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BRUNO FRITZSONS BONIN

EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITÁRIA

EQUINA NA RESPOSTA OVARIANA E EFICIÊNCIAREPRODUTIVA DE ÉGUAS IDOSAS EM PROGRAMA DE

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

Dissertação

Mestrado

Botucatu-SP

2009



BRUNO FRITZSONS BONIN

EFEITO DO TRATAMENTO COM EXTRATO DE PITUITÁRIA EQUINA NA

RESPOSTA OVARIANA E EFICIÊNCIA REPRODUTIVA DE ÉGUAS IDOSASEM PROGRAMA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

Dissertação apresentada à Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade Estadual Paulista, campus

de Botucatu, como parte das exigências

para obtenção do título de Mestre em

Medicina Veterinária, área de ReproduçãoAnimal.

Orientador: Professor Adjunto Marco Antônio Alvarenga

Botucatu-SP

2009



ii

AGRADECIMENTOS

A Deus que nos permite caminhar todos os dias vencendo batalhas e trilhando

nosso caminho em companhia de nossas famílias e amigos.

A minha família, Bruna, Sophia e Matheus (a caminho) por sempre estarem ao

meu lado entendendo o trabalho sem horário, conciliado com vários anos de

estudo longe de casa.

Aos meus familiares, pelos incessantes incentivos na busca constante de

novas informações e formação pessoal.

Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga, pelos

ensinamentos e confiança durante a realização do curso de Mestrado.

Ao Médico Veterinário e amigo José Antonio Dell’Aqua Júnior pelo auxilio na

avaliação estatística dos dados.

Aos docentes, colegas pós-graduandos e funcionários do Departamento de

Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, Unesp-Botucatu.

Ao amigo e proprietário da Central de Reprodução, Guilherme Gregolin, pela

viabilização da condução deste trabalho, nas dependências de sua Central.



iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Efeito da idade da égua doadora nas taxas de

recuperação embrionária........................................................................ 15

Tabela 2 – Número médio de ovulações por ciclo, número médio deembriões por ciclo, número médio de embriões por ovulação e númeromédio de embriões por éguas................................................................. 22

Tabela 3 – Número de ovulações por égua no G1, G2 e G3................. 23

Tabela 4 – Número de embriões recuperados por égua no G1, G2 eG3............................................................................................................ 24

Tabela 5 – Duração da fase folicular, tempo em dias da aplicação daprostaglandina (D8) até a ovulação por égua no G1, G2 eG3.............................................................................................................

25

Tabela 6 - Condizência entre o Estagio de desenvolvimento paracada embrião recuperado e o dia da recuperação (D8 do ciclo), noG1, G2 e G3............................................................................................ 26

Tabela 7 - Taxa de prenhez obtida por embriões recuperados no G1,G2 e G3................................................................................................... 26

Tabela 8 - Taxa de prenhez por ciclo obtidas no G1, G2 e G3............. 27



iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Porcentagem de éguas em atividade reprodutiva natural de

acordo com idade...................................................................................... 03

Figura 2 – Taxa de parição em éguas de acordo com idade.................... 04

Figura 3 – FSH e LH centralizado para ovulação..................................... 08



v

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................ 01

2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................. 03

2.1 Senilidade, dinâmica ovariana e ciclo estral ................................. 04

2.2 Alterações hormonais relacionadas à idade ................................. 06

2.3 Alterações da genitália externa e interna relacionadas à idade ..... 10

2.4Senilidade e qualidade de oócitos e embriões ................................ 11

3. OBJETIVOS........................................................................................... 17

4. MATERIAL E MÉTODO......................................................................... 18

4.1 Período e Local do Experimento ............................................................ 18

4.2 Animais e Grupos Experimentais ........................................................... 18

4.3 Delineamento Experimental ................................................................... 18

4.3.1 Exames Ultrassonográficos..................................................... 19

4.3.2 Colheita de Sêmen, Inseminações e Indução das Ovulações 19

4.3.3 Tratamentos ............................................................................. 20

4.3.4 Colheita, Manipulação e Transferência dos Embriões ............ 20

4.3.5 Diagnóstico de Gestação ......................................................... 21

4.4 Análise Estatística ......................................................................... 21

5. RESULTADOS....................................................................................... 22

6. DISCUSSÃO........................................................................................... 28

7. CONCLUSÕES....................................................................................... 34

8. REFERÊNCIAS...................................................................................... 35



vi

RESUMO

BONIN, B.F., Efeito do tratamento com extrato de pituitária equina na

resposta ovariana e eficiência reprodutiva de éguas idosas em programade transferências de embriões. Botucatu, 2009.

Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,

Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.

O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos de doses baixas do extrato de

pituitária eqüina (EPE) no crescimento folicular, taxa de ovulação e de

recuperação embrionária em éguas idosas. Doadoras de embrião (n=20) daraça Quarto de Milha de um programa comercial com idade de 15 a 20 anos de

idade, foram utilizadas em 3 ciclos consecutivos. O primeiro e o terceiro ciclo

foi utilizado como grupo controle e entre eles o grupo tratado com EPE no

segundo ciclo. Em todos os ciclos, a ultrassonografia transretal dos ovários foi

realizada diariamente após aplicação de prostaglandina e monitorando os dois

maiores folículos. Durante os três ciclos as éguas foram inseminadas com

sêmen a fresco ou refrigerado do mesmo garanhão e receberam uma aplicaçãode acetato de deslorelina após a detecção de pelo menos um folículo de 35 a

40 mm de diâmetro. A recuperação embrionária foi realizada por lavado uterino

8 dias pós ovulação seguidas da administração de prostaglandina. No ciclo

tratado, injeções de EPE (7mg/IM/duas vezes ao dia) se iniciaram no dia 8

após a ovulação até que um folículo pré-ovulatório fosse observado. A

porcentagem de éguas com mais de uma ovulação foi comparada pelo teste de

Fisher e a média do número de ovulações e embriões, assim como o diâmetro

folicular, entre os ciclos foram comparados usando teste de Student’s. A

porcentagem de éguas com mais de uma ovulação e o número de ovulações

foram maiores (p<0,05) no ciclo tratado com EPE (65% das éguas e 1,8

ovulações) do que o grupo controle antes (5% e 1,0) e depois do tratamento

(5% e 1,0). O número de embriões recuperados por ciclo também foi maior

(p<0,05) no grupo tratado com EPE (1,0/ciclo) comparado com os ciclos

controle (0,42/ciclo). Entretanto a taxa de embrião recuperado por ovulação foi

similar (p>0,05) entre os grupos controles (0,4 embriões/ovulação) e o ciclo



vii

tratado (0,6 embriões/ovulação). O tratamento com EPE possibilitou a

recuperação de embriões com estágio de desenvolvimento mais compatíveis

ao estágio embrionário. A taxa de prenhez dos embriões transferidos foi similar

entre os embriões recuperados no ciclo tratado (14/20-70%) e nos ciclos

controle (9/17-55%). Baseado nos resultados do presente experimento,

concluímos que o tratamento com EPE foi capaz de aumentar a eficiência

reprodutiva de éguas idosas doadoras de embrião, recuperando ao menos um

embrião por ciclo. O aumento nas taxas de recuperação embrionária nos ciclo

tratados com EPE aparentam estar mais relacionados ao número de ovulações

por ciclo do que uma melhora no oócito ou maturação folicular.

Palavras-chave: égua, idade, ovulações múltiplas, extrato de pituitária eqüino,

transferência de embriões



viii

ABSTRACT

BONIN, B.F., Effect of equine pituitary treatment on ovarian response and

reproductive efficiency of old mares in a embryo transfer program.Botucatu, 2009. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,

Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.

The present study aimed to evaluate the effect of the use of low doses of

equine pituitary extract (EPE) on follicular growth, ovulation rate and embryo

recovery rates in old mares. Embryo donors (n=20) of Quarter Horse breedfrom a commercial embryo center aging 15 to 20 years old , were used during

3 consecutive cycles. The first and third cycles were use as control being the

EPE treatment performed on the second cycle. In all cycles transrectal

ultrasonography of the uterus and ovaries was performed daily after PG

injection to follow the development of the two largest follicles. During the 3

estrus mares were inseminated with cooled or fresh semen from the same

stallion and received an injection of deslorelin (1 mg i.m.) upon detection of atleast one follicle of 35 to 40 mm in diameter. The embryo flushing’s were

performed on day 8 post-ovulation and were always followed by administration

of PG. On the treated cycle, EPE injections (7mg twice daily i.m.) were started

on day 8 after ovulation until a pre-ovulatory follicle was observed. The

percentage of mares with more than one ovulation was compared by means

using Fischer’s test and the mean number of ovulations and embryos, as well

as follicular diameters, between cycles were compared using Student’s t test.

