8/14/2019 Br. J. Pharmacol. (1990), 100, 735-742

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B r .J . P h a r m a c o l .( 1 9 9 0 ) ,1 0 0 ,7 3 5 - 7 4 2

P h a r m a c o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a le f f e c t so f t h e c a r d i o t o n i ca g e n t O r g l 1 0 3 2 5i n i s o l a t e dc a r d i a ca n d v a s c u l a rt i s s u ep r e p a r a t i o n s

1 M .S h a h i d ,M . G .M a r t o r a n a ,J . E .C o t t n e y& R . J .M a r s h a l l

S c i e n t i f i cD e v e l o p m e n t G r o u p , D e p a r t m e n to f P h a r m a c o l o g y ,O r g a n o nL a b o r a t o r i e sL i m i t e d ,N e w h o u s e ,L a n a r k s h i r eML1 5 SH

1 T h e p h a r m a c o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a le f f e c t so f a n o v e l c a r d i o t o n i ca g e n t , O r g 1 O 3 2 5h a v e b e e ns t u d i e di n i s o l a t e dc a r d i a ca n d v a s c u l a rt i s s u ep r e p a r a t i o n s .2 O r g l O 3 2 5p r o d u c e dc o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t( 0 . 1 5 - 4 . 8 m M )p o s i t i v ei n o t r o p i c ,p o s i t i v ec h r o n o t r o p i ca n d v a s c u l a rr e l a x a n t re sp o n se s i n r a b b i ti s o l a t e dp a p i l l a r y ,a t r i a la n d a o r t i cp r e p a r a t i o n s ,r e s p e c t i v e l y .T h em a x i m a lc h r o n o t r o p i ce f f e c t( 4 5 % )was s i g n i f i c a n t l yl e s st h a n t h e i s o p r e n a l i n em a x i m u m .T h e i n o t r o -p i ce f f e c t so f O r g l O 3 2 5w e r e n o t m o d i f i e db y a - o r , - a d r e n o c e p t o rb l o c k a d eo r b y p r e t r e a t m e n tw i t hr e s e r p i n e .O r g 1 0 3 2 5was a t l e a s t2 3 t i m e smore p o t e n t a t r e l a x i n ga o r t i cs t r i p sp r e - c o n t r a c t e dw i t h p h e n -y l e p h r i n et h a n w i t h K C I .3 O r g 1 O 3 2 5( 7 4 p M )p o t e n t i a t e d( 1 0 - 1 4f o l d )t h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c t so f i s o p r e n a l i n ei n r a b b i ti s o -l a t e dp a p i l l a r ym u s c l e s .C a r b a c h o li n h i b i t e dt h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c to f O r g 1 0 3 2 5 .B o t h t h ep o s i t i v e

i n o t r o p i ca n d v a s o r e l a x a n te f f e c t so f O r g l O 3 2 5w e r e a c c o m p a n i e d b yi n c r e a s e si n c y c l i cAMP b u t no tc y c l i cGMP.4 I n r a t p e r f u s e dh e a r t p r e p a r a t i o nO r g l O 3 2 5i n c r e a s e dp h o s p h o r y l a s ea , c y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea c t i v i t i e sa n d s t i m u l a t e dp h o s p h o r y l a t i o no f c o n t r a c t i l ep r o t e i n s( t r o p o n i n - Ia n d C - p r o t e i n ) .5 O r g l O 3 2 5s e l e c t i v e l yi n h i b i t e dt h e c y c l i cAMP h y d r o l y t i ca c t i v i t yo f c y c l i cAMP h i g h a f f i n i t yc y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s e( P D E )i s o e n z y m e s ,PDE I I I ( I C 5 06 5 / M m )a n d PDE I V ( I C 5 07 1 p M ) ,f r o mr a b b i tc a r d i a cv e n t r i c l e .Weak i n h i b i t i o n( I C 5 0> 2 5 0 p U M )o f PDE I a n d PDE II was o b s e r v e d .6 T h e r e s u l t sshow t h a t t h e c a r d i a cand v a s c u l a re f f e c t so f O r g 1 O 3 2 5ar e m e d i a t e db y an i n c r e a s ei nc e l l u l a rc y c l i cAMP d u e t o i n h i b i t i o no f PDE I I I a n d PDE IV a c t i v i t i e s .H o w e v e r ,i n c o nt r a s t t oo t h e rP D E - i n h i b i t o r sO r g l O 3 2 5p r o d u c e da m a r k e di n c r e a s ei n r e l a x a t i o nt i m e o f i s o l a t e dp a p i l l a r ym u s c l es u g g e s t i n gt h e i n v o l v e m e n to f a d d i t i o n a lc y c l i cA M P - i n d e p e n d e n tm e c h a n i s m so f a c t i o n .

I n t r o d u c t i o n

A r e d u c t i o ni nc a r d i a cp u m p i n ga n d a m a r k e di n c r e a s ei n p e r -i p h e r a lv a s c u l a rt o n e a r e c h a r a c t e r i s t i ch a e m o d y n a m i ca b n o r -m a l i t i e so b s e r v e di n c o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r ep a t i e n t s( s e eR e m m e ,1 9 8 6 ;P o o l e - W i l s o n& B u l l e r ,1 9 8 8f o rr e v i e w s ) .T h u so n e t h e r a p e u t i ca p p r o a c ht o t h et r e a t m e n to ft h i sd i s o r d e rh a sb e e n t o u s e a g e n t s w h i c h i n c r e a s et h ec o n t r a c t i l ee f f o r to fc a r d i a cm u s c l et o r e s t o r e pump f u n c t i o n ,a n d w h i c hr e l a xv a s c u l a rs m o o t hm u s c l et o l o w e rv a s c u l a rr e s i s t a n c e .P r e s e n td a y t h e r a p yo fc o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r es t i l li n v o l v e st h eu s e o fp o s i t i v ei n o t r o p i ca g e n t s s u c h a s c a t e c h o l a m i n e sa n d c a r d i a cg l y c o s i d e s( R e m m e ,1 9 8 6 ;R e t t i g& B e t t e ,1 9 8 8 ) .T h e s ed r u g s ,h o w e v e r ,h a v e s i g n i f i c a n td i s a d v a n t a g e s .C a r d i a cg l y c o s i d e s

h a v e a l o w t h e r a p e u t i ci n d e x

a n dc a n c a u s e

a r r h y t h m i a s .C a t e c h o l a m i n e sp r o d u c ea d i s p r o p o r t i o n a t er i s ei n h e a r tr a t ew h i c h a c c o m p a n i e st h e i n c r e a s ei n c o n t r a c t i l ef o r c e .T h et a c h y c a r d i ai s u n d e s i r a b l e ,f o ra n a l r e a d y m e ta b o l i c a l l yc om-p r i s e dm y o c a r d i u m ,s i n c ei t l e a d st o a f u r t h e ri n c r e a s ei no x y g e nc o n s u m p t i o na n d m ay i n c r e a s et h ec h a n c eo fa r r h y t h -m i a s .F u r t h e r m o r e ,t h ei n o t r o p i c e f f i c ac yo fc a t e c h o l a m i n e si nh e a r tf a i l u r ep a t i e n t sh a s b e e n q u e s t i o n e d ,b e c a u s eo f t h er e p o r t e dr e d u c t i o ni n t h ed e n s i t yo f c a r d i a cf i - a d r e n o c e p t o r si n f a i l i n gm y o c a r d i u m( B r i s t o we t a l . ,1 9 8 6 ;D e n n i s se t a l . ,1 9 8 9 ) .I n a d d i t i o n ,s t u d i e sh a v es h o w na n i n c r e a s ei n t h el e v e lo f t h eg u a n i n en u c l e o t i d er e g u l a t o r y p r o t e i nw h i c hi n h i b i t sa d e n y l a t ec y c l a s e( F e l d m a ne t a l . ,1 9 8 8 ) .T h e r e d u c t i o ni nv a s c u l a rt o n e p r o d u c e db y t h e s ea g e n t s( w i t ht h ee x c e p t i o no f/ ? 2 - a d r e n o c e p t o ra g o n i s t s )i s a c o n s e q u e n c eo fi m p r o v e dm y o -

c a r d i a la c t i v i t yr a t h e rt h a n a d i r e c te f f e c to n b l o o dv e s s e l sa n d

i n d e e d g l y c o s i d e st e n d t o c a u s e v a s o c o n s t r i c t i o nd i r e c t l y .C a r d i a c s t i m u l a n t sw i t h m i n i m a le f f e c ton h e a r tr a t e a n d

I A u t h o rf o rc o r r e s p o n d e n c e .

w h i c ha l s oc a u s e r e l a x a t i o no f v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ea r et h u s p o t e n t i a l l yu s e f u ld r u g s i n t h et r e a t m e n to f c o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r e .

I n t h i s p a p e r w e d e s c r i b et h e p h a r m a c o l o g i c a la n d b i o -c h e m i c a le f f e c t so fa new c a r d i o t o n i ca g e n t ,O r g l 0 3 2 5( F i g u r e1 ) i n i s o l a t e dc a r d i a ca n d v a s c u l a rt i s s u ep r e p a r a t i o n s .P r e -l i m i n a r yd a t a o n t h i sc o m p o u n dh a v e b e e np r e s e n t e dp r e -v i o u s l yt o t h eB r i t i s hP h a r m a c o l o g i c a lS o c i e t y( S h a h i de t a l . ,1 9 8 8 ;M a r s h a l le t a l . ,1 9 8 8 ) .

M e t h o d s

P h a r m a c o l o g i c a la n a l y s i s

I n o t r o p i ca c t i v i t yR i g h t v e n t r i c u l a rp a p i l l a r ym u s c l e sf r o mm a l e Ne w Z e a l a n dW h i t er a b b i t h e a r t sw e r e s u s p e n d e di nK r e b s - H e n s e l e i ts o l u t i o nc o n t a i n i n g( m m o l l ) : N a C l 1 1 8 ,K C I4 . 7 ,MgSO41 . 2 ,KH2PO41 . 2 ,C a C l 22 . 5 ,NaHCO32 5a n d g l u c o s e1 1 . 7a t 3 2 0 C ,w h i c h w a s a e r a t e dw i t h a g a sm i x t u r ec o n t a i n i n g9 5 % 0 2 a n d 5 % C O 2 .T h e t i s s u e sw e r es t r e t c h e db y a d j u s t i n gt h ed i a s t o l i ct e n s i o nt o 1 g a n d t h ee l e c t r i c a l l y - i n d u c e d( l H z w i t h p u l s e so f 1 m s d u r a t i o na t a

NO H

CH30

CH30

N H 2H C I

F i g r e1 T h e c h e m i c a l s t r u c t u r eo f O r g l O 3 2 5( N - h y d r o x y - 5 , 6 -d i m e t h o x y - 1 H - i n d e n e - 2 - c a r b o x i m i d a m i d e . H C I ) .

% a ' . "M a c m i l l a nP r e s sL t d ,1 9 9 0

8/14/2019 Br. J. Pharmacol. (1990), 100, 735-742

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7 3 6 M. SH A H I D e t a l .

v o l t a g e5 0 - 1 0 0 %a b o v e t h r e s h o l df r o m a G r a s s S 8 8s t i m u l a t o r )c o n t r a c t i o n sr e co r de d w i tha f o r c ed i s p l a c e m e n tt r a n s d u c e r( G r a s sF T03C) a t t a c h e d t o a G r a s s c u r v i l i n e a rc h a r tr e c o r d e r .A f t e ra n i n i t i a le q u i l i b r a t i o np er io d o f4 5 m i n( d u r i n gw h i c ht h et i s s u e sw e r ew a s h e dt h r e et i m e s ) ,a n y f a l lo f fi n d i a s t o l i ct e n s i o nw a sc o r r e c t e db y r e s e t t i n gb a c kt o 1 g a n ds t i m u l a t i o nf r e q u e n c yw a s l o w e r e dt o 0 . 4H z . A d d i t i o no fd r u gw a s s t a r t e d1 5m i n a f te r t h i sp r o c e d u r e .P a p i l l a r ym u s c l et w i t c hs h a p e sw e r er e c o r d e do n a n o s c i l l o s c o p ea n d p h o t o g r a -

p h e d .T h e f o l l o w i n gc o m p o n e n t so f t h ei s o m e t r i cc o n t r a c t i o nc u r v e w e r e a n a l y s e d :t i m e t o p e a k f o ' r c e ,r e l a x a t i o nt i m e a n dt o t a lt w i t c h d u r a t i o n .

C h r o n o t r o p i ca c t i v i t yS p o n t a n e o u s l yb e a t i n gr i g h ta t r i af r o mm a l e Ne w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t h e a r t sw e r e s u s p e n d e d( d i a s t o l i ct e n s i o n1 . 5 - 2 . 0g ) i n K r e b s - H e n s e l e i ts o l u t i o na sd e s c r i b e df o rp a p i l l a r ym u s c l ee x p e r i m e n t s .D r u g sw e r ea d d e da f t e ra s t a b i l i z a t i o np e r i o d o f 6 0m i n, d u r i ngw h i c h t i m e t h ep r e p a r a t i o n sw e r e w a s h e df o u rt i m e s ,a n d t h ef r e q u e n c yo fb e a t i n gw a s m e a s u r e dw i t h a t a c h o g r a p ha n d m o n i t o r e do n aG r a s s( M o d e l7 ;Q u i n c y ,M a s s . )r e c o r d e r .

