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BÁRBARA DO VALE MACHADO E
FANY SOUZA LINGORDO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA E DE PROTEÍNAS
ASSOCIADAS A REABSORÇÃO ÓSSEA EM TECIDO GENGIVAL
HUMANO DE PACIENTES TABAGISTAS E DIABÉTICOS
PORTADORES DE DOENÇA PERIODONTAL
NOVA FRIBURGO
2015
II
BÁRBARA DO VALE MACHADO E
FANY SOUZA LINGORDO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA E DE PROTEÍNAS
ASSOCIADAS A REABSORÇÃO ÓSSEA EM TECIDO GENGIVAL
HUMANO DE PACIENTES TABAGISTAS E DIABÉTICOS
PORTADORES DE DOENÇA PERIODONTAL
Monografia apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense/Campus Universitário de Nova Friburgo como Trabalho de Conclusão do Curso de Odontologia.
Orientador: Profª. Dra. REBECA DE SOUZA AZEVEDO
Nova Friburgo 2015
II
III
BÁRBARA DO VALE MACHADO E
FANY SOUZA LINGORDO
ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA E DE PROTEÍNAS
ASSOCIADAS A REABSORÇÃO ÓSSEA DE TECIDO GENGIVAL
HUMANO DE TABAGISTAS E DIABÉTICOS PORTADORES DE
DOENÇA PERIODONTAL
Monografia apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense/Campus Universitário de Nova Friburgo como Trabalho de Conclusão do Curso de Odontologia.
Aprovada em: / / 2015
Banca Examinadora
Prof. Dr. _________________________________________________________
Instituição: ______________________________Assinatura:________________
Prof. Dr. _________________________________________________________
Instituição: ______________________________Assinatura:________________
Prof. Dr. _________________________________________________________
Instituição: ______________________________Assinatura:________________
Nova Friburgo
2015
IV
DEDICATÓRIA
Dedicamos esse trabalho primeiramente a Deus, por estar sempre presente,
proporcionando força e inspiração nos momentos difíceis, para a realização desta
conquista.
Aos nossos pais por tudo o que nos ensinaram, por todo o carinho, apoio e
principalmente por sempre acreditarem em nós, nos apoiando e ajudando em todos
os momentos. As nossas irmãs e toda família que sempre nos desejaram o melhor.
Ao Matheus que sempre nos apoiou com palavras de incentivo.
A nossa querida orientadora pelo ensinamento, disponibilidade e colaboração
demonstrada no decorrer deste trabalho. Foi um enorme prazer tê-la como
orientadora e professora. E a todos aqueles que de alguma forma tornaram possível
a realização desse grande sonho.
V
AGRADECIMENTO
À Profa. Dra. Rebeca de Souza Azevedo pelo voto de confiança,
oportunidade, ensinamento e paciência.
A Profa. Dra. Gabriela Alessandra da Cruz Galhardo Camargo pelo auxílio
nas etapas clínicas deste trabalho.
A amiga Natalia Lucena pela amizade e companheirismo diário durante a
elaboração deste trabalho de conclusão de curso.
Às amigas Ana Paula e Daniele pelo auxílio nas diferentes etapas de
processamento laboratorial das amostras de tecido até a obtenção das lâminas que
foram analisadas.
Aos pacientes que participaram deste estudo, pela compreensão e
colaboração.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e
ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
apoio financeiro e bolsas de estudo durante a realização deste trabalho.
VI
RESUMO
O biofilme é o agente desencadeante da doença periodontal, porém, fatores modificadores como o tabagismo e o diabetes melito podem influenciar diretamente o hospedeiro, comprometendo sua resposta imunológica e inflamatória e o padrão microscópico do tecido periodontal. O objetivo desse estudo foi identificar a relação dos parâmetros histomorfológicos dos tecidos periodontais com o perfil imunoistoquímico de proteínas associadas à reabsorção óssea diretamente envolvidas com a doença periodontal, frente ao tabagismo e ao diabetes melito como fatores modificadores, permitindo um melhor entendimento da patogênese da doença periodontal e a influência que o tabagismo e o diabetes melito podem exercer nesta patogênese. Foram selecionadas 99 amostras de tecido gengival, sendo analisadas sob aspecto clínico, histológico e imunoistoquímico. Os resultados clínicos demonstraram a influência do tempo nas variáveis clínicas da perda tecidual. Os resultados histopatológicos evidenciaram um perfil semelhante entre os grupos com periodontite e os resultados imunoistoquímicos revelaram um perfil de ativação de osteoclastogênese nos grupos com periodontite, exceto no grupo de pacientes diabéticos. Baseado nesses resultados, a periodontite se desenvolve de forma semelhante sob todos os aspectos analisados.
Palavras-chave: doença periodontal, diabetes melito, tabagismo, imunoistoquímica, osteoclastogênese, RANK, RANKL, OPG.
VII
ABSTRACT
Biofilm is the triggering agent of periodontal disease, but factors like smoking and diabetes mellitus can directly influence the host, compromising their immune and inflammatory response and the microscopic standard of supporting periodontal tissue. The purpose of this study was to identify the relationship between the histological and morphologic parameters of supporting and protecting tissues of the teeth with immunohistochemical profile of proteins associated with bone resorption directly involved in periodontal disease, compared to smoking and diabetes mellitus as modifying factors, allowing better understanding of the pathogenesis of periodontal disease and the influence that smoking and diabetes mellitus can play on this pathogenesis. We selected 99 samples, which were analyzed considering clinical, histological and immunohistochemical aspects. Clinical results demonstrate the influence of time on clinical variables of tissue loss. Histopathological results showed a similar profile between groups with periodontitis and immunohistochemical results revealed a osteoclastogenesis activation profile on groups with periodontitis. Based on these results, we can conclude: periodontitis develops similarly in all aspects analyzed.
Key words:periodontal diseases, diabetes mellitus, smoking, immunohistochemical, osteoclastogenesis, RANK, RANL, OPG.
VIII
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................9
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................11
2.1. Doença periodontal.............................................................................................11
2.2. Osteoclastogênese na periodontite.....................................................................13
2.3. Relação entre tabagismo e doença periodontal..................................................16
2.4. Relação entre diabetes melito e doença periodontal..........................................18
3. MÉTODOS.............................................................................................................20
3.1. Seleção da amostra.............................................................................................20
3.2. Análise clínica......................................................................................................20
3.3. Análise histopatológica........................................................................................21
3.4. Análise imunoistoquímica....................................................................................22
3.5. Análise dos resultados........................................................................................23
4. RESULTADOS.......................................................................................................24
4.1. Perfil demográfico ...............................................................................................24
4.2. Perfil clínico.........................................................................................................24
4.3. Perfil histopatológico ..........................................................................................25
4.4. Perfil imunoistoquímico ......................................................................................29
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................33
6. CONCLUSÃO........................................................................................................37
7. REFERÊNCIAS......................................................................................................38
8. APÊNDICES...........................................................................................................45
9. ANEXOS ...............................................................................................................47
9
1. INTRODUÇÃO
A doença periodontal (DP) é um processo infeccioso que resulta em uma
resposta inflamatória acentuada de origem multifatorial de forma a comprometer os
tecidos de suporte e de proteção ao dente (LINDHE, LANG e KARRING, 2008). O
fator determinante é o acúmulo de biofilme sobre a superfície externa dos dentes,
contudo, existem fatores ambientais e sistêmicos que podem ter papel importante na
etiologia da DP, como o tabagismo e o diabetes melito (DM), que podem provocar
alterações na resposta imunológica e inflamatória do hospedeiro (RIBEIRO et al.,
2011).