The percentage of mares with more than one ovulation and number of

ovulations were higher (p<0.05) in the EPE-treated cycle (65% of mares and

1.8 ovulations) than in the control cycle before (5% and 1.0) and after treatment

(5% and 1.0). Also the mean number of embryos recovered per cycle were

higher (p<0.05) on EPE treated cycle (1.0 /cycle) than in no treated cycles

(0.42/cycle). However the embryo rate per ovulation was similar (p>0.05)

between no treated cycles (0.4 embryo/ovulation) and treated cycle (0.6

embryo/ovulation). The treatment with EPE allowed the recovery of embryos in



ix

stage of development more compatible with the embryonic age. The pregnancy

rates of the transferred embryos was also similar between embryos recovered

on treated (14/20-70%) an non treated cycles (9/17 -55%). Based on the results

of the present experiment we can concluded that EPE treatment was able to

increase the reproductive efficiency of old embryo donor mares, providing the

recovery of at least one embryo on average per cycle. The improvement on

embryo recovery rates on EPE treated cycle seems to be more related with the

increase in the number of ovulations per cycle than with improvement on oocyte

or follicle maturation.

Key words: mare, age, multiple ovulations, equine pituitary extract, embryo

transfer.



,QWURGXomR

1

1. INTRODUÇÃO

Fêmeas mamíferas apresentam um declínio gradativo na capacidade

reprodutiva com o avançar da idade. Diferente de outros animais domésticos,as éguas com o avançar da idade permanecem como parte da população de

reprodutoras ativas nos haras.

O declínio da fertilidade relacionado à idade em fêmeas tem pelo menos

dois componentes básicos: a diminuição da taxa de concepção/prenhez por

ciclo e um aumento das taxas de morte embrionária e abortamento nestes

animais.

As éguas são mais valiosas com sua progênie comprovada ou por seumaior tempo destinado a vitórias em competições, isso geralmente ocorre

quando a égua possui aproximadamente 15 anos de idade, coincidindo com a

queda em seu índice de fertilidade. Havendo assim um grande interesse dos

criadores de cavalo em manter estas reprodutoras de idade superior aos 15

anos na reprodução, justificado nos valores de venda de seus produtos.

Visando um maior aproveitamento e intensificação do ritmo do

melhoramento genético e da eficiência reprodutiva, se faz necessário à

utilização de biotecnologias reprodutivas, desta forma a transferência de

embriões busca suprir a demanda existente em relação a produtos oriundo de

éguas mais velhas com alto potencial genético.

Um dos problemas que interfere na eficiência reprodutiva de programas

de transferência diz respeito ao elevado percentual de éguas idosas existentes

nestes programas, pois sabidamente estas éguas têm uma eficiência

reprodutiva mais baixa do que éguas jovens.

As éguas idosas ainda podem apresentar uma maior porcentagem de

deformidades anatômicas, prejudiciais para reprodução como má coaptação e

conformação de vulva. Além de serem mais susceptíveis a endometrite pós-

cobertura, pela redução das contrações miometriais, sistema linfático

deficiente, útero mais penduloso e a incompetência de cérvix.

A fêmea eqüina por natureza é monovular, o que significa dizer que a

cada ciclo estral, geralmente, uma única ovulação irá ocorrer. A possibilidade

de se incrementar o número de ovulações no ciclo estral da égua traz consigo



,QWURGXomR

2

potenciais benefícios, como o aumento no número de oócitos disponíveis para

aplicação de diferentes técnicas de reprodução assistida e aumento no número

de embriões recuperados em uma única colheita, com conseqüente redução

dos custos do programa de transferência de embriões.

A ocorrência de ovulações duplas espontâneas em éguas é um fator que

incrementa a recuperação de embriões. Assim sendo, alguns grupos de

pesquisa têm se dedicado ao estudo dos fatores responsáveis pela baixa

recuperação embrionária em éguas superovuladas e ao desenvolvimento de

protocolos que driblem esses fatores, que produzam menos efeitos adversos e

promovam estimulação moderada e não excessiva dos ovários.

Farinasso (2004) utilizou doses de EPE mais baixas do que as

tradicionalmente utilizadas para superovulação e obteve aumento no número

médio de ovulações, provocado pela maior incidência de ovulações duplas e

triplas e de embriões recuperados em éguas. Por outro lado Jacob, 2008

demonstraram que éguas idosas apresentam baixo níveis de hormônio

luteinizante (LH) sérico no período periovulatório.

O referidos trabalhos nos motivaram a investigar a aplicabilidade de uma

baixa dose de EPE para incrementar o número de ovulações e embriões

recuperados em éguas, partindo da hipótese de que a aplicação exógena de

EPE poderia atuar beneficamente aumentando o número de ovulações por

ciclo bem melhorando a maturação folicular e ou oocitária por levar a um

aumento dos níveis séricos de LH.



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

Na industria eqüina em geral e entre os criadores principalmente, existe

um mercado interessado em aumentar a eficiência reprodutiva de seus animaismais valiosos, as fêmeas eqüinas obtêm seu maior valor econômico quando

sua progênie se destaca. Isto ocorre na égua quando passado sua vida média

reprodutiva, coincidindo com a diminuição dos índices de fertilidade, a partir de

15 – 17 anos de idade (LOSINNO et. al, 2000).

Fonte : LOSINNO,2006

Figura 1 – Porcentagem de éguas em atividade reprodutiva natural de acordo

com idade, adaptado por BAKER, 1993.

A diminuição da eficiência reprodutiva com o avançar da idade fica

evidente quando avaliadas as taxas de nascimentos com idade materna após

14 – 16 anos e aumento da morte embrionária precoce em éguas idosas (BALL

et al., 2000, BAKER, 1993).

As reprodutoras mais idosas (acima 16 anos), representam de 10 – 25%

das éguas que estão em um programa de reprodução (BAKER, 1993). É

grande a diferença da eficiência reprodutiva entre éguas idosas e jovens,

quanto a prenhez/ciclo (32% e 65 % respectivamente), nascimentos (54% e



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

4

82%, respectivamente) e perda embrionária (29% e 7% respectivamente)

(VANDERWALL, 1989).

Fonte: LOSINNO,2006

Figura 2 – Taxa de parição em éguas de acordo com idade, adaptado por

BAKER, 1993.

Corroborando com estes trabalhos, em um experimento com éguas

pônei, cobertas com o mesmo garanhão, éguas jovens (5 – 7 anos) e idosas (>

15 anos), obtiveram respectivamente, 100% de prenhez no dia 12 vs 32%, a

morte embrionária no d50 foi de 62% nas éguas idosas contra 11 % nas jovens

(CARNEVALE & GUINTER, 1992).

Esta diminuição da eficiência reprodutiva, demonstrada por menores

índices de prenhez e menores taxas de nascimentos, pode estar relacionada,

como em outros mamíferos a disfunções neuro-endócrinas, perda gestacional

ou uma combinação de todas elas. (BALL et al., 2000).

2.1. Efeito da senilidade no ciclo estral

A divergência em trabalhos é muito grande relacionado à idade, onde

cada pesquisador seleciona e classifica as éguas nas faixas etárias como jovens, intermediárias e idosas, dificultando a comparação entre os grupos.



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

5

Conforme publicado pelos seguintes autores: Carnevale et. al, (1993): 5-7 anos

nas jovens, 15-19 anos idade intermediária e > 20 anos nas idosas; Vanderwall

et. al,(1993) : 16 – 20 anos nas éguas idosas; Carnevale & Ginther (1995): 5 –

7 anos nas jovens e > 15 anos nas idosas; Fleury et al (1989) : jovens < 3

anos, intermediárias de 3 – 18 anos e idosas > 18 anos; Vogelsang &

Vogelsang (1989): jovens de 2 – 8 anos, intermediárias de 9 – 17 anos e idosas

de 18 a 28 anos; Alonso et. al.(2005) : jovens de 2 – 17 anos e idosas de 18 -

26 anos; Losinno (2006) :jovens de 3 - 8 anos e idosas >15 anos e Jacob

(2008) : jovens de 4 a 6 anos, intermediária de 10 a 14 anos e idosas >18

anos; Rambags et. al. (2008) jovens < 12 anos e idosas > 15 anos.

