgicos utilizando-se anticorpos disponíveis no mercado (Alomone
Labs Ltd., Jerusalém, Israel), segundo metodologia estabelecida (Varanda & de
Carvalho, 1994). Os anticorpos utilizados foram produzidos em coelhos contra uma
seqüência de aa da porção C-terminal (intracelular) de cada subtipo de receptor
46
purinérgico de ratos. Porém, observa-se grande homologia entre a mesma porção dos
receptores purinérgicos em camundongos (tabela 1).
Para os experimentos com o anticorpo anti-P2X7 foram utilizados macrófagos
como controle positivo, cedidos pelo Prof. Dr. Dario Zamboni, Depto. de Biologia
Celular e Microbiologia – FMRP, isolados de acordo com Zamboni & Rabinovitch
(2003).
Tabela 1: Seqüências de aminoácidos (aa) reconhecidas pelos anticorpos contra os subtipos P2X1-7 de ratos e seqüências de aa que compõem as terminações –COOH intracelulares dos receptores P2X1-7 de camundongos. Os aa apresentados em negrito são os que diferem entre as duas seqüências comparadas. Terminações –COOH Seqüência de aa do Epítopo
RP2X Acesso (Mus musculus) Homologia (Rattus norvegicus) Acesso
P2X1 AAF68968 DPAATSSTLGLQENMRTS 17/18 DPVATSSTLGLQENMRTS P47824
P2X2 NP_700449 SQQDSTSTDPKGLAQL 16/16 SQQDSTSTDPKGLAQL P49653
P2X3 NP_663501 VEKQSTDSGAYSIGH 15/15 VEKQSTDSGAYSIGH P49654
P2X4 NP_035156 YVEDYEQGLSGETDQ 13/15 YVEDYEQGLSGEMNQ P51577
P2X5 NP_201578 QENAFVNMKPSQILQTVKT 13/19 RENAIVNVKQSQILHPVKT P51578
P2X6 NP_035158 RTKYEEARAPKTTTNSS 15/17 RTKYEEARAPKATTNSA P51579
P2X7 CAA08853 RIRKE FPKTEGQYSG FKYPY 18/20 KIRKEFPKTQGQYSGFKYPY Q64663
Os experimentos de “Western Blot” foram desenvolvidos com auxílio do Prof. Dr.
Marcelo Damário Gomes e da pós-graduanda Ana Letícia Maragno, Depto. de
Bioquímica e Imunologia - FMRP. O protocolo de “Western Blot” utilizado foi:
• O lisado de células foi sonicado (Sonics Materials, Danbury, CT, USA) com
amplitude de 20% a 30%, em pulsos de 30 segundos, com o intuito de degradar
possíveis grumos de lipídeos, proteínas e DNA.
• O lisado de células foi, então, centrifugado por 5 min a 4º C e 10000 x g;
• Foi determinada a concentração de proteínas do lisado de células pelo método
colorimétrico de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) medindo-
47
se as densidades ópticas (Spectronic Genesys 2, Spectronic Instruments,
Rochester, NY, USA);
• A solução da amostra foi misturada com tampão de amostra: (2x) Tris/HCL pH
6,8 100 mM, SDS 4%, azul de bromofenol 0,2% e glicerol 20%; antes do uso foi
adicionado dithiotreitol – DTT – 200 mM, armazenado a –20º C. A solução foi
fervida a 98º C por 5 min em banho seco em bloco (Cientec Equipamentos para
Laboratórios Ltda, Piracicaba, SP, Brasil);
• As placas para eletroforese foram montadas com espaçadores Mini protean II
Bio-Rad e gel de resolução 12%: água destilada, 30% Acrylamide mix, 1,5 M
Tris pH 8,8, 10% SDS, 10% APS e TEMED;
• O gel de resolução foi aplicado no aparato de eletroforese até o nível desejado;
• Após a polimerização do gel de resolução, foi aplicado o gel de empacotamento
5% (água destilada, 30% Acrylamide mix, 1,0 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10%
APS e TEMED) e inserido o pente;
• Foram utilizados 100 µg de proteína e 20 µl de solução por poço;
• Foi então adicionado o tampão de corrida (Tris 205 mM, glicina pH 8,3 2,5 M e
SDS 1%) ao aparato de eletroforese e iniciou-se o processo à voltagem de 100
a 130 V durante 90 min;
• Após a eletroforese as proteínas resolvidas no gel de poliacrilamida/SDS foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, banhada pelo tampão de
transferência: Tris 48 mM, glicina 39 mM, metanol 20% e SDS 10% (Trans-Blot
SD, Semi Dry Transfer Cell, BioRad);
48
• O processo descrito no item acima teve duração de 25 min sob diferença de
voltagem de 10 V;
• A membrana foi corada com Vermelho Ponceau (Ponceau S 50 mg, ácido
acético glacial 5%, água Mili Q 50 ml) durante 1 minuto e descorada
rapidamente com água Mili Q, para que as bandas do marcador de tamanho
molecular fossem definidas;
• Em seguida, a solução de bloqueio (leite desnatado Molico – Nestlé 10%) foi
adicionada à membrana por 1 hora à temperatura ambiente ou durante uma
noite a 4º C;
• A membrana foi lavada três vezes por 5 min com Tris pH 7,5 1 M 50 ml, NaCl 5
M 20 ml, Tween 0,5 ml (TTBS) para retirada da solução de bloqueio;
• Após cessar o bloqueio a membrana foi incubada por uma hora à temperatura
ambiente na presença do anticorpo primário desejado diluído adequadamente
em TTBS, BSA e azida (1:400);
• Novamente a membrana foi lavada por quatro vezes de 5 min em TTBS e
incubada com o anticorpo secundário durante 30 minutos (anti-IgG de coelho,
conjugado com peroxidase). O anticorpo secundário foi cedido pelo Prof. Dr.
Eduardo Brant de Oliveira, Depto. de Bioquímica e Imunologia - FMRP;
• Após o término da incubação a membrana foi lavada por mais quatro vezes
durante 10 min em TTBS e tratada com reagente quimioluminescente (Western
Blotting Luminal Reagent, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)
por 1 minuto;
49
• A membrana foi então exposta a um filme fotográfico (Hyperfilm, Amersham
Bioscience, UK) durante três tempos distintos: 1, 3 e 15 min;
• O filme foi banhado com revelador e fixador (Dental Kodak);
• Aguardou-se a secagem do filme e este foi colocado sobre a membrana para
cópia dos padrões marcados anteriormente por lápis utilizado em maquiagem
(de olhos).
5.4 Imunofluorescência
Utilizou-se um protocolo de imunofluorescência modificado de Borges e
colaboradores (2002). Para marcação dos subtipos de receptores purinérgicos foram
usados anticorpos primários (1:200), produzidos em coelhos, contra seqüências
intracelulares de aa dos receptores P2X1 a P2X7, os mesmos usados para os
experimentos de “Western Blot”. Para os experimentos de colocalização foi utilizado o
composto dihidrocloreto de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), marcador de núcleo
celular, e o anticorpo anti-Calreticulina (1:200), produzido em galinha, que marca o RE
celular. Os anticorpos secundários usados foram Alexa Fluor 488 (produzido em cabra
contra a IgG de coelhos) e Alexa Fluor 594 (produzido em cabra contra a IgG de
galinhas), utilizados na concentração 1:800 (Molecular Probes). A análise da
colocalização dos receptores purinérgicos com o núcleo e com o RE foi feita através do
Coeficiente de Sobreposição de Manders (MOC). O seu valor varia de zero a 1 e
quanto mais próximo de 1 maior a colocalização (Manders et al., 1993). Os resultados
obtidos pela técnica de “Western Blot” serviram inclusive como controles para as
imunofluorescências. O protocolo de extração e purificação de células foi descrito
50
anteriormente. Segue abaixo o protocolo utilizado para os experimentos de
imunofluorescência:
• As lamínulas foram lavadas com álcool e flambadas;
• Foram então mergulhadas em acetona (MERCK) adicionada de Biobond 2% por
4 min;
• Após lavagem das lamínulas com água Milli Q por 2 min, estas foram deixadas
em uma “estante” de papel alumínio até secarem (cerca de 60 min);
• As células previamente isoladas por dispersão mecânica e purificadas por
choque osmótico foram então semeadas (lamínulas redondas de 13 mm de
diâmetro, 100 l, e lamínulas quadradas 22X22 mm, 500 l);
• As células foram fixadas durante 15 min utilizando-se PFA 4% diluído em
tampão fosfato (PBS) em temperatura ambiente;
• Com o intuito de permeabilizar as células, estas foram lavadas por três vezes,
de 5 min cada, com PBS adicionado de 0,5% de Triton;
• As células foram então incubadas com a solução de bloqueio (PBS + 0,5%
Triton + 1% BSA + 5% soro de cabra) por 60 min na câmara úmida e escura (50
l pra cada lamínula redonda e 100 l pra cada lamínula quadrada);
• Posteriormente foram incubadas com anticorpo primário diluído em PBS + 0,5%
Triton + 1% BSA por 120 min na câmara úmida e escura;
• Após a lavagem das células por três vezes de 5 min com PBS estas foram
incubadas com anticorpo secundário, Alexa 488 ou Alexa 594 diluído em PBS +
1% BSA, por 60 min na câmara úmida e escura;
51
• Novamente as células foram lavadas por três vezes de 5 min com PBS e,
posteriormente, com água destilada;
• As lamínulas foram, então, montadas em lâminas utilizando-se Prolong
(Invitrogen).
Para os ensaios de controle negativo, foram repetidos todos os procedimentos
descritos acima, mas omitidos os anticorpos primários para cada subtipo dos
receptores purinérgicos.
A análise de todo o material de imunofluorescência foi feita em microscópio
confocal de fluorescência (Leica TCS SP5), disponível no Depto. de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos – FMRP, com a colaboração da Dra. Roberta
Ribeiro Costa, Depto. de Fisiologia - FMRP.
5.5 Captação de Corantes Fluorescentes
Experimentos de captação de corantes fluorescentes foram realizados com o
objetivo de investigar a presença do subtipo de receptor P2X7. Este apresenta a
característica peculiar de formar um grande poro na membrana, quando atuando como
canal funcional. Dessa forma, utilizando-se de dois corantes com moléculas de
tamanho grande, Amarelo de Lúcifer (AL) e Brometo de Etídeo (BE), as células de
Leydig foram estimuladas com ATP e observamos a ocorrência ou não de
fluorescência no interior das células. Para tanto seguimos o protocolo abaixo descrito,
modificado de Coutinho-Silva et al., (1999):
52
• As células previamente isoladas por dispersão mecânica e purificadas por
choque osmótico foram semeadas em placas de petri para microscopia confocal
(30 mm);
• Após 20 min de espera para que as células aderissem à placa, adicionou-se
uma solução de Hank’s + ATP 5 mM contendo AL 5 mM ou BE 10 µM;
• Após 10 min observou-se a fluorescência das células (na placa com o corante
AL a solução foi lavada antes de levar as células ao microscópio);
• Nas placas que serviram para os experimentos controle o procedimento foi o
mesmo, porém a solução de Hank’s adicionada não continha ATP, somente os
corantes.
Os experimentos de captação de corantes, da mesma forma que os
experimentos de imunofluorescência, foram analisados em microscópio confocal de
fluorescência (Leica TCS SP5), com a colaboração da Dra. Roberta Ribeiro Costa.
5.6 Eletrofisiologia
Para os experimentos eletrofisiológicos, após o isolamento as células foram
transferidas para uma câmara de acrílico com volume de aproximadamente 300 µL
montada sobre a platina de um microscópio de fase invertido (Nikon-TMD). Medidas de
correntes iônicas foram realizadas utilizando-se a técnica de “patch clamp” (Hamill et
al., 1981) em suas configurações “whole-cell” e “cell-attached” todas feitas no modo
“voltage-clamp”. Todos os registros eletrofisiológicos foram realizados em células de
Leydig isoladas a fresco e que permaneceram aderidas às lamínulas de vidro mesmo
53
depois de submetidas à perfusão com solução de banho. As micropipetas de vidro
foram estiradas a partir de capilares de vidro (Borosilicate Glass, Sutter Instruments Co,
Novato, CA, USA) com auxílio de um estirador microcontrolado P-97 (Sutter
Instruments Co, Novato, CA, USA). As extremidades dos capilares foram flambadas
para que estes, após serem estirados, não danificassem o eletrodo de Ag/AgCl e
facilitassem a obtenção de selos estáveis e de alta resistência (GΩ ).