A permanência do processo infeccioso em íntima associação aos tecidos
periodontais leva a ativação e a manutenção de uma resposta imune-inflamatória de
caráter crônico local, que pode levar a destruição tecidual por meio de mecanismos
que incluem a produção de proteínas envolvidas na degradação do tecido conjuntivo
e do osso alveolar constituintes do periodonto de suporte (GRAVES et al., 2008).
O tabagismo é considerado um importante fator capaz de influenciar no
desenvolvimento da DP, provavelmente pela ação da nicotina no sangue e no fluido
crevicular do paciente, que é capaz de dificultar a chegada de células inflamatórias
de defesa no tecido e sulco gengivais e de ampliar a produção de mediadores
imunológicos pró-inflamatórios e que favorecem a osteoclastogênese (CARVALHO,
SANTOS e CURY, 2008; LIMA et al., 2008; WENDELL e STEIN, 2001).
O DM é também considerado um importante fator influenciador na instalação
e progressão da DP ao promover uma alteração microvascular e, consequente
redução do número de leucócitos polimorfonucleares no sulco gengival (BRUNETTI,
2004), além de ser capaz de estimular uma maior produção e secreção de citocinas
pró-inflamatórias associadas à atividade de metaloproteinases de matriz e de
osteoclastos, atuando, portanto, no mecanismo de osteoclastogênese (MEALEY e
OATES, 2006; ALVES et al., 2007).
Dessa forma, esta pesquisa pretende avaliar comparativamente as
características morfológicas e o padrão de expressão imunoistoquímica de proteínas
associadas a osteoclastogênese – receptor de ativação do fator nuclear kB (RANK),
10
do ligante do RANK (RANKL) e da osteoprotegerina (OPG) – no tecido gengival de
pacientes com DP modificada ou não pelo tabagismo e pelo DM.
11
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Doença periodontal
A DP é altamente prevalente em indivíduos com higiene bucal deficiente e
tem como etiopatogênese uma associação multifatorial complexa. É um processo
inflamatório que acomete os tecidos de suporte ao dente em resposta à presença de
acúmulo bacteriano sobre a superfície externa dos dentes (biofilme), resultando em
um desequilíbrio entre a agressão bacteriana e outros fatores externos e a
capacidade de defesa do organismo. Caracteriza-se pela perda de inserção
periodontal devido à destruição do ligamento periodontal e pela perda do osso de
suporte (osso alveolar) (COELHO et al., 2005; GUSMÃO et al., 2005; LINDHE,
LANG e KARRING, 2008).
As características da DP expressam sinais clínicos da inflamação, como:
presença de eritema, de edema e de sangramento gengival, que em conjunto
representam um quadro clínico compatível com gengivite. Este quadro clínico pode
progredir e resultar na reabsorção do tecido ósseo alveolar com destruição do
cemento radicular e do ligamento periodontal. A progressão da doença ocorre em
surtos locais específicos ou de forma generalizada e, caso não haja tratamento,
pode levar a perda dos dentes associados (COELHO et al., 2005; KAWAMURA,
GIOVANINI e MAGALHÃES, 2005). Microscopicamente, de uma maneira geral, a
gengiva normal se caracteriza pela presença de uma inflamação discreta constituída
principalmente de plasmócitos, e que ao evoluir para a DP passa a apresentar um
infiltrado inflamatório proeminente, composto, neste momento, principalmente de
neutrófilos, macrófagos e/ou linfócitos, que passam a adquirir uma localização
perivascular (ALVES et al., 2000). Progressivamente, a DP exibe destruição das
fibras do ligamento periodontal, migração do epitélio juncional em sentido apical,
reabsorção óssea por meio de osteoclastos e formação de bolsa periodontal
(GUSMÃO et al., 2005; LINDHE, LANG e KARRING, 2008).
O biofilme, que é o fator etiológico primário da DP, é composto por diversos
tipos microbianos, que progressivamente colonizam a superfície do dente se
estendendo da superfície supragengival até a superfície subgengival, e com isso,
provocam, também progressivamente, diferentes formas de resposta inflamatória do
hospedeiro (CAWSON e ODELL, 2013). A “lesão inicial” ocorre rapidamente à
12
medida que o biofilme se deposita sobre o dente. Entre 24 e 48 horas, alterações
histopatológicas vasculares podem ser evidenciadas sob o epitélio juncional. Ocorre
vasodilatação de arteríolas, capilares e vênulas, seguida de aumento da pressão
hidrostática na microcirculação e aumento da permeabilidade vascular de modo que
fluidos e proteínas exsudam para os tecidos. Neste momento, ocorre também um
aumento da migração de neutrófilos, que se depositam na região de epitélio
juncional e sulco gengival (CAWSON e ODELL, 2013; LINDHE, LANG e KARRING,
2008; SMITH, SEYMOUR e CULLINAN, 2010). A manutenção deste biofilme por
cerca de uma semana pode levar ao desenvolvimento da “lesão precoce”, que se
caracteriza pela incapacidade do hospedeiro responder a esta agressão bacteriana
e a consequente alteração no padrão inflamatório. Os vasos sanguíneos que estão
abaixo do epitélio juncional permanecem dilatados, mas ocorre um aumento em sua
quantidade (angiogênese), os linfócitos e os macrófagos passam a coexistir em
predominância com os neutrófilos, que já estavam presentes desde a “lesão inicial”.
Uma pequena quantidade de plasmócitos residentes ainda pode ser observada, e
fibroblastos começam a se degenerar (LINDHE, LANG e KARRING, 2008; PAGE e
SCHROEDER, 1976; SMITH, SEYMOUR e CULLINAN, 2010). A doença
estabelecida ocorrerá a partir da manutenção e evolução do biofilme na superfície
subgengival do dente e representa a gengivite propriamente dita. Nesta fase, ocorre
o aumento do exsudato do fluido crevicular com intensa migração de leucócitos,
particularmente os plasmócitos, que passam a ser as células inflamatórias
predominantes, e exibem uma localização superficial (próxima a papila interdentária)
e perivascular. Há perda das fibras de colágeno superficiais, contudo, a inserção
epitelial continua próxima ou na junção amelocementária e o osso alveolar e o
ligamento periodontal permanecem intactos (CAWSON e ODELL, 2013; LINDHE,
LANG e KARRING, 2008; PAGE e SCHROEDER, 1976).
O estágio final da doença pode ser conhecido como “lesão avançada” e
caracteriza a periodontite, que, assim como em todas as etapas anteriores, se
desenvolve a partir da manutenção e evolução do biofilme subgengival, que levará a
uma progressão apical contínua do epitélio juncional e, consequentemente, ao
aprofundamento da bolsa periodontal (CAWSON e ODELL, 2013; LINDHE, LANG e
KARRING, 2008; PAGE e SCHROEDER, 1976). Na periodontite, ocorre a destruição
dos tecidos de suporte do dente, fibras do ligamento periodontal e osso alveolar
13
(PAGE e SCHROEDER, 1976; SMITH, SEYMOUR e CULLINAN, 2010), e este
processo pode ser desencadeado pelo biofilme por meio da ação dos componentes
bacterianos, como os lipopolissacarídeos presentes na parede celular das bactérias
Gram-negativas, ou pelo estímulo das células do hospedeiro, que, a partir da
agressão microbiana, irão secretar mediadores inflamatórios, que guiam e regulam a
resposta inflamatória passível de ser destrutiva (CAWSON e ODELL, 2013; LINS et
al., 2007; LINDHE, LANG e KARRING, 2008).
