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Page 1: Brasil. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 20, n. 3, p ... · Hortic. bras., v. 20, n. 3, set. 2002. 419 O morangueiro é produzido em di-versas regiões e tipos de clima, desde

419Hortic. bras., v. 20, n. 3, set. 2002.

O morangueiro é produzido em di-versas regiões e tipos de clima,

desde zonas temperada, mediterrânea,subtropical até zonas de taiga. A espé-cie cultivada, Fragaria XananassaDuch., um híbrido originário da Améri-ca, proveniente das espécies Fragariavirginiana e Fragaria chiloensis, se de-senvolve em todo o mundo, mas popu-lações naturais desta espécie são restri-tas à costa da California e aos Estadosde Oregon e Washington, EUA(Hancock & Luby, 1993).

Além do melhoramento ter provo-cado o estreitamento da base genéticado morangueiro cultivado (Sjulin &Dale, 1987), a maioria das cultivares

CONTI, J.H.; MINAMI, K.; TAVARES, F.C.A. Comparação de caracteres morfológicos e agronômicos com moleculares em morangueiros cultivados noBrasil. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 20, n. 3, p. 419-423, setembro 2002.

Comparação de caracteres morfológicos e agronômicos com molecularesem morangueiros cultivados no BrasilJosé Henrique Conti; Keigo Minami; Flavio Cesar Almeida TavaresESALQ, C. Postal 09, 13.418-900 Piracicaba – SP. E-mail: [email protected]

originou-se de poucos ancestrais (Scott& Lawrence, 1975). O sucesso no de-senvolvimento de novas combinaçõesde caracteres pode ser limitado pois atual-mente não se conhece a diversidade dogermoplasma disponível em programasde melhoramento e as informações deorigem não são elucidativas quanto àdiversidade genética, podendo ocorrercultivares diferentes geneticamente, mascom nomes semelhantes (Graham et al.1996).

No Brasil, a cultura do morangueiroteve grande expansão a partir da décadade 60, devido à aceitabilidade da culti-var Campinas (Passos, 1997) e à intro-dução de novas técnicas de cultivo.

Atualmente, a ocorrência de antracnose(“flor preta”) e a expansão da culturapara áreas distantes dos mercados con-sumidores tem estimulado o produtor abuscar novas técnicas de cultivo e no-vas cultivares. Contudo, na utilizaçãodestas novas formas, é imprescindívelcaracterizá-las, como meio de se evitaro cultivo de germoplasma com consti-tuições genômicas semelhantes, embo-ra com denominações diferentes. Adi-cionalmente, a caracterização genéticaconstitui a base para trabalhos de esti-mativas de similaridade genética.

A caracterização de cultivares podese basear nas diferenças de morfologiada folha, da planta ou do fruto ou das

RESUMOCaracteres morfológicos (forma dos dentes, ângulo da base e

razão entre o comprimento e a largura do folíolo, cor da folha, posi-ção da inflorescência em relação à folhagem e tamanho do cáliceem relação ao fruto), agronômicos (grau de proteção da inflorescênciapelas folhas, presença de “pescoço” no fruto, produção, número epeso médio de frutos, teor de sólidos solúveis, pH, textura e corexterna e interna) e moleculares foram estudados em cultivares domorangueiro, para verificar se os dados morfológicos e agronômi-cos apresentam correlação com os moleculares. Dados experimen-tais foram obtidos em campo em Atibaia (SP) e Piracicaba (SP), em1996, no delineamento em blocos ao acaso, com quatro repetições edezesseis plantas por parcela das cultivares Campinas, Dover,Guarani, Princesa Isabel e AGF 080. Para a caracterização molecularutilizou-se o método do polimorfismo de DNA amplificado ao aca-so (RAPD). Os resultados da análise de similaridade entre as culti-vares foram equivalentes, quando utilizadas característicasmorfológicas e agronômicas ou moleculares, indicando que os mé-todos de caracterização tiveram o mesmo poder de resolução na dis-tinção das cultivares. A ‘AGF 080’ não dispõe de registros de ori-gem, mas não foi possível distinguí-la da ‘Campinas’, pelos méto-dos utilizados. A cultivar Princesa Isabel tem origem semelhante à‘Guarani’; no entanto suas características morfológicas, agronômi-cas e moleculares foram mais semelhantes com as da ‘Dover’, quenão tem relações de origem com ‘Princesa Isabel’.

