brigite stela afonso de almeida

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DE Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM LABORATÓRIO BRIGITE STELA AFONSO DE ALMEIDA MANAUS 2014

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Page 1: Brigite Stela Afonso de Almeida

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DE Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM LABORATÓRIO

BRIGITE STELA AFONSO DE ALMEIDA

MANAUS

2014

Page 2: Brigite Stela Afonso de Almeida

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BRIGITE STELA AFONSO DE ALMEIDA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DE Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM LABORATÓRIO

Dissertação apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientadora: Profª Dra Maria das Graças Vale Barbosa Guerra

Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Filemon Paolucci Pimenta

MANAUS 2014

Page 3: Brigite Stela Afonso de Almeida

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FICHA CATALOGRÁFICA

A447a Almeida, Brigite Stela Afonso de.

Avaliação do efeito de diferentes fontes de repasto sanguíneo na biologia de Anopheles aquasalis, colonizado em laboratório. / Brigite Stela Afonso de Almeida. -- Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, 2014.

xix, 99 f. : il.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2014.

Orientadora: Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa Guerra

1. Colônias de insetos. 2. Alimentação sanguínea 3. Comportamento alimentar 4. Longevidade I. Título.

CDU: 614.4

Page 4: Brigite Stela Afonso de Almeida

iii

FOLHA DE JULGAMENTO

AVALIAÇÃO DO EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DE Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM

LABORATÓRIO

BRIGITE STELA AFONSO DE ALMEIDA

“ Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-

Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.”

Banca Julgadora:

______________________________________

Profa. Dra. Maria das Graças Vale Barbosa Guerra Presidente

______________________________________

Prof. Dr. Felipe Arley Costa Pessoa Membro

______________________________________

Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro Membro

Page 5: Brigite Stela Afonso de Almeida

iv

Dedico este trabalho, à minha querida mãezinha Felizarda Carvalho Tavares Afonso (in memoriam), que

embora não tenha ficado para ver o desfecho dessa etapa da minha vida, sempre incentivou e apoiou o meu crescimento profissional, possibilitando a minha vinda para o Brasil em

2006 para fazer a graduação em farmácia. Uma mulher virtuosa e guerreira, exemplo de força, trabalho e dignidade.

Poderia dizer muitas coisas, mas prefiro o silêncio. ”Afinal Saudades também é Presença!”

Amor Incondicional, Saudades Eternas...!

Page 6: Brigite Stela Afonso de Almeida

v

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, pela vida, força, iluminação e coragem ao longo de toda minha jornada aqui no Brasil e por mais esta etapa da minha formação acadêmica.

À minha inesquecível e amada família, especialmente a minha mãe-avózinha, irmãos, tios e primos pelo amor incondicional, incentivos e por entenderem a minha ausência ao longo desses oito anos e meio no Brasil.

À Professora Dra. Maria das Gaças Vale Barbosa Guerra por ter aceitado esse desafio de me orientar, mesmo antes de me conhecer, uma vez que eu nunca tinha feito parte do seu grupo de pesquisa. Obrigada pela acolhida, paciência, pelos ensinamentos, apoio, amizade e cobranças que me permitiram concluir este trabalho.

Ao Professor Dr. Paulo Filemon Paolucci Pimenta pela confiança que depositou em mim para realizar esta pesquisa, pela compreensão e orientação.

Um agradecimento especial à Dra Leíla Coelho e ao Dr. Jorge Guerra pelo apoio e amizade desde a minha entrada no mestrado.

Ao Dr. José Bento Pereira Lima pela disponibilidade, amizade, pelos treinamentos, muitos e valiosos conselhos/sugestões desde a definição do projeto e em momentos difíceis durante a realização deste trabalho. Além do seu vasto conhecimento, a sua simplicidade, ética e paciência, faz do senhor um exemplo de pesquisador e pessoa.

À Dra. Claudia Maria Rios Veslasquez e a pós-doutoranda Gisele de Almeida, pela disponibilidade, paciência e valiosas sugestões dadas, principalmente na elaboração do projeto de dissertação; a Gisele acompanhou-me na realização dos experimentos pilotos. Ter vosso apoio na fase inicial foi fundamental para que eu pudesse chegar até aqui.

À Universidade do Estado do Amazonas (UEA), através da coordenação do Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical (PGMT) e à Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pela logística e a oportunidade oferecida.

Ao corpo docente do PGMT / UEA pelos conhecimentos transmitidos ao longo de cada módulo e aos secretários do programa, em especial à Sra. Maria da Conceição dos Santos Tufic, Altariza e Dona Socorro, pela gentileza e paciência.

À Coordenação de Apoio à Pesquisa (CAPES), pelo suporte financeiro através da bolsa de estudo concedida no período de dois anos de mestrado.

Page 7: Brigite Stela Afonso de Almeida

vi

À Gerência da Entomologia, na pessoa do Sr. Nelson Fé, pelo apoio logístico para execução deste trabalho.

À memória de Funmilayo Deborah Ajibewa e de Joilosn Teixeira Lima, amigos que me incentivaram a fazer o mestrado, que viveram na minha história e marcaram a minha trajetória de vida aqui em Manaus, de fato “quem vive no coração e na lembrança não morre jamais”!

À colega e amiga Karolina da Costa Sabino pelo incentivo constante, carinho, amizade, companheirismo, ajuda e bons conselhos cada vez que a ameaça do desânimo ou de desistência parecia eminente ao longo desta jornada. Juntamente com a amiga Karoline Jimenez Lô compartilhamos momentos difíceis e alegres das nossas vidas.

À amiga Débora por existir, sim porque ela é uma amiga fora do comum. Pela preocupação, carinho, amor incondicional que sempre demonstrou ter para comigo, boas conversas, palavras de motivação não só neste trabalho, mas na minha vida pessoal, alegrias e presteza ajuda nos momentos mais difíceis no decorrer desta caminhada desde a graduação até agora. E esses agradecimentos aqui expressados, se estendem também às amigas: Dra Victoria Sposina (carinhosamente, Vicky), Dra. Rose Mary, Dra Rosilene e Dra Ilda.

À Dra Ritinha que embora morando atualmente, no Rio de Janeiro sempre fez parte dessa grande conquista, cuidou de mim como uma mãe quando morou em Manaus, sempre me deu incentivos e se preocupou comigo, a minha eterna gratidão.

Às amigas Sônia Miwa, Sandra Diniz e Suellen Ferreira pela preocupação e incentivos e aos amigos do Programa de Estudante Convênio de Graduação (PEC-G), especialmente Raymounde, Oswald, Leozinho, Cynthia, Christiane e Vera Larissa, pela amizade de todos.

À amiga Ìria Cabral, na altura técnica responsável pelo insetário Dr. Agostinho Cruz Marques, pela forma eficiente e organizada como conduziu o fornecimento de mosquitos Anopheles aquasalis para os meus experimentos, de forma que não faltasse para outros colegas pesquisadores também, por toda ajuda na execução do trabalho, ensinamentos, “puxões de orelhas”, amizade e momentos de alegrias proporcionado, sem os quais eu não teria conseguido concluir a parte prática do projeto.

Não posso deixar ainda de agradecer toda a atenção da amiga doutoranda Keillen Monick Campos, pelos ensinamentos, principalmente na adaptação do método de alimentação indireta, pelo carinho, conversas, conselhos importantes, correções da dissertação final e pela amizade revelada, juntas demos muitas risadas. O meu agradecimento também à Dona Miracelma Queiroz pelas orações e solidariedade.

Page 8: Brigite Stela Afonso de Almeida

vii

Ao Felipe Brito, ex-aluno PAIC da instituição, pela ajuda durante a realização dos experimentos, principalmente na preparação de inúmeros copos para posturas individuais das fêmeas, na exaustiva tarefa de contagem dos ovos postos e larvas, dissecção dos ovários, tratamentos dos animais, anestesia e eutanásia, e sobretudo pela amizade.

Aos colegas e amigos da turma do curso de Medicina Tropical pelo apoio, confratenizações ao término de cada disciplina e de maneira geral, pelo intercâmbio na trajetória do curso, em especial Ana Gualberto Vaz (amigona), Loren Rebeca, Amaury Bentes, Ione Pinto, Edson Fidelis, Priscila Bentes e Efrein dAlva.

Aos amigos dos laboratórios de Entomologia pelo respeito, amizades, apoios em algum momento da pesquisa e agradável convívio nomeadamente: Juciely, Dona Iolanda, Layla, Laíse, Jeremias, Maurício, Cybele, Paula, Sara, Rubéns, Sr. Flávio, Dona Rita e Rafaela. Não se esquecendo, da doutoranda Rosa, Adria que vez ou outra ensinaram-me e ajudaram-me no tratamento prévio dos animais.

Aos amigos do Laboratório de Análises clínicas do Hospital Universitário Getúlio Vargas (HUGV), a minha segunda casa, pelo suporte emocional, financeiro por meio de plantões e pela torcida de sempre.

À Dra Ana Custódio pelo ombro amigo, conselhos e apoio em alguns momentos difíceis no período de execução do experimento.

Ao Centro Internacional de Pesquisa Clínica em Malária, na pessoa do Prof. Dr. Marcus Lacerda pela acolhida no seu grupo de pesquisa, proporcionando-me muitos momentos de conhecimentos através das reuniões de Malária.

Ao Biotério da FMT-HVD por ter fornecido a maioria dos animais para a pesquisa e ao do INPA , que algumas vezes forneceu-nos camundongos.

Aos voluntários que forneceram sangue para alimentação dos mosquitos.

Ao Vanderson Sampaio pela ajuda na obtenção de dados atualizados referentes aos casos de malária no Brasil.

Aos funcionários do setor de Bacteriologia da FMT-HVD, nomeadamente Dra Rossicléia, Dr. Soares Geraldo Majela, Dra. Andrea Espara e Dona Luisa, pelo incentivo no início desta caminhada.

Aos membros da banca da minha aula de defesa, Prof. Dr. Felipe Arley Costa Pessoa e Prof. Dr. Wuelton Monteiro pelas pertinentes considerações, que certamente serviram para melhorar este trabalho final.

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Por fim, quero fazer um agradecimento muito especial a doutoranda Djane da Silva pela total disponibilidade, paciência, apoio nas últimas etapas dos experimentos, por toda ajuda na organização e tabulação dos dados, análise estatística dos mesmos.Também pelos ensinamentos e preciosas sugestões que em muito contribuiram para elaboração desta dissertação e em especial pela amizade conquistada. Enfim, muito obrigada amiga e que Deus lhe pague.

A todos que embora não citados, mas que de alguma forma me ajudaram no delinear deste caminho.

Muito obrigada!

Page 10: Brigite Stela Afonso de Almeida

ix

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”.

(Marthin Luther King)

“Valor das coisas não está no tempo que elas duram mas na intensidade com que elas acontecem.

Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis.”

(Fernando Pessoa)

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RESUMO

Anopheles aquasalis é uma espécie do subgênero Nyssorhynchus que cresce em água salobra, tem distribuição litoránea na América Central e do Sul, considerada vetora de malária em algumas regiões de Venezuela e do Brasil. Visando o controle desta doença, este anofelino tem sido colonizado em laboratório desde 1995 para o desenvolvimento de diversos estudos, entre eles, a interação parasita-hospedeiro. Nesse contexto, propôs-se avaliar os efeitos de diferentes fontes de repasto sanguíneo na biologia de Anopheles aquasalis colonizado em laboratório. Esse foi um estudo experimental realizado no insetário Dr. Agostinho Cruz Marques situado no Centro de Entomologia da Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado na cidade de Manaus. Fêmeas de An. aquasalis com idade entre 3 a 7 dias e em jejum de 24 horas, foram alimentadas de forma direta e indireta, com sangue de camundongo, hamster, galinha e ser humano; para avaliação em triplicatas da preferência alimentar, longevidade e fecundidade. No que concerne à preferência alimentar, não se observou nenhuma diferença estatísticamente significativa em relação ao número de fêmeas ingurgitadas e a quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas submetidas às diferentes fontes. Quanto à longevidade, de uma maneira geral, as médias de sobrevivência variaram de 24 dias para alimentação com sangue de galinha e 18 dias em sangue de humano. A respeito da fecundidade, observou-se um aumento na média de ovos postos pelas fêmeas durante as gerações F0 a F1 nas quatro fontes de sangue testadas, entretanto este aumento foi mais evidente entre as fêmeas que se alimentaram com sangue de camundongo (2268 a 7475 ovos postos), exceto as fêmeas alimentadas com sangue de galinha, em que houve um declínio entre uma geração e outra (1127 a 0). Os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que o mosquito Anopheles aquasalis tem um comportamento eclético e oportunista com variações na preferência e no método de oferta da fonte sanguínea. A maior quantidade de sangue ingerido que proporcionou maior longevidade das fêmeas foi o sangue de galinha, entretanto, a maior fecundidade foi registrada nas fêmeas que se alimentaram de sangue de camundongo e hamster.

Palavras-chave: Colônias de insetos, alimentação sanguínea, comportamento alimentar, longevidade, fecundidade.

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ABSTRACT

Anopheles aquasalis is a species of the subgenus Oncorhynchus that grows in brackish water, has coastal distribution in Central and South America, and it has been considered malaria vector in some regions of Venezuela and Brazil. This anopheline has been colonized in the laboratory since 1995 to the development of large studies, such as host-parasite interactions in order to control this disease. In this study, we proposed to evaluate the effects of different sources of blood meal in the biology of An. aquasalis colonized in the laboratory. This was an experimental study conducted at Dr. Agostinho Cruz Marques insectary situated at Centre of Entomology of Tropical Medicine Foundation Dr. Hector Vieira Dourado in Manaus city. Three – to seven–day–old females of An. aquasalis and sugar withdrawn 24 hours before, were fed directly and indirectly, with blood of mouse, hamster, chicken and human; in triplicate to evaluate the feeding preference, longevity and fecundity. Regarding the feeding preference, none statistically significant difference was observed in relation to the number of engorged females and the amount of blood ingested by females fed with the different sources. Regarding the longevity, in general, the averages of survival ranged from 18 days for human blood to 24 days for feeding with chicken blood; about fecundity, we observed an increase in the average of eggs laid by females in the four sources tested during the generation F0 and F1, however this increase was more evident among females fed with mouse blood (2268 to 7475 eggs laid), except the females fed with chicken blood which declined between one generation and another (1127 to 0). These results demonstrated that An. aquasalis has an eclectic and opportunistic behavior with variations in the preference and the method of supply of blood. The largest amount of ingested blood that provided greater longevity of females was chicken blood, however, the greater fecundity was observed in females fed with mice and hamster blood.

Keywords: Insects colonies, blood meal source, feeding behaviour, longevity, fecundity.

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RESUMO LEIGO

Anopheles aquasalis é um dos principais mosquitos ou pernilongos que transmite a doença malária no Brasil. Cresce em água com um certo gosto de sal e está distribuído na região costeira da América do Sul e Central. Esse mosquito tem sido criado em laboratórios desde 1995 para servir de base em vários estudos, com o objetivo de controlar a doença malária. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes tipos de alimentação sanguínea no comportamento de Anopheles aquasalis criado em laboratório. Foi um estudo experimental realizado no insetário Dr. Agostinho Cruz Marques situado no Centro de Entomologia da Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado na cidade de Manaus. Fêmeas do mosquito An. aquasalis com idade entre 3 a 7 dias e em jejum de 24 horas, foram alimentadas diretamente na pele e artificialmente através de uma película de parafilme, com sangue de camundongo, hamster, galinha e ser humano; para avaliação em três vezes do hábito alimentar, sobrevivência e fecundidade. A respeito do hábito alimentar: não teve nenhuma diferença significativa em relação ao número de fêmeas alimentadas e a quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas. Quanto ao tempo de vida, de uma maneira geral, a sobrevivência variou em torno de 24 dias para alimentação com sangue de galinha e 18 dias em sangue de humano. A respeito da fecundidade, obteve-se um aumento no número de ovos postos pelas fêmeas em todas as fases nas quatro fontes de sangue animal estudadas, porém este aumento foi mais notório entre as fêmeas que se alimentaram com sangue de camundongo (2268 a 7475 ovos postos), execeto as fêmeas alimentadas de sangue de galinha que diminuiu (1127 a 0). Os resultados obtidos nesse estudo mostraram que o mosquito Anopheles aquasalis tem um hábito alimentar variável, pois sugou sangue de todos os animais que foram usados na pesquisa. As fêmeas que mais se sobreviveram foram aquelas que se alimentaram de sangue de galinha. E colocaram mais ovos as fêmeas alimentadas em camundongo e hamster.

Palavras-chave: Criação de insetos, alimentação sanguínea, comportamento alimentar, sobrevivência, fecundidade.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Distribuição mundial das espécies de Anopheles. ..................................... 4

Figura 2 – Mapa com a distribuição de Anopheles aquasalis . .................................. 5

Figura 3 - Localidade de infecções naturais, por Plasmodium em Anopheles aquasalis, ao

longo do território Brasileiro. ....................................................................................... 8

Figura 4 – Imagem do ciclo biológico do Anopheles .................................................. 9

Figura 5 - Alimentação direta em camundongo (a) e galinha (b)............................. 27

Figura 6 – Sistema de alimentação artificial ou indireta. .......................................... 29

Figura 7 - Longevidade de fêmeas alimentadas com diferentes fontes . ................. 34

Figura 8 - Tempo de sobrevivência medio de fêmeas alimentadas com diferentes fontes

sanguíneas. .............................................................................................................. 35

Figura 9 – Valores médios de fêmeas ingurgitadas, posturas, oviposturas, ovos retidos e de

ovos postos na geração F0 pelos métodos direto e indireto. .................................... 37

Figura 10 - Valores médios de fêmeas ingurgitadas, ovos postos, larvas, pupas e adultos

(fêmeas e machos) em cada geração de estudo por diferentes fontes de alimentação

sanguínea (a) alimentação direta e (b) alimentação indireta. ................................... 39

Page 15: Brigite Stela Afonso de Almeida

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Média de fêmeas ingurgitadas e da quantidade de sangue ingerido em miligrama

por fonte alimentar. ................................................................................................... 33

Tabela 2 - Média de fêmeas vivas em porcentagem ao longo do experimento por cada fonte.