Va s c u l a ra c t i v i t yA o r t i cs t r i p sf r o m m a l e Ne w Z e a l a n dW h i t e r a b b i t sw e r e s u s p e n d e di n K r e b s - H e n s e l e i ts o l u t i o n( 3 7 0 C )a n d a l l o w e dt o s ta b i l i zef o r6 0 m i n( d u r i n gw h i c ht h et i s s u e sw e r e w a s h e df o u rt i m e s )b e f o r et h ee x p e r i m e n t sw e r ec o m m e n c e d .T h e t i s s u e sw e r ec h a l l e n g e dw i t h a n e a r m a x i m a l( E C 9 0 )c o n c e n t r a t i o no fp h e n y l e p h r i n e( 1 0 p M )o r K C I( 6 0 m M )a n d a l l o w e dt o r e a c h p e a k e f f e c tb e f o r e t h es p a s m o g e nw a sw a s h e do u t .T h i s p r o c e d u r ew a s r e p e a t e d( u s u a l l yt w i c e )u n t i la c o n s i s t e n tr e s p o n s et o t h es p a s m o g e nh a d b e e ne s t a b l i s h e d .T h e d e g r e e o f c o n t r a c t u r ep r o d u c e d b y p h e n y l e p h r i n e( 2 . 4 6+ 0 . 0 5g ) a n d K C l( 2 . 1 3+ 0 . 1 4 g )w a s s i m i l a ri n m a g n i -t u d e .Va s c u l a rr e l a x a n ta c t i o nw a s a n a l y s e db y c u m u l a t i v e l ya dd in g d r u gt o a o r t i cs t r i p sp r e - c o n t r a c t e dw i t h p h e n y l e p h -r i n eo r K C l .

I n a l l i s o l a t e dt i s s u ep r e p a r a t i o ne x p e r i m e n t s ,c u m u l a t i v ec o n c e n t r a t i o n - e f f e c tc u r v e sw e r ec o n s t r u c t e da n d e a c hc o n c e n -t r a t i o no ft h et e s ta g e n t w a s a l l o w e dt o r e a c hp e a ke f f e c t( 2 0 -3 0m i n )b e f o r ea d d i t i o no f t h en e x t c o n c e n t r a t i o n .

B i o c h e m i c a la n a l y s i s

C y c l i cn u c l e o t i d em e a s u r e m e n t sC y c l i cn u c l e o t i d el e v e l si nc a r d i a ca n d v a s c u l a rp r e p a r a t i o n sw e r e m e a s u r e da c c o r d i n gt o t h e p r o c e d u r ed e s c r i b e df o r r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l eb yR o d g e r& S h a h i d( 1 9 8 4 ) .T h e s ed e t e r m i n a t i o n sw e r em a d ea tt h e p e a k o f t h e p o s i t i v ei n o t r o p i cr e s p o n s ef o r p a p i l l a r ym u s c l e sa n d a t d i f f e r e n tl e v e l so fr e l a x a t i o n( 1 0 ,2 5 ,5 0 ,7 5 a n d1 0 0 % )f o ra o r t i cs t r i p s .I n t h el a t t e re x p e r i m e n t s d r u g sw e r ea d d e di n a c u m u l a t i v em a n n e rt o a c h i e v e t h e d e s i r e dl e v e lo fr e l a x a t i o n .T h e e f f e c t so f c h o l i n o c e p t o ra g e n t so n a n e a rm a x i m a lc o n c e n t r a t i o no fO r g 1 0 3 2 5( 1 . 9m M )w e r ee x a m i n e di nr a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s .A l le x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m e di nt h ep r e s e n c eo fp r o p r a n o l o l( 0 . 1p M ) .T h ei n o t r o p i cr e s p o n s et oO r g l O 3 2 5w a s a l l o w e dt o r e a c hp l a t e a u( 2 0 m i n )b e f o r ea d d i -t i o n o f e i t h e rc a r b a c h o l( 2 2 p M )o r s o d i u m n i t r o p r u s s i d e( 1m M ) .T h en e g a t i v ei n o t r o p i ce f f e c to fc a r b a c h o lw a s a l l o w e dt o r e a c h p e a k e f f e c t( 3 - 4m i n ) b e f o r et i s s u e sw e r e r a p i d l yf r o z e ni n l i q u i dn i t r o g e nf o rc y c l i cn u c l e o t i d ea n a l y s i s .S o d i u mn i t r o p r u s s i d ew a s a l l o w e d t o a c t f o r 1 5 m i nb e f o r ef r e e z e -c l a m p i n go fp a p i l l a r ym u s c l e s .I n some e x p e r i m e n t sa t r o p i n e( 1p M )w a s a l s ou s e d a n d t h i sw a s a d d e da t t h es a m et i m e a sp r o p r a n o l o lw h i c hw a s2 0 - 3 0m i nb e f o r e t h ea d m i n i s t r a t i o no fO r g 1 0 3 2 5 .

C y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s eC a r d i a cc y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s e( P D E )i s o e n z y m e sw e r e p r e p a r e db y i o n : .e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y b ya p r o c e d u r ee s s e n t i a l l ys i m i l a rt o t h a td e s c r i b e db y R e e v e se t a l .( 1 9 8 7 ) .T h e t e m p e r a t u r ew a sm a i n t a i n e da t 4 0 C t h r o u g h o u tt h e e x t r a c t i o np r o c e d u r e .B r i e f l y ,v e n t r i c u l a rt i s s u e( 5 - 1 5g ) f r o m m a l e Ne w Z e a l a n d

W h i t e r a b b i th e a r t sw a s h o m o g e ni z e di n B i s - T r i s b u f f e r( 2 0m m ,p H 6 . 5 )c o n t a i n i n g :1m md i t h i o t h r e i t o l ,2 m Mb e n z a m i -d i n e ,2 m mEDTA, 50mMs o d i u ma c e t a t ea n d 1 0 0 p u Mp h e n y l -m e t h a n es u l p h o n y lf l u o r i d ea n d c e n t r i f u g e da t 1 2 , 0 0 0 gf o r1 0 m i n .T h e s u p e r n a t a n tf r a c t i o nw a s a p p l i e d( 6 0m lh 1) t o ac o l u m no f D E A E - s e p h a r o s eC L - 6 Bf a s t - f l o w( 1 . 6x 3 2 c m )a n d t h eb o u n dp r o t e i n sw e r ee l u t e dw i t h al i n e a rg r a d i e n t( 5 0 -1 0 0 0 m M )o fs o d i u ma c e t a t ei n f i v eb e d v o l u m e so fh o m o g e n i -z a t i o nb u f f e r( 3 0m l h 1 ) .F r a c t i o n s( 1 0m l ) w e r ec o l l e c t e da n da s s a y e df o rPDE a c t i v i t y .E t h y l e n eg l y c o lw a s a d d e dt o a f i n a lc o n c e n t r a t i o no f 30 % ( v / v )a n d t h e a c t iv ef r a c t i o n sf r o z e ni nl i q u i dn i t r o g e n b e f o r el o n g - t e r ms t o r a g ea t - 7 0 ' C .

PDE a c t i v i t yw a s m e a s u r e da c c o r d i n g t o t h e m e t h o dd e s c r i b e db y M e t h v e ne t a l .( 1 9 8 0 )w i t h m i n o rm o d i f i c a t i o n sa s d e s c r i b e di n d e t a i lb y S h a h i d& R o d g e r( 1 9 8 9 ) .T h e s t a n -d a r d a s s a y m i x t u r e ( 2 0 0 u p l )c o n t a i n e d : 3 m MM g C I 2 ,1mMa d e n o s i n e 5 ' - m o n o p h o s p h a t e(AMP) o r g u a n o s i n e 5 ' -m o n o p h o s p h a t e( G M P ) , 1I M 3 H - l a b e l l e d / u n l a b e l l e dc y c l i cn u c l e o t i d e( - 0 . 0 9u C i ) , 1m m d i t h i o t h r e i t o l ,0 . 0 5 % ( w / v )b o v i n es e r u ma l b u m i ni n 5 0 m MT r i s - H C I ,p H 7 . 4 .S a m p l e sw e r e i n c u b a t e da t 3 7 Cf o r 1 5 m i na n d t h er e a c t i o nw a s t e r -m i n a t e d b yh e a t ( i na l u m i n i u mb l o c k ss e ta t 1 0 5 C ) .T h e u n r e -a c t e dc y c l i cn u c l e o t i d ew a s r e c o v e r e db y c h r o m a t o g r a p h yo ns m a l la l u m i n ac o l u m n sa n d c o u n t e di n a l i q u i ds c i n t i l l a t i o nc o u n t e r . C y c l i cn u c l e o t i d e sl a b e l l e dw i t h ` 4 Cw e r e u s e d a sr e c o v e r ym a r k e r sf o rt h es e p a r a t i o no n a l u m i n a .

P h o s p h o r y l a s ea a n d c y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea c t i v i t yC a r d i a cp h o s p h o r y l a s ea a n d a d e n o s i n e3 ' : 5 ' - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e( c y c l i cAMP-PrK)a c t i v i t i e sw e r e e x a m i n e da c c o r d i n gt o t h em e t h o dd e s c r i b e db y E n g l a n d& S h a h i d( 1 9 8 7 ) .R a t h e a r t sw e r ep e r f u s e db y t h eL a n g e n d o r f ft e c h n i q u ew i t h K r e b s - H e n s e l e i ts o l u t i o ni n t h ea b s e n c ea n d p r e s e n c eo fd r u g .T h e t i s s u e sw e r ef r e e z e - c l a m p e da t t h ep e a k o f t h ep o s i t i v ei n o t r o p i cr e s p o n s ea n d s t o r e da t- 7 0 Cf o rd e t e r m i n a t i o no fe n z y m ea c t i v i t i e s .

C o n t r a c t i l e p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o nT h ee f f e c t so n c o n t r a c t i l e

p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o nw e r e a n a l y s e d b y t h e m e t h o dd e s c r i b e db y E n gl a nd& S h a h i d( 1 9 8 7 ) .R a t h e a r t sw e r e p e r -f u s e dw i t h K r e b s - H e n s e l e i ts o l u t i o nc o n t a i n i n g 1 3 . 5p C io fr a d i o a c t i v ep h o s p h a t e( [ 3 2 P ] - P Jf o r 1 5 m i ni n a r e c y c l i n gs y s t e m .T h e i n c o r p o r a t i o no f r a d i o a c t i v ep h o s p h a t ei n t oc o n -t r a c t i l ep r o t e i n si n t h ea b s e nc e o rp r e s e n c eo fd r u gw a sa s s e s s -e d b y S D S - g e le l e c t r o p h o r e s i sa n d a u t o r a d i o g r a p h y .

C a l c i u mf l u xa n a l y s i sS a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mm i c r o s o m e sw e r ep r e p a r e db y a m o d i f i e dm e t h o db a s e do n t h et e c h n i q u ed e s c r i b e db y H o l l i n w o r t h& E n g l a n d( 1 9 7 8 ) .B r i e f l y ,f r e s hv e n -t r i c u l a rt i s s u ef r o mr a b b i th e a r t sw a sh o m o g e n i s e di n 1 0v o lo fb u f f e rA c o n t a i n i n g :290mMs u c r o s e ,5 mMN a N 3 ,15mM2 -m e r c a p t oe t h a n o l ,0 . 5m m EDTA a n d 3 0m mT r i sH C l ( p H7 . 0 ) .T h e h o m o g e n a t e w a ss u b j e c t e dt o a s e r i e so fd i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o ns t e p st o y i e l da p r e p a r a t i o nm a i n l yc o n t a i n i n gs a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mm e m b r a n e s .A l lp r o c e d u r e sw e r ep e r -f o r m e da t 4 C .M a r k e r e n z y m ea n a l y s i ss h o w e dt h a t t h e r ew a sa s e v e nf o l de n r i c h m e n to f s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mC a 2 +-A T P a s ea c t i v i t y .C a 2+ - u p t a k ei n t os a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mv e s i c l e sw a s m e a s u r e db y t h em e t h o dd e s c r i b e db y H a r i g a y a& S c h w a r t z( 1 9 6 9 ) .S a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mv e s i c l e s( 2 0 u gp r o t e i nm l -1 )w e r ei n c u b a t e da t 3 7 Ci n b u f f e r( p H 6 . 8 )c o n -t a i n i n g :5 0 mML - h i s t i d i n e ,100mMK C I ,3 m MM g C l 2 ,10mMp o t a s s i u mo x a l a t e ,10mm NaN3, 5 m m N a 2 A T P ,0 . 2 9 9m mEGTA a n d 0 . 1 8 m mI 5 C a C l 2( 0 . 0 3 4 p u C i m l - 1 ) .T h e f r e eCac o n c e n t r a t i o ni n t h e a s s a ym i x t u r ew a s 4 . 8 5a m . S a m p l e s( 0 . 5 m l )o f t h ea s s a ym e d i u mw e r e r e m o v e da t v a r i o u st i m ep o i n t sa n d r a p i d l yf i l t e r e do v e r0 . 4 5p m m e m b r a n e si n a M i l l i -p o r e f i l t r a t i o na p p a r a t u s .E a c h f i l t e rw a s w a s h e d w i t h3 x 2 m l i c e - c o l db u f f e r( p H 6 . 9 )c o n t a i n i n g :5 m M N a N 3 ,100mMK C I , lomM M g C l 2 ,2 m MN a 2 AT P,25mMT r i sH C Ia n d t h e n d r i e db e f o r ed e t e r m i n a t i o no fr a d i o a c t i v i t yb y l i q u i ds c i n t i l l a t i o nc o u n t i n g .