Palavras-chave: Fragaria x ananassa Duch., RAPD, similaridadegenética, caracteres morfo-agronômicos.

ABSTRACTComparison of morphological and agricultural characters

with molecular ones in Brazilian strawberries

The morphological (form of teeth, angle of the base, and ratiobetween length and width of leaves, color of leaves, inflorescenceposition regarding the canopy, calyx size related to the fruit andimmature fruit color), agricultural (degree of protection ofinflorescence to the leaves and the characteristics of neck presencein fruits, production, number and average weight, amount of solublesolids, pH, texture and external and internal color) and molecularcharacteristics of strawberries were studied, to identify correlationbetween morphological and agricultural data to the molecular ones.Field data were collected in Atibaia and Piracicaba (São Paulo State),in 1996. Experimental design was of randomized blocks with fourreplications and sixteen plants per plot using the cultivars Campinas,Dover, Guarani, Princesa Isabel and AGF 080. The molecularcharacterization was obtained through the method of RandomAmplified Polymorphic DNA (RAPD). The results of the similarityanalysis among cultivars were equivalent, when morphological andagricultural or molecular characteristics were evaluated, indicatingthat the methods presented the same resolution power to distinguishcultivars. In spite of the unknown origin of ‘AGF 080’, it was notpossible to distinguish it from the ‘Campinas’ using the methodemployed. Although Princesa Isabel’s origin is similar to ‘Guarani’,the morphological, agricultural and molecular characteristicspresented more similarity to ‘Dover’ which has no origin relationshipwith ‘Princesa Isabel’.

Keywords: Fragaria Xananassa Duch., RAPD, genetic similarity,morpho-agronomic traits.

(Recebido para publicação em 25 de fevereiro de 1999 e aceito em 15 de março de 2002)

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moléculas de proteínas ou de DNA, asquais são comumente denominadas dediferenças moleculares. No Brasil, oregistro institucional de cultivares demorangueiro baseia-se no trabalho dePassos et al. (1994) onde são descritasas características morfológicas que de-vem ser consideradas na caracterizaçãode cultivares. A caracterizaçãomolecular por análise de proteínas(isoenzimas) é interessante na cultura domorangueiro. No entanto, os trabalhosde Nehra et al. (1991) e Bringhurst etal. (1981), demonstraram que o núme-ro de possíveis “marcadores” é peque-no. Proposta por Williams et al. (1990),a técnica de Polimorfismo de DNAAmplificado ao Acaso (RAPD) demons-trou ser eficiente na identificação decultivares do morangueiro nos trabalhosde Parent & Pagé (1995); Gidoni et al.(1994) e Graham et al. (1996).

A decisão de qual método utilizardepende dos recursos disponíveis e dograu de confiabilidade do método. Acomparação entre métodos de caracte-rização é uma maneira de estimar o po-der de resolução de cada um. Com da-dos morfológicos e agronômicos ou commoleculares é possível estimar o graude similaridade entre cultivares. A com-paração dos dados de similaridade obti-dos permite determinar a possibilidadede uso dos métodos de caracterização.Com a finalidade de verificar a viabili-dade de aplicação da caracterizaçãomolecular, via RAPD, em moranguei-ros, em relação à caracterizaçãomorfológica atualmente utilizada, foiproposto o presente trabalho.