.................................................................................................................................. 35

Tabela 3 - Valores totais de ovos postos e percentuais de larvas, pupas, fêmeas e machos

em cada geração de estudo por diferentes fontes de alimentação sanguínea. ........ 36

Page 16: Brigite Stela Afonso de Almeida

xv

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS

An. - Anopheles

ANOVA – Análise de variância

CEP - Comité de Ética em Pesquisa

D - Direto

ELISA - Ensaio imuno-enzimático em fase sólida (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

EP - Erro Padrão

FIOCRUZ - Fundação Oswald Cruz

FMT-HVD - Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

fr - Frasco

g - Grama

GENT - Gerência de Entomologia

ID - Indireto

IM - Intramuscular

IP - Intraperitoneal

Kg - Kilograma

LAFICAVE - Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores

mg - Miligrama

mL - Mililitro

n - Número de uma amostra

PBS - Solução Salina Tamponada com Fosfato (Phosphate - Buffered Saline)

SBCAL - Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

Page 17: Brigite Stela Afonso de Almeida

xvi

µL - Microlitros

% - Percentual

ºC – Graus Celsius

Page 18: Brigite Stela Afonso de Almeida

xvii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

1.1 Malária 1 1.1.1 Agentes etiológicos da malária humana 1

1.1.3 Vetores de malária humana 2

1.1.4 Anopheles aquasalis Curry 1932 5

1.2. Biologia dos anofelinos 8 1.2.1 Ciclo de vida dos anofelinos 8

1.2.1.1 Ovos 9

1.2.1.2 Larvas 9

1.2.1.3 Pupas 10

1.2.1.4 Adultos 10

1.2.2 Fecundidade 10

1.2.3 Hábito alimentar de anofelinos adultos 11

1.2.4 Longevidade 13 1.2.5 Fatores abioticos e bióticos que interferem na biologia de anofelinos 15 1.3. Colônias de insetos em laboratório 16

1.3.1 Colônia de Anopheles aquasalis 18

1.4 Métodos de alimentação 19 2. OBJETIVOS 24

2.1 Geral 24 2.2 Específicos 24

3. MATERIAIS E MÉTODOS 25

3.1 Modelo de estudo 25 3.2 Aspectos éticos 25

Page 19: Brigite Stela Afonso de Almeida

xviii

3.3 Universo de estudo 25 3.3.1 Mosquitos 25

3.4 Procedimentos 25 3.4.1 Fontes de repasto sanguíneo 25

3.4.2 Tratamento dos animais antes do repasto 26

3.4.3 27

Avaliação do comportamento alimentar 27

3.4.3.1 Alimentação direta em animais 27

3.4.3.2 Alimentação indireta – Ensaios de membrana (parafilme) 28

3.4.3.3 Quantidade de sangue ingerido 29

3.4.4 Efeito das diferentes fontes sobre a longevidade do An. aquasalis 29

3.4.5 Efeito das diferentes fontes sobre a fecundidade do An. aquasalis 30

3.4.5.1 Acompanhamento da prole por duas gerações 31

3.5 Análise estatística dos dados 31 4. RESULTADO 33

4.1 Comportamento alimentar de An. aquasalis submetidas as diferentes fontes de repasto sanguíneo animal através de métodos direto e indireto de alimentação. 33

4.2 Efeito de diferentes fontes de alimentação sanguínea sobre a longevidade. 34 3 Efeito de diferentes fontes de alimentação sanguínea sobre fecundidade do mosquito

36 5. DISCUSSÃO 40

5.1 Considerações sobre os resultados dos métodos de oferta de fonte alimentar 46 5.2 Considerações finais 47

6. CONCLUSÃO 48

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49

8. ANEXOS / APÊNDICE 56

8.1 Anexo A – Aprovação junto ao Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-HVD 56

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xix

8.2 Anexo B – Licença da Comissão de Ética no Uso de Animais 58 8.3 Anexo C - Fluxograma dos procedimentos 58 8.4 Anexo D - Procedimentos Operacionais Padrões (POPs) 60 8.5 Anexo E - Minuta de artigo 68 8.6 Apêndice A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 77

Page 21: Brigite Stela Afonso de Almeida

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Malária

A malária é uma doença infecciosa febril aguda, considerada um dos mais importantes

problemas de saúde pública mundial (1), endêmica em 104 países tendo sido em 2012

responsável por 207 milhões de casos no mundo, com cerca de 627.000 mortes, dos quais

80% dos casos e 90% das mortes se concentram no continente africano (2).

No Brasil, em 2013 foram registrados mais de 169.000 casos da doença, 99,7%

ocorreram na Amazônia Legal (3, 4), que compreende os estados do Acre, Amapá,

Amazonas, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins e uma porção ocidental do

Maranhão (5). E no estado do Amazonas foram registrados 76.070 casos da doença,

representando 45 % do total de casos (4).

A alta prevalência de malária na Região Amazônica pode estar relacionada a fatores

ecológicos que favorecem o desenvolvimento da fauna anofélica, além de fatores

socioeconómicos. Aliado a esses fatores tem-se um aspeto relevante que é a densidade

vetorial que, associada à preferência alimentar do inseto, determina a capacidade vetorial

dos transmissores desta doença (5-8).

Embora a malária ainda seja uma doença bastante prevalente em países tropicais e

subtropicais, atualmente em muitos países endêmicos, tem-se estabelecido estratégias de

controle da malária, objetivando eliminar e prevenir novos casos da doença (9).

1.1.1 Agentes etiológicos da malária humana

A malária é uma doença causada por protozoários cuja classificação taxonômica é

(10).

Filo: Apicomplexa

Page 22: Brigite Stela Afonso de Almeida

2

Classe: Aconoidasida

Ordem: Haemosporida

Família: Plasmodiidae

Gênero: Plasmodium

Atualmente, são descritas seis espécies responsáveis pela malária no mundo:

Plasmodium falciparum (Welch, 1897), Plasmodium malariae (Laveran, 1881), Plasmodium

ovale (Stephens, 1922), Plasmodium vivax (Grassi, 1890), Plasmodium knowlesi (Krotoski et

al, 1980)e mais recentemente Plasmodium cynomolgi (Mayer, 1907) estas duas últimas

espécies são parasitas de macacos e foram descritas causando infecção em humanos (7, 11-

14).

No Brasil, a malária é causada principalmente por P. vivax (86,81% dos casos

registrados), P. falciparum (11,93% dos casos), que embora com um menor número de casos

é responsável por casos mais graves, podendo inclusive ser letal, caso o indivíduo não seja

tratado a tempo. A gravidade da malária associada ao parasitismo por Plasmodium

falciparum é justificada na capacidade desse Plasmodium aderir ao epitélio dos capilares

sanguíneos, podendo, assim, ocasionar falência renal aguda, malária cerebral e edema

pulmonar (1, 15) . Porém, há relatos de que o P. vivax, em casos de coinfecção com outras

doenças também pode contribuir para a morte do indivíduo (16, 17).

As espécies de Plasmodium são transmitidas ao homem através da picada de fêmeas

de mosquitos do gênero Anopheles durante a refeição sanguínea. Anofelinos são insetos de

grande importância epidemiológica por serem vetores de doenças, como a filariose e a

malária (10, 18).

1.1.3 Vetores de malária humana

Os mosquitos transmissores da malária pertencem, segundo Rey (10), à seguinte

classificação taxonomica:

Page 23: Brigite Stela Afonso de Almeida

3

Classe: Insecta

Ordem: Díptera

Sub-Ordem: Nematocera

Família: Culicidae

Sub-Familia: Anophelinae

Gênero: Anopheles

Taxonomicamente é importante destacar que o gênero Anopheles é constituído de

seis subgêneros: Cellia, Stehomya, Lophopomyia, Anopheles, Kerteszia e Nyssorhynchus.

Dentre estes o subgênero Cellia é o único que não é encontrado na região neotropical e

somente os subgêneros Anopheles, Kertezia e Nyssorhynchus possuem importância médica

(18, 19).

Atualmente, são conhecidos cerca de 500 espécies do gênero Anopheles e destas, 70

espécies são vetores da malária no mundo (Figura 2) (18, 20). No Brasil ocorrem cerca 55

espécies (21) e as principais espécies transmissoras estão inseridas no subgênero

Nyssorhynchus: Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root 1926, Anopheles (Nyssorhynchus)

aquasalis Curry 1932 e Anopheles albitarsis Lynch-Arribalzaga, 1878 (22-25).

Page 24: Brigite Stela Afonso de Almeida

4

Figura 1 – Distribuição mundial das espécies de Anopheles (26).

Page 25: Brigite Stela Afonso de Almeida

5

1.1.4 Anopheles aquasalis Curry 1932

É uma espécie do subgênero Nyssorhynchus, de distribuição quase

exclusivamente litorânea das Américas Central e do Sul. Pode ser encontrado na costa

Atlântica, desde São Paulo (Brasil) até o Panamá e Costa Rica; e na costa do Pacífico,

desde estes últimos países até o Equador. Ocorre também nas Antilhas Menores, em

Trinidad e Tobago (10, 18, 20, 23) (Figura 3).

Figura 2. Mapa com a distribuição de Anopheles aquasalis no Continente Americano (27).

Page 26: Brigite Stela Afonso de Almeida

6

Este mosquito é encontrado em algumas localidades brasileiras distantes mais

do que 100 e 200 km do litoral atlântico e que possuem o solo rico em cloreto de sódio,

como é o caso de algumas áreas do sertão nordestino ou em regiões cujo terreno sofre

invasão das marés como ocorre no município de Belém, estado do Pará (28).

Esse vetor se desenvolve naturalmente em ambientes ensolarados e em água

salobra, limpa e fresca e com vegetação emergente, como manguezais, lagoas,

represas e canais de irrigação (29).

Na literatura o An. aquasalis tem demonstrado diferentes hábitos alimentares,

zoofílico e antropofílico ou até eclético, variando conforme a sua localização geográfica

(30-32). De uma maneira geral são exofílicos, com atividade crepuscular e noturno (20,

29). Em estudo realizado por Flores-Mendoza et al., no município de Guapimirin, no

estado do Rio de Janeiro e que apresenta clima semitropical, observou-se o hábito

zoofílico de An. aquasalis e a preferência alimentar por sangue bovino e equino (33) .

Já Xavier e Rebêlo observaram que no estado do Maranhão, região Nordeste do Brasil

e que possui clima semiárido, o hábito de An. aquasalis é endofílico e antropofílico, e

esta espécie é considerada principal vetor da malária na região (34).

Galvão et al. mostraram que na região Amazônica brasileira, mas

especificamente no município de Belém, estado do Pará onde o clima é equatorial o

mosquito é preferencialmente zoofilíco (28) e apresentando segundo Deane et. al.

preferência alimentar por sangue bovino e sangue equino (31).

Anopheles aquasalis é considerado um importante vetor de malária nas áreas

onde se encontra distribuído (35-39), especialmente em algumas regiões costeiras de

Venezuela e Brasil (40, 41).

No litoral do Brasil, do Norte ao Sul, embora menos antropofílico, An. aquasalis

tem atuado como vetor da malária (34) e já foi encontrado infectado naturalmente com

Plasmodium sp. em algumas regiões, a exemplo de Belém, estado do Pará, do estado

do Maranhão e outras regiões brasileiras conforme demonstrado na figura 4 (33).

Page 27: Brigite Stela Afonso de Almeida

7

Silva et al. realizaram um levantamento sobre a fauna anofélica na cidade de

Belém entre 1995 e 2004, e registraram a ocorrência de catorze espécies de anofelinos:

An. albitarsis s.l., An. aquasalis, An. braziliensis, An. darlingi, An. evansae, An.

intermedius, An.mediopunctatus s.l., An. nuneztovari, An. oswaldoi, An. peryassui, An.

shannoni, An. strodei, An. triannulatus s.l. e Anopheles sp., uma espécie próxima a An.

Galvaoi (2006). Destas, An. aquasalis foi a espécie de maior densidade no município:

3.424 adultos (46,26%) e 11.588 (99,21%) larvas (38) .

Mascarenhas et al., na ilha de Cotijaba (Belém do Pará) evidenciaram que o

principal vetor da malária na ilha de estudo era o An.aquasalis, uma vez que tinha sido

a espécie mais prevalente encontrado no peridomícilio (63,3%) e mesmo nos períodos

mais secos (42).

Ainda em Belém, um estudo sobre a infecção experimental, por meio da técnica

de dissecção do estômago e das glândulas salivares de mosquitos, dez dias após o

repasto infectante, mostrou o An. aquasalis infectado tanto por Plasmodium falciparum

como P. vivax (45). Nessa mesma linha de pesquisa, recentemente outros estudos

foram descritos demonstrando a suscetibilidade deste anofelino vetor por espécie de P.

vivax (36, 43, 44).

Mas geralmente, Anopheles aquasalis é tido como vetor secundário no litoral da

região Norte, principalmente no estado do Amapá, onde é simpátrica ao An. darlingi,

tendo sido encontrado 2 a 5 % de índices esporozoíticos (8, 10).

Page 28: Brigite Stela Afonso de Almeida

8

Figura 3 - Localidade de infecções naturais, por Plasmodium em Anopheles aquasalis, ao longo do território Brasileiro (33).

1.2. Biologia dos anofelinos

1.2.1 Ciclo de vida dos anofelinos

Os anofelinos são insetos holometábolos, isto é, apresentam metamorfose

completa em seu ciclo evolutivo. Possuem o ciclo de vida constituído por quatro

estágios de desenvolvimento, sendo eles, ovo, larva (quatro estádios), pupa e adulto

(Figura 5). Os três primeiros estágios ocorrem em meio aquático, enquanto que o último

é terrestre (18, 20).

Page 29: Brigite Stela Afonso de Almeida

9

Figura 4. Imagem do ciclo biológico do Anopheles (45).

1.2.1.1 Ovos

Os ovos dos anofelinos são depositados de forma isolada diretamente na água

limpa, parada ou com pouca correnteza e flutuam devido à presença de expansões

laterais (flutuadores) que contêm ar. Morfologicamente, possuem aspecto alongado e

apresentam simetria láteral e seu tempo de eclosão depende da temperatura e da

umidade, contudo possuem tempo de eclosão que variam de 2 a 3 dias (10, 18).

1.2.1.2 Larvas

As larvas de anofelinos são morfologicamente semelhante à de outros culicideos

e necessitam de cerca de sete a dez dias para o seu desenvolvimento, sendo que o

tempo pode ser variável de acordo com a espécie , fatores bióticos e abióticos (18).

Diferente dos outros culicídeos, as larvas de anofelinos são desprovidas de sifão

respiratório posterior, mas possuem um aparelho espiracular dorsal, que ajuda as larvas

assumirem a postura horizontal ou paralela na superfície da água onde se alimentam e

respiram (46).

Pupa

Larvas

Adultos

Ovos

Page 30: Brigite Stela Afonso de Almeida

10

1.2.1.3 Pupas

A pupa é a forma imatura que sucede os quatro estádios larvais e que se

localizam na superficie da água, onde respiram. Este estágio pode durar de 1 a 3 dias

dependendo da espécie, não se alimenta e sofrem modificações necessárias para

formar os adultos (18, 20).

Morfologicamente, na fase pupar é possível separar os machos das fêmeas, pois

em geral os machos são menores que as fêmeas e biologicamente emergem mais cedo

que as fêmeas, aproximadamente um dia antes (46, 47).

1.2.1.4 Adultos

Quando o inseto adulto completamente formado emerge, abandona a água e vai

para um abrigo e ao pousar mantém o corpo e a probóscida em linha reta, o que

permite diferenciá-lo dos demais culicídeos. O corpo dos adultos é nitidamente dividido

em cabeça, tórax e abdome (18).

1.2.2 Fecundidade

De maneira geral, a fecundidade dos mosquitos anofelinos está relacionada com a

produção de ovos postos por fêmeas (48, 49). Para a produção dos ovos férteis é

necessário que os mosquitos copulem, e geralmente a cópula ocorre após a

emergência das fêmeas.

Na natureza, algumas espécies, eurigâmicas copulam através de enxame formado

pelos machos para onde as fêmeas são atraídas, durante o voo. Enquanto outras

espécies (estenogâmicas) o acasalamento ocorre sem formação de enxame (50). Já no

âmbito experimental, não se observa a formação de enxame, devido a problemas

relacionados com o espaço, que normalmente é pequeno. Naturalmente, uma fêmea

pode-se manter fértil por toda sua vida logo no primeiro acasalamento, mas isso não a

impende de copular mais de uma vez , no caso de se cessar os espermatozóides

armazenados na espermateca (20).

Page 31: Brigite Stela Afonso de Almeida

11

Com o intuito de promoverem o desenvolvimento dos ovários e maturação dos

ovos, as fêmeas realizam o repasto sanguíneo (51). A procura por sangue animal é

favorecido por vários estímulos, tais como, visão, correntes de convecção, odores e

dióxido de carbono. Após a alimentação sanguínea, as fêmeas descansam por algum

tempo, próximo do local da alimentação ou distante, até que a digestão do sangue se

complete, e então procuram um lugar para a desova (8).

Geralmente, o intervalo entre a alimentação sanguínea e a postura é de três

dias, em condições de temperatura adequada (52). Independentemente, das fêmeas

estarem inseminadas ou não, é comum elas colocarem ovos (ainda inférteis), com isso

alguns estudos defendem que o número de ovos está relacionado com o tamanho das

fêmeas e com a quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas (53). Normalmente a

postura ocorre no período noturno.

O número de ovos por fêmea é bastante variável para cada espécie, mas

normalmente uma fêmea ovipõe de 50 a 500 ovos por postura, variando de duas a oito

posturas por fêmea após a alimentação sanguínea (54). Os ovos, após um período

médio de dois a quatro dias, em temperatura média de 26º C, originam às larvas, que

em cerca de sete a dez dias formam as pupas e os adultos emergem entre 36 a 48

horas depois da pupagem (45).