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O r g 1 O 3 2 5 :A NEW CARDIOTONICAGENT 7 3 7

M a t e r i a l s

P h e n y l e p h r i n e ,( ) i s o p r e n a l i n ea n d 3 - i s o b u t y l - 1 - m e t h y l -x a n t h i n e( I B M X )w e r e p u r c h a s e df r o mS i g m a( P o o l e ,D o r s e t ,U . K . ) .Ve r a p a m i lw a so b t a i n e df r o mA . G . K n o l l ,L u d w i g s c h a -f e n . [ 8 - 3 H ] - a d e n o s i n e3 ' :5 ' - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e( 2 5 -3 0C i mmol 1 ) ,[ 8 - 3 H ] - g u a n o s i n e3 ' :5 ' - c y c l i cm o n o p h o s p h a t e( 1 5 - 2 0C i m m o f l1 ) ," 5 C a C l 2 ( 1 0 - 4 O m C im g - ' c a l c i u m )w e r eo b t a i n e df r o m Amersham I n t e r n a t i o n a l( A m e r s h a m ,B u c k s . ,U . K . ) .A l lo t h e ra n a l y t i c a lc h e m i c a l sw e r e o b t a i n e de i t h e rf r o m S i g m aC h e m i c a lC o . o r B . D . H . C h e m i c a l s( b o t h o fP o o l e ,D o r s e t , U . K . )a n d w e r e n o r m a l l yo f A n a l a ro r e q u i v a -l e n tg r a d e .O r g l O 3 2 5( 3 0 m g m l - ' )w a s d i s s o l v e di n d i s t i l l e dw a t e r a n d s u b s e q u e n td i l u t i o n sw e r emade e i t h e ri n s a l i n eo ra p p r o p r i a t eb u f f e rs o l u t i o n .T h e f u l lc h e m i c a lname f o rO r g l O 3 2 5i ss h o w ni n F i g u r e1 .

S t a t i s t i c s

T h e r e s u l t sa r ep r e s e n t e da s mean v a l u e s+ s . e . m e a n .I n i s o -l a t e dt i s s u ee x p e r i m e n t st h eE C 5 0v a l u e s( t h ec o n c e n t r a t i o no fd r u gp r o d u c i n g50 % o fi t sown maximumr e s p o n s e )w e r ec a l -c u l a t e d ,f r o mc u m u l a t i v ec o n c e n t r a t i o n - e f f e c tc u r v e s .T h ec o n -c e n t r a t i o n sp r o d u c i n g50 % i n h i b i t i o no f p h o s p h o d i e s t e r a s ea c t i v i t y( I C 5 0v a l u e s )w e r e d e t e r m i n e db y a n i t e r a t i v en o n -l i n e a rr e g r e s s i o nc u r v ef i t t i n gp r o g r a m m e .T h e s i g n i f i c a n c eo fd i f f e r e n c e sb e t w e e nm e a n sw a sd e t e r m i n e db y S t u d e n t ' st t e s t :a P v a l u eo fl e s st h a n0 . 0 5w a s t a k e na sb e i n gs i g n i f i c a n t .

R e s u l t s

P h a r m a c o l o g i c a ls t u d i e s

E f f e c t so n p a p i l l a r ym u s c l e sO r g 1 O 3 2 5i n d u c e dc o n c e n t r a t i o n( 1 . 5x 1 0 i m - 4 . 8x 1 0 3 M ) - r e l a t e dp o s i t i v e i n o t r o p i cr e s p o n s e s ,i n r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s( F i g u r e2 )t h a tw e r ef a s ti n o n s e t ( 3 0 - 6 0s )a n d t o o k 1 0 - 1 5m i nt o e s t a b l i s hp e a k .T h e s ee f f e c t sc o u l db e r e v e r s e db y w a s h i n g( c o n t r a c t i o n sr e t u r n i n gt o

c o n t r o ls i z ew i t h i n3 0m i n ) a n d w e r e r e a d i l yr e p e a t a b l e .T h emean E C 5 0v a l u ef o rO r g l O 3 2 5w a s 3 6 0 + 9 0 , u M( n= 6 )a n di t sm a x i m a lr e s p o n s ew a s g r e a t e r( 1 1 8+ 2 % )t h a n t h a tp r o -d u c e db y i s o p r e n a l i n e( = 1 0 0 % ) .O r g l O 3 2 5h a d p r o n o u n c e de f f e c t so n t h ep a p i l l a r ym u s c l ec o n t r a c t i o ns h a p e( F i g u r e2 b ) .I t p r o d u c e dp o s i t i v ek l i n o t r o p i cr e s p o n s e s( i . e .i n c r e a s e dt h er a t eo ft e n s i o nd e v e l o p m e n t ) ,a s m a l lr e d u c t i o ni n t h et i m e t op e a k o f c o n t r a c t i o na n d m a r k e d l ys l o w e dt h er a t e o f r e l a x -a t i o n ,w h i c hw a s t h em a i nc a u s e f o rt h eg r e a t e rt o t a lt w i t c hd u r a t i o n .T h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c to f O r g 1 0 3 2 5wa s n o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db y a - ( 1 . 3u Mp h e n t o l a m i n e )o r f I - ( 0 . 1 1 1 Mp r o p r a n o l o l )a d r e n o c e p t o rb l o c k a d eo r b y p r e t r e a t m e n t( 2 4 h )w i t h r e s e r p i n e( 5m gk g - i . p . )( d a t an o t s h o w n ) .T h i s i n d i c a t e st h a tt h ei n o t r o p i ce f f e c t so fO r g l O 3 2 5a r e u n l i k e l yt o b e m e d i -a t e db y r e l e a s eo fc a t e c h o l a m i n e so r a c t i v a t i o no f a d r e n o c e p -t o r s . A t a s u b t h r e s h o l di n o t r o p i cc o n c e n t r a t i o n( 7 4 p M ) ,O r g 1 O 3 2 5p o t e n t i a t e dt h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c t so f i s o -p r e n a l i n ei n r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s ,p r o d u c i n ga 1 0 - 1 4f o l dp a r a l l e ll e f t w a r ds h i f to f t h ei s o p r e n a l i n ec o n c e n t r a t i o n - e f f e c tc u r v e( F i g u r e3 ) .T h emean E C 5 0v a l u e sf o ri s o p r e n a l i n e ,f r o m4 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s ,i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o fO r g 1 0 3 2 5w e r e 1 4 2 + 2 2n m a n d 1 4 + 3 nM ( * *P < 0 . 0 1co m-p a r e d t o i s o p r e n a l i n ea l o n e E C 5 0v a l u e )r e s p e c t i v e l y.T h emaximum r e s p o n s e t o i s o p r e n a l i n ewas n o t a f f e c t e db yO r g l 0 3 2 5 .

E f f e c t so n r i g h ta t r i a O r g l O 3 2 5 p r o du c e dc o n c e n t r a t i o n -d e p e n d e n tp o s i t i v ec h r o n o t r o p i cr e s p o n s e si n r a b b i ts p o n t a -n e o u s l yb e a t i n gr i g h ta t r i aw i t h a n E C 5 0v a l u e( 4 7 5+ 1 7 O P M )w h i c hw a s s l i g h t l yg r e a t e rt h a n ,b u t n o t s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t

f r o m ,t h eE C 5 0v a l u ef o r i t s p o s i t i v ei n o t r o p i ca c t i o n .T h u sO r g l O 3 2 5w a s f o r c e - s e l e c t i v ew i t ha c h r o n o t r o p i c / i n o t r o p i cr a t i oo f 1 . 2 .T h e m a x i m a li n c r e a s ei n b e a t i n gf r e q u e n c ywas4 9b e a t sm i n -1 w h i c hr e p r e s e n t s45% o f t h em a x i m a lr e s p o n s ee v o k e db y i s o p r e n a l i n ei n r a b b i tr i g h ta t r i a .

2 . 0

1 . 5 t0 )

c0

a )H o 1 . 0 1

0 . 5 1

5 4 3- l o g [ O r g 1 0 3 2 5 1( M )

b

2

2 0 0 msI ( X ' n - 3 m l

~~9 [~~~~~~

F i g u r e2 ( a )C u m u l a t i v ec o n c e n t r a t i o n - e f f e c tc u r v e f o r t h ep o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c to fO r g 1 0 3 2 5i n e l e c t r i c a l l ys t i m u l a t e d( 0 . 4H z ) r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s .T h e m e a n( s . e .o fm e a n )b a s a la n d m a x i m a lt e n -s i o n sw e r e 3 0 0+ 8 8mg a n d 2 0 6 5 200mg r e s p e c t i v e l y .E a c hp o i n ti st h emean o f s i xd e t e r m i n a t i o n sa n d v e r t i c a ll i n e ss h o ws . e . m e a n .( b )E f f e c t so fO r g 1 0 3 2 5o n r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e( 0 . 4H z ) t w i t c hs h a p e .T h ep r e - d r u gc o n t r a c t i o n( C )i si n d i c a t e d .

E f f e c t so n a o r t i cs t r i p s I n t h e s ee x p e r i m e n t st h ee f f e c t so fi s o -b u t y l m e t h y l x a n t h i n e( I B M X ) a n d v e r a p a m i l w e r e a l s oa n a l y s e df o r c o m p a r a t i v ep u r p o s e s .T h e r e s u l t s a r es u m -m a r i z e d i n T a b l e 1 . O r g 1 0 3 2 5e l i c i t e da c o n c e n t r a t i o n -d e p e n d e n tr e l a x a n tr e s p o n s ei n a o r t i cs t r i p sp r e c o n t r a c t e dw i t h p h e n y l e p h r i n eo r K C 1 . T h e s e r e s p o n s e sw e r e s l o wi no n s e t ,t a k i n g2 0 - 3 0 m i nt o r e a c hp e a k e f f e c t ,a n d w e r e s u s -t a i n e dw h i l s tt h ed r u gw a s i n c o n t a c tw i t h t h et i s s u e s .N o r m a lr e s p o n s e st o t h es p a s m o g e n sc o u l db e r e - e s t a b l i s h e da f t e r3 0 -6 0 m i no f d r u g w a s h o u t .A g a i n s tp h e n y l e p h r i n e ,O r g 1 0 3 2 5w a s 1 0 - 2 0t i m e sl e s sp o t e n t t h a n I B M X .B o t ha g e n t s w e r ea tl e a s to n e o r d e ro f m a g n i t u d el e s sp o t e n t a t i n h i b i t i n gK C l -i n d u c e dc o n t r a c t u r e .I n d e e d a n E C 5 0v a l u ev e r s u sK + c o u l d

1 0 0

0

a )( 0

5 0C xE

o 0

_X;~~~~~~~~~~~I---s- I

*0 ~ ~ ~ *~-

-/

_, ; , /1

i ; . - ' * -*7 J L . . . . . ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~8 7

- l o g [ I s o p r e n a l i n e ]( m )

6 5

F i g u r e3 C u m u l a t i v ec o n c e n t r a t i o n - e f f e c tc u r v e s t o i s o p r e n a l i n ei nr a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s ( 0 . 4H z ) ,w h e n t e s t e di n t h e a b s e n c e( 0 0 ) a n d p r e s e n c e( A - - - - A ) o fa t h r e s h o l d ,n o n - i n o t r o p i c ,c o n c e n t r a t i o no fO r g 1 O 3 2 5( 7 4 p M ) .Ve r t i c a ll i n e ss h o ws . e . m e a n .

a P o o l

a A

I

3

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4/8

7 3 8 M . SHAHIDe t a l .

T a b e 1 R e l a x a n t e f f e c t so f O r g l O 3 2 5 ,i s o b u t y l m e t h y l -x a n t h i n e( I B M X )a n d v e r a p a m i lo n r a b b i ta o r t i cs t r i p sp r e -c o n t r a c t e dw i t hp h e n y l e p h r i n e( 1 0 p M )o r K C I( 6 0 m M )

E C 5 0( a M )KCl

O r g l O 3 2 5IBMXVe r a p a m i l

> 5 0 0 02 1 5+ 1 6

0 . 0 4 6 0 . 0 1 8

P h e n y l e p h r i n e

2 2 0+ 3 01 3 . 4+ 2 . 42 . 2 3+ 0 . 4 5

E a c hv a l u ei s t h em e a n+ s . e . m e a n o fa t l e a s tf o u rd i f f e r e n tp r e p a r a t i o n s .

n o t b e d e t e r m i ne df o rO r g 1 O 3 2 5a s i t o n l y p r o d u c e da 15 %r e l a x a t i o na t t h et o p c o n c e n t r a t i o nt e s t e d .H o w e v e r ,t h er a n ko r d e r o fp o t e n c yw a s t h es a m ea s t h a to b t a i n e dw i t h p h e n y l -e p h r i n e .Ve r a p a m i lw a s m a r k e d l ym o r ep o t e n t a t i n h i b i t i n gb o t h t h eKCl a n d p h e n y l e p h r i n er e s p o n s ew h e nc o m p a r e dt oO r g l O 3 2 5a n d IBMX. H o w e v e r ,i n c o n t r a s tt o t h e s el a t t e rc o m p o u n d sv e r a p a m i lw a s a p p r o x i m a t e l y5 0 t i m e sm o r ep o t e n t a t i n h i b i t i n gK C l r e s p o n s e s .T h u s O r g l O 3 2 5 h a daK C l / p h e n y l e p h r i n eE C 5 0r a t i oo f >2 3 a n d v e r a p a m i lh a d av a l u eo f0 . 0 2 .

