bromatologia ii - paulo figueiredo · •22-02-2018 •1 bromatologia ii paulo figueiredo...

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Bromatologia II

Paulo Figueiredo

[email protected]

Programa

1. Análise de carboidratos: extracção e separação; métodos de identificação. Determinação quantitativa: métodos físicos, químicos e biológicos. determinação de fibra.

2. Análise de lípidos: extracção e determinação quantitativa; identificação e quantificação de ácidos gordos.

3. Análise de proteínas: determinação de proteína total e azoto não proteico. Separação e identificação de proteínas e aminoácidos.

4. Análise da humidade: métodos físicos e químicos. Obtenção e determinação de cinzas.

6. Análise de minerais: identificação e determinção quantitativa.7. Análise de vitaminas: identificação e determinação quantitativa de

vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis.

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Bibliografia

1. P. Figueiredo (2016), Introdução à Química dos Alimentos: Métodos Analíticos. Novas Edições Acadêmicas.

2. Nielsen, S. S. (2017), Food analysis. New York: Springer, 5th edition. 3. Damodaran, S. & Parkin, K. L. (2017), Fennema’s Food Chemistry. Boca

Raton: CRC, 5th edition. 4. Nollet, L. M. L., Toldrá, F (2015), Handbook of Food Analysis. Boca

Raton: CRC, 3rd edition. 5. Coultate, T.. (2015), Food: The Chemistry of its Components.

Cambridge: Royal Society of Chemistry, 6th edition. 6. R. Owusu-Apenten, Introduction to food chemistry, 2004, CRC

Web

1. http://www.pfigueiredo.org/uatla.html

http://www.pfigueiredo.org/food.html

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Avaliação

A. Exame – 100 %

B. Avaliação contínua:1. 2 Frequências – 30 % + 30 %2. Discussão de artigos – 25 %3. Resolução de exercícios – 15 %

Componentes mais abundantes dos alimentosfunções:

nutrientesadoçantesmatéria-prima para produtos fermentadospropriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetalresponsáveis por reacções de escurecimento

Análise de carboidratos 6

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podem ocorrer isolados, ou física ou quimicamente associados a outras moléculas

glicoproteínasglicolípidos

fibras dietéticascarboidratos não digeríveislenhina


razões para determinação de tipo e concentração de carboidratos nos alimentos:

padronizaçãoalimentos devem ter composições que respeitem a legislação

rotulagem nutricionalinformação ao consumidor sobre teor nutricional

detecção de adulteraçõescada alimento tem a sua “impressão digital” de carboidratos

qualidade alimentarpropriedades físico-químicas dos alimentos dependem do tipo e

concentração de carboidratos presentesdoçura, aparência, estabilidade, textura

económicasevitar desperdício de ingredientes dispendiosos

processamentoeficácia de diversas operações depende do tipo e concentração

dos carboidratos presentes


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Amostragemmoídas

causar mínima alteração no teor de humidadelípidos e clorofila removidos por extracção com éter de petróleo

carboidratos insolúveisoutros interferentes removidos por:

descoloraçãoresinas de permuta iónicaprecipitação por agentes clarificantes

Análise de hidratos de carbono 9

agentes clarificantes:solução básica de acetato de chumbo

descolora a soluçãousado em polarimetria de soluções coloridas

ácidos fosfotungístico e tricloroacéticoprecipitam proteínas

ferricianeto de potássio e sulfato de zincoprecipitam proteínasdescoloram parcialmente a solução

sulfato de cobreespecífico para determinação da lactose em leite

Análise de carboidratos

Amostragem

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requisitos dos agentes clarificantes:remover completamente interferentes sem adsorver ou

modificar açúcaresexcesso de clarificante não deve afectar procedimentoprecipitado deve ser pequenoprocedimento relativamente simples


Amostragem

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remoção de etanolevaporação sob vácuo


Amostragem

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DistillazioneCNRrota.mp4

DistillazioneCNRrota.mp4

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Amostragem

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Métodos qualitativosreacções colorimétricas

condensação de produtos de degradação de açúcares em ácidos fortes com compostos orgânicos

antrona e fenol são dos mais utilizadosantrona reage especificamente com carboidratos em

solução concentrada de H2SO4

cor verde azuladareacção com os produtos de degradação

hidroximetilfurfural ou furfural


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reacções colorimétricasreacção de fenol com H2SO4

método simples, rápido, sensível, exacto e específico

permite determinar quase todos os tipos de carboidratos

cor produzida é estávelresultados reprodutíveispoucos problemas com interferentes


