breve histórico sobre potenciais elétricos em nervos e...

5910179 – Biofísica I – Turma de Biologia – FFCLRP – USP – Prof. Antônio Roque História 2

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Breve histórico sobre potenciais elétricos em nervos e músculos, parte 2

Os principais elementos da teoria da membrana de Bernstein são os seguintes:

1. As células nervosas são compostas por um interior eletrolítico circundado

por uma fina membrana cuja permeabilidade iônica é seletiva.

2. No repouso, existe uma diferença de potencial elétrico através da membrana

da célula. Esse potencial de repouso não depende de processos metabólicos.

3. O potencial de repouso é gerado devido à seletividade da membrana no

repouso apenas aos íons de potássio. A concentração dos íons de potássio é

maior do lado de dentro da célula do que do lado de fora e essa diferença de

concentração causa difusão dos íons de potássio através da membrana.

A difusão provoca uma diferença de potencial através da membrana cujo

valor de equilíbrio (repouso) é dado pela equação de Nernst,

E = RTFln

K +!" #$foraK +!" #$dentro

. (1)

Este potencial de repouso torna-se acessível experimentalmente pela secção

transversal de um nervo, ou seja, ele é o potencial de injúria responsável

pela corrente de injúria.

4. Durante a excitação da célula, a permeabilidade da membrana aumenta de

forma generalizada para todos os íons (ou seja, a membrana torna-se

permeável aos íons que antes estavam impedidos de passar por ela no

repouso) e isso leva à diminuição ou ao desaparecimento da polarização

existente previamente (despolarização). Esta é a causa da “variação

negativa” de du Bois-Reymond.


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A figura abaixo fornece um esquema da teoria de Bernstein.

state, excitable cells generated a diffusion potential across theirmembrane as a consequence of the selective permeability of themembrane for potassium ions and of the higher concentration ofthese ions in the intracellular compartment compared to the extra-cellular medium. According to Bernstein, the potential arose be-cause the outward movement of the positive-charged potassiumions could not be compensated by movements of other ions,because of the exclusive permeability of the membrane for potas-sium. This tended to leave an excess of negative charges in theinterior of the cell and to create an excess of positive chargesoutside (Fig. 8a and b).To account for the excitatory events in nerve and muscle,

Bernstein assumed that the excitation consisted in a disappearanceof the polarization present in the resting state (i.e., in a “depolar-ization”) consequent to a sudden and generalized increase of theion permeabilities of the membrane. Bernstein’s theory will bereferred to as membrane theory of excitation, and one of itsimplications, confirmed by later studies (see later) was that mem-brane electrical resistance decreased during excitation [15].With Bernstein the focus on electrical phenomena of excitable

cells was, therefore, based clearly on the properties of the cellmembrane. This still undefined surface of separation between theintracellular and extracellular media started to acquire a physico–chemical connotation. Apparently one of the reasons that ledBernstein to develop his membrane theory of nerve excitation wasthe consideration of the similarity between the negativity of thecurrent measured from an injured nerve and the negativity of theaction current. Because injury was likely to produce an “exposure”of the nerve interior to the recording electrode, it could be assumedthat a similar phenomenon occurred during the “negative oscilla-tion” and therefore that nerve (and muscle) excitation consisted ina reversible “rupture” of the membrane separating the intracellularand extracellular media.

The English School: Lucas and Adrian

After Bernstein the progress of knowledge on the mechanismsof electrical excitability was mainly due to the work of Englishphysiologists. A fundamental acquisition concerned the “all-or-nothing” character of electrical excitation in nerve and muscle.This character, whose origin can be traced to the work of FeliceFontana [28,29,68], had already emerged from studies carried outon heart muscle in 1871 by the American physiologist H. P.Bowditch working in Carl Ludwig’s laboratory in Leipzig [17].Bowditch noticed that if an electrical stimulus applied directly tothe isolated apex of frog heart was capable of inducing a contrac-tile response (i.e., if its intensity was larger than a minimumvalue), the strength of contraction remained constant when theintensity was further increased. On the other hand, stimuli ofintensity smaller than the minimum effective value did not result inany detectable contraction. For several years this “all-or-nothing”property seemed, however, to belong exclusively to the heartmuscle, because the strength of contraction elicited in a striatedmuscle, stimulated either directly or through its motor nerve,increased apparently in a relatively smooth way by increasing thestimulus intensity. In 1902, Francis Gotch put forward the hypoth-esis that this pattern was basically due to an increase of the numberof excited fibers, rather than an increase of the response amplitudein any excited fiber, which he supposed to be a constant quantity[37]. Following Gotch, Keith Lucas, working in Cambridge, suc-ceeded in showing that other electrically excitable tissues indeedfollow the “all-or-nothing” law. In 1905 he reduced, by carefuldissection, the number of active muscle fibers in the dorso-cuta-neous muscle of the frog to 20 or less, and excited the muscledirectly with an electrical stimulus. By increasing the intensity ofthe stimulus he found that the strength of the resulting contraction

FIG. 8. Scheme of Bernstein’s theory of membrane polarization. (a) A muscle fiber in the resting state, with an excess of negative charges insidethe membrane and of positive charge outside; (b) a lesion has removed the local barrier to ion passage provided by the membrane, and, therefore,A becomes negative with respect to B, allowing for a current flow from B to A. According to Bernstein [15], a similar phenomenon would occurduring excitation A representing then the active region of the membrane (From [15]).

394 PICCOLINO

Esquema da teoria da membrana de Bernstein. a. Célula nervosa ou fibra

muscular no estado de repouso. Há um excesso de cargas negativas do lado de

dentro da membrana e um excesso de cargas positivas do lado de fora. b. Uma

lesão na extremidade esquerda (região indicada por A) remove localmente a

membrana, que impedia a passagem de íons, e, portanto, a região A torna-se

negativa com relação à região B, de maneira que uma corrente pode fluir de B

para A. De acordo com Bernstein, um fenômeno similar ocorreria durante a

excitação da célula ou da fibra e, neste caso, A representaria a região ativa da

membrana.

O aspecto mais importante da teoria de Bernstein foi a valorização da

membrana neuronal como essencial para o entendimento dos fenômenos

elétricos nas células nervosas, mesmo que ainda pouco se soubesse na época

sobre as propriedades da membrana.


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O mais curioso, porém, sobre o modelo de Bernstein é que ele considerou apenas

o potássio como o íon mais importante e desprezou a reversão na polarização que

ele mesmo tinha observado experimentalmente em 1868. Por causa disso, a sua

teoria permaneceu incompleta, considerando apenas um dos aspectos

fundamentais responsáveis pelo comportamento elétrico da membrana neuronal.

Sabemos atualmente que durante o repouso da célula a permeabilidade da

membrana ao potássio é dominante, mas durante a fase de excitação a

permeabilidade ao sódio torna-se transientemente dominante. Foi necessário

esperar aproximadamente mais meio século depois da teoria de Bernstein para se

chegar a uma teoria de membrana mais completa e satisfatória.

O próximo passo importante nessa história foi a constatação experimental de que

a excitação elétrica em nervos e músculos é um fenômeno do tipo tudo-ou-nada.

A emergência desse conceito pode ser datada dos estudos sobre o músculo

cardíaco feitos em 1871 pelo fisiologista norte-americano Henry P. Bowditch

(1840-1911) quando ele estagiou no laboratório do fisiologista alemão Carl

Ludwig (1816-1895) na Universidade de Leipzig.

Bowditch observou que se um estímulo elétrico fosse aplicado diretamente ao

ápice do coração de sapo isolado isso seria capaz de induzir uma contração.


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Para tal, a intensidade do estímulo elétrico tinha que ser maior que um dado valor

mínimo e a força da contração era sempre a mesma independente de aumentos na

intensidade do estímulo acima desse mínimo. Estímulos abaixo do valor mínimo

não provocavam nenhuma contração detectável.

Por vários anos essa característica tudo-ou-nada parecia ser uma propriedade

exclusiva do músculo estriado cardíaco. Estudos feitos com músculos estriados

esqueléticos, estimulados diretamente ou via seu nervo motor, mostravam que a

força da contração crescia de forma graduada (suave) em função da intensidade

do estímulo.