B i o c h e m i c a ls t u d i e s

E f f e c t so n t i s s u ec y c l i cn u c l e o t i d el e v e l sO r g l O 3 2 5p o t e n t i a t e dt h ep o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c t so f i s o p r e n a l i n et h u s s u g g e s t i n gt h ei n v o l v e m e n to f c y c l i cAMP i n i t s m e c h a n i s mo f a c t i o n .T h i s p o s s i b i l i t yw a st e s t e di n a m o r ed i r e c tf a s h i o nb y e x a m i n -i n gt h ee f f e c t so f O r g 1 O 3 2 5o n c y c l i cn u c l e o t i d el e v e l si n i n t a c tc a r d i a ca n d v a s c u l a rt i s s u ep r e p a r a t i o n s .P a p i l l a r ym u s c l e so ra o r t i cs t r i p sw e r e t r e a t e dw i t h v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fO r g l O 3 2 5a n d f r e e z e - c l a m p e da t t h ep e a k o f r e s p o n s ea n dp r o c e s s e df o rc y c l i cn u c l e o t i d ea n a l y s i s .I t i s c l e a rf r o m t h ed a t a s h o w ni n T a b l e 2 t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n ti n c r e a s e si n p a p i l l a r ym u s c l ed e v e l o p e dt e n s i o np r o d u c e db yO r g 1 O 3 2 5w e r e a s s o c i a t e dw i t h s i g n i f i c a n ti n c r e a s e si n c y c l i c

AMP. T h e c o n c e n t r a t i o no f c y c l i cGMP w a s , h o w e v e r ,n o ts i g n i f i c a n t l ym o d i f i e db y O r g l 0 3 2 5 .

M u s c a r i n i ca g o n i s t s ,s u c ha s c a r b a c h o l ,i n h i b i tc y c l i cAMP-m e d i a t e dp o s i t i v ei n o t r o p y( W a t a n a b e& B e s c h ,1 9 7 5 ;E n d o h ,1 9 8 0 )a n d t h u sp r o v i d e a u s e f u lm e t h o df o r t e s t i n gt h ei n v o l v e m e n to f c y c l i cAMP i n t h e i n t r a c e l l u l a re f f e c t so fc a r d i a cs t i m u l a n t s .T h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c to f a n e a rm a x i m a lc o n c e n t r a t i o n o fO r g 1 0 3 2 5w a sp a r t i a l l yr e v e r s e db yc a r b a c h o l ( T a b l e3 ) , p r o du c in g am a x i m a ld e c r e a s eo f3 0 + 7 % . A n a l y s i so fc y c l i cn u c l e o t i d el e v e l si n t h ep a p i l l a r ym u s c l e s u s e di n t h e s ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h en e g a t i v ei n o t r o p i cr e s p o n s ep r o d u c e db y c a r b a c h o lw a sa s s o c i a t e dw i t ha 1 9 6 %i n c r e a s ei nc y c l i cGMP l e v e lb u t n o s i g n i f i c a n tc h a n g ei n c y c l i cAMP. B o t h t h ed e c r e a s ei n c o n t r a c t i l ef o r c ea n di n c r e a s ei n c y c l i cGMP c a u s e db y c a r b a c h o lw e r eb l o c k e db ya t r o p i n e ,c o n f i r m i n gt h a t t h e s ee f f e c t so fc a r b a c h o la r em e d i -a t e d b y m u s c a r i n i cr e c e p t o rs t i m u l a t i o n .T h e l a r g ei n c r e a s ei nr e l a x a t i o nt i m e p r o d u c e db y O r g 1 0 3 2 5w a s n o t s i g n i f i c a n t l ym o d i f i e db y c a r b a c h o l .I n t h ea b s e n c eo fO r g l O 3 2 5 ,c a r b a c h o lh a d n o e f f e c to n d e v e l o p e dt e n s i o nb u t s t i l lp r o d u c e da ni n c r e a s ei n c y c l i cGMP. T h el a t t e re f f e c tw a sb l o c k e db y a t r o -p i n e ( T a b l e3 ) .I n c o n t r a s tt o c a r b a c h o l ,s o d i u mn i t r o p r u s s i d ep r o d u c e da r e l a t i v e l ys m a l l( 1 8 % )a n d n o t s i g n i f i c a n t ,i n h i b i -t i o no fO r g l O 3 2 5 - i n d u c e dp o s i t i v ei n o t r o p yd e s p i t ep r o d u c i n ga t e nf o l di n c r e a s ei n c y c l i cGMP l e v e l( T a b l e3 ) .T h e r ew a ss i g n i f i c a n tv a r i a t i o ni n t h e a b s o l u t ed e v e l o p e dt e n s i o np r o d u c -e d b y O r g l O 3 2 5a l o n e i n t h i ss e to fe x p e r i m e n t s .T h e p r e c i s er e a s o n sf o rt h i sa r en o t c l e a rb u t i t i sl i k e l yt o b e d u e t od i f f e r -e n c e si n t h er e s p o n s i v e n e s so fd i f f e r e n tp a p i l l a ry m u s c l e s .

T h e v a s o r e l a x a t i o np r o d u c e db y O r g l 0 3 2 5 w a sa l s oa s s o c i -a t e dw i t h a n e l e v a t i o ni n c y c l i cAMP c o n t e n t .I n a c o n c e n t r a -t i o n r a n g e s i m i l a r t ot h a t u s e d i n p a p i l l a r ym u s c l ee x p e r i m e n t s ,O r g l O 3 2 5 - i n d u c e dr e l a x a n tr e s p o n s e sw e r ep a r a l l e l e db y i n c r e a s e si n c y c l i cAMP ( F i g u r e4 a ) .H o w e v e r ,s i g n i f i c a n tc h a n g e si n c y c l i cAMP w e r eo b s e r v e do n l ya t c o n -c e n t r a t i o n sp r o d u c i n g75 % a n d 1 0 0 %r e l a x a t i o n s .A s i m i l a rp i c t u r ew a so b t a in ed w it hIBMX ( F i g u r e4 b )w i t h i n c r e a s e si nc y c l i cAMP a t 5 0 % ,75 % a n d 1 0 0 %r e l a x a t i o n sb e i n gs i g n i f i -c a n t l yd i f f e r e n tf r o mc o n t r o l .

T a b l e2 E f f e c t so fO r g 1 O 3 2 5o n t e n s i o nr e s p o n s e sa n d c y c l i cn u c l e o t i d el e v e l si n r a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e s

C y c l i cAMP C y c l i cGMPC o n c .( u M ) Te n s i o n( m g ) ( p m o lm g - 't i s s u e )

C o n t r o l Ve h i c l e 5 3 7+ 6 4 0 . 6 0+ 0 . 0 6 0 . 0 2 1 0 . 0 0 2O r g l O 3 2 5 9 3 5 8 5+ 9 4 1 . 0 2+ 0 . 0 5 * * 0 . 0 2 0+ 0 . 0 0 3

3 7 0 8 1 1 + 1 1 9 * * 1 . 2 6+ 0 . 0 5 * * 0 . 0 3 3 0 . 0 0 61 9 0 0 1 6 3 8+ 1 6 5 * * 1 . 4 6+ 0 . 0 6 * * 0 . 0 2 5+ 0 . 0 0 3

E a c hv a l u ei s t h emean s . e . m e a n ,n = 3 - 6 .* * P < 0 . 0 1c o m p a r e dt o a p p r o p r i a t ec o n t r o lv a l u e ,S t u d e n t ' st t e s t .

T a b l e 3 E f f e c t so fc a r b a c h o la n d s o d i u mn i t r o p r u s s i d eon t h e c a r d i a ce f f e c t so fO r g 1 0 3 2 5

T e n s i o n( m g )C o n t r o l D r u gr e a t m e n t

R e l a x a t i o nt i m e ( m s )C o n t r o l D r u g

C y c l i cAMP C y c l i cGMP( p m o lmg - t i s s u e )

C o n t r o l( p r o p r a n o l o l ,0 . 1p M )

C a r b a c h o l( 2 2 u M )C a r b a c h o li n t h e

p r e s e n c eo fa t r o p i n e( 1u M )O r g 1 0 3 2 5( 1 9 0 0 p M )O r g l O 3 2 5( 1 9 0 0 p M )

+ c a r b a c h o l( 2 2p M )O r g l O 3 2 5( 1 9 0 0 . u M )

+ c a r b a c h o li n t h ep r e s e n c eo fa t r o p i n e( 1 M )

O r g l O 3 2 5( 1 9 0 0 . u M )+ s o d i u mn i t r o p r u s s i d e( 1m M )

0 . 7 6 0 . 0 8 0 . 0 2 5 0 . 0 0 7

413+78 50679467+37 428+38

3 3 2+ 5 8 1 6 3 8+ 1 6 5 * * *1 6 3 5+ 1 6 5 1 1 4 5+ 1 0 8 *

1 0 8 3 1 1 5 1 1 8 6+ 1 8 5

1 8 8 8 1 9 3 8 0 . 6 3 0 . 0 4 0 . 0 5 8 0 . 0 1 3 * *177+7 178+8 0 . 9 3+ 0 . 1 6 0 . 0 2 2 + 0 . 0 1 0

1 5 4+ 7 2 5 9+ 2 0 * * 1 . 4 6 0 . 0 6 * * 0 . 0 2 5 0 . 0 0 32 6 0 1 9 2 8 4+ 1 8 1 . 3 0+ 0 . 0 7 * * 0 . 0 7 4+ 0 . 0 1 1 * *

2 6 9 2 0 2 5 4 1 7

2 1 8 3+ 3 5 3 1 7 9 2+ 2 5 4 2 8 7+ 2 3 2 7 1 1 6

1 . 1 7 0 . 1 3 * 0 . 0 2 8+ 0 . 0 0 6

1 . 2 3 0 . 3 0 0 . 2 0 3 0 . 0 0 9 * * *

C y c l i cn u c l e o t i d el e v e l sr e l a t et o t e n s i o n v a l u e sg i v e ni n ' D r u g 'c o l u m n .T h e ' D r u g 'c o l u m n ss h o wt h et i s s u ' er e s p o n s e sb e f o r ef r e e z ec l a m p i n gi n l i qu i d n i t ro g e n .T h e ' C o n t r o l 'c o l u m n ss h o wt i s s u er e s p o n s e sj u s tp r i o rt o a d d i t i o no ft h el a s td r u gi ne a c ht r e a t m e n tr e g i m e .D a t as h o w na r e m e a n s+ s . e . m e a n( n= 4 - 6 ) .* P < 0 . 0 5 ;** P < 0 . 0 1 ;** * P < 0 . 0 0 1c o m p a r e dt o a p p r o p r i a t ec o n t r o lv a l u e ,S t u d e n t ' st t e s t .

8/14/2019 Br. J. Pharmacol. (1990), 100, 735-742

5/8

O r g 1 O 3 2 5 :A NEW CA RD I O TO N I CAGENT 7 3 9

,&,, .1 0

6 5 4 3

- l o g [ I B MX ]( M )

' a

: 2. 4 0 i

C u . ~

a )

0 . 2 0 ' _ 0

= D` c

0 . 1 0 >'U a0 E

- a

F i g u r e4 E f f e c t so f O r g 1 0 3 2 5( a ) a n d i s o b u t y l m e t h y l x a n t h i n e( I B M X ,b ) on r e l a x a t i o n( 4 , c y c l i cAMP l e v e l s( A ) a n d c y c l i cGMPl e v e l s( X ) i n r a bb i t a o r t i cs t r i p sp r e - c o n t r a c t e dw i t h p h e n y l e p h r i n e( 1 0 p M ) .e a c hp o i n t r e p r e s e n t st h emean v a l u ef r o m6 e x p e r i m e n t s .T h ev e r t i c a la n d h o r i z o n t a lb a r s s h o ws.e.mean. I n some cases s . e .me a n i ss m a l l e rt h a n t h es i z eo f t h es y m b o l .C o n t r o lc y c l i cAMP a n d c y c l i cGMP l e v e l sar e g i v e nn ear t h eo r d i n a t es c a l e .