Métodos qualitativos

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propriedades redutoras do grupo carbonilonão específicasrequerem remoção de outros agentes redutoressolução de Fehling é reagente mais conhecido

redução de cobre


Métodos qualitativos

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Métodos quantitativosMunson-Walker

método gravimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratos2 reagentes de Fehling

A – sulfato de cobreB – tartarato de sódio e potássio/NaOH

reacção com carboidratos redutoresforma precipitado de óxido de cobre

pp filtrado num cadinho de fundo porosopp lavado com água quentepp seco e pesado


Munson-Walkerredução não é estequiométrica

calibração com soluções padrão de cada carboidratotabelas relacionam peso do pp com a quantidade de

carboidrato, para cada carboidrato


Métodos quantitativos

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Lane-Eynonmétodo titrimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratosadição da solução de carboidrato a mistura (1:1) em

ebulição das soluções de Fehlingazul de metileno usado como indicador

mudança de cor no ponto de viragemmétodo não é estequiométrico

utilização de tabelas e padrões



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Somogyimétodo microtitrimétricoredução de cobre pelos grupos redutores dos carboidratosusado para determinar pequenas quantidades de carboidratosreagente de cobre contém:

tampão fosfatoiodeto de potássio

iodo vai oxidar ião cuprososulfato de sódio

minimiza oxidação do óxido cuproso por O2 do ar



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Somogyireagente adicionado em excesso, mas em quantidade

conhecidacarboidrato redutor reduz Cu a óxido cuprosoCu2O oxidado pelo iodoexcesso de iodo titulado com tiossulfato de sódio

reacção não estequiométricarequer padronização



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Métodos cromatográficoscarboidratos separados e determinados individualmente

separação baseada em:coeficiente de partiçãopolaridadetamanho

cromatografia em papelTLCcromatografia em colunaGC

requer amostras voláteisem geral, necessário derivatizar

HPLCactualmente mais rápido, específico, sensível e preciso

HPLC e GC usados em conjunto com NMR e MS



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Métodos cromatográficosHPLC

análise de monossacáridos e oligossacáridostambém permite análise de polissacáridos, após hidrólisemétodo rápido, com elevado grau de exactidãopode ser utilizado em ampla gama de concentraçõesnão requer derivatização



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HPLCfases estacionárias

permuta aniónicapermuta catiónicafase normalfase reversa


Métodos quantitativosMétodos cromatográficos

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permuta aniónicacarboidratos têm pKa entre 12-14

em solução básica, grupos OH podem ionizarseparados em permuta aniónica

sequência de eluição:açúcares álcoois (alditois)< monossacáridos

< dissacáridos < outros oligossacáridosgeralmente detectores electroquímicos



1. Glucose 2. Fructose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose

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permuta catiónicaseparação por ordem decrescente de PM

oligossacáridos (DP>3) < trissacáridos < dissacáridos < monossacáridos < alditois

muito eficazes para resolver monossacáridos



1. Sucrose 2. Glucose 3. Fructose 4. Mannitol 5. Sorbitol

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fase normalfase estacionária polar

sílica gel com grupos aminofase móvel de polaridade crescente

acetonitrilo (50-85 %)/águamonossacáridos e alditois < dissacáridos < outros

oligossacáridosaçúcares redutores reagem com grupos amino

deterioração da coluna



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fase reversafase estacionária hidrofóbica

sílica gel com cadeias alquilo ou fenilofase móvel polar

habitualmente águamonossacáridos têm tempos de retenção muito curtos

tendem a eluir num único pico não resolvidoadição de sais pode aumentar Rt

presença de anómerosduplicação e/ou alargamento dos picosadição de uma amina à fase móvel acelera

anomerização e reduz problema



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fase reversa



1. Fructose 2. Glucose 3. Maltose 4. Maltotriose 5. Maltotetraose 6. Maltopentaose 7. Maltohexaose 8. Maltoheptaose 9. Maltooctaose

