bioprospecÇÃo de extratos metanÓlicos de … · “confia no senhor e faze o bem, assim...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

BIOLÓGIAS

DAYANNE LOPES GOMES

BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS METANÓLICOS DE

MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO

NORTE: AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTICOAGULANTE,

ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA.

NATAL 2012

DAYANNE LOPES GOMES

BIOPROSPECÇÃO DE EXTRATOS METANÓLICOS DE

MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO

NORTE: AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTICOAGULANTE,

ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA.

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Biológicas da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre

de Oliveira Rocha.

NATAL 2012

Dedico esta obra

Aos meus filhos Helena e Heitor, pois com eles aprendi o que é amar incondicionalmente. Meus filhos foram força e incentivo para que eu nunca desistisse e pudesse, um dia, servir de exemplo e orgulho. Quando somos sós a conclusão de um mestrado pode parecer apenas mais uma conquista pessoal, mas com

filhos uma coisa que para muitos pode ser relativamente simples se torna algo de proporções imensas e vocês me permitiram viver isso.

Ao meu marido Leonardo por ter me dado os melhores presentes da minha vida, meus filhos.

Dedico esta obra

A Jailma (amigaannn), mais do que amigas, uma pessoa que fiz questão que entrasse na minha família na figura de madrinha de Heitor. Minha escolha não poderia ter sido outra sendo você a pessoa que é - não

importa o momento, não importa o milagre ou a dor, seja qual for o caminho. Por você eu faria isso mil vezes!

"Pode ser que um dia o tempo passe... Mas, se a amizade permanecer, Um de outro se há-de lembrar.

Pode ser que um dia nos afastemos...

Mas, se formos amigos de verdade, A amizade nos reaproximará.

Pode ser que um dia não mais existamos...

Mas, se ainda sobrar amizade, Nasceremos de novo, um para o outro.

Pode ser que um dia tudo acabe...

Mas, com a amizade construiremos tudo novamente, Cada vez de forma diferente.

Sendo único e inesquecível cada momento Que juntos viveremos e nos lembraremos para sempre.

Há duas formas para viver a sua vida:

Uma é acreditar que não existe milagre. A outra é acreditar que todas as coisas são um milagre."

Albert Einstein

Dedico esta obra

Ao meu orientador Hugo/amigo/profi, chamando você de Profi certa vez fui confundida quando falava

sobre você e acharam que me referia ao professor Carl P. V.Dietrich. No momento não entendi, mas hoje

posso tranquilamente dizer que você não é só o meu profi e sim “O prof”. Uma pessoa que não mede esforços

em nos ajudar quando precisamos e o mais importante, acredita no que podemos fazer. Obrigada

principalmente pela paciência e confiança depositada, espero ter retribuído de alguma forma com esse

trabalho.

AGRADECIMENTOS

“Confia no Senhor e faze o bem, assim habitarás a terra, e te alimentarás em segurança; Deleita-se também

no Senhor; e Ele te concederá o que deseja o teu coração; Entrega o teu caminho ao Senhor; confia Nele, e

Ele tudo fará.” Salmos 37: 3-5. Obrigada meu Deus!

Ao meu marido Leonardo, um menino que caiu de paraquedas na minha vida. Juntos estamos crescendo e

amadurecendo, assim como nosso amor;

Aos meus filhos, que são o tic-tac do meu coração. Que Deus caminhe sempre ao lado de vocês, e me guie

para passar todos os ensinamentos necessários para vida;

Aos meus pais, Cyreneu e Célia, por se esforçarem, a vida inteira, para que conseguíssemos alcançar nossa

maior riqueza e herança: os estudos. E, por sempre torcerem muitas vezes sem nem entender qual o motivo

exato, mas que seja para nossa felicidade;

Aos meus irmãos, Dastaev, Dmitryev, Drielle e Dmetryus. A gente briga, a gente chora, mas a gente se ama!

Sei que posso contar com vocês sempre;

Aos meus compadres e comadres, em especial França por oferecer “amor de graça” a nós e principalmente a

meus filhos, me ajudando para que eu mantenha minha jornada diária de trabalho;

A toda família Medeiros Rocha, em especial à tia Marly e minha sogra Ceiça, que sempre exaltaram a importância das conquistas acadêmicas e participaram ativamente na conclusão dessa dissertação;

À toda família Biopol, desde os que são a “lenda viva” Ivan (quero muito bem!); a velha guarda que foi

quem me introduziu na pesquisa no laboratório e que me ensinou a base de ser um pesquisador, Sara (minha

companheira de viagens, uma das mentes mais brilhantes que conheço), Marianiiinha (muito dedicada a tudo

que faz. Teve dúvida? Pergunte a quem sabe! Quer viajar? É com ela também!), Leandro (sempre objetivo e

determinado); as pessoas da minha época de entrada, Amigan (que me ajudou de todas as formas possíveis e

imagináveis), Rafildo (É um fofonildo! Quebrou muitos galhos, ou árvores inteiras?kkk), Leonardo (o ex-

gordinho mais TDB e engraçado. Eu tinha que casar com um Léo, né?), Citnhia (me ajudou muito na

realização desses experimentos o que nos proporcionou grande aproximação e identificação entre nós),

Ruthiin (juntas, juntas a gente nunca fez nada, mas sempre me ajudou! Te curto!) Rafa e Ruth ( se eu fosse

pagar todas as consultorias que pedi, vocês já tinham se casado. Valeu!), Raniere (ainda bem que “Só a

vitória interessa!” é passado), Gabriel (com seu mundinho engraçado, sempre prestativo) Arthur (minha

parêa de cantigas); a nova geração, Fernando (as tardes são mais empolgantes com suas músicas), Max (só

de jogar basquete já gostei), Vinícius (uma pessoa polinômia, digamos), Joanna (apesar de não ter convivido

no lab mas sempre nos demos bem e fico muito feliz por meus filhos fazerem parte do seu casamento), Letícia

(esforçada em crescer), Karol (me acompanhou e me ajudou quando entrou no lab, espero ter conseguido te

animar e não traumatizar, na pesquisa), Moacir (entende de tudo um pouco), Daniel (a tecnologia em

pessoa), Ronny Von, ops, Lucas (um gentleman, você vai longe!), Ingrid (pela torcida na qualificação), Dani

(com seus doces o trabalho é mais produtivo!), Ana Karina (muito decidida) e Pablo, Almino, Monique (cada

vez se soltando mais), vocês sem dúvida fazem parte desse trabalho!

Ainda duas pessoas que foram muito importantes para o meu aprendizado na vida e laboratório mas que não

estão mais em nosso cotidiano, Ned e Popó (Diego);

A minha banca de qualificação: Vanessa de Paula Soares e Josélio Maria Galvão, a contribuição e

reconhecimento de vocês foi muito importante;

A professora Tatjana de Souza e Francisco Freire pela disposição na utilização do citômetro de fluxo e

esclarecimento de algumas dúvidas;

Aos professores do programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas e Depto. de Bioquímica por terem

atuado como ancoras para nossa descoberta e crescimento de saberes e experiências;

Aos colegas de mestrado, pois compartilhamos momentos de dúvidas, indecisões, mas principalmente de

torcida para que ocorresse tudo bem no fim para todos. Destaco CB (Cláudio Bruno) que além de ter me

ajudado na disciplina de Bioestatística sempre se mostrou solidário durante todo o mestrado;

Aos outros amigos que não são do lab mas que tornam os estresses do dia a dia mais amenos: Luciana,

Fernanda, “Por Jesus” Águida, Donana (Ana), Kako (Madson), Manu e, minhas pupilinhas Marina

Macêdo e Lourdinha;

Aos funcionários do Departamento e da secretaria da Pós em especial a Louise por ser tão prestativa;

À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento desta pesquisa;

Ao mentor/amigo/Profi pela confiança, paciência, tempo e dinheiro depositados em mim e na realização

desse sonho.

MUITO OBRIGADA!

“...Aprendi que não devemos nos comparar com os outros, mas com o melhor que podemos fazer...”

Charles Chapin

RESUMO Macroalgas marinhas são organismos conhecidos por apresentar uma diversidade de biomoléculas com propriedades farmacológicas. O litoral do Rio Grande do Norte apresenta mais de 100 espécies de macroalgas marinhas, a maioria delas ainda não explorada quanto ao seu potencial farmacológico. Açúcares e compostos fenólicos são os compostos de macroalgas marinhas mais estudados, sendo atribuída a estes uma gama de propriedades biológicas, como: atividade anticoagulante, anti-inflamatória, antitumoral e antioxidante. Neste trabalho, foram obtidos extratos metanólicos de treze algas do litoral do Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Acanthophora specifera;Botryocladia occidentalis;Caulerpa cupresoides; C. racemosa; C. prolifera; C. sertularioides e Codium isthmocladum), e esses foram avaliados quanto ao seu potencial anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo. Nenhum dos extratos metanólicos apresentaram atividades anticoagulante, porém quando avaliados com relação ao potencial antioxidante todos os extratos apresentaram atividade em quase todos os testes realizados (capacidade antioxidante total, sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação férrica e atividade redutora). Os extratos apresentaram resultados mais expressivos no teste de quelação férrica, principalmente para o extrato da alga C. racemosa que chegou a quase 100% de atividade. Destaca-se também a capacidade de doar elétrons dos extratos, em especial, dasalgas D. mentrualis,D. cilliolata e C. prolifera que apresentaram os maiores potenciais. Nosestudos de citotoxidade, todos os extratos apresentaram atividades em diferentes níveis frente as células tumorais HeLa, entretanto, os extratos de D. cilliolata (MEDC) e D. menstrualis (MEDM) apresentaram atividade específica para esta linhagem celular, não apresentando citotoxidadepara as células3T3. Estudos com estes dois extratos utilizando técnicas de citometria de fluxo, microscopia de fluorescência e testes in vitro mostraram que MEDC e MEDM induzem a apoptose em células HeLa através da ativação das caspases 3 e 9 e ainda, MEDC induz a parada do ciclo celular na fase S. Juntos, esses resultados mostraram que os extratos metanólicos de algas marrom D. mentrualis e D. cilliolata podem conter agentes com potencial utilização no combate de células de adenocarcinoma uterino humano. O presente estudo também aponta para a necessidade de investigações mais aprofundadas no âmbito fitoquímico e biológico para se identificar produtos biologicamente ativos presentes nos extratos. Palavras-chave: Atividade antiproliferativa, atividade anticoagulante, atividade antioxidante, extratos metanólicos, apoptose.

