Biotecnologia no Melhoramento

de Plantasde Plantas

PLANTAS TRANSGÊNICAS

02/09/2013

Sumário

• Algumas definições

• Objetivo da transformação gênica

• Como fazer uma planta transgênica?

• Aplicações

Algumas definições

• Transformação genética: é a transferência (introdução) de uma sequência de DNA (ou mais especificamente um gene) em um organismo sem que haja a fecundação ou o cruzamento.

• Transgênico: organismos transformados geneticamente.

Ex: Vegetais - plantas transgênicas.

• Denominação geral : Organismos Geneticamente Modificados (OGM)

Objetivo da transformação gênica

Introduzir um transgene em um organismo,

por meio da engenharia genética ou da

tecnologia do DNA recombinante, de tecnologia do DNA recombinante, de

forma que ele se expresse, seja estável e

herdado pelas progênies do indivíduos

Como se faz uma

planta transgênica?planta transgênica?

Passos necessários para transformação

• Identificação , isolamento e caracterização do gene desejável (doador)

• Construção do cassete de expressão e clonagem

• Transferência desse gene para dentro da célula vegetal

• Integração desse gene ao genoma da planta

• Regeneração e seleção das células transformadas

• Expressão do gene introduzido nas plantas

• Transmissão do gene introduzido de geração em geração

Estrutura molecular do gene

O que: Final do geneOnde: O que:Proteína bacteriana

Absorção de Fe

Síntese açúcar

Final do geneOnde:Folhas

Raiz

Quando:Início da germinação

Ataque de insetos

Quanto:Muito

Pouco

Lembrando: Expressão de um gene

Construção do cassete de expressão

Cassete de expressão: contém o promotor, região Cassete de expressão: contém o promotor, região

codificante e terminadora

Pode conter outros elementos reguladores

Construção do cassete de expressão

Construção do cassete de expressão http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB209952.1

Região promotora 35S do vírus do mosaico da

couve flor

Peptídeo de trânsito de Petúnia

Gene que codifica a proteína EPSPS que confere

resistência ao herbicida

Sequência de DNA presente na soja RR (RoundupReady).

Região terminadora do gene da nopalina sintase

(NOS)

Cassete contendo gene de interesse + regiões promotoras + terminadoras + genes de seleção

Região promotora

Região terminadoraRegião terminadora

Transferência do gene para dentro da

célula vegetal

• Transformação indireta: mediada por

Agrobacterium tumefaciens

• Transformação direta: bombardeamento

(biobalística)

Transferência do gene para dentro da célula vegetalModelo esquemático de transformação direta

(bombardeamento) e indireta (Agrobacterium).

Transformação mediada por

Agrobacterium tumefaciens

• Método mais utilizado em dicotiledôneas e algumas

monocotiledôneas

• Bactéria gran-negativa (-)

• Plasmídeo Ti• Plasmídeo Ti

• T-DNA ou DNA de transferência

- natureza: produção de substâncias que servirão de

alimentos para o patógeno e levarão a célula a se

multiplicar

• Formação de tumores (galhas)

O plasmídeo Ti de Agrobacterium

Modelo da Interação Molecular Mediado por Agrobacterium naTransformação Genética das Células da Planta.

Tzfira and Citovsky – Cell Biology vol 12 N°.3 March 2002

O plasmídeo Ti manipulado

Transformação mediada por

Agrobacterium tumefaciens

• Vantagens de ser natural, apresentar alta

probabilidade de integração do gene e a

transferência de um pequeno número de

transgenestransgenes

• Desvantagens: dependente da suscetibilidade

do vegetal a infecção por Agrobacterium

http://www.youtube.com/watch?v=4EWmvSh_bAQ

http://www.youtube.com/watch?v=TMrUaswOICA

Transformação por bombardeamento

• Método mecânico de transformação

• Utilizado em espécies não infectadas por Agrobacterium

(cereais)

• Consiste em acelerar uma macropartícula carregada de • Consiste em acelerar uma macropartícula carregada de

milhões de microesferas de tungstênio ou ouro revestidos

com DNA exógeno em direção às células a serem

transformadas

Transformação por bombardeamento

• Vantagem : permite a transformação de células, tecidos e espécies de forma direta, simples e rápida, sendo aplicável para transferência de genes a espécies nas quais os outros métodos são falhos

• Desvantagem: integração de múltiplas cópias; fragmentação dos genes em diferentes posições no genoma, podendo alterar ou silenciar a expressão dos genes exógenos

http://www.youtube.com/watch?v=oIpnGbYyT_Q

http://www.youtube.com/watch?v=nxjIbBiudp0

Seleção e regeneração das células

transformadastransformadas

09.09.2013

Seleção utilizando marcadores de

seleção ou seleção negativa

– Permite o crescimento preferencial da célula transformada na presença do agente seletivo eliminando a não-transgênica.