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HPLCdetectores

índice de refracçãoelectroquímicosderivatização pós-colunaderivatização pré-coluna



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HPLCdetectores

índice de refracçãoaplicável a todos os carboidratosmedidas lineares numa larga gama de concentraçõesprincipais limitações:

não permite utilização de gradientes de eluiçãodetecção mede massas, não concentrações



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HPLCdetectores

electroquímicosdetector de amperometria pulsada (PAD) usado

habitualmente com cromatografia de permuta aniónicapermite utilização de gradientesrequer utilização a pH elevado



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HPLCdetectores

derivatização pós-colunaaumento da sensibilidade de detecção por adição de um

grupo substituinteconcentração medida por UV/Vis ou fluorescência

maior sensibilidade que detectores de índice de refracção



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HPLCdetectores

derivatização pré-colunareacções têm que ser estequiométricasderivatização de oligossacáridos com grupos aromáticos

aumento de resolução com HPLC em fase normal



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Métodos cromatográficosGC

análise quantitativa e qualitativanecessário converter os carboidratos em compostos

voláteis, por derivatizaçãoperacetatos de alditolperacetatos do ácido aldónico



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GCprincipal problema:

necessários 2 passos de preparaçãoredução dos grupos aldeído a álcoois primáriosconversão do carboidrato reduzido num éster de

peracetato volátil ou num éter pertrimetilsililadocada passo tem que ser estequiométrico



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GCaplicação a carboidratos neutros

1.redução a alditoiscarboidratos obtidos a partir do extracto com 80 %

EtOH ou por hidrólise de polissacáridosredução com borohidreto de sódio dissolvido em

hidróxido de amónio (T ambiente)adição de ácido acético, gota a gota

até parar libertação de H2

destruição do borohidreto em excessosolução evaporada até securaadição de metanol e evaporação até eliminação de iões

boratose frutose estiver presente

reduzida a D-glucitol + D-manitol



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GCaplicação a carboidratos neutros

2. acetilação de alditoisadição de anidrido acético

balão fechado e aquecido a 121 ºCarrefecido

adição de águadecomposição do anidrido acético em excesso

evaporação até secura3. GC dos peracetatos

resíduo dissolvido em clorofórmiocromatografia isotérmica

identificação através dos Rt relativamente a hexaacetato de inositol

padrão interno



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GCaplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos

necessário um método diferente1.redução

hidrolisado evaporado até securaresíduo dissolvido em sol. carbonato de sódio

tratado com borohidreto de sódio em excessoadição de ácido acético

decomposição do borohidreto em excessoadição de metanol e evaporação até eliminação de iões

boratoácidos urónicos reduzidos a ácidos aldónicos e

aldoses a alditois



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GCaplicação a hidrolisados de polissacáridos contendo ácidos urónicos

2. preparação dos derivados trimetilsililados e cromatografiaácidos aldónicos convertidos em éteres de per-TMSdirectamente injectados

necessário utilizar gradiente de temperaturaidentificação através dos Rt



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GCdetector mais usado

FID



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Métodos cromatográficosTLC

usado em análise de rotinaanálise rápida e simultânea de diversas amostras

identificação e quantificação de carboidratos em melaços



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Espectrometria de massapouco usada

não rotineiroMALDI-TOF em análise de séries homólogas de oligossacáridos



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Métodos electroforéticoscarboidratos derivatizados por reacção com boratos

tornam-se electricamente carregadoscarboidratos aplicados num gel ao qual se aplica uma

voltagemseparação baseada no tamanho

moléculas menores movem-se mais rapidamente no campo eléctrico



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Métodos ópticosrefractometria

índice de refracção da solução de carboidratosdeterminação de açúcares totais, como sólidos solúveisutilização em controlo de qualidade

xaropes, geleias, sumos de frutapolarimetria

polarímetro mede rotação óptica de uma solução pura de um carboidrato

densimetriamedida da gravidade específica de uma solução açucarada

densidade é função da concentração de carboidratoa uma dada temperatura (20 ºC)

resultados exactos para soluções purasresultados aproximados para alimentos açucarados

(xaropes, ...)