Em resumo, pode-se dizer que apesar da exposição dos tecidos gengivais
aos periodontopatógenos ser um pré-requisito para a inflamação e destruição
tecidual que ocorre na DP, apenas a sua presença não é suficiente para explicar o
início e a progressão da doença. Uma vez iniciado os processos imunológicos e
inflamatórios, várias moléculas como, metaloproteinases, citocinas, prostaglandinas
e outras enzimas do hospedeiro são liberadas pelos leucócitos, fibroblastos e outras
células residentes do tecido local (GRAVES, LIU e OATES, 2007). Embora estas
reações teciduais supostamente protejam o hospedeiro da invasão microbiana, a
estrutura organizacional do biofilme promove relativa inacessibilidade dos leucócitos
e dos fatores antimicrobianos do hospedeiro a estes microorganismos,
inviabilizando, assim, a sua eliminação (GRAVES, LIU e OATES, 2007). Com isso,
haverá uma perpetuação do processo imunológico e inflamatório, que, por
conseguinte, levará à destruição dos próprios tecidos de suporte do dente do
hospedeiro (KORNMAN e GIOVINE, 1998). É importante destacar que somado a
este fato, fatores de riscos ambientais e adquiridos, como o tabagismo e o DM,
podem agravar a resposta inflamatória do hospedeiro frente à agressão bacteriana
e, dessa maneira, favorecer o avanço da doença (KORNMAN e GIOVINE, 1998).
2.2. Osteoclastogênese na periodontite
O osso alveolar, assim como outros tecidos ósseos, é um tecido dinâmico,
que sofre constante processo de remodelação a partir da reabsorção da matriz
óssea por osteoclastos (osteoclastogênese) e subsequente deposição de nova
matriz óssea por osteoblastos (osteogênese) (BELIBASAKIS e BOSTANCI, 2012). É
um evento que pode ocorrer de forma fisiológica, em que se observa um equilíbrio
entre osteoclastogênese e osteogênese, ou de forma patológica, em que se observa
um desequilíbrio entre a osteoclastogênese e a osteogênese, promovendo uma
14
maior reabsorção óssea,como a que acontece na periodontite (BELIBASAKIS e
BOSTANCI, 2012).
A inflamação que se instalou no local da periodontite favorece o processo de
reabsorção óssea mobilizando os osteoclastos, principalmente por meio dos
mediadores inflamatórios fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 1 (IL-1)
e prostaglandina E2, que, por sua vez, irão ativar as proteínas associadas ao
processo de osteoclastogênese (YASSUDA et al., 1998).
Todo o processo de osteoclastogênese parece ocorrer a partir do
funcionamento do sistema denominado RANK-RANKL-OPG (BELIBASAKIS e
BOSTANCI, 2012; GIANNOPOULOU, MARTINELLI-KLAY e LOMBARDI, 2012), em
quea proteína RANK, o seu respectivo ligante RANKL, e a osteoprotegerina (OPG),
constituem os componentes moleculares do sistema de remodelação óssea. O
RANK está expresso em altos níveis em células precursoras de osteoclastos, e o
RANKL, que é seu ligante, é secretado por vários tipos celulares, especialmente os
osteoblastos. A ocorrência de uma ligação entre o RANK e o RANKL na superfície
das células pré osteoclásticas permitirá a diferenciação destas células em
osteoclastos, ativando, assim, o processo de osteoclastogênese. A OPG, que
também é secretada pelos osteoblastos, inibe o processo de reabsorção óssea ao
se ligar ao ligante RANKL, num evento competitivo que irá impedir que este se ligue
ao seu receptor, o RANK, inibindo, assim, o processo de osteoclastogênese
(BELIBASAKIS e BOSTANCI, 2012) (Figura 1).
15
Figura 1 – Sistema RANK-RANKL-OPG.
O sistema RANK-RANKL-OPG é regulado por citocinas e hormônios, em que
a presença de proteínas, como IL-1β, TNF-α e IL-17 provocam inflamação e
favorece o mecanismo de osteoclastogênese por meio da indução da expressão de
RANKL pelos osteoblastos; enquanto a presença de proteínas, como OPG, IL-4 e IL-
10 inibem a inflamação e a osteoclastogênese por meio do bloqueio da sinalização
de RANKL direta ou indiretamente (ROSKAMP, VAZ e LIMA, 2006; SILVA, 2012).
Um resumo do funcionamento do sistema RANK-RANKL-OPG sob condições
normais e sob influência de inflamação local e a sua relação com a
osteoclastogênese encontra-se ilustrado na Figura 2.
16
Figura 2 – Funcionamento do sistema RANK-RANKL-OPG em homeostase e
inflamação, destacando a sua atuação no processo de osteoclastogênese. Na
homeostase, há uma maior disponibilidade de OPG, que se liga ao RANKL,
impedindo, assim, a sua ligação com RANK e a consequente diferenciação dos
osteoclastos (lado esquerdo). Na inflamação, por sua vez, há uma maior
disponibilidade de RANKL, que ficará livre para fazer a sua ligação com RANK e a
consequente diferenciação dos osteoclastos que atuarão na reabsorção óssea (lado
direito) (MORAES, 2010).
2.3. Relação entre o tabagismo e a doença periodontal (DP)
O hábito do tabagismo está diretamente associado a diferentes alterações
patológicas, que inclui uma maior prevalência e incidência da DP (BARTECCHI,
MACKENZIE e SCHRIER, 1994). A associação entre tabagistas e a perda óssea na
periodontite não pode ser somente relacionada com a infecção causada pelo
biofilme, mas está também diretamente relacionada com a exposição do indivíduo
ao tabaco e aos seus efeitos locais e sistêmicos de forma dependente da duração
e/ou quantidade de cigarros consumidos diariamente (BERGSTROM, ELIASSON e
DOCK, 2011). Além disso, o consumo de tabaco pode também ter um efeito
mascarador dos sinais clínicos da inflamação, visto que a nicotina é capaz de
promover vasoconstricção na microcirculação do tecido gengival e de induzir o
17
aumento da espessura do epitélio gengival, e com isso, é comum que o
sangramento gengival seja reduzido nos pacientes tabagistas (BERGSTROM,
ELIASSON e DOCK, 2011; CARVALHO, SANTOS e CURY, 2008; JOHNSON e
GUTHMILLER, 2007; MÜLLER, STADERMANN e HEINECKE, 2002).
Pacientes tabagistas com periodontite apresentam tendência maior à perda
de inserção, a perda óssea alveolar e ao aumento da frequência de dentes perdidos
quando comparados a pacientes com periodontite que não são tabagistas. Estes
fenômenos provavelmente ocorrem como resultado da nicotina, particularmente da
cotinina, que é o subproduto da nicotina e permanece por até 19 horas nos fluidos
biológicos, como urina, sangue e fluido crevicular, e que é utilizada como marcador
bioquímico do tabaco, pois sua análise permite que se estime o grau de exposição
passiva ou ativa ao tabaco (BERGSTROM, ELIASSON e PREBER, 1991; CHEN et
al., 2001; FIGUEIREDO et al., 2007; GONZALEZ et al., 1996; VAN DER WEIJDEN
et al., 2001).