Em 1902, o neurofisiologista inglês Francis Gotch (1853-1913) apresentou a

hipótese de que o comportamento de excitação seria do tipo tudo-ou-nada

também para as fibras musculares esqueléticas.

Segundo Gotch, a não observação de um comportamento do tipo tudo-ou-nada

quando se estimula um pedaço de músculo esquelético seria porque ele é

composto de muitas fibras.

Embora cada fibra responda a um estímulo com uma excitação constante

independente da intensidade do estímulo, o que era medido nos experimentos da

época era a resposta coletiva de todas as fibras. Ou seja, o crescimento gradual

detectado seria apenas o crescimento do número de fibras individuais excitadas

por estímulos cada vez mais intensos.


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A maneira de testar essa hipótese seria conseguir isolar poucas fibras musculares

esqueléticas para testar sua resposta.

Esse teste foi feito pelo fisiologista inglês Keith Lucas (1879-1916) na

Universidade de Cambridge em 1905.

Lucas conseguiu reduzir, por dissecação cuidadosa, o número de fibras

musculares do músculo dorso-cutâneo do sapo a 20 ou menos e realizou

experimentos em que excitava o músculo diretamente com um estímulo elétrico.

Ao aumentar a intensidade do estímulo, Lucas observou que a força da contração

resultante aumentava em passos discretos cujo número era, em geral, menor que o

número de fibras musculares em sua preparação.

Em 1909 Lucas repetiu seu experimento, mas agora estimulando o músculo por

um estímulo aplicado ao nervo motor (composto por apenas 9 ou 10 fibras

nervosas). Novamente a resposta contráctil aumentava em passos discretos cujo

número era sempre menor do que o número de fibras nervosas (figura a seguir).


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increased in discrete steps, whose number was in general less thanthe number of active muscle fibers [74].In 1909 Lucas made a comparable experiment using a similar

preparation but elicited muscle contraction through a stimulusapplied to a motor nerve [76]. Again the contractile responseincreased in discrete steps whose number was normally smaller, inthis case, than the number of the active nerve fibers (Fig. 9).A direct demonstration of the all-or-nothing character of the

propagated electrical signal in nerve emerged from the first record-ing of the electrical activity of single nervous fibers, an epoch-making discovery obtained by Lucas’ student, Adrian in 1926.Adrian, in his first study, using the capillary electrometer and avacuum tube amplifier, succeeded in revealing the presence ofindividual electric oscillations in the discharge of various sensoryfibers of both frog and cat in response to physiological stimulation[4] (Fig. 10A–C). In a second study, carried out in collaborationwith Zottermann [6], in order to better isolate the electrical activityof a single fiber, Adrian made recourse to the nerve supplying thesterno-cutaneous muscle of the frog on the assumption that thismuscle might contain just one muscle spindle. If the muscle wascut carefully in order to minimize the number of active sensoryunits, and a low mechanical load applied, the response recordedfrom the nerve consisted in a rather regular train of impulse-likedeflections of constant amplitude and duration, which were shownto represent the activity of a single sensory fiber. Increasing theintensity of the stimulus led to an increase of the discharge fre-quency without any change of amplitude and duration of everyindividual impulse. These features were later confirmed in a vari-ety of nervous (and muscular) fibers leading to the understandingthat an impulse-code modulation is the ordinary means used bymany nerve fibers (and by other excitable cells) to code informa-tion.Another property of the nervous signal, somewhat related to the

all-or-nothing feature, was revealed by the results of other exper-iments carried out by Lucas and Adrian. In these experimentssmall segments of nerve were more or less completely inactivatedby exposure to alcoholic vapors or to other procedures interfering

with the conduction process [1,2,5,77,78]. In a frog nerve-muscu-lar preparation, a long exposure time was necessary to produce theconduction block if the treatment was applied to a short nervesegment. A much shorter time was effective in blocking the nerveif a long segment was exposed. However, if the treatment wasapplied to two similar short segments, separated by a relativelylarge untreated portion, the time of application needed to producethe block corresponded closely to that necessary in the applicationto a short single segment (Fig. 11a and b). Clearly, in the untreatedportion the signal was regenerated, regaining its original ampli-tude, if the block did not exceed a certain value. The words Lucaswrote with reference to Adrian’s experiments penetrate a funda-mental aspect of the “energetics” of nerve signal propagation, andare worth quoting at length:“A disturbance, such as the nervous impulse, which progresses

in space must derive the energy of its progression from somesource; and we can divide such changes as we know into twoclasses according to the source from which the energy is derived.One class will consist of those changes which are dependent on theenergy supplied to them at their start. An example of this kind isa sound wave or any strain in an elastic medium which depends forits progression on the energy of the blow by which it was initiated.A sound wave will lose its initial energy if the medium in whichit progresses is imperfectly elastic, because the medium will beheated in its deformation. Suppose a sound wave travellingthrough air and then encountering a tract of treacle. In this passagethrough the treacle it will lose its energy more rapidly than in thepassage through the air, but on emerging into the air again it willhave suffered permanent loss, and will not recover the energywhich it had before it entered the treacle. A second class ofprogressive disturbance is one which depends for its progressionon the energy supplied locally by the disturbance itself. An exam-ple of this type is the firing of a train of gunpowder, where theliberation of energy by the chemical change of firing at one pointraises the temperature sufficiently to cause the same change at thenext point. Suppose that the gunpowder is damp in part of the train;in this part the heat liberated will be partly used in evaporating

FIG. 9. The 1909 experiment of Lucas and the all-or-nothing law. The abscissa represents the strength of the electrical stimulus appliedto the motor nerve and the ordinate the mechanical response of the muscle (height of the contraction of the cutaneous dorsi muscle ofthe frog). Notice the step-like transitions in the muscle response as the intensity of the stimulus is increased within a critical range (From[76]).

LUIGI GALVANI AND ANIMAL ELECTRICITY 395

Figura retirada do artigo de 1909 de Lucas, intitulado “A contração “tudo ou

nada” da fibra muscular esquelética de anfíbio”. A abscissa representa a força do

estímulo elétrico aplicado ao nervo motor e a ordenada representa a resposta

mecânica do músculo (altura de uma alavanca levantada pela contração do

músculo). Observe o crescimento em degraus da resposta para estímulos acima de

um valor mínimo.

Infelizmente, Lucas morreu aos 37 anos em combate aéreo durante a Primeira

Guerra Mundial e não pode continuar seus estudos científicos.

A linha de pesquisa iniciada por ele foi continuada por seu estudante, e mais tarde

professor da Universidade de Cambridge, o eletrofisiologista inglês Edgar Adrian,

Lord Adrian, (1889-1977).

Em 1926, Adrian realizou um experimento para medir a atividade elétrica de tipo

tudo-ou-nada de uma única fibra nervosa.


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Em seu experimento, Adrian usou um eletrômetro capilar e um amplificador a

válvula. Antes de passar à descrição do experimento e seu resultado, vamos

descrever abaixo o que é um eletrodo capilar, um dos mais importantes

instrumentos usados para medir diferenças de potenciais elétricos entre o fim do

século XIX e as primeiras décadas do século XX.

O eletrômetro capilar foi inventado pelo físico francês Gabriel Lippmann (1845-

1921) em 1872. O seu funcionamento se baseia nos fatos de que (1) existe uma

diferença de potencial na interface entre mercúrio e ácido sulfúrico diluído e que

(2) a tensão superficial nessa interface muda quando a diferença de potencial

entre os dois fluidos é alterada.

A figura da página seguinte (esquerda) mostra o esquema do eletrômetro capilar

de Lippmann.

O eletrodo capilar foi muito usado no fim do século XIX e início do século XX

para medir diferenças de potencial entre diferentes pontos da superfície do corpo

de humanos e animais.

Em particular, ele foi usado pelo fisiologista inglês Augustus D. Waller (1856-

1922) para fazer o primeiro registro eletrocardiográfico em 1887 (figura da

esquerda a seguir, parte de baixo).