1.2.3 Hábito alimentar de anofelinos adultos

Usualmente, ambos os sexos dos mosquitos têm como alimentação básica

substâncias açucaradas, provenientes de néctar de flores, orvalho e as frutas (20).

Esses carboidratos, armazenados no divertículo, são essenciais para obtenção de

energia para o voo, prolongam a longevidade dos mosquitos, além de fornecerem o

combustível inicial para produção de ovos (55). Geralmente, os alados anofelinos têm

hábitos crepusculares e noturnos (20)

Manda et al., estudando a preferência de Anopheles gambiae por açucar de

diferentes plantas e seus efeitos na sobrevida e fecundidade desta espécie, mostraram

que o An. gambiae que se alimentou das plantas (Tecoma stans, Senna didymobotrya,

Page 32: Brigite Stela Afonso de Almeida

12

Ricinus communis e Hamelia patens ) sobreviveu por mais tempo e seguido de uma

alimentação sanguínea depositou mais ovos quando comparado com os espécimes que

haviam se alimentado da planta Lantana camara (56).

Todavia, como já mencionado no item anterior as fêmeas são hematófagas, pois

através do sangue adquirem proteínas necessárias para o amadurecimento de seus

ovos e também podem contribuir para o metabolismo energético (18).

O repasto sanguíneo é facilitado pela injeção da saliva dos mosquitos no

hospedeiro vertebrado. A saliva é proveniente das glândulas salivares, presentes no

tórax dos mosquitos e diversas substâncias existentes na saliva auxiliam na

alimentação do mosquito, promovendo vasodilatação e atividade anticoagulante, a

exemplo da enzima apirase (54).

Após o repasto sanguíneo, o sangue é digerido no estômago do inseto, onde é

envolvido por matriz peritrófica, rica em quitina, que é secretada pelas células epiteliais

do intestino médio a cada ingestão sanguínea. Essa matriz extracelular funciona como

uma camada que separa a superfície interna do estômago do sangue recém-ingerido,

resguardando as suas vilosidades dos possíveis danos causados pelos elementos do

bolo alimentar, como os cristais de hemoglobina; e constitui uma barreira contra os

patógenos que eventualmente possam ter sido ingeridos com o sangue, limitando o seu

desenvolvimento e migração para outras partes do organismo (57).

Um outro evento que também ocorre nas células epiteliais do mosquito, logo

após a ingestão do sangue é a síntese e a produção de hormônios, as endopeptidases

tripsina, quimotripsina e aminopeptidase que promovem a clivagem dos componentes

das proteínas presentes no sangue. Mas de antemão, o processo de digestão do

sangue começa com a remoção do excesso de água e de hemólise (9).

Os hábitos de alimentação sanguínea dos anofelinos e seu padrão alimentar

fazem parte de um conjunto de informações necessárias para o entendimento do

comportamento das espécies em áreas de transmissão de malária, e cujo

conhecimento é de importância epidemiológica uma vez que pode subsidiar medidas

adequadas de controle da doença (55, 84).

Page 33: Brigite Stela Afonso de Almeida

13

A busca da fonte sanguínea por fêmeas de anofelinos dependerá de vários

fatores tais como: a preferência de cada espécie, a disponibilidade de hospedeiros na

região e as condições ambientais (18, 40).

Zimmerman et al., estudando a origem da alimentação sanguínea de anofelinos

no estado do Amapá, através da técnica de ELISA, observaram um alto índice de

sangue humano em An. marajoara, enquanto que em An. nuneztovari uma maior

proporção de alimentação sanguínea mista, confirmando que o repasto pode ser em

mais de um hospedeiro (58).

Em 1957, Omardeen et al. realizaram um estudo sobre os hábitos alimentares da

espécie An. aquasalis na região costeira de Trinidad, na Venezuela, relataram o

ecletismo alimentar desta espécie, podendo se alimentar de até quatro espécies

diferentes (59).

Teste de precipitina é muito utilizado para detectar fontes ou repastos sanguíneos

simples e mistos e uma grande proporção destes foi relatada para algumas espécies

(60). Sênior–White encontrou 12% de repastos mistos em An.aquasalis (31).

Empregando o mesmo teste imunológico, Forattini et al. realizaram um estudo sobre os

hábitos alimentares da fauna de Culicidae do Vale do Ribeira, São Paulo, Brasil, e

confirmaram a preferência de Aedes spp. por mamíferos e de Culex (Culex) spp.por

aves (61).

Em análise da preferência alimentar de 596 espécimes de An. aquasalis

capturados em ambiente domiciliar, Deane et al. observaram que os mosquitos

apresentaram preferência pelo sangue humano em detrimento de outras fontes,

sugerindo que a fonte humana era a que estava mais próxima e abundante, sendo que

a galinha apresentou menor porcentagem de fêmeas positivas para o teste da

preciptina (46). Também nos primeiros meses de 1942, Galvão et al., trabalhando com

mosquitos capturados em domícilios, encontraram índices antropofílicos de 14,2 % para

An.tarsimaculatus (An.aquasalis) e de 12% para An. darlingi (57).

1.2.4 Longevidade

Page 34: Brigite Stela Afonso de Almeida

14

A longevidade dos adultos depende tanto de fatores intrínsecos, como nutrição

larval, metabolismo dos alados e sua idade fisiológica, quanto de fatores extrínsecos

como temperatura, umidade, disponibilidade das fontes de carboidratos adequados

para a nutrição, luminosidade e efeito de parasitas e predadores (26). Em geral, os

mosquitos adultos sobrevivem por um mês. Mas, a taxa de sobrevivência dos culicídeos

nos trópicos varia entre uma a duas semanas (31), e as fêmeas, usualmente,

sobrevivem por tempo sensivelmente mais longo do que os machos (26).

A taxa de mortalidade pode ser da ordem de 20% ou muito mais baixa

dependendo da espécie. Em regiões costeiras da Àfrica o An. gambiae apresentou uma

taxa de mortalidade diária de 7 a 8%, contrastando com 13 a 15 % em outras áreas da

Tazânia (18).

É relevante o conhecimento sobre a longevidade, pois permite estimar a

capacidade vetorial de uma espécie, uma vez que possibilita saber se o plasmódio

conseguirá completar ou não o seu ciclo esporogônico e desta forma o vetor poderia

transmitir a doença (9,18, 31).

Alguns autores relataram que a longevidade está relacionada com a quantidade

de sangue ingerido durante o repasto sanguíneo, e que esta depende tanto do tamanho

da fêmea (53) quanto do comportamento defensivo do hospedeiro encarregado de

fornecer o sangue (62). Na natureza, as fontes estão livres para reagir e então, o

sucesso hematófago poderia estar comprometido, pelo fato do mosquito não completar

a sua sucção (31).

Nesse contexto, é preciso assumir que existe concordância gonotrófica quando

cada oviposição é precedida por um repasto e que há constância entre a alimentação e

a postura, para que se possa estimar o tempo em dias vivido pelo mosquito (idade

cronológica) (26, 86).

Em condições de semi-campo (natural), Lymo et al. demonstraram que a

sobrevivência do mosquito An. arabiensis após o repasto em diferentes animais não

dependia da quantidade de sangue ingerido, alegando que a sobrevivência foi

semelhante tanto em humanos como em outros mamíferos (vaca, bezerro e galinha).

Page 35: Brigite Stela Afonso de Almeida

15

Contudo, os mesmos autores, observaram uma maior longevidade entre os espécimes

que se alimentaram em animais imobilizados, ou seja, em situação pouco reativa,

destacando – se os espécimes de An. gambiae que haviam se alimentado em humano.

Eles associaram a sobrevivência desses anofelinos com o volume de sangue ingerido

em cada fonte, enfatizando a importância da reposta defensiva dos animais frente às

picadas dos mosquitos (85).

Gary e Foster relataram que fêmeas de An. gambiae alimentadas somente com

sangue sobrevivem de 20 a 43 dias, sugerindo que com o repasto sanguíneo esta

espécie pode viver tempo suficiente o que a torna um vetor muito competente na

transmissão de malária (63).

Em relação à An. aquasalis, parece que é bastante longevo (31). Não obstante,

Lima, (64) observou uma baixa longevidade entre as fêmeas de An. aquasalis que

tinham feito o repasto sanguíneo, contrapondo com o que o Consoli e Oliveira

descreveram, que as fêmeas que faziam o respasto sobreviviam por períodos mais

longos (26).

1.2.5 Fatores abioticos e bióticos que interferem na biologia de anofelinos

Tanto fatores abióticos, como temperatura, umidade e luminosidade, quanto

fatores bióticos, exemplo, nutrição larval, são importantes no sucesso da biologia dos

mosquitos e consequentemente na manutenção dos mesmos em laboratório (65).

No Vale do Paraíba, entre os Estados de São Paulo e Rio de Janeiro, Guimarães

et al. relataram à influência das precipitações pluviométricas e da temperatura sobre a

incidência da fauna de mosquitos do Parque Nacional da Serra da Bocaina. Os autores

constataram que nos meses mais frios e secos do ano, cerca de 70% das espécies

chegaram a desaparecer, assim realçando que os fatores climáticos, como frequência

das chuvas, umidade e temperaturas baixas ajudam na redução da diversidade e da

densidade populacional dos mosquitos (66).

De Carvalho et al. analisando o impacto da temperatura sob o desenvolvimento

embrionário e a reprodução de duas espécies de Anopheles neotropicais (An. aquasalis

Page 36: Brigite Stela Afonso de Almeida

16

e An. albitarsis), observaram uma queda abrupta na viabilidade dos ovos da espécie

An. albitarsis em baixas temperaturas (20-23ºC), mostrando portanto que os ovos

desta espécie são mais suscetíveis à temperaturas baixas (20-23 ºC) que o An.

aquasalis (67).

Estudos realizados com as espécies de gêneros diferentes também mostram a

influência dos fatores supracitado no desenvolvimento das espécies estudadas.

Richards et al., avaliando os efeitos de fontes de repasto sanguíneo na

reprodução de Culex pipiens quinquefasciatus, observaram baixa fecundidade entre as

fêmeas alimentadas com sangue bovino tratado (desfibrinado ou citratado), cerca de 54

ovos/jangadas durante a alimentação artificial, comparado com aproximadamente 118

ovos por jangadas na alimentação direta em galinhas, em função disto eles atribuíram

três problemas: 1) temperatura de incubação utilizada nos experimentos, 2) tipo de

hospedeiro e 3) idade das fêmeas que fizeram o repasto (71).

Canyion et al., avaliando os efeitos da humidade e da dieta em açucar no

comportamento do vetor Aedes aegypti, demonstraram que a umidade relativa em torno

de 34% afetou significativamente a fecundidade de Ae. aegypti, causando redução nas

oviposturas, descartando a hipótese de que a dieta em açucar poderia ter este efeito no

vetor. No entanto, com a umidade de 84% a postura foi boa (68).

1.3. Colônias de insetos em laboratório

O estabelecimento de colônias de insetos em laboratórios vem sendo realizado

em várias partes do mundo com diversas finalidades, tais como estudos de biologia

(comportamento, fisiologia, genética, citologia etc), taxonomia, infectibilidade com

diversos patógenos, interação parasito hospedeiro, suscetibilidade / resistência de

mosquito a possíveis agentes de controle: químicos, físicos ou biológicos e de

plasmódios aos antimaláricos, visando o controle de vetores e de parasitos (48, 69-71).

As primeiras tentativas bem sucedidas de iniciar uma colônia de Anopheles

gambiae (principal vetor de malária na África) foram relatadas por Moores, tendo sido

realizado durante um curso de capacitação em Malária no Quênia, onde a colônia foi

Page 37: Brigite Stela Afonso de Almeida

17

mantida por três anos (72) e em seguida pelo Shute, em Arusha, Tanganyika na

Unidade de Pesquisa de Agrotóxicos Colônial, com o intuito de fornecer uma fonte de

mosquitos que poderiam ser usados em testes de suscetibilidade de An. gambiae aos

inseticidas na África Oriental (71, 73).

Quanto aos vetores neotropicais, em Costa Marques, Rondonia, Brasil, foi

estabelecida a primeira colônia de An. deaneorum através de cópula forçada ou

induzida pelo Klein et al.(74). Horosko III et al em 1997, descreveram a primeira colônia

de 18 gerações da espécie An. albitarsis estabelecida por meio de cópula livre em

Santa Catarina (75).

Já o An. darlingi (principal vetor de malária no Brasil), a primeira e efetiva

tentativa de criação de uma colônia dessa espécie eurigâmica foi descrita em 1947 por

Gigioli na Guiania Inglesa, obtendo 35 gerações por acasalamento natural (76).

Posteriormente, em 1988 Buralli e Bergo descreveram a instalação e a manutenção

dessa mesma espécie no município de Araraquara, SP, como parte do programa de

pesquisa em malária da Superintendência de Controle de Endemias-SUCEN (77).

Numa região peruana, Moreno et al. estudando a infecção por P. vivax em

mosquitos de An. darlingi colonizado em laboratório conseguiram estabelecer a colônia

até a geração F6 também por cópula livre (69).

Embora muito importante, a criação de insetos em laboratório é muitas vezes

problemática, devido principalmente a dificuldades relativas à reprodução, como a não

realização de cópula livre por algumas espécies (101, 104). Além do mais, muitos

fatores, a exemplo da umidade baixa, temperatura inadequada, altas concentrações de

metais em água proveniente da torneira, e diferentes fontes alimentares influenciam na

criação dos insetos (67, 68, 78-83).

Todavia, algumas espécies, a exemplo de An. aquasalis, são adaptadas a

criação e reprodução em sistema fechado. Assim, na tentativa de solucionar o problema

de reprodução de algumas espécies, a técnica de cópula induzida é frequentemente

utilizada em vários estudos para criação e manutenção de colônia de mosquitos (84) .

No entanto, a cópula induzida é uma técnica que requer bastante tempo, exige uma boa

Page 38: Brigite Stela Afonso de Almeida

18

capacitação técnica e é insuficiente para a produção em massa, por vezes necessária

para determinados trabalhos experimentais (87, 98).

Por meio desta técnica, Baker manteve Anopheles punctipennis por mais de dois

anos e meio em laboratório e observou que machos com idade de três ou quatro dias

são melhores para a realização da cópula, embora indivíduos com um dia de idade

possam ser usados para este fim. Além do mais, conforme Baker os machos podem ser

utilizados mais de uma vez em cópulas induzidas. Este autor conseguiu realizar oito

cópulas sucessivas utilizando um único macho, entretanto, somente as três primeiras

fêmeas foram inseminadas (104). Já no Rio de Janeiro, Lima chegou a geração F 19

com o An. marajoara (64).

Mais recentemente, empregando a mesma técnica, Amir et al. descreveram a

primeira criação de Anopheles cracens (vetor discriminado por abergar o parasita de

malária, Plasmodium Knowlesi) na Malásia, até sexta geração. No insetário do

Departamento de Parasitologia, os espécimes desse mosquito eram alimentadas com

sangue de humano e de hamster, mantidas com solução açucarada a 10% adicionado

a vitamina complexo B, sob a temperatura de 24-26ºC e umidade relativa de 60-80%

(85).

1.3.1 Colônia de Anopheles aquasalis

A criação de anofelinos envolvidos na transmissão de malária humana em

laboratório é essencial para o desenvolvimento de pesquisa em malária, já que grande

parte dos trabalhos publicados recentemente, exige maior conhecimento da interação

parasito – vetor. Sabe - se que a primeira descrição sobre os hábitos da espécie

Anopheles aquasalis (= Anopheles tarsimaculatus) foi feita pelo Curry(86). Logo, no

início da década de 50, foram dados os primeiros passos para se conhecer o

comportamento desta espécie em laboratório, através de estudos sobre a sua bionomia

(31, 87).

No Brasil, a espécie An. aquasalis foi colonizada pela primeira vez em 1995, no

laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores (LAFICAVE), Instituto

Page 39: Brigite Stela Afonso de Almeida

19

Oswaldo Cruz, da Fundação Oswaldo Cruz, Fiocruz/RJ. Os espécimes percursores

desta colônia foram obtidos na parede de um curral no Município de Guapimirim, Rio de

Janeiro. Em laboratório esta espécie foi mantida em sistema fechado, ou seja, através

de cópula livre. Atualmente a colônia continua sendo mantida em sistema fechado e

serve como ferramenta para a realização de vários estudos. No entanto, apesar de ser

mantida por cerca de 20 anos, essa colônia ainda sofre flutuações, principalmente nos

meses mais frios (74, 87).

Em 2006, foi realizada a colonização bem sucedida de An. aquasalis em água

doce no Instituto Evandro Chagas, na cidade de Belém, com mosquitos oriundos de

coletas dominiciliares no próprio município. Em condições laboratorial, Da Silva et al.

conseguiram por meio de cópula induzida a ovoposição e por consequência a obtenção

de nove gerações deste anofelino (103).

Recentemente, na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado foi

implantado um insetário de Dípteras (Dr. Agostinho Cruz Marques), onde existe há

cerca de dois anos uma colônia de An. aquasalis. Os espécimes desta colônia são

mantidos por meio de cópula livre e tem se mostrado relativamente fáceis de manuseio.

Muito embora, ainda instável ao longo desses anos, os exemplares vêm sendo

utilizados como modelo experimental na realização de vários estudos, como o de

interação parasito – hospedeiro (Dados não publicados).

Arruda et al. conseguiram chegar a segunda geração (F2) e a fertilidade de quase

todos os ovos do An. albitarsis e do An. aquasalis, comprovando a importância das

condições ambientais tanto para a manutenção dos anofelinos em cativeiro quanto à

técnica utilizada (101).

Portanto, existem variações nas técnicas de criação de mosquitos, as quais

devem ser adaptadas à realidade de cada laboratório, considerando as condições

disponíveis para manutenção de colônias (83).