E f f e c t so n c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s ei s o e n z y m e s Onep o s s i b l em e c h a n i s mf o rr a i s i n gc e l l u l a rc y c l i cAMP c o n c e n t r a -t i o ni s b y i n h i b i t i o no f c y c l i cn u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e( P D E ) a c t i v i t y .T h e s e e n z y m e s e x i s ti n m u l t i p l e m o l e c u l a rf o r m s w h i c hd i f f e rn o t o n l y i n t h e i rk i n e t i ca n d r e g u l a t o r yp r o p e r t i e s ,b u t a l s oi n t h e i r s e n s i t iv i t yt o a v a r i e t yo f i n h i b i -t o r y c o m p o u n d s( s e eB e a v o ,1 9 8 8 f o r r e v i e w ) .T h u s i t wasi m p o r t a n tt o e x a m i n et h e e f f e c t so f O r g 1 0 3 2 5on s e p a r a t e dPDE i s o e n z y m e s .R a b b i t v e n t r i c u l a rPDEs w e r e r e s o l v e db yi o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n d t h e t y p i c a le l u t i o np r o f i l eo f a c t i v i t i e si s s h o w ni n F i g u r e 5 . F o u r m a i np e a k s o f PDEa c t i v i t ywer e o b s e r v e dw h i c hh a v e b e e nl a b e l l e dPDE I , I I ,I I Ia n d I V a c c o r d i n gt o n o m e n c l a t u r e u s e db y R e e v e se t a l .( 1 9 8 7 )f o rhuman c a r d i a cv e n t r i c l e .T h e r e g u l a t o r yc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s e PDE i s o e n z y m e swere: PDE I wa s s t i m u l a t e db y C a /c a l m o d u l i n ;c y c l i cGMP s t i m u l a t e dc y c l i cAMP a c t i v i t yo fPDE I I ; c y c l i cGMP i n h i b i t e dc y c l i cAMP h y d r o l y s i sb yPDE I I I ; PDE I V was u n a f f e c t e db y C a / c a l m o d u l i no r c y c l i cGMP a n d p r e s e n t l yh a s no known r e g u l a t o r .F u r t h e r m o r e ,PDE II a c t i v i t ywas a l s os t i m u l a t e db y C a / c a l m o d u l i n( F i g u r e5 ) i n d i c a t i n gt h e p re se n c e o f more t h a n o n e C a / c a l m o d u l i na c t i v a t e d PDE i n r a b b i t c a r d i a cv e n t r i c l e .A l t h o u g hPDE I I( f r a c t i o n2 0 )a n d PDE IV ( f r a c t i o n s2 2 a n d 2 3 )e l u t ec l o s et oe a c h o t h e r t h e y c an b e c l e a r l yd i s t i n g u i s h e db y t h e i rr e g u l a -t o r y a n d k i n e t i cp r o p e r t i e sa n d s e n s i t i v i t yt o a v a r i e t yo f s e l e c -t i v ePDE i n h i b i t o r s( S h a h i d ,u n p u b l i s h e dr e s u l t s ) .I t i s c l e a rf r o m t h er e s u l t ss h o w ni n F i g u r e 6 t h a t O r g 1 O 3 2 5p r o d u c e dc o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n ti n h i b i t i o no f c y c l i cAMP PDE a c t i v -i t y .H o w e v e r ,t h e compound s h o w e d3 - 4 f o l ds e l e c t i v i t yf o ri n h i b i t i n gPDEs I I I a n d IV i n an a l m o s te q u i p o t e n tf a s h i o n .I n c o n t r a s t , t h e r e was o n l y w e a k i n h i b i t i o n o f PDE I a n dPDE I I a c t i v i t y .

E f f e c t so n p h o s p h o r y l a s ea , c y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea n d c o n t r a c t i l ep r o t e i np h o s p h o r y l a t i o nAn i n c r e a s e i nc y t o s o l i cc y c l i cAMP causes a c t i v a t i o n o f c y c l i cAMP-d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e w h i c ht h e n p h o s p h o r y l a t e sa v a r i e t yo f p r o t e i n s u b s t r a t e s( e . g .p h o s p h o r y l a s e ,c o n t r a c t i l e p r o t e i n s )i n v o l v e d i n r e g u l a t i n gc o n t r a c t i l ef u n c t i o n ( f o rr e v i e w s se eO p i e , 1 9 8 2 ;E v a n s , 1 9 8 6 ) .I n v i e w o f t h e PDE i n h i b i t o r ye f f e c t so f , a n d t h e r i s e i n t i s s u ec y c l i cAMP p r o d u c e db y ,O r g l 0 3 2 5t h e e f f e c t so f t h i scompound on c a r d i a cp h o s p h o r y l -as e a , c y c l i cA M P - P r K a c t i v i t yan d c o n t r a c t i l e p r o t e i n p h o s -p h o r y l a t i o n w e r e a n a l y s e d .T h e r a t h e a r t L a n g e n d o r f fp r e p a r a t i o nwas u s e d t o e na b l e d e t e r m i n a t i o no f a l l t h r e ep a r a m e t e r si n e a c h t i s s u e .A s i n g l e ,near maximal c o n c e n t r a -

t i o n ( 1 9 0 0 , M m )o f

O r g l 0 3 2 5was t e s t e d an d

c o m p a r e dw i t h

a p p r o x i m a t e l ye q u i - e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n so f IBMX ( 4 5 0p M )a n d i s o p r e n a l i n e( 0 . 1 j U M ) .T h e b i o c h e m i c a lr e s p o n s e s w e r em e a s u r e da t t h e p e a k o f t h e c o n t r a c t i l e r e s p o n s e w h i c ho c c u r r e da f t e r1 2 0 ,6 0 a n d 3 0 s p e r f u s i o n w i t h O r g 1 O 3 2 5 ,

1 0 0 0-

E

- CE

C )a )

C' )

a )

e nT 00

0.

C)

0.

CL

0

0

8 0 0-

6 0 0-

4 0 0-

2 0 0-

0

0

aII N. I

I 'I

I~

I I! I ~I II II I I

I II * I

] i f

0 4 8 1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2

F i g u r e5 E l u t i o n p r o f i l eo f c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s e( P D E )a c t i v i t i e si n r a b b i tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u ma f t e ri o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y( s e eM e t h o d sf o rd e t a i l s ) .F o u r m a i np e a k so f a c t i v -i t i e s( l a b e l l e dI , I I ,I I I a n d I V ) w e r e o b s e r v e d .E f f e c t so f C a 2 "( 2 0 g M )a n d c a l m o d u l i n( 1 . 5 p g m l P) ( b r o k e nl i n e s )on c y c l i cAMP ( a ) a n dc y c l i cGMP ( b )h y d r o l y s i sa t 1j u Ms u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nar e s h o w n .

IBMX a n d i s o p r e n a l i n e ,r e s p e c t i v e l y .O r g l O 3 2 5p r o d u c e das i g n i f i c a n ti n c r e a s ei n c y c l i cAMP-PrK a c t i v i t yr a t i o ( c o n t r o l :0 . 1 3+ 0 . 0 1 ;O r g l 0 3 2 5 :0 . 3 7+ 0 . 0 4 * * ,**P < 0 . 0 1 ,n = )w h i c h was s i m i l a rt o t h e r e s pons e o b t a i ne d w i t hIBMX( 0 . 3 5+ 0 . 0 4 * * )b u t much s m a l l e rt h a n t h e m a x i m a li n c r e a s ee l i c i t e db y i s o p r e n a l i n e( 0 . 7 4+ 0 . 0 3 * * ) .A l l t h r e ec o m p o u n d s ,

c

0

.0

C

. _ O

PDE I I I

PDE I V

PD E II

PD E I

6 5

- l o g [ O r g 1 0 3 2 5 ]( M )4 3 . 4

F i g u r e6 I n h i b i t o r ye f f e c t so f O r g 1 O 3 2 5on c y c l i cAMP ( 1p M )h y d r o -l y s i sb y r a b b i t c a r d i a cv e n t r i c l ep h o s p h o d i e s t e r a s e( P D E )i s o e n z y m e s .The e f f e c t son P DE I a n d PDE I I w e r e e x a m i n e di n t h e p r e s e n c eo ft h e s t im u l a to r sC a 2 l ( 2 0 O M ) / c a l m o d u l i n( 1 . 5p g m l 1 ) an d c y c l i cGMP ( 1 p M ) ,r e s p e c t i v e l y .T he mean I C 5 0v a l u e s+ s.e.mean ( n= 4 - 6 )were : PDE I > 2 5 0 p U M( 1 9 % ) ; PDE I I > 2 5 0 , u M( 3 9 % ) ; PDE I I I ,6 5 + 1 2 p M ;PDE I V ,7 1 1 9 # M ;v a l u e s i n p a r e n t h e s e si n d i c a t e %i n h i b i t i o na t 2 5 0 p i M .

10 0

0

x

X 5 0

0

a

5 4 3 2

a _1

- l o g [ O r g ' 1 0 3 2 5 ]( M )

b

1 0 0 -0 . 4 0

0 . 3 0

5 0 -0 . 2 0

0 . 1 0

I 0 01

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7 4 0 M . SH A H I D e t a l .

a

1 . 7 0

1 . 3 0

0 . 9 0

0 . 5 0

1 . 6 0

1 . 2 0

0 . 8 0

0 . 4 0

1 5-T n - I P h o s p h o l i p i d

O r g

I s o

0 .

7 1 0 -0-E

Ec

0 )

4- 5 -0 LQ

+

C o n2 5 4 5 6 5 8 5 1 0 5

b

0 I0

0 2 0 4 0 6 0 8 0D i s t a n c e(mm)

1 0 0 1 2 0

F i g u r e7 D e n s i t o m e t e rt r a c e so fa u t o r a d i o g r a p h so fp o l y a c r y l a m i d eg e l so f w h o l eh e a r tp r o t e i n sa f t e rp e r f u s i o nw i t h r a d i o a c t i v ep h o s -p h a t e .H e a r t s w e r e p e r f u s e db y r e c y c l i n gw i t h [ 3 2 P ] - P if o l l o w e db yp e r f u s i o nw i t h :C o n , c o n t r o lm e d i u m ;O r g .O r g l 0 3 2 5( 1 9 0 0 , M )f o r1 2 0s ; I s o ,i s o p r e n a l i n e( 0 . 1 Ip M )f o r3 0 s .( a )a n d ( b )r e p r e s e n t5 % a n d1 2 . 5 %p o l y a c r y l a m i d eg e l sr e s p e c t i v e l y .T h e p o s i t i o n so f t h ek n o w np h o s p h o r y l a t e dc a r d i a cp r o t e i n sa r e i n d i c a t e d :T n - I ,t r o p o n i n - I ;P - L C ,m y o s i nP - l i g h tc h a i n .N o t et h a tt h et r a c e sf o ri s o p r e n a l i n ea n dO r g l O 3 2 5h a v e b ee nm o v e da p p r o x i m a t e l y0 . 4a n d 0 . 8a b s o r b a n c eu n i tu p w a r d sr e s p e c t i v e l yt o i m p r o v ec l a r i t y .

A

0 '

vO~

/ o f o 0 s f

I .

5

A

/ e 0

/ */ e

4 f

1

1 0T i m e( m i n )

F i g u r e8 E f f e c t so f O r g 1 O 3 2 5o n t h e t i m e c o u r s e o f o x a l a t e -a n dAT P - d e p e n d e n tC a 2 +u p t a k eb y s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mv e s i c l e sp r e -p a r e d f r o m r a b b i tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m .T h e s y m b o l sr e p r e s e n t :c o n t r o l( - ) , p l u s1 6 6 0 p u MO r g 1 O 3 2 5( A ) ,a n d C a 2 " - u p t a k ei n t h ea b s e n c eo fo x a l a t e( - ) .

c a r d i a c a c t i o no fO r g 1 O 3 2 5f u r t h e r ,i t se f f e c t so n s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mC a 2 +u p t a k ew e r ea l s os t u d i e d .R a b b i tc a r d i a cv e n -t r i c u l a rs a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mv e s i c l e sa c c u m u l a t e dC a 2 " ,i na t i m e - d e p e n d e n tm a n n e r ,o n l yi n t h ep r e s e n c eo fAT P a n do x a l a t e .T h e s t o r e dC a 2 + c o u l d b e r e l e a s e dr a p i d l yb y t h eC a 2 +i o n o p h o r eA 2 3 1 8 7( 3p g g m l - ' )c o m p l e t e l yw i t h i nm i n( d a t an o t s h o w n ) .O r g l O 3 2 5( 1 6 6 0 U M )d i dn o t s i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h et i m e c o u r s eo f C a 2 + - u p t a k e b ys a r c o p l a s m i cr e t i -c u l u mv e s i c l e s( F i g u r e8 ) .

D i s c u s s i o n

a t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n sa l s oi n c r e a s e dp h o s p h o r y l a s eaa c t i v i t y,w i t h i s o p r e n a l i n ea g a i ns h o w i n gt h e l a r g e s te f f e c t( c o n t r o l :6 . 7+ 1 . 5 % ; O r g l O 3 2 5 : 5 3 . 5+ 5 % * * ; IBMX:4 8 + 5 * * ;i s o p r e n a l i n e :7 2 + 3 % * * ;**P < 0 . 0 1 ,n = 4 ) .T h ei n c r e a s e si n p h o s p h o r y l a s ea a n d c y c l i cAMP-PrK a c t i v i t i e sw e r e p a r a l l e l e db y a c o r r e s p o n d i n gr i s e i nt h e p h o s -p h o r y l a t i o no f c o n t r a c t i l e p r o t e i n s .I t i s c l e a rf r o mt h ed e n s i -t o m e t e rt r a c e s ,o fp o l y a c r y l a m i d eg e l s ,s h o w ni n F i g u r e7 t h a tO r g l O 3 2 5 p r o d u c e dl a r g ei n c r e a s e si n t h ep h o s p h o r y l a t i o no ft r o p o n i n - Ia n d C - p r o t e i n .B o t hIBMX a n d O r g l 0 3 2 5p r o d u c -e d s i m i l a re f f e c t s ,a l t h o u g ht h em a g n i t u d eo ft h er e s p o n s ew a sg r e a t e rw i t h O r g l O 3 2 5( T a b l e4 ) .