Assim, de forma genérica, é possível afirmar que a nicotina tem sido
associada a várias alterações celulares que podem contribuir para o início e
posterior progressão da DP. E, apesar da nicotina ser capaz de aumentar o número
de células inflamatórias na corrente sanguínea, ela promove a redução do número
destas células no tecido periodontal ao induzir a secreção de epinefrina, que ativará
o sistema nervoso simpático, causando uma vasodilatação inicial, a qual se segue
uma vasoconstricção, que acaba dificultando a chegada das células inflamatórias no
tecido e sulco gengivais, comprometendo, dessa maneira, o sistema de defesa local.
Além disso, a nicotina é capaz de prejudicar a quimiotaxia de neutrófilos e
macrófagos, induzir a apoptose de neutrófilos e comprometer a fagocitose exercida
pelos macrófagos, o que aumenta a susceptibilidade a infecção microbiana
(CARVALHO, SANTOS e CURY, 2008; LIMA, 2008). A nicotina também aumenta a
produção de outros mediadores imunológicos, como TNF-α, IL-1 e IL-6, que são
mediadores pró-inflamatórios e que favorecem a osteoclastogênese (WENDELL e
STEIN, 2001).
Neste contexto, é importante destacar que é sabido que à medida em que a
infecção periodontal provoca destruição do periodonto, ocorre também uma tentativa
de reorganização dos tecidos periodontais, ou seja, há um processo de reparo
concomitante ao processo de destruição, que acontece por meio da formação de um
18
novo tecido conjuntivo (GAMAL e BAYOMY, 2002). Todavia, este evento costuma
ser afetado pelo tabagismo, já que, a nicotina também altera a proliferação e a
migração dos fibroblastos, células responsáveis pela produção da matriz extracelular
do tecido conjuntivo (TANUR et al., 2000).
Diante do exposto, pode-se concluir que os pacientes tabagistas costumam
exibir maior severidade e prevalência da periodontite associada a uma menor
resposta imunológica, mas é importante que se ressalte que a diminuição do hábito
e da frequência do consumo de tabaco costuma melhorar as condições periodontais
e o processo de reparo (BERGSTROM, ELIASSON e DOCK, 2011).
2.4. Relação entre o diabetes melito (DM) e a doença periodontal (DP)
O DM consiste num grupo de doenças metabólicas caracterizadas pela
hiperglicemia resultante de falha na secreção ou na ação da insulina, podendo ser
dividido em três principais tipos: DM tipo 1 (diabetes insulinodependente), DM tipo 2
(diabetes não-insulinodependente) e DM gestacional (que ocorre durante o período
de gravidez).
Estudos epidemiológicos têm evidenciado um risco aumentado entre 3 e 4
vezes para o desenvolvimento da gengivite e da periodontite no grupo de pacientes
com DM1 ou DM2, na comparação com os pacientes não diabéticos (CORREIA,
ALCOFORADO e MASCARENHAS, 2010). O princípio básico para o entendimento
das complicações periodontais em pacientes diabéticos está na hiperglicemia e na
consequente ativação da resposta imune inata do hospedeiro, que ocorre porque o
estado hiperglicêmico afeta as funções de sinalização celular (BARBOSA, 2013).
Além disso, a hiperglicemia altera o microambiente da bolsa periodontal, uma vez
que a alta concentração de glicose no fluido crevicular afeta a composição do
biofilme, promovendo um aumento do número de bactérias anaeróbicas Gram-
negativas, que costumam estar presentes em grandes concentrações na
periodontite (GRAVES et al. ,2006).
A hiperglicemia também será responsável por promover o acúmulo de
produtos finais da glicosilação (AGEs) no sangue e, particularmente nos tecidos
periodontais. Os AGEs se formam por meio da glicosilação e oxidação de proteínas
e lipídeos e têm a capacidade de se ligar a receptores de membrana de diferentes
tipos celulares, incluindo as células endoteliais e os monócitos/macrófagos. Ao se
19
ligarem aos receptores de monócitos/macrófagos, há um aumento do estresse
oxidativo celular, o que resultará numa maior produção e secreção de citocinas
inflamatórias, como TNF-α e IL-1, que estão associadas à diferenciação e a
atividade de osteoclastos e também à produção de metaloproteinases de matriz, que
são enzimas responsáveis pelo remodelamento da matriz extracelular do tecido
conjuntivo, atuando, portanto, efetivamente no mecanismo de osteoclastogênese,
contribuindo, dessa forma, para a progressão e a severidade da DP (ALVES et al.,
2007; MEALEY e OATES, 2006). É importante destacar que a formação dos AGEs
está relacionada ao tempo em que o organismo ficou exposto à hiperglicemia,
portanto, quanto maior a duração do DM e quanto pior for o controle glicêmico do
paciente, maior será a quantidade destes produtos circulando e acumulados nos
tecidos periodontais (ALVES et al., 2007).
Um resumo do papel do DM no desenvolvimento e progressão da DP
encontra-se ilustrado na Figura 3.
Figura 3 – Fisiopatologia da periodontopatia associada ao diabetes melito. Fonte:
Adaptado de ALVES et al., 2007.
20
3. MÉTODOS
3.1. Seleção da amostra
Este é um estudo transversal que engloba as partes clínica e histopatológica
do projeto de pesquisa intitulado “Avaliação clínica, histopatológica e microbiológica
de tecido gengival humano de pacientes portadores de doença periodontal”
(aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital
Universitário Antônio Pedro da Universidade Federal Fluminense (UFF) – CAAE
0158.0.258.000-10 – Anexo A).
Foram selecionados 99 dentes oriundos de pacientes, atendidos nas Clínicas
Odontológicas da Faculdade de Odontologia da UFF, Campus Universitário de Nova
Friburgo (FOUFF/NF), que apresentavam dentes com extração indicada por motivos
ortodônticos, periodontais ou condenados por destruição avançada de cárie,
diabéticos ou não diabéticos, tabagistas ou não tabagistas e que não tinham
realizado nenhum tipo de tratamento para a doença periodontal. Os indivíduos que,
durante a anamnese, apresentavam qualquer evidência de outros fatores
modificadores locais e/ou sistêmicos que podiam interferir diretamente na conclusão
do trabalho, como o etilismo, a osteoporose, a imunodeficiência adquirida ou
induzida, foram excluídos do estudo. As mulheres grávidas ou lactantes e os
pacientes com candidíase bucal também foram excluídos do estudo.
3.2. Análise clínica
Os pacientes foram inicialmente submetidos a um exame clínico para avaliar
a sua história médica e social e as condições de saúde bucal e periodontal – índice
de placa (IP), índice de sangramento à sondagem (SS), profundidade de sondagem
(PS), recessão gengival (RG) e nível de inserção clínico (NIC).
Após a indicação da exodontia, foram realizados os procedimentos
convencionais que seriam realizados independentes dessa pesquisa para realização
de exodontia nas dependências da FOUFF/NF. A remoção do tecido gengival foi
realizada na face vestibular e lingual ou palatina do dente selecionado, utilizando-se
lâmina de bisturi 15C inclinada em 45º por meio de uma incisão intrasulcular a 2 mm
da margem gengival e com o auxílio de uma cureta para remoção do colar gengival.