1.4 Métodos de alimentação

Page 40: Brigite Stela Afonso de Almeida

20

A necessidade de manutenção de colônias de mosquitos em laboratórios vem

motivando diversos autores a estudarem metodologias alternativas à utilização de

animais mantidos em laboratório. Usualmente, dois métodos de alimentação são

empregados: (1) direto no animal, simulando o repasto sanguíneo em condições

naturais, e (2) indireto, utilizando-se membranas naturais (pele de animais) ou sintéticas

(como exemplo, película de “Parafilm” ou Baudruche) acopladas a alimentadores de

vidro. Deng et al. usaram membrana a base de colágeno de gado no sistema de

alimentação por membrana para alimentar as espécies dos mosquitos Aedes aegypti e

Ae albopictus (50, 88-91).

Esses métodos vêm sendo utilizados não somente para fins de manutenção da

colônia como frisado acima, mas também possibilita a realização de diversos estudos,

cuja a natureza e o conhecimento geram interesses no ponto de vista epidemiológicos

(92, 93). Em vista disso, estudos foram realizados para avaliar e otimizar a eficácia

desses métodos (89, 94, 95).

Estudos in vitro têm comparado os métodos direto e indireto, mostrando que

existem diferenças significativas na eficiência destes dois métodos dando supremacia

para alimentação direta (93, 94, 96), como alternativa, Diallo et al. sugerem o uso de

maior quantidade de espécimes de mosquitos na alimentação indireta (94), enquanto

outros estudos relataram que essa diferença não é significativa (97). No entanto, a

alimentação em membrana é o método que vem sendo usado amplamente como uma

forma de infectar mosquitos com sangue coletados de voluntários infectados com P.

falciparum (92, 97-99) e P. vivax (43, 44, 100).

Sattabongkot et al., comparando o método de alimentação direta com quatro

métodos de alimentação por membrana para determinar a infecção do mosquito An.

dirus por P. vivax, relataram não ter encontrado diferença significativa entre os métodos,

com exceção à alimentação por membrana a partir do sangue total, onde registraram

uma baixa proporção de mosquitos infectados e consequentemente menor produção de

oocistos. Sugerindo a importância do anticorpo presente no sangue humano para o

bloqueio da transmissão (95) .

Page 41: Brigite Stela Afonso de Almeida

21

Bonnet et al., estudando a infectividade do P. falciparum em mosquitos

An.gambiae a partir da alimentação direta e por membrana, observaram que a taxa de

infecção por mosquito foi mais elevada na alimentação direta do que alimentação por

membrana, onde a média de mosquitos infectados e de oocistos foram respetivamente,

19,4% e 5,63 (alimentação direta), comparando com 12,1% e 2,65 da alimentação em

membrana (119).

Por outro lado, Awono-Ambene et al., em um estudo similar ao anterior, agora com

o An.arabiensis, constataram que não havia diferença significativa entre os métodos,

pois as taxas de infecção por mosquitos eram (10 % versus 11,3 %). Ambos estudos

relataram haver boa relação entre os dois métodos e destacaram a preferência dos

voluntários participantes da pesquisa em fornecer o sangue para alimentação artificial

do que sujeitarem-se às picadas dos mosquitos, como ocorre na alimentação direta

(96).

Em outro estudo, Van Der Kolk et al., utilizaram a membrana de parafilme para

otimizar os ensaios com membrana de alimentação padronizada na redução da

transmissão de malária. Ressaltando nesses estudos também a importância do tipo de

membrana para o sucesso nos obejtivos previamente propostos (101).

Bousema et al., em um estudo multicêntrico, realizado em cinco países diferentes

da Àfrica ocidental e central (Mali, Senegal, Gambia, Camarões e Papua Nova Guiné),

constataram que a alimentação direta nos animais é mais sensível para detectar o

potencial da transmissão humana para o mosquito An. gambiae s.s. e An. arabiensis.

Os autores ainda sugeriram algumas medidas para melhorar a alimentação artificial

através de membrana, como, respirar perto do alimentador ou cobrir o alimentador com

materiais que contêm odor humano (93).

Um estudo realizado em Burkina Faso por Sangare et al., com a infecção

experimental de An. gambiae por P. falciparum através de alimentação por membrana

de parafilme revelou que o sangue pré-aquecido não tinha qualquer efeito sobre a

longevidade e fecundidade das fêmeas, por conseguinte não influenciava na

quantidade de sangue ingerido (53).

Page 42: Brigite Stela Afonso de Almeida

22

Ressalta-se ainda o uso de método de alimentação artificial em espécie

pertecente a gênero diferente, como Rocha et al. que verificando a viabilidade e a

eficiência da membrana de silicone na alimentação dos triatomíneos Rhodnius pictipes,

mostraram que pode-se otimizar a manutenção de colônias do R. pictipes em

laboratório através da alimentação artificial com o uso de membrana de silicone,

destacando a praticidade no manuseio desta membrana, o seu baixo custo e a

similaridade observada no comportamento dessa espécie em relação à membrana e a

alimentação direta na pele dos hospedeiros (102).

Portanto, são relevantes as propostas que busquem alternativas de melhoria na

aceitação da fonte de alimentação artificial pelos mosquitos, uma vez que o método

direto tem como desvantagens, a não aceitabilidade de voluntários, por haver

possibilidade de reações alérgicas cutâneas, devido as picadas dos insetos. O que

poderia levar ao uso de anti-histamínicos, além disso há burocrácia ética para inclusão

de indivíduos cobaias nesses tipos de pesquisas (93).

Uma colônia produtiva de insetos é usada para a realização de diferentes estudos

(biologia, taxonomia, interação parasito – hospedeiro, controle de populações vetoras e

de transmissão de doenças, entre outras), os quais poderão fornecer subsídios para

novas estratégias de controle das populações de mosquitos e transmissão de espécies

de Plasmodium causadores de malária. Entretanto a realização desses tipos de estudos

requer que a colônia esteja em condições ótimas, com uma produção estável de larvas

e adultos para se poder planejar e executar os experimentos.

O interesse particular em se estudar o An. aquasalis, deve-se ao fato deste ser um

dos vetores envolvidos na transmissão de malária nas Américas, principalmente no

Brasil e também por ser uma espécie que já sendo criada em laboratórios e utilizada

como modelo experimental em vários estudos sobre a interação parasito hospedeiro,

observa-se flutuações populacionais ao longo da sua criação em laboratórios.

Provavelmente, existem alguns parâmetros sobre a biologia dessa espécie que

precisam ser melhor elucidados e adaptados considerando as condições de cada

laboratório.

Page 43: Brigite Stela Afonso de Almeida

23

Sendo assim, neste trabalho avaliou-se alguns parâmetros do desenvolvimento e

da reprodução de An. aquasalis, submetidas a alimentação em fontes sanguíneas

distintas, visando-se a obtenção de informações que possam aprimorar o

estabelecimento de uma colônia desta espécie no laboratório, e sobretudo que auxilie

nas tentativas de estabelecimento de outras espécies, particularmente An. darlingi, o

principal vetor de malária no Brasil que até o momento não foi possível a sua

colonização por um número extenso de gerações.

Page 44: Brigite Stela Afonso de Almeida

24

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar o efeito das diferentes fontes de repasto sanguíneo na biologia de

Anopheles aquasalis colonizado em laboratório.

2.2 Específicos

• Descrever o comportamento alimentar de An. aquasalis submetidas as diferentes

fontes de repasto sanguíneo animal através de métodos direto e indireto de

alimentação.

• Avaliar o efeito das diferentes fontes de alimentação sanguínea sobre a

longevidade e fecundidade do mosquito.

• Fazer o acompanhamento do “fitness” da prole considerando a quantidade e

sobrevida das larvas, pupas e adultos durante duas gerações.

Page 45: Brigite Stela Afonso de Almeida

25

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Modelo de estudo

Esse foi um estudo experimental realizado no insetário Dr. Agostinho Cruz

Marques situado na Gerência de Entomologia (GENT) da Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) na cidade de Manaus, Amazonas.

3.2 Aspectos éticos

O presente estudo faz parte de um projeto mais amplo intitulado” Manutenção de

colônias de insetos transmissores de doenças” aprovado pela Sociedade Brasileira de

Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) segundo o protocolo nº P-20/10.4. Foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FMT-HVD sob o registro nº

348.100 (Anexos A e B).

3.3 Universo de estudo 3.3.1 Mosquitos

Foram utilizados neste estudo 6.000 fêmeas de An.aquasalis com idade entre 3

a 7 dias, obtidas da colônia de An. aquasalis já estabelecida na FMT-HVD, cuja a cepa

é oriunda de uma população colonizada de mosquitos do laboratório de Fisiologia e

Controle de Artrópodes Vetores (LAFICAVE), FIOCRUZ, Rio de Janeiro (64).

3.4 Procedimentos 3.4.1 Fontes de repasto sanguíneo

As fontes de repasto sanguíneo utilizados neste trabalho foram camundongos da

espécie Mus musculus pesando aproximadamente 20 gramas e criados em biotério,

hamster da espécie Mesocricetus auratus, com aproximadamente 40 gramas e criados

Page 46: Brigite Stela Afonso de Almeida

26

em biotério, galinhas (Gallus gallus) possuindo diferentes pesos e adquiridas em

comércios da região centro-oeste de Manaus e voluntários humanos (Homo sapiens).

Quadro 1 - Número de animais utilizados (camundongo, hamster e galinha) durante o

período do estudo.

Fontes/ Métodos Camundongo Hamster Galinha

Direto 12 un* 12 un 10 un

Indireto 24un 12un 10un

*(un) – unidades

3.4.2 Tratamento dos animais antes do repasto

Camundongo, hamster e galinha foram previamente anestesiados com uma

solução de trabalho baseada na combinação de 0,2 mL de Ketamina (fr-ampola

50mg/mL), 0,8 mL de Xilazina (fr-ampola de 20mg/mL) e 3 mL de PBS à 1x. Cada

cobaia tinha seu peso estimado e as doses a serem administradas eram calculadas em

função da concentração de Xilazina e Ketamina, conforme demonstrado no Quadro 2.

As doses foram aplicadas intraperitoneal (I.P) e intramuscular (I.M) segundo Paiva et

al., e Shinya, com algumas modificações (103, 104).

Os cobaias galinha, camundongo e hamster foram utilizadas uma única vez, e

após a utilização desses animais na alimentação direta e indireta, os mesmos foram

sacrificados por meio da técnica de deslocamento cervical.

Quadro 2 - Relação de anestésicos/doses aplicados em animais.

Espécie Xilazina (mg/Kg)

Ketamina (mg/Kg)

Via de administração

Volume da solução administrado (mL)

Camundongo* 6-10 75-100 Intra-peritoneal 0,1 Hamster* 6-10 75-100 Intra-muscular 0,2 Galinha* 6-10 75-100 Intra-muscular 1,0

(*) Nota: Para cada animal foi estimado um peso médio. Camundongo 20g, hamster 40g e galinha 2500g.

Page 47: Brigite Stela Afonso de Almeida

27

3.4.3 Avaliação da preferência alimentar 3.4.3.1 Alimentação direta em animais

Quatro grupos de 100 fêmeas de An. aquasalis entre 3 a 5 dias de idade foram

separadas e mantidas em jejum (retirada da solução açucarada) por 24 horas antes da

alimentação. Cada grupo foi colocado em um pote de alimentação coberto com tecido

(tipo filó), o qual ficaram em contato direto com a pele de uma das fontes por um tempo

de uma hora. Os animais (camundongo e hamster) foram colocados com o ventre sobre

o pote de alimentação contendo mosquitos, como demonstrado na figura 7. Enquanto a

galinha, depenou-se uma pequena área do seu corpo para depois colocar o pote com

os mosquitos (Figura 7) (91) modificado.

Em alimentação direta na fonte humano, o voluntário ofereceu uma região do seu

antebraço para contato com os mosquitos retidos no pote.

Figura 5 - Alimentação direta em camundongo (a) e galinha (b). Fonte: Acervo pessoal, 2014.

Após a alimentação, as fêmeas ingurgitadas foram separadas e mantidas com

solução açucarada a 10%. As fêmeas foram aproveitadas para a manutenção da

colônia de Anopheles aquasalis conforme o procedimento operacional padrão (Anexo

8.4).

(a) (b)

Page 48: Brigite Stela Afonso de Almeida

28

3.4.3.2 Alimentação indireta – Ensaios de membrana (parafilme)

Foram utilizados quatro grupos de 100 fêmeas de An. aquasalis considerando as

mesmas condições descritas acima para a alimentação direta. A quantidade de 1 mL de

sangue de cada animal foi coletada com agulha de insulina, sendo que em camundongo

e hamster, a coleta foi feita por punção cardíaca, enquanto a galinha e humano, por

punção venosa.

O sangue coletado das diferentes fontes foi acondicionado em tubo de hemólise

Vacutainer contendo heparina. Posteriormente, procedeu-se a alimentação indireta,

através de um sistema de alimentação artificial.

O sistema de alimentação artificial consiste de um aparelho de Banho-Maria

acoplado a um sistema de circulação de água ligado ao alimentador artificial de vidro

através de mangueiras, conforme mostrado na figura 8. A circulação de água aquecida

mantém a temperatura do sangue entre 37ºC a 40ºC e os alimentadores de vidro

envoltos com uma membrana de parafilme constituem a região de alimentação

sanguínea e ficam em cima dos potes contendo os mosquitos para alimentação,

segundo Das et al. modificado (105).

Importa frisar que, para a eficácia de alimentação indireta é necessário que se tome

alguns cuidados em relação a membrana a ser usada. Se for parafilme, tem que estar

bem esticada, pelo menos três vezes do tamanho inicial (Comunicação pessoal) de

modo a facilitar a atividade hematófagica dos mosquitos. Ou seja, a membrana deve

estar relativamente fina para os mosquitos poderem perfurá-lo facilmente, sem que

ocorra o vazamento (91).

Aos alimentadores de vidro envoltos com uma película de parafilme, foram

adicionados cerca de 500 µL de sangue coletado dos cobaias, os quais foram

colocados sobre o pote contendo os insetos, para que os mesmos pudessem se

alimentar (Figura 8). Cada grupo foi alimentado indiretamente por cerca de uma hora e

passado o tempo para alimentação às fêmeas ingurgitadas foram contadas e separadas

das fêmeas não ingurgitadas, conforme a técnica utilizada pelo Sangare et al. com

algumas modificações (53, 105).

Page 49: Brigite Stela Afonso de Almeida

29

Figura 6 – Sistema de alimentação artificial ou indireta. Fonte: GENT, 2013.

3.4.3.3 Quantidade de sangue ingerido

A quantidade de sangue que cada fêmea ingeriu foi calculada pela diferença de

seu peso antes e depois do repasto sanguíneo. Para esta fase, pesou-se com auxílio de

uma balança de precisão analítica, 50 fêmeas não alimentadas e 50 fêmeas

alimentadas direta ou indiretamente com diferentes fontes em tubos de Falcon

diferenciados conforme a fonte de alimentação; previarmente as fêmeas foram

adormecidas em freezer -20°C, por 5 minutos, a fim de imobilizá-las e também de

impedir a digestão do sangue ingerido, adaptado de Deane et al. (46).

Após cada alimentação foi calculada a taxa de alimentação por cada fonte: Taxa

de alimentação sanguínea = (número de fêmeas alimentadas / número de fêmeas

testadas) x 100% , de acordo com Deng et al (88) .

3.4.4 Efeito das diferentes fontes sobre a longevidade do An. aquasalis

Foram realizados três replicatas de 8 grupos de 100 fêmeas (n=2400) com 3 a 5

dias de idade, para cada uma das fontes do repasto sanguíneo e para cada método de

alimentação (direto e indireto). Após a alimentação as fêmeas ingurgitadas, foram

Page 50: Brigite Stela Afonso de Almeida

30

separadas em gaiolas de papelão medindo 17 cm de diâmetro X 17 cm de altura com a

parte superior revestida com tela de Nylon preta e alimentadas com solução açucarada

a 10%, de acordo com a metodologia adaptada de Sattabongkot et al.(118).

Diariamente as fêmeas mortas eram contadas e retiradas das gaiolas. Também era feito

o registro diário da temperatura (26 ± 2 oC) e da umidade relativa (70 ± 20%).

3.4.5 Efeito das diferentes fontes sobre a fecundidade do An. aquasalis

Um total de 1200 fêmeas, sendo três replicatas de 8 grupos de 50 fêmeas com a

idade de 5 a 7 dias, foram submetidas a alimentação sanguínea em cada uma das

fontes animais e através dos métodos (direto e indireto). Após a alimentação, as fêmeas

ingurgitadas foram separadas, colocadas em gaiolas e mantidas por três dias,

oferecendo-se solução açucarada a 10%.

Para obtenção de ovos, após três dias, as fêmeas ingurgitadas foram

transferidas individualmente em um copo de plástico para postura, forrado com tiras de

papel filtro nas laterais internas para evitar que os ovos se dessecassem quando

aderissem à superfície do copo, recoberto com tecido de Nylon (filó) com um pequeno

orifício (que permitia a introdução dos mosquitos) contendo água desclorada salinizada

(0,2 g de sal marinho). As fêmeas permaneciam ali durante três dias consecutivos.

Conforme o procedimento da manutenção da colônia de An. aquasalis prescrito (Anexo

8.4) e a técnica descrita por Santos et al. com algumas modificações (106).

Após três dias da transferência, as fêmeas vivas foram retiradas com o auxílio de

um capturador de Castro (aspirador) e as mortas também foram removidas usando uma

pinça. Enquanto se retirava as tiras de papel filtro contendo ovos para a contagem

destes com auxílio de estereoscópio (lupa). Também nos copos de posturas onde se

observou a existência de ovos e de larvas (L1), realizou-se a contagem dos mesmos.

As fêmeas que realizaram ou não a postura, e as que se mantiveram vivas ou

mesmo mortas mas ainda íntegras, tiveram seus ovários dissecados para verificar a

presença ou não de ovos retidos, como forma de quantificar as fêmeas que tinham

feito a ovipostura e destas quais teriam ovos desenvolvidos ainda retidos no abdome.

Page 51: Brigite Stela Afonso de Almeida

31

Dessa forma, o número total de ovos postos por fêmea e de ovos retidos foi

calculado considerando-se somente as fêmeas que fizeram a oviposição.