MATERIAL E MÉTODOS

Os dados das característicasmorfológicas e agronômicas foram ob-tidos em experimentos de campo emAtibaia (SP), em área de produção co-mercial de frutos e em Piracicaba (SP),em área do Departamento deHorticultura da ESALQ/USP, em 1996,no delineamento de blocos ao acaso,com quatro repetições e dezesseis plan-tas por parcela com as cultivares Cam-pinas, Dover, Guarani, Princesa Isabele AGF 080. Foram obtidas característi-cas moleculares em laboratório, utilizan-do folhas não expandidas destas culti-

vares, cultivadas em vasos. A cultivarCampinas IAC 2712 foi desenvolvidaem 1955 pelo IAC, após cruzamento dosclones Doner e Tahoe (Camargo, 1960).A cultivar Dover, desenvolvido na Uni-versidade da Flórida (EUA), foi selecio-nada para a característica de resistên-cia a antracnose nas condições daFlórida, resultado do cruzamento reali-zado em 1973 entre a cultivar FloridaBelle e o clone Fla. 71-189 (Howard &Albregts, 1980). As cultivares GuaraniIAC 5074 e IAC Princesa Isabel foramdesenvolvidas pelo engenheiro agrôno-mo Francisco Antonio Passos [a primei-ra corresponde ao ‘seedling’ número 13,selecionado da progênie do cruzamen-to realizado em 1974 entre as cultivares(Campinas x Monte Alegre) x Alema-nha e a segunda foi selecionada do cru-zamento realizado em 1981 entre as cul-tivares Alemanha e IAC Jundiai](Camargo & Passos, 1993). A ‘AGF080’ foi desenvolvida pela empresaAgroflora Reflorestamento eAgropecuária S/A.

Camargo (1963) explica que a partecomestível, carnosa e suculenta do mo-rango é um receptáculo dos verdadei-ros frutos que são os aquênios,pequeninos, duros e superficiais. Entre-tanto, para fins comerciais, denomina-se fruto ao conjunto do receptáculocarnoso mais os aquênios, nomenclatu-ra adotada neste trabalho. As caracte-rísticas analisadas podem ser separadasem dois grupos, aquelas que se referemà morfologia da planta, da folha ou dofruto e aquelas que são de interesse agro-nômico. As características analisadas,bem como a metodologia utilizada es-tão citados na Tabela 1.

Para a extração do DNA, utilizadono estudo dos caracteres moleculares,em cada cultivar, foram coletadas duasfolhas “não expandidas”. A estas foiadicionado nitrogênio líquido e em se-guida maceradas até a formação de umpó bem fino. Este material foi colocadoem tubo de Eppendorf, onde foi adicio-nado tampão de extração (3% CTAB,1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mMTris Hcl pH 8,0, 1%polivinilpirrolidone). O tubo foi incu-bado em banho Maria e em seguida foiadicionada solução de clorofórmio-alcool isoamílico (24:1), após foi agita-

do e centrifugado. Os ácidos nucleicosforam, então, precipitados através daadição de acetato de amônia 5 M e etanole depois ressuspenso em tampão TE (10mM Tris HCl pH 8,0 e 1,0 mM EDTA),até ficar completamente dissolvido. Emseguida procedeu-se ao tratamento comRNAse e quantificação das amostras deDNA por espectrofotometria.

As amplificações foram feitas emvolume de 25 ml contendo 20 mM deTris Hcl pH 8,4, 50 mM de KCl, 100mM de cada um dos 4desoxinucleotídeos, 20 ng de “primer”(10 pares de bases), 0,1% Triton X-100,1,8 mM de MgCl2, 25 ng de DNA, 1,5U da enzima Taq DNA Polimerase e 8,6ml de água Milli Q estéril. A reação deamplificação foi feita em termociclador.O programa inicia-se com uma pré-denaturação a 92ºC, por 2 minutos, se-guida de 45 ciclos de 45 segundos a94ºC, 1 minuto a 42ºC e 2 minutos a72ºC, com uma extensão final de 2 mi-nutos a 72ºC. Os fragmentos amplifica-dos foram separados em gel de agarosea uma corrente elétrica de 100 mA. Ogel foi corado com brometo de etídeo,descorado e fotografado. Os “primers”escolhidos foram os da “OperonTechnologies”, quais sejam, B6(TGCTCTGCCC), B19(ACCCCCGAAG), B8(GTCCACACGG), G5(CTGAGACGGA) e G11(TGCCCGTCGT) pois apresentaramcapacidade de gerar número médio defragmentos de DNA amplificadospolimórficos de alto peso, maiorpolimorfismo e alta repetibilidade dosresultados. Estes “primers” geraram 73fragmentos de DNA amplificados, quesão os “marcadores”.