A micropipeta conecta a célula em estudo, através do eletrodo de Ag/AgCl, ao
sistema eletrônico de medida, um amplificador de “patch” (Axopatch 200B, Axon
Instruments, Foster City, CA, USA). Os dados de corrente são repassados a um
microcomputador através de um conversor analógico-digital (Digidata 1440A, Axon
Instruments, Foster City, CA, USA) e armazenados em disco rígido. A interface,
controlada pelo software PClamp (Digidata) serve tanto à aquisição de dados como à
geração de protocolos específicos de voltagem.
5.6.1 Experimentos em “whole-cell”
Os experimentos na configuração “whole-cell” foram realizados com o intuito de
diferenciar o subtipo de receptor purinérgico responsável pela corrente macroscópica
nas células de Leydig de camundongos. Nessa configuração, a micropipeta de vidro
(resistência entre 3 e 4 MΩ ) é selada à membrana celular até atingir-se um selo de alta
resistência (>1 GΩ ). Com o uso de uma seringa conectada à micropipeta de vidro,
aplica-se uma pressão negativa na pipeta para o rompimento de uma pequena área da
membrana selada à pipeta. Assim, torna-se possível o registro de correntes
macroscópicas de célula de Leydig. A solução de pipeta era composta essencialmente
54
por KCl 140 mM. A estimulação das células com ATP (Sigma-Aldrich Co., St. Louis,
MO, USA) bem como a incubação com o composto Ivermectina (Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA) foram feitas com auxílio de um sistema de perfusão desenvolvido em
nosso laboratório e controlado por um sistema de válvulas (RSC – Bio-Logic Co., Claix,
France). Após amplificação as correntes iônicas foram filtradas em 2 KHz e adquiridas
a uma taxa de 5 KHz.
5.6.2 Experimentos em “cell attached”
A justificativa para este tipo de experimento é baseada no fato de que os
receptores purinérgicos presentes em células de Leydig possuam grande
permeabilidade a Ca2+ e, dessa forma, sua ativação deve causar alteração na
concentração intracelular deste íon (Poletto Chaves et al., 2006). Dado o aumento da
[Ca2+]i após a perfusão com ATP, pudemos observar o efeito da ativação dos canais
BKCa, utilizando a configuração “cell-attached”. Isto é, a micropipeta de vidro
(resistência entre 12 e 15 MΩ )?? foi selada à membrana celular, sem rompê-la, de modo
a registrar-se a atividade de um único canal iônico sem retirá-lo da célula. O “patch”
teve sua voltagem fixada em vários níveis. Por outro lado, estimou-se que a célula em
estudo teve seu potencial de repouso próximo de zero mV, já que as soluções de
banho e pipeta continham KCl 140 mM. A aplicação de ATP procedeu-se da mesma
maneira descrita anteriormente. Após amplificação, as correntes iônicas foram filtradas
em 2 KHz e amostradas a uma taxa de 10 KHz.
5.7 Soluções e Substâncias Químicas
55
As soluções utilizadas para os experimentos de eletrofisiologia estão
apresentadas na tabela 2. O pH da solução de Hank’s foi ajustado para 7,4 com a
adição de NaOH (Hank’s NaCl) e KOH (Hank’s KCl). Para a solução de pipeta o ajuste
do pH foi feito com KOH para o valor 7,2 para a solução de pipeta utilizada nos
experimentos de “whole-cell” (WC) e 7,4 nos experimentos de “cell-attached” (CA).
Todas as soluções foram filtradas (membrana de celulose 0,22 µm de poro, Millipore,
São Paulo - SP, Brasil) e medidas as osmolalidades (OS osmometer, Fiske Associates
Needham Heights, MA, USA).
As soluções que continham ATP foram preparadas diariamente a partir de uma
solução estoque de ATP 100 mM, mantida a -20º C, diluída em Hank’s. O composto
Ivermectina (22,23 - dihydroavermectin B1) é um análogo semi-sintético da
abamectina, uma lactona macrocíclica também chamada de avermectina B1a, derivada
do processo de fermentação do fungo S. avermitilis. A Ivermectina foi diluída em DMSO
em alíquotas de 10 mM que foram mantidas a -20º C. Estas alíquotas foram utilizadas
para preparação da solução de incubação das células nas concentrações de 0,5 µM e
3 µM. A concentração de DMSO não ultrapassou 0,03%.
Tabela 2: Composição (mM) das soluções de banho e pipeta e suas respectivas osmolalidades (mOsm/KgH2O; média±DP). As soluções de Hank’s e pipeta WC foram utilizadas para os experimentos na configuração “whole-cell’. E para os experimentos de “cell-attached” foram utilizadas as soluções de Hank’s KCl e pipeta CA.
56
Soluções NaCl KCl CaCl2 MgCl2 Hepes D-glicose EGTA TEA NaHCO3 osmolalidade
Hank's 140 4,6 1,6 1,13 10 10 5 311,3 ± 3,19
Hank's KCl 145 1,6 1,13 10 10 5 314 ± 3,67
Pipeta WC 140 2 10 11 2 314,25 ± 3,73
Pipeta CA 145 3 1 10 5 314,25 ± 3,73
5.8 Análise estatística
A análise dos resultados foi realizada pelo programa computacional R (version
2.5.1, 2007-06-27, Copyright (C), The R Foundation for Statistical Computing, ISBN 3-
900051-07-0). Foi utilizado o teste de Wilcoxon signed rak test, utilizado como teste
pareado. Os resultados serão apresentados na forma média±EPM.
57
6 Resultados
Nas células de Leydig, foram descritos receptores purinérgicos que apresentam
rápida ativação e lenta dessensibilização, caracterizando-se como receptores
ionotrópicos P2X (Poletto-Chaves et al., 2006). Com o objetivo de caracterizar
possíveis subtipos de receptores ionotrópicos em células de Leydig, realizaram-se
experimentos, cujos resultados serão apresentados a seguir.
6.1 Marcação da Enzima 3ß HSD
Visando obter preparações de células de Leydig com certo grau de pureza,
desenvolvemos um protocolo baseado na aplicação de choque hiposmótico às células
extraídas por dispersão mecânica. Tal preparação serviu aos experimentos de
imunofluorescência, para que pudéssemos identificar as células de Leydig pelo
microscópio confocal, devido a sua morfologia característica, com maior facilidade.
Para nos certificarmos da eficácia do protocolo desenvolvido, realizamos experimentos
de marcação da enzima 3ß hidroxi esteróide desidrogenase (3ß-HSD), característica
das células de Leydig e indispensável para a biossíntese do hormônio testosterona. Na
figura 3, painéis A e C, podemos observar o experimento de marcação da enzima 3ß-
HSD antes do choque hiposmótico com menor e maior aumento, respectivamente.
Como podemos observar, existem células coradas com azul intenso e muitas outras
células não coradas, ou seja, contaminantes. Já as imagens B e D da figura 3 ainda
mostram as células coloridas de azul intenso, evidenciando a presença da enzima 3ß-
HSD, porém com poucas células não marcadas. Este resultado nos mostra que o
método utilizado na purificação destas células foi eficiente, visto que a preparação
58
apresenta as células de Leydig sem alteração de morfologia e muito pouca
contaminação com outras células.
A B
C D
Figura 3: Identificação das células de Leydig por marcação da enzima 3ß-HSD. Em A podemos observar a suspensão de células, antes do choque osmótico, com a marcação para a enzima 3ß-HSD. Em C temos o mesmo experimento em aumento maior. Em B temos a suspensão de células, após do choque osmótico, marcadas para a enzima 3ß-HSD e em D a imagem do mesmo experimento em aumento maior. As células marcadas de azul intenso indicam a presença da enzima 3ß-HSD caracterizando-as como células de Leydig. As setas exemplificam células de Leydig. (Barra = 20 µm).
6.2 “Western Blot”
Dado que este tipo de experimento requer uma preparação com grande número
de células e sem contaminação com outros tipos celulares, as células de Leydig foram
extraídas por dispersão mecânica associada à enzima colagenase, purificadas por
59
meio do choque hiposmótico e separadas de outros contaminantes utilizando-se
centrifugação em gradiente descontínuo de percoll. As figuras 4 a 6 mostram os
resultados para os sete subtipos de receptores. Estão presentes bandas marcadas
para os subtipos P2X2, P2X4 e P2X6 (figura 4). Os pesos moleculares dessas bandas,
em torno de 65 KDa, estão de acordo com o esperado para as respectivas proteínas
formadoras desses receptores. Com o intuito de avaliar a especificidade dos
anticorpos, foram realizados experimentos utilizando-se anticorpos anti-P2X2, anti-P2X4
e anti-P2X6 pré-incubados por uma hora com o respectivo peptídeo cognato de cada
anticorpo. Nesses experimentos, o anticorpo primário foi lavado pois não se ligou à
proteína do receptor, visto que estava ligado ao peptídeo cognato. Dessa forma, as
bandas correspondentes aos anticorpos anti-P2X2, anti-P2X4 e anti-P2X6 não são
detectadas (figura 4). Na figura 5, são mostrados os resultados com anticorpos
correspondentes aos subtipos P2X1, P2X3 e P2X5. Como podemos observar, não há
marcação para essas proteínas, que também apresentam pesos moleculares em torno
de 65 KDa. A banda marcada para o subtipo P2X5 corresponde a uma ligação
inespecífica do anticorpo. Já o experimento com o anticorpo contra o subtipo P2X7
mostrou mais de uma banda marcada (figura 6). A banda correspondente ao receptor
P2X7 é pouco visível tanto nas células de Leydig como nos macrófagos, usados como
controle positivo para este experimento por apresentarem receptores P2X7 endógenos
(Coutinho-Silva et al., 1999). As outras bandas marcadas apresentam menor peso
molecular. Utilizando-se o anticorpo pré-incubado por uma hora com o respectivo
peptídeo cognato, tanto a banda correspondente ao receptor P2X7 (cerca de 70 KDa)
quanto as bandas de menor peso molecular não foram marcadas. Devido à presença
60
de outras bandas reconhecidas pelo anticorpo anti-P2X7, não prosseguimos com os
experimentos de imunofluorescência. Porém, experimentos de permeabilização das
células de Leydig foram feitos com o intuito de avaliar a funcionalidade desse receptor
e serão descritos no decorrer deste trabalho.
Figura 4: “Western Blots” com anticorpos anti-P2X2, anti-P2X4 e anti-P2X6. A figura mostra bandas marcadas para os anticorpos anti-P2X2, anti-P2X4 e anti-P2X6, bem como aqueles onde estes anticorpos foram previamente incubados por uma hora com seus respectivos peptídeos cognatos (Ac + PC). Nestes há confirmação de que as bandas anteriormente marcadas correspondem aos respectivos receptores por estarem ausentes após incubação dos anticorpos com os peptídeos cognatos.
Figura 5: “Western Blots” utilizando anticorpos contra os subtipos P2X1, P2X3 e P2X5. Não há marcação para as bandas dos subtipos P2X1, P2X3 e P2X5. A banda marcada para o subtipo P2X5 corresponde a uma ligação não específica do anticorpo.
61
Figura 6: “Western Blots” utilizando o anticorpo contra o subtipo P2X7. Há marcação da banda próximo ao peso molecular de 70 KDa,correspondente ao subtipo P2X7, tanto nas células de Leydig quanto nos macrófagos (seta). No experimento em que o anticorpo foi previamente incubado por 60 min com seu respectivo peptídeo cognato (Ac + PC) a banda correspondente ao receptor não foi marcada, desaparecendo também as bandas de menor peso molecular marcadas nas células de Leydig.
6.3 Imunofluorescência
Com o objetivo de reforçar os resultados de “Western Blot” e usando-os como
referência foram realizados experimentos de imunofluorescência em células de Leydig
de camundongos com os mesmos anticorpos utilizados anteriormente.
A figura 7 apresenta as fotos dos experimentos de imunofluorescência para as
seis subunidades de receptores purinérgicos. Esses resultados reforçam aqueles de
“Western Blot”, exibindo marcação para as subunidades P2X2, P2X4 e P2X6 (figura 7,
B2, D2 e F2, respectivamente). A distribuição celular desses receptores é distinta, como
evidenciado pelos painéis A2, B2 e C2 da figura 8, que correspondem à marcação para
as subunidades P2X2, P2X4 e P2X6, respectivamente. A ausência de marcação para as
subunidades P2X1, P2X3 e P2X5 é indicada pelos painéis A2, C2 e E2 da figura 7,
62
respectivamente, pois estes não se distinguem do experimento controle (figura 7, G2).
Foram realizados experimentos de dupla marcação, utilizando-se anticorpos anti-P2X2,
anti-P2X4 e anti-P2X6 associados ao DAPI (marcação do núcleo celular) e ao anticorpo
anti-Calreticulina (marcação do RE). O grau de colocalização foi avaliado pelo
coeficiente de sobreposição de Manders (MOC) e estão evidenciados pela marcação
de cor branca nas imagens sobrepostas da figura 8: P2X2-RE 0,699 (A5); P2X2-DAPI
0,660 (A6); P2X4-RE 0,927 (B5); P2X4-DAPI 0,750 (B6); P2X6-RE 0,816 (C5); P2X6-DAPI
0,778 (C6). Os pontos que exibem maior fluorescência na marcação das subunidades
P2X2 e P2X6 estão indicados pelas setas brancas na figura 8 (A2 e A6, C2 e C6,
respectivamente) e são, possivelmente, os aglomerados de subunidades denominados
de “clusters”.