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A Brief History of Electrocardiography - Progress through Technology

Chr. Zywietz

Biosigna Institute for Biosignal Processing and Systems Research, Hannover, Germany

First explorations of bioelectricity and electricity generated by the heart

Knowledge of bioelectricity started with the observation by L. Galvani in 1787 [1] that a frog muscle contracted when exposed to an electrical discharging process. Galvani postulated the idea of animal electricity, which was for a long time strongly opposed by Alessandro Volta. Only after the development of sensitive Galvanometers (Nobili in 1825 and others) it was possible to prove that there are charges and currents within the frog itself. Matteucci demonstrated in 1843 that also from the resting heart muscle electrical current could be measured [2]. DuBois-Reymond has investigated these Phenomena in more detail and introduced for the changing current associated with muscle contraction the term ìaction potentialî [3]. An action current on the spontaneous beating heart associated with the systolic shortening of the myocard fibres has been first observed by Koelliker and M¸ller [4]. DuBois-Reymond developed - by applying a galvanometer - an instrument capable of delivery of stimulation pulses to muscles and measuring discharge currents in a shortly alternating modus. Because of its ìflow slicingî it was called a ìrheotomeî. In 1878 Engelmann [5] was the first to present graphically the time course of the variations in electric potential of the frog heart obtained by Bernsteinís differential rheotome, a modification of the DuBois-Reymond instrument. The first to record electric potentials associated with the beating heart from the body surface was Augustus Desiree Waller in 1887 - 1888 [6].

Waller carried out his studies using the capillary electrometer invented by the French physicist Gabriel Lippmann in 1873 [7]. Figure 1 depicts the capillary electrometer.

Fig. 1. The capillary electrometer as constructed by Lippmann in 1873. Its function is based on the principle of polarization and surface tension at the mercury-sulfuric acid interface. Electric potentials are sensed by the two wires connected with the sulfuric acid and with the mercury. If the potential difference changes, the mercury meniscus will be moving. The position of the meniscus could be observed by a microscope or be projected onto a screen. If that screen is covered with photosensitive material and the screen is moved perpendicular to the axis of the capillary, time varying potential differences may be seen on the photosensitive screen as function of the length (x-axis). The lower part of the figure shows three tracings: on top t a time marking at every 50 ms, in the middle the cardioscope recording and trace e is the electrometer recording.

Eletrômetro capilar de Lippmann (figura da esquerda, topo). Um tubo capilar é

preenchido com mercúrio e ácido sulfúrico diluído. Os potenciais elétricos no

mercúrio e no ácido sulfúrico diluído são medidos por eletrodos colocados em

contato com os dois fluidos. Quando a diferença de potencial entre os dois se

altera, as bordas do menisco de mercúrio se movem. A posição do menisco pode

ser observada com um microscópio ou projetada numa tela.

Se a tela for recoberta com algum material fotossensível e puder ser posta em

movimento perpendicularmente ao eixo do capilar, as variações temporais da

diferença de potencial podem ser registradas na tela fotossensível em função do

comprimento (eixo-x).


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A parte de baixo da figura da esquerda mostra três traços: o indicado por t indica

o tempo, marcado a cada 50 ms; o do meio é o registro com o cardioscópio (um

instrumento que mede os deslocamentos mecânicos do coração); o de baixo é o

registro com o eletrômetro feito por Waller em 1887.

A figura da direita da página anterior ilustra o princípio de registro da diferença

de potencial entre os lados direito e esquerdo do corpo com o eletrômetro capilar.

Nas palavras do próprio Waller para a audiência de um congresso internacional de

fisiologia na Basiléia, Suíça (1889):

“O disco de luz sobre a tela transparente em frente a vocês é do campo de um

microscópio iluminado por trás. A sombra vertical é de um tubo capilar fino com

uma metade cheia com mercúrio e a outra metade cheia com ácido sulfúrico, isto

é, um eletrômetro capilar de Lippmann. Os baldes de água salgada nos quais eu

agora imerso minhas mãos estão conectados aos dois polos do eletrômetro, o

balde onde está a mão direita ao ácido sulfúrico e o onde está a mão esquerda ao

mercúrio. Vocês veem que o mercúrio pulsa com um ritmo que, obviamente, é o

do meu coração. E aqueles que estiveram mais perto da tela poderão distinguir

que a cada batida há um movimento duplo da coluna de mercúrio”.


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By means of the capillary electrometer Waller investigated systematically the potential distributions associated with the beating heart on man and animals. Figure 2 depicts a display from Wallerís original publication in 1887 [6, 8].

Fig. 2. Distribution of negative and positive potentials on human and animal body surfaces. Waller even predicted the reversal of the electrical pattern in case of situs inversus [6, 7].

Between 1893 and 1896 George J. Burch and Willem Einthoven developed methods of calibrating and correcting records obtained from the capillary electrometer and predicted finally a signal shape which was close to the ìtrueî ECG shape [9] (see Figure 3). Einthovenís denomination of electrocardiographic waveforms is in use until today.

Fig. 3. Electrocardiographic notation suggested by Einthoven, which resulted from his work with the capillary electrometer and which is very similar to that in use at present time (see Einthoven, W. [9]).

It deserves our unrestricted admiration that and how these scientists (without the tools of modern systems theory) predicted the ECG signal just by ìthinkingî before its shape has been confirmed so brilliantly by the next generation of electrical measurement instruments.

By means of the capillary electrometer Waller investigated systematically the potential distributions associated with the beating heart on man and animals. Figure 2 depicts a display from Wallerís original publication in 1887 [6, 8].

Fig. 2. Distribution of negative and positive potentials on human and animal body surfaces. Waller even predicted the reversal of the electrical pattern in case of situs inversus [6, 7].

Between 1893 and 1896 George J. Burch and Willem Einthoven developed methods of calibrating and correcting records obtained from the capillary electrometer and predicted finally a signal shape which was close to the ìtrueî ECG shape [9] (see Figure 3). Einthovenís denomination of electrocardiographic waveforms is in use until today.

Fig. 3. Electrocardiographic notation suggested by Einthoven, which resulted from his work with the capillary electrometer and which is very similar to that in use at present time (see Einthoven, W. [9]).

It deserves our unrestricted admiration that and how these scientists (without the tools of modern systems theory) predicted the ECG signal just by ìthinkingî before its shape has been confirmed so brilliantly by the next generation of electrical measurement instruments.

A figura acima (topo) mostra um registro do potencial cardíaco feito com um

eletrômetro capilar pelo médico e eletrofisiologista holandês Willem Einthoven

(1860-1927). A parte de baixo da figura mostra um eletrocardiograma (ECG)

feito pelo mesmo Einthoven com a notação das formas de onda introduzida por

ele e usada até hoje. Note que o traço obtido pelo eletrômetro capilar não é muito

diferente do ECG.


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Voltando à nossa história, em 1926 Lord Adrian realizou pela primeira vez na

história o registro da atividade elétrica de uma única fibra nervosa. Ele trabalhou

com o nervo ciático do sapo dissecado de tal forma que apenas duas ou três fibras

ficavam expostas ao registro (figura abaixo).

IMPULSES IN PHRENIC NERVE FIBRES.

across by pressure with a fine hook (Fig. 1 C) and the central strand isthen split in the same way. The object of the dissection is to leave a few

Fig. 1. Method of dissecting nerve so as to divide all but two or three fibres.

fibres in the middle of the nerve intact but separated as far as possiblefrom one another. If this is accomplished, the remaining fibres are,cautiously divided until only the smallest strand is left joining the twoends of the nerve (Fig. 1 D). We have rarely attempted to carry thedissection to the stage at which only one fibre is left undivided. Onefibre chosen at random might turn out to be afferent and not motor, andit is much harder to isolate a single fibre than to isolate a group of threeor four. The electrical records usually provide sufficient evidence of thenumber of motor fibres in action, and the actual number of undividedfibres can be checked by microscopical examination after the experimentis over. The number of undivided fibres has always been greater than the-number of motor fibres which appear to be in action in our records.