�Tipos:

� Antibióticos: gene nptII – resistente a canamicina

� Herbicidas: gene ESPS sintase - glifosato

: gene bar - imidazolinona

Marcadores de seleção

Genes repórteres ou seleção positiva

• Separar de forma precoce as plantas transformadas das não transformadas, neste caso não há eliminação das plantas não transformadas.

- GUS (b-glucuronidase)

- confere à célula transgênica capacidade de produzir citocinina e se desenvolver mais rapidamente que as não-transgênicas

Genes repórteres

Esquema das etapas de seleção e

regeneração de plantas transgênicas.

Transformação

Como sei que a minha planta foi

transformada?• Testes dos organismos transformados

Análise molecular via PCR (Polymerase Chain Reaction)

utilizando primers específicos para o cassete de expressão

Antes da liberação e

utilização comercial

do organismo

geneticamente

modificado, é

importante conhecer

e certificar a sua

biossegurança.

Aplicações

• Características de Produção – “Input”

– visam redução de custo de produção

– resistência à doenças, pragas ou herbicidas

– “performance” – produtividade

• Características de Consumo – “Output”

– acrescentam valor

– melhor qualidade protéica

– novas cores, formas e tamanho

– melhor conservação pós-colheita

• Soja Roundup Ready:

– glifosato (Round up™)

– gene EPSPS-CP4

– bactéria Agrobacterium tumefaciens

Aplicações

– bactéria Agrobacterium tumefaciens

• Milho LibertyLink®:

– glufosinato (Basta®)

– gene PAT - bactéria Streptomyces hygroscopicus

Tecnologia Roundup Ready

Aplicações

• Resistentes a insetos: ordem Lepidoptera– introdução do gene Cry1A(b)

• bactéria Bacillus thrurigienses

– algodão (Bollguard®) e milho (Yieldguard®)

• Eventos combinados– resistência a insetos das ordens Lepidoptera e Coleoptera– resistência a insetos das ordens Lepidoptera e Coleoptera

– resistência a insetos e herbicidas

• Resistência ao vírus da mancha anelar– Mamão

• Resistência ao vírus do mosaico dourado – Feijão

Resistência ao vírus da mancha anelar

Milho Bt (insetos)

Transgênico Convencional

Genes de resistência a insetos expressos em plantas GM

Tipo de Gene Proteína Ordem

Microorganismos Cry endotoxinas de Bt Lepidoptera/Coleptera

Proteína vegetativa inseticida – vip Lepidoptera

Isopentyl transferase (ipt) Lepidoptera/Homoptera

Coleterol oxidase Lepidoptera/Coleptera

Helicoverpa armigera stunt virus Lepidoptera

Plantas Inibidores de serino protease Lepidoptera/Coleptera

Inibidores de cisteíno protease Coleptera/ HomopteraInibidores de cisteíno protease Coleptera/ Homoptera

Inibidores de Amilase Lepidoptera/Coleptera

Lectinas Coleptera/Homoptera/Lepidoptera

Peroxidases Lepidoptera/Coleptera/Homoptera

Quitinases Homoptera

Tryptophan decarboxylase (TDC) Homoptera

Animais Quitinases (insetos) Lepidoptera

Biotin binding proteins (avidin) Coleoptera/Lepidoptera

Aumento do Volume de Madeira em Pinus

Resistência ao frio em Eucalipto

Não transgênico

TransgênicoTransgênico

�Gene CBF•Induz rota metabólica para proteção ao frio

Aplicações - output

• Tomate Flavr Sarv.

– gene antisenso da poligalacturonase

– retarda o amadurecimento

• Arroz dourado– alta produção de betacaroteno

• (provitamina A)

Melhoramento Convencional x BiotecnologiaMelhoramento Convencional x Biotecnologia

Melhoramento Convencional

Planta Doadora Material Comercial

Novo Material Comercial

“Linkage drag”

Uso de transformação de plantas

Organismo doador

Material Comercial

Novo Material Comercial

Caráter de interesse

Vantagens dos transgênicos x convencionais

� Redução do tempo para obtenção de novas cultivares;

� Precisão – transferência apenas dos genes desejáveis;

� Características podem ser introduzidas de uma única vez sem � Características podem ser introduzidas de uma única vez sem

complicações de genes extras por retrocruzamento;

� Transferência de genes entre organismos filogeneticamente

diferentes;

Perspectivas para 10 anosPerspectivas para 10 anos

• Economia 133,95 bilhões de litros de água na lavoura

• 3 milhões de pessoas poderão ser atendidas

• 21,8 milhões de árvores serão preservadas

• Redução na emissão de 2,96 milhões de toneladas CO2

equivale a retirada de 465 mil carros da ruaequivale a retirada de 465 mil carros da rua

• Economia de 1,11 bilhão de litros de combustível

• Redução 127 mil ton. de ingredientes ativos

• Economia de US$8 bilhões em custo de produção até 2020

• Aumento de produção / área