63
Figura 7: Presença de diferentes subunidades de receptores purinérgicos em células de Leydig. Nos painéis à esquerda podemos observar as imagens por contraste diferencial de interferência (DIC) seguidas de seus respectivos campos fluorescentes (painéis à direita) para as subunidades P2X1 (A1 e A2), P2X2 (B1 e B2), P2X3 (C1 e C2), P2X4 (D1 e D2), P2X5 (E1 e E2), P2X6 (F1 e F2), e para o experimento controle (G1 e G2). (Barra = 10 µm).
64
Figura 8: Colocalização das subunidades P2X2, P2X4 e P2X6 com o núcleo celular e RE. Os painéis A1-4 exibem, respectivamente, a imagem por contraste diferencial de interferência (DIC), o campo fluorescente correspondente para a subunidade P2X2, a marcação para o RE e a marcação para o núcleo celular. Foram sobrepostas as imagens da marcação para a subunidade P2X2 com a marcação para o RE (A5), e com a marcação para o núcleo celular (A6). Em branco, nas imagens sobrepostas, estão evidenciadas as regiões de colocalização. Os painéis adicionais seguem a mesma descrição, porém, referem-se às subunidades P2X4 (B1-6) e P2X6 (C1-6). As setas em branco indicam pontos com maior fluorescência que são, possivelmente, os aglomerados de subunidades denominados “clusters”, tanto para a subunidade P2X2 quanto para a subunidade P2X6. (Barra = 10 µm).
6.4 Captação de Corantes Fluorescentes
Para esclarecermos os resultados de “Western Blot” relacionados com o
receptor purinérgico P2X7, foram realizados experimentos de captação de corantes
fluorescentes utilizando-se Amarelo de Lúcifer e Brometo de Etídeo. Ambos
apresentam moléculas de tamanho grande, 457,24 KDa e 394,31 KDa
respectivamente, e são incapazes de permear a membrana celular das células de
Leydig a não ser por um grande poro. O receptor P2X7 possui a capacidade peculiar de
formar um poro de maior tamanho quando comparado aos outros subtipos de
receptores purinérgicos P2X. Considerando-se os resultados de “Western Blot”, que
65
sugerem a presença desses receptores em células de Leydig, a estimulação dessas
células com ATP deveria levar à abertura dos receptores P2X7 com conseqüente
permeação dos corantes. Esses corantes deixariam fluorescente o interior da célula
como um todo, no caso do Amarelo de Lúcifer, e o núcleo, no caso do Brometo de
Etídeo. A figura 9 mostra que não há fluorescência detectável para ambos os corantes
nas células intactas, sugerindo que esses receptores não estão presentes nas células
de Leydig, ou que não sejam funcionais.
Figura 9: Ausência de captação de corantes pelas células de Leydig após a estimulação por ATP. A foto A1 mostra a imagem por DIC, a foto A2 o campo fluorescente e a foto A3 a sobreposição das duas imagens para o experimento com Amarelo de Lúcifer. Podemos observar que apenas as células danificadas apresentam fluorescência para o corante. Em B1 temos a imagem por DIC, em B2 a imagem da fluorescência e em B3 as duas imagens anteriores sobrepostas referentes ao experimento com Brometo de Etídeo. Repetidamente, só as células morfologicamente alteradas exibem marcação dos seus núcleos com o corante. (Barra = 20 µm).
66
6.5 Eletrofisiologia
6.5.1 Configuração “whole-cell”
Com o objetivo de identificar os subtipos de receptores purinérgicos funcionais
responsáveis pela resposta da célula de Leydig ao ATP foi investigado o efeito de
diferentes concentrações de Ivermectina nessa resposta. O registro controle feito após
a primeira estimulação das células com ATP serviu como referência para a
comparação dos registros subseqüentes, estimulação com ATP após incubação das
células com Ivermectina por 3 min e estimulação com ATP após lavagem das células
por 5 min. O protocolo experimental acima descrito está esquematizado na figura 10 e
os registros de correntes foram numerados de acordo com a ordem do protocolo.
Todos os registros foram feitos sob voltagem de -50 mV. A figura 11 mostra os
registros do experimento controle, feitos em seqüência, sem incubação com a
Ivermectina. Na figura 12 podemos observar que não há diferença significativa entre os
valores dos picos das correntes evocadas em resposta às três estimulações seguidas
com ATP. A segunda resposta ao ATP apresentou uma corrente de 100,83±3,59% em
relação à corrente controle e a terceira resposta de 92,97 ± 3,66% n=17).
Figura 10: Protocolo para estudo dos efeitos da Ivermectina da resposta ao ATP em células de Leydig. O protocolo foi iniciado pela aplicação de ATP 100 µM por 6 s seguido de lavagem com Hank’s (H) por 20 s. Após a primeira lavagem as células foram incubadas com Ivermectina durante 3 min e novamente fez-se uma aplicação de ATP 100 µM por 6 s na presença de Ivermectina. Foi feita então a segunda lavagem com duração de 5 min e um terceiro e último pulso de ATP 100 µM foi aplicado às células.
t (s)
67
Quando incubadas com Ivermectina 0,5 µM as células responderam com um
aumento de 131,23±5,90% (n=12) na corrente purinérgica em relação ao registro inicial
controle, que estatisticamente não foi revertido após a lavagem 101,35 ± 4,70%, n=10)
(figuras 13 e 14). Já para as células que foram incubadas com Ivermectina 3 µM a
resposta diminuiu para 64,18 ± 4,81% (n=19) em relação ao controle inicial, sendo este
efeito estatisticamente revertido após a lavagem 76,67 ± 4,13% (n=11) (figuras 15 e
16).
68
ATP 1 ATP 2 ATP 3
100 pA
Figura 11: Correntes purinérgicas macroscópicas de células de Leydig. Correntes purinérgicas evocadas em resposta à estimulação com ATP 100 µM. Os registros foram feitos em seqüência com intervalo de lavagem primeiramente de 3min20s (1 e 2) e em seguida de 5 min (3).
ATP 1 ATP 2 ATP 30
20
40
60
80
100
120
140
Co
rr
en
te (
%)
Figura 12: Valores normalizados dos picos das correntes evocadas por aplicação seqüencial de ATP. O gráfico apresenta a comparação entre os picos das correntes números 2 e 3 em relação à primeira corrente registrada: ATP1 -466,76±109,75 pA; ATP2 -456,64±104,36 pA; ATP3 -414,88±90,11 pA; n=17. Não há diferença significativa entre os valores dos três picos das correntes purinérgicas (Wilcoxon test p<0,05; *p=0,4775; #p=0,07566).
* #
69
ATP 1 ATP 2 ATP 3
200 pA
Figura 13: Correntes purinérgicas de células de Leydig após incubação com Ivermectina 0,5 µM. Correntes purinérgicas evocadas em resposta à estimulação com ATP 100 µM, no 1, à estimulação com ATP após incubação com Ivermectina 0,5 µM por 3 min, no 2, e à estimulação com ATP após lavagem de 5 min, no 3. Após o primeiro registro as células foram lavadas com Hank’s por 20 s antes de iniciar-se a incubação com Ivermectina.
ATP 100 µM ATP 100 µM + IVM 0,5 µM
ATP 1 ATP 2 ATP 30
20
40
60
80
100
120
140
Co
rr
en
te
(%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
Co
rr
en
te
(%
)
IVM [0,5] Figura 14: Valores normalizados dos picos das correntes purinérgicas evocadas em resposta à estimulação por ATP na presença de Ivermectina 0,5 µM. O gráfico apresenta a comparação entre os picos das correntes após incubação com Ivermectina 0,5 µM por 3 min, segunda aplicação de ATP, e após lavagem da droga por 5 min, terceira aplicação de ATP: ATP1 -171,10±51,79 pA; ATP2 -208,40±60,83 pA (n=12); ATP3 -180,60±55,91 pA; (n=10). Há aumento significativo da corrente purinérgica após a incubação com Ivermectina 0,5 µM, porém este não é revertido após o período de lavagem (Wilcoxon test p<0,05; *p=0,0002441 n=12; #p=0,001953).
*
#
70
ATP 1 ATP 2 ATP 3
150 pA Figura 15: Correntes purinérgicas em células de Leydig após incubação com Ivermectina 3 µM. Correntes purinérgicas evocadas em resposta à estimulação com ATP 100 µM, no 1, à estimulação com ATP após incubação com Ivermectina 3 µM por 3 min, no 2, e à estimulação com ATP após lavagem de 5 min, no 3. Após o primeiro registro as células foram lavadas com Hank’s por 20 s antes de iniciar-se a incubação com Ivermectina.
ATP 100 µM ATP 100 µM + IVM 0,5 µM
ATP 1 ATP 2 ATP 30
20
40
60
80
100
120
140
Co
rr
en
te (
%)
0
20
40
60
80
100
120
140
Co
rr
en
te (
%)
IVM [3] Figura 16: Valores dos picos das correntes evocadas por estimulação com ATP na presença de Ivermectina 3 µM. O gráfico apresenta a comparação entre os picos das correntes após incubação com Ivermectina 3 µM por 3 min, segunda aplicação de ATP, e após lavagem da droga por 5 min, terceira aplicação de ATP: ATP1 -434,09±97,07 pA; ATP2 -253,27±57,17 pA (n=19); ATP3 -343,18±88,13 pA; (n=11). Há diminuição significativa da corrente purinérgica após a incubação com Ivermectina 3 µM, revertida após o período de lavagem (Wilcoxon test, p<0,05; *p=1,907x10-6; #p=0,06524).
* #
71
6.5.2 Configuração “cell-attached”
Com o objetivo de observar se há interação entre o influxo de íons Ca2+ por
ativação de receptores purinérgicos P2X e o aumento de atividade de canais BKCa
presentes nas células de Leydig, foram realizados experimentos utilizando a
configuração “cell-attached”. A figura 17 mostra um registro de correntes unitárias dos
canais BKCa na ausência (controle) e presença de ATP. Podemos observar que há
aumento imediato da atividade desses canais em resposta às concentrações
crescentes de ATP. Para quantificar esse efeito procedemos à avaliação do parâmetro
N.Po, que significa o número de canais presentes no “patch” multiplicado pela
probabilidade de abertura do canal e equivale à corrente média, no tempo, dividida pela
corrente unitária do canal (figura 18). A figura mostra que o aumento da atividade
desses canais é dose-dependente. Os canais BKCa são ativados tanto em resposta ao
aumento de Ca2+ no intracelular como também em resposta à despolarização. Sendo
assim, foram realizados experimentos em “cell-attached” com o objetivo de avaliar a
dimensão da influência de diferentes valores de voltagem sobre a resposta dos canais
BKCa à estimulação das células de Leydig com ATP. A figura 19 apresenta registros de
canais unitários BKCa em duas situações, controle e com ATP, sob voltagens que
variaram de -30 mV a -80 mV. Esses valores de voltagem correspondem às voltagens
no interior da pipeta. Dessa forma, o interior celular é submetido a valores opostos, de
30 mV a 80 mV, despolarizados. Como a solução que banha as células contém a
mesma concentração de Cloreto de Potássio que a solução de pipeta, considera-se
que o potencial de repouso dessas células é nulo, não influenciando na voltagem
aplicada através da pipeta. Os valores de corrente média para os registros controles e
72
com ATP, de acordo com os diferentes valores de voltagem, estão mostrados na figura
20. Como era esperado para esses canais, podemos notar que há aumento de
amplitude da corrente média tanto na situação controle quanto na presença de ATP em
resposta ao aumento da voltagem aplicada. Porém, a condutância do canal não se
altera significativamente (223 pS no controle e 193 pS com ATP). Os resultados
apresentados na figura 21 mostram que, somente há resposta significativa do canal ao
aumento de [Ca2+] intracelular evocado pela estimulação de receptores purinérgicos
sob voltagens despolarizadas 30 mV e 60 mV (intracelular). De acordo com a análise
da figura 21, o parâmetro N.Po, exibe dependência de voltagem e a estimulação com
ATP parece ter menor influência nos seus valores.
73
Figura 17: Efeito do ATP sobre correntes unitárias dos canais BKCa. Esta figura mostra o aumento imediato da atividade dos canais BKCa em resposta à aplicação de ATP 45, 150 e 300 M de em células de Leydig. Foi aplicada voltagem de - 30 mV na pipeta.