The process of dissection and still more the subsequent manipulationof the nerve might be expected to prove rapidly fatal to the few fibreswhich bridge the gap, but fortunately the connective tissue sheath (whichhas been split but not cut transversely) acts as a most effective splint andprevents undue tension or displacement. In fact the nerve can be handledas though it were still undamaged, and the surviving fibres give a dis-charge which shows no signs of alteration for periods as long as twohours.

Each stage in the dissection is controlled by observing the impulsedischarge in the nerve distal to the division. The distal portion is slung ontwo small paint brush electrodes (cf. Adrian and Zotterman(6)), theproximal connected to earth and the distal to the input of the three valveamplifier described elsewhere(7). The amplified action currents can bephotographed with the capillary electrometer, but until the final stagesare reached it is usually more convenient to lead them to a telephone or

6-2

83

A estimulação do músculo era feita por um peso preso a ele, esticando-o. Os

resultados de Adrian revelaram a existência de oscilações elétricas individuais nas

fibras nervosas do sapo em resposta a estimulação (figuras A, B e C a seguir).

As figuras A, B e C a seguir são os primeiros registros publicados da atividade

elétrica unitária em fibras nervosas sensoriais eliciadas por estímulos fisiológicos.

As respostas elétricas foram obtidas com um eletrômetro capilar colocado em

contato com o nervo ciático do sapo e a ativação do nervo foi feita por

estimulação mecânica (um peso) do músculo gastrocnêmio.

O traço acima dos registros é uma calibração temporal feita com um diapasão

oscilando à frequência de 200 Hz.


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water, and the temperature rise will be less, so that the progress ofthe chemical change may even be interrupted; but if the firing doesjust succeed in passing the damp part, the progress of the changein the dry part beyond will be just the same as though the wholetrain had been dry [78].”From the studies of Adrian and Lucas, it became increasingly

evident that the amplitude and time course of the propagated signalin nerve and muscle depend in an essential manner on the localconditions of the nerve region in which it is recorded (or otherwisetested), and not on the intensity of the stimulus, nor on theconditions of the nerve region from which it originates (providedthat the stimulus is of sufficient intensity and the propagation is notcompletely blocked in between).In the work of Lucas, and in the initial studies of Adrian, the

nervous signal is generally referred to as “propagated disturbance”to distinguish it from the local effects induced by electrical stim-ulation near the site of stimulus application, effects that could berevealed especially by using subthreshold stimuli. “Propagateddisturbance” was also a noncommittal term employed to avoidpossible objections against the notion that the nerve signal was

essentially an electrical phenomenon. As a matter of fact, althoughit was generally recognized that nerve excitation was constantlyassociated with an electrical event, it was still unsettled whetherelectricity was the fundamental process of nerve signaling, orsimply one of its many possible manifestations (such as heatproduction, chemical modifications), a sort of epiphenomenon ofan underlying, more essential, process.It may seem surprising that the electrical nature of nerve signal

was still matter of debate more than one century after Galvani, andlong after Matteucci and du Bois-Reymond. As a matter of fact,theories of nerve conduction giving a predominant importance tochemical mechanisms have, for a long time, challenged hypothesesbased on the preeminence of electrical phenomena. For instance in1946, Nachmansohn proposed that acetylcholine could serve as a“messenger” for the conduction of the nerve impulse [89] and thishypothesis has persisted in the paths of science as late as 1975[90].The unequivocal evidence that the nervous signal is fundamen-

tally an electrical event, as Galvani had supposed at the end of the18th century, had to await for the most modern epoch of electro-physiology (i.e., the period of studies of nerve physiology carriedout by Hodgkin and his collaborators in Cambridge), which led tothe final elucidation of the mechanism underlying the generationand propagation of the nerve signal. However, the seeds for thismodern development can be traced back to the work of Lucas andAdrian.Before considering some aspects of this work in detail, we

should recognize that the difficulties in accepting the view that thenerve signal is an electrical event were not without logicalgrounds. The conduction of the nervous signal seemed to be tooslow for an event based on the propagation of a typical electricalsignal along a metallic wire. Moreover, starting from the initialobservations of von Helmholtz [44,47], it appeared that tempera-ture exerted a profound effect on the rate of propagation of nervousimpulses [101,102], and evidence had been accumulating pointingto a strong temperature dependence of other kinetic parameters ofthe propagated nervous disturbance [3,10,18,38,75]. Because ahigh temperature coefficient was generally considered to be anindication of the involvement of chemical reactions, these findingsled to envisioning the nervous impulse fundamentally as a chem-ical event [72], although the straight-forward applicability of thisreasoning to the case of the phenomena of cell excitation andconduction was questioned by some authors [3,72].From the studies of Adrian, Lucas, and their predecessors it

appeared increasingly evident that the electrical stimuli of intensityinsufficient to generate the “propagated disturbance” (or sub-threshold in modern terminology) were nevertheless capable ofincreasing the electrical excitability of a narrow segment of nervearound the point of application, and for a limited time duration[1,2,5,77,78]. A stimulus that was subthreshold if applied alone,could lead, through this mechanism, to the appearance of a fullydeveloped nerve signal if applied in combination with anothersimilar stimulus. Besides, this explained why a train of electricalstimuli could be more effective in stimulating a nerve whencompared to a single electrical pulse [5]. These findings suggestedthat “local responses” did not follow the all-or-nothing law aspropagated responses did. The different character of the two phe-nomena was also evident in that the arrival of a propagatedresponse was followed by a temporary reduction of local excit-ability (a phenomenon already recognized in the heart muscle byFelice Fontana [29,68], and denoted as the “refractory phase” byMarey in 1876 [80]). This reduced excitability contrasted with theincrease in electrical excitability which, as we have seen, appearedto be associated with weak stimuli. On the other hand, notwith-standing the obvious differences between local and propagated

FIG. 10. The first published recording of unitary electrical activity insensory nerve fibers elicited by physiological stimuli. The electrical re-sponses were derived with a capillary electrometer from the sciatic nerveof frog, and a mechanical stimulus applied to the gastrocnemius in order toactivate muscle sensory receptors therein. The trace above the recordingsis a time calibration provided by a tuning fork oscillating at the frequencyof 200 Hz. (A) Control, nerve killed near the muscle, no response; (B)muscle relaxes, no weight, no response; (C) wt. of 100 g applied for 10 s:clearly detectable, upward pointing deflections appear in the recordingtrace (From [4], modified).

396 PICCOLINO

A. Controle. Nervo morto próximo ao músculo, sem resposta. B. Músculo

relaxado (sem peso), sem resposta. C. Peso de 100 g aplicado por 10 s. O traço

mostra claramente várias deflexões.

Um segundo estudo de Adrian, feito em colaboração com o fisiologista sueco

Yngve Zotterman (1898-1982), que visitou seu laboratório em Cambridge em

1926, consistiu de registros da atividade elétrica em um dos pequenos músculos

do pescoço do sapo. As fibras musculares eram cortadas de tal forma que apenas

uma pequena parte da sua terminação permanecia presa ao nervo. Adrian assumiu

que nessa pequena parte havia apenas um fuso muscular (receptor sensorial), de

maneira que a estimulação ativaria apenas uma fibra.


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A estimulação por uma pequena carga mecânica (peso) revelou uma resposta no

nervo que consistia de um trem regular de deflexões com amplitude e duração

constantes (como impulsos propagando-se pela fibra).

E. D. ADRIAN AND Y. ZOTTERMAN.passage-of.sensory impulssto the central nervous system. The sensationdiminishes after. a time, but it; does so very slowly. The difierencebetween the response of a nerve and an end-organ to a constant stimuluscan. therefore be represented diagrammatically as in Fig. 3 B. Now ifwe assume that the end-organ reacts in exactly the same way as the nervefibre, with this one exception of a much slower rate of adaptation, it isobvious that. a steady stimulus will produce a regular discharge of im-pulses. When the stimulus is firt applied an impulse will be set up andthe end-organ will become refractory. It will recover and, as soon as itsexcitability had returned to the requisite value, another impulse willbe set up. If the stimulus has the strength a, (Fig. 3 A) the impulses

* ma a a 0la Va a a .s.. 2IsJom

Mig. 4 A, B and C. Exp. 1. Single end-organ in action. Rhythm with various loads.A. 1I grmn., 10 sec. ,Frequency 33 per mec.B. f, grin,, 10 sec. Frequency 27 per sec.(C. J gri., 10 se. Frequency 21 per se. Les regular.D. -,-xp. 15. Cinemnatograph film. Gradual loading and progressve increase in fr-equency.