Originalmente, as éguas têm aproximadamente 40.000 folículosprimordiais e ciclam continuamente por 25 anos. Presumivelmente o pool de

folículos primordiais é finito principalmente, por não ter sido citado, até o

presente momento, a ocorrência de mitoses em oogônias de potras ou éguas

(GINTER, 1993). A égua é poliéstrica estacional, com ciclos reprodutivos

regulares durante o período de maior intensidade de luz e intervalos

transicionais no início e fim do período ovulatório da estação (CARNEVALE,

2008).O efeito da idade sobre a atividade ovariana tem sido caracterizado

também pelo decréscimo do volume ovariano, pela redução do número de

folículos antrais e pela menor vascularização do estroma intra-ovariano em

mulheres idosas (KUPESIC et al., 2003). A disfunção ovariana também tem

sido responsabilizada como causa do decréscimo da eficiência reprodutiva em

éguas idosas (WESSON & GUINTER, 1981).

Com o avançar da idade mudanças no ciclo estral ocorrem refletindoalterações na função ovariana. Características comparadas no ciclo de éguas

de meia idade (15 -19 anos) e éguas jovens (5 – 7 anos) mostraram que a fase

luteal não diferiu , porém houve redução de 15 % da fase folicular , 9,4 dias das

éguas jovens contra 8,0 dias das éguas de meia idade e as éguas de meia

idade ovularam com folículos menores (CARNEVALE, 2008).

Diferenças significativas não foram encontradas na duração do ciclo

estral entre éguas velhas e jovens da primeira para segunda ovulação(VANDERWALL et al,.1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993)



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

6

encontraram intervalos de 23,9 ± 0,6, 23,0 ± 0,8 e 26,5 ± 0,7 dias para éguas

jovens (5 - 7 anos), com idade intermediária (15-19 anos) e idosas (>20 anos)

respectivamente.

Em outro estudo Jacob (2008) relatou que a duração do período

interovulatório para as éguas jovens, de idade intermediária e idosas foram,

respectivamente 22,6 ± 0,48, 22,4 ± 0,38 e 23,9 ± 0,55 dias (p= 0,0567). A

taxa de crescimento (mm/dia) nos 4 dias antes da ovulação nas éguas jovens,

de meia idade e idosas foi de 3,0 ± ,18; 2,5 ± 0,13 e 2,1 ± 0,32

respectivamente.

Um prolongado período interovulatório deveu-se ao prolongamento da

fase folicular e conseqüentemente ao prolongado intervalo da indução daluteólise até a ovulação, foi citado por Vanderwall et al,. (1993) em éguas

velhas (16 a 20 anos), quando comparado ao das éguas entre 10 e 11 anos.

Entretanto como todas as éguas foram cobertas, os autores sugeriram que o

prolongado intervalo entre ovulações pode ter se devido à não detecção de

perda embrionária precoce nos animais idosos.

Em mulheres, observa-se que nos anos que antecedem o período de

transição para a menopausa, ocorrem ovulações regulares, enquanto o ciclomenstrual é progressivamente encurtado. Fenômeno este que se deve ao

encurtamento da fase folicular em mulheres idosas (KLEIN et al., 2002).

Éguas com mais de 20 anos possuem significantemente um maior

intervalo interovulatório, com fase luteal similar, mas com longa fase folicular

comparada ás éguas jovens. Fato associado com atraso de 3 dias para na

emergência do folículo dominante e o crescimento mais lento do folículo

ovulatório (CARNEVALE et al.,1993).

2.2. Alterações hormonais e da dinâmica ovariana relacionadas à

senilidade

Na égua, a idade pode também afetar os níveis dos hormônios

reprodutivos (CARNEVALE et al., 1993), embora em bovinos os níveis de

gonadotrofinas não tenham sido afetados pela idade das vacas (MALHI et al.,2005).



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

7

O efeito da idade sobre a concentração plasmática de progesterona não

foi observada durante os dois períodos ovulatórios em éguas (VANDERWALL

et al., 1993). Diferentemente Carnevale et al., (1993) observaram maiores

concentrações de progesterona em éguas idosas quando comparadas a éguas

com idade intermediária.

Carnevale et al (1993) demonstraram o efeito da idade sobre a função

do corpo lúteo, sendo que o grupo de éguas velhas apresentou concentração

de progesterona mais elevada, após a segunda ovulação, do que o grupo de

meia idade, embora o mesmo não tenha sido observado na primeira ovulação.

As concentrações sistêmicas do hormônio folículo estimulante (FSH) e

a atividade folicular durante a fase luteal são maiores em éguas de meia-idade(de 15 a 19 anos), quando comparadas às de éguas idosas (> 20 anos) ou

jovens (de 5 a 7 anos) (CARNEVALE et al., 1993).

No trabalho de Jacob (2008) não foi observado efeito de idade sobre as

concentrações de FSH, progesterona e estradiol séricos, em éguas pônei com

meia-idade ou idosas.

Resultados observados por Carnevale et al.(1993), revelaram que a

concentração de LH não diferiu entre as fêmeas do grupo 1 (5 a 7 anos), egrupo 2 (15 a 19 anos), embora o grupo 3 (20 anos ou mais) apresentou uma

baixa concentração de LH durante um segundo período ovulatório, porem, a

concentração de LH foi suficiente para induzir a ovulação.

Um efeito significativo de grupo foi observado sobre o LH ao redor da

ovulação e no período periovulatório (Figura 3). Assim, a concentração de LH

em éguas jovens ao redor da ovulação foi mais elevada do que em éguas de

idade intermediária e nas idosas. Foram observados menores níveis séricos deLH ao redor da ovulação ou seja 4 dias antes do momento ovulatório, em

éguas pôneis com mais de 18 anos (JACOB,2008).

Elevadas concentrações de FSH, sem aumento na concentração de LH,

aparentam ser os sinais iniciais da idade alterando a reprodução em éguas

(SOULES et al, 2000). Estas alterações poderiam estimular uma maior

proporção de folículos primordiais a entrar neste grande pool de folículos e

acelerar a depressão da reserva de folículos primordiais (RICHARDSON etal.,1987).



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

8

O primeiro sinal da idade afetando a reprodução é o encurtamento do

ciclo estral com elevadas concentrações de hormônio folículo estimulante

(FSH), seguido de ciclos longos com intermitentes ovulações e elevadas

concentrações de FSH e LH, se cessando com a falha no crescimento folicular

com gonadotrofinas elevadas aparentemente pela falência dos ovários

(CARNEVALE et al.,2008).

LH

Dias da Ovulação-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

L H

( n g / m l )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1820

22

Jovem

Média

Velha

FSH

Dias da ovulação-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

F S H

( n g / m l )

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Fonte : JACOB, 2008

)LJXUD)6+H/+FHQWUDOL]DGRSDUDRYXODomR

Segundo Carnevale et al (1993) a redução da concentração de LH

relatada em éguas velhas pode ter sido devido ao prolongamento da fase



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

9

folicular. Diferentemente, Jacob, 2008, não encontrou aumento da fase

folicular, nem houve diferenças entre as faixas etárias quanto à fase luteal.

Jacob (2008) verificou ainda um efeito de idade sobre a taxa de

crescimento folicular envolvendo o folículo dominante. Em éguas velhas, a taxa

de crescimento folicular não diferiu das éguas de meia idade, porém foi menor

(P<0,05) que nas éguas jovens, mesmo não havendo diferenças entre ciclos

nem no diâmetro do maior folículo.

Nas éguas velhas os folículos subordinados ao redor da ovulação foram

menores do que as éguas de meia-idade e jovens (JACOB, 2008). Muitas

éguas idosas (> 20 anos) eram reprodutivamente ativas, porém, os ovários de

poucas éguas poderiam ser classificados como senescentes (Wesson &Ginther, 1981).

Estudando as diferentes classes foliculares, Carnevale et. al, (1993),

encontraram efeito de idade significativo sobre o número de folículos de 16 a

20 mm de diâmetro, bem como interação significativa para o diâmetro do maior

folículo e o número de folículos de 11 a 15 mm, sugerindo que a maior

atividade folicular ocorreu no final fase lútea para o grupo de (15 a 19 anos) em

relação aos grupos de (5 a 7 anos) e grupo (20 anos ou mais), associada aosníveis de FSH durante o meio da fase luteal.

Em outro estudo não foram observadas diferenças do número de

folículos ovarianos de 11 a 20 mm de diâmetro, quando foram comparadas das

éguas velhas e éguas jovens, durante o período periovulatório na primeira e

segunda ovulação (VANDERWALL et al., 1993).

Este autor também observou crescimento folicular mais rápido do

folículo dominante em éguas jovens (5 e 6 anos), ao redor da ovulação dequatro dias antes há quatro dias após sua ocorrência, o número de folículos

para as classes foliculares de 5,1 a 10, 10,1 a 15, 15,1 a 20 mm foi menor nas

éguas velhas. Embora observadas algumas diferenças entre os grupos etários

neste estudo, demonstrou-se que os hormônios reprodutivos e atividade

folicular são mantidos em éguas velhas (JACOB, 2008).