ABSTRACT Seaweeds are organisms known to exhibit a variety of biomolecules with pharmacological properties. The coast of Rio Grande do Norte has over 100 species of seaweeds, most of them not yet explored for their pharmacological potential. Sugars and phenolic compounds are the most studied of these being assigned a range of biological properties, such as anticoagulant , antiinflammatory, antitumor and antioxidant activities. In this work, we obtained methanolic extracts from thirteen seaweeds of the coast of Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; D. mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Acanthophora specifera; Botryocladia occidentalis; Caulerpa cupresoides; C. racemosa; C. prolifera; C. sertularioides e Codium isthmocladum). They were evaluated as anticoagulant and antioxidant drugs, as well as antiproliferative drugs against the tumor cell line HeLa. None of the methanolic extracts showed anticoagulant activity, but when they were evaluated as antioxidant drugs all of extracts showed antioxidant activity in all tests performed (total antioxidant capacity, sequestration of superoxide and hydroxyl radicals, ferric chelation and reductase activity), especially the algae D. mentrualis, D. cilliolata and C. prolifera, who had the greatest potential to donate electrons.In addition, the ability of iron ions chelation appears as the main antioxidant mechanism of the methanolic extracts of these seaweeds mainly for the extract of the C. racemosa seaweed, which reached almost 100% activity. In the MTT assay, all extracts showed inhibitory activity at different levels againts HeLa cells. Moreover, D. cilliolata (MEDC) and D. menstrualis (MEDM) extracts showed specific activity to this cell line, not inhibiting the viability of 3T3 normal cell line, so they were chosen for detailing the antiproliferative mechanism of action. Using flow cytometry, fluorescence microscopy and in vitro assays we demonstrated that MEDC and MEDM induced apoptosis in HeLa cells by activation of caspases 3 and 9 and yet, MEDC induces cell cycle arrest in S phase. Together, these results showed that the methanolic extracts of brown seaweed D. menstrualis and D. cilliolata may contain agents with potential use in combatting cells from human uterine adenocarcinoma. This study also points to the need for more in-depth research on phytochemical and biological context to enable the purification of biologically active products of these extracts. Keywords: Antiproliferative, anticoagulant, antioxidant, methanolic extracts, apoptosis.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo clássico da cascata de coagulação sanguínea.............................. 17

Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes.................... 18

Figura 3.Caulerpa cupressoides variedade flabellata Børgesen............................... 46

Figura 4.Caulerpa sertularioides (S. G Gmelin) M Howe.......................................... 46

Figura 5.Caulerpa prolifera (Förssk.) J. V. Lamour................................................... 46

Figura 6. Caulerpa racemosa (Försskall) J. Agardh variedade occidentalis (J.

Agardh) Börgensen................................................................................... 47

Figura 7.Codium isthmocladum Vickers.................................................................... 47

Figura 8.Dictyopteris delicatula J.V. Lamouroux....................................................... 47

Figura 9.Dictyota ciliolata Sond. ex Kütz................................................................... 47

Figura 10.Dictyota menstrualis (Hoyt) Schnetter, Hörnig & Weber-Peukert……… 47

Figura 11.Dictyota mertensii (Martius) Kützing.......................................................... 48

Figura 12.Spatoglossum schröederi (C. Agardh) Kützing……………….........…….. 48

Figura 13.Sargassum filipendula C. Agardh.............................................................. 48

Figura 14.Acanthophora spicifera (Vahl) Børgesen.................................................. 48

Figura 15.Botryocladia occidentalis (Borgesen) Kylin............................................... 48

Figura 16.Capacidade antioxidante total dos extratos metanólicos de algas

tropicais.................................................................................................. 52

Figura 17.Poder redutor dos extratos metanólicos de algas tropicais...................... 53

Figura 18. Quelação férrica dos extratos metanólicos de algas tropicais.................. 54

Figura 19. Influência de ME de algas tropicais na viabilidade de células HeLa após

24, 48 e 72 h de incubação.............................................................. 57

Figura 20. Influência de MEDM e MEDC na viabilidade de células normais 3T3

depois de 24, 48 e 72 horas de incubação............................................... 58

Figura 21. Mudanças morfológicas de células HeLa após o tratamento com MEDC

e MEDM em diferentes tempos................................................................ 59

Figura 22. Mudanças morfológicas em células HeLa após o tratamento com

MEDC e MEDM por 24h seguido de marcação com DAPI................... 60

Figura 23. Análises de citometria de fluxo de células HeLa tratadas com MEDC e

MEDM....................................................................................................... 61

Figura 24. Análises de ciclo cellular de células HeLa por citometria de fluxo após

24h de tratamento..................................................................................... 63

Figura 25. Efeito de MEDC e MEDM na ativação de caspases................................. 64

LISTA DE TABELAS Tabela I. Principais características utilizadas para classificação das macroalgas..... 13

Tabela II. Avaliação da atividade antioxidante em macroalgas marinhas.................. 24

Tabela III. Composição química e atividade anticoagulante de extratos

metanólicos de algas........................................................................... 50

Tabela IV. Índices de correlação entre a quantidade de açúcares nos extratos e as

respectivas atividades de cada classe de algas....................................... 65

Tabela V. Índices de correlação entre a quantidade de compostos fenólicos nos

extratos e as respectivas atividades de cada classe de algas................. 65

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS µg Micrograma;

µL Microlitro;

AAO Avaliação da atividade antioxidante;

AO Atividade antioxidante;

aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada;

AT Antitrombina;

ATCC American Type Culture Collection;

ATP Adenosina tri-fosfato;

BHA Hidroxianisol butilado;

BHT Hidroxitolueno butilado;

CAT Capacidade antioxidante total;

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl;

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético;

EROs Espécies reativas do oxigênio;

EtOH Etanol;

FITC Isotiocianato de fluoresceína;

GSH Glutationa;

HCII Cofator II da heparina;

IC50 Concentração de um composto necessária para reduzir o crescimento

populacional de organismos, incluindo células eucarióticas, em 50 por

cento;

IP Iodeto de propídio;

MeOH Metanol;

mg Miligrama;

mL Mililitro;

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenil tetrazolium bromide);

NBT Nitroblue tetrazolium;

OMS Organização Mundial de Saúde;

ON. Radical Óxido Nítrico;

ORAC Sequestro de radical oxigênio;

PBS Tampão fostato salino;

OS Polissacarídeos Sulfatados;

PT Tempo de Tromboplastina;

RL Radical livre;

ROO. Radical peróxido;

RPM Rotações por minuto;

SFB Soro fetal bovino;

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico;

TBHQ Tert-butil hidroquinona;

TCA Ácido Tricloroacético;

TEAC AAO equivalente ao trolox;

TFPI Inibidor de fator tecidual;

UV Ultravioleta;

v/v Volume/Volume;

WHO World Health Organization;

α-TOH α-tocoferol.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 12

1.1 MACROALGAS MARINHAS............................................................................ 12

1.2 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DE EXTRATOS DE ALGAS

MARINHAS........................................................................................................ 12

1.2.1 Doenças cardiovasculares x Cascata da coagulação.......................... 15

1.2.2 Potencial anticoagulante de algas marinhas........................................ 19

1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE ALGAS

MARINHAS........................................................................................................ 21

1.3.1 Espécies Reativas do Oxigênio (EROs) x Antioxidantes..................... 21

1.3.2 Potencial antioxidante de algas marinhas............................................ 23

1.4 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE ALGAS

MARINHAS........................................................................................................ 28

1.4.1 Câncer x Mecanismo de morte celular................................................. 28

1.4.2 Potencial antiproliferativo de algas marinhas....................................... 30

2. OBJETIVOS............................................................................................................ 35

2.1 OBJETIVOS GERAIS....................................................................................... 35

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 35

3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 36

3.1 MATERIAL BIOLÓGICO.................................................................................. 36

3.2 LINHAGENS E CULTURAS CELULARES...................................................... 36

3.3 OUTROS MATERIAIS...................................................................................... 36

3.4 APARELOS...................................................................................................... 37

3.5 MÉTODOS....................................................................................................... 38

3.5.1 Obtenção dos extratos metanólicos..................................................... 38

3.5.2 Caracterização química........................................................................ 38

3.5.3 Atividades antioxidantes in vitro........................................................... 39

3.5.4 Atividade anticoagulante...................................................................... 40

3.5.5 Citotoxicidade e análise das células por microscopia

óptica................................................................................................... 41

3.5.6 Fragmentação nuclear......................................................................... 42

3.5.7 Avaliação da viabilidade e morte celular por Anexina V-FITC/ iodeto

de propídio (PI).................................................................................... 42

3.5.8 Ciclo celular.......................................................................................... 43

3.5.9 Avaliação da via de morte celular por ativação de caspases 3 e 9 .... 44

3.5.10 Análise estatística.............................................................................. 44

4. RESULTADOS....................................................................................................... 46

4.1 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO........................... 46

4.2 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS

METANÓLICOS................................................................................................. 49

4.3 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE PELOS ENSAIOS DE APTT E PT............. 49

4.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................................................... 50

4.4.1 Capacidade antioxidante total (CAT)................................................... 51

4.4.2 Poder Redutor...................................................................................... 52

4.4.3 Sequestro dos radicais superóxido( O2.-) e hidroxila (OH.).................. 52

4.4.4 Quelação Férrica.................................................................................. 53

4.5 CITOTOXICIDADE.......................................................................................... 55

4.5.1 Efeito de ME em células HeLa............................................................. 55

4.5.2 Efeito de MEDC e MEDM em células 3T3........................................... 57

4.6 CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO DE MEDC E MEDM NAS CÉLULAS

HELA.................................................................................................................. 57

4.6.1 Efeito de MEDC e MEDM na morfologia das Células HeLa................ 58

4.6.2 Mudanças na morfologia nuclear......................................................... 59

4.6.3 Efeito do MEDC e MEDM na marcação das células com iodeto de

propídeo e anexina V........................................................................... 60

4.6.4 Efeito dos extratos no ciclo das células HeLa...................................... 62

4.6.5 O tratamento com MEDC e MEDM promove ativação das caspases

em células HeLa.................................................................................. 63

4.7 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO DE PEARSON............................................... 64

5. DISCUSSÃO........................................................................................................... 66

6. CONCLUSÕES....................................................................................................... 77

7.REFERÊNCIAS........................................................................................................ 78

INTRODUÇÃO

Dayanne Lopes Gomes Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

12

1. INTRODUÇÃO

1.1 Macroalgas marinhas

As macroalgas marinhas constituem um grupo polifilético (não possuem

ancestral comum) e altamente diversificado deorganismos que têm muito pouca

coisa em comum a não ser o fato de serem predominantemente aquáticos e

desprovidos de um tecido constituído de células estéreis envolvendo os órgãos de

reprodução e um de um sistema diferenciado para condução de água(OLIVEIRA,

2002).

Por esta razão não constituem uma categoria taxonômica definida e muitos

autores têm classificado as algas não mais no Reino Plantae (dos vegetais) e sim,

no Protista. Sua classificação é baseada em várias propriedades como pigmentação,

natureza química de produtos fotossintéticos de reserva, organização das

membranas fotossintéticas e outros critérios morfológicos (CARLSSON et al., 2007).

Dessa forma, apesar de os sistemas de classificação variaram muito ao longo

dos tempos e consoante os autores, é geralmente consensual considerar que: as

macroalgas verdes se incluem no Filo Chlorophyta; as macroalgas vermelhas

pertencem ao FiloRodhophyta; as macroalgas marrons ou pardas se incluem no Filo

Heterokontophyta, classe Phaeophyceae (PEREIRA, 2009). Os critérios de

classificação utilizados e suas características estão sumarizados na tabela 1.