3.4.5.1 Acompanhamento da prole por duas gerações

A cinética de emergência dos alados foi feita seguindo os procedimentos de

criação dos anofelinos utilizado na rotina do laboratório (Vide Anexo 8.4). Três dias após

o início das posturas individuais, e da contagem, os ovos, as larvas de cada grupo de

fêmeas foram colocados em bacias, onde eram adicionadas ração para peixe

(Tetramin® Tropical Flakes) pulverizada de uma a duas vezes ao dia caso fosse

necessário, para manter o crescimento diário das larvas até a emergência das pupas.

Ao longo desta fase, foram observados todos os cuidados de limpeza diária das

bácias, reposição de água e as larvas eram separadas por tamanho e a troca das

bácias com larvas era realizada três vezes na semana.

As pupas, por sua vez, eram recolhidas e contadas diariamente com auxílio de

pipetas de Pasteur, colocadas em pequenos copos de plásticos com uma pequena

quantidade de água clorada contendo solução de sal marinho à 10% e inseridas em

gaiolas de papelão juntamente com solução açucarada a 10% até a emergência dos

adultos. Diariamente, o número de machos e fêmeas foi quantificado separadamente,

até o aparecimento do último adulto, sendo feito o acompanhamento e a mortalidade de

cada muda.

As gaiolas com adultos também foram inspecionadas diariamente, e o

acompanhamento se estendeu por duas gerações (F0 e F1). Sendo que a cada ciclo

gonotrófico, as fêmeas eram alimentadas com as fontes de repastos dos cobaias

envolvidos na pesquisa repetindo-se o experimento da fecundidade.

3.5 Análise estatística dos dados

Todos os ensaios foram realizados em triplicata, tomando-se as medidas de

temperatura (26 ± 2oC) e umidade relativa do ar (70 ± 20%) nas salas onde estava

Page 52: Brigite Stela Afonso de Almeida

32

sendo realizado o experimento. Os dados foram tabulados usando o programa

Microsoft Office Excel 2007. Foi utilizado o teste não paramétrico (ANOVA) com

comparação pelo método de Tukey para avaliação da preferência, sobrevida e

fecundidade.

A correlação de Pearson foi utilizado para correlacionar a quantidade de sangue

ingerido com o número de fêmeas ingurgitadas em cada fonte e o número de ovos

postos. Também foi feita a regressão linear entre a longevidade, temperatura e

umidade.

A normalidade foi avaliada através do programa Bioestat 5.3 (teste de Shapiro

Wilk). E o nível de significância considerado foi de 95%.

Page 53: Brigite Stela Afonso de Almeida

33

4. RESULTADO 4.1 Comportamento alimentar de An. aquasalis submetidas as diferentes fontes

de repasto sanguíneo animal através de métodos direto e indireto de alimentação.

Foram utilizadas um total de 3.600 fêmeas de An. aquasalis com idade de 3 a 5

dias para a descrição do comportamento alimentar. Das quatro fontes alimentares

ofertadas, observou-se que as fêmeas se alimentaram com maior frequência de sangue

humano tanto, durante a oferta da fonte direta como indiretamente, uma média de 96 e

75 fêmeas (96% e 75%, respetivamente). O menor percentual foi observado entre as

fêmeas alimentadas com sangue de galinha, com 58 e 56%. Observou-se diferença

estatística significativa (p = 0,0082) na comparação entre as fontes diretas em humano

versus galinha (direto e indireto).

Com relação, a quantidade de sangue ingerido, constatou-se maior quantitativo

3,11 mg e 3,40 mg entre as fêmeas que se alimentaram de galinha e o menor para

humano (média de 2,28 mg e 0,98 mg para métodos direto/indireto) (Tabela 1).

Quando avaliou-se estatisticamente a quantidade de sangue ingerido pelas

fêmeas alimentandas com diferentes tipos de sangue, não se encontrou diferenças

significativas entre as fontes de alimentação sanguínea (p = 0,052).

Tabela 1 - Média de fêmeas ingurgitadas e da quantidade de sangue ingerido em

miligrama por fonte alimentar.

Variável Fonte Humano/EP Hamster/EP Camundongo/EP Galinha/EP

Fêmeas

ingurgitadas

Direto 96±07 83,3±4,6 78,7±8 58±8,5

Indireto 75±9,8 62.7±13,1 56±10,8 56±10,8

Sangue

ingerido

Direto 2.28±0.73 1.87±0.37 2.25±0.35 3.11±1.30

Indireto 0.98±0.69 2.83±0.95 2.09±0.95 3.40±0.66

EP= Erro padrão

Page 54: Brigite Stela Afonso de Almeida

34

Comparando o número de fêmeas ingurgitadas e a quantidade de sangue ingerido

por elas, a análise estatística não verificou nehuma correlação significativa (p = 0,232).

4.2 Efeito de diferentes fontes de alimentação sanguínea sobre a longevidade.

Quanto à sobrevida das fêmeas submetidas a diferentes regimes alimentares, e

avaliada pelo acompanhamento da taxa de mortalidade ao longo do tempo, verificou-se

que a mortalidade foi maior para alimentação com sangue de humano, e menor para

galinha indiretamente ( Figuras 8).

Figura 7 - Longevidade de fêmeas alimentadas com diferentes fontes .

Observou-se que do 10º dia em diante, haviam menos de 50 % de fêmeas vivas,

exceto para as fêmeas alimentadas com sangue de camundongo e indiretamente em

galinha (Tabela 2), não havendo diferença significativa para a longevidade de fêmeas

expostas a diferentes condições alimentares sanguíneas (p= 0,740).

De uma maneira geral, as médias de sobrevivência foram relativamente

próximas para as fêmeas alimentadas com fontes sanguíneas diferentes, variando entre

24º dias para alimentação com galinha e 18º dias para humano (Figura 9). Não se

Page 55: Brigite Stela Afonso de Almeida

35

observou nenhuma correlação entre preferência alimentar e longevidade e quantidade

de sangue e longevidade (ADC p= 0,27; AIDC p= 0,41; ADHA p= 0,29; ADHA p= 0,80; ADHU

p= 0,86; AIDHU p= 0,70; ADG p= 0,46; AIDG p= 0,99).

Tabela 2 - Média de fêmeas vivas em porcentagem ao longo do experimento por cada

fonte. Fonte

Dia Humano

D Humano

ID Hamster

D Hamster

ID Camundongo

D Camundongo

ID Galinha

D Galinha

ID

3 86.3 84.9 71 66.5 89.6 76.3 76.3 85.5

6 61.6 68.7 52.3 53.4 79.7 72 55 76.1

7 57.3 58.9 49 50.7 76.6 70.4 49 73.9

10 35.5 49.4 39 43.7 65 61.6 36.9 62.7

13 14.8 28.7 18.4 24.7 42.1 45.2 18.3 48.1

16 4.7 12.3 6.3 12.7 25.5 28.3 9.1 32.7

17 2 7.1 3.7 9.3 19.4 22.3 6.9 25

20 0 2.3 0 2.7 4.3 4.5 1 5.6

23 0 0 0 0 0 0 0 1.2

Figura 8 - Tempo médio de sobrevivência de fêmeas alimentadas com diferentes fontes sanguíneas.

Humano D

Humano ID

Hamste

r D

Hamste

r ID

Camundongo D

Camundongo ID

Galinha D

Galinha I

D0

10

20

30

Fonte

Tem

po (d

ias)

Page 56: Brigite Stela Afonso de Almeida

36

3 Efeito de diferentes fontes de alimentação sanguínea sobre fecundidade do mosquito

Do total de ovos postos durante a geração F0, 41036, foi registrado maior

número de ovos postos nas fêmeas alimentadas com sangue de hamster

indiretamente (6933) seguido de camundongo direto (6805) e menor (3382)

naquelas que tinham-se alimentado em galinha indiretamente, e excecionalmente

nesse caso, não houve postura para obtenção da geração F1. Ainda com relação

a geração F1, o número total de ovos obtidos foi de 55062, e destes novamente as

fontes que mais se conseguiu maior número de ovos foram, 22424 para

camundongo D e 8800 para hamster ID (Tabela 3).

Tabela 3 - Valores totais de ovos postos e percentuais de larvas, pupas, fêmeas e machos em cada geração de estudo por diferentes fontes de alimentação sanguínea.

Fonte/ Método Geração Ovos Postos Larvas % Pupas % Fêmeas % Machos %

Camundongo D F0 6805 2264 (33,3) 1491,0 (65,9) 746,0 (50,0) 694,0 (46,5) F1 22424 8544 (38,1) 3035,0 (35,5) 1479,0 (48,7) 1361,0 (44,8)

Hamster D F0 6235 2015 (32,3) 1187,0 (58,9) 456,0 (38,4) 415,0 (35,0) F1 6768 2255 (33,3) 1058,0 (46,9) 398,0 (37,6) 419,0 (39,6)

Humano D F0 4476 1616 (36,1) 527,0 (32,6) 321,0 (60,9) 232,0 (44,0) F1 3937 1272 (32,3) 898,0 (70,6) 356,0 (39,6) 385,0 (42,9)

Galinha D F0 4087 1464 (35,8) 569,0 (38,9) 443,0 (77,9) 103,0 (18,1) F1 3214 1336 (41,6) 378,0 (28,3) 130,0 (34,4) 121,0 (32,0)

Camundongo ID F0 3998 1024 (25,6) 529,0 (51,7) 214,0 (40,5) 302,0 (57,1) F1 5473 1489 (27,2) 183,0 (12,3) 91,0 (49,7) 92,0 (50,3)

Hamster ID F0 6933 1545 (22,3) 1074,0 (69,5) 456,0 (42,5) 527,0 (49,1) F1 8800 5512 (62,6) 1049,0 (19,0) 530,0 (50,5) 465,0 (44,3)

Humano ID F0 5120 1714 (33,5) 929,0 (54,2) 456,0 (49,1) 383,0 (41,2) F1 4446 1149 (25,8) 842,0 (73,3) 403,0 (47,9) 384,0 (45,6)

Galinha ID F0 3382 942 (27,9) 115,0 (12,2) 66,0 (57,4) 46,0 (40,0) F1 0 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Entretanto, na geração F0, observou-se uma semelhança entre as médias

de fêmeas ingurgitadas, posturas e oviposições. As fêmeas que se alimentaram

indiretamente com o sangue de hamster tiveram as maiores médias de

ingurgitação (34/50; 68%), de oviposturas (16/ 27; 59%, respetivamente) e de ovos

Page 57: Brigite Stela Afonso de Almeida

37

postos (2311 ovos), exceto ao grupo que se alimentou de sangue de galinha

indiretamente, onde observou-se menor número de ingurgitadas (22/50; 44%), e

consequentemente menor quantidade de fêmeas colocadas para posturas,

oviposição e ovos postos (14/22, 64%; 5/14, 38%; 1127) (Figura 11).

Com relação à ovos retidos pelas fêmeas que ovipuseram, constatou-se

que as fontes indireta de galinha e direta de humano tiveram maiores médias de

fêmeas com ovos retidos, sendo 4,0 e 5,0 fêmeas (50% e 36%, respetivamente).

Enquanto que as menores médias de ovos retidos foram encontradas entre as

fêmeas alimentadas indiretamente com o sangue de humano (2,7/21%) e

diretamente em galinha (2,0/26%) (Figura 11).

Figura 9 – Valores médios de fêmeas ingurgitadas, submetidas à postura, que

ovipuseram, ovos retidos e ovos postos na geração F0 pelos métodos direto e

indireto.

De maneira geral, observou-se um aumento na média de ovos postos pelas

fêmeas durante as gerações F0 a F1 nas quatro fontes de sangue testadas,

entretanto este aumento foi mais evidente entre as fêmeas que se alimentaram

Page 58: Brigite Stela Afonso de Almeida

38

com sangue de camundongo (2268 a 7475 ovos), exceto as fêmeas alimentadas

de sangue de galinha que teve uma queda abrupta entre uma geração e outra

(1127 e 0), resultando numa média de 314 larvas, 38 pupas e 37 adultos (22

fêmeas e 15 machos) (Tabela 3 e Figura 12).

No repasto direto em camundongo (F0 e F1) obteve-se média de 755 / 2848

larvas L1 (33 e 38 %); 497 e 1012 pupas (66 e 36 %); 480 e 947 adultos (97 e

94%), destes, 52% eram fêmeas e 48% machos, em cada geração. Enquanto que

na alimentação direta em hamster, conseguiu-se 672 / 1128 larvas L1 (32 e 54 %);

358 e 350 pupas (59 e 47%); 290 e 409 adultos (73 e 77%) sendo 52 % fêmeas e

48 % machos (geração F0) e 49% fêmeas e 51% machos (geração F1) conforme

ilustrado na Tabela 3.

Nas análises estatísticas, encontrou-se diferença significativa quando foi

feita a correlação entre o número de fêmeas que ovipuseram e o número de ovos

postos para as fontes camundongo (p=0,021) e galinha (p=0,023) através do

método direto, nas demais fontes não se observou diferença (camundongo ID p=

0,26; Hamster D p= 0,20; Hamster ID p=0,30; Humano D p =0,28; Humano ID

p=0,59; Galinha ID p= 0,40).

(b)

(a)

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39

Figura 10 - Valores médios de fêmeas ingurgitadas, ovos postos, larvas, pupas,

adultos (fêmeas e machos) em cada geração de estudo por diferentes fontes de

alimentação sanguínea (a) alimentação direta e (b) alimentação indireta.

(b)

Page 60: Brigite Stela Afonso de Almeida

40

5. DISCUSSÃO

Esse estudo demonstrou que o mosquito Anopheles aquasalis tem um

comportamento eclético e oportunista com variações na preferência e no método

de oferta da fonte sanguínea.

As fontes de repasto sanguíneo foram testadas individualmente e em dias

diferentes, observando-se que as fêmeas de An. aquasalis se alimentaram da

fonte que se encontrava disponível no momento do experimento, inferindo que

esse comportamento possa ter favorecido o hábito alimentar variado desse

mosquito.

Essa observação também foi feita por Deane et al. que analisaram a

preferência alimentar de 1.215 espécimes de An. aquasalis obtidos de colônia e

armazenados em diferentes gaiolas que pernoitaram juntamente com diferentes

iscas (boi, homem, cão, gato, porco, carneiro, cavalo e galinha), pelo método da

precipitina. Os autores observaram que esse mosquito sugou as diferentes iscas

(31), o que também foi constatado no presente trabalho. No entanto, Deane et. al.

demonstraram que os valores absolutos de fêmeas alimentadas em boi são

maiores, mostrando a preferência por esta fonte em detrimento ao sangue de

galinha, que apresentou menor valor absoluto de fêmeas alimentadas, acordando

com a menor taxa de fêmeas alimentadas encontrada neste estudo.

Da Silva et al. e Flores-Mendonza et al., empregando o mesmo método dos

autores suprareferido, também verificaram hábitos diferentes entre os espécimes

de An. aquasalis, embora tivessem apresentado teste positivo em maior

quantidade para o sangue bovino e em menor quantidade para o sangue humano

(36, 33).

Contraditoriamente, no atual estudo feito em laboratório observou-se uma

tendência a maior valor absoluto das fêmeas alimentadas na fonte humana, mas

essas observações, não devem ser levadas em conta, uma vez que o presente

Page 61: Brigite Stela Afonso de Almeida

41

estudo não foi contemplado com os mesmos animais citados nos trabalhos

anteriores.

Nesse estudo constatou-se que as fêmeas se alimentavam com mais facilidade

no humano do que nas outras fontes, provavelmente porque o homem possui uma

área de exposição corpórea maior que as outras fontes, e na maioria das vezes

essa área já é depilada, propiciando às picadas de mosquitos.

Na literatura, estudo realizado sobre o comportamento alimentar de outro grupo

de inseto por Chagas et al.na cidade de Manaus, demonstrou que as fêmeas de

Lutzomyia cruzi (vetor de Leishmania chagasi) alimentavam-se mais facilmente e

preferencialmente em humanos (107).

Swami, Srivastava., através do teste de precipitina revelaram que o An.

subpictus tinha preferência mais pelo sangue bovino (57,44 %) do que sangue de

humano (17,02%), enquanto que o An. culicifacies e An. stephensi preferiram

sangue humano (72% e 53,8%), e por último o An. annlaris, somente sangue

bovino (100%) (60).

Já o Olayemi et al. investigando a influência do tipo de alimentação sanguínea

na reprodução do mosquito An. gambiae em Minna, na Nigéria, viram que dos

sete animais vertebrados (humano, cão, bovino, suíno, carneiro, cabra e galinha)

que serviram de fonte alimentar através do método indireto, o sangue humano

teve maior número de fêmeas ingurgitadas (94±3,36%), por conseguinte foi o

melhor em termos de ovipostura e taxa de eclosão dos ovos por fêmeas. O que

reforça os estudos sobre a bionomia deste vetor quanto a sua alta antropofilia e

competência vetorial (108).

Phasomkusolsil et al. observaram diferentes taxas de alimentação em cinco

espécies distintas de mosquitos colonizado em laboratório (Anopheles dirus, An.

cracens, An. minimus, An. sawadwongporni e Aedes aegypti). Das quatro fontes

estudadas, o sangue de hamster esteve entre as melhores fontes, uma vez que

teve maior número de fêmeas alimentadas entre as espécies e as médias

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42

percentuais encontraram-se distribuídas da seguinte maneira: 91,3 % An. cracens;

89,7% An. minimus; 70,3% An. sawadwongporni e 95,3% Ae. aegypti. Não

obstante, a maior média obtida com sangue humano foi observada entre os

mosquitos An. dirus (95%) (109) .

Ressalta-se que no presente estudo, as médias de fêmeas do mosquito An.

aquasalis que se alimentaram em humano foram 96% direto e 75% indiretamente,

enquanto em hamster, 83,3% e 62,7%, então as médias estão ligeiramente

semelhantes com as médias encontradas pelos autores supracitados. A análise

estatística apresentou significância entre número de fêmeas ingurgitadas para as

fontes humana e galinha (p =0.0082).