A literatura tem registrado falha de ovulação associada à idade. Em dois

experimentos foram documentadas que quatro éguas idosas de um grupo nãoovularam durante um período de 60 e 90 dias na estação fisiológica.



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

10

Entretanto, essas éguas tinham 29, 30, 30 e 33 anos de idade enquanto tais

falhas não foram observados no grupo de éguas jovens (VANDEWALL et al.,

1993).

2.3. Alterações da genitália externa e interna relacionadas à idade

Outros estudos relacionando o efeito da idade sobre a capacidade

reprodutiva de fêmeas têm focalizado anormalidades morfológicas do trato

genital. Dentro deste contexto, tem-se concluído que anormalidades estruturais

são mais comuns em animais idosos. Éguas velhas podem ser afetadas porproblemas reprodutivos como outros que não estão relacionados ao eixo

hipotalâmico hipofisário gonadal como má conformação na genitália externa,

patologias uterinas e tubáricas. Relata-se também que a endometrite é mais

freqüente em éguas velhas do que nas éguas jovens (CARNEVALE, 2008).

Brinsko et al., (1996), fizeram avaliações histopatológicas na ampola e

ístimo da tuba uterina de éguas não encontrando diferenças entre as faixas

etárias (velhas e jovens) nem associação entre idade e incidência de salpingite.Clinicamente anormalidades no endométrio são consideradas como

importantes fatores que resultam em baixa fertilidade em éguas velhas.

Inúmeros estudos caracterizaram mudanças degenerativas no endométrio com

o aumento da idade da égua e como conseqüência, declínio da fertilidade.

Estas mudanças incluem endometrose, endometrite e alterações vasculares

(BALL, 2000).

O sistema imune da égua sofre um declínio na sua eficiência comavançar da idade, com redução da habilidade do sistema de fornecer fagócitos,

imunoglobulinas e componentes do sistema complemento (MELO et al., 2008).

Éguas com idade avançada e susceptíveis a endometrite demonstraram

menor capacidade de limpeza uterina, acumulando fluido uterino após contato

com o espermatozóide ou inoculação bacteriana durante o estro, sendo o

principal fator relacionado à instalação da inflamação uterina (LEBLANC,

1997). O fluido pode estar presente devido a menor limpeza uterina seja



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

11

através do cérvix, ou devido à atividade diminuída dos vasos linfáticos, em

função de distúrbio no mecanismo de contração uterina (LEBLANC, 1994).

A razão da menor limpeza uterina não está bem estabelecida, mas

anormalidade miometrial, exaustão do músculo liso uterino, sinais hormonais

inapropriados controlando as contrações uterinas e conformação perineal

anormal tem sido implicada como fatores etiológicos (VANDERWALL &

WOODS, 2003).

Alterações vasculares degenerativas na parede uterina de éguas idosas

também têm sido descritas como fatores relacionados à deficiência do

mecanismo de defesa uterino, porém não está determinado se essas

alterações podem afetar o suprimento sanguíneo miometrial. A posição doútero mais voltado para o abdômen em éguas idosas pode também alterar e

prejudicar a eficiência da limpeza uterina (TROEDSSON, 1999).

As éguas mais velhas possuem uma maior incidência de degeneração e

alterações inflamatórias crônicas no endométrio. Contudo, quando

morfologicamente normais embriões em estágio de blastocisto transferidos nos

úteros de receptoras jovens e idosas não obtiveram diferenças estatísticas de

prenhez (55% vs 45% respectivamente) no dia 12 da gestação. O impacto dasalterações de endométrio, seria em períodos mais avançados da gestação

destas éguas com a maior taxa de morte embrionária nas receptoras mais

velhas (BALL, 2000).

2.4. Senilidade e qualidade de oócitos e embriões

O declínio da fertilidade em éguas velhas está bem documentadonestes últimos anos. Para as éguas jovens e idosas respectivamente, a

concepção por ciclo foi de 57% vs 31% e taxa de nascimento 82% vs 48%

segundo Madill, 2002. Outros trabalhos relacionando idade com a fertilidade se

preocuparam em estudar oócitos de éguas jovens (3-8 anos) e éguas idosas

(> 15anos) de Aguilar et al.(2002) e Losinno, (2006). A queda na eficiência

reprodutiva de éguas idosas (14 -16 anos) e os efeitos da idade da doadora

sobre a taxa de recuperação embrionária em eqüinos (grupo de maior idade >



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

12

16 anos) foram também relatados por Ball et. al, (2000) e Duarte & Vieira,

(2005).

O decréscimo da eficiência reprodutiva foi demonstrado por baixasprenhezes e menor produção de potros em éguas de idade superior a 15 anos,

e como em outras espécies existe uma relação com a falha na ovulação, pobre

qualidade do oócito e morte embrionária (LOSINNO, 2006).

As causas deste declínio em éguas idosas (acima de 20 anos),

aparentam estar relacionados com a prolongada fase folicular, ovulação

irregular, menor número de folículos, menor taxa de crescimento do folículo

ovulatório e inatividade folicular que podem finalmente levar a alterações namaturação do ovócito (CARNEVALE et al., 1993).

A qualidade do oócito é o fator primário que afeta a performance

reprodutiva em éguas e mulheres mais velhas, as causas e o momento que isto

ocorre não estão bem determinadas (SAUER et al., 1994, CARNEVALLE et

al, 2008).

A menor taxa de fertilidade em éguas idosas pode resultar da fertilização

de oócitos que não sofreram maturação meiótica adequada ou porque osoócitos de éguas idosas podem ter maior prevalência de complementos

cromossomais anormais (BRINSKO et al., 1994).

A deterioração de oócitos associados com aumento da idade foi descrita

em muitas espécies. Examinando in vitro a maturação oocitária de éguas

jovens e idosas, foi observado que oócitos de éguas idosas possuem mais

falhas na maturação para metáfase II comparado aos das éguas jovens

(BRINSKO et al., 1995).Utilizando modelos in vivo Carnevalle & Guinther,(1995), demonstraram

pela primeira vez na égua a relação entre idade cronológica e danos a oócitos

e embriões, ou seja próximo da ovulação e estágios iniciais de

desenvolvimento.

Estudos em éguas sugerem que os problemas relacionados com a

reprodução de éguas idosas ocorram no período de pré-blastocisto.

Comparando taxa de fertilização entre éguas jovens e idosas não reveloudiferenças significativas, porém mostrando tendência (p<0,1) das éguas jovens



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

13

com uma taxa maior de fertilização de 96% contra 81% das éguas idosas. As

taxas de recuperação embrionária no dia 4 pós-ovulação foram maiores no

grupo de éguas jovens contra o grupo de éguas idosas 92% contra 65%,

respectivamente. Embriões que foram recuperados e transferidos para

receptoras jovens os índices de prenhez foi de 84% para embriões das éguas

jovens e de 25% para os embriões das éguas idosas, tendo ocorrido uma

perda embrionária de 9 % nos embriões provenientes de éguas jovens contra

62% para os de éguas idosas (BALL et al, 1989). Demonstrando que

infertilidade relacionada à idade nas éguas está alterações estruturais ou

funcionais do período embrionário inicial, intra-oviduto sendo menos importante

ambiente tubárico .Carnevale et al.,(1993), descreveram uma taxa e fertilização

significativamente maior em éguas jovens versus éguas idosas no dia 1,5 pós-

ovulação (88% em éguas jovens contra 45% em éguas idosas). Estes dados se

correlacionam com as menores taxas de recuperação embrionária em éguas

doadoras jovens versus idosas (LOSINNO & ALVARENGA 2006).

Carnevale & Ginther (1995) reportando os resultados da transferência

intrafalopiana de gametas (GIFT), com oócitos coletados de folículos pré-ovulatórios, de éguas velhas (> 20 anos) e jovens (6 – 10 anos) e somente os

oócitos maduros transferidos para receptoras jovens inseminadas, observaram

menores taxas de prenhez quando transferiram os oócitos de éguas velhas

obtiveram 31% versus 92%. Confirmando assim o declínio da fertilidade com a

idade sendo o oócito um dos fatores primários de redução da fertilidade.

Existem diferenças significativas quanto ao desenvolvimento embrionário

entre os grupos etários e anomalias morfológicas observadas nos oócitos deéguas idosas. Ainda os oócitos das éguas mais velhas possuem muitas

anormalidades morfológicas como: vesícula ocupando > 50% do ooplasma,

diferentes formas, partes do ooplasma sem organelas e outras alterações

(CARNEVALE et al., 1999).