As algas têm ocorrência bem ampla decorrente da sua grande adaptabilidade

a condições adversas (RAO et al., 2007) e são organismos de grande relevância nos

ambientes recifais, estando presente em diversas situações e desempenhando

várias funções. As macroalgas, além de serem base de diversas cadeias tróficas,

servem de abrigo, berçário e refúgio para várias espécies de invertebrados e

pequenos vertebrados. As algas calcárias, principalmente os gêneros que formam

crostas, fornecem resistência aos recifes porque preenchem os espaços vazios e

consolidam remanescentes de organismos mortos, contribuindo na sedimentação

destes ambientes (FIGUEIREDO, 2000).

INTRODUÇÃO


13

Tabela I: Principais características utilizadas para classificação das

macroalgas. Fonte: Adaptado de STENGEL, CONNAN &POPPER, 2011; ROCHA,

ALVES, LEITE, 2011.

O Brasil possui uma enorme diversidade quanto ao número de espécies de

algas marinhas. Vidoti e Rollembeg (2004) relataram que no Brasil, a região

compreendida entre o Estado do Ceará e o Norte do Rio de Janeiro abriga uma flora

algal das mais diversificadas do país. O Rio Grande do Norte possui cerca de 125

espécies de algas marinhas divididas em 73 gêneros, sendo que 22 destes são de

algas verdes; 9 de algas marrons e 42 gêneros de algas vermelhas (OLIVEIRA,

2002).Dessas apenas as algas vermelhas dos gêneros Gracilaria e Hypnea vêm

sendo explorada com finalidade industrial. Esta exploração também seestende a

trechos do litoral do Estado do Ceará e da Paraíba (OLIVEIRA, 2002).

Em geral, as macroalgas marinhas apresentam um alto valor nutritivo, sendo

ricas em carotenóides, proteínas, fibras dietéticas, ácidos graxos essenciais,

vitaminas e minerais (MCHUGH, 2003). São utilizadas como fonte de alimentos

principalmente nos países asiáticos, chegando a constituir cerca de 25% da dieta

humana, fornecendo produtos que movimentam bilhões de dólares por ano. Por

exemplo, o comércio de “nori” (gênero Porphyra) foi responsável pela movimentação

de 1,8 bilhões de dólares/ano no inícioda década de 90 (OLIVEIRA, 1997).

Grupo Tipo de

clorofila

Outros pigmentos

acessórios

Substâncias

de reservas

Constituição

da parede

celular

Pigmentos

minoritários ou

encontrados em

grupos limitados

Chlorophyta:

Chlorophyceae

a, b

α-, β- e γ-carotenos,

luteina,

sifonaxantina,

sifoneina

Amido Celulose,

pectinas

Anteraxantina,

astaxantina,

cataxantina,

neoxantina,

violaxantina,

zeaxantina, equinona

Phaeophyta a, c2

β-caroteno,

fucoxantina,

zeaxantina,

violaxantina

Laminarina e

manitol

Celulose,

alginatos

Anteraxantina-like,

criptoxantina-like,

latoxantina-like,

e mactraxantina-like

carotenoides

Rhodophyta a, (d)

r-ficocianina, b-, c-

e r-ficoeritrina,

aloficocianinas, α e

β-carotenos

Amido das

florideas

Celulose,

pectinas

Anteraxantina,

criptoxantina, luteína,

violaxantina,

zeaxantina

INTRODUÇÃO


14

A aceitação de alga como alimento pela população brasileira ainda é

pequena, muitas vezes por uma questão cultural. Uma das formas de se romper esta

barreira é descobrir propriedade farmacológicas inerentes às algas e utilizar esta

informação como ferramenta para melhorar a sua receptividade pela população,

além de proporcionar um consumo seguro, fundamentado em dados de pesquisas

científicas (ROCHA, ALVES, LEITE, 2011).

Além de serem utilizadas no setor alimentício, as algas produzem uma gama

de substâncias utilizadas comercialmente. Estas substâncias podem ser derivadas

tanto de metabolismo primário como do metabolismo secundário da alga. Os

compostos envolvidos no metabolismo primário possuemuma distribuição universal

nas algas e estão relacionados com suas principais funções vitais, sendo estes os

aminoácidos, nucleotídeos, lipídios, carboidratos e a clorofila (STENGEL, CONNAN

& POPPER, 2011).

Polissacarídeos como alginatos, que são substâncias viscosas produzidas por

certas espécies de algas marrons, são utilizados na fabricação de papel e como

aditivos alimentares por sua habilidade de formar géis e estabilizar misturas

aquosas, dispersões e emulsões (TONELI et al., 2005).Ágar e carragenanas, que

são encontradas em algumas espécies de algas vermelhas, são usadas em diversas

finalidades como na indústria farmacêutica, fabricação de cosméticos, gelatina e

meios de cultura (TRIUS & SEBRANEK, 1996; IKEDA, 2003; ROCHA, ALVES,

LEITE, 2011).

As algas possuem também várias vias metabólicas secundárias que dão

origem a diversos compostos alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos,

cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos que, por vezes, são específicos de

determinadas famílias, gêneros ou espécies, e cujas funções são de extrema

relevância, como por exemplo, na defesa contra seus predadores (SOUZA et al.,

2003; NIERO et al., 2003).

Apesar do alto conteúdo de ácidos graxos poli-insaturados, durante o

armazenamento das algas marinhas esses compostos apresentam alta estabilidade

estrutural frente à oxidação, proporcionando vantagens para a estocagem de algas

(RAMARATHNAM et al., 1995). Como qualquer organismo fotossintético, asalgas

encontram-se expostas à grande quantidade de luze altas concentrações de

oxigênio, combinação que originaradicais livres, assim como, outros potentes

INTRODUÇÃO


15

oxidantes.A ausência de danos oxidativos nos ácidos graxos poli-insaturados

estruturais das membranas algais sugereque as algaspossuem compostos e

mecanismosantioxidantes (MATSUKAWA et al., 1997).

Os estudos com moléculas sintetizadas por algas também avançam nas

áreas relacionadas com as propriedades medicinais que estes possuem, como:

farmacologia, imunologia, bioquímica, química farmacêutica, farmacognosia e

química medicinal. São atribuídas várias propriedades a moléculas algais, tais como:

antioxidantes (AHN et al., 2007; COX et al., 2010; RAJAURIA et al.,2010; COSTA et

al., 2010), antimicrobianos (COX et al., 2010; Nagayama et al., 2002), antitumoral

(AWAD et al., 2008; ZUBIA et al., 2009; ALMEIDA-LIMA et al., 2010; COSTA et al.,

2011), anticoagulantes (CÂMARA et al., 2011; MAGALHÃES et al., 2011), antiviral

(ABRANTES et al.,2010; AHN et al., 2004). Estas atividades têm sido

extensivamente revisadas (GAMAL, 2010; GUPTA & ABU-GHANNAM, 2011;

WIJESEKARA, PANGESTUTI, & KIM, 2011).

A maioria das atividades descritas acima foram inicialmente descobertas a

partir do estudo de atividades de extratos obtidos de algas. O que tem se mostrado

como uma abordagem mais racional de descoberta de moléculas bioativas de algas,

pois fatores como diversidade de espécies; diversidade de moléculas; diversidade de

habitats fazem com que cada espécie de alga sintetize moléculas que lhes são

inerentes e que provavelmente não serão encontradas em outros organismos. E

uma busca direcionada a um tipo molécula ou classe de moléculas não seria, na

maioria das vezes, capaz de detectar moléculas inerentes de uma espécie.

1.2 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DE EXTRATOS DE ALGAS MARINHAS

1.2.1 Doenças Cardiovasculares x Cascata da coagulação

As mudanças no estilo de vida advindas da globalização e do progresso

tecnológico trouxeram consigo o aumento da expectativa de vida e a diminuição

progressiva do agravamento e aquisiçãode doenças transmissíveis. Por outro lado,

as Doenças Crônicas Não Transmissíveis, as quais compreendem as doenças

INTRODUÇÃO


16

cardiovasculares, respiratórias crônicas, cânceres e diabetes, despontam como as

maiores responsáveis por óbitos em todo o mundo (WHO, 2010).

Dentre tais enfermidades, as Doenças Cardiovasculares (DCV), que incluem

enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral (AVC), hipertensão e angina, tem a

maior prevalência mundial (WHO, 2011). No Brasil, as DCVs são responsáveis por

31,3% das mortes por doenças crônicas não transmissíveis, e atingem indivíduos de

todas as camadas socioeconômicas, principalmente aqueles pertencentes a grupos

vulneráveis, como os idosos e os de baixa escolaridade e renda (BRASIL, 2011).

O principal caminho patológico responsável por levar às doenças

coronarianas é aterosclerose, a qual envolve o acúmulo de lipídios e componente

fibroso em grandes artérias, gerando inflamação. Tal processo de deposição pode

iniciar, por sua ruptura espontânea ou mecânica, a cascata de coagulação na região

afetada, ocorrendo, dessa maneira, a formação do trombo, que pode ser deslocado,

provocando embolias, ou permanecer na parede vascular de artérias de grande e

médio calibre, diminuindo o fluxo sanguíneo para órgãos vitais como o coração e o

cérebro (LIBBY, RIDKER &HANSSON, 2011).

O desencadeamento do processo de coagulação abrange diversos

elementos, tais como: paredes vasculares, plaquetas e proteínas solúveis nas

imediações de lesões traumáticas (LIBBY, RIDKER & HANSSON, 2011).

Em meados dos anos 60, numa tentativa de explicar os mecanismos da

coagulação, Macfarlane, Davie e Ratnoff propuseram uma hipótese que continha a

seqüência de eventos responsáveis pela fisiologia da coagulação (MACFARLANE,

1964; DAVIE & RATNOFF, 1964). Tal hipótese acabou se tornando um modelo

clássico da coagulação sangüínea. Nele a coagulação ocorre por meio da ativação

proteolítica seqüencial de zimógenos, por proteases presentes no plasma,

resultando na formação de trombina que converte a molécula de fibrinogênio em

fibrina. Este modelo (Figura 1) divide o mecanismo da coagulação em três vias:

extrínseca (que envolve componentes do próprio sangue e outros que usualmente

não o compõe) e intrínseca (contém somente componentes do próprio sangue) e a

via comum (o ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca que leva a

ativação da fibrina).

INTRODUÇÃO


17

Figura 1.Modelo clássico da cascata de coagulação sanguínea. PT: tempo de

trombina; APTT: Tempo parcial de tromboplastina ativada; FT: Fator tecidual; PL: Plaquetas; FT:

Fator tecidual.

FONTE: Adaptado de ADAMS E BIRD, 2009.