Na sequência, as amostras foram numeradas e acondicionadas em frascos plásticos
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contendo formol tamponado a 10%, onde permaneciam até o dia do processamento
histológico. Após a exodontia, os pacientes foram medicados conforme o protocolo
medicamentoso convencional para a realização de exodontia nas dependências da
FOUFF/NF e a remoção da sutura foi realizada 7 dias após o procedimento cirúrgico.
Todas as amostras removidas foram classificadas em 5 grupos de acordo
com a análise periodontal e a presença ou não do DM e do tabagismo seguindo a
Tabela 1.
Tabela 1– Grupos de estudo.
Grupo Perfil clínico e periodontal
DM+DP Pacientes diabéticos e com perda óssea (periodontite)
T+DP Pacientes tabagistas e com perda óssea (periodontite)
S+DP Pacientes não diabéticos e não tabagistas e com perda óssea
(periodontite)
S+G Pacientes não diabéticos e não tabagistas e com sangramento
gengival (gengivite)
CONTROLE Pacientes não tabagistas e não diabéticos sem qualquer DP
3.3. Análise histopatológica
As amostras de gengiva removidas foram mantidas armazenadas no formol
tamponado a 10% por pelo menos 48 horas para início das técnicas de preparação
dos tecidos para confecção das lâminas histológicas e observação ao microscópio.
Cada amostra foi analisada macroscopicamente, e após clivagem, foram mantidas
por mais 48 horas antes do processamento histotécnico por um processador
automático de tecidos. O material obtido do processamento foi incluído em blocos de
parafina, que foram submetidos a cortes de 3μm de espessura e foram corados em
hematoxilina e eosina seguindo o protocolo de coloração do Laboratório de
Patologia Oral da FOUFF/NF.
Todos os casos foram avaliados em microscópio óptico pela professora
22
orientadora, uma aluna de pós-graduação e duas alunas de graduação para análise
de cada uma das características morfológicas previstas para esta análise
(Apêndices A e B).
3.4. Análise imunoistoquímica
Para a reação imunoistoquímica foram selecionados 52 casos que continham
material suficiente e adequado para a realização de todas as reações e que foram
submetidos a cortes histológicos adicionais de 3μm em lâminas silanizadas.
Para a reação imunoistoquímica, os cortes histológicos foram
desparafinizados em xilol e hidratados em concentrações decrescentes de álcool até
água corrente. Em seguida, foi realizada a recuperação antigênica dos casos em
forno de microondas usando ácido cítrico (pH=6,0) ou EDTA/TRIS (pH 9.0), de
acordo com o anticorpo utilizado. Após os cortes serem resfriados em temperatura
ambiente, eles foram lavados em água corrente, e posteriormente, colocados em
peróxido de hidrogênio (20 volumes) com 5 trocas de 5 min para inibir a ação da
peroxidase endógena. Os anticorpos primários foram preparados com albumina
bovina sérica a 1% (BSA) e incubados com cada amostra a 8º C (em geladeira)
overnight (Tabela 2). Após a incubação com os anticorpos primários, os cortes foram
tratados com os anticorpos de amplificação do sistema LSAB (Dako), e a revelação
foi feita por meio do cromógeno Diaminobenzidina (SIGMA) para visualizar a
atividade da peroxidase. Ao final, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina
de Carazzi.
23
Tabela 2 – Anticorpos primários utilizados no estudo.
Anticorpos
primários
Clone Fabricante Diluição Solução para
recuperação
antigênica
RANK H-300 Santa Cruz 1:800 CITRATO
RANKL N-19 Santa Cruz 1:50 TRIS-Edta
OPG N-20 Santa Cruz 1:50 TRIS-Edta
A expressão dos marcadores imunoistoquímicos foi classificada de forma
subjetiva em 0 (indetectável), 1 (até 25% das células positivas), 2 (entre 26% e 50%
de células positivas) e 3 (mais de 50% de células positivas), baseada na média de
células coradas em até 10 campos em objetiva de 40x de cada espécime sob
microscópio óptico e foi realizada pelos alunos de graduação e pós-graduação de
forma independente, e posteriormente por todos os pesquisadores em conjunto sob
supervisão da orientadora.
3.5. Análise dos resultados
Os resultados foram apresentados de forma descritiva tentando associar as
características mais prevalentes em cada um dos grupos estudados.
24
4. RESULTADOS
4.1 Perfil demográfico
A amostra foi composta de 99 tecidos gengivais, que envolviam
principalmente os dentes molares e eram oriundas de 84 pacientes, sendo 41
homens e 43 mulheres com idade média de 44 anos, a maioria integrante do grupo
de estudo S+DP (Tabela 3).
Tabela 3– Características demográficas da população do estudo.
Grupo de estudo DM+DP T+DP S+DP S+G CONTROLE
N (%)
12 (11,9%) 22 (21,8%) 35 (34,6%) 16 (15,8%) 14 (13,9%)
Dente
Anterior
Pré-Molar
Molar
4 (33,3%)
4 (33,3%)
4 (33,3%)
4 (18,2%)
8 (36,4%)
10 (45,4%)
4 (11,4%)
10 (28,6%)
21 (60%)
4 (25%)
5 (31,3%)
7 (43,7%)
0 (0%)
7 (50%)
7 (50%)
Sexo
Feminino
Masculino
2 (16,6%)
10 (83,4%)
7 (46,7%)
8 (53,3%)
16 (53,3%)
14 (46,6%)
10 (71,4%)
4 (28,6%)
8 (61,5%)
5 (38,5%)
Idade média
(variação)
50,6
(32-67)
49,6
(32-60)
46,4
(30-63)
38,2
(26-38)
37,3
(21-59)
4.2 Perfil clínico
Todas as amostras removidas foram classificadas em 5 grupos de acordo
com a análise periodontal e a presença ou não do DM e do tabagismo, sendo
importante destacar que todos os pacientes portadores das condições modificadoras
da DP avaliadas, apresentaram DP. Ou seja, nenhum paciente tabagista ou
diabético tinha a gengiva e/ou periodonto de suporte inalterado.
Na análise periodontal foram descritas 5 variáveis: IP, SS, PS, RG, NIC. Os
pacientes do grupo CONTROLE exibiram menor índice de todas as variáveis
25
analisadas, exceto a PS, que exibiu um índice um pouco menor no grupo S+G. Além
disso, os pacientes S+DP exibiram os maiores índices de SS e de OS, os pacientes
DM+DP exibiram os maiores índices de RG e NIC e os pacientes T+DP exibiram o
maior índice de IP (Tabela 4).
Tabela 4 – Características periodontais da população do estudo.
Grupo de estudo DM+DP T+DP S+DP S+G CONTROLE
N (%) 12 (11,9%) 22 (21,8%) 35 (34,6%) 16(15,8%) 14 (13,9%)
IP
(variação)
62,5
(0-100)
93,18
(25-100)
75,71
(0-100)
65,62
(0 - 100)
12,5
(0 - 100)
SS
(variação)
83,33
(0-100)
80,68
(0-100)
89,28
(0-100)
64,06
(0 - 100)
16,07
(0 - 75)
PS
(variação)
3,72
(1,25-5,25)
4,25
(1,75-8,75)
4,80
(3-7,25)
2,26
(1,25 - 3)
2,35
(1,75 - 3)
RG
(variação)
1,66
(0-5,5)
0,63
(0-5,5)
0,87
(0-7)
0,125
(0 - 1,25)
0
(0 - 0)
NIC
(variação)
5,39
(2,75-10,75)
4,98
(1,75-10,75)
5,25
(3-11,25)
2,39
(1,25 - 3,75)
2,35
(1,75 - 3)
4.3 Perfil histopatológico
A análise histopatológica incluiu a avaliação de características do tecido
epitelial e do tecido conjuntivo. No tecido epitelial, foi possível observar que todos os
grupos exibiram um epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, sendo
preferencialmente hiperplásico nos grupos DM+DP, S+DP e CONTROLE. Além
disso, a presença de exocitose foi frequentemente observada em todos os grupos,
exceto o CONTROLE, e a presença de colônias bacterianas foi frequentemente
observada somente nos grupos DM+DP e S+DP. No tecido conjuntivo, foi possível
observar que ele era constituído de um tecido conjuntivo primariamente denso em
todos os grupos, contudo exibindo elevada celularidade somente no grupo DM+DP.
