Calculando KM

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<p> Utilizao do MS Excel para calcular KM e Vmax a partir do grfico de Lineweaver-Burke Rodrigo Csar dos Santos Vida 2008 NDICE 1 INTRODUO..................................................................................................... 3 2 TPICOS EM CINTICA ENZIMTICA.............................................................. 4 2.1 SOBRE AS ENZIMAS........................................................................................... 4 2.2 A CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN E VELOCIDADE MXIMA.............................. 5 3. FUNES LINEARES........................................................................................ 7 3.1 TERMOS DE UMA FUNO LINEAR....................................................................... 7 3.2 REPRESENTAO GRFICA DE UMA FUNO....................................................... 8 3.3 REGRESSO LINEAR ....................................................................................... 10 4 USANDO O MS EXCEL..................................................................................... 14 4.1 FRMULAS E CLCULOS.................................................................................. 15 4.1.1 Digitando uma frmula .......................................................................... 15 4.1.2 Utilizando o assistente de frmulas....................................................... 16 4.2 CALCULANDO Y EM FUNO DE X.................................................................... 18 4.3 CALCULANDO OS COEFICIENTES A E B DE UMA FUNO LINEAR ..................... 19 4.3.1 Calculando o coeficiente A.................................................................. 19 4.3.2 Calculando o coeficiente B.................................................................. 19 4.3.3 Calculando o coeficiente de correlao................................................. 19 4.4 CRIANDO GRFICOS DE REGRESSO LINEAR COM O MS EXCEL ........................ 20 5 ANALISANDO KM E VMAX.............................................................................. 22 5.1 O GRFICO DE LINEWEAVER-BURKE................................................................. 23 6. REFERNCIAS................................................................................................. 28 3 1 INTRODUO Oestudodacinticaenzimticaumimportantetpicodentrodo contedoprogramticodadisciplinadebioqumicaouenzimologia.Aregresso linearumassunto importanteetil emdiversasreasdeconhecimentos.Com basenelapodemosmontarumacurvadecalibraoeanalisarseosdadosso ou no confiveis. Paracompreenderasregresseslinearesdeve-seprimeiro compreender as funes lineares, suas caractersticas e suas resolues. OMicrosoftExcel(MSExcel)umaferramentasimplesquepode serfacilmenteoperadaparaaresoluodetodosessesclculosedeuma infinidadedeoutros.Dentreeles,adeterminaodaconstantedeMichaelis-Mentenedavelocidademximaobservadasemumareao,umaalternativa resoluo em papel milimetrado, mais confivel e rpida de fazer. Esse trabalho tem por objetivo introduzir ao leitor as facilidades de se utilizaroMSExcelparadeterminaodessasconstantes.Incluirpidas explicaessobrecinticaenzimtica,explicaessobrefuneslineareseos mtodosderesoluodeumaregressolinearmanualmenteepeloMSExcel, bemcomoospassosparasecriarumgrficoe,finalmente,comocalcularas constantes de Michaelis-Menten e velocidade mxima. 4 2 TPICOS EM CINTICA ENZIMTICA A cintica enzimtica, por definio, estuda os processos catalisados porenzimas,especialmenteavelocidadedareao.Asenzimasso macromolculasproticascomcapacidadecatalticacapazesdecatalisar(ou seja, acelerar) reaes qumicas sobre outras molculas, denominadas substrato. Asenzimaspossuemstiodeligaocomoqualseligamao substrato e catalisam a reao, convertendo o substrato (S) ao produto da catlise (P). A enzima no sofre reao durante o processo, de modo que ao fim da reao permanece inalterada. E + SESEPE + P 2.1 Sobre as enzimas As enzimas possuem stios de ligao (centros catalticos) para com osubstrato,muitasdelasmaisdeum.Dessaforma,podemosconcluirqueao aumentarmos a concentrao do substrato, aumenta-se tambm a velocidade da reao.Issoverdadeiroatumadeterminadaconcentraodosubstrato, quandoapesardeaumentarmosaconcentraodosubstrato(mantendoa concentraodaenzima),avelocidadedareaonosemodifica.Chamamos esse ponto de velocidade mxima (Vmax). Os stios catalticos so extremamente sensveis ao substrato com o qual so colocados. Assim h uma especificidade por parte das enzimas para com determinadossubstratos.De fato, paracertossubstratoshapenasumaenzima especfica capaz de catalisar uma reao com eficincia. Algumasenzimaspodemserinfluenciadasporoutroselementos presentes no meio. Algumas enzimas possuem um stio de ligao especial onde elementosmoduladorespodemseligarinfluenciandonareao:moduladores negativos diminuem a velocidade da enzima, enquanto os positivos aumentam-na. As enzimas com tal propriedade so denominadas enzimas alostricas. 