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Métodos enzimáticosrápidos, muito específicos e sensíveis para baixas concentraçõessequência de reacções enzimáticas é método preferencial para

determinação de amidorequerem pouca preparação da amostra

alimentos líquidos podem ser analisados directamentealimentos sólidos requerem prévia dissolução em água

existem diversos kits comerciais para analisar carboidratosespecíficos

métodos mais frequentemente usados para determinar concentrações:

permitir que a reacção enzimática finalize e medir a concentração do produto

proporcional à concentração do substrato inicialmedição da velocidade inicial da reacção enzimática

proporcional à concentração do substrato



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Métodos enzimáticos



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Métodos enzimáticospreparação da amostra

recomendada utilização do tratamento de Carrezadição de sol. de hexacianoferrato de potássioadição de sol. de sulfato de zincoadição de sol. de NaOH

destrói emulsõesprecipita proteínasabsorve algumas cores

suspensão filtradafiltrado límpido usado directamente para ensaios



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Métodos enzimáticosex: D-glucose/D-frutose

1) conversão de glucose em glucose-6-fosfatopor hexacinase e ATP

2) G6P oxidada por NADP+, na presença de G6P-desidrogenaseG6P + NADP+ ↓ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

NADPH formado proporcional à concentração de G6P na amostra

medido por espectrofotometria a 340 nmconcentração de frutose determinada por conversão da frutose

em glucose (por via enzimática) e repetição do procedimento



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Métodos enzimáticosex: maltose/sacarose

1) maltose e sacarose hidrolisadas por a-glucosidasemaltose ↓ 2 Glu; sacarose ↓ Glu + Fru

2) concentrações de glucose e frutose determinadas pelo método anterior

problema:se existirem outros oligossacáridos, estes também são

hidrolisados



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Métodos físicospolarimetria

mede o ângulo de rotação da luz polarizada no plano, ao atravessar uma solução

extensão da polarização proporcional à concentração das espécies opticamente activasa = [a]lc



Polarímetro:•fonte de luz monocromática•polarizador•porta-amostra•analisador (mede ângulo de rotação)

a – ângulo de rotação medido[a] – actividade óptica (constante

para cada espécie)l – percurso ópticoc - concentração

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Métodos físicosângulo de rotação depende da temperatura e comprimento

de ondausam-se condições padrão da risca D do sódio

T = 20 ºC; l = 589.3 nmprepara-se uma curva de calibração a vs. c

ou[a] tirado da bibliografia

concentração do carboidrato determinada por medição do seu ângulo de rotação e comparando com valores da curva de calibração



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Métodos físicosrefractometria

determinação do índice de refracção (n)

medição do ângulo de refracção (r) e do ângulo de incidência (i) numa zona fronteira entre o material da amostra e um padrão

para carboidratos, o material de referência é quartzo



m

cn

c c – velocidade da luz no vácuo

cm – velocidade da luz no material

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Métodos físicosíndice de refracção de carboidratos aumenta

proporcionalmente à concentraçãoíndice de refracção depende de temperatura e

comprimento de ondamedidas feitas a 20 ºC e 589.3 nm

método rápido e simplesuso rotineiro na indústria

análise de xaropes, mel, melaços, compotas, …



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Métodos físicosinfra-vermelho

restantes componentes principais dos alimentos não absorvem radiação IV no mesmo comprimento de onda

possibilidade de determinar concentraçõesprocesso rápido e não destrutivo

densidadedensidade de soluções aquosas aumenta com aumento da

concentração de carboidratosdensidade medida por densímetros ou garrafas de

densidadeuso de rotina na indústria

determinação em sumos e outras bebidas



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Ensaios imunológicosespecíficos para carboidratos de baixo peso molecular

carboidrato de interesse ligado a uma proteínainjectado num animalanimal desenvolve anticorpos específicos para o

carboidratoanticorpos podem ser extraídos

usados como parte de kits para determinação da concentração do carboidrato em alimentos



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Reagentesamostra500 mL solução A: sulfato cúprico + H2SO4

500 mL solução B: tartarato de sódio e potássio + NaOHsolução de ferrocianeto de potássio 0.025 Msolução de acetato de zinco 1.0 M, com ác. acético 20 mL/Lsolução de azul de metileno 1 %HCl conc.papel indicador de vermelho CongoNaOH 40 %HCl 1 NNaOH 0.1 N