A análise dos dados morfológicos eagronômicos foi realizada com base emSteel & Torrie (1960). Foram emprega-das, na análise, a média das parcelas eas diferenças entre as médias dos trata-mentos foram comparadas por meio doteste Tukey em 5% de probabilidade. Aanálise dos dados moleculares foi basea-da na presença ou ausência de bandas(1 ou 0 respectivamente) com o mesmopeso molecular. A partir dos géis obti-dos foram construídas matrizes binárias.Os dados qualitativos e quantitativosobtidos da análise das características

J. H. Conti et al.

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morfológicas e agronômicas foramtransformados em matrizes binárias con-forme o proposto por Bussab et al.(1990). A partir das matrizes binárias,formaram-se as matrizes de coeficien-tes de similaridade pelo método da si-milaridade qualitativa com o coeficien-te de Jaccard (J). Para a formação dosdendogramas, as matrizes de coeficien-tes de similaridade foram analisadaspelo método do desempenho seqüencialde aglomeração hierárquica de grupos(“Sahn Clustering”), com o coeficientedo método da média aritmética entrepares não ponderados (UPGMA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Três dendogramas foram organiza-dos, um com os dados morfológicos eagronômicos, outro com os dadosmoleculares e o terceiro com os dadosmorfológicos, agronômicos emoleculares agrupados.

O dendograma obtido pela análisedos dados morfológicos e agronômicos,separou as cultivares Dover, Guarani ePrincesa Isabel entre si e das cultivaresCampinas e AGF 080. Os dados da ma-

triz de coeficientes de similaridade indi-caram que as cultivares Campinas e AGF080 apresentaram 100% de similarida-de. As cultivares Dover e Princesa Isa-bel demonstraram ser as mais semelhan-tes (50% de similaridade), depois de‘Campinas’ e ‘AGF 080’. A cultivarGuarani ficou mais próximo de ‘Campi-nas’ e ‘AGF 080’ (40,5% de similarida-de) e mais distante de ‘Dover’ (27,0% desimilaridade) e ‘Princesa Isabel’ (23,7%de similaridade). As cultivares Campinase AGF 080 apresentaram 47,2% de simi-laridade com ‘Princesa Isabel’ e 39,5%de similaridade com ‘Dover’ (Tabela 2).

Comparação de caracteres morfológicos e agronômicos com moleculares em morangueiros cultivados no Brasil

Características TiposÉpocaflorada

Ordemfrutificação

Equipamentos ReferênciasNúmero deamostras

Forma dentesdo folíolo

AgudaIntermediáriaarredondada

1ª visualLemaitre &

Linden (1968)50 folhas

maduras/parcela

Cor da folhaVerde clara

Verde médiaVerde escura

1ª visualPassos et.al.

(1994)50 folhas

maduras/parcela

Ângulo base dofolíolo

Quantificado(graus)

1ª transferidorLemaitre &

Linden (1968)50 folhas

maduras/parcela

Razão compri-mento/largura

do folíoloQuantificado 1ª régua

Lemaitre &Linden (1968)

50 folhasmaduras/parcela

Posição inflor.em relação a

folhagem

AcimaAbaixo

Acima e abaixo2ª visual

Lemaitre &Linden (1968)

Todas as plantas

Tamanho docálice em

relação ao fruto

Pequeno MédioGrande

2ª 2ª ou 3ª visualPassos et.al.