158

O aumento da intensidade do estímulo provocava o aumento da frequência de

descargas elétricas, sem variação na amplitude e na duração dos impulsos. Esses

resultados foram confirmados por medidas com outras fibras nervosas (e

musculares), levando Adrian a propor que a maneira como a informação sobre os

estímulos é codificada pelos nervos é através de um código de frequência de

impulsos (figura acima).


14

Os estudos de Adrian e Lucas reforçaram a hipótese de que o sinal nervoso é de

natureza elétrica. Além disso, eles mostraram que o sinal nervoso que se propaga

pelos nervos e músculos consiste de pulsos estereotipados cuja amplitude e

variação temporal não dependem da intensidade do estímulo (mas a frequência

dos pulsos sim), desde que essa intensidade tenha um valor suficientemente

grande.

O nome dado por Lucas, e mantido por Adrian em seus estudos iniciais, para o

pulso que se propaga pelos nervos e músculos era “distúrbio propagado”

(atualmente ele é chamado de “potencial de ação”). Esse nome era

suficientemente neutro para evitar conflitos com os que eram contrários à

hipótese de que o sinal nervoso é de natureza elétrica (mesmo em plena década de

1930 ainda havia cientistas que debatiam essa hipótese).

O termo usado por Lucas e Adrian também foi escolhido para diferenciar a

perturbação nervosa que se propagava pelo nervo das perturbações locais que

eram induzidas no local da aplicação do estímulo. Essas perturbações locais

podiam ser estudadas usando estímulos subliminares, ou seja, estímulos

insuficientes para produzir um “distúrbio propagado”.

Adrian observou que um único estímulo subliminar aplicado a um nervo não

produz um sinal nervoso (distúrbio propagado), mas a aplicação de dois ou mais

estímulos subliminares pode levar ao aparecimento de um sinal nervoso bem

definido.


15

Isso explicava porque um trem de estímulos elétricos poderia ser mais efetivo em

estimular um nervo do que um único estímulo isolado.

As respostas elétricas locais induzidas em um nervo por um estímulo subliminar

foram chamadas por Adrian de “respostas locais” (atualmente, diríamos que essas

respostas são flutuações localizadas do potencial de membrana com amplitude

inferior ao limiar de voltagem para a geração de um potencial de ação).

As descobertas de Adrian sugeriam que as “respostas locais” não seguem a lei do

tudo-ou-nada válida para os “distúrbios propagados”. Além dessa diferença entre

os dois fenômenos, Adrian também observou outra:

A passagem de um “distúrbio propagado” por um ponto em um nervo era seguida

por uma redução temporária da excitabilidade local naquele ponto (isto é, por um

dado tempo ficava mais difícil provocar a ocorrência de um “distúrbio

propagado” naquele ponto). Esse fenômeno já era conhecido antes de Adrian.

Felice Fontana o observou no músculo cardíaco e o fisiologista francês Étienne-

Jules Marey (1830-1904) o denominou de “fase refratária” (atualmente usa-se o

termo “período refratário”).

De maneira oposta, a passagem de uma “resposta local” em um ponto em um

nervo era seguida por um aumento temporário na excitabilidade local naquele

ponto (isto é, por um dado tempo ficava mais fácil provocar a ocorrência de um

“distúrbio propagado” naquele ponto).


16

Em síntese:

- Estímulo fraco (abaixo do limiar) → aumento temporário da excitabilidade

local → facilitação da ocorrência de um distúrbio propagado caso mais

estímulos fracos sejam aplicados no local

- Estímulo forte (acima do limiar) → distúrbio propagado → redução

temporária da excitabilidade no local

Adrian também realizou um experimento em que uma região do nervo de um

sapo era resfriada pela aplicação de vapor de álcool. Esse resfriamento impedia a

passagem de um “distúrbio propagado” pela região resfriada, mas Adrian

observou que quando o “distúrbio propagado” chegava ao início da região que

bloqueava sua passagem, na outra extremidade dessa região ocorria um aumento

na excitabilidade local. Esse resultado era compatível com a teoria do circuito

local de Hermann (ver aula passada) e sugeria que um “distúrbio propagado” é

precedido por uma onda de aumento de excitabilidade.

Enquanto Adrian realizava seus experimentos na Inglaterra, do outro lado do

Atlântico, nos Estados Unidos, o biofísico americano Kenneth Stewart Cole

(1900-1984), trabalhando na Universidade de Colúmbia em Nova York e no

Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole na península de Cape Cod no

estado de Massachusetts, começava um estudo sistemático sobre as propriedades

elétricas das membranas celulares.


17

Cole usava uma ponte de Wheatstone de corrente alternada para medir a

impedância da membrana de células de invertebrados e vertebrados imersas em

uma solução salina (banho). Ele trabalhou com ovos de ouriços-do-mar, algas

gigantes, axônios gigantes de lula e músculos de sapos. Os experimentos de Cole

davam essencialmente sempre os mesmos resultados, resumidos a seguir:

Cada célula tem um citoplasma de alta condutância (condutividade elétrica com

valor entre 30 a 60% do valor da condutividade elétrica da solução salina usada

como banho). O citoplasma está isolado do banho por uma membrana de baixa

condutância e capacitância elétrica de aproximadamente 1 µF/cm2.

Os experimentos de Cole confirmaram a teoria da membrana de Bernstein e

deram suporte à teoria do circuito local de Hermann. Na visão que começava a

emergir sobre o comportamento elétrico de uma célula nervosa, esta passava a ser

vista como tendo um interior (citoplasma) no qual os íons podem se movimentar

quase tão livremente como se estivessem no espaço extracelular separado do

exterior por uma membrana de dimensões moleculares e baixa permeabilidade ao

fluxo iônico.

O axônio de um neurônio podia então ser imaginado como um tubo condutor

cilíndrico (como um cabo submarino) isolado do meio extracelular por uma

membrana de capacitância e resistência elétricas bem definidas. Uma perturbação

elétrica em um ponto desse cabo se propagaria passivamente como um fluxo de

corrente ao longo da direção axial do cilindro para regiões vizinhas do ponto.


18

Parte dessa corrente escaparia pela membrana e fluiria pelo meio extracelular de

volta ao ponto onde a perturbação se originou (veja a figura do modelo do

circuito local de Hermann na página 31 da aula passada).

Voltando à Inglaterra, na segunda metade da década de 1930 o então jovem

fisiologista Alan Lloyd Hodgkin (1914-1998) da Universidade de Cambridge

realizou experimentos que comprovaram de forma definitiva o modelo de

condução elétrica do impulso nervoso.

Hodgkin repetiu os experimentos de Adrian da década de 1920 em que a

propagação do impulso nervoso pelo nervo ciático de um sapo é bloqueada pelo

resfriamento de um pedaço do nervo. Ele aplicava estímulos elétricos em um dos

lados intactos do nervo e observava o efeito do outro lado (medindo a contração

do músculo) no momento em que o impulso nervoso atingia a fronteira entre a

região intacta e a região bloqueada (veja a figura a seguir).


19

A. L. HODGKINshock S1 applied to A produced no response at C (Fig. 1). A sub-threshold shock S2 was then applied to B; since this was below threshold,it also produced no response. However, if the two shocks were combinedso that S2 followed S1 by 1 or 2 msec., impulses were set up and couldbe detected at C. Clearly the volley of blocked impulses increased theexcitability beyond the block and enabled S2 to excite. Subsequentexperiments showed that the increase in excitability lasted for a fewmilliseconds, and that it might involve a decrease of 90 p.c. in theelectrical threshold.

si A

Blocked y';

Block |

S2+

" C *excitabikty ,

Fig. 1. Fig. 2.