Ex: Determinação de carboidratos totais e redutores

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Preparação da amostrapesar ou pipetar quantidade suficiente para obter 250 mL de sol.

com ~1 % de carboidratosjuntar 50 mL H2O

agitarneutralizar até pH 7.00

com NaOH 0.1 Npassar sol. para balão volumétrico de 250 mLclarificar

volumes iguais de K4Fe(CN)6 e Zn2(CH3COO)2

agitarcompletar volume do balão com H2Ofiltrar sobre papel de filtro secoobtém-se sol. a



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Inversão da sacarose para determinação de carboidratos totaispipetar 50 mL da sol. a para balão volumétrico de 100 mLadicionar 5 mL HCl conc.aquecer em banho-maria a 68-70 ºC (5 min)arrefecercolocar papel indicador no balãoneutralizar com NaOH 40 %

até papel ficar roxocompletar volume com H2O

agitarobtém-se sol. b



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Método de Lane-Eynonpreparar licor de Fehling

misturar partes iguais de sols. A e Bagitar bem

1 mL = 5.00 mg glucosecolocar sol. a numa bureta de 50 mLpipetar 10 mL do licor de Fehling para erlenmeyer de 125 mL

juntar igual volume de H2Oaquecer em bico de Bunsen até fervura

juntar 5 mL da sol. adeixar ferver

adicionar 3-4 gotas de azul de metileno 1 %reiniciar titulação

adição de porções de 0.5 mL da sol. aperto do ponto final, cor da espuma sobrenadante começa

a desaparecerpp vermelho tijolo (óxido cuproso)



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Método de Lane-Eynoncontinuar titulação gota a gotano ponto final, sobrenadante totalmente incolor

repetir titulação com sol. aadicionar de uma vez o volume gasto na anterior, menos 1 mLao recomeçar a ferver, juntar 3-4 gotas de azul de metileno

continuar titulção gota a gota, até desparecer a correpetir procedimento com sol. b



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Fibra brutamateriais não digeríveis e insolúveis em ácidos e bases diluídas

celulose, lenhina, pentosanassem valor nutritivo

acção peristáltica do intestinosegundo as funções:

polissacáridos estruturaiscelulose, hemicelulose, pectinas

compostos estruturais não polissacáridoslenhina

polissacáridos não estruturaisgomas, mucilagens, carragenano, agar

Análise de polissacáridos e fibra 62

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importância da determinação da fibra bruta em alimentos e raçõesavaliação nutritiva de rações

rações com muita fibra têm baixo valor nutritivoeficiência na moagem e refinação de farinhasverificação da maturação de fibras e vegetais

produtos muito maduros têm maior quantidade de fibraadulterações

cascas em nozes moídas, sementes em frutas processadas


1967introdução do conceito de fibra dietética

digestão clássica com ácido e base para obter fibra bruta conduz a incertezas e variabilidade relativamente ao valor nutritivo

determinação inclui parte das proteínas e conduz a perca de parte da lenhina

mais adequado separar lenhina, celulose e hemicelulose e minimizar o teor de azoto

digestão enzimáticafibra dietética – matérias vegetais insolúveis que não são digeríveis

por enzimas proteolíticas e diastáticas e que não podem ser utilizadas, excepto por fermentação microbiana no sistema digestivo


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fibra dietéticaconjunto de todos os componentes não digeríveis de um

alimentotodos os polissacáridos, excepto amilose e amilopectina

fibra insolúvelcelulose, celulose microcristalina, lenhina, hemiceluloses e

amido resistentefibra solúvel

restantes polissacáridos, pectina, gomas e hidrocolóides


consumo tem benefícios fisiológicosprevenção de:

cancrosdoenças cardíacasdiabetes


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Análise de amidoamostragem:

em alimentos naturais encontra-se sob forma de grânulosnecessário separá-lo dos outros componentes

secagem, trituração, maceração, filtração, centrifugação

em alimentos termicamente processados é uma mistura de amilose e amilopectina

secos, triturados e dispersos em EtOH/H2O (80:20)monossacáridos e oligossacáridos solúveisamido insolúvel

separado por filtração ou centrifugaçãose algum amido em grânulos estiver presente:

amostra dispersa em água quente (> 65 ºC) com ácido perclórico ou cloreto de cálcio