(1994)50 frutos/parcela

Proteção dainflorescênciapelas folhas

PoucoRegularmente

Muito2ª visual

Passos et.al.(1994)

Todas as plantas

Ocorrência depescoço nos

frutosPresente Ausente 2ª 2ª ou 3ª visual

Passos et.al.(1994)

50 frutos/parcela

Produção, nú-mero e peso

dos frutosQuantificado (kg) todas todas balança

Passos(1982);Passos (1997)

Frutoscomerciáveis

Teor de sólidossolúveis dos

frutos

Quantificado(Graus Brix)

3ª 2ª ou 3ª densitômetro Passos (1982)100 g de

frutos/parcela

pH dos frutos Quantificado 3ª 2ª ou 3ª peagâmetro Passos (1982) 100g/parcela

Textura dosfrutos

Quantificado 3ª 2ª ou 3ªtexturômetro

TAXT2Ferreira(1981)

5 frutos/parcela

Cor externa einterna dos

frutos

Quantificado(croma - c*)

3ª 2ª ou 3ªespectro-fotômetro

Ferreira (1981) 5 frutos/parcela

Tabela 1. Metodologia e padrões utilizados na análise das características morfo-agronômicas. Piracicaba, ESALQ, 1996.

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A disposição das cultivares Campi-nas, Dover, Guarani, Princesa Isabel eAGF 080 no dendograma obtido, atra-vés dos dados moleculares, ficou igualao dendograma obtido com os dadosmorfológicos e agronômicos, só diferin-do pelos valores de similaridade.Graham et al. (1996) verificaram que ograu de similaridade entre as cultivares,quando os dados eram originários doestudo de ‘pedigree’, eram menores queo grau de similaridade quando os dadoseram da análise de RAPD. Assim, con-cluiu que, com os dados de ‘pedigree’,há diferenças grandes entre as cultiva-res que na verdade são semelhantesquando o estudo utiliza dados de mar-cas RAPD. Um terceiro dendograma foiconstruído com os dados morfológicos,agronômicos e moleculares unidos dascinco cultivares e o resultado foi a mes-ma disposição de cultivares dosdendogramas obtidos quando os dadosforam analisados separadamente, só di-ferindo pelos valores de similaridade(Tabela 3).

Gomes (1995) comparou linhagensde Sacharomyces cerevisae com dadosmoleculares e por característicasmorfológicas. Em linhagens da indús-tria cervejeira os dendogramas obtidosde dados oriundos dos métodos de se-paração de cromossomos, eletroforesede proteínas e RAPD apresentaram amesma formação de grupos. O autor

também realizou análise conjunta dosdados, reunindo todos os métodos, e odendograma obtido manteve a mesmaformação de grupos.

A grande similaridade entre ‘Dover’e ‘Princesa Isabel’ no dendogramaconstruído com dados morfológicos eagronômicos, era esperada pela seme-lhança que as duas cultivares apresen-taram entre si nos dados morfológicos.No entanto, não há informações sobreorigem que mostre alguma relação en-tre o “pedigree” destas cultivares. A se-melhança apresentada entre eles, pelaanálise dos dados moleculares, pode in-dicar que as diferenças morfológicas,expressas na planta, e asdissimilaridades do DNA, expressaspela análise de RAPD, proporcionaramresultados próximos. Isso pode ser acei-to pela mesma disposição das cultiva-res no dendograma obtido pela análisedas características morfológicas e agro-nômicas e no obtido pela análisemolecular. Por outro lado, o “pedigree”das cultivares Guarani e Princesa Isa-bel são muito semelhantes, pois ambostêm 50% de alelos comuns do progeni-tor Alemanha. Além disso, o outro pro-genitor de ‘Guarani’ é o resultado docruzamento entre ‘Campinas’ e ‘MonteAlegre’ e o outro de ‘Princesa Isabel’ éa cultivar Jundiaí que também tem comoprogenitores as cultivares Campinas eMonte Alegre. Ou seja, ‘Guarani’ e

Cultivares Dover AGF 080 Campinas Princesa Isabel Guarani

Dover 0,586 0,586 0,750 0,467

AGF 080 0,395 1,000 0,606 0,548

Campinas 0,395 1,000 0,606 0,548

Princesa Isabel 0,500 0,472 0,472 0,545

Guarani 0,270 0,405 0,405 0,237

Tabela 2. Coeficientes de similaridade entre cultivares com base em dados morfológicos e agronômicos (abaixo da diagonal) e de “marcadores”RAPD (acima da diagonal). Piracicaba, ESALQ, 1996.