ATP 150 µM
ATP 300 µM
ATP 45 µM
10 pA
74
[45] [150] [300]0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
NP
o
ControleATP
Figura 18: Efeito do ATP sobre a atividade dos canais unitários BKCa. O gráfico quantifica o aumento da atividade dos canais BKCa, representado pelo parâmetro N.Po, em resposta à concentrações crescentes de ATP aplicado às células de Leydig. Os valores médios do NPo seguidos do EPM para os grupos ATP 45, 150 e 300 M, nas situações controle e ATP são, respectivamente: 0,00115±0,00041, 0,00428±0,00236, n=7; 0,00128±0,00029, 0,01773±0,01012, n=5; 0,00397±0,00142, 0,02613±0,01053 n=9; Wilcoxon test, p<0,05; *p=0,01563; #p=0,03125; ? p=0,001953).
10 pA
200 ms
-30 mV
-40 mV
-50 mV
-60 mV
-70 mV
-80 mV
Controle ATP
Figura 19: Registro de canal unitário utilizando-se a configuração “cell-attached” sob diferentes voltagens. Esta figura mostra o aumento imediato da atividade dos canais BKCa em resposta à aplicação de 300 M de ATP nas células de Leydig mantidas sob diferentes valores de voltagem. Quanto maior a voltagem aplicada, maior a corrente que passa pelo canal, tanto no controle como na presença de ATP.
*
#
?
Controle ATP
75
-80 -70 -60 -50 -40 -30-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-80 -70 -60 -50 -40 -30-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
Co
rr
en
te (
pA
)
Voltagem (mV)
Controle ATP
Figura 20: Relação corrente x voltagem dos canais BKCa em situação controle e após a após a estimulação com ATP. A figura mostra a corrente média de canal unitário BKCa em função da voltagem. As retas são ajustes de uma função linear aos pontos, resultando numa condutância de 223 pS na situação controle e 193 pS após estimulação com ATP. Entre parênteses o número de células analisadas.
-80 -70 -60 -50 -40 -30
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
-80 -70 -60 -50 -40 -30
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
NP
o
Voltagem (mV)
Controle ATP 300 µM
Figura 21: Relação N.Po x voltagem dos canais BKCa em resposta à estimulação com ATP. A figura mostra os valores de N.Po (médias±EPM) para canais unitários BKCa em função dos valores de voltagem da pipeta. Em ambas as situações experimentais (controle e ATP) nota-se que o parâmetro N.Po apresenta dependência de voltagem. Há alteração da dependência de voltagem decorrente da aplicação de ATP apenas nos valores de voltagem 30 mV e 60 mV (intracelular) (Wilcoxon test, p<0,05; *p=0,03125; #p=0,03125).
(4)
(4)
(6)
(4) (3)
(6)
(4)
(4)
(6) (3)
(4)
(6)
* #
76
O aumento da atividade dos canais BKCa em resposta ao influxo de Ca2+
decorrente da estimulação das células de Leydig com ATP é revertido imediatamente
quando retirado o estímulo. Podemos observar a diminuição das correntes no período
de lavagem do ATP (figura 22). Avaliando-se estatisticamente os valores de N.Po dos
canais BKCa podemos observar que não há diferença significativa entre os valores de
corrente controles e após a lavagem do ATP, mostrando que seu efeito é reversível
(figura 23).
-10 pA
ATP
Figura 22: Reversão do efeito do ATP sobre as correntes dos canais BKCa. Este registro de canal unitário mostra o aumento imediato da atividade dos canais BKCa em resposta à aplicação de ATP 300 M (barra preta superior, 75 s). Esse aumento é revertido quando o estímulo é retirado, e as correntes voltam aos valores basais semelhantes à situação basal. A voltagem aplicada nesse registro foi de -30 mV.
Controle ATP0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025ATP
Lavagem
NP
o
Figura 23: Reversão do efeito do ATP sobre os valores de N.Po dos canais BKCa. O gráfico quantifica o aumento da atividade dos canais BKCa, representado pelo parâmetro N.Po, em resposta à aplicação de ATP 300 µM e a reversão desse efeito imediatamente após o início da lavagem. Os valores médios do NPo para os grupos controle, ATP e lavagem são, respectivamente: 0,00414± 0,00160; 0,01627±0,00420; 0,00739± 0,00263; n=8 (Wilcoxon test, p<0,05; *p=0,001953 n=8; #p=0,25).
*
#
300 µM
77
7 Discussão
Nas células de Leydig de camundongos estão presentes receptores que
apresentam rápida ativação e dessensibilização lenta, após a estimulação por ATP,
caracterizando-se como receptores ionotrópicos P2X (Poletto-Chaves et al., 2006). A
maior parte dos aspectos funcionais dos receptores P2X nessas células é consistente
com as características observadas em receptores homoméricos P2X2 (Poletto Chaves
et al., 2006). No entanto, os resultados de “Western blot” apresentados (figuras 4 a 6)
mostram a presença de pelo menos 4 subtipos diferentes de receptores purinérgicos, a
saber: P2X2, P2X4, P2X6 e P2X7. O anticorpo anti- P2X7 reconheceu quatro bandas de
pesos moleculares diferentes, uma correspondente ao peso molecular do clássico
subtipo P2X7 (cerca de 70 kDa) e outras três de pesos moleculares menores. Para este
experimento foi utilizado um controle positivo com macrófagos, que apresentam
expressão endógena de receptores P2X7 (Coutinho-Silva et al., 1999). Como resultado,
observamos que a banda marcada próxima de 70 KDa apresentada para os
macrófagos corresponde à banda de maior peso apresentada pelas células de Leydig.
Dessa forma, podemos inferir que as células de Leydig expressam endogenamente
receptores P2X7.
Com o intuito de reforçar os resultados de “Western blot” para os outros subtipos
de receptores, foram realizados experimentos de imunofluorescência utilizando-se os
mesmos anticorpos, com exceção do anti-P2X7. Os resultados de imunofluorescência
foram apresentados na figura 7 e corroboram os resultados de “Western blot”. Aschrafi
e colaboradores (2004), estudando a expressão das isoformas dos receptores P2X em
78
oócitos, demonstraram que para o subtipo P2X2 apenas os receptores com uma
formação trímerica, são incorporados à membrana. Os receptores não-funcionais
resultam de subunidades P2X2 aglomeradas, denominados de “clusters”, e não são
inseridos à membrana plasmática. De forma parcialmente semelhante aos receptores
P2X2, sabe-se que a subunidade P2X6 forma arranjos tetraméricos e, portanto, incapaz
de formar um canal homomérico funcional. Da mesma foram que os receptores P2X2,
esses arranjos formam “clusters” e ficam retidos no RE (Aschrafi et al., 2004). Para
que seja possível a formação de arranjos triméricos funcionais P2X6, incorporados à
membrana plasmática, é necessária a ocorrência de um processo de glicosilação
(Jones et al., 2004). Os resultados de Imunofluorescência para a presença dos
receptores P2X2 e P2X6 (figuras 8, painéis A2 e C2, respectivamente) mostram a
marcação de pontos aglomerados no interior celular que podem ser os “clusters”
homoméricos formados por essas subunidades. Interessantemente, através de dupla
marcação com DAPI e com o anticorpo anti-Calreticulina associados aos anticorpos
anti-P2X2, anti-P2X4 e anti- P2X6, podemos observar que há colocalização destes
receptores com o núcleo celular e com o RE, evidenciada pela marcação na cor branca
(Figura 8, painéis A5 e A6, B5 e B6, C5 e C6, respectivamente). A intensidade da
colocalização foi avaliada pelo Coeficiente de Sobreposição de Manders e indicou
intensa colocalização para a subunidade P2X4 com o RE (0,927).
Sendo assim, ainda que existam resultados prévios consistentes com o perfil de
receptores funcionais P2X2, os resultados acima descritos sugerem que as várias
subunidades presentes estejam formando receptores heteroméricos. Na tentativa de
esclarecer quais os possíveis arranjos formados pelos receptores presentes nas
79
células de Leydig, que se responsabilizassem pelas características das correntes
observadas, procedeu-se à análise funcional destes. A diferenciação entre os
receptores funcionais homoméricos P2X2 e P2X4 é dificultada pela existência de
características farmacológicas comuns. A dessensibilização lenta e a cinética da
corrente em resposta aos agonistas são semelhantes entre esses receptores (Bianchi
et al., 1999, Lynch et al., 1999). Além disso, a ação dos antagonistas é controversa
(Townsend-Nicholson et al., 1999, Jones et al., 2000), devido a pouca especificidade.
Entretanto, a ação do composto Ivermectina sobre esses receptores é distinta. Esta
droga atua como agonista de receptores homoméricos P2X4, aumentando tanto a
potência do ATP (cerca de dez vezes) quanto sua resposta máxima (de 50 – 300 %),
sem exibir efeito algum sobre os receptores homoméricos P2X2 (Khakh et al., 1999).
Ma e colaboradores (2004) mostraram que neurônios do gânglio óptico de
camundongos selvagens que não responderam ao aßmeATP tiveram redução da
corrente após serem pré-incubadas por 2 min com Ivermectina 1 µM. Há evidências da
presença de receptores P2X2 e P2X2/3 nessas células e os resultados mostram que a
Ivermectina pode inibir as correntes purinérgicas destes receptores (Ma et al., 2004). O
efeito da Ivermectina sobre receptores P2X4 se dá pela ligação em dois sítios distintos.
Um sítio de alta afinidade (EC50 0,25 M), capaz de aumentar a resposta máxima ao
ATP, possivelmente por diminuir a dessensibilização do canal. Outro sítio de baixa
afinidade (EC50 2 M) aumenta a afinidade ao ATP, acredita-se por mecanismos de
estabilização do canal na sua conformação aberta (Priel & Silberberg, 2004). De acordo
com os nossos resultados, referentes ao protocolo apresentado na figura 10, as células
submetidas à incubação com 0,5 µM de Ivermectina por 3 min apresentaram aumento
80
de aproximadamente 30% no pico da corrente, efeito não revertido após a lavagem
(figuras 13 e 14). Já as células incubadas com 3 µM de Ivermectina por 3 min
mostraram diminuição de aproximadamente 35 % no pico da corrente, com reversão
parcial do efeito após a lavagem (figuras 15 e 16). O experimento controle para a
observação do efeito da Ivermectina em células de Leydig está apresentado nas figuras
11 e 12. Na ausência de Ivermectina a aplicação seqüencial de ATP não altera
significativamente o valor da corrente máxima. Considerando-se os resultados de
aumento de corrente para a incubação com Ivermectina 0,5 µM, podemos inferir que,
nesta concentração, a droga tenha atuado em um receptor heteromérico que possui a
subunidade P2X4. Porém, como o aumento foi pequeno quando comparado ao efeito
da Ivermectina em receptores homoméricos P2X4, o receptor heteromérico nativo
parece apresentar outras subunidades além da subunidade P2X4. O efeito inibitório da
incubação com Ivermectina 3 µM corrobora a hipótese de que, além da subunidade
P2X4, outras subunidades estão envolvidas nos receptores funcionais expressos nas
células de Leydig. A presença de outras subunidades na composição do receptor tem
um efeito ativo na sensibilidade farmacológica à Ivermectina (Priel & Silberberg, 2004).
Lê e cols. (1998) observaram que o perfil da cinética do receptor heteromérico P2X4/6,
após 2 a 5 dias da transfecção em oócitos, difere do perfil farmacológico do receptor
homomérico P2X4. Os receptores P2X4/6 apresentam maior sensibilidade ao aßMeATP
em comparação com os receptores P2X4. Após pré-incubação de 2 min com
Ivermectina 3 µM há aumento da sensibilidade para ambos (Khakh et al., 1999). No
entanto, considerando-se os resultados de Poletto-Chaves e colaboradores (2006) que
mostram a insensibilidade dos receptores P2X funcionais de células de Leydig de
81
camundongos à estimulação com aßMeATP, exclui-se a possibilidade da existência de
receptores heteroméricos P2X4/6 nessas células.
Em relação aos outros receptores P2X, os P2X2 diferenciam-se funcionalmente
por exibirem aumento da corrente em situações de pH ácido (pH 6,5) (King et al., 1996;
King et al., 1997; Stoop et al., 1997; Miller et al., 1998; Wildman et al., 2002). Porém,
variações do pH de 6,5 para 5,5 ocasionam a diminuição da corrente purinérgica para
os receptores heteroméricos P2X2/6, enquanto que para os receptores homoméricos
P2X2 as correntes permanecem aumentadas (King et al., 2000). Segundo Poletto-
Chaves e colaboradores (2006) as células de Leydig de camundongos submetidas a
um valor de pH de 5,5 apresentam proeminente decréscimo das correntes. Esses
resultados corroboram a hipótese de receptores heteroméricos que envolvam as
subunidades P2X2 e P2X6.