26
O infiltrado inflamatório foi preferencialmente identificado como acentuado em todos
os grupos com periodontite (DM+DP, T+DP e S+DP), sendo do tipo crônico em
praticamente todos os casos independente do grupo de estudo. A intensidade da
vascularização foi mínima em todos os grupos de estudo, exceto no grupo
CONTROLE, cuja vascularização foi classificada como leve na maioria dos casos
(Tabelas 5 e 6) (Figura 4, 5 e 6).
Tabela 5 – Características microscópicas do tecido epitelial da população de estudo.
Grupo de estudo DM+DP T+DP S+DP S+G CONTROLE
N (%) 12 (11,9%) 22 (21,8%) 35 (34,6%) 16 (15,8%) 14 (13,9%)
Espessura
Normal
Hiperplásico
Atrófico
4 (33,3%)
8 (66,7%)
0 (0%)
11 (50%)
11 (50%)
0 (0%)
17 (48,6%)
18 (51,4%)
0 (0%)
10 (62,5%)
6 (37,5%)
0 (0%)
6 (42,8%)
8 (57,2%)
0 (0%)
Queratinização
Sim
Não
12 (100%)
0 (0%)
22 (100%)
0 (0%)
35 (100%)
0 (0%)
16 (100%)
0 (0%)
14 (100%)
0 (0%)
Hiperqueratinização
Sim
Não
5 (41,6%)
7 (58,4%)
11 (50%)
11 (50%)
13 (37,1%)
22 (62,9%)
3 (18,7%)
13 (81,3%)
5 (35,7%)
9 (64,3%)
Exocitose
Sim
Não
9 (75%)
3 (25%)
12 (54,5%)
10 (45,5%)
23 (65,7%)
12 (34,3%)
9 (56,2%)
7 (43,8%)
5 (35,7%)
9 (64,3%)
Colônia bacteriana
Sim
Não
7 (58,3%)
5 (41,7%)
8 (36,3%)
14 (63,7%)
18 (51,4%)
17 (48,6%)
3 (18,7%)
13 (81,3%)
2 (14,3%)
12 (45,7%)
27
Figura 4 – Características microscópicas do tecido epitelial (HE). (A) Epitélio
estratificado pavimentoso paraqueratinizado encontrado na maioria das amostras
(x10). (B) Exocitose observada frequentemente em todos os grupos do estudo, com
exceção do grupo CONTROLE (x40).
A B
28
Tabela 6– Características microscópicas do tecido conjuntivo da população de estudo.
Grupo de estudo DM+DP T+DP S+DP S+G CONTROLE
N (%)
12(11,9%) 22(21,8%) 35(34,6%) 16(15,8%) 14(13,9%)
Densidade
Denso
Frouxo
11 (91,7%)
1 (8,3%)
12 (64,5%)
10 (54,5%)
28 (80%)
7 (20%)
13 (81,2%)
3 (18,8%)
13 (92,8%)
1 (7,2%)
Celularidade
Bem celular
Pouco celular
8 (56,6%)
4 (33,4%)
7 (31,8%)
15 (68,2%)
15 (42,8%)
20 ( 57,2%)
7 (43,8%)
9 (56,2%)
5 (35,7%)
9 (64,3%)
Infiltrado Inflamatório
Ausente
Leve
Moderado
Acentuado
1 (8,3%)
2 (16,7%)
3 (25%)
6 (50%)
1 (4,5%)
5 (22,7%)
7 (31,9%)
9 (40,9%)
2 (5,7%)
5 (14,3%)
9 (25,7%)
19 (54,3%)
2 (12,5%)
4 (25%)
7 (43,7%)
3 (18,8%)
4 (28,6%)
6 (42,8%)
2 (14,3%)
2 (14,3%)
Tipo de Inflamação
Ausente
Aguda
Crônica
Mista
0 (0%)
0 (0%)
9 (75%)
3 (25%)
1 (4,5%)
1 (4,5%)
19 (86,5%)
1 (4,5%)
1 (2,8%)
1 (2,8%)
32 (91,6%)
1 (2,8%)
2 (12,5%)
0 (0%)
14 (87,5%)
0 (0%)
2 (14,3%)
0 (0%)
10 (71,4%)
2 (14,3%)
Vascularização
Mínima
Leve
Moderado
Acentuado
4 (33,3%)
5 (41,7%)
3 (25%)
0 (0%)
11(50%)
9 (41%)
1 (4,5%)
1 (4,5%)
18 (51,4%)
5 (14,3%)
8 (22,8%)
4 (11,5%)
7 (43,7%)
4 (25%)
4 (25%)
1 (6,3%)
4 (28,6%)
7 (50%)
3 (21,4%)
0 (0%)
29
Figura 5 - Características microscópicas do tecido conjuntivo (HE).
Tecido conjuntivo denso e vascularização mínima, ambos encontrados em todos os
grupos de estudo (x10).
Figura 6 – Características microscópicas do tecido conjuntivo (HE). (A) Intenso
infiltrado inflamatório, encontrado frequentemente nos grupos com periodontite,
saudável sistematicamente ou não (x10). (B) Intenso infiltrado inflamatório crônico -
com presença de linfócitos e plasmócitos (x40).
4.4. Perfil imunoistoquímico
A análise imunoistoquímica revelou que a proteína RANK foi expressa em
todos os grupos de estudo, sendo importante destacar que seu percentual de
expressão mais frequente foi de até 25% das células do tecido conjuntivo em todos
os grupos de estudo, exceto no grupo S+DP, que também exibiu frequente
percentual de expressão entre 26 e 50% de suas células do tecido conjuntivo. Além
A B
30
disso, é importante ressaltar que não houve nenhum percentual de expressão de
RANK superior a 25% nos casos do grupo CONTROLE e que somente o grupo S+G
exibiu considerável número de casos com percentual de expressão de RANK
superior a 50% de suas células do tecido conjuntivo (Tabela 7 e Figura 7).
A expressão imunoistoquímica da proteína RANKL também foi identificada em
todos os grupos de estudo, sendo importante destacar que ela foi frequentemente
expressa em mais de 50% das células do tecido conjuntivo dos grupos DM+DP,
S+DP e T+DP, embora RANKL também tenha sido expresso de forma frequente em
até 25% das células do tecido conjuntivo deste último grupo (T+DP). Esse elevado
valor de RANKL provavelmente significa uma maior diferenciação dos osteoclastos e
a ativação da osteoclastogênese, principalmente nesses grupos onde a perda
tecidual é maior. É importante ainda ressaltar que a maioria dos casos do grupo
CONTROLE exibiu expressão indetectável de RANKL, que nenhum caso do grupo
S+G exibiu expressão de RANKL superior a 25% e que nenhum caso do grupo
S+DP foi indetectável para a expressão de RANKL (Tabela 7 e Figura 8).