E f f e c t so n s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mC a 2+ u p t a k eT h e i n c r e a s ei n p a p i l l a r ym u s c l er e l a x a t i o nt i m e c a u s e db y O r g l O 3 2 5i sa t y p i c a lo fa g e n t s w h i c ha c t t h r o u g ha c y c l i cA M P - d e p e n d e n tm e c h a n i s ma n d i s u s u a l l yi n d i c a t i v eo fa n e f f e c ton o r g a n e l l e s( e . g .s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m )i n v o l v e di n c o n t r o l l i n gc y t o s o l i cC a 2+ c o n c e n t r a t i o n .I n o r d e r t o a n a l y s et h i sa s p e c to f t h e

I n i s o l a t e dc a r d i a cp r e p a r a t i o n s ,O r g l O 3 2 5w a s m o r ep o t e n ta t i n c r e a s i n gc o n t r a c t i l ef o r c et h a n p r o d u c i n gp o s i t i v ec h r o n o -t r o p y .O r g l O 3 2 5h a d a f o r c e / r a t eE C 5 0r a t i oo f 1 . 2 ,w h i c hi s2 2 t i m e sg r e a t e rt h a n t h ev a l u e sf o u n df o ri s o p r e n a l i n e ,a m r i n -o n e a n d IBMX i n r a b b i tc a r d i a cp r e p a r a t i o n s( S h a h i d&R o d g e r ,1 9 8 9 ) .F u r t h e r m o r e ,w h i l s tt h em a x i m a lp o s i t i v ei n o -t r o p i ce f f e c to fO r g l O 3 2 5w a s s l i g h t l yg r e a t e rt h a n i s o p r e n a -l i n e ,t h el a r g e s ti n c r e a s ei n r i g h ta t r i a lb e a t i n gf r e q u e n c yw a so n l y4 5% o ft h ei s o p r e n a l i n em a x i m u m .T h ep h a r m a c o l o g i c a lp r o f i l eo fO r g l O 3 2 5i n i s o l a t e dc a r d i a ct i s s u e si s s i m i l a rt o newc a r d i o t o n i c ss u c h a s p i m o b e n d a n ,s u l m a z o l e( S m i t he t a l . ,1 9 8 7 )a n d s a t e r i n o n e( A r m a he t a l . ,1 9 8 8 )b u t s u b s t a n t i a l l yd i f -f e r e n tf r o m o t h e ra g e n t s s u c h a s m i l r i n o n ea n d p i r o x i m o n e( S m i t he t a l . ,1 9 8 7 ) ,a l l o f w h i c ha l s oa c t t h r o u g ha c y c l i cA M P - d e p e n d e n tm e c h a n i s m .T h e l a t t e rc o m p o u n d sa n dIBMX h a v ef o r c e / r a t es e l e c t i v i t yr a t i o ss i m i l a rt o i s o p r e n a l i n e .T h e ' f o r c es e l e c t i v e 'a c t i o no fO r g 1 0 3 2 5i n v i t r ow a sp a r a l l e l e di n a n a e s t h e t i z e dd o g e x p e r i m e n t sw h e r e l a r g ei n c r e a s e si nc a r d i a cc o n t r a c t i l i t yw e r e a s s o c i a t e dw i t h o n l ya m i n o r a n d

T a b l e4 C o n t r a c t i l ep r o t e i np h o s p h o r y l a t i o ni n r a tp e r f u s e dh e a r t s

T r e a t m e n t

C o n t r o lO r g l O 3 2 5( 1 9 0 0 p u M )IBMX

( 4 5 0 p M )

T r o p o n i n - I C - p r o t e i n M y o s i nP -( m o lP 0 4mo'1 p r o t e i n ) l i g h tc h a i n

0 . 2 0 0 . 0 31 . 4 3+ 0 . 1 4 * *0 . 9 2+ 0 . 0 2 * *

0 . 5 4+ 0 . 0 54 . 5 4+ 0 . 2 3 * *4 . 0 8+ 0 . 3 9 * *

0 . 5 0+ 0 . 0 20 . 3 5+ 0 . 0 30 . 4 1+ 0 . 0 6

D a t as h o w na r e means + s . e . m e a n( n= 4 ) .* * P < 0 . 0 1c o m p a r e dt o a p p r o p r i a t ec o n t r o lv a l u e ,S t u d e n t ' st t e s t .

I -I F - - - - -

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O r g 1 O 3 2 5 :A NEW CARDIOTONI C AGENT 7 4 1

t r a n s i e n tt a c h yc a r di a ( Ma r s h a l le t a l . ,1 9 8 8 ) .I t i s d i f f i c u l tt of o r ma p r o p e rc o m p a r i s o no f t h ei n v i t r oi n o t r o p i cp o t e n c yo fO r g l O 3 2 5w i t h o t h e rn e w c a r d i o t o n i c ss i n c et h e r ei s m a r k e dv a r i a t i o ni n t h em e t h o d su s e d f o r c a l c u l a t i n gE C 5 0v a l u e s .A d d i t i o n a l l yt h e r ea p p e a r t o b e s p e c i e s - r e l a t e dd i f f e r e n c e si nt h es e n s i t i v i t yt o t h e s e d r u g s .F o r e x a m p l e ,m i l r i n o n eh a s b e e ns h o w nt o b e i n a c t i v ei n r a t ( F r a n g a k i se t a l . ,1 9 8 9 ) ,w e a k l ya c t i v e i ng u i n e a - p i g( B e t h k ee t a l . , 1 9 8 8 )a n d s u b s t a n t i a l l ym o r ep o t e n t i n d o g ( E n do he t a l . ,1 9 8 6 )v e n t r i c u l a rm y o c a r d -i u m . U n d e r o u r e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ,m i l r i n o n eh a d a nE C 5 0v a l u eo f5 1 8 p Mf o rr a b b i tp a p i l l a r ym u s c l e sw h i c hi s i nc l o s ea g r e e m e n tw i t h t h e v a l u e o b t a i n e d b y B e t h kee t a l .( 1 9 8 8 )f o rg u i n e a - p i gp a p i l l a r ym u s c l e s .T h u s , O r g l 0 3 2 5w a sm o r ep o te nt t h a nm i l r i n o n ea t i n c r e a s i n gc o n t r a c t i l ef o r c e .I nc o n t r a s t ,m i l r i no ne h a sa s i g n i f i c a n t l yl o w e rE C 5 0( 3 4 , U M )f o rc h r o n o t r o p yi n r a b b i tr i g h ta t r i a( S h a h i de t a l . ,1 9 8 9 ) .

O r g l 0 3 2 5w a s m a r g i n a l l ym o r e p o t e n t i n i t s a c t i o n so na o r t i cs t r i p st h a n o n c a r d i a ct i s s u e s .T h eE C 5 0v a l u e ,h o w e v e r ,i s s t i l ls u b s t a n t i a l l yh i g h e r w h e n c o m p a r e dt o o t h e r PDEi n h i b i t o r ss u c h a s m i l r i n o n e( S i l v e re t a l . , 1 9 8 8 ) .T h i s mayp a r t l yb e r e l a t e d t ot h eh i gh c o nc e n tr a t i o no f p h e n y l e p h r i n eu s e d i n t h i ss t u d y s i n c ei t h a s b e e n s h o w nt h a t t h ed e g r e e o fv a s o c o n s t r i c t i o nm a r k e d l yi n f l u e nc e s t h ep o t e n c yo fa v a r i e t yo f v a so r e l a x a n t s u bs t a n c e s( O ' D o n n e l l& Wa n s t a l l , 1 9 8 7 ) .F u r t h e r m o r e ,m i l r i no ne h a sb e e ns h o w nt o e l e v a t eb o t h c y c l i cAMP a n d c y c l i cGMP i n a o r t i ct i s s u e ( S i l v e re t a l . ,1 9 8 8 )a n ds i n c eb o t h n u c l e o t i d e sc a u s e v a s c u l a rr e l a x a t i o na m o r ep o t e n t e f f e c tc o u l d b e a c h i e v e d .T h e d i f f e r e n t i a le f f e c t so fO r g l O 3 2 5a n d IBMX o n p h e n y l e p h r i n e -a n d K C l - i n d u c e dc o n t r a c t u r e sa r e c o n s i s t e n tw i t h t h e i d e ao f t h e s ea g e n t sh a v i n g a n i n t r a c e l l u l a rs i t eo f a c t i o n .W i n s l o we t a l . ( 1 9 8 6 )h a v e s h o wn ,u s i n g a s p e c t r u mo fd r u g s ,t h a tc o m p o u n d s ,s u c ha s C a 2+ c h a n n e la n t a g o n i s t s( e . g .v e r a p a m i l ) ,w h i c ha c ta t t h ep l a s m am e m b r a n e ,h a v e al o w K C l / p h e n y l e p h r i n eE C 5 0r a t i ow h e r e a si n t r a c e l l u l a r l yC a 2" - m o d i f y i n gd r u g s ,l i k ec a l m o d u l i ni n h i b i t o r s ,h a v e a r a t i oc l o s et o 1 . C l e a r l yIBMX a n dO r g 1 0 3 2 5p r o d u c e dr a t i o smuch g r e a t e rt h a n 1 a n d a r eu n l i k e l yt o m o d i f yC a 2+ f l u xd i r e c t l y .

P o t e n t i a t i o no f

i s o p r e n a l i n e - i n d u c e dp o s i t i v e

i n o t r o p yb yO r g 1 O 3 2 5s u g g e s t st h a tc y c l i cAMP g e n e r a t i o ni s i n v o l v e di n

i t sm e c h a n i s mo fa c t i o n .T h i s w a s c o n f i r m e db y t h ei n c r e a s ei nc y c l i cAMP o b s e r v e d i n b o t h c a r d i a ca n d a o r t i ct i s s u e st r e a t e dw i t h O r g l O 3 2 5 .F u r t h e r m o r e ,t h e p o s i t i v ei n o t r o p i ce f f e c t so f O r g 1 0 3 2 5w e r e i n h i b i t e db y c a r b a c h o l .T h e l a t t e rt e s ti s c o m m o n l ye m p l o y e dt o d e t e c tt h ei n v o l v e m e n to fc y c l i cAMP ( W a t a n a b e& B e s c h , 1 9 7 5 ;E n d o h , 1 9 8 0 ) .M u s c a r i n i ca g o n i s t sc a n i n h i b i tc y c l i cAMP- d e p e n d e n tr e s p o n s e se i t h e rb y l o w e r i n gc y c l i cAMP ( e . g .i n h i b i t i o no f a d e n y l a t ec y c l a s e ,s t i m u l a t i o no fPDE I I ) o r b y p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o nt h r o u g ha c t i v a t i o no f c y c l i cG M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e .F o rO r g l 0 3 2 5 ,t h e l a t t e rp o s s i b i l i t ys e e m sm o r e l i k e l ys i n c e t h ec y c l i cAMP r e s p o n s ew a s n o t s i g n i f i c a n t l ym o d i f i e db y c a r -b a c h o l .M o r e o v e r ,i t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t i t i s t h e

m u s c a r i n i cr e c e p t o r - m e d i a t e di n c r e a s ei n c y c l i cGMP w h i c hi sc a p a b l eo f a n t a g o n i s i n gt h ee f f e c t so f c y c l i cAMP, s i n c et h emuch l a r g e re l e v a t i o no f c y c l i cGMP p r o d u c e db y s o d i u mn i t r o p r u s s i d e( p r e s u m a b l yd u e t o d i r e c ts t i m u l a t i o no f g u a -n y l a t ec y c l a s e )h a d o n l y a m i n o re f f e c to n t h ep o s i t i v ei n o t r o -p i ce f f e c to r c y c l i cAMP g e n e r a t i o np r o d u c e db y 0 r g 1 0 3 2 5 .T h e l a t t e ro b s e r v a t i o ns u g g e s t st h a te i t h e rc y c l i cGMP i si r r e l e v a n tt o t h ee f f e c t so fc a r b a c h o lo r t h a tt h e r ea r ed i s t i n c tf u n c t i o n a l' p o o l s 'o fc y c l i cGMP i n v o l v e di n m e d i a t i n gd i f f e r -e n tc e l l u l a rr e s p o n s e s .I n d e e dt h e r ei s c o n s i d e r a b l ee v i d e n c ei nt h el i t e r a t u r et o s u p p o r tt h en o t i o n o f c o m p a r t m e n t a t i o no fc y c l i cn u c l e o t i d e si n c a r d i a cm u s c l e( E n g l a n d& S h a h i d ,1 9 8 7 ) .I n v i e w o f t h i s i n t r a c e l l u l a rc o m p l e x i t yi t i s i m p o r t a n t t oe s t a b l i s ht h a ta g e n t sw h i c he l e v a t ec y c l i cAMP a l s oa c t i v a t ec y c l i cAMP-PrK a n d s t i m u l a t e p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n .I n

r a t p e r f u s e dh e a r t s ,b o t h O r g 1 O 3 2 5a n d IBMX i n c r e a s e dc y c l i cAMP-PrK a c t i v i t yr a t i o ,p h o s p h o r y l a s ea a c t i v i t ya n dp h o s p h o r y l a t i o no ft r o p o n i n - Ia n d C - p r o t e i n .T h i s i s i n a g r e e -m e n t w i t h t h e e f f e c t sf o u n d f o r i s o p r e n a l i n eb y E n g l a n d&S h a h i d( 1 9 8 7 )a n d K r a n i a s e t a l . ( 1 9 8 5 )f o r r a ta n d r a b b i t

h e a r t ,r e s p e c t i v e l y .S a r c o l e m m a la n d s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m( s e eO p i e ,1 9 8 2 )p r o t e i n si n v o l v e di n r e g u l a t i n gc y t o s o l i cC a 2 +a r e a l s op h o s p h o r y l a t e db y c y c l i cAMP-PrK. A l t h o u g hn od i r e c tm e a s u r e m e n to f m e m b r a n e - p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o nw a s m a d ei n t h i ss t u d y , t h e r e a r e i n d i c a t i o n si n F i g u r e7 t h a tp r o t e i n sm i g r a t i n g w it h a p p a r en t m o l e c u l a rw e i g h to fa p p r o x -i m a t e l y1 1 0 0 0 - 1 5 0 0 0a r e p h o s p h o r y l a t e di n r e s p o n s e t oO r g 1 0 3 2 5 .T h e s e p r o t e i n sa r e p r o b a b l y p h o s p h o l a m b a na n d / o r a 1 5 0 0 0 - m o l e c u l a rw e i g h ts a r c o l e m m a lp r o t e i n( H u g g i n s& E n g l a n d , 1 9 8 3 ) .Few PDE i n h i b i t o r sh a v e b e e ns t u d i e df o rt h e i re f f e c t so n p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n .H o w e v e r ,R a p u n d a l oe t a l .( 1 9 8 9 )h a v ed e m o n s t r a t e dt h a tm i l r i n o n e( u pt o a c o n c e n t r a t i o no f 1 0 0 p M )f a i l e dt o i n c r e a s ep h o s -p h o r y l a t i o no f e i t h e rt r o p o n i n - Io r C -p r o t e ini n g u i n e a - p i gp e r f u s e dh e a r t s .M i l r i n o n e d i d , h o w e v e r ,s t i m u l a t ep h o s -p h o r y l a t i o no fp h o s p h o l a m b a n .