Posteriormente, foi proposto um novo modelo de cascata de coagulação, que

é mais aceito atualmente, pois não defende que há uma ativação em “cascata” e sim

uma relação entre três complexos enzimáticos pró-coagulantes que vão culminar na

ativação da trombina: Complexo “tenase” extrínseco, complexo “tenase” intrínseco e

complexo protrombinase (Figura 2). Após uma lesão no endotélio vascular, o FT

(Fator Tecidual) é exposto e se liga ao Fator VIIa que é normalmente encontrado no

sangue. O complexo FT/VIIa ativa os fatores IX e X na presença do cálcio. O fator

IXa, por sua vez, potencializa a formação de Xa através da formação do “complexo

tenase intrínseco” . Por fim, o fator Xa forma complexo com o fator Va convertendo o

fator II (protrombina) em fator IIa (trombina) (ADAMS; BIRD, 2009), como observado

na figura 2.

INTRODUÇÃO


18

Simultaneamente a esses processos de formação do trombo,

independentemente da via utilizada, existe a ação de fatores fisiológicos que atuam

como anticoagulantes e impedem a propagação desse trombo tais como: proteína C

e S, inibidor do fator tecidual (TFPI), antitrombina (AT) e cofator II da heparina

(HCII).

Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. (a) O

Fator VII encontra-se ativado em concentrações muito baixas no sangue. (b) O Fator VIIa tem alta

afinidade pelo FT. O complexo FT/VIIa é capaz de converter uma quantidade significativamente maior

de Fator VII, gerando o Fator VIIa. (c) No entanto o principal papel de FT/VIIa é formar um complexo

com os Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), levando a formação dos Fatores Xa e IXa. O

Fator Xa, por sua vez, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez

ativam os cofatores V e VIII. (d) Os Fatores IXa e VIIIa se complexam ao Fator X (Complexo tenase

intrínseco) ativando mais moléculas de trombina. (e) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II

(Complexo protrombinase) aumentando consideravelmente sua conversão em trombina (a formação

de trombina por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). FT: Fator tecidual.

Fonte: OLIVEIRA, 2011.

Assim, quando se evidencia um desequilíbrio entre os processos de formação

do coágulo (coagulação) e dissolução do mesmo (fibrinólise), a chance de se

adquirir uma doença cardiovascular torna-se bastante elevada (MANN, BUTENAS &

BRUMMEL, 2003).

A B C

D

E

INTRODUÇÃO


19

Os anticoagulantes são um dos principais grupos de fármacos utilizados no

tratamento de doenças cardiovasculares, e a heparina é o mais utilizado na

terapêutica, pois diferente de outros apresenta uma maior versatilidade no

tratamento destes tipos de patologias (WEITZ & WEITZ, 2010). Entretanto, esse

fármaco pode apresentar algumas reações adversas indesejáveis. Em alguns

pacientes, observa-se o aparecimento de trombocitopenia, efeitos anticoagulantes

variáveis, além dos efeitos hemorrágicos residuais da heparina, apresentado por

fragmentos de heparina que não possuem atividade anticoagulante (NADER et al.,

1979; NADER et al., 2004, ROCHA et al., 2004).

Além disso, a heparina é obtida, principalmente, de intestino suíno ou bovino,

o que, apesar de nunca ter sido documentado, pode trazer risco de contaminação

aos pacientes por partículas virais ou outros agentes (ROCHA et al., 2004). Outro

agravante é o aparecimento de contaminações em lotes de heparinas comerciais.

Recentemente, um condroitin supersulfatado foi isolado de preparações

contaminadas de heparina, e este tem sido associado a mais de 800 casos de

internação por reação anafilática e 231mortes nos Estados Unidos, se tornando um

problema global, afetando também pacientes na Austrália, China, Dinamarca,

França, Alemanha, Itália e Japão (GUERRINI et al., 2008, LIMA et al., 2011, RUDD

et al., 2011). Ainda, outro contaminante foi identificado, TBEP (tris(2-n-butoxyethyl)

phosphate), e este está associado a eventos de toxicidade no sistema nervoso,

fígado, entre outros (SASSAKI et al., 2011). Os fatores citados acima estimulam a

busca por novos compostos anticoagulantes, com menores efeitos colaterais ou

semefeitos colaterais, que possam vir a substituir a heparina, ou o seu uso em

algumas situações específicas.

1.2.2 Potencial anticoagulante de algas marinhas

O potencial anticoagulante de algas marinhas vem sendo avaliado desde a

década de 30 do século passado (CHARGAFF et al., 1936). E durante este período

observa-se que diferentes tipos de materiais foram estudados, desde extratos (KIM,

2004; ATHUKORALA et al., 2007;COSTA et al., 2010; MOURA et al., 2012) até

moléculas isoladas (MAYER et al., 2011; YOON et al., 2007).

INTRODUÇÃO


20

Os polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas são um dos grupos de

moléculas que mais tem potencial como fármacos para a substituição da heparina,

por terem similaridades estruturais (são polissacarídeos e são sulfatados), além de

serem obtidos de uma fonte distante filogeneticamente dos humanosdiminuindo

consideravelmente o risco de contaminações virais e, principalmente porpossuir

grande diversidade estrutural, o que fornece a possibilidade deles apresentarem

mecanismo de ação diferente da heparina (ROCHA et al., 2006).

Os ensaios in vitro realizados para a prospecção de compostos, inclusive

polissacarídeos sulfatados, com atividade anticoagulante e avaliação laboratorial de

distúrbios na coagulação sanguínea ainda são baseados no modelo antigo de

classificação da coagulação. E para tal, usa-se dois testes denominados de aPTT

(Tempo de tromboplastina parcial ativada) e o PT (Tempo de protrombina), que

analisam, respectivamente, alterações nas vias intrínseca e extrínseca (PARK et al.,

2008; VALERIE, 2009). Estes testes são de fácil execução, reprodutíveis, de baixo

custo econômico, e fornecem resultados de forma rápida, sendo assim usados como

testes de escolha para a prospecção de compostos anticoagulantes (VALERIE,

2009).

A partir de estudos in vitro utilizando testes de aPTT e PT vários

polissacarídeos sulfatados foram selecionados para estudos mais complexos,

inclusive in vivo. Os resultados atuais apontam que assim como a estrutura dos

polissacarídeos é bem variada, seus mecanismos de ação anticoagulante também

são, e é possível identificar polissacarídeos cuja ação anticoagulante se dá por inibir

diretamente a trombina, por potencializar AT e/ou HCII, por promover a liberação do

TFPI, por promover a liberação porteoglicanos de heparan sulfato antirombótico,

dentre outros (LEITE et al., 1998; NISHINO et al., 1991; MINIX & DOCTOR, 1997;

SHANMUGAN & MODY, 2000; ROCHA et al., 2005a, 2005b; DROZD et al., 2006;

YOON et al., 2007).

Com relação a extratos metanólicos não se identificou trabalhos que

avaliassem a atividade anticoagulante destes extratos. Porém, deve-se ter em mente

que extratos metonólicos de algas podem ser ricos em polissacarídeos sulfatados, e

compostos fenólicos (STENGEL, CONNAN & POPPER, 2011), e, além disso, há

trabalhos na literatura que mostram que polissacarídeos mesmo não sendo

sulfatados, apresentam atividade anticoagulante, como polissacarídeos de plantas

INTRODUÇÃO


21

ricos em ácidos urônicos (YOON et al., 2002) e xilanas de sabugo de milho (MELO-

SILVEIRA et al., 2012). Com relação aos compostos fenólicos, pode-se citar, por

exemplo, o trabalho de Bijak e colaboradores (2011) que mostrou que extratos ricos

em flavonoides apresentam atividade anticoagulante superior a extratos que

apresentam outros tipos de compostos fenólicos (BIJAK et al., 2011). Portanto, é

possível os extratos metanólicos de algas potiguaresapresentam compostos com

potencial para serem anticoagulantes e que este potencial ainda não foi estudado.

1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE ALGAS MARINHAS

1.3.1 Espécies reativas do oxigênio (EROs) x antioxidantes

O O2 tem um significado fundamental paraos organismos aeróbios, pois

participa da obtenção deenergia na forma de ATP, através da cadeia respiratória,

como aceptor final de elétrons (SCANDALIOS, 1997). Participa também devárias

reações metabólicas como a biossíntese deprostaglandinas e esteróides e na

oxidação de muitassubstâncias aromáticas, entre outras (FLESCHIN et al.,2000). No

entanto, ao mesmo tempo em que a redução respiratória do O2 para a H2O fornece a

energia necessária para a imensa complexidade dos organismos superiores, ela

também pode levar à formação das espécies reativas de oxigênio (EROs). Elas

englobam os radicais livres e outros derivados ativosdo oxigênio, como radical

hidroxila (OH·), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion superóxido (O2-), e, além de

serem inevitavelmente coproduzidos nas reações de redução do oxigênio a água,os

EROs ainda podem ser produzidos por outros fatores, como por exemplo,

mediadores de carcinogênesis e injúria inflamatória (BANERJEE, DASGUPTA & DE,

2005) e fontes ambientais (luz ultravioleta, radiação ionizante e, poluentes como o

paraquato (substância tóxica usada como herbicida) (WICKENS, 2001).

As EROs participam de vários processos celulares. Por exemplo, estão

envolvidas nos mecanismos de reações inflamatórias ou atuam como segundos

mensageiros para manter diversas funções celulares (ROVER JUNIOR, 2001).

Contudo, quando em altas concentrações elas podem provocar danos a uma grande

variedade de biomoléculas, ocasionando, por exemplo, a peroxidação lipídica das

INTRODUÇÃO


22

membranas celulares (GUPTA & ABU-GHANNAM, 2011). Por isso, elas estão

envolvidas em vários processos deletérios nos organismos como ocâncer, a

aterosclerose, a diabetes mellitus, a artrite reumatóide, a distrofia muscular, a

catarata, as desordensneurológicas e o processo de envelhecimento (NORDBERG

& ARNÉR, 2001; NGO et al., 2010).

Finalmente, a presença de EROs tem sido correlacionada com um grande

número dedoenças, mas não como agentes etiológicos e sim comofatores que

participam diretamente dos mecanismos fisiopatológicos, os quais determinam a

continuidade eas complicações de diversos estados patológicos (ROVERJÚNIOR et

al., 2001).

Devido aos efeitos deletérios dos EROs os organismos aeróbios, desde as

cianobactériasaté o homem, desenvolveram uma série de mecanismos fisiológicos e

biomoleculares de defesa contra os efeitosdas EROs. Nas célulasde organismos

fotossintetizantes esses mecanismosestão mais fortemente desenvolvidos em

comparaçãocom outras células, uma vez que as membranasfotossintéticas, os

tilacóides, são alvo primáriopara os efeitos deletérios oxidativos, por estarem em

exposição direta a fatores oxidantes e por conterem lipídeos não saturados como

elementos estruturais majoritários. Portanto, vários mecanismos de proteção contra

as EROs são desenvolvidos nessas células. De fato, as porções fotossintetizantes

das plantas e algas, como as folhas e os talos, contêm numerosas substâncias

antioxidantes. Com relação às algas, há outros fatores que estimulam elas a

produzirem substâncias antioxidantes, como o fato deles na maior parte de suas

vidas estarem submetidas a rápidas variações de intensidade de luz e

concentrações de O2 e CO2 ao longo da coluna de água. Por este e outros motivos

tem sido relatado que as algas produzem uma grande variedade de compostos

metabólicos que não são produzidos por plantas terrestres (PLAZA, CIFUENTES &

IBÃNEZ, 2008).