A expressão imunoistoquímica da proteína OPG, como em todas as proteínas
até então estudadas, também foi identificada em todos os grupos de estudo, mas o
seu percentual de expressão foi um pouco mais variável em cada grupo de estudo.
Ainda assim, de um modo geral, foi possível perceber que em todos os grupos com
periodontite houve uma expressão frequente de OPG num percentual de expressão
superior a 25% de suas células do tecido conjuntivo. Além disso, no grupo
CONTROLE esta expressão de OPG foi relativamente bem distribuída em todos os
grupos de percentual de expressão de até 50% das células do tecido conjuntivo, e
no grupo S+G esta expressão de OPG se distribui somente entre os percentuais de
expressão variando até 50% das células do tecido conjuntivo. E, para finalizar, é
fundamental também destacar que, embora a expressão de OPG num percentual
superior a 50% das células do tecido conjuntivo seja um achado frequente em todos
os grupos com periodontite, a expressão de RANKL num percentual de expressão
superior a 50% das células do tecido conjuntivo é superior nestes grupos com
periodontite, com exceção do grupo de pacientes diabéticos (DM+DP) (Tabela 7 e
Figura 9).
31
Tabela 7–Características imunoistoquímicas da população de estudo.
Grupo de estudo DM+DP T+DP S+DP S+G CONTROLE
N (%)
RANK
Indetectável
Até 25%
Entre 26% e 50%
Mais de 50%
11(20,4%)
2 (18,2%)
5 (45,4%)
3 (27,3%)
1 (9%)
12 (22,2%)
3 (25%)
6 (50%)
2 (16,7%)
1 (8,3%)
12 (22,2%)
3 (25%)
4 (33,3%)
4 (33,3%)
1 (8,3%)
11(20,4%)
1 (9%)
5 (45,4%)
2 (18,2%)
3 (27,3%)
8 (14,8%)
1 (12,5%)
7 (87,5%)
0 (0%)
0 (0%)
RANKL
Indetectável
Até 25%
Entre 26% e 50%
Mais de 50%
OPG
Indetectável
Até 25%
Entre 26% e 50%
Mais de 50%
3 (27,3%)
3 (27,3%)
1 (9%)
4 (36,4%)
1 (9%)
2 (18,2%)
2 (18,2%)
6 (54,5%)
1 (8,3%)
5 (41,7%)
1 (8,3%)
5 (41,7%)
0 (0%)
3 (25%)
5 (41,7%)
4 (33,3%)
0 (0%)
2 (16,7%)
2 (16,7%)
8 (66,7%)
0 (0%)
1 (8,3%)
6 (50%)
5 (41,7%)
2 (18,2%)
9 (81,8%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
7 (63,6%)
4 (36,4%)
0 (0%)
5 (62,5%)
0 (0%)
1 (12,5%)
2 (25%)
2 (25%)
2 (25%)
3 (37,5%)
1 (12,5%)
RANKL/OPG
Indetectável
Até 25%
Entre 26% e 50%
Mais de 50%
3
1,5
0,5
0,7
0
1,7
0,2
1,25
0
2
0,3
1,6
0
1,3
0
0
2,5
0
0,3
2
32
Figura 7- Imunomarcação da proteína RANK em células inflamatórias de um caso
do grupo S+G (x100).
Figura 8 - Imunomarcação da proteína RANKL nas células inflamatórias de um caso
do grupo S+DP (x100).
Figura 9 - Imunomarcação da proteína OPG nas células infamatórias de um caso do
grupo S+DP (x100).
33
5. DISCUSSÃO
A DP, como já foi exposto, é um processo infeccioso que resulta em uma
resposta inflamatória acentuada de origem multifatorial que compromete os tecidos
de suporte e de proteção ao dente (LINDHE, LANG e KARRING, 2008). Dessa
forma, o alvo da presente monografia é o estudo da patogênese da periodontite a
partir da análise comparativa das características clínicas, histopatológicas e
imunoistoquímicas da gengiva de pacientes tabagistas, diabéticos e sem qualquer
outro fator de risco.
O perfil epidemiológico dos pacientes com periodontite é formado por adultos
com idade superior a 40 anos, enquanto o grupo de pacientes com gengivite é
formado por adultos jovens, não apresentando relação de prevalência ao sexo, que
quando existe, se refere ao sexo masculino (BRENNAN, SPENCER e SLADE, 2001;
BRODEUR et al., 2001; MEDEIROS e ROCHA, 2006). Tal descrição é parcialmente
reproduzida em nossa amostra, cujos pacientes com periodontite exibiam idade
média de 49 anos e os pacientes com gengivite exibiam uma idade média menor de
38 anos. Não identificamos também relação de prevalência de sexo, havendo uma
distribuição relativamente equilibrada entre ambos os sexos, numa relação de cerca
de 1 mulher para cada 0,95 homem, provavelmente por se tratar de uma pesquisa
conduzida em uma faculdade de odontologia, que geralmente conta com um número
maior de pacientes do sexo feminino cadastrados e em atendimento. Além disso,
como já citado, a idade média aumentou consideravelmente nos grupos com a
periodontite já instalada, uma vez que o tempo é um fator importante para a
progressão da doença ea perda óssea lenta e gradual (SUDA et al., 2000; HUGOSO
e LLAURELL, 2000; TIMMERMANN et al., 2000).
A análise do perfil clínico periodontal evidenciou que as variáveis avaliadas
exibiram menor índice nos pacientes do grupo CONTROLE, ou seja, os pacientes
que apresentavam saúde gengival não evidenciaram sinais clínicos da DP. E, os
grupos constituídos de pacientes com periodontite apresentaram os maiores valores
nas variáveis clínicas. O grupo DM+DP exibiu os maiores índices de RG e NIC, o
que evidencia que este grupo de pacientes exibiram uma maior perda tecidual. Tal
achado pode ser justificado pelo fato dos pacientes portadores de DM apresentarem
mecanismos de supressão da atividade osteoclástica e osteoblástica, sendo a
34
supressão da formação óssea muito maior do que a reabsorção (BARBOSA, 2013).
Além disso, estes pacientes apresentam complicações vasculares que geram a
exacerbação da destruição periodontal (BARBOSA, 2013). O grupo T+DP, por sua
vez, exibiu o maior índice de IP, corroborando com Reis et al., (2012) e
contradizendo Carvalho, Santos e Cury, (2008).
A análise histopatológica avaliou a histomorfologia do tecido epitelial e do
tecido conjuntivo. O epitélio de superfície identificado em todos os casos foi do tipo
estratificado pavimentoso queratinizado, que é comum a todo epitélio de
revestimento oral, incluindo a gengiva. Todos os grupos, exceto S+G, exibiam um
epitélio preferencialmente hiperplásico, característica que pode estar relacionada a
presença de bactérias atuando como agentes agressores no sulco, capazes de
instituir um processo inflamatório local e a consequente resposta de hiperplasia
epitelial (PAGE e SCHROEDER, 1976). Talvez, um menor número de casos
exibindo hiperplasia epitelial no grupo S+G seja resultado de uma colonização
bacteriana e processo inflamatório ainda precoces na gengivite. A exocitose foi
frequentemente observada em todos os grupos, exceto no grupo CONTROLE, o que
era de se esperar visto que na gengiva inflamada ocorre uma migração de células
inflamatórias do tecido conjuntivo para o epitélio de revestimento, formando assim,
uma barreira entre o tecido e o biofilme. Entretanto, o mesmo não seria esperado em
uma gengiva sadia visto que não há biofilme suficiente que estimule a permanência
do processo inflamatório (SMITH, SEYMOUR e CULLIMAN, 2000). Adicionalmente,
um estudo que relaciona a presença da exocitose nos tecidos periodontais afirma
que o biofilme, agente etiológico da periodontite, uma vez acumulado no sulco
gengival libera várias toxinas provocando uma reação inflamatória desencadeando a
presença das células inflamatórias no epitélio (TWINIG, 1984).