5 2.2 A constante de Michaelis-Menten e velocidade mxima Comojvimosasenzimassosaturveis.Issoimplicaqueum grficodevelocidadeenzimticanoserlinear,masapartirdedeterminada concentrao de substrato descrever uma curva. Aconcentraodosubstrato,portanto,fatordeterminantepara atingiravelocidademxima,comomostradonogrficoacima.Aconstantede Michaelis-Menten(KM)forneceaquantidadedesubstratonecessriaparase atingirametadedavelocidademxima.Amedidadavelocidademximaa medidadaquantidadedesubstratoconvertidaemprodutoemdadoperodode tempo,epodetercomounidadeM.min-1.AunidadedeKMamesmaparaa medida do substrato (mM, M...). UmerrobastantecomumacreditarqueKMsernumericamente igualametadedeVmax.ObservequeKMdizrespeitoaumamedidade concentraodesubstrato,enquantoVmaxamedidadavelocidadede transformao do substrato em produto. Podemos concluir que o quociente de KM por Vmax no necessariamente ser igual a 2. ConhecerasconcentraesdeKMeVmaxsoimportantespois garantemousoracionaldasenzimas.Muitoscatalisadoresenzimticosso sintetizadosempoucaquantidadeousocomercialmentecarose,portanto, 6 devemserusadoscomsapincia.Paracalcularessesvaloreshdiferentes metodologias.Existemdisponveisnomercadoprogramasbaseadosem regresso no linear, capazes de fornecer respostas precisas a partir do grfico da curvadacinticaenzimtica.Noentanto,nemsempretemosacessofcilatais programas sofisticados. OutraformadecalcularKMeVmaxutilizandoaplotagemdos dadosempapelmilimetrado,ondeacurvalinearizadaeasinformaesso obtidasatravsdaregressolineardoscoeficientesdaequao.Essemtodo podeaindaserutilizadonoprogramaMSExcel,maissimplesefcildeser encontrado em computadores domsticos, e que fornece dados bastaste precisos e confiveis. 7 3. FUNES LINEARES 3.1 Termos de uma funo linear Umafunoumaequaomatemticacompelomenosuma incgnita, onde para cada valor atribudo haver valores referentes, ou em funo deste. Trata-se de relaes matemticas especiais entre dois objetos. Nocasodasequaeslineares(deprimeirograu)asfunes apresentam a seguinte formulao bsica: ( ) a bx x f + = OndeXsoosvaloresconhecidos(atribudos)eYsoosvalores determinadosemfunodaXsegundoaequao.Matematicamentefalando,X correspondeaoconjuntodomnioeY,aoconjuntoimagemdaequao.Os termosbeasocoeficientesdaequao,ondebchamadodeinclinao da reta e a o termo independente. Emumafunolinear,paracadavalorXatribudo,possvel calcular o valor de um e apenas um Y correspondente. Os valores atribudos para X podem ser feitos de maneira aleatria. Observe a funo abaixo: ( ) 4 2 + = x x f Para calcular esses valores correspondentes de Y, basta substituir os valores atribudos para X na equao. XYf(x) = 2x + 4 y = 2x + 4 -3-2y = 2 * (-3) + 4 = -2 -20y = 2 * (-2) + 4 = 0 -12y = 2 * (-1) + 4 = 2 04y = 2 * 0 + 4 = 4 16y = 2 * 1 + 4 = 6 28y = 2 * 2 + 4 = 8 310y = 2 * 3 + 4 = 10 8 3.2 Representao grfica de uma funo Asfunespossuemumarepresentaogrficabaseadaem coordenadas(X,Y)emumplanocartesiano.Acoordenadaabcissa(horizontal) correspondeaosvaloresdefinidosparaX,eacoordenadaordenada(vertical) corresponde aos valores encontrados para Y. No caso do exemplo anterior, quando colocados no plano cartesiano, os valores descrevero o seguinte grfico: -4-2024681012-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Podemosobservarqueasfunesdoprimeirograusoditas lineares, pois sua representao grfica sempre tende linearizao. Um grfico arepresentaovisualdeumafuno,eapartirdelepodemostirarimportantes concluses: O ponto em que o grfico toca o eixo X (ou seja, onde Y = 0) corresponde raizdaequao.Araizdeumaequaofornecidaquandoigualamosa funo zero. Nas funes lineares, h apenas uma raiz, e ela sempre est presente. 9 O termo independente A a coordenada onde o grfico toca o eixo Y (pois ento X = 0) quando ambos os eixos possuem a mesma origem. A inclinao da reta B define o ngulo de inclinao do grfico. Se o valor de Bpositivo,diz-seterumgrficocrescente.QuandoovalordeB negativo, um grfico decrescente. No caso de uma equao quadrtica (de segundo grau, onde h uma incgnitaXelevadaaoquadrado).Ogrficodefinidocomoumaparbolaque cortaoeixoXemdoispontos,evidenciandoduasrazesdistintas(oXeXda frmuladeBhskara),apenasemumponto,nocasoderazescoincidentes (quandoA=0)ounotocarempontoalgum,nocasodenohouverrazes (quandoA</p>