gelatinização do amido


Análise de amidométodos para determinação da concentração:

enzimas adicionadas a uma solução de amido para o degradar a glucose

glucose analisada pelos métodos anterioresconcentração de amido calculada a partir da concentração

de glucoseadição de iodo leva à formação de um complexo insolúvel

determinado por gravimetriasecagem e pesagem do precipitado formado

determinado por titulaçãoquantidade de iodo necessária para precipitar o amido

utilização de métodos físicosdensidade, refractometria, polarimetria

desde que não existam componentes interferentes na solução


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Análise de amidoconcentrações de amilose e amilopectina determinadas pelos

mesmos métodos usados para amidonecessário primeiro separar a amilose da amilopectina

agentes químicos que precipitem selectivamente um dos dois

determinação da concentração do amido resistentenecessário adicionar DMSO

dissolve o amido antes de prosseguir com a análise


Análise de amido


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Análise de amidoex:

amostra finamente trituradaadicionado EtOH 80 %adição de DMSOagitar e aquecer em banho-mariaadicionar sol. tamponizada de a-amilase

agitar em vortexrecolocar no banhoapós 5 min, levar a 50 ºCadicionar sol. de glucoamilase e tampão de acetato de sódio

(pH 4.5)misturar e incubar a 50 ºC

transferir para balão volumétrico e perfazer volume com H2Otirar aliquotas

tratar com reagente glucose oxidase/peroxidase e incubar a 50 ºC

medir absorvância


Análise de gomas e hidrocolóidespolissacáridos adicionados aos alimentos + gelatina

produtos cárneos processadoschocolates e derivadosgeladosmolhos para saladas

análise difícil:estruturas químicas diversasdiferentes solubilidadesdiversos pesos moleculares

procedimento geral:extracção da goma e fraccionamento do extracto

identificação e quantificação dos monossacáridos após hidrólise ácida

fraccionamento provoca alguma perca de material


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Análise de gomas e hidrocolóides


Análise de gomas e hidrocolóidesamostra seca e pulverizada

preferível por liofilizaçãoremoção de substâncias lipídicas

extracção em Soxhletclorofórmio/metanol (95:5)

solvente removido por secagem ao ar, seguido de exsicador


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Análise de gomas e hidrocolóidesadição de EtOH 80 %

remoção de carboidratos solúveis, outros compostos de baixo PM e cinzas

remoção de proteínas (para facilitar digestão)extracto disperso em tampão de acetato de sódio (pH 6.5),

com NaClmistura aquecida

adição de papaínamistura incubada

arrefecimento da mistura e adição de NaCladição de 4 volumes EtOH

polissacáridos precipitammistura centrifugada


Análise de gomas e hidrocolóidesresíduo suspenso em tampão acetato (pH 4.5)adicionar sol. de glucoamilase/amiloglucosidase, no mesmo tampão

incubarremoção de amido e fibra insolúvel por centrifugação

arrefecer e adicionar NaCladicionar 4 volumes EtOH

precipita polissacáridos solúveismistura centrifugada

resíduo insolúvel é a fibra dietética solúvelresíduo suspenso em água desionizada

diálise contra azida de sódioanti-microbiana

diálise contra água desionizadaremoção da azida

resíduo liofilizado


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Análise de gomas e hidrocolóidesresíduo colocado em frasco fechado

adicão de ácido trifluoroacéticosolução aquecida

arrefecer e evaporar até securacorrente de ar ou N2

determinação de monossacáridosHPLC ou GC


Análise de pectinanão é uma substância única

diversos graus de esterificação e amidaçãoprincipal componente comum:

éster metílico do ácido a-D-galacturónico

não existem métodos oficiais para determinaçãoestratégia mais comum:

precipitação com álcool


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Análise de pectinadifícil hidrolisar ligações glicosídicas em ácidos urónicos

provoca decomposiçãonão é possível usar hidrólise ácida seguida de cromatografia

saponificação em NaOHacidificaçãoadição de Ca2+

precipitação da pectinapectato de cálcio lavado, seco e medido por gravimetria


Análise de pectinagrau de esterificação

parâmetro importante em produtos naturais ou em que se adiciona pectina

directamente medido por titulaçãoantes ou depois da saponificação

pectina isolada lavada com EtOH acidificadogrupos carboxilato convertidos em grupos ácido