Cultivares Dover AGF 080 Campinas Princesa Isabel Guarani

Dover 1,000

AGF 080 0,478 1,000

Campinas 0,478 1,000 1,000

Princesa Isabel 0,617 0,536 0,536 1,000

Guarani 0,358 0,471 0,471 0,380 1,000

Tabela 3. Coeficientes de similaridade entre cultivares com base em dados morfológicos, agronômicos e de “marcadores” RAPD. Piracicaba,ESALQ, 1996.

‘Princesa Isabel’ têm os mesmos pro-genitores. No entanto, provavelmentedevido ao processo seletivo a que fo-ram submetidos os progenitores quederam origem a estas cultivares, resul-tou em cultivares bem diferentes. As-sim, ‘Princesa Isabel’, apesar da origemdiferente de ‘Dover’, é mais parecidomorfologicamente e molecularmentecom esta cultivar do que com ‘Guarani’que, em termos de origem, é semelhan-te a ‘Princesa Isabel’, indicando que aseleção foi eficiente para alterar a com-posição genética nestas cultivares. En-tão, apesar de ‘Dover’ não ter semelhan-ças de origem com ‘Princesa Isabel’, ti-nha semelhanças morfológicas com estacultivar, que refletiram em similarida-de nas análises moleculares.

Os resultados comparados entre osmétodos de caracterização com base emcaracterísticas morfológicas e agronô-micas e o fundamentado em caracterís-ticas moleculares, deste trabalho, de-monstrou que a disposição das cultiva-res nos dendogramas foram iguais, sódiferindo o grau de similaridade entreeles. Ferreira & Grattapaglia (1996) co-mentam que “marcadores”morfológicos existem em menor núme-ro, o que limita a cobertura do genoma,além disso são específicos para um de-terminado tecido o que impede a suadeterminação quando há apenas algumaparte vegetativa da planta disponível. Os

J. H. Conti et al.

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“marcadores” moleculares têm a vanta-gem de em geral serem neutros em re-lação a efeitos fenotípicos com efeitomínimo ou nulo de epistasia oupleiotropia. A desvantagem dos“marcadores” moleculares é a necessi-dade de alguns equipamentos, além deconhecimento próprio para o desenvol-vimento da técnica, o que envolve, porexemplo, a determinação prévia de quais“marcadores” são os mais adequados àcultura que está sendo avaliada.

Considerando que a técnica deRAPD é relativamente barata, e queneste trabalho já foram detectados os“primers” B6, B8, B19, G5 e G11 comoos mais eficientes para a cultura domorangueiro, podemos inferir que é viá-vel utilizar o método de caracterizaçãomolecular, por análise de RAPD, comooutra opção à caracterizaçãomorfológica atualmente utilizada. No-vos trabalhos, com um número maiorde “primers”, poderá permitir uma ca-racterização e uma estimativa de distân-cia genética mais precisa das cultivaresdo morangueiro e também possibilitaráverificar possíveis diferenças entre ascultivares Campinas e AGF 080.

AGRADECIMENTOS

O presente trabalho foi realizado gra-ças ao apoio da FAPESP, processo 96/1606-2, do CNPq, dos Departamentos deHorticultura e Genética da ESALQ/USP,e do produtor rural Claudemir RodriguesSpinassi de Atibaia.

LITERATURA CITADA

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Comparação de caracteres morfológicos e agronômicos com moleculares em morangueiros cultivados no Brasil