Em relação a quantidade de sangue ingerido pelas fêmeas, embora as

análises estatísticas não tenham demonstrado quaisquer diferença significativa, os

dados absolutos mostraram que aparentemente, as fêmeas demoram mais tempo

para digerir o sangue de galinha, em vista do maior quantitativo de sangue

observado nesta fonte.

Salienta-se as diferenças inerentes ao sangue das fontes testadas, pois as

hemácias (os eritrócitos) do sangue de galinha são nucleadas enquanto que nos

demais mamíferos avaliados no estudo são anucleadas (71), talvez isso possa

justificar esses achados, uma vez que o sangue de galinha teria maior densidade

eritrocitária, por isso teria maior peso. Contudo, os resultados obtidos induzem a

inferir que o sangue ingerido pelas fêmeas não é proporcional ao número de

fêmeas ingurgitadas, ou seja, essas variáveis são independentes e que elas

dependem do tipo de sangue ingerido, tendo em conta que não foi observado

nenhuma associação (p=0,232).

De maneira geral, a longevidade das fêmeas alimentadas com fontes

diferentes foi muito semelhante, entretanto fêmeas alimentadas em humano,

apresentaram maior mortalidade e as que se alimentaram em galinha,

sobreviveram um pouco mais. É possível que estes achados estejam

relacionados, com a quantidade de sangue ingerido por essas fêmeas, como foi

Page 63: Brigite Stela Afonso de Almeida

43

observado. Considerando que alguns estudos sugerem maior longevidade em

fêmeas que se alimentam de maior quantidade de sangue em razão do valor

nutritivo ingerido (77).

Constatou-se que a mortalidade foi de 50% a partir do décimo dia para a

maioria das condições alimentares ofertadas, exceto as fontes camundongo e

galinha pelo método indireto. Na literatura, anofelino adulto que alcança vigésimo

dia tem grandes possibilidades de transmitir o parasito da malária (63).

Todavia, relativo a longevidade de An. aquasalis em laboratório a melhor

fonte a ser usada em estudo desta natureza é a galinha, uma vez que as fêmeas

mostraram-se um pouco mais longevas.

Na avaliação da fecundidade utilizou-se fêmeas com idade entre 5 a 7 dias,

de forma a se garantir maior número de fêmeas inseminadas para o estudo. Uma

vez que o tempo de contato entre machos e fêmeas durante a cópula livre é

importante para a ampliar a possibilidade de inseminação das fêmeas,

aproveitando a capacidade dos machos em efetuar a cópula livremente, com um

tempo mínimo de contato de cinco noites (74, 87).

Nesse contexto, Baker e Arruda et al. em estudos sobre a criação de An.

aquasalis e An. albitarsis em laboratório, constaram maior índice de fêmeas

inseminadas utilizando machos com a idade variando entre oito e cartoze dias. E

não observaram variação da inseminação em relação a idade das fêmeas.

Entretanto, esses autores conseguiram colonizar essas espécies apenas até as

gerações F2 e F4 respetivamente, devido aos problemas com microrganismos

(104, 101).

Com relação à viabilidade de ovos postos, avaliada pelo percentual de

larvas emergidas, os dados sugerem que a emergência das larvas não é

proporcional à eclosão dos ovos. A média de ovos postos por fêmeas

aparentemente mais elevada na fonte de camundongo não revelou diferença

significativa em relação as outras fontes testadas. Entretanto, a análise de

Page 64: Brigite Stela Afonso de Almeida

44

correlação entre o número de fêmeas que ovipuseram e o número de ovos postos

foi significante para as fontes camundongo (p=0,021) e galinha (p=0,023) através

do método direto, nas demais fontes não se observou diferença.

Durante o desenvolvimento de ovócitos, pode ocorrer reabsorção de

folículos ovarianos por fêmeas de alguns anofelinos, e fatores, a exemplo da

quantidade de sangue ingerido (sua composição protéica), o status nutricional das

fêmeas, a virgindade e escassez de reserva energética podem estar envolvidos

neste processo (86, 93, 136). Tendo em conta que os aminoácidos e pequenos

peptídeos provenientes da digestão do sangue são indispensáveis para que se

desencadeie a vitelogênese que resultaria no acúmulo de vitelo nos ovos (110).

Estes fatores podem justificar os achados neste estudo, em relação aos

ovos desenvolvidos encontrados nos ovários de muitas fêmeas. Aliado a isso tudo,

pode-se inferir que as fêmeas de An. aquasalis não se adaptaram ao aparato

utilizado para postura individual no experimento, sugerindo que essa forma de

oviposição não seja a mais adequada para ser utilizada na rotina de criação desta

espécie em laboratório, sob a hipótese de que a postura coletiva das fêmeas

possa produzir resultados de ovipostura mais satisfatórios.

Por outro lado, o número de fêmeas que emergiram foi relativamente maior

que os de machos, principalmente na geração F1, e notou-se que os machos

foram menos longevos, fato que pode ter influenciado na inseminação das

fêmeas, resultando numa baixa fertilidade e reduzido o número de ovos

encontrados para algumas fontes. Essas observações estão de acordo com o que

já é descrito na literatura a respeito da longevidade dos machos comparado a de

fêmeas. Acredita-se que este seja um aspecto importante, que requer a atenção

na criação de uma colônia de anofelinos em laboratório em função do sucesso de

cópula livre.

É provável ainda que a baixa fecundidade observada em algumas fontes,

esteja relacionado com as possíveis interrupções que podem decorrer ao longo do

ciclo gonotrófico, como má nutrição das fêmeas durante a fase larval, o que

Page 65: Brigite Stela Afonso de Almeida

45

poderia dificultar o processo da oogênese com apenas um repasto, considerando

que havendo uma discordância gonotrófica, alguns vetores necessitariam de mais

de um repasto sanguíneo para se completar a respetiva oogênese e postura (9).

Neste estudo, embora os ensaios tenham sido feito em triplicata, cada tentativa de

alimentação foi realizada uma única vez.

Lyimo et al., relataram que as condições hematológicas do hospedeiro,

como a concentração de hemoglobina, a densidade de células vermelhas, a

composição de aminoácido presente no sangue ingerido pelas fêmeas, podem

interferir no fitness do mosquito. No caso de anemia poderia resultar numa

diminuição da fecundidade (85).

No entanto, Emami et al. mostraram os efeitos de variações de hematócrito

do sangue humano no fitness de outra espécie An. gambiae, ressaltando que esse

vetor ingere em menor quantidade o sangue de baixa densidade eritrocitária (em

trono de 15%) mas, com esse sangue obteve-se maior produção de ovos

(aproximadamente 15%) há mais do que aquele que se alimentou de sangue com

densidade normal (hematócrito de 50%) (111).

Já Vantaux et al. avaliando os efeitos da primeira alimentação sanguínea na

longevidade e fecundidade do mosquito An. coluzzii, constataram que o tipo de

sangue teve influencia significativa na sobrevida das fêmeas (p<0,001),

salientando-se que a maior longevidade foi detectada entre as fêmeas que se

alimentaram de sangue humano (20,26 ± 0,45 dias) e menor para coelho e

porquinho da Ìndia. Porém, os mesmos autores revelaram que o tipo de sangue

não influenciou na fecundidade dos mosquitos (112).

É importante reiterar que algumas questões envolvendo a viabilidade de ovos

depositados pelas fêmeas, poderiam ser contornadas com o exame das

espermatecas, que é feito através da dissecção das fêmeas para verificação da

presença dos espermatozóides na espermateca. Desta forma, se poderia obter o

registro do número de fêmeas inseminadas por posturas e saberia se a cópula

Page 66: Brigite Stela Afonso de Almeida

46

livre tinha sido eficaz para o sucesso da reprodução, mas que não foi possível

avaliar no presente estudo.

Além do mais, não houve a preocupação de se controlar a proporção de

fêmeas e machos nas gaiolas nesse estudo, de certo que pode-se ter desiquílibrio

na proporção de machos e fêmeas nas gaiolas. E para o sucesso de cópula livre,

esta proporção pode ser de 1:1 ou maior para machos (87, 130).

Outro fato importante, é a questão de contaminação por microrganismos, que

podia estar presente na água que era utilizada na manutenção da colônia e até

mesmo na comida, tais como, fungos e bactérias (113).

Durante o período que estava sendo realizado os experimentos, utilizava-se no

laboratório água mineral, desclorada e salinizada para cuidar do fitness,

justamente com o propósito de prevenir também esses tipos de contaminação.

Mas nem sempre se atinge este fim com suceso, além do mais, o controle

microbiológico não era feito nem da água e nem tão pouco da ração, apenas era

possível observar uma grande mortalidade entre os estágios imaturos (L1, pupas)

e os adultos, o que tem representado um desafio para muitos insetários na criação

de mosquitos. Contudo, para os estudos de fecundidade com a espécie An.

aquasalis, as melhores fontes são camundongo e hamster.

5.1 Considerações sobre os resultados dos métodos de oferta de fonte

alimentar

Com relação aos métodos de alimentação, também verificou-se variações, pois

ora alimentação direta parecia melhor, ora alimentação indireta, muito embora a

alimentação diretamente na pele dos animais tenha sido um pouco mais preferida

em alguns experimentos, porém não se observou diferença significativa entre os

métodos direto e indireto; corroborando alguns estudos que demonstraram que

não havia diferença significativa entre esses dois métodos (95, 97).

Page 67: Brigite Stela Afonso de Almeida

47

5.2 Considerações finais

Portanto, o conhecimento dos hábitos alimentares dos mosquitos, reveste-se

de grande importância para o estabelecimento da colônia de uma determinada

espécie em laboratório, bem como para avaliação da capacidade vetorial desses

insetos à nível epidemiológico, e constitui uma grande ferramenta no controle de

doenças de transmissão vetorial, como a malária.

Os dados gerados nesse estudo poderão ajudar na implementação de novas

estratégias de criação de anofelinos na condição laboratorial e desta forma

aprimorar a colônia para realização de mais estudos consecutivos.

Esse é o primeiro trabalho que avalia a preferência e o desenvolvimento de An.

aquasalis submetidas a fontes de alimentação sanguínea distintas em laboratório,

acredita-se que mais estudos são necessários de forma que se possa ter dados e

por conseguinte conclusões mais consistentes sobre a influência de diferentes

fontes na biologia desses mosquitos em cativeiro.

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48

6. CONCLUSÃO

1 - Observou-se um comportamento eclético de Anopheles aquasalis da

colônia de FMT-HVD, uma vez que:

2 - Maior número de fêmeas se alimentaram de sangue humano nos dois

métodos ofertados (direto e indireto).

3 - As fêmeas que apresentaram maior longevidade, ingeriram maior

quantidade de sangue de galinha .

4 - E as fêmeas mais fecundas foram as que se alimentaram de sangue de

camundongo e hamster.

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49

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Brasil, Saúde Md, Saúde SdVe. Guia de vigilância epidemilógica. In: Epidemiológica DdV, editor. 7ª edição ed. Brasília2010. 2. Organization WH. World malária report. 2013. 3. Boletim. Situação epidemiológica da malária no Brasil, 2000 a 2011. In: Saúde SdVeS-Md, editor. Brasil2013. 4. Brasil. Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica. In: SUS ID, editor. 2014. 5. Tauil PL. Malária no Brasil: epidemiologia e controle. In: Secretaria de Vigilância em Saúde M, editor. 2009. p. 223-40. 6. Oliveira RL, Guimarães AEG, Arlé M, Silva TF, Castro MG, Motta MA, et al. Anopheline species, some of theirs habits and relation to malaria in endemic areas of Rondonia state, Amazon region of Brazil. 1989;84(4):501-14. 7. Alecrim MGC, Alecrim WD. Malária. In:Cimerman, S.; Cimerman, B. Medicina Tropical. São Paulo2003. 105-17 p. 8. Lourenço-De-Oliveira R, editor. Principais insetos vetores e mecanismos de transmissão das doenças infecciosas e parasitárias. Guanabara-Koogan ed. Rio de Janeiro2005. 9. Oliveira-Ferreira J, Lacerda MV, Brasil P, Ladislau JL, Tauil PL, Daniel-Ribeiro CT. Malaria in Brazil: an overview. Malar J. 2010;9:115. Epub 2010/05/04. 10. Rey L. Parasitologia. 4ª ed. Rio de Janeiro2013. 222-57; 728-39 p. 11. Sabbatani S, Fiorino S, Manfredi R. The emerging of the fifth malaria parasite (Plasmodium knowlesi): a public health concern? The Brazilian journal of infectious diseases : an official publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases. 2010;14(3):299-309. Epub 2010/09/14. 12. Bronner U, Divis PC, Farnert A, Singh B. Swedish traveller with Plasmodium knowlesi malaria after visiting Malaysian Borneo. Malaria journal. 2009;8:15. Epub 2009/01/17. 13. Sabbatani S, Fiorino S, Manfredi R. Plasmodium knowlesi: from Malaysia, a novel health care threat. Le infezioni in medicina : rivista periodica di eziologia, epidemiologia, diagnostica, clinica e terapia delle patologie infettive. 2012;20(1):5-11. Epub 2012/04/06. 14. Ta TH, Hisam S, Lanza M, Jiram AI, Ismail N, Rubio JM. First case of a naturally acquired human infection with Plasmodium cynomolgi. Malaria journal. 2014;13:68. Epub 2014/02/26. 15. Gomes AP, Vitorino RR, Costa AD, Mendonca EG, Oliveira MG, Siqueira-Batista R. Severe Plasmodium falciparum malaria. Revista brasileira de terapia intensiva. 2011;23(3):358-69. Epub 2011/09/01. Malaria grave por Plasmodium falciparum. 16. Andrade BB, Reis-Filho A, Souza-Neto SM, Clarencio J, Camargo LM, Barral A, et al. Severe Plasmodium vivax malaria exhibits marked inflammatory imbalance. Malaria journal. 2010;9:13. Epub 2010/01/15. 17. Lacerda MV, Fragoso SC, Alecrim MG, Alexandre MA, Magalhaes BM, Siqueira AM, et al. Postmortem characterization of patients with clinical diagnosis of Plasmodium vivax malaria: to what extent does this parasite kill? Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2012;55(8):e67-74. Epub 2012/07/10. 18. Consoli RAGB, Oliveira RL. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Rio de Janeiro1994. 19. Rosa-Freitas MG, Lourenco-de-Oliveira R, de Carvalho-Pinto CJ, Flores-Mendoza C, Silva-do-Nascimento TF. Anopheline species complexes in Brazil. Current knowledge of those related to malaria transmission. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1998;93(5):651-5. Epub 1998/11/27. 20. Forattini OP. Culicidiologia Médica. São Paulo2002. 21. Rebelo JM, Moraes JL, Alves GA, Leonardo FS, Rocha RV, Mendes WA, et al. [Distribution of

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8. ANEXOS / APÊNDICE

8.1 Anexo A – Aprovação junto ao Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-HVD

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8.2 Anexo B – Licença da Comissão de Ética no Uso de Animais

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8.3 Anexo C - Fluxograma dos procedimentos

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8.4 Anexo D - Procedimentos Operacionais Padrões (POPs)

1. OBJETIVOS Descrever o procedimento para Manutenção de Colônias de anofelinos.

2. DEFINIÇÕES

Não se aplica.

3. APLICÁVEL A

Todos os laboratórios e ou grupos de pesquisa que constituem a REDIMA (Rede Amazônica da Dinâmica de Infecção Experimental com Malária).

Emenda Razão da emenda

Código POP POP_MAL_LB_012_v01D_PT

Título Procedimento para Manutenção de Colônias de anofelinos.

Idioma da versão original PORTUGUÊS

Elaborado por: Anne Cristine Gomes de Almeida Data & assinatura

Revisado por: Keillen Monick Martins Campos Iria Cabral de Rodriguez Data & assinatura

Aprovado por: José Bento Pereira Lima Data & assinatura

Data de aplicação:

Data da próxima revisão:

POP_MAL_LB_012_v01D_PT

Procedimento Operacional Padrão

Centro de Entomologia

INSETÁRIO Dr. AGOSTINHO CRUZ MARQUES

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4. RESPONSABILIDADES Técnicos, estudantes de iniciação científica, mestrado, doutorado, pós-doutorado e

pesquisadores dos laboratórios da rede, envolvidos na execução das técnicas para manutenção de colônias de anofelinos;

Equipe do Insetário da Gerência de Entomologia, FMT-HVD.

5. POP'S RELACIONADOS

• Procedimento para Dissecção e Detecção Microscópica da Infecção de anofelinos por Plasmodium (versão atual do POP_MAL_LB_014);

• Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio (versão atual do POP_MAL_LB_002);

• Procedimento para infecção experimental de mosquitos anofelinos (versão atual do POP_MAL_LB_013);

• Procedimento para anestesia e utilização de cobaios na colônia de anofelinos (versão atual do POP_MAL_LB_016);

• Procedimento para preparação de água e comida para larvas de mosquitos da colônia de anofelinos (versão atual do POP_MAL_LB_015).