As causas dos defeitos morfológicos de oócitos de fêmeas mais velhas

não estão bem determinadas. Supõe-se que mutações no ácido

desoxirribonucléico (DNA) e a produção de espécies radioativas de oxigênio



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

14

(ROS), afetam diretamente os oócitos, assim como os danos mitocôndriais

também foram descritos (RAMBAGS et al.,2005).

Rambags et al, (2008), estudando através de PCR o número de cópias

de acido desoxirribonucléico (DNA) de oócitos e embriões provenientes de

éguas jovens (< 12 anos) e idosas (>15 anos), observaram que os embriões de

éguas jovens possuíam mais mitocôndrias do que seus oócitos, já nas éguas

idosas a quantidade de mitocôndrias não aumentou nos embriões quando

comparado aos seus oócitos, indicando um atraso na replicação mitocondrial.

Segundo Losinno (2006) as éguas velhas ovulam oócitos com

alterações morfológicas com mais freqüência com danos estruturais na

cromatina nuclear, diminuindo assim o índice de fertilidade desta categoria.Este autor comparando oócitos de éguas velhas e jovens, obtidos após recente

ovulação, obteve uma maior proporção de oócitos com citoplasma fragmentado

tendo sido estes valores de 18,5% em éguas velhas e 5,6% em éguas jovens.

Comparando o estagio de maturação nuclear (metáfase x não determinado)

obteve em oócitos de éguas jovens 71,4% metáfase (I ou II) e 28,6% não

determinado e no grupo de éguas velhas, 46,6% metáfase (I ou II) e 53,4% não

determinado.Os achados de Losinno (2006) são concordantes com os dados de

fertilidade em campo, monta natural, inseminação artificial ou transferência de

embrião, onde se encontra a fertilidade média por ciclo nestas categorias de 70

% para éguas jovens e 40% nas éguas velhas (WOODS, 1989).

Segundo Ball, (2000) após transferência do embrião, quando este se

apresenta morfologicamente normal, a taxa de prenhez na receptora não diferiu

estatisticamente (55% versus 45% dia 12) entre éguas receptoras jovens evelhas, respectivamente nos dias 12 e 28 de gestação, o impacto das

alterações uterinas seriam em períodos mais longos da gestação.

Vogelsang & Vogelsang (1989), observaram que de 624 tentativas de

coletas foram recuperados 271 embriões, gerando 159 prenhezes. Quando

subdivididos em faixas etárias no grupo das éguas de idade de 2-8 anos as

taxas foram 61% recuperação, 70 % de prenhez e 14 % morte embrionária

precoce. Por outro lado no grupo das éguas de 9-17 anos foi obtido 51%recuperação embrionária, 52% de prenhez e 24 % de morte embrionária. No



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

15

grupo das éguas velhas de 18-28 anos foram obtidos 30% recuperação

embrionária, 56% prenhez e 30 % de morte embrionária.

Duarte & Vieira (2005), também observaram que a idade da doadora

alterou as taxas de recuperação embrionária em eqüinos quando divididos em

grupos de diferentes idades, sendo 2-4 anos, 4-17 anos e >17 anos, as taxas

de recuperação obtidas foram, 81,1%, 73,2% e 53,3% respectivamente.

A literatura é contraditória quanto à possibilidade dos embriões

coletados provenientes de éguas velhas (acima 18 anos) levarem uma

gestação a termo. Onde alguns autores encontraram um índice de prenhez

similar aos 15 e 50 dias (ALONSO et al., 2005). Hunt et al, (2005) observaram

queda na eficiência reprodutiva de éguas idosas em programa de transferênciade embriões (tabela 1).

Idade Taxa de Recuperação Taxa de Prenhez Eficiência4-7 (n=30) 81,5% 64,3% 52,4%8-14(n=113) 101,6% 65,4% 66,4%15-19(n=59) 70,4% 59,1% 41,6%>20(n=10) 46,2% 54,2% 25%

Adaptado de HUNT et al. 2005

Tabela 1 – Efeito da idade da égua doadora nas taxas de recuperação

embrionária*

Um estudo demonstrou que blastocistos provenientes de éguas idosas

apresentavam menos células totais, menores escores de qualidade e tendiam a

ter menor diâmetro. Nele foram sugeridos que os defeitos de desenvolvimento

do embrião ou ambiente do oviduto podem explicar a falha no estabelecimento

da gestação em éguas idosas e subférteis (CARNEVALE et al., 1993).

Embriões de éguas velhas possuem menos blastômeros e um escore de

classificação mais pobre que os embriões de éguas jovens (BRINSKO et al.,

1994).

É consenso que o envelhecimento reprodutivo associado à idade está

relacionado a uma perda da viabilidade de oócitos e embriões. Em bovinos

entre os sinais mais evidentes está no aumento da quantidade de

ovócitos/embriões com anomalias cromossômicas, ativação partenogênica



5HYLVmRGH/LWHUDWXUD

16

espontânea, fragmentação citoplasmática associada a apoptose dos ovócitos,

polispermia, desenvolvimento anormal dos embriões e aumento da morte

embrionária precoce (ARMSTRONG, 2001).

Segundo Carnevale (2008) a idade associada às alterações de

fertilidade e atividade cíclica na égua têm a provável causa a falha na atividade

ovariana. O declínio da fertilidade está correlacionado com a redução da

viabilidade do oócito podendo ser resultado de seu tempo em estágio meiótico

nos ovários por décadas.



2EMHWLYRV

17

3. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento

com extrato de pituitária eqüina (EPE) na resposta ovariana e na eficiênciareprodutiva de éguas idosas em programa de transferência de embriões.



DWHULDOHPHWRGR

18

4. MATERIAL E MÉTODO

4.1. Período e Local do Experimento

O presente trabalho foi realizado durante a estação reprodutiva

2006/2007 e 2007/2008, mais especificamente entre os meses de setembro a

janeiro dos anos citados, nas dependências da Central de Reprodução de

Eqüinos Guilherme Gregolin Services Center Inc., localizada no município de

Tatuí, São Paulo.

4.2. Animais e Grupos Experimentais

Foram utilizadas 20 éguas doadoras de embrião da raça Quarto de

Milha, com idade entre 15 e 20 anos (média de 16,9 anos) e pesando 450 a

550 Kg. Todas as éguas utilizadas estavam em plena atividade reprodutiva.

As éguas doadoras eram mantidas em piquetes de capim coast

cross (Cynodon dactylon ) e capim-transvala (Digitaria decumbens) com acesso

a água e sal mineralizado à vontade e 2 kg de ração comercial peletizada

própria para eqüinos duas vezes ao dia.

4.3. Delineamento Experimental

Após terem sido monitoradas e inseminadas durante o estro

imediatamente anterior ao início do experimento, as éguas doadoras foram

submetidas ao procedimento de colheita de embrião no oitavo dia pós-

ovulação. Nesse mesmo dia, as mesmas recebiam, por via intramuscular, 7,5

mg de dinoprost-trometamina e eram incluídas no grupo experimental. Trêsciclos estrais consecutivos foram monitorados em todas as éguas pertencentes

ao grupo experimental, de modo que o primeiro e o terceiro ciclo estudado

serviram de controle e no segundo ciclo foram realizados os tratamentos a

base de extrato de pituitária eqüina (EPE). Dessa forma, cada animal utilizado

foi o seu próprio controle. As colheitas de embrião eram sempre seguidas da

administração de agente luteolítico.



DWHULDOHPHWRGR

19

4.3.1 Exames ultra-sonográficos

Nos três ciclos estudados, desde o dia 10 (dia 0 = ovulação) dois

dias após a colheita do embrião (dia 8), até a ovulação seguinte, as éguasdoadoras tiveram a atividade ovariana e condição uterina monitoradas

diariamente por ultra-sonografia transretal com auxílio de um aparelho

equipado com um transdutor linear de 6 a 8 MHz (Pie-Medical 485, Holanda).

Os diâmetros dos maiores folículos foram determinados por meio da média

aritmética das duas maiores distâncias transversais do antro folicular em uma

única imagem congelada no monitor do aparelho de ultra-sonografia

(GINTHER, 1995) em todos os grupos.

Os folículos foram mensurados (altura e largura) e posteriormente

desenhados em ficha própria de acordo com suas posições nos ovários, sendo

usado como referência a presença do corpo lúteo e outros folículos a fim de

manter-se a identidade dos dois maiores folículos. Quando observados mais

de um folículo dominante foi feita à média entre eles para comparações futuras.