Substâncias naturais com atividade redutora e neutralizadora de radicais

livres são muito usadas como agentes antioxidantes exógenos (PIETTA, 2000;

NORDBERG; ARNÉR, 2001; RASTOGI et al., 2010).Portanto, as algas marinhas

podem representar uma importante fonte de substâncias antioxidantes naturais tanto

para as indústrias alimentícias como para as farmacêuticas (MATSUKAWA et al.,

INTRODUÇÃO


23

1997). Por isso, a atividade antioxidante é uma das principais atividades

investigadas dos extratos de algas marinhas.

1.3.2 Potencial antioxidantes de algas marinhas

Assim como observado para outros organismos, o estudo de substâncias

antioxidantes algais deve levar em consideração que estas substânciaspodem atuar

através de mecanismos variados como capturar ou regenerar radicais livres,

decompor peróxidos, extinguir O2, inibir enzimas envolvidas no processo de

formação de radicais livres, inibir a cascata de reação dos radicais livres, entre

outros (NIKI, 2010). As reações de oxidação de substratosocorrem através de

umacascata queinclui três etapas (iniciação, propagação e terminação), por essa

razão a capacidade de uma variedade de substâncias antioxidantes em atuar como

bloqueadores de alguma das etapas do processo em cadeia das reações radicalares

tem sido indiretamente avaliada, através de métodos diversos, usando vários

modelos. Para muitos desses métodos, os resultados obtidos dependem do modelo

usado e da hidrofilicidade/lipofilicidade da amostra antioxidante testada. Assim,

devido às diferenças entre os sistemas de testes empregados para se fazer a

avaliação da atividade, recomenda-se o uso de pelo menos dois métodos,

dependendo do potencial esperado (ROCHA et al., 2007).

O interesse inicial pelo estudo de substâncias com atividade antioxidante em

algas surgiu no Japão. Posteriormente ela se intensificou por vários motivos,

inclusive pela busca de novos aditivos para alimentos, em substituição àqueles

antioxidantes sintéticos utilizados, como o hidrixianisol butilado (BHA), hidroxitolueno

butilado (BHT) e tert-butil hidroquinona (TBHQ) os quais mostravam efeitos

carcinogênicos, alterações de atividade de enzimas e lipídios em animais (QI et al.,

2005; LI et al., 2007). Hoje é possível, com o uso de ferramentas de buscas na

interneta identificação de vários grupos de pesquisadores em busca de substâncias

com atividade antioxidante sintetizadas por algas (Tabela 2). Serão tecidos alguns

comentários sobre algumas delas no texto abaixo.

INTRODUÇÃO


24

Autores/Ano Alga estudada Estudo

Fujimoto; Kaneda, 1980

Algas marrons Eisenia bicyclis e Undaria pinnatifi

Maior atividade AO no teste de estabilidade do éster metilico do óleo de girassol

Fujimoto; Kaneda, 1984

Polysiphonia urceolata Purificou princípios antioxidantes de trabalho anterior ->Fosfolipídios e

Fucoxantina

Le Tutour et al., 1990

Algas marrons Laminaria digitata, Himanthalia

elongata, Fucus vesiculosus, Fucus serratus e

Ascophyllum nodosum

Isolamento dos princípios AO de extratos apolares e verificação de

sinergismo com a vitamina E

Cahyana et al.,

1992 Alga marrom Eisenia bicyclis

Pirofeofitina a identificada como um dos

princípios AO

Foti et al., 1994 Algas marrons do gênero

Cystoseira

Meroditerpenos frente ao 1O2, O2

∸ e ROO.

boa atividade p/ 1O2 e nenhuma p/ O2

∸; p/ 2

→ boa atividade p/ ROO.

Yan et al., 1996 Alga marrom Sargassum

kjellmanianum Florotaninos com AAO 2,6 vezes maior que

BHT

Anggadiredja et al., 1997

Alga marrom Sargassum polycystum

Extratos dos talos frescos e secos: algas secas ↓ AAO e algas frescas (extrato

MeOH) ↑ AAO

Matsukawa et al., 1997

Algas marrons Colpomenia bullosa, Desmarestia ligulate, Eisenia

bicyclis, Hizikia fusiformis, Laminaria religiosa, Sargassum

horneri, Sargassum macrocarpum, Sargassum siliquastrum,

Sargassum thunbergii, Scytosiphon lomentaria, Spatoglossum

pacificum. Verde Enteromorpha linza

e vermelhas Ahnfeltiopsis paradoxa, Chondrus giganteus, Grateloupia

elliptica, Mazzaella japônica e Porphyra sp.

Extratos em H2O e EtOH frente ao DPPH e lipoxigenase

Le Tutour, 1998

Algas marrons Fucus vesiculosus, F. serratus, e Ascophyllum

Nodosum

Identificação de substâncias relacionadas com clorofila a, tocoferóis, fucoxantina e

fosfolipídios como princípios AO

Yan et al., 1998 4 Ulvales (algas verdes), 12 algas

vermelhas e 12 algas marrons

Seqüestro de DPPH e ∙OH dos extratos secos: 6 →Boa AAO frente ao

DPPH; 2 → Boa atividade para ∙OH

Xue et al., 1998 Compostos comerciais 1º relato de AAO de polissacarídeos

sulfatados(PS) de algas: todos os derivados de quitina e alginato mostraram boa AAO

Yan et al., 1999 Alga marrom Hijikia fusiformis Seqüestro de DPPH: fucoxantina >

atividade (extrato em Me2CO)

Ruberto et al., 2001 Algas marrons do gênero

Cystoseira Correlação entre AAO e o conteúdo dos

extratos em derivados tetrapreniltoluquinóis

Novoa et al., 2001 Alga vermelha Bryothamnion

triquetrum Extrato aquoso sobre a peroxidação lipídica

Xue et al., 2001 Alga marrom Laminaria japonica AAO PS de ↓ peso molecular

Rupérez et al., 2002

Alga marrom Fucus Vesiculosus

Isolamento de PS potenciais para indústria alimentícia

Lim et al., 2002 Alga marrom Sargassum

siliquastrum Compostos fenólicos submetidos a

diferentes métodos

Burritt et al., 2002 Alga vermelha Stictosiphonia

arbuscula ↑ da atividade de enzimas envolvidas na

regeneração do ascorbato e GSH

Fisch et al., 2003 Alga marrom Cystoseira crinita 14 meroditerpenóides isolados e

submetidos a ensaio do DPPH, de TBARS, TEAC e quimiluminescência

Fallarero et al., 2003

Alga vermelha Bryothamnion triquetrum e alga verde Halimeda

Atividade neuroprotetora contra efeitos oxidativos deletérios de H2O2 e MeHgCl,

INTRODUÇÃO


25

incrassata dos extratos aquosos. Correlação com ↑ conteúdo de substâncias fenólicas

Nagai; Yukimoto, 2003

Algas marrons Ecklonia cava, Undaria pinnatifida, Hizichia

Fusifomis e alga verde Ulva pertusa

Bebidas utilizadas na culinária japonesa testadas com 4 métodos diferentes.

Correlação do conteúdo de fenóis e AAO

Perez et al.,

2003a,b

Algas vermelhas Laurencia sp, Gelidium sp, Bryothamnion sp e

Gracilaria SP

AAO frente aos radicais O2∸, ∙OH e

aqueles gerados sob luz UV e ensaio TBARS

Kang et al., 2004 Alga marrom Ecklonia stolonifera Isolamento de 5 derivados florotaninos com

AAO

Ahn et al., 2004 Alga marrom Scytosiphon

lomentaria

Extratos hidrolisados por enzimas carboidrases e proteases frente a radicais

hidroxilas

Heo et al., 2005

Algas marrons Ecklonia cava, Ishige okamurae, Sargassum fullvelum, Sargassum horneri, Sargassum

coreanum, Sargassum thunbergii e Scytosipon lomentaria

Extratos hidrolisados enzimaticamente a partir de 5 tratamentos diferentes e

submetidos a ensaios de DPPH O-2 ,HO

-

,H2O2

Yuan, Bone e Carrington, 2005

Alga vermelha Palmaria palmata Extratos solúveis em butanol foram efetivos

e estáveis no sequestro de radicais hidroxilas inibidores de peroxidação lipídica

Yuan, Carrington e Walsh,2005

Alga vermelha Palmaria palmata AAO de extratos aquosos da alga quando

exposta a radiações UV distintas

Athukorala, Kim e Jeon, 2006

Alga marrom Ecklonia cava Extratos ricos em polissacarídeos ou polifenóis frente a diversos testes AO

Lim, et.al, 2006 Alga vermelha Neorhodomela

aculeate DPPH, NO

. e peroxidação lipídica de extrato

MeOH

Yuan e Walsh, 2006

Alga vermelha Palmaria palmata e algas marrons Laminaria setchellii,

Macrocystis integrifolia e Nereocystis leutkeana

AAO de poder redutor e correlação com compostos fenólicos

Chandini, Ganesan e Bhaskar, 2008

Algas marrons Sargassum marginatum, Padina tetrastomatica

e Turbinaria conoides

Fracionamento com solventes de polaridade decrescente a partir de extrato MeOH e

comparação entre AO e compostos fenólicos

Chew et al., 2008 Alga marrom Padina antillarum,

verde Caulerpa racemosa e vermelha Kappaphycus alvarezzi

Extração com diferentes % de MeOH e avaliação da AAO. Melhores resultados

obtidos com 50%

Devi et al., 2008

Algas vermelhas Gelidiella acerosa, Gracilaria edulis, Chondrococcus Hornemanni, Hypnea pannosa,

Jania rubens E algas marrons Turbinaria

conoides, Padina gymnospora, Dictyota dichotoma, Sargassum

wightii e Haligra sps.

Correlação positiva entre composição fenólica e alguns testes AO realizados ->

inibição da peroxidação lipídica e habilidade redutora férrica.

Também fez testes de seqüestro de DPPH, OH

,, H2O2, ON

. e poder redutor.

Heo et al., 2008 Alga marrom Ishige okamurae Isolamento de polifenol AO->

difloretohidroxicarmalol

Kumar, Ganesan e Rao, 2008

Alga vermelha Kappaphycus alvarezii

5 solventes diferentes, não houve correlação entre teste AO e solvente de

extração

Ganesan, Kumar e Bhaskar, 2008

Algas vermelhas Euchema kappaphycus, Gracilaria edulis e

Acanthophora spicifera

Extratos com clorofórmio e MeOH (1:1(v/v)), e mais 5 frações com solventes de

polaridade crescente.