6. PROCEDIMENTOS

6.1 Recursos necessários

6.1.2 Materiais

Bacias plásticas retangulares (17 x 24 x 4 cm)

Bacias retangulares grandes (30 X 22 X 6 cm)

Bacias plásticas redondas (22 cm de diâmetro X 12 cm de altura)

Bacias plásticas (40 X 26 X 7 cm),

Gaiola 17 cm de diâmetro X 17 cm de altura

Erlenmeyer de 50ml

Copos de Postura

Açúcar cristal

Papel de filtro

Água

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Sal marinho

Papel toalha

Gaze

Algodão bola/ Algodão em rolo

Fitas adesivas para identificação

Copinhos plásticos descartáveis com 120ml de capacidade

Esponja

Camundongos

6.1.3 Equipamentos

Freezer - 20ºC

Termohigrometro digital

6.2 Procedimentos com os ovos e larvas pequenas

• Dois a três dias após o início da postura, retirar os copos das gaiolas e colocar os ovos em bacias retangulares (17 x 24 x 4 cm), forradas com papel-filtro nas laterais internas e contendo 120 ml da solução utilizada para a criação de An. aquasalis. Evitar colocar um número excessivo de ovos por bacia;

• Verte-se a água dos copos de postura para as bacias retangulares e com um pissete, joga-se água pelas bordas dos mesmos (nos papéis-filtro), permitindo com isso que todos os ovos dos copos de postura sejam transferidos para as bacias;

• Na postura forçada, após dois a três dias, os mosquitos sobreviventes são removidos, com o auxílio de capturador de Castro e com um pissete, joga-se água pelas bordas dos mesmos (nos papéis-filtro), para que todos os ovos do aparato sejam transferidos para a bacia;

• Esperar a eclosão das larvas por dois a três dias, colocando comida para larvas pequenas nas próprias bacias. Nesta etapa a água não é trocada e a bacia é manipulada o mínimo possível, adicionando mais comida e água caso seja necessário;

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• Dois a três dias após a eclosão dos ovos, retirar lentamente o papel filtro colocado da lateral interna das bacias e, utilizando um pedaço de papel toalha ou de papel higiênico retirar o excesso de sujeira da superfície incluindo os ovos restantes em seguida, transferir as larvas para bacias plásticas retangulares (17 x 24 x 4 cm), com aproximadamente 120 ml de água (em geral 100 a 150 larvas por bacia para An. aquasalis);

• Após distribuir as larvas, marcar as bacias com fita adesiva da cor definida para a espécie, anotando na fita a data da transferência. Nota: Sempre que nova bacia for aberta, colocar a fita com a data em que a

larva foi colocada no copo (e NÂO a data de transferência). Esta data indica a idade aproximada da larva.

6.3 Procedimentos com as larvas

• Diariamente, limpar as bacias com um pedaço de papel toalha ou de papel higiênico. Estes pedaços devem ser cortados e estocados (procurar evitar o uso de papéis que não absorvem muita água); Nota: Colocar o papel na superfície da água, retirando assim o excesso de

comida e as exúvias. O papel flutua e se adere à sujeira que está na superfície. As larvas não se grudam.

• Para repor a água perdida por evaporação, ao longo do dia e no papel, durante a

limpeza, adicionar aproximadamente 60 ml de água em cada bacia;

• Após o processo de limpeza das bacias, alimentar as larvas com comida; Nota: muita comida suja as bacias. Pouca comida provoca canibalismo. A

quantidade ideal é conseguida com a prática.

• Quando as larvas atingirem o estadio (L3), transferi-las para bacias retangulares 17 X 24 X 4 cm), com aproximadamente 240mL de água (em torno de 1 cm de lâmina de água). Nesta etapa, as larvas devem ser separadas por tamanho; Nota: Devem ser colocadas de 100 a 150 por bacia para An. aquasalis.

• Após a limpeza diária das bacias, coloca-se comida; Nota: se houver excesso de comida na superfície da água nas bacias

retangulares é preciso passar papel toalha para remover.

• Retirar, diariamente, as pupas das bacias, logo pela manhã. Para isto, usar pipetas plásticas descartáveis tipo Pasteur com a ponta cortada, para ficar larga. As pupas são contadas e encaminhadas para as respectivas gaiolas; Não descartar as pipetas e usar uma para cada espécie. As pipetas são

marcadas com fita da cor correspondente a espécie e são mantidas, na sala de larvas, em vidros separados, contendo solução de hipoclorito;

Quando uma bacia for descartada, retirar a fita colorida de identificação ainda na sala de larvas e jogar fora. Este procedimento facilita a lavagem.

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• Na parte da tarde, verificar a quantidade de comida em todas as bacias e, se

necessário, adiciona-se um pouco mais de comida. As larvas mais vorazes são as L2 e L3.

6.4 Procedimento com as pupas

• Colocar no máximo 300 pupas em cada recipiente (copinhos de 120 ml); • Colocar aproximadamente 300 pupas em cada gaiola (17 cm de diâmetro X 17 cm

de altura); • Colocar pupas em uma mesma gaiola por no máximo 3 dias.

6.5 Procedimentos com adultos 6.5.1 Preparações das gaiolas para os adultos

• Verificar as condições das caixas que já estão limpas e guardadas; • Adicionar papel-filtro cortado (redondo) no fundo da gaiola; • Na parte externa da gaiola colar sobre a fita marrom a etiqueta referente a

abertura da nova gaiola, contendo informações referentes a espécie que está trabalhando, o nº da gaiola, a espécie, data de abertura, responsável, data de alimentação e colar o durex da cor referente a espécie.

Obs: sempre é necessário o preenchimento de todas as informações.

• Introduzir na gaiola uma mamadeira com solução de sacarose a 10%; • Colocar o copo com as pupas na gaiola e anotar na ficha correspondente, o

número da gaiola, data de abertura, espécie, número de pupas adicionadas por dia e o somatório do número de pupas (segundo versão atual dos POP_MAL_LB_012_A02 e POP_MAL_LB_012_A03);

• Pôr um pano (ou uma gaze) umedecido sobre cada gaiola. Estes devem ser molhados diariamente (mas não encharcados).

6.5.2 Manutenções das gaiolas com adultos

• Inspecionar as gaiolas diariamente, retirando copos nos quais os adultos já emergiram; Nota: Os copos com água atraem os adultos, principalmente os machos, que

acabam morrendo, diminuindo a taxa de fêmeas inseminadas.

• A primeira alimentação em geral é feita com 7 dias após a abertura da gaiola (em caso dessa gaiola ser usada na colônia), em casos de infecção utiliza-se mosquitos com 3 a 5 dias após a abertura da mesma - quando esta é montada em

Page 85: Brigite Stela Afonso de Almeida

65

apenas um ou dois dias – ou 4 a 6 dias, quando a gaiola for montada por mais de dois dias;

• São usados camundongos ou hamster anestesiados segundo o POP_MAL_LB_016_v01D_PT, para alimentar os anofelinos. Estes são colocados sobre as gaiolas por no máximo 40 minutos;

• Anotar data e dados relativos à alimentação na ficha correspondente a cada gaiola (segundo versão atual do POP_MAL_LB_012_A02_v01_PT). Da mesma forma, anotar o destino de cada gaiola, com a data (se foi entregue para alguém, se os mosquitos sobreviventes depois de algum tempo, foram colocados em alguma outra gaiola – neste caso, em qual gaiola e a data); Nota: Em caso de “fusão” de gaiolas, descartar a de menor número e manter

na colônia a mais recente. Colocar as fêmeas em postura forçada três dias após a alimentação sanguínea;

• Alternativamente, realiza-se postura forçada, um aparato plástico (8,5 cm de diâmetro X 4,5 cm de altura), com a parte superior recoberta por uma tela de nylon com um pequeno orifício (que permite a introdução dos mosquitos). O aparato plástico fica mergulhado em uma bacia (18 x 8 cm) contendo solução de sal marinho a 0,2%, e com as paredes interna recoberta com papel–filtro;

• Dois a três dias após a alimentação as fêmeas são transferidas para o aparato de postura onde permanecem por dois a três dias. Nota: ao abrir o manguito, para manipular a gaiola, soprar para dentro, de

forma a manter os anofelinos no interior. 6.6 Limpieza das bacias e gaiolas

• Lavar as bacias com esponja destinada apenas para isto, SEM sabão ou detergente. Verificar se as etiquetas foram retiradas. Esfregar bastante, enxaguar bastante, e deixar escorrendo. No dia seguinte, organizar as bacias em seus devidos lugares. Nota: No caso das esponjas verde-amarelas (de cozinha), usar apenas o lado

amarelo (o lado verde arranha, criando nichos propícios ao acúmulo de sujeira e à proliferação de micro-organismos).

• Colocar as gaiolas das quais os mosquitos devem ser descartados na geladeira ou

no freezer a -20°C por, pelo menos, uma noite. É importante que, pela manhã, o freezer seja esvaziado antes que gaiolas sejam lá colocadas. As gaiolas retiradas do freezer devem ser limpas. Para isto, o manguito é aberto (envolvendo a própria gaiola), a gaiola é sacudida sobre a lata de lixo e o papel-filtro do fundo é retirado. Periodicamente, é conveniente colocar as gaiolas para tomar sol, depois que saem do freezer e são limpas.

6.7 Controles de temperatura e umidade relativa no insetário

Page 86: Brigite Stela Afonso de Almeida

66

• Cada sala do insetário deve ser equipada com um termohigrômetro de máxima e

mínima; • Todos os dias, a temperatura e a umidade relativa (máxima, mínima e do

momento) são anotadas e o aparelho é zerado. Anota-se também a data e a hora da anotação e o nome do operador (versão atual do POP_MAL_LB_012_A01_v01_PT);

• A temperatura ideal para a sala de larvas é de 27-28°C. Nesta sala, a umidade relativa não é importante (as larvas estão na água);

• Para a sala dos adultos, a temperatura ideal é de 25-26°C. É importante que não passe de 27°C, pois a longevidade diminui muito. A umidade relativa é ideal entre 70 e 80% e crítica abaixo de 60%. Nota: aumentar a umidade de todo o insetário, pode gerar desconforto para

quem lá trabalha e estimular a proliferação excessiva de fungos, o que acaba prejudicando a colônia. Uma solução seria manter a umidade da sala dos adultos entre 70 e 80% e colocar as gaiolas dos anofelinos sobre bacias com águas e com pano úmido por cima.

Nota: se caso só exista uma sala onde se manipula larvas e adultos a temperatura deve ser intermediária de 26ºC.

6.8 Biosseguranças

Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1)

7. REFERÊNCIAS

1. Adegas MG, Barroso-Krause C, Lima JBP, Valle D. Parâmetros de biossegurança para Insetários e infectórios de vetores (Aplicação e adaptação das normas gerais para laboratórios definidas pela Comissão Técnica de Biossegurança da Fiocruz). 1. ed. Rio de Janeiro: Ed. Diretoria do Instituto Oswaldo Cruz, 64pp, 2005. v. 1. 64pp.

2. José Bento Pereira Lima, Denise Valle. Manutenção das colônias de anofelinos. Protocolo LAVICAF. Rio de Janeiro, março de 2007.

Page 87: Brigite Stela Afonso de Almeida

67

8. REGISTRO DOS ANEXOS

A versão atual deste POP foi traduzida a ____________________ e a versão traduzida entra em efeito em ___/___/_____.

Assinatura do responsável: ___________________

TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo

versão/idioma):

Titulo do anexo 1: Controle de Temperatura e Umidade Relativa do Insetário POP_MAL_LB_012_A01_v01_PT

Titulo do anexo 2: Controle de Gaiolas e Alimentação de mosquitos POP_MAL_LB_012_A02_v01_PT

Titulo do anexo 3: Controle da Viabilidade da Colônia de Anofelinos POP_MAL_LB_012_A03_v01 _PT

NOME DO ANEXO:

CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma)

Novo Criado por:

Data e assinatura

Aprovado por:

Data e assinatura

Revisão

Tradução

dd mm aa

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68

8.5 Anexo E - Minuta de artigo

Avaliação do efeito de diferentes fontes de repasto sanguíneo na biologia de Anopheles aquasalis, colonizado em laboratório

Evaluation of the effect of different blood meal sources on the biology of colonized

Anopheles aquasalis.

Brigite Stela Afonso de Almeida1,2, Djane Claeys Baia da Silva1,2, Íria Cabral2, Felipe da Rocha de Brito3, Keillen Monick Campos Martins1,2, Claúdia Rios Velasquez5, José Pereira Bento Lima6, Paulo Filemon Paulocci Pimenta1,4,6 e

Maria das Graças Vale Barbosa Guerra1,2,3

1 Pós-graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM. 2 Gerência de Entomologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM. 3 Escola Superior de Ciências da Saúde, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM. 4 Centro de Pesquisas René Rachou-Fiocruz-MG. 5 Instituto de Pesquisa Leônidas e Maria Deane,Fundação Oswald Cruz, Manaus, AM. 6 Instituto Oswald Cruz - FIOCRUZ, RJ. Endereço para correspondência: Dra. Maria das Graças Vale Barbosa Guerra. Depog/ Gerência de Entomologia/FMT-HVD. Av. Pedro Teixeira, 25, 69040-000 Manaus, AM. Brasil e-mail: [email protected] RESUMO Anopheles aquasalis é a uma espécie de anofelino que vem sendo colonizado em laboratório desde 1995 com vistas aos estudos sobre a biologia e interação parasito-hospedeiro, visando o controle da malaria. Em um estudo experimental, propôs-se avaliar os efeitos das diferentes fontes de repasto sanguíneo na biologia do Anopheles aquasalis colonizado em laboratório. Foram ofertadas de forma direta e indireta, sangue de camundongo, hamster, galinha e ser humano, para avaliação da preferência alimentar, longevidade e fecundidade de fêmeas com idade entre 3 a 7 dias, em jejum de 24 horas. Observou-se que maior número de fêmeas (96%) se alimentou de sangue humano; maior quantitativo (3,11mg e 3,40 mg) de sangue ingerido foi galinha, sem diferença estatística significativa; de uma maneira geral, as médias de sobrevivência variaram de 24 dias para alimentação com sangue de galinha e 18 dias em sangue humano.Observou-se um aumento na média de ovos postos pelas fêmeas durante as gerações F0 à F1; com destaque para as fêmeas que se alimentaram com sangue de camundongo (2.268 à 7.475 ovos postos), execeto as fêmeas alimentadas de sangue de galinha que declinou entre uma geração e outra (1127 à 0). Os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que o mosquito Anopheles aquasalis tem um comportamento eclético com variações no hábito alimentar e no método de oferta da fonte sanguínea. As fêmeas de anofelinos alimentadas com sangue de galinha foram mais logevas, entretanto, a maior fecundidade foi registrada nas fêmeas que se alimentaram de sangue de camundongo e hamter.

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69

Palavras-chave: Colônias de insetos. Alimentação sanguínea.Comportamento

alimentar. Longevidade. Fecundidade.

ABSTRACT Anopheles aquasalis is the only species of the subgenus Oncorhynchus that grows in brackish water, has coastal distribution in Central and South America, and it has been considered malaria vector in some regions of Venezuela and Brazil. This anopheline has been colonized in the laboratory since 1995 to the development of large studies, such as host-parasite interactions in order to control this disease. In this study, we proposed to evaluate the effects of different sources of blood meal in the biology of An. aquasalis colonized in the laboratory. This was an experimental study conducted at Dr. Agostinho Cruz Marques insectary situated at Centre of Entomology of Tropical Medicine Foundation Dr. Hector Vieira Dourado in Manaus city. Three – to seven–day–old females of An. aquasalis and sugar withdrawn 24 hours before, were fed directly and indirectly, with blood of mouse, hamster, chicken and human; in triplicate to evaluate the feeding preference, longevity and fecundity. Regarding the feeding preference, none statistically significant difference was observed in relation to the number of engorged females and the amount of blood ingested by females fed with the different sources. Regarding the longevity, in general, the averages of survival ranged from 18 days for human blood to 24 days for feeding with chicken blood; about fecundity, we observed an increase in the average of eggs laid by females in the four sources tested during the generation F0 and F1, however this increase was more evident among females fed with mouse blood (2268 to 7475 eggs laid), except the females fed with chicken blood which declined between one generation and another (1127 to 0). These results demonstrated that An. aquasalis has an eclectic and opportunistic behavior with variations in the preference and the method of supply of blood. The largest amount of ingested blood that provided greater longevity of females was chicken blood, however, the greater fecundity was observed in females fed with mice and hamster blood.

Keywords: Insects colonies, blood meal source, feeding behaviour, longevity, fecundity.

Anopheles aquasalis (Curry

1932) é uma espécie do subgênero

Nyssorhynchus, com distribuição

quase exclusivamente litorânea das

Américas Central e do Sul (1-3).

Este vetor tem sido colonizado

já algum tempo em alguns

Page 90: Brigite Stela Afonso de Almeida

70

laboratórios (4-6), onde tem servido

de base para realização de vários

estudos como o de biologia e

interação parasito-vetor (5, 7, 8). Mas

ainda apresenta períodos com

flutuações e dentre os fatores bióticos

e abióticos envolvidos nesta

problemática estão fonte de repasto

sanguíneo, temperatura e umidade(9-

11). Na literatura o An. aquasalis tem

demonstrado diferentes preferências

alimentares, zoofílico e antropofílico

ou até eclético, variando conforme a

sua localização geográfica(4, 12, 13).

De uma maneira geral são exofílicos,

com atividade crepuscular e noturno .

No entanto pouco se sabe sobre a

logevidade e fecundidade deste

mosquito quando alimentado com

distintas fontes de repasto sanguíneo

Portanto, neste estudo, propôs-se

avaliar os efeitos das diferentes

fontes de repasto sanguíneo na

biologia do Anopheles aquasalis

colonizado em laboratório.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo. Tratou-se de um

estudo experimental, realizado no

insetário Dr. Agostinho Cruz Marques

na Gerência de Entomologia, da

Fundação de Medicina Tropical Dr

Heitor Vieira Dourado (FMT – HVD)

na cidade de Manaus.

Aspectos éticos. O presente estudo

foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa (CEP) da FMT-HVD sob o

registro nº 348.100 e fazia parte de

um projeto mais amplo intitulado”

Manutenção de colônias de insetos

transmissores de doenças” aprovado

pela Sociedade Brasileira de Ciência

em Animais de Laboratório (SBCAL)

segundo o protocolo nº P-20/10.4.

Mosquitos e Procedimentos. Foram alimentadas, 6000 fêmeas de

An. aquasalis com idade entre 3 a 7

dias e em jejum de 24 horas, obtidas

da colônia de An. aquasalis já

estabelecida na FMT-HVD, através

dos métodos direto e indireto em

sangue de camundongo, hamster,

galinha e voluntário humano; para

avaliação em triplicatas do

comportamento alimentar,

longevidade e fecundidade.