4.3.2 Colheita de Sêmen, Inseminações e Indução das Ovulações

Sêmen proveniente de um único garanhão de fertilidade comprovada

foi utilizado para as inseminações. Após a colheita, realizada com auxílio de

uma égua em cio, por meio de vagina artificial própria para garanhões, o

sêmen era filtrado para a remoção da fração gelatinosa. A concentração

espermática era determinada com auxílio de uma câmara de Neubauer, a

motilidade espermática avaliada em microscópio de luz e o sêmen diluído na

concentração de 25 – 50 milhões de espermatozóides por mililitro (mL), emmeio diluente à base de leite desnatado Botu-sêmen (Biotech Botucatu –

Botucatu - SP)

Durante o estro, após a detecção de pelo menos um folículo com 35 mm

de diâmetro, as éguas eram inseminadas com no mínimo 1.000 x 106

espermatozóides móveis. As inseminações foram repetidas a cada 48 horas,

quando necessário, até que fosse detectada a ovulação. As ovulações foram

induzidas por meio da administração de 1 mg de acetato de deslorelina



DWHULDOHPHWRGR

20

intramuscular, mediante a detecção de pelo menos um folículo ovariano com

35 a 40 mm de diâmetro. Vale ressaltar que os protocolos de inseminação

artificial e indução das ovulações foram os mesmos para os ciclos controle e

tratado.

4.3.3 Tratamentos

Passado o ciclo controle e finalizada a colheita e a avaliação do

embrião no oitavo dia pós-ovulação, era iniciado o tratamento para indução de

ovulações múltiplas a base de extrato de pituitária eqüina (EPE). Esse

tratamento foi administrado do dia 8 até o dia anterior à indução das ovulações

por meio da administração de 1mg de acetato de deslorelina.

Os animais pertencentes ao Grupo EPE (n=20) receberam 7,0 mg

de extrato de pituitária eqüina por via intramuscular duas vezes (entre 7 e 8

horas da manhã e nova aplicação entre 5 e 6 horas da tarde) ao dia durante o

período especificado. O extrato de pituitária utilizado no presente trabalho foi

produzido no Laboratório de Reprodução Animal do Departamento de

Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ, Unesp-Botucatu, SP,Brasil, conforme descrito por GUILLOU e COMBARNOUS (1983).

4.3.4 Colheita, Manipulação e Transferência dos Embriões

Os embriões foram recuperados no oitavo dia pós-ovulação por meio

de lavagem uterina usando três litros de solução de Ringer com lactato, a 35

ºC, conforme descrito (ALVARENGA et. al., 1993). Após a identificação e

classificação quanto ao grau de desenvolvimento do embrião, o mesmo erasubmetido à dez passagens de meio e mantido por menos de uma hora em

meio de manutenção filtrado até o momento da transferência.

Os embriões foram transferidos através do método não-cirúrgico

(transcervical) para receptoras ciclantes que haviam ovulado entre 5 e 8 dias

antes da transferência. Resumidamente, os embriões eram acondicionados

entre colunas de meio de manutenção e ar no interior de uma palheta de 0,25

ou 0,5 ml e colocadas no inovulador. O inovulador era recoberto então por



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21

uma camisa sanitária plástica. Antes da transferência as receptoras tinham a

cauda enfaixada, o conteúdo fecal retirado da ampola retal e as regiões

perivulvar e perianal higienizadas. O inovulador contendo o embrião era

conduzido através da cérvix da receptora, a camisa sanitária rompida e o

embrião depositado lentamente no corpo do útero.

4.3.5 Diagnóstico de Gestação

As receptoras foram examinadas por meio de ultra-sonografia

transretal, quatro a seis dias após a transferência do embrião para se

determinar à presença ou não de vesícula embrionária.

4.4 Análise Estatística

Valores percentuais para variáveis qualitativas foram comparados

pelo teste exato de Fischer. Foi considerada diferença significativa quando

p<0,05. Variáveis quantitativas (número de ovulações e embriões por ciclo,

duração da fase folicular e crescimento médio diário do folículo dominante)

foram comparadas utilizando-se análise de variância (ANOVA) seguido quando

necessário pelo teste Tukey a 5% de significância.



5HVXOWDGRV

22

5. RESULTADOS

O percentual de éguas com múltiplas ovulações no ciclo pré-

tratamento (G1), ciclo tratado com EPE (G2) e ciclo pós-tratamento (G3) foi de5% (1/20), 65% (13/20) e 5% (1/20), respectivamente (p<0,05).Em nenhum dos

ciclos foi observado falha da ovulação ou mesmo desenvolvimento de folículos

hemorrágicos. Nos ciclos com mais de uma ovulação as mesmas aconteceram

em intervalo de tempo médio de 24 a 48 horas entre as ovulações.

O tratamento com EPE (G2) resultou em um maior número de

ovulações e embriões por ciclo (p<0.05) em comparação aos ciclos controles

no pré-tratamento (G1) e pós-tratamento (G3). Não foram contudo observadas

diferenças significativas (p>0,05) no número de ovulações entre os grupos

controle. Da mesma forma não foram encontradas diferenças significativas

quando comparado o número de embriões recuperados por ovulação entre G1,

G2 e G3 (p>0,05). O número de ovulações por égua foi significativamente

superior nos ciclos tratados com EPE (G2) quando comparados aos obtidos

nos grupos controle (G1 e G3). O tratamento com EPE também resultou em um

maior número de embriões recuperados por égua por ciclo (p< 0,05) emcomparação aos controles (G1 e G3). Os resultados estão sumarizados na

tabela 2 e particularizados nas tabelas 3 e 4.

Tabela 2 : Número médio de ovulações por ciclo, número médio de embriões

por ciclo e número médio de embriões por ovulação.

Pré-Tratamento

(G1)

Tratamento

(G2)

Pós-Tratamento

(G3)

Ovulações/ciclo 1,05 ª 1,8 b 1,05 ª

Embriões/ciclo 0,45 ª 1,0 b 0,4 ª

Embrião/ovulação 0,4 ª 0,6 ª 0,4 ª



5HVXOWDGRV

23

Tabela 3: Número de ovulações por égua no ciclo pré-tratamento, ciclo tratado

com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo pós-tratamento.

Animal Pré Tratamento Tratamento Pós Tratamento

01 1 1 1

02 1 2 1

03 1 3 1

04 1 1 1

05 1 3 1

06 1 2 1

07 1 1 1

08 1 2 1

09 1 2 1

10 1 2 2

11 1 2 1

12 1 2 1

13 1 1 1

14 1 2 1

15 1 3 1

16 2 1 1

17 1 2 1

18 1 1 1

19 1 1 1

20 1 2 1

1,05 ª 1,8 b 1,05 ª



5HVXOWDGRV

24

Tabela 4: Número de embriões recuperados por égua no ciclo pré-tratamento

(G1), no ciclo tratado com EPE (7 mg b.i.d) e no ciclo pós-tratamento (G3).

Animal Pré-Tratamento Tratamento Pós-Tratamento

01 0 0 0

02 0 1 1

03 0 0 1

04 1 1 0

05 0 0 0

06 0 1 0

07 1 1 0

08 1 1 1

09 0 2 1

10 0 2 1

11 1 2 0

12 0 1 1

13 0 1 0

14 0 2 0

15 1 2 1

16 2 0 0

17 1 1 0

18 0 0 0

19 0 0 0

20 1 2 1

0,45 ª 1,0 b 0,4 ª



5HVXOWDGRV

25

Os ciclos que não se obteve embrião recuperado ou lavado negativo

foram de 60% (12/20), 30% (06/20) e 60% (12/20) nos grupos G1, G2 e G3

respectivamente, mostrando tendências de significância do grupo tratado com

EPE em relação aos grupos controle (p=0,11). Quando agrupamos os grupos

controle (G1 + G2) em comparação ao grupo tratado com EPE (G1) obtivemos

uma diferença significativa de lavados negativos (p<0,05) dos grupos controle

60% (24/40) contra 30% (6/20) do grupo tratado.

Conforme mostra a tabela 5, o tratamento com baixa dose de EPE

(G2) resultou em um encurtamento da fase folicular (diminuição do número de

dias) da aplicação da prostaglandina (D8) até 1 dia antes da ovulação (p< 0,05)diferindo do ciclo controle pós-tratamento (G3). Mas não houve diferença

significativa entre o grupo tratado (G2) e o grupo pré-tratamento (G1).

Tabela 5: Média em dias da duração da fase folicular da aplicação da

prostaglandina (D8) até a ovulação por égua nos grupos G1, G2 e G3.