This kind of summation can be observed in Various ways; thus B lair& Erlanger [1936] found that it occurred in anodally polarized nerves,and I. have observed it at pressure as well as at cold blocks. The im-portant point about the observation is that it provides a method oftesting theories of nervous transmission. According to an electrical theorythe explanation of summation would be that eddy currents spreadthrough the block and increase excitability in the nerve beyond. Fig. 2shows how the conventional local circuit diagram can be extended toexplain the interaction between blocked impulse and subthreshold shock.If the flow of current beyond the block was just below threshold, animpulse would not traverse the block, but it would produce a largeincrease in excitability. The electrical view of nervous transmissionwould be considerably strengthened if it could be shown that theincrease in excitability was produced in this way. If the local circuits set

184

Segundo as próprias palavras de Hodgkin no artigo de onde a figura acima foi

retirada (Hodgkin, A. L., Evidence for electrical transmission in nerve. Part 1. J.

Physiol. (London) 90:183-210, 1937):

Um nervo foi bloqueado pela ação de resfriamento local. Quando o bloqueio foi

completo, um choque máximo S1 aplicado em A não produzia resposta em C. Um

choque subliminar S2 era então aplicado a B; como ele era abaixo do limiar, ele

também não produzia resposta. Entretanto, se os dois choques fossem

combinados de maneira que S2 seguisse S1 por 1 ou 2 milisegundos, impulsos

eram ativados e podiam ser detectados em C. Claramente o trem de impulsos

bloqueados aumentava a excitabilidade do nervo além da região bloqueada e

permitia que S2 gerasse excitação.


20

Tendo demonstrado que um potencial de ação1 gerado antes da região bloqueada

produz uma redução no limiar de excitação (potencial local) depois da região

bloqueada, Hodgkin mediu como esses potenciais locais se propagavam ao longo

do nervo à frente da região bloqueada.

Ele observou que a amplitude de um potencial subliminar decai

exponencialmente com a distância percorrida à medida que ele se propaga ao

longo do nervo (veja a figura a seguir, extraída do mesmo artigo citado acima).

case for a close relationship between signal propagation and elec-trical events in the nerve. This relationship was further supportedby the results of a subsequent study aimed at investigating thechanges of conduction speed induced in both crab and squid nervesby modifications of the conductivity of the extracellular medium.It was found that the speed decreased when the conductivity wasdecreased (by immersing the nerve in oil or reducing the volumeof conductive fluid around it) and, on the contrary, it increasedwhen the conductivity was increased by making recourse to me-tallic conductors [54].In the crab nerve, moreover, Hodgkin succeeded in showing

that a local electrical response, comparable to that appearing aftera partial conduction block, could be elicited near the site ofapplication of a subthreshold electrical stimulus. An electrode wasused to stimulate a nerve with short electrical pulses of differentintensities, and the resulting electrical responses were recorded inthe immediate vicinity with another electrode [53]. The responsesbrought about by anodal stimuli (i.e., stimuli that produced apositive potential on the external nerve surface, and were, there-fore, of opposite polarity to those capable of eliciting a nerveimpulse) appeared to be largely the result of a passive spread ofcurrent along the nerve fibers. With cathodal (i.e., external nega-tive) stimuli the responses were mirror images of those obtainedwith anodal stimulation only as far as small intensities were

concerned. Large stimuli evoked responses characterized by aprominent tail. These responses did rather abruptly develop intofull impulsive events, when the stimulus exceeded a “threshold”value. Again this finding confirmed the expectations of Lucas andAdrian, based on the observations of local excitability changeselicited by weak electrical stimuli in frog nerves. It remained to beinvestigated what functional relationship existed between the sub-threshold responses evoked by cathodal stimuli and the full-blownnerve response, and how the localized potential changes, whichaccompanied the leading edge of this response, intervened in theconduction process. This required major advances in the experi-mental preparation and technique, advancements that were on theway after the “rediscovery” by J. Z. Young of the existence in thesquid of a “giant axon” which, by its size, appeared ideal forelectrophysiological recordings [111]. Using extracellular elec-trodes, Cole and Curtis provided clear evidence that the actionpotential in this axon was accompanied by a decrease in membraneresistance [24] (Fig. 13).Both Cole and Curtis, and Hodgkin and Huxley, succeeded

afterwards in inserting an electrode inside the axon and in mea-suring directly the transmembrane potential in the resting state andduring excitation [25,60]. The existence of the resting membranepolarization postulated by Bernstein was confirmed by these stud-ies (the interior of the cell being about 50 mV negative with

FIG. 12. The initial experiments of Hodgkin. (a) Increase of excitability; (b) appearance of subthreshold depolarizations in the region distal to the site ofa block induced by local cooling. In (a) the increase of excitability is observed only if the test shock (S2) is applied after the control shock (S1) with a delaycorresponding to the conduction time between the two sites of stimulation. (b) The upper record, A, represents the action potential recorded proximally tothe block, while the lower recordings B–F are the potentials recorded at progressively longer distances beyond the blocked site. Note the progressivedecrease of potential with the distance from the block, and the calibration difference between A and B–F. (From [51]).

398 PICCOLINO

1 A partir deste ponto, vamos começar a nos referir ao pulso elétrico que se propaga por um nervo ou neurônio pelo seu nome moderno: potencial de ação.


21

No traço de cima (A) está mostrado o potencial de ação registrado num ponto

antes da região bloqueada. Os traços posteriores (B−F) mostram os potenciais

subliminares registrados além da região bloqueada, em pontos cada vez mais

distantes dela. Note o progressivo decaimento do potencial com a distância

(perceba que houve uma mudança de escala para mostrar os pulsos em B−F em

relação a A).

Posteriormente, Hodgkin notou que não era necessário fazer um experimento com

uma região bloqueada do nervo para observar o decaimento do potencial com a

distância. Um potencial subliminar gerado em um ponto de um nervo intacto se

propagava pelo nervo com sua amplitude diminuindo exponencialmente com a

distância. Ele interpretou esse fenômeno em termos do modelo de circuito local

de Hermann como sendo a propagação passiva de um pulso elétrico gerado em

uma região excitada da membrana para regiões não excitadas da membrana.

O que faltava era mostrar que essa excitação elétrica que se propagava a partir da

geração de um pulso subliminar em um ponto do nervo era da mesma natureza

que a excitação propagante que seguia à frente de um potencial de ação quando

este se propagava pelo nervo.

Isso tornou-se possível a partir de um trabalho realizado por Cole e seu

colaborador Howard J. Curtis (1906-1989) em 1939 no Laboratório de Biologia

Marinha em Woods Hole.


22

Desde 1936, Cole e Curtis vinham usando uma ponte de Wheatstone de corrente

alternada de alta sensibilidade desenvolvida por eles para realizar medidas da

capacitância e da resistência de membrana de diferentes tipos de célula.

Eles trabalharam inicialmente com a alga de água doce do gênero Nitella2 e

mostraram que a capacitância da sua membrana superficial vale 1 µF/cm2 e não

muda de valor durante a passagem de um potencial de ação. Porém, a

resistência da membrana superficial é fortemente reduzida quando um

potencial de ação passa pelo ponto de medição.

Em 1936, Cole encontrou-se com o zoólogo inglês John Zachary Young (1907-

1997) em um congresso nos Estados Unidos e este contou-lhe sobre uma nova

preparação experimental com a qual estava trabalhando. Tratava-se do axônio

gigante de lula.

Young tinha descoberto na região do manto da lula fibras nervosas bastante

grossas que se “pareciam com veias”. Posteriormente, ele mostrou que essas

fibras são de fato axônios motores que controlam a contração do manto causando

a expulsão de um poderoso jato de água que impulsiona o animal para a frente ou

para trás para que ele possa atacar uma presa ou escapar de um predador. Young

chamou esses axônios motores de axônios gigantes (veja a figura a seguir).