carboxílico livresácido em excesso eliminado

dispersão do ácido pectínico em água titulada com base diluída (NaOH), em excesso

saponificação dos grupos metiléstertitulação com ácido

determinação de base não saponificadagrau de esterificação


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Análise de pectinagrau de esterificação

também pode ser medido por GCmedição do MeOH libertado pela saponificação

medição por NMR


Análise de fibrasprocedimentos habituais:

remoção de lípidosamostra seca, finamente trituradalípidos removidos por extracção com solvente

remoção de proteínashidrolisadas e solubilizadas

enzimas, ácidos fortes, bases fortesaminoácidos separados da fibra por filtração ou

precipitação selectiva com soluções de EtOHremoção de amido

amido gelatinizado em água quenteamido hidrolisado e solubilizado

enzimas, ácidos fortes, bases fortesglucose separada por filtração ou precipitação

selectiva com soluções de EtOH


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Análise de fibrasprecipitação selectiva de fibras

fibras separadas por precipitação selectiva com soluções de EtOH

análise de fibrasteor em fibra determinado por gravimetria

pesar uma fracção de fibra insolúvel, isolada da amostra

teor em fibra determinado quimicamentefibra hidrolisada a monossacáridos

concentração medida pelos métodos descritos


Análise de fibras


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Análise de fibrasmétodos gravimétricos

carboidratos digeríveis, lípidos e proteínas solubilizados selectivamente por reagentes químicos ou hidrolisados enzimaticamente

matéria não solúvel ou não digerida filtradaresíduo de fibra calculado por gravimetria

métodos químicoscarboidratos digeríveis removidos por via enzimáticacomponentes da fibra hidrolisados por ácido

monossacáridos obtidos medidos (valor da fibra)


em ambos os métodos é necessário remover completamente o amido digerível

provoca sobreestimação do valor da fibra

Análise de polissacáridos e fibra

Análise de fibras

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•44

preparação da amostraamostras com > 10 % lípidos

remoção de lípidos por extracção com éter de petróleo ou hexano

centrifugação para remover solventeextracção repetida 2 vezesamostra seca a 70 ºC

estufa de vácuo, durante a noiteamostra triturada

passar num filtro com malha de 0.3-0.5 mmregista-se a perca de peso para corrigir no cálculo de fibra dietética

devida a perca de gordura e humidade


Análise de fibras

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preparação da amostraamostras não sólidas com < 10 % fibra

liofilizadas antes da análiseamostras não sólidas com > 10 % fibra

liofilização não necessária


Análise de fibras

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•45

métodos gravimétricosmétodo da fibra bruta

simples; não adequado para análise de alimentosdetermina celulose e lenhina mas não hemiceluloses,

pectinas e hidrocoloidesdigeridos pelo ácido e pela basetende a cair em desuso

valor aproximado da fibra não digerível nos alimentosextracção sequencial de uma amostra (após remoção de

lípidos) com 1.25 % H2SO4 e 1.25 % NaOHresíduo insolúvel recolhido por filtração

seco, pesado e incinerado (correcção para contaminação com minerais)


Análise de fibras

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Análise de fibras

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•46

métodos gravimétricosmétodo da fibra total

sancionado pela AOACutilizado pela indústria para vários alimentosisolamento da fracção de interesse por precipitação selectiva

determinação da sua massa por pesagemalimento sofre eliminação de gorduras, secagem e

gelatinizaçãodigestão enzimática do amido e proteínas

a-amilase, amiloglucosidase, protease

adição de 95 % EtOHprecipitação de toda a fibra

solução filtradafibra recolhida, seca e pesada


Análise de fibras

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amostra misturada com tampãoadição de a-amilase

ajuste de pHmistura aquecida em banho-maria

gelatinização e digestão do amidoarrefecimento e adição de protease

digestão da proteínaajuste do pH e adição de glucoamilase

total digestão do amidopassos subsequentes dependem de se querer determinar fibra total,

insolúvel ou solúvel


Análise de fibras método da fibra total

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determinação de fibra insolúvel e solúvelmistura filtrada sob Celite