Os receptores homoméricos P2X7 apresentam características peculiares quando
comparados aos outros subtipos. Em relação à farmacologia, o agonista mais potente
para os receptores nativos P2X7 de camundongos é o BzATP, com EC50 em torno de
90 µM. Para esses receptores o EC50 para o ATP é de aproximadamente 734 µM
(Chessel et al., 1998). As células de Leydig de camundongos apresentaram um valor
de EC50 para os receptores funcionais em torno de 44 µM para ativação pelo ATP
(Poletto Chaves et al., 2006), o que não condiz com a presença de receptores
purinérgicos P2X7 funcionais. Além disso, a necessidade de concentrações milimolares
de ATP para sua estimulação in vivo coloca em questão a sua função fisiológica (Hibell
et al., 2000). Outra característica peculiar aos receptores P2X7 é a capacidade de
permitir a passagem de moléculas de grande peso molecular, até 900 KDa, após
82
exposição prolongada ao agonista (Surprenant et al., 1996). Assim sendo, alguns
corantes fluorescentes podem ser utilizados para detectar a formação de poros pelos
P2X7, como o Amarelo de Lúcifer (457,24 KDa) e Brometo de Etídeo (394,31 KDa).
Estes foram utilizados em experimentos de captação e serviram para se avaliar a
possível presença de receptores P2X7 funcionais em células de Leydig de
camundongos (Coutinho-Silva et al., 1999). Os resultados de ambos os experimentos,
com Amarelo de Lúcifer e Brometo de Etídeo (figura 9), mostraram, no entanto, que
não houve marcação fluorescente das células de Leydig intactas após estimulação
prolongada com ATP (5 mM). Apenas as células danificadas, que provavelmente
apresentavam rompimento da membrana celular, foram coradas. Estes resultados nos
levam a conclusão de que receptores P2X7 homoméricos funcionais não estão
presentes em células de Leydig de camundongos.
Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo indicam que os
receptores purinérgicos presentes em células de Leydig de camundongos são
heterômeros P2X2/4/6. Porém, as características funcionais do receptor expresso são
dominantes para a subunidade P2X2. Resultados semelhantes foram descritos também
para neurônios de Purkinje de ratos recém-nascidos, levando a hipótese da presença
de receptores heteroméricos P2X2/4/6 (Mateo et al., 1998). Em nosso caso, a
possibilidade de formação de canais heteroméricos P2X4/7 não foi considerada, pois
estes deveriam responder à ativação por BzATP e apresentar significante aumento da
corrente após pré-incubação de 5 min com Ivermectina 3 µM (Guo et al., 2007), fatos
não observados nos experimentos aqui descritos.
83
Poderia ser sugerido a existência de isoformas do receptor homomérico P2X7
devido à presença de outras bandas marcadas para o anticorpo anti-P2X7 nos
experimentos de “Western Blot”. Para receptores P2X7 de humanos já foram descritas
sete isoformas derivadas de “splice” alternativo. Uma das isoformas estudadas
apresenta-se parcialmente funcional e com expressão ligeiramente maior quando
comparada à expressão do receptor P2X7 que não sofreu “splice” (Cheewatrakoolpong
et al., 2005). Das quatro isoformas já descritas para camundongos três não apresentam
estruturas moleculares reconhecíveis pelo anticorpo utilizado (“b”, “c” e “d”), com
exceção da isoforma “a” que apresenta estrutura molecular com 99% de identidade em
relação à subunidade P2X7 que não sofreu “splice” [número de acesso pelo National
Center for Biotechnology Information - NCBI: NP 035157 (isoforma “a”), NP 001033934
(isoforma “b”), NP 001033928 (isoforma “c”), NP 001033976 (isoforma “d”)]. Dessa
forma, há necessidade de aprofundar os estudos moleculares da subunidade P2X7 e,
possivelmente, de suas isoformas nas células de Leydig de camundongos,
particularmente com a utilização de anticorpos mais específicos, não disponíveis no
mercado no momento.
A estequiometria entre as subunidades que formam o receptor está diretamente
ligada à expressão dessas subunidades na célula de Leydig. Segundo Collo e
colaboradores (1996), as isoformas P2X4 e P2X6 dos receptores purinérgicos P2X
demonstram um padrão distinto no que diz respeito à distribuição celular dos níveis de
RNAm, em cérebro de ratos adultos. Utilizando-se da técnica de Microscopia de Força
Atômica (AMF), Barrera e colaboradores (2007) demonstraram que a variação na
expressão das subunidades ocasiona mudanças na estequiometria da composição dos
84
canais heteroméricos. Quanto maior a expressão de um determinado subtipo, ele
estará presente em maior número na formação do receptor funcional que irá para a
membrana, sendo este efeito reversível. Esses resultados mostram que o arranjo dos
receptores P2X na forma e heterômeros é plástica e depende diretamente dos níveis
relativos de expressão de cada subunidade, reforçando a importância de estudos
subseqüentes sobre o papel dos diferentes arranjos na sinalização purinérgica.
Embora tenha sido descrita a presença dos receptores purinérgicos P2X em
células de Leydig de camundongos e sejam realizados estudos objetivando a
caracterização dos subtipos específicos desses receptores, a correlação do influxo de
íons Ca2+ com a fisiologia dessas células ainda é obscura. Kawa (1987), através de
estudo utilizando a técnica de “patch-clamp”, demonstrou que quando ocorre
despolarização da célula de Leydig, esta exibe uma condutância para K+ dependente
de Ca2+. Estudos de eletrofisiologia em células de Leydig demonstraram a presença de
canais para K+ nessas células e determinaram que aumento da [Ca2+] intracelular leva
a um aumento na atividade dos canais para K+. Carnio & Varanda (1995) também
observaram que a condutância desses canais era de 202 pS utilizando-se a
configuração “cell-attached” e sugeriram que as células de Leydig expressam os canais
para K+ dependentes de Ca2+ de alta condutância (BKCa). Com o objetivo de observar
se há interação entre o influxo de íons Ca2+, via ativação de receptores purinérgicos
P2X, e o aumento de atividade de canais de BKCa foram realizados experimentos onde
mediu-se a atividade de canais unitários na configuração “cell attached”. A figura 17
mostra um registro de correntes unitárias dos canais BKCa na ausência e presença de
ATP. Podemos observar que há alteração imediata na freqüência de abertura dos
85
canais com a aplicação de ATP. Para quantificar esse efeito procedemos à avaliação
do parâmetro N.Po, que significa o número de canais presentes no “patch” multiplicado
pela probabilidade de abertura do canal e equivale à corrente média dividida pela
corrente unitária. Observando os resultados apresentados na figura 18 para três
concentrações de ATP podemos notar que o aumento da atividade dos canais BKCa,
quando adicionada solução de banho com ATP, às células é dose-dependente. Além
disso, a ação indireta do ATP na atividade dos canais BKCa é reversível (figuras 22 e
23). Dessa forma, inferimos que a ativação de receptores purinérgicos pelo ATP leva à
ativação dos canais BKCa por aumento da [Ca2+] intracelular.
Além de serem ativados em resposta ao aumento de Ca2+ no intracelular, os
canais BKCa são ativados também em resposta à despolarização. Os experimentos
apresentados pela figura 19 foram realizados com o intuito de observar a influência da
variação da voltagem na amplitude da resposta dos canais BKCa, quando as células de
Leydig são estimuladas com ATP. Há aumento de amplitude da corrente média em
resposta ao aumento da despolarização no intracelular, em ambas as situações
experimentais, sem alteração significativa da condutância do canal (controle 223 pS;
ATP 193 pS) (figura 20). Porém, o aumento significativo no parâmetro N.Po ocorre
somente para os valores 30 mV e 60 mV (intracelular) (figura 21). Especula-se que sob
valores de voltagem mais despolarizados no interior celular, o estímulo de voltagem
seja o parâmetro dominante sobre a cinética do canal. Já é bem conhecida a
participação dos íons K+ na hiperpolarização da membrana em reposta às alterações
da [Ca2+]i. A interação entre esses mecanismos influencia a motilidade e a reação
acrossômica no espermatozóide em camundongos (Wu et al., 1998). Em neurônios do
86
sistema nervoso entérico de camundongos a razão de disparos é modulada por canais
para K+ dependentes de Ca2+ de condutância intermediária (IKCa), sendo estes
responsáveis pela hiperpolarização após o potencial de ação (Neylon et al., 2004). A
interação entre a variação da [Ca2+]i evocada pela abertura de canais purinérgicos e a
ativação de canais BKCa leva a hipótese da participação dos canais BKCa no decurso
temporal da dessensibilização dos receptores P2X.
87
8 Conclusões
• As subunidades P2X2, P2X4, P2X6 e P2X7 de receptores purinérgicos estão
presentes em células de Leydig de camundongos;
• Os resultados indicam que os receptores purinérgicos funcionais nessas células
sejam heterômeros P2X2/4/6;
• O efeito da Ivermectina sobre receptores P2X das células de Leydig reforça a
hipótese de que os receptores funcionais apresentam uma única subunidade
P2X4 associada a outras subunidades;
• A ativação de receptores P2X estimulados por ATP leva a um aumento de
atividade dos canais BKCa presentes nas células de Leydig. Este aumento da
atividade dos canais BKCa é dose-dependente e reversível.
88
9 Referências Bibliográficas
ALEXANDER K.; NIFORATOS, W.; BIANCHI, B.; BURGARD, E.C.; LYNCH, K.J.;
KOWALUK, E.A.; JARVIS, M.F.; VAN BIESEN, T. Allosteric modulation and
accelerated resensitization of human P2X3 receptors by cibacron blue. J.
Pharmacol. Exp. Ther., 291:1135–1142, 1999.
ASCHRAFI, A.; SADTLER, S.; NICULESCU, C.; RETTINGER, J.; SCHMALZING, G.
Trimeric Architecture of Homomeric P2X2 and Heteromeric P2X1+2 Receptor
Subtypes. J. Mol. Biol., 342:333-343, 2004.
BARRERA, N. P.; HENDERSON, R. M.; MURREL-LAGNADO, R. D.; EDWARDSON, J.
M. The Stoichiometry of P2X2/6 Receptor Heteromers Depends on Relative Subunit
Expression Levels. Biophys. J. 93(2):505-12, 2007.
BARRERA, N.P.; ORMOND, S.J.; HENDERSON, R.M.; MURRELL-LAGNADO, R.D.;
EDWARDSON, J.M. Atomic force microscopy imaging demonstrates that P2X2
receptors are trimers but that P2X6 receptor subunits do not oligomerize. J. Biol.
Chem., 280:10759–10765, 2005.
BEAN, B. P.; ATP-activated channels in rat and bullfrog sensory neurons: concentration
dependence and kinetics. J. Neurosci., 10:1-10, 1990.
BIANCHI, B. R.; LYNCH, K. J.; TOUMA, E.; NIFORATOS, W.; BURGARD, E. C.;
ALEXANDER, K. M.; PARK, H. S.; YU H.; METZGER, R.; KOWALUK, E.; JARVIS,
M. F.; van BIESEN, T. Pharmacological characterization of recombinant human
and rat P2X receptor subtypes. J. Pharmacol. 376:127–138, 1999.
89
BLATZ, A. L.; MAGLEBY, K. L. Calcium-activated potassium channels. Trends
Neurosci., 10:463-67, 1987.
BO, X.; ZHANG, Y.; NASSAR, M.; BURNSTOCK, G.; SCHOEPFER, R. A P2X
purinoceptor cDNA conferring a novel pharmacological profile. FEBS Lett.,
375:129–133, 1995.
BO, X.; SCHOEPFER, R.; BURNSTOCK, G. Molecular cloning and characterization of
a novel ATP P2X receptor subtype from embryonic chick skeletal muscle. J. Biol.
Chem., 275:14401–14407, 2000.
BO, X.; KIM, M.; NORI, S.L.; SCHOEPFER, R.; BURNSTOCK, G.; NORTH, R.A. Tissue
distribution of P2X4 receptors studied with an ectodomain antibody. Cell Tissue
Res., 313:159–165, 2003.
BOBANOVIC, L.K.; ROYLE, S.J.; MURRELL-LAGNADO, R.D. P2X receptor trafficking
in neurons is subunit specific. J. Neurosci., 22:4814–4824, 2002.
BORGES E.L.; de FÁTIMA LEITE, M.; BARBOSA, A.J.; ALVES, J.B. Route of jejunal
mucosa absorption of trypsin demonstrated by immunofluorescence. Histochem.
J. 34(11-12):525-8, 2002.
BRADBURY, E.J.; BURNSTOCK, G.; MCMAHON, S.B. The expression of P2X3
purinoreceptors in sensory neurons: effects of axotomy and glial-derived
neurotrophic factor. Mol. Cell Neurosci., 12:256–268, 1998.