T h e r i s ei n c yc l i cAMP e v o k e db y O r g 1 0 3 2 5i s d u e t o i n h i -b i t i o no f PDE a c t i v i t y .I n c o n t r a s tt o p r e v i o u sf i n d i n g s( Ta n i g u c h ie t a l . ,1 9 7 8 ;A r t m a ne t a l . ,1 9 8 9 ) ,r a b b i tv e n t r i c u l a rPDE c o u l d b es e p a r a t e di n t of o u rs u b t y p e sb y i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y .T h i s i s i n a g r e e m e n tw i t h t h ePD E p r o f i l ed e s c r i b e df o rr a t ( N i c h o l s o ne t a l . ,1 9 8 9 ) ,d o g ( K o m a se t a l . ,1 9 8 9 ) ,g u i n e a - p i ga n d human ( R e e v e se t a l . ,1 9 8 7 )c a r d i a cv e n -t r i c l e .H o w e v e r ,i n c o n t r a s tt o t h e s es t u d i e s ,i n r a b b i tc a r d i a cv e n t r i c l eb o t h PDE I a n d PDE I I w e r e a c t i v a t e db y C a /c a l m o d u l i ns u g g e s t i n gt h ep r e s e n c eo fm u l t i p l ef o r m so f c a l -m o d u l i nr e g u l a t e dPDE i n t h i st i s s u e .T h e e x i s t e n c e o fs e v e r a lC a / c a l m o d u l i ns t i m u l a t e dPDEs i n o n e t i s s u eh a sp r e v i o u s l yb e e n d e m o n s t r a t e df o rb r a i nc e l l s( N i c h o l s o ne t a l . ,1 9 8 9 )b u tn o t f o rc a r d i a c m u s c l e .O r g 1 O 3 2 5p r o d u c e dd u a li n h i b i t i o no fPDE I I I ( c y c l i cG M P - i n h i b i t e d )a n d PDE I V ( c y c l i cGMP-i n s e n s i t i v ea n d r o l i p r a mi n h i b i t e d )s u b t y p e s .T h i sPD E i n h i b i -t o r yp r o f i l ei s d i f f e r e n tf r o m o t h e rn e w i n o t r o p i ca g e n t ss u c ha s p i m o b e n d a n ,m i l r i n o n ea n d i m a z o d a na l l o f w h i c hs h o wm a r k e ds e l e c t i v i t yf o ri n h i b i t i n gPDE I I I .T h e e x a c tr e a s o n su n d e r l y i n gt h ed i f f e r e n c ei n t h eE C 5 0f o rp o s i t i v ei n o t r o p ya n dt h eI C 5 0f o rPDE i n h i b i t i o nf o rO r g 1 0 3 2 5a r eu n c l e a r .I t i su n l i k e l yt o b e d u e t o p o o r p e n e t r a t i o n ,s i n c eO r g 1 O 3 2 5a t a

s u b t h r e s h o l dc o n c e n t r a t i o np o t e n t i a t e dt h ee f f e c t so f i s o p r e n a -l i n e .S i m i l a rd i s c r e p a n c i e si n f u n c t i o n a la n d PDE i n h i b i t o r ye f f e c t sh a v eb e e no b t a i n e df o ro t h e rc o m p o u n d s( B e t h k ee t a l . ,1 9 8 8 ;S h a h i d& R o d g e r ,1 9 8 9 ;A r t m a ne t a l . ,1 9 8 9 ) .O n ep o s -s i b l ee x p l a n a t i o ni s t h a tw h i l s tO r g 1 O 3 2 5i n h i b i t sPDE I I I / I Va c t i v i t i e st h e a c t u a li n c r e a s ei n c y c l i cAMP m a yb e l i m i t e db e c a u s eo f t h ew e a k i n h i b i t o r ye f f e c to f O r g l O 3 2 5o n o t h e rPDEs ( i . e .PDE I a n d I I ) .

A l t h o u g ht h e d a t a p r e s e n t e di n t h i sp a p e r p r o v i d es t r o n ge v i d e n c ef o rt h ei n v o l v e m e n to fc y c l i cAMP i n t h ep h a r m a c o l -o g i c a la c t i o no f O r g 1 0 3 2 5 ,t h e r ea r e s o m ei n d i c a t i o n st h a to t h e ra d d i t i o n a lm e c h a n i s m sm a y a l s o b e i n v o l v e d .F o ri n s t an c e , t h ei n c r e a s ei n c a r d i a cr e l a xa t i o n t i m ei s a t y p i c a lo fa g e n t st h a ta c t o n l yv i a t h ec y c l i cAMP s y s t e m .C a t e c h o l -a m i n e s c h a r a c t e r i s t i c a l l yi n c r e a s et h e r a t eo f r e l a x a t i o na n d

t h u sa b b r e v i a t ec a r d i a ct w i t c h( R o d g e r& S h a h i d ,1 9 8 9 ) .T h i sl a t t e r e f fe c ti s b e l i e v e dt o b ed u e i n p a r tt o c y c l i cAMPm e d i -a t e dp h o s p h o r y l a t i o no ft r o p o n i n - Iw h i c hr e d u c e st h ea f f i n i t yo fC a 2 +f o rt r o p o n i n - C( s e eO p i e ,1 9 8 2 ) .O r g 1 O 3 2 5p r o d u c e dm a r k e dp h o s p h o r y l a t i o no f t r o p o n i n - Ib u t a l s op r o l o n g e dr e l a x a t i o n .T h i st e n d st o s u g g e s tt h a ta n a d d i t i o n a l a c t i o no fO r g 1 0 3 2 5i sc o u n t e r a c t i n gt h ee f f e c t so fc y c l i cAMP o n r a t eo fr e l a x a t i o n .D i r e c te f f e c t so n C a 2+ s e q u e s t r a t i o nb y s a r c o -p l a s m i cr e t i c u l u ma r eu n l i k e l ys i n c eO r g 1 0 3 2 5d i dn o t s i g n i f i -c a n t l ya f f e c tC a 2 + - u p t a k ei n s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u mv e s i c l e s .O t h e rp o s s i b i l i t i e si n c l u d e ,c h a n g e si n i o n i cc o n d u c t a n c e ,s u c ha s t h a tp r o d u c e db y Na+ c h a n n e l t o x i n sl i k e v e r a t r i d i n e( H o n e r j a g e r& R e i t e r ,1 9 7 5 )o r i n c r e a s e dC a 2 " - s e n s i t i v i t yo ft h em y o f i b r i l s( R u e g g ,1 9 8 6 )b o t h o fw h i c ha r ek n o w nt o e x a g -g e r a t et h er e l a x a t i o np h a s e .

I n c o n c l u s i o n ,t h e r e s u l t so f t h ep r e s e n ts t u d ys h o wt h a tO r g 1 O 3 2 5p r o d u c e dd i r e c t ,l a r g e ,p o s i t i v ei n o t r o p i c ,v a s c u l a rr e l a x a n ta n d w e a kp o s i t i v ec h r o n o t r o p i cr e s p o n s e si n i s o l a t e dt i s s u ep r e p a r a t i o n s .T h e s ee f f e c t sw e r e m a i n l ym e d i a t e db ya ni n c r e a s ei n c e l l u l a rc y c l i cAMP d u e t o i n h i b i t i o no fPDE I I I

8/14/2019 Br. J. Pharmacol. (1990), 100, 735-742

8/8

7 4 2 M . SHAHIDe t a l .

a n d PDE I V a c t i v i t i e s .H o w e v e r ,t h ep r o l o n g a t i o no f c a r d i a cr e l a x a t i o nt i m e s u g g e s t s t h ei n v o l v e m e n to fa d d i t i o n a lc y c l i cA M P - i n d e p e n d e n tm e c h a n i s m si n t h e p h a r m a c o l o g i c a la c t i o n so fO r g 1 O 3 2 5 .

W e g r a t e f u l l ya c k n o w l e d g et h eh e l p o fDr P. J . E n g l a n di n t h er a th e a r te x p e r i m e n t s ,Ms K a r e nB u r n sf o rc a r e f u lt y p i n g o f t h em a n u -s c r i p ta n d P r o f .I . W.R o d g e rf o r h e l pa n d a d v i c ei n s o m eo f t h es t u d i e s .

R e f e r e n c e s

ARMAH,B . I . ,H O F F E R B E R ,E .& S T E N Z E L ,W .( 1 9 8 8 ) .P h a r m a c o l o g i c a lp r o p e r t i e so ft h ep o s i t i v ei n o t r o p i ca n d a ; - a d r e n o c e p t o rb l o c k i n ga g e n ts a t e r i n o n e .A r z n e i m - F o r s c h . / D r u gR e s . ,3 8 ,1 2 8 7 - 1 2 9 2 .ARTMAN,M . , KITHAS, P. A . ,WIKE, J . S . ,CRUMP, D . B . & STRADA, S . J .( 1 9 8 9 ) .I n o t r o p i cr e s p o n s e st o c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s ei n h i b i t o r si n i m m a t u r ea n d a d u l t r a b b i tm y o c a r d i u m .J . C a r d i o -v a s c .P h a r m a c o l . ,1 3 ,1 4 6 - 1 5 4 .

B E AV O ,J . A .( 1 9 8 8 ) .M u l t i p l ei s o e n z y m e so f c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o -d i e s t e r a s e .I n A d v a n c e si n S e c o n dM e s s e n g e ra n d P h o s p h o p r o t e i nR e s e a r c h ,Vo l .2 2 ,e d .G r e e n g a r d ,P . & R o b i n s o n ,G . A . ,p p . 1 - 3 8 .Ne w Y o r k :R a v e nP r e s s .

BETHKE, T . , B R U N K H O R S T,D . , V . DE R LEYEN, H . , MEYER, W . ,N I G B U R ,R .& S C H O L Z ,H .( 1 9 8 8 ) .M e c h a n i s mo f a c t i o na n d c a r -d i o t o n i ca c t i v i t yo f a n e w p h o s p h o d i e s t e r a s ei n h i b i t o r ,t h eb e n z -i m i d a z o l ed e r i v a t i v ea d i b e n d a n( BM 1 4 . 4 7 8 ) ,i n g u i n e a - p i gh e a r t s .N a u n y n - S c h m i e d e b e r g sA r c h .P h a r m a c o l . ,3 3 7 ,5 7 6 - 5 8 2 .

BRISTOW, M . R . , GINSBURG, R . ,UMANS,V . ,FOWLER,M . , MINOBE,W . ,RASMUSSEN,R . ,Z E R A ,P . ,MENLOVE,R . ,SHAH, P . ,JAMIESON,S . & S T I N S O N ,E . ( 1 9 8 6 ) .

f i l -a n d , a 2 - a d r e n e r g i cr e c e p t o rs u b -

p o p u l a t i o n si n n o r m a la n d f a i l i n ghuman v e n t r i c u l a rm y o c a r d -i u m : c o u p l i n go f b o t h r e c e p t o rs u b t y p e st o m u s c l ec o n t r a c t i o na n d s e l e c t i v ef i - r e c e p t o rd o w n - r e g u l a t i o ni n h e a r tf a i l u r e .C i r c .R e s . ,5 9 ,2 9 7 - 3 0 8 .

DENNISS, A . R . ,COLUCCI, W. S . ,ALLEN, P. D . & MARSH,J . D .( 1 9 8 9 ) .D i s t r i b u t i o na n d f u n c t i o no f human v e n t r i c u l a rb e t aa d r e n e r g i cr e c e p t o r si n c o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r e .J . M o l . C e l l .C a r d i o l . ,2 1 ,6 5 1 - 6 6 0 .

ENDOH,M . ( 1 9 8 0 ) .T h e t i m e c o u r s eo f c h a n g e si n c y c l i cn u c l e o t i d el e v e l sd u r i n gc h o l i n e r g i ci n h i b i t i o no f p o s i t i v ei n o t r o p i ca c t i o n so fi s o p r e n a l i n ea n d t h e o p h y l l i n ei n t h e i s o l a t e dc a n i n e v e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m .N a u n y n - S c h m i e d e b e r g sA r c h . P h a r m a c o l . ,3 1 2 ,1 7 5 -1 8 2 .