2 Essa alga tem células cilíndricas longas capazes de transmitir impulsos elétricos de duração bem mais lenta (1 segundo) que a dos impulsos em nervos de animais. Pode parecer estranho, mas algumas plantas têm a capacidade de disparar impulsos elétricos para sinalizar eventos.


23

Cole percebeu que o axônio gigante de lula seria um modelo ideal para o estudo

da propagação nervosa por uma única fibra nervosa, ao contrário do que vinha

sendo feito até então com músculos e nervos de animais como o sapo (compostos

por vários axônios).

Cole e Curtis usaram eletrodos externos ao axônio gigante para estimulá-lo e

medir o potencial de ação gerado e, ao mesmo tempo, com sua ponte de

Wheatstone, medir a variação na resistência da membrana do axônio no ponto

pelo qual o potencial de ação passava. O resultado obtido por eles é que a

resistência da membrana é fortemente reduzida pela passagem do potencial de

ação. Correspondentemente, a condutância da membrana é fortemente aumentada

pela passagem do potencial de ação.

A figura abaixo, retirada do artigo original de Cole e Curtis (Cole, K. S. and

Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. J. Gen.

Physiol. 22:649-670, 1939) mostra o resultado deles.


24

respect to the exterior [60] (Fig. 14). Unexpectedly, however, itappeared that during excitation the potential overshot the zerolevel by several tens of millivolts, a finding that was clearly incontrast with Bernstein’s membrane theory (no substantial differ-

ence of potential should exist across the membrane if this becamepermeable to all ion species), but well in line with the initialobservation, made by Bernstein himself (and in less ancient timesby Shaefer [98]) that the amplitude of the action current couldsometimes exceed that of the injury current. The interpretation ofthese results was postponed by the Cambridge group because ofthe events of war.In 1949, Hodgkin and Katz succeeded in showing that the

action potential of the squid nerve decreased in amplitude bydecreasing the extracellular concentration of sodium ions, andsuggested that this was the consequence of the involvement of aselective increase of membrane permeability for sodium ions in thedischarge of the action potential [66]. Because sodium ions arelargely in excess in the extracellular medium compared to the axoninterior, the resulting electrochemical potential would be positive(axon interior vs. extracellular compartment), and therefore, mem-brane potential would change polarity during excitation as a con-sequence of the sodium permeability increase. In other words, themembrane potential, which in the resting state depended on thepermeability for potassium ions, would be largely dominated dur-ing the excitation by the permeability for sodium ions, and thepassage from the one to the other of the two conditions would bethe consequence of a specific change of membrane permeabilityinduced by the electrical stimulus. The notion that the membranebecame selectively permeable to sodium at the peak of the actionpotential was an important revision of the Bernstein’s theory,which assumed an unselective passage of all ions during theexcitation, a theory which, as already mentioned, implied thealmost complete disappearance of any difference of membranepotential whatsoever during nerve excitation.In order to verify whether the new theory, based on a transition

between two permeability states of the membrane, could accountfor the basic properties of nerve excitation and conduction, it wasnecessary to study in an accurate and quantitative way the changesof membrane currents and permeability accompanying the appear-ance of the action potential. However, a study of this kind wasdifficult with conventional techniques, because the “regenerative”and “explosive” properties of the action potential discharge did notpermit a study of the relationship between membrane current andmembrane voltage during the excitation process. To obtain accu-rate information on the electrical events responsible for the actionpotential it was necessary to circumvent the explosive character ofthis event, by forcing the membrane potential to assume, and tomaintain, certain levels in spite of its tendency to evolve sponta-neously when the threshold value was exceeded.

The Voltage Clamp, the Squid Axon, and the Hodgkin-HuxleyModel

The sought for technique that made possible the study ofmembrane events underlying the generation of action potentialswas the voltage-clamp devised in 1949 by Cole [23] and byMarmont [81]. It was applied in a masterly way to the squid axonby Hodgkin and Huxley in collaboration with Katz, in a series ofstudies published in 1952, which represent a fundamental mile-stone in the investigations on animal electricity [61–65]. In theepoch of Lucas and Adrian, the explosive character of the propa-gated response had been somewhat subdued by using proceduresbased on partial block of small segments of the nerve, but theseprocedures could give little information about what would happenonce the threshold was exceeded.In voltage clamp, the “block” of the electrical events underly-

ing the explosive character of the action potential is not based onthe application of narcotic agents or temperature changes, butrelies on the use of a feedback circuit capable of providing the

FIG. 13. The classical demonstration of the increase of conductance in thesquid axon during the discharge of the action potential. Upper line: actionpotential; white-dark band: measure of the membrane impedance obtainedwith the Wheatstone bridge method by applying a high frequency (20 KHz)sinusoidal signal to two electrodes placed on the opposite site of a giantaxon. From a measure of the impedance changes obtained at variousfrequencies (and proportional to the width of the band) the change ofconductance was estimated to be approximately 40 times at the peak of theaction potential relative to rest. Time marks: 1 ms apart. (From [24]).

FIG. 14. The first published intracellular recording of the action potentialin the squid axon. Time course of the difference between the internal andexternal potential, in the resting state and during the discharge of an actionpotential. Time mark, 500 Hz. Notice the large positive overshoot of themembrane potential during the action potential, which contrasted with theexpectation of the Bernstein’s theory (From [60]).


A figura mostra duas medidas superpostas. O traço único com um pico positivo

seguido por um decaimento abaixo do valor de repouso é o potencial de ação

medido extracelularmente. O envelope (ou banda) claro-escuro é a medida da

impedância feita com a ponte de Wheatstone pela aplicação de um sinal senoidal

de alta frequência (20 KHz) a dois eletrodos situados em lados opostos do axônio

gigante. A largura do envelope mede a redução na impedância (ou o aumento na

condutância) da membrana associada ao potencial de ação.

As alças abaixo da figura são para marcar o tempo. Elas medem intervalos iguais

de 1 ms, mas o espaçamento não mostra isso porque a escala usada para medir

tempo pelo osciloscópio de Cole e Curtis era logarítmica.

A medida das variações na impedância para várias frequências permitiu a Cole e

Curtis estimar o aumento na condutância da membrana de aproximadamente 40%

no ponto em que ocorre o pico do potencial de ação.


25

A importância do aumento na condutância (ou diminuição na resistência) da

membrana é que ela indica que a membrana do axônio torna-se muito mais

permeável aos íons no ponto por onde passa um potencial de ação.

Essa descoberta do aumento na condutância iônica estava de acordo com a teoria

da membrana de Bernstein.

Para relembrar, segundo Bernstein o valor negativo do potencial de membrana no

repouso é devido à alta permeabilidade da membrana ao potássio, que possui alta

concentração no meio extracelular. Ainda segundo Bernstein, quando ocorre um

potencial de ação a membrana torna-se permeável a todos os íons e é isso que faz

com que o potencial de membrana convirja para zero (e não ultrapasse o zero).

Será que o potencial converge mesmo para zero? Como já vimos, o próprio

Bernstein fez alguns experimentos em que o pulso de potencial ultrapassava o

zero e tornava-se transitoriamente positivo, mas ele preferiu descartar esses

resultados.

O fato é que realizando apenas medidas do potencial de injúria com nervos de

sapos, como se fazia até a década de 1930, seria impossível determinar com

certeza se o potencial converge para zero ou ultrapassa esse valor.


26

O potencial de injúria é a diferença de potencial entre um pedaço intacto de um

nervo e a extremidade seccionada (injuriada) dele. Portanto, ele é apenas uma

medida grosseira do verdadeiro potencial de membrana, que é a diferença de

potencial entre o interior e o exterior de um neurônio. E sem conhecer o valor

exato do potencial de repouso de um neurônio não é possível saber se a amplitude

de um potencial de ação ultrapassa o zero ou não.

A descoberta do axônio gigante de lula tornou possível, pela primeira vez, a

realização de uma medida intracelular do potencial de membrana e, portanto, de

um potencial de ação a partir do valor de repouso.

Em 1938, Hodgkin fez uma visita a Cole e Curtis em Woods Hole e aprendeu

sobre o axônio gigante de lula e as medidas deles sobre aumento da condutância

associada à passagem de um potencial de ação.