Os animais camundongo, hamster e

galinha foram previamente

anestesiados com uma solução de

trabalho baseada na combinação de

0,2 mL de Ketamina (fr-ampola

Page 91: Brigite Stela Afonso de Almeida

71

50mg/mL), 0,8 mL de Xilazina (fr-

ampola de 20mg/mL) e 3 mL de PBS

à 1x. Cada combaia tinha seu peso

estimado e as doses a serem

administradas eram calculadas em

função da concentração de Xilazina e

Ketamina. As doses foram aplicadas

intraperitoneal (I.P) e intramuscular

(I.M). Enquanto a alimentação em

humano era feito direto do braço do

voluntário. Para alimentação indireta

coletou-se1 mL de sangue de cada

animal , sendo que em camundongo

e hamster, a coleta foi feita por

punção cardíaca, enquanto a galinha

e humano, por punção venosa. Em

seguida cerca de 500 uL desse

sangue foi colocado em alimentador

de vidro envolto a membrana de

parafilme.

Quantidade de sangue ingerido.

Foi calculado mediante o peso das

fêmeas depois e antes da

alimentação em balaça de precisão.

Longevidade. Após cada

alimentação, das fêmeas ingurgitadas

, diariamente era feito o controle da

sobrevivência com a remoção das

fêmeas mortas.

Fecundidade. Três dias depois da

alimentação em cada fonte, as

fêmeas alimentadas eram colocadas

em posturas individuais. .Após 3 dias,

os ovos postos e L1 foram contados e

os ovários das fêmeas dissecados

para visualização de ovos retidos.

Posteriormente, acompanhou-se o

fitness da prole por duas gerações.

Análises estatísticas. A

tabulação dos dados foi feita por meio

do programa Microsoft Office Excel

2007. Foram utilizados também o

Teste (ANOVA) com comparação pelo

método de Tukey, correlação de

Pearson, regressão linear e a

normalidade foi avaliada através do

programa Bioestat 5.3 (teste de

Shapiro Wilk). Considerando o nível

de significância de 5%.

RESULTADOS. a) Comportamento alimentar: observou-se que maior

número de fêmeas (96±07%) se

alimentou de sangue humano e

menor quando a fonte ofertada era

indireto em galinha (56±10,8%). Com

relação, a quantidade de sangue

ingerido, observou-se maior

quantitativo 3.11±1.30mg e

3,40±0.66mg para as fêmeas

Page 92: Brigite Stela Afonso de Almeida

72

alimentadas com sangue de galinha e

menor para fonte humana

(0.98±0.69mg ) (tabela 1).

b) Longevidade: De uma maneira

geral, as médias de sobrevivência

variaram de 24º dias para

alimentação com sangue de galinha e

18º dias em sangue humano (Figura

1).

C) Fecundidade: observou-se um

aumento na média de ovos postos

pelas fêmeas durante as gerações F0

à F1 nas quatro fontes de sangue

testadas, entretanto este aumento foi

mais evidente entre as fêmeas que se

alimentaram com sangue de

camundongo (2.268 à 7.475 ovos

postos), execeto as fêmeas

alimentadas de sangue de galinha

que teve uma redução brusca na

produção de ovos entre uma geração

e outra (1.127 e 0, respectivamente)

(Tabela2). Com relação à ovos retidos

pelas fêmeas que ovipuseram,

constatou-se que as fontes indireta de

galinha e direta de humano tiveram

maiores médias de fêmeas com ovos

retidos, sendo 4,0 e 5,0 fêmeas,

respetivamente. Enquanto que as

menores médias de ovos retidos

foram encontradas entre as fêmeas

alimentadas indiretamente com o

sangue de humano (2,7) e

diretamente em galinha (2,0).

Tabela 4 - Média de fêmeas ingugitadas e da quantidade de sangue ingerido em

miligrama por fonte alimentar.

Variável Fonte Humano/EP Hamster/EP Camundongo/EP Galinha/EP

Fêmeas

ingugitadas

Direto 96±07 83,3±4,6 78,7±8 58±8,5

Indireto 75±9,8 62.7±13,1 56±10,8 56±10,8

Sangue

ingerido

Direto 2.28±0.73 1.87±0.37 2.25±0.35 3.11±1.30

Indireto 0.98±0.69 2.83±0.95 2.09±0.95 3.40±0.66

Page 93: Brigite Stela Afonso de Almeida

73

Fonte/ Método Geração Ovos Postos Larvas % Pupas % Fêmeas % Machos %

Camundongo D F0 6805 2264 (33,3) 1491,0 (65,9) 746,0 (50,0) 694,0 (46,5) F1 22424 8544 (38,1) 3035,0 (35,5) 1479,0 (48,7) 1361,0 (44,8)

Hamster D F0 6235 2015 (32,3) 1187,0 (58,9) 456,0 (38,4) 415,0 (35,0) F1 6768 2255 (33,3) 1058,0 (46,9) 398,0 (37,6) 419,0 (39,6)

Humano D F0 4476 1616 (36,1) 527,0 (32,6) 321,0 (60,9) 232,0 (44,0) F1 3937 1272 (32,3) 898,0 (70,6) 356,0 (39,6) 385,0 (42,9)

Galinha D F0 4087 1464 (35,8) 569,0 (38,9) 443,0 (77,9) 103,0 (18,1) F1 3214 1336 (41,6) 378,0 (28,3) 130,0 (34,4) 121,0 (32,0)

Camundongo ID F0 3998 1024 (25,6) 529,0 (51,7) 214,0 (40,5) 302,0 (57,1) F1 5473 1489 (27,2) 183,0 (12,3) 91,0 (49,7) 92,0 (50,3)

Hamster ID F0 6933 1545 (22,3) 1074,0 (69,5) 456,0 (42,5) 527,0 (49,1) F1 8800 5512 (62,6) 1049,0 (19,0) 530,0 (50,5) 465,0 (44,3)

Humano ID F0 5120 1714 (33,5) 929,0 (54,2) 456,0 (49,1) 383,0 (41,2) F1 4446 1149 (25,8) 842,0 (73,3) 403,0 (47,9) 384,0 (45,6)

Galinha ID F0 3382 942 (27,9) 115,0 (12,2) 66,0 (57,4) 46,0 (40,0) F1 0 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

Figura 1 – Tempo médio de sobrevivência de fêmeas alimentadas com diferentes fontes animais (humano, hamster, camundongo e galinha).

Figura 2 -. Valores médios de fêmeas ingurgitadas, posturas, oviposturas, ovos retidos e de ovos postos durante a geração F0.

Tabela 2 -. Valores absolutos e percentual médio de ovos postos, larvas, pupas, fêmeas e machos em cada geração de estudo por diferentes fontes de alimentação sanguínea .

Humano D

Humano ID

Hamste

r D

Hamste

r ID

Camundongo D

Camundongo ID

Galinha D

Galinha I

D0

10

20

30

Fonte

Tem

po (d

ias)

Page 94: Brigite Stela Afonso de Almeida

74

DISCUSSÃO

A avaliação do efeito das

diferentes fontes de repasto

sanguíneo na biologia do Anopheles

aquasalis colonizado em laboratório

realizada nesse estudo demonstrou

que esse mosquito tem um

comportamento eclético e oportunista

com variações na preferência e no

método de oferta da fonte sanguínea.

A maior quantidade de sangue

ingerido e que proporcionou maior

longevidade foi o de galinha,

entretanto, a maior fecundidade foi

registrada nas fêmeas que se

alimentaram de sangue de

camundongo e hamter.

Considerando que nesse

estudo, as fontes de repasto

sanguíneo foram testadas

individualmente e em dias diferentes,

sugerindo que as fêmeas de An.

aquasalis se alimentaram da fonte

que se encontrava disponível no

momento do experimento, acredita-se

que esse fato possa ter favorecido o

hábito alimentar variado desse

mosquito. Entretanto, os dados

apresentados corroboram

especialmente, com os de Deane et

al., Flores-Mendonza et al. e Da Silva

et al., pois esses autores também

discorreram a respeito do hábito

alimentar variável desta espécie. (4,

12, 14)

Possivelmente, a maior

longevidade das fêmeas que se

alimentaram com sangue de galinha

esteja relacionado com a quantidade

de sangue ingerido pelas fêmeas.

Talvez as diferenças hematológicas

existentes nos tipos de sangue

testados explique a divergência

observada, pois sabe-se que os

eritrócitos do sangue de galinha são

nucleados enquanto dos demais são

anucleados, o que pode alterar

também a densidade do sangue a ser

digerido. Contudo as análises

estatísticas não revelaram nenhuma

diferença significativa entre as fontes.

Concernente a fecundidade,

Olayemi et al. investigando a

influência do tipo de alimentação

sanguínea na reprodução do

mosquito Anopheles gambiae em

Minna, na Nigéria, viram que dos sete

animais vertebrados (humano, cão,

bovino, suíno, carneiro, cabra e

galinha) que serviram de fonte

Page 95: Brigite Stela Afonso de Almeida

75

alimentar através do método indireto,

o sangue humano teve maior número

de fêmeas ingurgitadas (94±3,36%),

por conseguinte foi o melhor em

termos de oviposição, fecundidade e

taxa de eclosão dos ovos por fêmeas,

reforçando os estudos sobre a

bionomia deste vetor quanto a sua

alta antropofilia e competência

vetorial (15).

Contraditoriamente, com o que

foi observado nesse estudo, a fonte

que favoreceu maior fecundidade foi

camundongo, em seguida hamster e

depois humano, sendo a fonte

galinha a que menos contribuiu para

o sucesso desta temática.

Acredita-se que os dados gerados

nesse estudo ajudará na

implementação de novas estratégias

de criação de anofelinos na condição

laboratorial e desta forma aprimorar a

colônia para realização de mais

amplos estudos adjacentes.

No entanto, por ser o primeiro

trabalho que avalia a preferência e o

desenvolvimento de Anopheles

aquasalis submetidas a fontes de

alimentação sanguínea distintas em

laboratório, torna-se necessário que

mais estudos sejam realizados a fim

de que se possa ter conclusões mais

consistentes sobre a influência de

diferentes fontes na biologia desses

mosquitos em cativeiro.

AGRADECIMENTOS Às instituições envolvidas nesta pesquisa, à CAPES pela fornecimento da

bolsa de estudo, aos orientadores, aos demais colaboradores, aos amigos do dia a dia e aos colegas da turma de mestrado 2012/2014.

REFERÊNCIAS

Page 96: Brigite Stela Afonso de Almeida

76

1. Consoli R, Oliveira R. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Fiocruz, editor. Rio de Janeiro1994. 228 p.

2. Forattini OP. Culicidiologia Médica. São Paulo2002.

3. Sinka ME, Rubio-Palis Y, Manguin S, Patil AP, Temperley WH, Gething PW, et al. The dominant Anopheles vectors of human malaria in the Americas: occurrence data, distribution maps and bionomic precis. Parasites & vectors. 2010;3:72. Epub 2010/08/18.

4. Da Silva AN, Dos Santos CC, Lacerda RN, Santa Rosa EP, De Souza RT, Galiza D, et al. Laboratory colonization of Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae) in Belem, Para, Brazil. Journal of medical entomology. 2006;43(1):107-9. Epub 2006/03/02.

5. Lima JB, Valle D, Peixoto AA. Adaptation of a South American malaria vector to laboratory colonization suggests faster-male evolution for mating ability. BMC evolutionary biology. 2004;4:12. Epub 2004/05/11.

6. Arruda ME, Rios RI, Arantes PC, Oliveira AC, Nascimento LP. Manutenção em laboratório de Anopheles albitarsis e Anopheles aquasalis por cópula induzida. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz Rio de Janeiro. 1982;77(1):89-91. Epub jan./mar. 1982.

7. Lima ASDS. Aspectos Básicos do Desenvolvimento e da Reprodução em Laboratório de Anopheles neotropicais, vetores da malária. [Dissertação ]. Rio de Janeiro2009.

8. Rios-Velasquez CM, Martins-Campos KM, Simoes RC, Izzo T, dos Santos EV, Pessoa FA, et al. Experimental Plasmodium vivax infection of key Anopheles species from the Brazilian Amazon. Malaria journal. 2013;12:460. Epub 2013/12/24.

9. Guimaraes AE, Gentile C, Lopes CM, Sant'Anna A. [Ecology of mosquitoes in areas of the National Park of "Serra da Bocaina", Brazil: II - Monthly frequency and climatic factors]. Revista de saude publica. 2001;35(4):392-9. Epub 2001/10/16. Ecologia de mosquitos em areas do Parque Nacional da Serra da Bocaina: II - Frequencia mensal e fatores climaticos.

10. Canyon DV, Hii JL, Muller R. Adaptation of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) oviposition behavior in response to humidity and diet. Journal of insect physiology. 1999;45(10):959-64. Epub 2003/05/29.

11. Richards SL, Anderson SL, Yost SA. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of vector ecology : journal of the Society for Vector Ecology. 2012;37(1):1-7. Epub 2012/05/03.

12. Deane LM, Vernin CS, Damasceno RG. Avaliação das preferências alimentares das fêmeas de Anopheles darlingi e Anopheles aquasalis em Belém. . Revista do Serviço Especial de Saúde Pública Rio de Janeiro. 1949;2(3):793-808.

Page 97: Brigite Stela Afonso de Almeida

77

13. Xavier MM, Rebelo JM. [Species of Anopheles (Culicidae, Anophelinae) in a malaria-endemic area, Maranhao, Brazil]. Revista de saude publica. 1999;33(6):535-41. Epub 2000/02/26. Especies de Anopheles (Culicidae, Anophelinae) em area endemica de malaria, Maranhao, Brasil.

14. Flores-Mendoza C, Lourenco-de-Oliveira R. Bionomics of anopheles aquasalis Curry 1932, in Guarai, State of Rio de Janeiro, southeastern Brazil--I. Seasonal distribution and parity rates. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1996;91(3):265-70. Epub 1996/05/01.

15. Olayemi IK, Ande AT, Danlami G, Abdullahi U. Influence of blood meal type on reproductive performance on the malaria vector, Anopheles gambiae s.s. (Diptera: Culicidae). Journal of Entomology. 2011;8(5):459-67.

8.6 Apêndice A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

O (a) Senhor (a) está sendo convidado (a) a participar deste estudo da

Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) intitulado” ESTUDO EXPERIMENTAL PARA AVALIAR OS EFEITOS DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DO Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM LABORATÓRIO” sob a

coordenação da pesquisadora Dra. Maria das Graças Vale Barbosa.

Os objetivos deste estudo são: Avaliar o efeito das diferentes fontes de repastos

sanguíneos na biologia do Anopheles aquasalis colonizado em laboratório.

Específicamente, vamos verificar a predileção do An. aquasalis por diferentes tipos de

repasto sanguíneo animal através de métodos diretos e indiretos e avaliar os efeitos

destas diferentes fontes de alimentação sobre a longevidade e a fecundidade do

mosquito.

Você oferecerá uma região do seu antebraço para contato com os mosquitos

durante 30 minutos (alimentação direta), e também você será solicitado a doar uma

amostra de sangue (1mL) por punção venosa para que seja oferecido aos mosquitos

através de alimentadores artificiais (alimentação indireta). Você terá toda autonomia

para decidir entrar ou não na pesquisa. Também, você terá toda liberdade para se

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retirar do estudo a qualquer momento, sem prejuízo de qualquer natureza. Tanto sua

pessoa quanto os dados por você fornecidos serão mantidos sob absoluta

confidencialidade e, portanto, ninguém mais terá conhecimento sobre sua participação.

Durante o processo de retirada de sangue ou alimentação direta dos mosquitos no seu

antebraço, você poderá sentir algum desconforto. Caso venha a sofrer algum dano

durante ou após esses procedimentos, você tem a garantia de indenização, ou

tratamento e acompanhamento por parte da instituição promotora da pesquisa, do

investigador e inclusive no caso de reaçãoes alérgicas que se comprove o ocorrido.

Gostaríamos de enfatizar que a sua decisão de participar do estudo é

completamente voluntária, ou seja, não está de maneira alguma associada a qualquer

tipo de recompensa financeira ou em outra espécie. Entretanto, você pode ser

ressarcido de eventuais despesas, tais como transporte e alimentação, quando for o

caso.Todo material utilizado para a coleta de sangue será descartável e será jogado

fora, em local apropriado, após a sua análise.

Todo o material coletado será utilizado apenas para essa pesquisa. Os

resultados desse estudo serão publicados em revistas cientificas onde o (a) senhor (a)

não será identificado (a).

Se o (a) senhor (a) aceitar participar, garantimos que poderá desistir a qualquer

momento, bastando para isso, informar sua decisão da maneira mais conveniente.

O (a) senhor (a) poderá ter qualquer tipo de explicação durante o tempo da

pesquisa, inclusive, após a publicação, entrando em contato com a responsável pela

pesquisa Brigite Stela Afonso de Almeida, no endereço Avenida Apuriná, nº773 A, Praça

14-Centro. E-mail: [email protected] / Celular: 91769438

Para quaisquer informaçãoes, fica disponibilizado o endereço do CEP/FMT-HVD,

sito à Av. Pedro Teixeira nº 25 – Dom Pedro, Cep 69.040-000, Manaus-Am, que

funciona de 2ª a 6ª Feira, das 08:00 às 14:00 horas, telefone (92)2127-3572, e-mail:

[email protected]

Universidade do Estado do Amazonas – UEA (Av. Djalma Batista, 3578 - Flores CEP

69050-010).

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79

Com este estudo, esperamos gerar informações capazes de otimizar a produção

de uma colônia de An. Aquasalis, permitindo o desenvolvimento de diferentes

experimentos sobre interação parasito-hospedeiro, em busca de novas estratégias de

controle das populações de mosquitos e da transmissão da malária.

Eu,___________________________________________________________,

declaro ter sido suficientemente informado (a) a respeito do trabalho: “ ESTUDO EXPERIMENTAL PARA AVALIAR OS EFEITOS DE DIFERENTES FONTES DE REPASTO SANGUÍNEO NA BIOLOGIA DO Anopheles aquasalis, COLONIZADO EM LABORATÓRIO” e concordo voluntariamente em participar desse estudo. Afirmo ter

entendido e estar de acordo com todos os itens deste documento que li ou que foram

lidos para mim.

Assinatura do participante da pesquisa Data / /

Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste (a) participante, ou representante legal, para a participação neste estudo.

_________________________________ ___/_______/______

Assinatura do responsável pelo estudo Data