A análise do tecido conjuntivo deste estudo evidenciou que, independente da
presença de maior ou menor inflamação, a maioria dos casos de todos os grupos
era constituída de um tecido conjuntivo denso (fibroso), o que vai de encontro a um
estudo realizado por Pinchbacket al. (1996), que revelou a presença tecido
conjuntivo fibroso na gengiva que exibia mínima quantidade de inflamação. O
infiltrado inflamatório se mostrou acentuado em todos os grupos de pacientes com
periodontite (DM+DP, T+DP e S+DP), moderado no grupo de pacientes com
gengivite (S+G) e leve no grupo de pacientes com saúde gengival (CONTROLE), o
35
que reflete que a resposta inflamatória progride de acordo com a evolução da DP
(ALVES, 2000; NEVILLE et al., 2005; PAGE e SCHROEDER, 1976). A
vascularização, por sua vez, se revelou preferencialmente mínima em todos grupos
de estudo, o que não se aplicou a afirmativa de que há um aumento da
vascularização nos tecidos com maior quantidade de inflamação (ALVES, 2000;
NEVILLE et al., 2005).
O sistema RANK, RANKL e OPG está diretamente ligado ao processo de
reabsorção óssea, tanto fisiológico quanto patológico. Sua ação se dá através
ligação de RANKL ao seu receptor RANK provocando a ativação dos osteoclastos.
Por outro lado, a ligação de OPG ao RANKL inibe a capacidade de RANKL se ligar
ao RANK, provocando assim, a inibição da osteoclastogênese (GIANNOPOULOU,
MARTINELLI-KLAY e LOMBARDI, 2012).
O grupo CONTROLE, representado por pacientes com gengiva clinicamente
sadia, de um modo geral, exibiu uma baixa expressão imunoistoquímica de RANK e
de RANKL e uma elevada expressão imunoistoquímica de OPG, corroborando
assim com a literatura que relatou maiores expressões de RANK e OPG em
pacientes com gengiva clinicamente sadia, sugerindo, assim, a inibição da
osteoclastogênese (LUCENA, 2011). Neste ponto, é importante também destacar
que, reforçando este resultado, nossos achados clínicos também identificaram uma
menor perda tecidual neste grupo de pacientes com gengiva sadia.
A expressão de RANK, RANKL e OPG no fluido crevicular de pacientes com
gengiva saudável, com gengivite e com periodontite foi avaliada por Bostanci et al.
(2007), que identificaram baixos níveis de RANKL e OPG nas gengivas saudáveis e
com gengivite, de forma similar ao que identificamos neste estudo, refletindo, assim,
um provável equilíbrio no processo de osteoclastogênese dos tecidos envolvidos nas
doenças que não são caracterizadas pela perda óssea alveolar.
Todos os grupos de pacientes portadores de periodontite (S+DP, DM+DP,
T+DP), exibiram, de uma maneira geral, o mesmo padrão de porcentagem de
células positivas entre as proteínas avaliadas. A proteína RANK apresentou mais
frequentemente o percentual de expressão de até 25% das células positivas, RANKL
apresentou o percentual de expressão de mais de 50% das células positivas em
todos os grupos e OPG com o percentual de expressão de até 50% das células
36
positivas, exceto no grupo DM+DP que apresentou mais de 50% das células
positivas para essa proteína. Com exceção do grupo de pacientes diabéticos,
nossos resultados indicam maior índice de osteoclastogênese visto que RANKL foi
mais expresso em relação a OPG, o que caracteriza um aumento na atividade
osteoclástica, e consequentemente, maior severidade da doença (LU et al., 2006;
BOSTANCI et al., 2007).
Ao analisar especificamente o grupo de pacientes DM+DP, é possível
observar que há uma elevada expressão imunoistoquímica de OPG, o que
desfavorece o processo de osteoclastogênese. Neste contexto, apesar de estudo
realizado por Duarte et al. (2007) sugerir que o DM poderia exercer um papel
modulador em indivíduos com periodontite por inibição da produção de OPG, estudo
realizado por Costa et al. (2010) revelou que pacientes portadores de DM
apresentavam elevadas concentrações salivares de OPG, podendo tal fato estar
relacionado ao envolvimento da microvasculatura no DM, em que elevadas
concentrações de OPG podem representar um mecanismo de defesa contra
calcificações arteriais e outras formas destes prejuízos vasculares.
Ao analisar especificamente o grupo de pacientes T+DP, é possível observar
que há um certo equilíbrio entre a expressão imunoistoquímica de RANKL e OPG,
embora haja uma maior expressão do primeiro, favorecendo um pouco a
osteoclastogênese. Neste contexto, um estudo realizado por Buduneli et al. (2006)
revelou que os pacientes tabagistas com periodontite exibiam maiores valores de
PS, NIC, maiores níveis de RANKL e menores níveis de OPG, quando comparados
aos pacientes não tabagistas com periodontite, indicando, dessa forma, o
favorecimento da osteoclastogênese, de forma semelhante ao nosso estudo, exceto
pelos parâmetros clínicos periodontais, que foram inferiores no grupo de pacientes
tabagistas.
37
6. CONCLUSÃO
Com base nos resultados deste estudo foi possível verificar que os pacientes
do grupo CONTROLE exibiram os menores índices do perfil clínico periodontal
associados a ausência de exocitose e a uma baixa expressão imunoistoquímica de
RANK e de RANKL e elevada expressão imunoistoquímica de OPG, evidenciando,
dessa forma, a influência das variáveis clínicas na perda dos tecidos periodontais e
a ação de inibição da osteoclastogênese. Os grupos de pacientes portadores de
periodontite (S+DP, DM+DP, T+DP), de uma maneira geral, apresentaram
resultados semelhantes em todas as análises, em que se observa elevados índices
do perfil clínico periodontal associado a uma elevada expressão de RANK e de
RANKL e uma menor expressão de OPG, destacando, assim, a importância clínica e
destes marcadores no processo de osteoclastogênese. É importante destacar que
pacientes do grupo T+DP apresentaram uma maior expressão imunoistoquímica de
RANKL, que favorece a osteoclastogênese e pode justificar a maior índice de
biofilme visível seguido de perda óssea. Além disso, ao contrário do que se
esperava, observou-se uma elevada expressão imunoistoquímica de OPG no grupo
DM+DP, o que desfavorece o processo de osteoclastogênese, que pode ocorrer por
outros mecanismos.
38
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44
8.APÊNDICE
Apêndice A - Ficha de análise microscópica desenvolvida para este estudo.
45
Apêndice B - Ficha de revisão da análise microscópica desenvolvida para este
estudo.
46
9. ANEXO
Anexo A -Parecer do Comitê de Ética