Al-Amoudi et al., 2009

Alga verde Ulva lactuca, marrom Sargassum crassifolia e vermelha

Digenea simplex

Composição química e AAO de extratos. Extratos metanólicos com melhores

resultados que aquosos

Kim et. al, 2009 Alga marrom Ecklonia stolonifera Isolamento de fluorotaninos AO

Zubia et al., 2009 Algas marrons Alaria esculenta,

Asperococcus bullosus, Bifurcaria bifurcata, Cystoseira tamariscifolia,

Ensaios de DPPH, poder redutor e sistema ácido linoléico-beta caroteno. H. siliquosa

possui atividade semelhante à BHA e BHT.

INTRODUÇÃO


26

Desmarestia ligulata, Dictyota dichotoma, Fucus ceranoides, F.

serratus, Halidrys siliquosa e Saccorhiza polyschides

Algas da ordem Fucales apresentaram correlação entre AAO e compostos

fenólicos

Wang, Jónsdóttir e Ólafsdóttir, 2009

Algas marrons Fucus vesiculosus, F. serratus Laminaria

hyperborea, Saccharina latissima, L. digitata, Alaria esculenta e Ascophyllum nodosum. Algas

vermelhas Palmaria palmata e Chondrus crispus e a

verde Ulva lactuca

Prospecção de AAO de extratos 70% cetônicos e aquoso de algas da costa

islandesa. % maior de compostos fenólicos em extratos cetônicos correlacionados a

testes de DPPH e ORAC. F. vesiculosus, F. serratus e A. nodosum tiveram melhor AAO

Costa et al., 2010

Algas marrons Dictyota cervicornis, Dictyopteris delicatula, Dictyota menstrualis, Dictyota mertensii,

Sargassum filipendula e Spatoglossum schroederi; alga vermelha

Gracilaria caudata e, verdes Caulerpa cupressoides, Caulerpa Prolifera, Caulerpa sertularioides

Codium isthmocladum

Extratos ricos em polissacarídeos sulfatados. Os extratos das algas C.

sertularioides, G. caudata e D. cervicornis se destacaram. Não houve correlação entre o conteúdo de sulfato e atividade

antioxidante.

Subash et. al., 2010

Alga marrom Turbinaria odonata Extrato aquoso frente teste de peroxidação

lipídica, ON. e seqüestro de DPPH

Hu et al., 2010 Alga marrom Undaria pinnatifida AAO de polissacarídeos sulfatados obtidos

por extração aquosa

Apostolidis e Lee, 2010

Alga marrom Ascophyllum nodosum

Avaliação da atividade antioxidante in vitro (DPPH) do conteúdo fenólico da alga

mediada pela inibição da α-Glicosidase e α-Amilase

Suganthy et al., 2010

Alga vermelha Gelidiella Acerosa

Frações de benzeno e diclorometano ↑ AAO e atividade quelante de metais

Devi et al. , 2011 Alga marrons Halimeda tuna,

Turbinaria conoides e vermelha Gracilaria foliifera

AAO total e poder redutor com correlação moderada com conteúdo de polifenóis.

Ganesan Kumar e Rao, 2011

Algas verdes Enteromorphacompressa, E. linza e

E. tubulosa

↑↑ sequestro radical DPPH para extrato MeOH de E. compressa (IC501.89 mg/mL)

O’Sullivan et al., 2011

Algas marrons Ascophyllum nodosum, Pelvetia canaliculata e

Fucus serratus

Além de testes in vitro avaliou a atividade de enzimas AO (catalase e superóxido

dismutase)

Tabela II: Avaliação da atividade antioxidante em algas marinhas. AO: atividade

antioxidante;RL: radical livre; AAO: avaliação da atividade antioxidante; α-TOH: α-tocoferol; O2-: ânion

superóxido; ROO.: radical peróxido; EROs: espécies reativas do oxigênio; TBARS: substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico; TEAC: AAO equivalente ao trolox; MeOH: Metanol; ON.: Radical

Óxido Nítrico; ORAC: sequestro do radical oxigênio; H2O2: Peróxido de Hidrogênio; PS:

Polissacarídeos Sulfatados; EtOH: Etanol; DPPH:radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil;↑↑: muito maior; ↑:

maior; : resultado; ↓: menor/baixo; %: porcentagem; p/: para.Fonte: Adaptado ROCHA et. al.,

2007.

As algas marrons, geralmente quando são estudadas juntamente com as

algas verdes e vermelhas, apresentaram maior atividade antioxidante. Isto ocorre

devido à uma classe específica de polifenóis: os florotaninos, que são polímeros de

INTRODUÇÃO


27

floroglucinol (1,3,5 -trihidroxibenzeno) e, por terem as características químicas dos

taninos provavelmente também agem no combate à micro-organismos patogênicos

(GOO et. al., 2010).

Os polifenóis exercem suas propriedades antioxidantes através de vários

mecanismos de ação, podendo prevenir a peroxidação lipídica ao doar átomos de

hidrogênio paraos radicais lipídicos (ROO· ou RO·) e produzir radicais antioxidantes

derivados de lipídios (FRS·), que são mais estáveis e menos prontamente

disponíveis para promover a auto-oxidação (Reação-1 e Reação-2):

ROO* ou RO* + FRS ROOH ou ROH + FRS* (Reação-1)

FRS* + FRS* FRS-FRS (Reação-2)

(KIOKIAS, VARZAKAS, OREOPOULOU, 2008; GUPTA e ABU-GHANNAM, 2011).

Esses compostos são solúveis em solventes orgânicos e, estudos têm

mostrado que os extratos de algas obtidos com metanol como solvente

apresentarammelhores resultados em vários testes antioxidantes em comparação a

outros extratos, como aquosos. Ainda, alguns autores correlacionaram em seus

trabalhos à atividade antioxidante e o conteúdo de polifenóis em seus extratos

metanólicos (Tabela II).

Outra classe de antioxidantes naturais extraídos de algas, principalmente

vermelhas, são os “aminoácidos tipo micosporinas” (mycosporine-like amino acids,

MAAs). Eles são uma família de metabólitos secundários, intrínseca de organismos

aquáticos, que absorvem radiação ultravioleta. Por isso, possuem a capacidade para

dissipar radiação absorvida de forma eficiente sem produzir EROs conferindo

fotoestabilidade eresistência a vários estressores abióticos (RASTOGI et al., 2010).

Recentemente, carboidratos incluindo vários fucoidans, agaro-

oligossacarídos, entre outros polissacarídeos, principalmente ligados a grupamentos

sulfato, têm sido relatados por possuir propriedades antioxidantes. Porém, não foram

encontrados estudos que demonstrem uma correlação positiva entre o conteúdo de

açúcaresou sulfato presentes nesses extratos e suas respectivas atividades

antioxidantes.

Carboidratos antioxidantes são de significativa utilidade por serem geralmente

solúveis em água e terem baixa toxicidade. Além disso, a maioria destas moléculas

é consumida em segurançacomo componentes de produtos alimentares por muitos

anos. Neste contexto, muita atenção tem sido recentemente empregada para o

INTRODUÇÃO


28

desenvolvimento denovos aditivos de carboidratos com atividade antioxidante

potente (AJISAKA et al., 2009).

Recentemente, houve incrementos notáveis na investigação científicasobre o

papel benéfico de compostos extraídos de algas para o estresse oxidativo, porém,

nenhuma alga de litoral potiguar, pelo que se sabe, teve o potencial de seus extratos

metanólicos avaliados como antioxidante.

1.4 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS DE ALGAS MARINHAS

1.4.1 Cancêr X Mecanismo de morte celular

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO) entre os anos de

2005 a 2015 oitenta e quatro milhões de pessoas irão morrer acometidos de câncer

(WHO, 2010). Câncer é o termo utilizado para definir neoplasias, células que

proliferam de maneira anormal, malignas (KING, ROBINS, 2006). Para uma

neoplasia, também chamada de tumor, ser considerada um câncer é necessário que

suas células tenham habilidade para invadir os tecidos adjacentes (ALBERTS et al.,

2008).

O câncer é uma enfermidade causada pelo acúmulo de muitos eventos,

genéticos e epigenéticos, que agem numa única célula por um longo tempo. Entre

esses fatores a dieta desempenha um papel importante. Por exemplo, nos países

ocidentais a maior incidência de morte, dentre todos os cânceres, é atribuído ao

câncer de cólon o qual têm aumentado na Ásia devido a um aumento nos indivíduos

que são adeptos a hábitos alimentares ocidentais. Por isso, a dieta é um fator

importante na prevenção de câncer, pois está intrinsecamente relacionado com o

seu aparecimento (REDDYA, ODHAVA, BHOOLAB, 2003; PARK et al., 2008).

A prevenção do câncer é a forma mais efetiva para o controle desta doença

porque as opções de tratamento apresentam-se geralmente como paliativos, visando

apenas o controle dos sintomas. A quimioprevenção é uma estratégia para inibir,

retardar ou reverter a carcinogênese humana, utilizando principalmente

substânciasque ocorrem na natureza (LEE et al., 2011). Existem muitas formas de

ação de compostos anticancerígenos, tais como a apoptose de células tumorais,

impacto da síntese de proteínas e função ou, o impacto na biossíntese de ácidos

INTRODUÇÃO


29

nucleicos seja pela indução de danos na estrutura de DNA, inibição da síntese de

RNA, ou paralisação do processo de transcrição. Do ponto de vista da biologia

celular, um composto que possa induzir apoptose em células tumorais (ZHANG et

al., 2007) e/ou inibir a proliferação dessas células pela parada do ciclo celular

(JIANG et al., 2005) pode desempenhar papel importante.

Existem vários fatores relacionados à progressão ou parada do ciclo de uma

célula. Dentre esses fatores podem-se destacar os checkpoints que nada mais são

do que pontos específicos durante o ciclo celular em que a célula realiza uma

checagem de sua maquinaria e material genético para poder prosseguir para a

próxima fase (ALBERTS et al., 2008).

A incapacidade no controle do processo de ciclo celular traz consigo um preço

elevado, onde eucariotos superiores têm um sistema de segurança para "manipular

a sua morte celular", segundo a qual seu programa básico de vida sofre apoptose

(REDDYA, ODHAVA, BHOOLAB, 2003).

A apoptose é uma forma de morte celular que ocorre durante várias situações

normais e patológicas em organismos e contribui para a substituição de células, a

remodelação do tecido e remoção das células danificadas em condições normais

(DE‐LONG, 1988). Porém, uma característica marcante das células tumorais é a

perda da capacidade de realização da morte celular, portanto, o bloqueio da morte

celular programada, apoptose, contribui para o crescimento do tumor, promove a

progressão neoplásica e a resistência a agentes citotóxicos anticâncer (BEDI et al.,

1995).

Células que estão sofrendo apoptose apresentam mudanças morfológicas

específicas as quais incluem: formação de bolhas na membrana plasmática,

condensação do citoplasma e da cromatina, fragmentação nuclear e formação dos

corpos apoptóticos os quais são posteriormente submetidos à ação dos fagócitos

(CONRADT, 2009).