BRAKE, A. J.; WAGENBACH, M. J.; JULIUS, D. New structural motif for ligant-gated
ion channel defined by ionotropic ATP receptor. Nature, 371:519-523, 1994.
90
BROWN, S.G.; TOWNSEND-NICHOLSON, A.; JACOBSON, K.A.; BURNSTOCK, G.;
KING, B.F. Heteromultimeric P2X1/2 receptors show a novel sensitivity to
extracellular pH. J. Pharmacol. Exp. Ther., 300:673–680, 2002.
BUELL, G.; LEWIS, C.; COLLO, G.; NORTH, R.A.; SURPRENANT, A. An antagonist-
insensitive P2X receptor expressed in epithelia and brain. EMBO J., 15:55–62,
1996.
BULANOVA, E.; BUDAGIAN, V.; ORINSKA, Z.; HEIN, M.; PETERSEN, F.; THON, L.;
ADAM, D.; BULFONE-PAUS, S. Extracellular ATP induces cytokine expression
and apoptosis through P2X7 receptor in murine mast cells. J. Immunol.,
174:3880–3890, 2005.
BURNSTOCK, G.; COCKS, T.; CROWE, R.; KASAKOV, L. Purinergic innervation of the
guinea-pig urinary bladder. Br. J. Pharmacol., 63:125–138, 1978.
BURNSTOCK, G.; KENNEDY, C. Is there a basis for distinguishing two types of P2-
purinoceptor? Gen. Pharmacol., 16:433-40, 1985.
BURNSTOCK, G.; KNIGHT, G.E. Cellular distribution and functions of P2 receptor
subtypes in different systems. Int. Rev. Cytol., 240:31–304, 2004.
CALVERT, R.C.; SHABBIR, M.; THOMPSON, C.S.; MIKHAILIDIS, D.P.; MORGAN,
R.J.; BURNSTOCK, G. Immunocytochemical and pharmacological
characterisation of P2-purinoceptor-mediated cell growth and death in PC-3
hormone refractory prostate cancer cells. Anticancer Res., 24:2853–2859, 2004.
CARNIO, E. C.; VARANDA, W. A. Calcium-activated potassium channels are involved
in the response of mouse Leydig cells to human chorionic gonadotropin. Braz. J.
Med. Biol. Res., 28:813-824, 1995.
91
CARON, K.M.; SOO, S.C.; WETSEL, W.C.; STOCCO, D.M.; CLARK, B.J.; PARKER,
K.L. Targeted disruption of the mouse gene encoding steroidogenic acute
regulatory protein provides insights into congenital lipoid adrenal hyperplasia.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(21):11540-5, 1997.
CASTELUCCI, P.; ROBBINS, H.L.; POOLE, D.P.; FURNESS, J.B. The distribution of
purine P2X2 receptors in the guinea-pig enteric nervous system. Histochemistry
and Cell Biology, 117:415-22, 2002.
CASTELUCCI, P.; ROBBINS, H.L.; FURNESS, J.B.. P2X(2) purine receptor
immunoreactivity of intraganglionic laminar endings in the mouse gastrointestinal
tract. Cell Tissue Research, 312: 167-74, 2003.
CHEEWATRAKOOLPONG, B.; GILCHREST, H.; ANTHES, J.C.; GREENFEDER, S.
Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP
channel. Biochem. Biophys. Res. Commun., 332(1):17-27, 2005.
CHEN, C-C; AKOPIAN, A. N.; SIVILOTTI, L.; COLQUHOUN, D.; BURNSTOCK, G.;
WOOD, J.N. A P2X purinoceptor expressed by a subset of sensory neurons.
Nature, 337:428-431, 1995.
CHESSELL, I. P.; MICHEL, A. D.; HUMPHREY, P. P. A. Effects of antagonists at the
human recombinant P2X7 receptor. Br. J. Pharmacol. 124:1314–1320, 1998.
COLLO, G.; NORTH, R. A.; KAWASHIMA, E.; MERLO-PICH, E.; NEIDHART, S.;
SURPRENANT, A.; BUELL, G. Cloning of P2X5 and P2X6 receptors and the
distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channel. J.
Neurosci., 16:2495-2507, 1996.
92
COLLO, G.; Neidhart, S.; Kawashima, E.; Kosco-Vilbois, M.; North, R.A.; Buell, G.
Tissue distribution of the P2X7 receptor. Neuropharmacology, 36:1277–1284,
1997.
CONNELL, C. J.; CHRISTENSEN, K. The ultrastructure of the canine testicular
interstitial tissue. Biol. Reprod., 12:368-82, 1975.
COOKE, B. A.; GOLDING, M.; DIX, C. J.Catecholamine stimulation of steroidogenesis
in Leydig cells. Biochem. Soc. Trans., 10:491-3, 1999.
COUTINHO-SILVA, R.; PERSECHINI, P. M.; BISSAGIO, R. D.; PERFETTINI, J. L.;
NETO, A. C.; KANELLOPOULOS, J. M.; MOTTA-LY, I.; DAUTRY-VARSAT, A.;
OJCIUS, D. M. P2Z/P2X7 receptor-dependent apoptosis of dendritic cells.. Am. J.
Physiol., 276:1139-47, 1999.
DAVIES, D.L.; KOCHEGAROV, A.A.; KUO, S.T.; KULKARNI, A.A.; WOODWARD, J.J.;
KING, B.F.; ALKANA, R.L. Ethanol differentially affects ATP-gated P2X3 and P2X4
receptor subtypes expressed in Xenopus oocytes. Neuropharmacology, 49:243–
253, 2005.
DUAN, S.; ANDERSON, C.M.; KEUNG, E.C.; CHEN, Y.; CHEN, Y; SWANSON, R.A.
P2X7 receptor-mediated release of excitatory amino acids from astrocytes. J.
Neurosci., 23:1320–1328, 2003.
DUFAU, M. L. Endocrine regulation and communicating functions of the Leydig cell.
Annu. Rev. Physiol., 50:483-508, 1988.
DUNN, P.M.; ZHONG, Y.; BURNSTOCK, G. P2X receptors in peripheral neurons.
Prog. Neurobiol., 65:107–134, 2001.
93
EGAN, T.M.; HAINES, W.R.; VOIGT, M.M. A domain contributing to the ion channel of
ATP-gated P2X2 receptors identified by the substituted cysteine accessibility
method. J. Neurosci., 18:2350–2359, 1998.
EGAN, T.M.; KHAKH, B.S. Contribution of calcium ions to P2X channel response. J.
Neurosci., 24:3413–20, 2004.
ERHARDT, J.A.; PILLARISETTI, K.; TOOMEY, J.R. Potentiation of platelet activation
through the stimulation of P2X1 receptors. J. Thromb. Haemost., 1:2626–2635,
2003.
EVANS, R.J.; LEWIS, C.; BUELL, G.; VALERA, S.; NORTH, R.A.; SURPRENANT, A.
Pharmacological characterization of heterologously expressed ATP-gated cation
channels (P2X purinoceptors). Mol. Pharmacol., 48:178–183, 1995.
EVANS, R. J.; LEWIS, C.; VIRGINIO, C.; LUNDSTROM, K.; BUELL, G.;
SURPRENANT, A.; NORTH, R. A. Ionic permeabilityof, and divalent cation effects
on, two ATP-gated cation channels (P2X receptors) expressed in mammalian
cells. J. Physiol., 497:413-422, 1996.
FILIPPINI, A.; RICCIOLI, A.; DE CESARIS, P.; PANICCIA, R.; TETI, A.; STEFANINI,
M.; CONTI, M.; ZIPARO, E. Activation of inositol phospholipid turnover and
calcium signaling in rat Sertoli cells by P2-purinergic receptors: modulation of
follicle-stimulating hormone responses. Endocrinology, 134(3):1537-45, 1994.
FORD, A.P.D.W.; GEVER, J.R.; NUNN, P.A.; ZHONG, Y.; CEFALU, J.S.; DILLON,
M.P.; COCKAYNE, D.A. Purinoceptors as therapeutic targets for lower urinary
tract dysfunction. Br. J. Pharmacol., 147:S132–S143, 2006.
94
FORESTA, C.; ROSSATO, M.; NOGARA, A.; GOTTARDELLO, F.; BORDON, P.; DI
VIRGILIO, F. Role of P2-purinergic receptors in rat Leydig cell steroidogenesis.
Biochem. J., 320:499-504, 1996.
FRANKE, H.; BRINGMANN, A.; PANNICKE, T.; KRÜGEL, U.; GROSCHE, J.;
REICHENBACH, A.; ILLES, P. P2 receptors on macroglial cells: functional
implications for gliosis. Drug Dev. Res., 53:140–147, 2001.
FRANKE, H.; KRÜGEL, U.; ILLES, P. P2 receptors and neuronal injury. Pflugers
Arch., 452(5):622-44, 2006.
FRANKE, H.; ILLES, P. Involvement of P2 receptors in the growth and survival of
neurons in the CNS. Pharmacol. Ther., 109:297-324, 2006.
FREDHOLM, B. B.; ABBRACHIO, M. P.; BURNSTOCK, G.; DAILY, J. W.; HARDEN, K.;
JACOBSON, K. A.; LEFF, P.; WILLIANS, M.; VI. Nomenclature and classification
of purinoceptors. Pharmacol. Rev., 46:143-156, 1994.
FU, X.W.; NURSE, C.A.; CUTZ, E. Expression of functional purinergic receptors in
pulmonary neuroepithelial bodies and their role in hypoxia chemotransmission.
Biol. Chem., 385:275–284, 2004.
GARCIA-GUZMAN, M.; SOTO, F.; LAUBE, B.; STÜHMER, W. Molecular cloning and
functional expression of a novel ratheart P2X purinoceptor. FEBS Letters,
388:123-127, 1996.
GARCIA-GUZMAN, M.; STUHMER, W.; SOTO, F. Molecular characterization and
pharmacological properties of the human P2X3 purinoceptor. Mol. Brain Res.,
47:59–66, 1997.
95
GARGETT, C.E.; WILEY, J.S. The isoquinoline derivative KN-62 a potent antagonist of
the P2Z-receptor of human lymphocytes. Br. J. Pharmacol., 120:1483–1490
1997.
GAYLE, S.; BURNSTOCK, G. Immunolocalisation of P2X and P2Y nucleotide receptors
in the rat nasal mucosa. Cell Tissue Res., 319:27–36, 2005.
GEVER, J.R.; COCKAYNE, D.A.; DILLON, M.P.; BURNSTOCK, G.; FORD, A.P.D.W.
Pharmacology of P2X channels. Eur. J. Physiol., 452: 513–537 2006.
GOLDENBERG, R.C.; FORTES, F.S.; CRISTANCHO, J.M.; MORALES, M.M.;
FRANCI, C.R.; VARANDA, W.A.; CAMPOS DE CARVALHO, A.C. Modulation of
gap junction mediated intercellular communication in TM3 Leydig cells. J.
Endocrinol., 177(2):327-35, 2003.
GREIG, A.V.H.; LINGE, C.; HEALY, V.; LIM, P.; CLAYTON, E.; RUSTIN, M.H.A.;
MCGROUTHER, D.A.; BURNSTOCK, G. Expression of purinergic receptors in
non-melanoma skin cancers and their functional roles in A431 cells. J. Invest.
Dermatol., 121:315–327, 2003.
GROSCHEL-STEWART, U.; BARDINI, M.; ROBSON, T.; BURNSTOCK, G.
Localisation of P2X5 and P2X7 receptors by immunohistochemistry in rat stratified
squamous epithelia. Cell Tissue Res., 296:599–605, 1999.
GUO, C.; MASIN, M.; QURESHI, O.S.; MURRELL-LAGNADO, R.D. Evidence for
Functional P2X4/P2X7 Heteromeric Receptors. Mol. Pharmacol., 72:1447–1456,
2007.
96
HAINES, W.R.; TORRES, G.E.; VOIGT, M.M.; EGAN, T.M. Properties of the novel
ATP-gated ionotropic receptor composed of the P2X1 and P2X5 isoforms. Mol.
Pharmacol., 56:720-727, 1999.
HAMILL, O. P.; MARTY, A.; NEHER, E.; SAKMANN, B.; SIGWORTH, F. J. Improved
patch-clamp techniques for higt-resolution current recording from cells and cell-
free membrane patches. Pflugers Arch., 391(2):85-100, 1981.
HANSEN, M.A.; BENNETT, M.R.; BARDEN, J.A. Distribution of purinergic P2X
receptors in the rat heart. J. Auton. Nerv. Syst., 78:1–9, 1999.
HANSEN, M.A.; DUTTON, J.L.; BALCAR, V.J.; BARDEN, J.A.; BENNETT, M.R. P2X
(purinergic) receptor distributions in rat blood vessels. J. Auton. Nerv. Syst.,
75:147–155, 1999b.