De volta a Cambridge, Hodgkin começou a trabalhar juntamente com o biofísico

inglês Andrew Fielding Huxley (1917-2012) usando o axônio gigante de lula

como modelo experimental.

Um dos estudos feitos por eles tinha por objetivo medir a viscosidade do

citoplasma, ou axoplasma, do axônio gigante. O método usado era inserir uma

pequena gota de mercúrio pela extremidade cortada de um axônio pendurado na

vertical e medir sua velocidade de queda pelo interior do axônio.


27

Para surpresa dos dois, a gota de mercúrio não caía, mas permanecia na

extremidade cortada. Eles descobriram que isso ocorria porque o interior do

axônio não é fluídico como eles supunham, mas pastoso como um feixe de pasta

de dentes espremido para fora de um tubo de pasta de dente.

Este resultado lhes deu a ideia de que poderiam inserir pelo interior do axônio um

tubo muito fino de vidro (um capilar de vidro) preenchido com uma solução

salina condutora. Esse capilar de vidro poderia ser utilizado como eletrodo

(chamado de eletrodo capilar) para medir a verdadeira diferença de potencial

entre o interior e o exterior do axônio.

A possibilidade de se registrar o potencial de membrana com um eletrodo interno

ao axônio gigante de lula já havia sido considerada durante a visita de Hodgkin a

Cole em 1938, mas esta era a primeira vez que isto se tornava possível.

Hodgkin e Huxley então cortaram um axônio gigante em um dado ponto com

uma tesoura bem fina e conseguiram inserir por essa extremidade cortada uma

cânula de vidro bem fina. Posteriormente, eles amarraram o axônio à cânula com

um fio de seda, selando o lado exposto do axônio.

Pela cânula eles inseriram um eletrodo capilar de 100 µm de diâmetro até que a

ponta do eletrodo ficasse em contato com o interior do axônio. Essa inserção

tinha que ser feita com muito cuidado para que a ponta do eletrodo não arranhasse

a superfície interna da membrana.


28

Eles resolveram esse problema com o uso de dois espelhos em ângulo reto e um

microscópio. A figura abaixo, tirada do artigo publicado por eles em 1939

(Hodgkin, A. L. and Huxley, A. F., Action potentials recorded from inside a

nerve fiber. Nature 144:710-711, 1939), mostra o eletrodo capilar no interior do

axônio.

A inserção do eletrodo capilar no interior do axônio permitiu a primeira medida

realizada na história do potencial de membrana de um neurônio (o potencial no

interior da célula medido em relação ao potencial no exterior).

Confirmando o que já se sabia, Hodgkin e Huxley obtiveram que o potencial de

membrana no repouso é negativo. O valor medido por eles era de

aproximadamente −50 mV.


29

Após a medida do potencial no repouso, eles determinaram o que acontece

quando um impulso passa pelo axônio em resposta a um estímulo. Esta foi uma

das medidas mais importantes na história da biofísica e mostrou que o potencial

no interior do axônio cresce em direção a zero e ultrapassa o zero, tornando-se

positivo e crescendo quase tanto do lado positivo quanto a magnitude do

potencial de repouso (o pico do potencial de ação chegava aproximadamente a 40

mV).

respect to the exterior [60] (Fig. 14). Unexpectedly, however, itappeared that during excitation the potential overshot the zerolevel by several tens of millivolts, a finding that was clearly incontrast with Bernstein’s membrane theory (no substantial differ-

ence of potential should exist across the membrane if this becamepermeable to all ion species), but well in line with the initialobservation, made by Bernstein himself (and in less ancient timesby Shaefer [98]) that the amplitude of the action current couldsometimes exceed that of the injury current. The interpretation ofthese results was postponed by the Cambridge group because ofthe events of war.In 1949, Hodgkin and Katz succeeded in showing that the

action potential of the squid nerve decreased in amplitude bydecreasing the extracellular concentration of sodium ions, andsuggested that this was the consequence of the involvement of aselective increase of membrane permeability for sodium ions in thedischarge of the action potential [66]. Because sodium ions arelargely in excess in the extracellular medium compared to the axoninterior, the resulting electrochemical potential would be positive(axon interior vs. extracellular compartment), and therefore, mem-brane potential would change polarity during excitation as a con-sequence of the sodium permeability increase. In other words, themembrane potential, which in the resting state depended on thepermeability for potassium ions, would be largely dominated dur-ing the excitation by the permeability for sodium ions, and thepassage from the one to the other of the two conditions would bethe consequence of a specific change of membrane permeabilityinduced by the electrical stimulus. The notion that the membranebecame selectively permeable to sodium at the peak of the actionpotential was an important revision of the Bernstein’s theory,which assumed an unselective passage of all ions during theexcitation, a theory which, as already mentioned, implied thealmost complete disappearance of any difference of membranepotential whatsoever during nerve excitation.In order to verify whether the new theory, based on a transition

between two permeability states of the membrane, could accountfor the basic properties of nerve excitation and conduction, it wasnecessary to study in an accurate and quantitative way the changesof membrane currents and permeability accompanying the appear-ance of the action potential. However, a study of this kind wasdifficult with conventional techniques, because the “regenerative”and “explosive” properties of the action potential discharge did notpermit a study of the relationship between membrane current andmembrane voltage during the excitation process. To obtain accu-rate information on the electrical events responsible for the actionpotential it was necessary to circumvent the explosive character ofthis event, by forcing the membrane potential to assume, and tomaintain, certain levels in spite of its tendency to evolve sponta-neously when the threshold value was exceeded.

The Voltage Clamp, the Squid Axon, and the Hodgkin-HuxleyModel

The sought for technique that made possible the study ofmembrane events underlying the generation of action potentialswas the voltage-clamp devised in 1949 by Cole [23] and byMarmont [81]. It was applied in a masterly way to the squid axonby Hodgkin and Huxley in collaboration with Katz, in a series ofstudies published in 1952, which represent a fundamental mile-stone in the investigations on animal electricity [61–65]. In theepoch of Lucas and Adrian, the explosive character of the propa-gated response had been somewhat subdued by using proceduresbased on partial block of small segments of the nerve, but theseprocedures could give little information about what would happenonce the threshold was exceeded.In voltage clamp, the “block” of the electrical events underly-

ing the explosive character of the action potential is not based onthe application of narcotic agents or temperature changes, butrelies on the use of a feedback circuit capable of providing the

FIG. 13. The classical demonstration of the increase of conductance in thesquid axon during the discharge of the action potential. Upper line: actionpotential; white-dark band: measure of the membrane impedance obtainedwith the Wheatstone bridge method by applying a high frequency (20 KHz)sinusoidal signal to two electrodes placed on the opposite site of a giantaxon. From a measure of the impedance changes obtained at variousfrequencies (and proportional to the width of the band) the change ofconductance was estimated to be approximately 40 times at the peak of theaction potential relative to rest. Time marks: 1 ms apart. (From [24]).

FIG. 14. The first published intracellular recording of the action potentialin the squid axon. Time course of the difference between the internal andexternal potential, in the resting state and during the discharge of an actionpotential. Time mark, 500 Hz. Notice the large positive overshoot of themembrane potential during the action potential, which contrasted with theexpectation of the Bernstein’s theory (From [60]).


A teoria da membrana de Bernstein caía por terra. A figura acima, tirada do

mesmo artigo citado anteriormente, mostra a histórica medida do potencial de

ação feita por Hodgkin e Huxley.


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Após a descoberta de Hodgkin e Huxley, que foi confirmada por Cole e Curtis em

1940, o problema central na neurofisiologia passou a ser determinar o

mecanismo iônico responsável pela geração de um potencial de ação.

Infelizmente, devido à Segunda Guerra Mundial que eclodiu logo após as

medidas de Hodgkin e Huxley em 1939, toda a pesquisa na área foi interrompida

por vários anos e só foi retomada pelos mesmos Hodgkin e Huxley e outros oito

anos depois.

breve histórico sobre potenciais elétricos em nervos e...

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