No processo apoptótico, existem duas vias principais de ativação na

apoptose: A) Via extrínseca, mediada pela interação ligante–receptor. Os receptores

de membrana plasmática que desencadeiam sinalização para apoptose pertencem à

superfamília de receptores do Fator de Necrose Tumoral (TNF). Uma vez unidos aos

seus ligantes, estes receptores são trimerizados e recrutam proteínas adaptadoras

ao domínio de morte citosólico (DD). Subseqüentemente, as proteínas ativam a

INTRODUÇÃO


30

caspase-8 e/ou 10 formando um complexo, onde as caspases efetoras são ativadas

(principalmente caspase-3) (KROEMER, 2007; VERMEULEN, 2005). B) Via

intrínseca, mediada pela via mitocondrial. A liberação de proteínas pró-apoptóticas

normalmente localizadas no espaço intermembranar da mitocôndria, caracterizam

esta via. Quando o citocromo c é liberado no citosol é desencadeada uma via

apoptótica dependente de caspase, onde o citocromo c ativa Apaf-1 e, por sua vez,

na presença de ATP, liga-se à procaspase-9, formando o apoptosoma. Após esta

associação, a caspase-9 ativa as caspases-3-6 e -7, permitindo a fragmentação de

DNA. No entanto, quando a proteína AIF (fator indutor de apoptose) é liberada no

citosol, uma via de morte celular por apoptose independente de caspase é ativada

(BROKER, 2005; KROEMER, 2007).

Nota-se que há ativação de caspases em ambas as vias principais de

apoptose, o que as torna um importante indicativo para o diagnóstico exato desse

tipo de morte celular. Porém, de acordo com o Comitê de Nomenclatura sobre a

Morte Celular (DCNTs), a detecção exata de uma célula em apoptose só é possível

através de uma abordagem integrada, baseada em vários aspectos tanto

morfológico como parâmetros bioquímicos. Existem alguns casos que os indícios de

apoptose em uma célula não estão relacionados a mecanismos de morte celular, por

exemplo, a exposição de fosfatidilserina em granulócitos neutrofílicos pode ser

reversível, então uma abordagem apenas com citometria de fluxo seria errônea

(KROEMER, 2009).

1.4.2 Potencial antiproliferativo de macroalgas marinhas

As principais terapias utilizadas no combate ao câncer envolvem o ataque

direto as células tumorais e menos comumente a o uso de imunoestimulantes (INCA,

2012). O ataque ao tumor pode ocorrer através de remoção cirúrgica, uso de

radioterapia, e principalmente, uso de quimioterápicos. Muitos desses fármacos

quimioterápicos apresentam mínimos benefícios à sobrevivência do paciente, pois

podem selecionar células resistentes ao medicamento, além de geralmente

possuírem elevada toxicidade, por não serem seletivos para as células tumorais, o

que gera diversos efeitos colaterais (MACDONALD & ASTROW, 2001; RABIK &

DOLAN, 2007).

INTRODUÇÃO


31

Devido a esses fatores existe uma grande busca por compostos que possam

promover a morte seletiva de células cancerígenas (PASTAN & FITZGERALD, 1991;

KIM et al., 2010) e com isso, os compostos derivados de fontes naturais têm sido

foco de considerável atenção dos pesquisadores que procuram desenvolver agentes

terapêuticos para o combate ao câncer.

Aproximadamente um terço de todos os fármacos vendidos mundialmente são

produtos naturais ou foram desenvolvidas a partir de estruturas de compostos

originalmente naturais (MENNA, 2009) e quase 60% dos medicamentos aprovados

para tratamento de câncer são de origem natural (AMADOR et al., 2003). Contudo,

muitas espécies, principalmente de fungos, plantas, macroalgas e invertebrados e os

compostos que lhes são inerentes ainda não foram avaliados como

anticancerígenos, o que faz com esses organismos sejam protagonistas na busca de

compostos anticancerígenos em vários estudos

(YUAN & WALSH, 2006; LAVI et al., 2006; GAMAL-ELDEEN et al., 2007,

JOSEP LLORET, 2010). Apesar disto, com os avanços dos estudos, algumas

classes de compostos, por apresentarem maior potencial, passaram a ser mais

procuradas em detrimento de outras, assim moléculas comocompostos fenólicos

(YUAN & WALSH, 2006), polissacarídeos neutros (CHEN & CHANG, 2004; LAI,

WONG, CHEUNG, 2008), açúcares aminados (DESLANDES et al., 2000), e

polissacarídeos sulfatados (WANG et al., 2008) quando identificados em organismos

ainda não estudados recebem um enfoque especial afim de se identificar se eles

possuem ou não atividade anticancerígena.

Algas marinhas sintetizam muitos dos compostos anticancerígenos citados

acima. Além disso, há alguns anos o consumo regular de algas e seus produtos

foram associados com efeitos supressivos sobre o desenvolvimento de neoplasias,

tanto benignas quanto malignas (cancêr) (ESKIN, GROTKOWSKI, & CONNOLLY,

1995).

Estudos posteriores mostraram a importância das algas como componentes

alimentares em comunidades asiáticas, como kelps (nome popular para diversas

algas marrons) e outras algas vermelhas e verdes, pois combatiam a formação de

neoplasias como de mama (FUNAHASHI et al., 2001), pele (HIGASHI-OKAI, OTANI,

& OKAI, 1999) e intestino (LEE & SUNG, 2003).

INTRODUÇÃO


32

Outros estudos mostraram que a administração de algas em pó ou seus

extratos também reduziam a taxa de incidência de tumorigênese. Estas preposições

são baseadas usando estudos in vitro e modelos animais in vivo (PARK et al., 2005;

BAE & CHOI, 2007). Por isso, há uma crescente corrente que recomenda o

consumo de algas não só como alimentos nutritivos, mas também como

nutracêuticos, ou seja, alimentos com atividade terapêutica (MORAES & COLLA,

2006).

Estudos com moléculas sintetizadas por algas mostraram que um grupo

importante de compostos a que se têm atribuído atividades antitumorais é o grupo

dos compostos fenólicos, que por possuírem propriedades antioxidantes podem

conferir proteção do material genético celular contra a ação oxidativa de espécies

reativas de oxigênio, que é um fator de grande relevância para a carcinogênese. Por

exemplo, os fluorotaninos derivados da alga marrom Laminaria japonica mostraram

considerável atividade antiproliferativa contra células de carcinoma hepático (BEL-

7402) e células de linhagem de leucemia murina (P388) de forma dose dependente

(YANG et al., 2010).

Avaliando extratos etanólicos da alga marrom Undaria pinnatifida, Nishibori e

colaboradores (2012) evidenciaram 80% de redução da viabilidade de células de

cancêr de cólon (HCT116) com apenas 2% de extrato após 24 h de tratamento. Os

resultados obtidos por esses autores com relação a mudanças nas características

morfológicas e ativação de caspase 3 levaram os autores a atribuir a morte dessas

células por apoptose. A partir de outros dados os autores afirmaram que este extrato

causa o seu efeito tóxico sobre as células provavelmente através de um mecanismo

diferente daqueles subjacentes à efeitos carcinoestáticos de 5-fluorouracil (5-FU) e

irinotecan (CPT-11), fármacos de referência utilizados no tratamento desse tipo de

cancêr (NISHIBORI et al., 2012).

Há trabalhos que apontam a capacidade de compostos polifenólicos algais em

controlar o crescimento do tumor tanto in vitro (YUAN & WALSH, 2006) como in vivo

(HWANG et al., 2006). Neste último, uma administração de polifenóis de algas numa

taxa de 0,1%-0,5% da alimentação de ratos resultou numa diminuição de até 60%

do volume do tumor, sendo atribuída a esta diminuição a inibição da enzima COX 2

(ciclooxigenase 2) e proliferação celular (HWANG et al., 2006).

INTRODUÇÃO


33

Carotenóides, como a fucoxantina encontrada em algas marrons, tem efeito

antiproliferativo em células de leucemia humana (ISHIKAWA et al., 2008), de câncer

de cólon (Caco-2, HT-29 e DLD-1) (HOSOKAWA et al., 2004) e de próstata (PC-3,

DU 145 e LNCaP) (KOTAKE, ASAI & NAGAO, 2005; KOTAKE NARA et al, 2001). O

efeito de indução de apoptose pela fucoxantina nestes tipos celulares tem sido

relatada e associada com ativação de caspase-3, -8 e -9 (HENGARTNER, 2000),

indução da fragmentação de DNA e diminuição dos níveis de proteína supressora de

apoptose (Bcl-2) (HOSOKAWA et al., 2004).

Recentemente, Ganesan e colaboradores (2011) relataram que sifonaxantina,

derivada da alga verde Codium fragile, inibe de forma mais potente o crescimento de

células HL-60 (células de leucemia humana) do que fucoxantina. Este trabalho

revela a importância do grupo hidroxila da sifonaxantina para o forte efeito inibitório

encontrado (GANESAN et al., 2011). Porém, o atual conhecimento da relação entre

a estrutura e a atividade apoptótica da fucoxantina e seus derivados é incerto,

alguns investigadores sugerem que as duplas ligações conjugadas e 5,6

monoepóxido, por serem altamente suscetíveis a ácidos, álcalis e oxigênio levam a

ocorrência de suas formas pró-oxidativas que induzir a apoptose em várias

linhagens de células de cancêr (PANGESTUTIA, KIMA, 2011).

Açúcares, tais como, laminaranas, fucanas, fucoidans, representamoutros

compostos anticancerígenos de algas (YAMASAKI et al., 2009; YE et al., 2005).

Porfirana, umtipo de polissacarídeoextraído de algas vermelhas do gênero Porphyra

sp. apresentaram atividades antitumorais (GUO, XU, & ZHANG, 2007; ZHAO et al.,

2006), e induziram apoptose em linhagens de células de câncer gástrico, AGS

(KWON, NAM, 2006).

Com relação a polissacarídeos, mais precisamente polissacarídeos sulfatados,

o efeito antiproliferativo in vitro de uma classe desses compostos extraídos de algas

marrons, as fucanas, frente a diversas linhagens tumorais já vem sendo estudado há

um longo tempo. Como, por exemplo, pode-se citar o efeito antiproliferativo de

fucanas frente a células oriundas de carcinoma broncopulmonar (RIOU et al., 1996),

hepatoma (HAYAKAWA et al., 2000), carcinoma de Ehrlich (ITOH et al., 1995),

adenocarcinoma de mama (YAMASAKI et al., 2009), carcinoma de cervix uterino

(COSTA et al., 2011), leucemia (SONG et al., 2010), câncer de colo retal (KIM et al.,

2010) e linfoma (AISA et al., 2005). Sua ação sobre a proliferação celular ocorre

INTRODUÇÃO


34

principalmente por duas maneiras: promove parada do ciclo celular e/ou induz morte

celular, além disso, os estudos aqui citados mostram que esse efeito antiproliferativo

se dá devido a uma ação direta das fucanas. Relata-se também que para que esses

polissacarídeos desempenhem seus efeitos nas células o teor de sulfato presente

em suas moléculas é de importância crucial (TANIGAWA et al., 2003; HAROUN-

BOUHEDJA et al., 2000).