E N D O H , M . , YANAGISAWA,T . , T A I R A ,N . & B L I N K S ,J . R .( 1 9 8 6 ) .E f f e c t so f n e w i n o t r o p i ca g e n t s o n c y c l i cn u c l e o t i d em e t a b o l i s ma n d c a l c i u mt r a n s i e n t si n c a n i n e v e n t r i c u l a rm u s c l e .C i r c u l a t i o n ,

7 3 ,( S u p p l .3 ) ,1 1 7 - 1 3 1 .ENGLAND,P. J .& S H A H I D ,M . ( 1 9 8 7 ) .E f f e c t so ff o r s k o l i no n c o n t r a c -t i l er e s p o n s e sa n d p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o ni n t h ei s o l a t e dp e r f u s e dr a th e a r t .B i o c h e m .J . ,2 4 6 ,6 8 7 - 6 9 5 .

E VA N S ,D . B .( 1 9 8 6 ) .M o d u l a t i o no f cAMP: m e c h a n i s mf o rp o s i t i v ei n o t r o p i ca c t i o n .J . C a r d i o v a s c .R e s . ,8 ,( S u p p l .9 ) ,5 2 2 - 5 2 9 .

FELDMAN, A . M . , C AT E S ,A . E . ,VEAZEY, W . B . ,HERSHBERGER,R . E . ,BRISTOW, M . R . ,BAUGHMAN,K . L . ,BAUMGARTNER,W. A .& V AND O P,C .( 1 9 8 8 ) .I n c r e a s eo f t h e4 0 , 0 0 0 - m o lw t .p e r t u s s i st o x i ns u b -s t r a t e( G - p r o t e i n )i n t h ef a i l i n ghuman h e a r t .J . C l i n .I n v e s t . ,8 2 ,1 8 9 - 1 9 7 .

FRANGAKIS,C . J . ,LANNI, C . ,LASHER, K . P. ,BENTLEY, R . G . & FARAH,A . E .( 1 9 8 9 ) .T h e r o l eo f c y c l i cAMP a n d t h e d i h y d r o p y r i d i n e -s e n s i t i v ec h a n n e l s o n t h e m e c h a n i s mo f a c t i o no f m i l r i n o n e( C o r o t r o p e ) .J . C a r d i o v a s c .P h a r m a c o l . ,1 3 ,9 1 5 - 9 2 4 .

H A R I G A YA ,S .& SCHWARTZ,A .( 1 9 6 9 ) .R a t e o fc a l c i u mb i n d i n ga n du p t a k ei n n o r m a la n i m a la n d f a i l i n ghuman c a r d i a cv e n t r i c l e .C i r c .R e s . ,2 5 ,7 8 1 - 7 9 4 .

HOLLINWORTH,D . N . & ENGLAND, P . J .( 1 9 7 8 ) .T h e s t i m u l a t i o no fc a l c i u mu p t a k ei n t os a r c o p l a s m i c - r e t i c u l u mv e s i c l e sf r o mr a th e a r tb y a d e n o s i n e3 ' , 5 ' - p h o s p h a t ed e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e .B i o c h e m .S o c .T r an s . , 6 ,5 7 3 - 5 7 6 .

HONERJAGER,P .& R E I T E R ,M . ( 1 9 7 5 ) .T h e r e l a t i o nb e t w e e ne f f e c t so fv e r a t e r i d i n eo n a c t i o np o t e n t i a la n d c o n t r a c t i o ni n m a m m a l i a nv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m .N a u n y n - S c h m i e d e b e r g sA r c h .P h a r m a c o l . ,2 8 9 ,1 1 - 2 8 .

H U G G I N S ,J . P.& ENGLAND,P . J .( 1 9 8 3 ) .S a r c o l e m m a lp h o s p h o l a m b a ni s p h o s p h o r y l a t e di n i s o l a t e dr a th e a r t sp e r f u s e dw i t h i s o p r e n a l i n e .FEBS L e t t . ,1 6 3 ,2 9 7 - 3 0 2 .

KOMAS,N . ,LUGNIER, C . ,LE B E C ,A . ,SERRADEIL-LE G A L ,C . ,BAR-THELEMY,G . & S T O C L E T ,J . C .( 1 9 8 9 ) .D i f f e r e n t i a ls e n s i t i v i t yt oc a r d i o t o n i cd r u g so fc y c l i cAMP p h o s p h o d i e s t e r a s ei s o l a t e df r o mc a n i n e v e n t r i c u l a ra n d s i n o a t r i a l - e n r i c h e dt i s s u e s .J . C a r d i o v a s c .

P h a r m a c o l . ,1 4 ,2 1 3 - 2 2 0 .KRANIAS, E . G . ,GARVEY, J . L . ,S R I VA S T AVA ,R . D . & SOLARO, R . J .

( 1 9 8 5 ) .P h o s p h o r y l a t i o na n d f u n c t i o n a lm o d i f i c a t i o n s o fs a r c o -p l a s m i cr e t i c u l u ma n d m y o f i b r i l si n i s o l a t e dr a b b i th e a r t ss t i m u -

l a t e dw i t h i s o p r e n a l i n e .B i o c h e m .J . ,2 2 6 ,1 1 3 - 1 2 1 .MARSHALL,R . J . ,SHAHID, M . ,C O T T N E Y,J . , BRUIN, J . C .& McINDE-W A R ,I .( 1 9 8 8 ) .O r g l 0 3 2 5a n e wc a r d i o t o n i ca g e n t .C a r d i o v a s c u l a re f f e c t si na n a e s t h e t i z e d a n i m a l s .B r .J . P h a r m a c o l . ,9 5 ,4 8 9 P.

METHVEN,P . ,LEMON,M . & BHOOLA,K . ( 1 9 8 0 ) .T h e m e t a b o l i s mo fc y c l i cn u c l e o t i d e si n t h eg u i n e a - p i gp a n c r e a s .C y c l i cAMP p h o s -p h o d i e s t e r a s ea n d c y c l i cGMP p h o s p h o d i e s t e r a s e .B i o c h e m .J . ,1 8 6 , 4 9 1 - 4 9 8 .

NICHOLSON,C . D . ,JACKMAN,S . A .& W I L K E ,R .( 1 9 8 9 ) .T h e a b i l i t yo fd e n b u f y l l i n et o i n h i b i tc y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s ea n d i t sa f f i n i t yf r o ma d e n o s i n er e - u p t a k es i t e .B r .J . P h a r m a c o l . ,9 7 ,8 8 9 -8 9 7 .

O ' D O N N E L L ,S . R .& W A N S T A L L ,J . C .( 1 9 8 7 ) .C h o i c ea n d c o n c e n t r a t i o no f c o n t r a c t i l ea g e n t i n f l u e n c er e s p o n s e so f r a t a o r t a t o v a s c u l a rr e l a x a n td r u g s .J . P h a r m .P h a r m a c o l . ,3 9 ,8 4 8 - 8 5 0 .

O P I E ,L . H .( 1 9 8 2 ) .R o l eo fc y c l i cn u c l e o t i d e si n h e a r tm e ta b o l i s m . C a r -d i o v a s c .R e s . ,1 6 ,4 8 3 - 5 0 7 .

P O O L E - W I L S O N ,P. A .& B U L L E R ,N . P.( 1 9 8 8 ) .C a u s e so fs y m p t o m si nc h r o n i cc o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r ea n d i m p l i c a t i o n sf o r t r e a t m e n t .A m .J . C a r d i o l . ,6 2 ,3 1 A - 3 4 A .

RAPUNDALO,S . T . ,S O L A R O ,R . J .& K R A N I A S ,E . G .( 1 9 8 9 ) .I n o t r o p i cr e s p o n s e st o i s o p r o t e r e n o la n d p h o s p h o d i e s t e r a s ei n h i b i t o r si ni n t a c tg u i n e a - p i gh e a r t s :c o m p a r i s o no f c y c l i cAMP l e v e l sa n dp h o s p h o r y l a t i o no f s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u ma n d m y o f i b r i l l a rp r o -t e i n s .C i rc . R e s . ,6 4 ,1 0 4 1 1 1 .

R E E V E S ,M . L . ,L E I G H ,B . K .& ENGLAND,P . J .( 1 9 8 7 ) .T h e i d e n t i f i c a t i o no f a n e w c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s ea c t i v i t yi n humana n d g u i n e a - p i g c a r d i a cv e n t r i c l e .B i o c h e m .J . ,2 4 1 ,5 3 7 - 5 4 1 .

REMME,W .J . ( 1 9 8 6 ) .C o n g e s t i v eh e a r tf a i l u r e - p a t h o p h y s i o l o g ya n dm e d i c a lt r e a t m e n t .J . C a r d i o v a s c .P h a r m a c o l . ,8 ( S u p p l .1 ) ,S 3 6 -S 5 2 .

R E T T I G ,G . F .& B E T T E ,L . ( 1 9 8 8 ) .C u r r e n t t h e r a p yo f a c u t eh e a r tf a i l u r e .C a r d i o v a s c u l a rD r u g sa n d T h e r a p y ,2 ,4 0 1 - 4 0 6 .

RODGER,I . W.& S H A H I D ,M . ( 1 9 8 4 ) .F o r s k o l i n ,c y c l i cn u c l e o t i d e sa n dp o s i t i v ei n o t r o p i s mi n i s o l a t e dp a p i l l a r ym u s c l e so ft h er a b b i t .B r .J . P h a r m a c o l . ,8 1 ,1 5 1 - 1 5 9 .

RUEGG, J . C .( 1 9 8 6 ) . E f f e c t so f n e w i n o t r o p i ca g e n t s o n C a 2+ s e n s i -t i v i t yo fc o n t r a c t i l ep r o t e i n s .C i r c u l a t i o n ,7 3 ( S u p p l .3 ) ,7 8 - 8 4 .

S H A H I D ,M . & RODGER, I . W.( 1 9 8 9 ) .C h r o n o t r o p i ca n d i n o t r o p i ca c t i o n so fa m r i n o n e ,c a r b a z e r a na n d i s o b u t y l m e t h y l x a n t h i n e :r o l eo fp h o s p h o d i e s t e r a s ei n h i b i t i o n .B r .J . P h a r m a c o l . ,9 8 ,2 9 1 - 3 0 1 .

SHAHID, M . ,COTTNEY, J . , MARSHALL,R . J . , MARTORANA,M . G . ,RODGER,I . W. ,B R U I N ,J . C .& McINDEWAR,I .( 1 9 8 8 ) .O r g l O 3 2 5 ,an e w c a r d i o t o n i ca ge nt w i th p o s i t i v ei n o t r o p i ca n d v a s o d i l a t o rp r o p e r t i e s .B r .J . P h a r m a c o l . ,9 5 ,4 8 8 P.

S H A H I D ,M . ,COTTNEY, J . C . ,NICHOLSON, C . D . ,MARSHALL,R . J . ,B R U I N ,J . C . ,McINDEWAR, I . , WALKER, G . B . ,DICKSON, M . &W Y L I E ,K . ( 1 9 8 9 ) .O r g 3 0 0 2 9a n e wc a r d i o t o n i ca g e n t w i t h p o s i t i v ei n o t r o p i ca n d v a s c u l a rr e l a x a n tp r o p e r t i e s .B r .J . P h a r m a c o l . ,9 6 ,1 1 P .

S I L V E R ,P . J . ,LEPORE, R . E . ,O'CONNER, B . ,LEMP, B . M . ,HAMEL, L . T. ,B E N T L E Y,R . G .& H A R R I S ,A . L .( 1 9 8 8 ) .I n h i b i t i o no f t h el o w K mc y c l i cAMP p h o s p h o d i e s t e r a s ea n d a c t i v a t i o no ft h ec y c l i cAMPs y s t e m i n v a s c u l a rs m o o t hm u s c l eb y m i l r i n o n e .J . P h a r m a c o l .E x p . T h e r . ,2 4 7 ,3 4 - 4 2 .

S M I T H ,G . W. ,H A L L ,J . C .& W E S T ,P. A .( 1 9 8 7 ) .L a c ko fi n o t r o p i cs e l e c -t i v i t yo f p h o s p h o d i e s t e r a s ee n z y m ei n h i b i t o r si n v i t r o .J . P h a r m .P h a r m a c o l . ,3 9 ,7 4 8 - 7 5 1 .

T A N I G U C H I ,T . S . ,FUGIWARA,M . ,L E E ,J . & H I D A K A ,H . ( 1 9 7 8 ) .C y c l i c3 ' , 5 ' - n u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s eo f r a b b i ts i n o - a t r i a ln o d e .B i o c h i m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n . ,7 3 ,1 9 - 2 4 .

WATANABE,A . M . & B E S C H ,H . R .( 1 9 7 5 ) .I n t e r a c t i o nb e t w e e nc y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ea n d c y c l i cg u a n o s i n em o n o p h o s p h a t ei n g u i n e a - p i gv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m .C i r c .R e s . ,3 7 ,3 0 9 - 3 1 7 .

WINSLOW,E . ,FARMER, S . ,MARTORANA,M . G . & MARSHALL,R . J .( 1 9 8 6 ) .T h e e f f e c t so fb e p r i d i lc o m p a r e dw i t hc a l c i u ma n t a g o n i s t s

o n r a ta n d r a b b i ta o r t a .E u r .J . P h a r m a c o l . ,1 3 1 ,2 1 9 - 2 2 8 .( R e c e i v e dJ a n u a r y3 , 1 9 9 0

R e v i s e dM a r c h6 ,1 9 9 0A c c e p t e dA p r i l9 ,1 9 9 0 )