HECHLER, B.; LENAIN, N.; MARCHESE, P.; VIAL, C.; HEIM, V.; FREUND, M.;
CAZENAVE, J.P.; CATTANEO, M.; RUGGERI, Z.M.; EVANS, R.; GACHET, C. A
role of the fast ATP-gated P2X1 cation channel in thrombosis of small arteries in
vivo. J. Exp. Med., 198:661–667, 2003.
HIBELL, A. D.; KIDD, E. J.; CHESSELL, I. P.; HUMPHREY, P. P. A.; MICHEL, A. D.
Apparent species differences in the kinetic properties of P2X7 receptors. Br J
Pharmacol. 130:167–173, 2000.
HIBELL, A. D.; KIDD, E. J.; CHESSELL, I. P.; HUMPHREY, P. P. A.; MICHEL, A. D.
Apparent species differences in the kinetic properties of P2X7 receptors. Br J
Pharmacol. 130:167–173, 2001.
HONORE, P.; DONNELLY-ROBERTS, D.; NAMOVIC, M.T.; HSIEH, G.; ZHU, C.Z.;
MIKUSA, J.P.; HERNANDEZ, G.; ZHONG, C.; GAUVIN, D.M., CHANDRAN, P.;
97
HARRIS, R.; MEDRANO, A.P.; CARROLL, W.; MARSH, K.; SULLIVAN, J.P.;
FALTYNEK, C.R.; JARVIS, M.F. A-740003 [N-(1-[(cyanoimino)(5-quinolinylamino)
methyl]amino-2,2-dimethylpropyl)-2-(3,4-dimethoxyphenyl)acetamide], a novel
and selective P2X7 receptor antagonist, dose-dependently reduces neuropathic
pain in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther., 319(3):1376-85, 2006.
HU, H.Z.; GAO, N.; LIN, Z.; GAO, C.; LIU, S.; REN, J.; XIA, Y.; WOOD, J.D. P2X(7)
receptors in the enteric nervous system of guinea-pig small intestine. J. Comp.
Neurol., 440(3):299-310, 2001.
JAIME-FIGUEROA, S.; GREENHOUSE, R.; PADILLA, F.; DILLON, M.P.; GEVER, J.R.;
FORD, A.P.D.W. Discovery and synthesis of a novel and selective drug-like P2X1
antagonist. Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:3292–3295, 2005.
JANSZEN, F. H.; COOKE, B. A.; VAN DRIEL, M. J. A.; VAN DER MOLEN, H. J. The
effect of calcium ions on testosterone production in Leydig cells from rat testis.
Biochem. J., 160:433-7, 1976.
JARVIS, M.F.; BURGARD, E.C.; MCGARAUGHTY, S.; HONORE, P.; LYNCH, K.;
BRENNAN, T.J.; SUBIETA, A.; VAN BIESEN, T.; CARTMELL, J.; BIANCHI, B.;
NIFORATOS, W.; KAGE, K.; YU, H.; MIKUSA, J.; WISMER, C.T.; ZHU, C.Z; CHU,
K.; LEE, C.H.; STEWART, A.O.; POLAKOWSKI, J.; COX, B.F.; KOWALUK, E.;
WILLIAMS, M.; SULLIVAN, J.; FALTYNEK, C. A-317491, a novel potent and
selective non-nucleotide antagonist of P2X3 and P2X2/3 receptors, reduces chronic
inflammatory and neuropathic pain in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
99:17179–17184, 2002.
98
JIANG, L.H.; RASSENDREN, F.; SPELTA, V.; SURPRENANT, A.; NORTH, R.A. Amino
acid residues involved in gating identified in the first membrane-spanning domain
of the rat P2X2 receptor. J. Biol. Chem., 6:6, 2001.
JONES, C. A.; CHESSELL, I.P.; SIMON, J.; BARNARD, E. A.; MILLER, K. J.; MICHEL,
A. D.; HUMPHREY, P. P. A.; Functional characterization of the P2X4 receptor
orthologues. Br. J. Pharmacol. 129:388–394, 2000.
JONES, C.A.; VIAL, C.; SELLERS, L.A.; HUMPHREY, P.P.A.; EVANS, R.J.;
CHESSELL, I.P. Functional regulation of P2X6 receptors by N-linked glycosylation:
identification of a novel aß-methylene ATP-sensitive phenotype. Mol. Pharmacol.,
65:979–985, 2004.
KANJHAN, R.; HOUSLEY, G.D.; THORNE, P.R.; CHRISTIE, D.L.; PALMER, D.J.; LUO,
L.; RYAN, A.F. Localization of ATP-gated ion channels in cerebellum using P2x2R
subunit-specific antisera. Neuroreport, 7:2665–2669, 1996.
KAWA, K. Existence of calcium channels and intercellular couplings in the testosterone-
secreting cells of the mouse. J. Physiol., 393:647-666, 1987.
KHAKH, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signaling at synapses.
Nature Neurosci., 2:165-174, 2001.
KHAKH, B. S.; BAO, X.R.; LABARCA, C.; LESTER, H. A. Neuronal P2X transmitter-
gated cátion channels change their ion selectivity in seconds. Nat. Neurosci.,
2(4):322-30, 1999.
KIDD, E.J.; GRAHAMES, C.B.A.; SIMON, J.; MICHEL, A.D.; BARNARD, E.A.;
HUMPHREY, P.P.A. Localization of P2X purinoceptor transcripts in the rat nervous
system. Mol. Pharmacol., 48:569–573, 1995.
99
KING, B. F.; ZIGANSHINA, L. E.; PINTOR, J.; BURNSTOCK, G. Full sensitivity of P2X2
purinoceptor to ATP revealed by changing extracellular pH. Br. J Pharmacol.
117(7):1371-3, 1996.
KING, B. F.; WILDMAN, S. S.; ZIGANSHINA, L. E.; PINTOR, J.; BURNSTOCK, G.
Effects of extracellular pH on agonism and antagonism at a recombinant P2X2
receptor. Br. J. Pharmacol. 121:1445–1453, 1997.
KING, B.F.; TOWNSEND-NICHOLSON, A.; WILDMAN, S.S.; THOMAS, T.; SPYER,
K.M.; BURNSTOCK, G. Coexpression of rat P2X2 and P2X6 subunits in Xenopus
oocytes. J. Neurosci., 20:4871-4877, 2000.
KING, M.; HOUSLEY, G.D.; RAYBOULD, N.P.; GREENWOOD, D.; SALIH, S.G.
Expression of ATP-gated ion channels by Reissner’s membrane epithelial cells.
Neuroreport, 9:2467–2474, 1998.
KLINEFELTER, G. R.; HALL, P. F.; EWING, L. L. Effect of Luteinizing Hormone
Deprivation In Situ on Steroidogenesis of Rat Leydig Cells Purified by a Multistep
Procedure1. Biology Of Reproduction, 36:769-783, 1987.
KUMAR, S.; BLUMBERG, D. L., CANAS, J. A.; MADDAIAH, V. T. Human chorionic
gonadotropin (hCG) increases cytosolic free calcium in adult rat Leydig cells. Cell
Calcium, 15:349-355, 1994.
KUNZ, L.; THALHAMMER, A.; BERG, F.D.; BERG, U.; DUFFY, D.M.; STOUFFER,
R.L.; DISSEN, G.A.; OJEDA, S.R.; MAYERHOFER, A. Ca2+-activated, large
conductance K+ channel in the ovary: identification, characterization, and
functional involvement in steroidogenesis. J. Clin. Endocrinol. Metab.,
87(12):5566-74, 2002.
100
LE FEUVRE, R.A.; BROUGH, D.; TOUZANI, O.; ROTHWELL, N.J. Role of P2X7
receptors in ischemic and excitotoxic brain injury in vivo. J. Cereb. Blood Flow
Metab., 23:381–384, 2003.
LE, K.T.; BABINSKI, K.; SÉGUÉLA, P. Central P2X4 and P2X6 channel subunits
coassemble into a novel heteromeric ATP receptor. J. Neurosci., 18:7152-7159,
1998.
LE, K.T.; BOUE-GRABOT, E.; ARCHAMBAULT, V.; SÉGUÉLA, P. Funcional and
biochemical evidencefor heteromeric ATP-gated channels compose of P2X1 and
P2X5 subunits. J. Biol. Chem., 274:15415-15419, 1999.
LEE, H.Y.; BRADINI, M.; BURNSTOCK, G. Distribution of P2X receptors in the urinary
bladder and the ureter of the rat. J. Urol., 163:2002–2007, 2000.
LEWIS, C.; NEIDHART, S.; HOLY, C.; NORTH, R.A.; BUELL, G.; SURPRENANT, A.
Coexpression of P2X2 and P2X3 receptor subunits can account for ATP-gated
currents in sensory neurons. Nature, 377:432-435, 1995.
LIU, M.;KING,B.F.; DUNN, P.M.; RONG, W.; TOWNSEND-NICHOLSON, A.;
BURNSTOCK, G. Coexpression of P2X(3) and P2X(2) receptor subunits in varying
amounts generates heterogeneous populations of P2X receptors that evoke a
spectrum of agonist responses comparable to that seen in sensory neurons. J.
Pharmacol. Exp. Ther., 296(3):1043-50, 2001.
LOIR, M. Spermatogonia of rainbow trout: III. In vitro study of the proliferative response
to extracellular ATP and adenosine. Mol. Reprod. Dev., 53(4):443-50, 1999.
101
LYNCH, K. J.; TOUMA, E.; NIFORATOS, W.; KAGE, K. L.; BURGARD, E. C.; Van
BIESEN, T.; KOWALUK, E.A.; JARVIS, M. F. Molecular and functional
characterization of human P2X2 receptors. Mol. Pharmacol. 56:1171–118, 1999.
MA, B.; RUAN, H.Z.; COCKAYNE, D.A.; FORD, A.P.D.W.; BURNSTOCK, G.; DUNN,
P.M. Identification of P2X receptors in cultured mouse and rat parasympathetic otic
ganglion neurones including P2X knockout studies. Neuropharmacology,
46:1039–1048, 2004.
MACKENZIE, A.B.; SURPRENANT, A.; NORTH, R.A. Functional and molecular
diversity of purinergic ion channel receptors. Ann. NY Acad. Sci., 868:716-29,
1999.
MANDERS, E.M.M.; VERBEEK, F.J.; ATEN, J.A. Measurement of co-localization of
objects in dual-colour confocal images. J. Microsc., 169:375–382,1993.
MANNA, P.R.; PAKARINEN, P.; EL-HEFNAWY, T.; HUHTANIEMI, I.T. Functional
assessment of the calcium messenger system in cultured mouse Leydig tumor
cells: regulation of human chorionic gonadotropin-induced expression of the
steroidogenic acute regulatory protein. Endocrinology, 140(4):1739-51, 1999.
MANNA, P.R.; KERO, J.; TENA-SEMPERE, M.; PAKARINEN, P.; STOCCO, D.M.;
HUHTANIEMI, I.T. Assessment of mechanisms of thyroid hormone action in
mouse Leydig cells: regulation of the steroidogenic acute regulatory protein,
steroidogenesis, and luteinizing hormone receptor function. Endocrinology,
142(1):319-31, 2001.
102
MANNA, P.R.; WANG, X.J.; STOCCO, D.M. Involvement of multiple transcription
factors in the regulation of steroidogenic acute regulatory protein gene expression.
Steroids., 68(14):1125-34, 2003.
MATEO, J.; GARCIA-LECEA, M.; MIRAS-PORTUGAL, M.T.; CASTRO, E. Ca2+ signals
mediated by P2X-type purinoceptors in cultured cerebellar Purkinje cells. J.
Neurosci. 18:1704 –1712, 1998.
MEECH, R. W. Calcium dependent potassium activation in nervous tissues. Annu. Rev.
Biophys. Bioeng., 7:1-18,1978.
MEECH, R. W. Intracellular calcium injection causes increased potassium conductance
in Aplysia nerve cells. Comp. Biochem. Physiol., 42A:493,1972.
MEECH, R. W.; STRUMWASSER, F. Intracellular calcium injection activates potassium
conductance in Aplysia nerve cells. Fed. Proc., 29:834a,1970.
MEIKLE, A. W.; LIU, X. H.; STRINGHAM, J. D. Extracellular calcium and luteinizing
hormone effects on 22-hydroxycholesterol used for testoterone production in
mouse Leydig cells. J. Androl., 12:148-51, 1991.
MICHEL, A.D.; CHESSELL, I.P.; HUMPHREY, P,P,A, Ionic effects on human
recombinant P2X7 receptor function. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol.,
359:102–109, 1999.