Pré- Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3)

10,2 ± 1,7 ab 9,4 ± 1,9 a 10,9 ± 1,4 b

Não foram observadas diferenças estatísticas (p>0,05) quanto ao

crescimento folicular médio (mm) do folículo dominante do dia D10 até oum dia

antes da ovulação nos diferentes grupos. Tendo sido de 19,7 ± 6,3 mm, 21,4 ±

5,4 mm e 22,9 ± 4,5 mm, os valores médios de crescimento para G1, G2 e G3.

Da mesma forma não foram observadas diferenças significativas, havendo

contudo tendência à significância (p=0,1) á ser maior a taxa de crescimento

diário do folículo dominante no grupo tratado. Onde observamos uma taxa de

crescimento médio diário de foi de 2,5 ± 0,7 mm, 2,8 ± 0,6 mm e 2,6 ± 0,4 mm

no G1, G2 e G3 respectivamente. Em 40 % (8/20) dos ciclos tratados com EPE

e 15 % (6/40) dos ciclos não tratados observou-se crescimento folicular médio

diário a 3mm (p<0,05).



5HVXOWDGRV

26

O tratamento com baixa dose de EPE resultou em um maior número

de embriões (p<0.001) oito dias após a ovulação com grau de desenvolvimento

condizente com idade gestacional em D8 (blastocistos ou blastocistos

expandidos) ou mórulas e blastocistos iniciais em D6 nas ovulações

assincrônicas nas éguas com múltiplas ovulações. Por outro lado não foram

observadas diferenças significativas no grau de desenvolvimento dos embriões

recuperados entre os grupos controle (Tabela 6).

Tabela 6: Condizência entre o estágio de desenvolvimento para cada

embrião recuperado e o dia da recuperação (D8 do ciclo), no G1, G2 e G3.

Grau de

Desenvolvimento

Pré-Tratamento

(G1)

Tratamento

(G2)

Pós-Tratamento

(G3)

Não Condizente 44,45%(4/9) ª 0%(0/20) b 75%(6/8) ª

Condizente 55,55%(5/9) ª 100%(20/20) b 25%(2/8) ª

Conforme mostra a tabela 7, o tratamento com baixa dose de EPE

(G2) não foram observadas uma maior taxa de prenhez (70 %), quando

comparado aos grupos controle no pré-tratamento (G1) e pós-tratamento (G3),

55,5% e 50% respectivamente (p=0.07). Não houve diferenças significativas

(p>0,05) do número de prenhezes obtidas pelos embriões recuperados do

grupo tratado com EPE (G2) em comparação aos controles (G1 e G3).

Tabela 7: Taxa de prenhez obtida por embriões recuperados no G1, G2 e G3

Pré-Tratamento (G1) Tratamento (G2) Pós-Tratamento (G3)Prenhez 55,5% (5/9) ª 70,0%(14/20) ª 50,0%(4/8) ª

Conforme mostra a tabela 8, no tratamento com EPE foram

observadas diferenças significativas (p<0,01), para melhoria da taxa de

prenhez por tentativa de transferência de embrião em comparação aos

controles no pré-tratamento e pós-tratamento.

Tabela 8: Taxa de prenhez por ciclo obtidas no G1, G2 e G3.



5HVXOWDGRV

27

Pré-Tratamento

(G1)

Tratamento

(G2)

Pós-Tratamento

(G3)

Prenhez/Ciclo 25% (5/20) ª 70%(14/20) b 20%(4/20) ª

A eficiência do programa (taxa de recuperação embrionária x taxa de

prenhez) entre ciclos tratados e ciclos não tratados foi de 21.8% ( 42% x 52%)

para os grupos controle (G1 e G2) e de 70% (100% x 70%) para o grupo

tratado (G2) com diferença significativa (p<0,05).

A taxa de morte embrionária precoce aos 50 dias nas éguas tratadas

com EPE (G2) foi de 7,1% (01/14), não diferenciando ( P>0.05) dos grupos

controle que foi de 20% (01/05) no G1 e 0% (0/04) no G3.



'LVFXVVmR

28

6. DISCUSSÃO

No presente trabalho o tratamento com EPE foi capaz de estimular

com eficiência a atividade ovariana em éguas idosas cíclicas, onde opercentual de éguas com múltiplas ovulações no ciclo tratado com EPE (G2) foi

de 65% (13/20) enquanto os grupos controles no pré e pós-tratamento foram

de 5% (1/20) e 5% (1/20) respectivamente. Valores diferentes, mais altos, são

relatados por autores como Douglas (1979) que relatam 75% de resposta nas

éguas com tratamento superovulatório, Farinasso (2004) descreve uma

porcentagem de 76,9% de múltiplas ovulações utilizando doses de 4 e 6 mg

uma vez ao dia de EPE em éguas ciclantes e Carmo (2007) 84% de resposta eoutro valor mais baixo como de 30,8% Rocha Filho (2004) estes trabalhos

foram realizados com éguas jovens e férteis. Em nenhum dos ciclos dos grupos

controle ou grupo tratado foi observado falha da ovulação ou mesmo

desenvolvimento de folículos anovulatórios, o que seria esperado segundo

alguns autores tanto para éguas superovuladas, (DIPPERT et. al, 1994; LAPIN

& GINTHER, 1997) como em éguas idosas (NEWCOMBE et al.,1997; McCUE

& SQUIRES, 2002).No presente trabalho obtivemos em média 1,0 embrião por ciclo,

média superior aos grupos controle que tiveram 0,45 e 0,4 embrião por ciclo. A

média do grupo tratado foi muito próxima ao obtido no experimento

desenvolvido por Carmo et. al, (2003) trabalhando com superovulação em

éguas jovens, que obteve em média 1,1 embrião por ciclo , havendo contudo

este autor utilizado uma dose mais alta de EPE (25 mg a cada 12 horas) que a

do presente trabalho onde este autor obteve uma taxa de recuperaçãoembrionária por ovulação de 30%, mais baixa que a do presente experimento.

Outros trabalhos com múltiplas ovulações relatam a recuperação de

aproximadamente 1 a 2 embriões por ciclo (DOUGLAS, 1979; WOODS &

GUINTER, 1984; McCUE, 1996, MACHADO, 2003; FARINASSO, 2004).

Considerando à média de recuperação embrionária do grupo controle (0,45 e

0,4) pode-se verificar que estas foram menores que as médias esperadas (0,6

embriões/ciclo) em programas de transferência de embriões segundoAlvarenga et. al, (2008) e de 0,7 reportada por Hunt et. al, (2005) em éguas de



'LVFXVVmR

29

15 – 19 anos e similares às reportadas por Vogelsang & Vogelsang, (1989) que

obteve 51% de recuperação em éguas de 9-17 anos. Contudo superior as

relatadas por Fleury et al, (1989), relatando uma taxa de 24,1 % em éguas com

mais de 18 anos.

Analisando o número de embriões recuperados por ovulação

obtivemos 0,4 (40%) nos grupos controle e 0,6 (60%) no grupo tratado, o que

não diferiu significativamente . Estes dados são similares aos descritos por

Woods & Ginther (1984) em éguas jovens tratadas com EPE para múltiplas

ovulações onde relataram uma taxa de 0,6 e 0,7, no grupo tratado e no grupo

controle, respectivamente. Mas superiores quando comparados aos trabalhosde Alvarenga, (2001); Scoggin et al, (2002); Carmo et. al., (2003); Machado et.

al, (2003), onde obtiveram 49%, 43,2%, 30,2% e 26% respectivamente.

Estando de acordo com o trabalho de Carmo et. al., (2005) que observou ser

maior taxa de recuperação por ovulação em éguas com menos de 3 ovulações

por ciclo.

Comparando os lavados que não recuperaram embriões, ao

agruparmos os grupos controle (G1 + G3) em comparação ao grupo tratadocom EPE (G2) obtivemos 60% (24/40) de lavados negativos nos grupos

controle contra 30% (6/20) no grupo tratado diferindo estatisticamente. As

éguas do grupo tratado tiveram uma taxa de lavados negativos similares ao

reportado na literatura para éguas não superovuladas reprodutivamente jovens

e normais. E inferiores aos dados apresentados por Farinasso (2004) no

trabalho com múltiplas ovulações em éguas jovens que obteve 45% de lavados

negativos e Machado et al (2003) 70% de lavados negativos. Mas superioresao trabalho de Adans et al (1993) que obteve 24% de lavados negativos em

éguas jovens.