fibra insolúvel retida no filtrolavada com água

o filtrado contém fibra solúveladição de EtOH e lavagem com água

pp fibra solúvelfiltrada sob vácuo, com Celiteresíduo lavado 3 vezes com EtOH



93

resíduos de fibra (total, insolúvel ou solúvel) nos filtros lavados com EtOH 95 % e acetona

filtros secos na estufa, arrefecidos e pesadosalguma proteína e minerais complexam com constituintes da

parede celularnecessidade de corrigir

se se pretende determinar amido resistenteanálise de triplicado de amostra

se não se pretende determinar amido resistenteamostras em duplicado

uma amostra para determinar teor em azotoKjeldahl

outra incinerada para determinar teor em cinzas



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•48

fibra dietética expressa em percentagem de peso secofibra dietética total = fibra insolúvel + fibra solúvel



1 2R +R

Branco (mg) = -P-A2

1 2

1 2

R +R-P-A-B

2Fibra (%) = x100m +m

2

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métodos gravimétricosmétodo da fibra total

processo alternativo:componentes da fibra solúveis em água e insolúveis

determinados após filtração da amostra digeridafibra solúvel fica no filtradofibra insolúvel no retentado

componente insolúvel seco e pesadocomponente solúvel precipitado por adição de

EtOH 95 %filtrado, seco e pesado

determina-se proteína e cinzas das diversas fracçõespara corrigir o resultado

fibra = peso residual – peso (proteína + cinza)tendência para sobrestimar o teor de fibra em alimentos com

teores elevados de monossacáridosmonossacáridos “presos” no pp


Análise de fibras

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•49

métodos químicosteor de fibra considerado igual à soma dos monossacáridos mais a

lenhina restante (após remoção dos carboidratos)monossacáridos determinados segundo métodos descritos


Análise de fibras

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métodos químicosmétodo Englyst-Cummings

elimina-se a gordura da amostraamostra aquecida em água

gelatinização do amidoamido e proteínas digeridos por enzimasfibra precipitada com EtOH 100 %

pp separado por centrifugação, lavado e secofibra hidrolisada por H2SO4 conc.

concentração dos monossacáridos obtidos determinada por colorimetria, cromatografia, ...

massa da fibra na amostra considerada igual à massa de monossacáridos


Análise de fibras

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•50


teores de fibra solúvel e insolúvelpassos de separação semelhantes aos dos métodos

gravimétricosnão dá informação sobre teor de lenhina

digestão ácida não conduz à sua degradaçãoalimentos que contêm elevados teores de lenhina (raros)

analisados por outro método


Análise de fibras

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Análise de fibras

100

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•51


mais rápidomenos requisitos técnicosequipamento menos especializadomais reprodutível que método da AOAC


Análise de fibras

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métodos detergentesfibra por detergente ácidoAcid Detergent Fibre (ADF)

muito utilizado em raçõesdeterminação de celulose + lenhina


Análise de fibras

2

1

Wteor de fibra % = 100

W

W1 – peso da amostra (g)

W2 – peso do resíduo (g)

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métodos detergentesfibra por detergente neutroNeutral Detergent Fibre (NDF)

método oficial para determinação da fibra dietética em grãos de cereais

determinação de celulose + hemicelulose + lenhina


Análise de fibras

(peso do cadinho + paredes celulares) - peso do cadinhoteor de fibra % = 100

peso da amostra

paredes celulares ≡ resíduos de fibra

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Reagentesamostra (ração animal)sol. detergente ácido

adicionar 20 g CTAB a um balão volumétrico de 1 Lacertar volume com H2SO4 1 N

Procedimentopesar 1 g da amostramoer finamente e secarcolocar em frasco de refluxo com 100 mL do detergente ácido

aquecer até ebulição (5-10 min)refluxar 60 min

terminar refluxoagitar o frasco e filtrar em cadinho previamente incinerado e

pesadoadicionar água quente (90-100 ºC) até 2/3 do cadinho

deixar repousar 15-30 s

Ex: Determinação de fibra por detergente ácido


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secar sob vácuorepetir lavagem com água quentelavar 2 vezes com acetona

até total desaparecimento da corsecar acetona sob vácuosecar cadinho com a fibra

estufa com ventilação (3 h, 100 ºC)pesar

Ex: Determinação de fibra por detergente ácido


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