MIGITA, K.; HAINES, W.R.; VOIGT, M.M.; EGAN, T.M. Polar residues of the second
transmembrane domain influence cation permeability of the ATP-gated P2X(2)
receptor. J. Biol. Chem., 276:30934–30941, 2001.
103
MILLER, K.J.; MICHEL, A.D.; CHESSELL, I.P.; HUMPHREY, P.P.A. Cibacron blue
allosterically modulates the rat P2X4 receptor. Neuropharmacology, 37:1579–
1586, 1998.
MILLER, W.L. Molecular biology of steroid hormone synthesis. Endocr. Rev., 9:295–
318, 1988.
MULRYAN, K.; GITTERMAN, D.P.; LEWIS, C.J.; VIAL, C.; LECKIE, B.J.; COBB, A.L.;
BROWN, J.E.; CONLEY, E.C.; BUELL, G.; PRITCHARD, C.A.; EVANS, R.J.
Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1
receptors. Nature, 403:86–89, 2000.
NAKATSUKA, T.; TSUZUKI, K.; LING, J.X.; SONOBE, H.; GU, J.G. Distinct roles of
P2X receptors in modulating glutamate release at different primary sensory
synapses in rat spinal cord. J. Neurophysiol., 89:3243–3252, 2003.
NAKAZAWA, K.; INOUE, K.; OHNO, Y. An asparagine residue regulating conductance
through P2X2 receptor/channels. Eur. J. Pharmacol., 347:141–144, 1998.
NEYLON, C.B.; NURGALI, K.; HUNNE, B.; ROBBINS, H.L.; MOORE, S.; CHEN, M.X.;
FURNESS, J.B. Intermediate-conductance calcium-activated potassium channels
in enteric neurones of the mouse: pharmacological, molecular and
immunochemical evidence for their role in mediating the slow
afterhyperpolarization. J. Neurochem., 90(6):1414-22, 2004.
NICKE, A.; BÄUMERT, H. G.; RETTINGER, J.; EICHELE, A.; LAMBRECHT, G.;
MUTSCHLER, E.; SCHMALZING, G. P2X1 and P2X3 receptors form stable
trimers: a novel structural motif of ligand-gated ion channels. EMBO J. 17:3016–
3028, 1998.
104
NICKE, A.; KERSCHENSTEINER, D.; SOTO, F. Biochemical and functional evidence
for heteromeric assembly of P2X1 and P2X4 subunits. J. Neurochem., 92:925–
933, 2005.
NISHI, H.; KATO, F.; MASAKI, E.; KAWAMURA, M. ADP-sensitive purinoceptors
induce steroidogenesis via adenylyl cyclase activation in bovine adrenocortical
fasciculata cells. Br. J. Pharmacol., 137(2):177-84, 2002.
NORTH, R. A.; BARNARD, E. A. Nucleotide receptors. Curren. Opin. Neurobiol.,
7:346-357, 1997.
NORTH, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiol. Rev., 10:1013-1067,
2002.
PARVATHENANI, L.K.; TERTYSHNIKOVA, S.; GRECO, C.R.; ROBERTS, S.B.;
ROBERTSON, B.; POSMANTUR, R. P2X7 mediates superoxide production in
primary microglia and is up-regulated in a transgenic mouse model of Alzheimer’s
disease. J. Biol. Chem., 278:13309–13317, 2003.
PEREZ-ARMENDARIZ, E. M.; NADAL, A.; FUENTES, E.; SPRAY, D. C. Adenosine 5’-
triphosphate (ATP) receptors induce intracellular calcium changes in mouse
Leydig cells. Endocrine, 4:239-247, 1996.
POLETTO-CHAVES, L. A.; PONTELLI, E. P.; VARANDA, W. A. P2X Receptors in
Mouse Leydig Cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 290:1009-1017, 2006.
PRIEL, A.; SILBERBERG, S.D. Mechanism of ivermectin facilitation of human P2X4
receptor channels. J. Gen. Physiol., 123:281–293, 2004.
105
RADFORD, K.M.; VIRGINIO, C.; SURPRENANT, A.; NORTH, R.A.; KAWASHIMA, E.
Baculovirus expression provides direct evidence for heteromeric assembly of P2X2
and P2X3 receptors. J. Neurosci., 17:6529-6533, 1997.
RASSENDREN, F.; BUELL, G.N.; VIRGINIO, C.; COLLO, G.; NORTH, R.A.;
SURPRENANT, A. The permeabilizing ATP receptor, P2X7. Cloning and
expression of a human cDNA. J. Biol. Chem., 272:5482–5486, 1997.
RETTINGER, J.; BRAUN, K.; HOCHMANN, H.; KASSACK, M.U.; ULLMANN, H.;
NICKEL, P.; SCHMALZING, G.; LAMBRECHT, G. Profiling at recombinant
homomeric and heteromeric rat P2X receptors identifies the suramin analog
NF449 as a highly potent P2X1 receptor antagonist. Neuropharmacology,
48:461–468, 2005.
ROBERTS, J.A.; VIAL, C.; DIGBY, H.R.; AGBOH, K.C.; WEN, H.; ATTERBURY-
THOMAS, A.; EVANS, R.J. Molecular properties of P2X receptors. Pflugers
Arch., 452(5):486-500, 2006.
RUBIO, M.E.; SOTO, F. Distinct localization of P2X receptors at excitatory postsynaptic
specializations. J. Neurosci., 21:641–653, 2001.
RUPPELT, A.; MA, W.; BORCHARDT, K.; SILBERBERG, S.D.; SOTO, F. Genomic
structure, developmental distribution and functional properties of the chicken P2X5
receptor. J. Neurochem., 77:1256–1265, 2001.
RYTEN, M.; DUNN, P.M.; NEARY, J.T.; BURNSTOCK, G. ATP regulates the
differentiation of mammalian skeletal muscle by activation of a P2X5 receptor on
satellite cells. J. Cell. Biol., 158:345–355, 2002.
106
SAEZ, J. M. Leydig cells: endocrine, paracrine, and autocrine regulation. Endocr. Rev.,
15:574-626, 1994.
SCHEIBLER, P.; PESIC, M.; FRANKE, H.; REINHARDT, R.; WIRKNER, K.; ILLES, P.;
NORENBERG, W. P2X2 and P2Y1 immunofluorescence in rat neostriatal medium-
spiny projection neurones and cholinergic interneurones is not linked to respective
purinergic receptor function. Br. J. Pharmacol., 143:119–131, 2004.
SCHUMAKER, M.; SCHAFER, G.; HOLSTEIN, A. F.; HILZ, H. Rapid isolation of mouse
Leydig cells by centrifugation in Percoll density gradients with complete retention
of morphological and biochemical integrity. FEBS Lett., 91:333-8, 1978.
SOARES, A. G.; AOKI, M. S.; MIYABARA, E. H.; DELUCA, C. V.; ONO, H. Y.; GOMES,
M. D.; MORISCOT, A. S. Ubiquitin-ligase and deubiquitinating gene expression in
stretched rat skeletal muscle. Muscle Nerve. 36(5):685-93, 2007.
SOTO, F.; GARCIA-GUZMAN, M.; GOMEZ-HERNANDEZ, J.M.; HOLLMANN, M.;
KARSCHIN, C.; STUHMER, W. P2X4: an ATP-activated ionotropic receptor
cloned from rat brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3684–3688, 1996.
STOOP, R.; SURPRENANT, A.; NORTH, R. A. Different sensitivities to pH of ATP-
induced currents at four cloned P2X receptors. J. Neurophysiol., 78:1837–1840,
1997.
SURPRENANT, A.; RASSENDREN, F.; KAWASHIMA, E. NORTH, R. A.; BUELL, G.
The cytolytic P2Z receptor pf extracelular ATP identified as a P2X receptor (P2X7).
Science, 272:735-738, 1996.
SURPRENANT, A.; SCHNEIDER, D.A.; WILSON, H.L.; GALLIGAN, J.J.; NORTH, R.A.
Functional properties of heteromeric P2X1/5 receptors expressed in HEK cells and
107
excitatory junction potentials in guinea-pig submucosal arterioles. J. Auton. Nerv.
Syst., 81:249–263, 2000.
TAI, C.J.; KANG, S.K.; LEUNG, P.C. Adenosine triphosphate-evoked cytosolic calcium
oscillations in human granulosa-luteal cells: role of protein kinase C. J. Clin.
Endocrinol. Metab., 86(2):773-7, 2001.
TORRES, G.E.; EGAN, T.M.; VOIGT, M.M. Topological analysis of the ATP-gated
ionotropic [correction of ionotrophic] P2X2 receptor subunit. FEBS Lett. 425:19–23,
1998.
TORRES, G.E.; EGAN, T.M.; VOIGT, M.M. Hetero-oligomeric assembly of P2X
receptor subunits. J. Biol. Chem., 274:6653-6659, 1999.
TOWNSEND-NICHOLSON, A.; KING, B. F.; WILDMAN, S.S.; BURNSTOCK, G.
Molecular cloning, functional characterization and possible cooperativity between
the murine P2X4 and P2X4a receptors. Mol. Brain Res., 64:246–254, 1999.
ULISSE, S.; FABBRI, A.; DUFAU, M. L. Corticotropin-releasing factor receptors and
actions in rat Leydig cells. J. Biol. Chem., 264:2156-63, 1989.
VALERA, S.; HUSSY, H.; EVANS, R. J.; ADAMI, N.; NORTH, R. A.; SURPRENANT, A.;
BUELL, G. A new class of ligant-gated ion channel defined by P2X receptor of
extracellular ATP. Nature, 371:516-519, 1994.
VARANDA, W. A.; de CARVALHO, A. C. Intercellular communication between mouse
Leydig cells. Am. J. Physiol., 267:C563-9, 1994.
VIAL. C,; EVANS, R.J. P2X receptor expression in mouse urinary bladder and the
requirement of P2X1 receptors for functional P2X receptor responses in the mouse
urinary bladder smooth muscle. Br. J. Pharmacol., 131:1489–1495, 2000.
108
VULCHANOVA, L.; ARVIDSSON, U.; RIEDL, M.; WANG, J.; BUELL, G.;
SURPRENANT, A.; NORTH, R.A.; ELDE, R. Differential distribution of two ATP-
gated channels (P2X receptors) determined by immunocytochemistry. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93:8063–8067, 1996.
WANG, C. Z.; NAMBA, N.; GONOI, T.; INAGAKI, N.; SEINO, S. Cloning and
pharmacological characterization of a fourth P2X receptor subtype widely
expressed in brain and peripheral tissues including various endocrine tissues.
Bioch. Bioph. Res. Comm., 220:196-202, 1996.
WANG, E.C.Y.; LEE, J.M.; RUIZ, W.G.; BALESTREIRE, E.M.; VON BODUNGEN, M.;
BARRICK, S.; COCKAYNE, D.A.; BIRDER, L.A.; APODACA, G. ATP and
purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. J. Clin.
Invest., 115:2412–2422, 2005.
WANG, X.; ARCUINO, G.; TAKANO, T.; LIN, J.; PENG, W.G.; WAN, P.; LI, P.; XU, Q.;
LIU, Q.S.; GOLDMAN, S.A.; NEDERGAARD, M. P2X7 receptor inhibition improves
recovery after spinal cord injury. Nat. Med., 10:821–827, 2004.
WILDMAN, C. Z.; NAMBA, N.; GONOI, T.; INAGAKI, N.; SEINO, S. Cloning and
pharmacological characterization of a fourth P2X receptor subtype widely
expressed in brain and peripheral tissues including various endocrine tissues.
Bioch. Bioph. Res. Comm., 220:196-202, 1999.
WILDMAN, S.S.; BROWN, S.G.; RAHMAN, M.; NOEL, C.A.; CHURCHILL, L.;
BURNSTOCK, G.; UNWIN, R.J.; King, B.F. Sensitization by extracellular Ca2+ of
rat P2X5 receptor and its pharmacological properties compared with rat P2X1. Mol.
Pharmacol., 62:957–966, 2002.
109
WU, W.L.; SO, S.C.; SUN, Y.P.; CHUNG, Y.W.; GRIMA, J.; WONG, P.Y., YAN, Y.C.;
CHAN, H.C. Functional expression of P2U receptors in rat spermatogenic cells:
dual modulation of a Ca(2+)-activated K+ channel. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 248(3):728-32, 1998.
XIONG, K.; HU, X.Q.; STEWART, R.R.; WEIGHT, F.F.; LI, C. The mechanism by which
ethanol inhibits rat P2X4 receptors is altered by mutation of histidine 241. Br. J.
Pharmacol., 145(5):576-86, 2005.
ZAMBONI, D.S.; RABINOVITCH, M. Nitric oxide partially controls Coxiella burnetii
phase II infection in mouse primary macrophages. Infect. Immun., 71:1225–1233,
2003.
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