Das reprodutoras analisadas no presente trabalho, quatro delas

(número 01,05,18 e 19) não obtivemos nenhum embrião coletado, mesmo com

o tratamento. Estas éguas também não foram responsivas as doses de 7 mg

b.i.d de EPE, suas idades são de 15, 18, 19 e 19 anos. Sugerindo que outros

fatores ligados à infertilidade como obstrução tubárica, conforme relatado por



'LVFXVVmR

30

Allen (2008), desta forma o transito dos gametas e /ou embriões estarão

impossibilitados por um aspecto mecânico.

Os dados na literatura são variados quando avaliado o período emdias entre a aplicação de prostaglandina até a primeira ovulação. No presente

trabalho o tempo decorrido entre a aplicação de prostaglandina e primeira

ovulação observada foi de 9,4 dias para o grupo tratado com EPE, e de 10,2 e

10,9 dias nos grupos controle pré (G1) e pós-tratamento (G3) respectivamente.

Farinasso (2004) observou intervalo de tempo inferior ou seja de 7,4 dias no

tratamento com 4mg e 5,6 dias com 6mg, resultados semelhantes a Dippert et.

al, (1994) que relataram 7,0 dias, trabalhos estes que selecionaram de acordocom a população de folículos ovarianos (menores que 25 mm), para as éguas

jovens tratadas e um período de 8,3 dias de Alvarenga et. al, (2001). Entretanto

outro trabalho relata um período mais longo de 10,2 dias de Rosas et al (1998).

Em ciclos não estimulados exogenamente a maioria dos autores relata uma

média de 9 dias entre aplicação de prostaglandina na fase intermediaria do

diestro e ovulação, valor este que não difere dos obtidos no presente trabalho.

Analisando o crescimento folicular médio (mm) do folículo dominantedo dia D10 até 1 dia antes ovulação nos diferentes grupos obtivemos 19,7 mm,

21,4 mm e 22,9 mm os valores médios de crescimento para G1, G2 e G3, não

foram observadas diferenças significativas entre eles, quando observado dois

ou mais folículos era feita à média entre eles.

Da mesma forma não foram observadas diferenças significativas,

havendo contudo tendência à significância (p=0,1) nas médias de crescimento

diário do folículo dominante nos diferentes grupos que foram de 2,5mm, 2,8

mm e 2,6 mm no G1, G2 e G3 respectivamente.. As taxas de crescimento

folicular nos trabalhos com múltiplas ovulações mostraram-se dentro da faixa

de variação também observadas por outros autores como: variações de 2,6

mm em média obtidos por CARMO, (2007) 2,1 mm em éguas Pôneis

(PALMER, 1993) e 3,0 mm observados por Ginther (1986) em éguas não

superovuladas e 2,25 mm/dia relatado por (GINTHER et al, 1992 e MACHADO,

2003) também em éguas não tratadas.



'LVFXVVmR

31

Quando analisado individualmente foi observado no grupo tratado

com EPE um maior percentual de éguas com folículos com taxa de

crescimento igual ou maior a 3,0 mm (40% x15%). Jacob, (2008) observou que

nos 4 dias anteriores a ovulação a taxa de crescimento do folículo dominante

das éguas jovens se aproximou de 3,0 mm por dia tendo sido superior as taxas

de crescimento folicular observadas em éguas de meia idade (2.5 mm/dia) e

idosas (2.1 mm/dia).

Observamos que o tratamento com baixa dose de EPE resultou em um

maior número de embriões aos oito dias após a ovulação com grau de

desenvolvimento compatível com idade gestacional em D8 (blastocistos oublastocistos expandidos) ou mórulas e blastocistos iniciais em D6 nas

ovulações assincrônicas nas éguas com múltiplas ovulações. Um atraso no

desenvolvimento de até 36 horas é esperado nos embriões de éguas velhas

em relação aos embriões de éguas jovens (CARNEVALE et al, 1993). Este

atraso no desenvolvimento embrionário pode ser consequência de defeitos

intrinsicos nos embriões, meio de desenvolvimeto pobre na tuba uterina e/ou

útero e inseminação pós-ovulatória (GUINTER,1992). Brisnsko et al (1996)

observaram um atraso no desenvolvimento embrionário após realização de

fertilização in vitro em oócitos de eguas idosas, demostrando ser o fator

qualidade do oócito implicado no retardo do embrião. Ball et. al, (1989)

corroborando com esta linha de raciocinio observou que fatores inerentes a

formacao o embrião são mais importantes que o ambiente tubarico no que diz

respeito a perda embrionaria na fase tubarica.

Rambags et. al, (2008), observaram que os embriões de éguas jovens

(<12 anos) possuíam mais mitocôndrias do que seus oócitos, já nas éguas

idosas (>15 anos) a quantidade de mitocôndrias não aumentou nos embriões

quando comparado aos seus oócitos, indicando um atraso na replicação

mitocondrial. Observamos no presente trabalho que em 58.8% dos embriões

recuperados nos grupos controle estavam com desenvolvimento não

condizentes como D8, atrasados, ou seja eram mórulas ou blastocistos iniciais.

Entretanto ao tratar estas éguas com EPE este atraso não foi verificado em



'LVFXVVmR

32

100% dos embriões, sugerindo que o EPE teve um efeito na maturação deste

oócito e transporte mais rápido deste embrião ao útero.

A taxa de prenhez por ciclo dos embriões coletados foi de 25%

(5/20) no G1, 70% (14/20) no grupo tratado com EPE (G2) e 20% (4/20) no G3.

Se compararmos a taxa de prenhez por ciclo nas éguas idosas temos uma

média de 32% de prenhez (Vanderwall,1989), um pouco acima do grupo

controle mas muito inferior ao grupo tratado com EPE.

A taxa de prenhez por embrião transferido das éguas tratadas com

EPE (G2) foi de 70 % (14/20), mostrou tendência (p=0.07) em ser superior nos

ciclos tratados diferenciando do grupo controle que foi de 55,5% no G1 e 50%no G3. Autores demonstraram que a taxa de prenhez de embriões de éguas de

15 - 19 anos foi de 54,2 % citado por HUNT et al (2005), 52 % em éguas 9 - 17

anos e 56% em éguas de 18-28 anos citado por Vogelsang & Vogelsang

(1989), 65% em éguas de 10 – 18 anos, citado por Carnevale et. al.,2000.

Valores semelhantes foram encontrados no presente trabalho nos grupos

controle G1 e G3 com idade de 15 -20 anos. Os embriões com estágio mais

lento de desenvolvimento, menores que esperados e estágios iniciais de

desenvolvimento no dia 7 ou 8 (D7 ou D8) resultam em taxas menores de

prenhez após inovulação (CARNEVALE et al., 1993). Entretanto ao

compararmos a taxa de prenhez por embrião do grupo tratado com EPE (G2)

de 70% foi superior ou semelhante à literatura às taxas de prenhezes de

embrião de doadoras jovens não tratadas, como 67,7 % em éguas de 2 – 9

anos (CARNEVALE et al, 2000), 65,4% nas éguas de 8 – 14 anos (HUNT et al,

2005) e com a taxa média de prenhez em programas de transferência de

embrião de 60% (ALVARENGA et al,2008) e 70% (SQUIRES & SEIDEL, 1995).

A eficiência do programa, ou seja, a relação entre a taxa de prenhez

e taxa de recuperação embrionária foi superior nas éguas tratadas com EPE

(70%) quando comparadas as não tratadas (21.8 %), demonstrando que o uso

do EPE em baixas doses beneficia altamente as éguas na faixa etária do

presente experimento (15 a 20 anos).



'LVFXVVmR

33

No que diz respeito às taxas de perda embrionária precoce (até 50

dias) os resultados não diferiram entre os grupos. Reafirmando os achados de

vários autores (FLEURY et al, 1989; ALONSO et al, 2005) os quais observaram

taxas similares de perda embrionária entre éguas idosas e jovens após TE

para o útero de receptoras reprodutivamente saudáveis. Contudo contradizem

os resultados de Carnevale et al,(2000) que observaram uma taxa de perda

embrionária de 20,5% em embriões de éguas idosas transferidos contra 13,3%

em éguas jovens e Vogelsang & Vogelsang (1989), 24% em éguas de 9 - 17

anos e 14 % em éguas de 2 - 8 anos.



&RQFOXV}HV

34

7. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente experimento permite concluir que

a administração de Extrato de Pituitária Equina em éguas idosas doadoras deembriões:

1- Interferiu positivamente na dinâmica de crescimento do folículo dominante e

codominante

2- Aumentou a incidência de multiplas ovulações

3- Incrementou a da taxa de recuperação embrionária por ciclo

3-Propiciou a recuperação de embriões em fase de desenvolvimento mais

condizente com a idade do embrião no D8

4- Melhorou a eficiência reprodutiva das doadoras tratadas.



5HIHUHQFLDV

35

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