OBJETIVOS


35

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo é a obtenção de extratos metanólicos de várias

espécies de algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte e avaliar a suas

atividades anticoagulante, antioxidante e antiproliferativa in vitro.

2.2. Objetivos específicos

- Coletar de 10 a 15 espécies diferentes de algas marinhas na praia de Búzios - RN

e Rio do Fogo - RN;

- Obter extratos metanólicos das algas utilizando uma metodologia já estabelecida

em nosso laboratório;

- Caracterizar quimicamente os extratos metanólicos obtidos através da

quantificação de compostos fenólicos, proteínas e açúcares totais;

- Analisar a atividade anticoagulante desses compostos através dos testes de PT

(tempo de protrombina) e aPTT (tempo de tromboplastina parcialmente ativada);

- Analisar o potencial antioxidante desses compostos através de diferentes ensaios

in vitro: capacidade antioxidante total, sequestro de radical hidroxila, sequestro de

radical superóxido, quelação férrica e poder redutor;

- Avaliar a capacidade dos extratos em influenciar a citotoxicidade celular tumoral

através do ensaio de MTT e selecionar aquele (s) extrato (s) com melhor potencial

antiproliferativo para analisar o processo de morte celular através de microscopia de

fluorescência, citometria de fluxo e ensaio de ativação de caspases.

RESULTADOS


46

4. RESULTADOS 4.1 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO A escolha das espécies de algas foi feita a fim de realizar o estudo com algas

verdes (Clorophyta), marrons (Heterokontophyta) e vermelhas (Rodhophyta). Além

disso, os critérios utilizados no momento da coleta foram o de abundância da alga e

facilidade de coleta. Os espécimes foram coletados na praia de Búzios (Nísia

Floresta/RN) e Rio do Fogo (Rio do Fogo/RN) no período de Dezembro de 2009 a

Fevereiro de 2010. Dessa forma, foram selecionadas 13 espécies de algas dentre

elas 5 da divisão Clorophyta, 6 da divisão Heterokontophyta e 2 da divisão

Rodhophyta. Abaixo segue a classificação das espécies:

Figura 3.Caulerpa cupressoides variedade flabellata Børgesen

Filo: Chlorophyta

Classe: Ulvophyceae

Ordem: Bryopsidales

Família: Caulerpaceae

Gênero: Caulerpa

Figura 4.Caulerpa sertularioides (S. G Gmelin) M Howe

Filo: Chlorophyta

Classe: Ulvophyceae

Ordem: Bryopsidales


Gênero: Caulerpa

Figura 5.Caulerpa prolifera (Förssk.) J. V. Lamour

Filo: Chlorophyta

Classe: Ulvophyceae

Ordem: Bryopsidales


Gênero: Caulerpa

RESULTADOS


47

Figura 6.Caulerpa racemosa (Försskall) J. Agardh variedade occidentalis (J.

Agardh) Börgensen

Filo: Chlorophyta

Classe: Ulvophyceae

Ordem: Bryopsidales


Gênero: Caulerpa

Figura 7.Codium isthmocladum Vickers

Filo: Chlorophyta

Classe: Bryopsidophyceae

Ordem: Bryopsidales

Família: Codiaceae

Gênero: Codium

Figura 8.Dictyopteris delicatula J.V. Lamouroux

Divisão: Heterokontophyta

Classe: Phaeophyceae

Ordem: Dictyotales

Família: Dictyotaceae

Gênero: Dictyopteris

Figura 9.Dictyota ciliolata Sond. ex Kütz



Ordem: Dictyotales


Gênero: Dictyota

Figura 10.Dictyota menstrualis (Hoyt) Schnetter, Hörnig & Weber-Peukert



Ordem: Dictyotales


Gênero: Dictyota

RESULTADOS


48

Figura 11.Dictyota mertensii (Martius) Kützing



Ordem: Dictyotales


Gênero: Dictyota

Figura 12.Spatoglossum schröederi (C. Agardh) Kützing



Ordem: Dictyotales


Gênero: Spatoglossum

Figura 13.Sargassum filipendula C. Agardh



Ordem: Fucales

Família: Sargassaceae

Gênero: Sargassum

Figura 14.Acanthophora spicifera (Vahl) Børgesen

Divisão: Rhodophyta

Classe: Florideophyceae

Ordem: Ceramiales

Família: Rhodomelaceae

Gênero: Acanthophora

Figura 15.Botryocladia occidentalis (Borgesen) Kylin

Divisão: Rhodophyta

Classe: Florideophyceae

Ordem: Rhodymeniales

Família: Rhodymeniaceae

Gênero: Botryocladia

RESULTADOS


49

As espécies de algas B. occidentalis, S. filipendula e D. mertensii foram

coletadas na praia de praia de Rio do Fogo – RN, todas as outras foram coletadas

na praia de Búzios – RN.

4.2 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS METANÓLICOS

Após o processo de obtenção dos extratos metanólicos (ME) de todas as

algas, esses foram solubilizados em 50% (v/v) metanol/ água para serem analisados

com intuito de se determinar o conteúdo de proteínas, açúcares totais e fenólicos

totais como mostrado na tabela III.

A quantidade de açúcares totais presente nos ME das diferentes espécies de

algas marrons variou de 0,3 (S. filipendula) a 241 mg/g (D. metensii). Os valores de

açucares totais encontrados nos ME das algas verdes foram, na maioria, menores

do que aqueles encontrados nas algas marrons, esses valores variaram de 10,6

mg/g para C. racemosa a 88,8 mg/g para C. prolifera. Com relação aos ME de algas

vermelhas não foi detectado a presença de açucares totais nestes extratos nas

condições avaliadas (até 100 µg).

Já com relação ao conteúdo de polifenóis totais todos os extratos tiveram

quantidades detectáveis destes componentes, sendo o extrato de C. sertularioides o

que apresentou a maior concentração de compostos fenólicos, 109,3 mg/g de

extrato.

Em todos os extratos, nas condições testadas, foram detectados apenas

traços de proteínas.

4.3 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE PELOS ENSAIOS DE aPTT e PT

A atividade anticoagulante dos ME foi avaliada pelos testes de PT e aPTT que

avaliam as vias extrínseca e intrínseca da coagulação, respectivamente. No

presente estudo, nenhum dos extratos foi capaz de duplicar o tempo de coagulação

em relação ao controle com a massa de 100 µg para ambos os testes (tabela III).

RESULTADOS


50

Extratos

Metanólicos

Dosagens Tempo de Coagulação (s)

Açúcares

Totais

(mg/g)

Compostos

Fenólicos

(mg/g)

Proteínas

(mg/g) aPTT PT

D. mentrualis 178,4 ± 3,45 5,5 ± 0,16 nd 67,50 ± 5,2 9,07 ± 2,57

D. ciliolata 148,3 ± 3,95 46,0 ± 0,39 nd 45,97 ± 5,51 11,13 ± 4,22

D. mertensii 241,9 ± 2,10 12,0 ± 0,03 nd 43,63 ± 3,84 13,30 ± 4,59

D. delicatula 182,0 ± 0,33 12,0 ± 0,01 nd 53,10 ± 2,38 18,63 ± 2,84

S. filipendula 0,3 ± 1,68 11,0 ± 0,02 nd 39,10 ± 2,06 12,40 ± 0,44

S. schröederi 120,5 ± 0,58 30,7 ± 0,06 nd 37,80 ± 0,69 13,20 ± 5,76

C. prolifera 88,8 ± 1,09 32,4 ± 1,09 nd 56,87 ± 4,10 16,43 ± 0,71

C. cupressoides 18,1 ± 2,10 41,4 ± 0,38 nd 43,83 ± 0,90 13,37 ± 0,15

C. sertularioides 14,6 ± 0,50 109,3 ± 1,60 nd 46,60 ± 6,19 17,57 ± 0,32

C. racemosa 10,6 ± 1,01 25,6 ± 0,39 nd 38,63 ± 5,72 14,97 ± 1,29

C. isthimocladum nd 13,0 ± 0,10 nd 38,07 ± 2,65 8,63 ± 2,66

B. occidentalis nd 7,4 ± 0,05 nd 35,20 ± 6,18 14,87 ± 1,36

A. spicifera nd 9,9 ± 0,02 nd 36,20 ± 1,05 16,93 ± 8,47

Controle - - - 40,03 ± 1,92 12,20 ± 0,85

Clexanne - - - 81,20 ± 0,40 *

Tabela III. Composição química e atividade anticoagulante de extratos

metanólicos de algas.APTT - Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativada; PT – Tempo de

Protrombina; * - não determinado; nd – não detectado com massa testada; s - segundos; Clexane –

heparina de baixo peso molecular. A massa utilizada nos testes anticoagulantes foi de 100 µg e a

concentração de clexanne foi de 0,1 µg/mL. Os dados são expressos como média (n=3) ± desvio

padrão de três determinações.

4.4 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Existem diversos métodos para a determinação das atividades antioxidantes.

Por isso, a atividade antioxidante in vitro dos extratos metanólicos das algas foi

avaliada por diferentes ensaios: capacidade antioxidante total (CAT), poder redutor,

quelaçãoférrica, sequestro do radical hidroxila e sequestro do radical superóxido.

RESULTADOS


51

4.4.1 Capacidade Antioxidante Total

O teste da capacidade antioxidante total (CAT) avalia a habilidade que

umaamostra tem em doar elétrons, ou seja, se oxidarem e assim neutralizar

espéciesreativas, como EROs.

Os MEde todas as algas exibiram atividade neste ensaio (figura 16), que tem

seu resultado expresso em mg deequivalentes de ácido ascórbico/ g de extrato.

Os extratos das algas marrons da família Dictyotaceae tiveram os melhores

valores de CAT, cerca de 30 mg equivalentes de ácido ascórbico (EAA)/g, sem

diferença significativa entre elas. A exceção foi o extrato de S. schröederi, que

apesar de ser uma Dictyotaceae apresentou um valor de CAT semelhante (p<0,01)

ao de S. filipendula, que é uma Fucales.

O extrato da alga verde C. prolifera apresentou um valor de CAT

significativamente semelhante ao da maioria daqueles obtidos com os extratos das

algas marrons. Já os outros extratos de algas verdes apresentaram um valor de CAT

inferior aos observados para o ME de C. prolifera, com destaque o ME de C.

sthimocladum que apresentou baixo valor de CAT (7,2 mg EAA/g).

Os extratos das algas vermelhas apresentaram um valor de CAT

significativamente semelhantes entre si, e sendo superiores apenas o valor de CAT

encontrado para o ME de C. isthmocladum.

RESULTADOS


52

Figura 16.Capacidade antioxidante total dos extratos metanólicos de algas

tropicais. Esses resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico (mg) por extrato

(g) . Os dados são expressos como média ± desvio padrão. a,b,c,d.e,f

Indicam diferença significativa (p <

0.01) entre os diferentes extratos de algas.x,y,z,w

Indicam diferença significativa (p < 0.01) entre os

extratos das diferentes classes de algas.

4.4.2 Poder Redutor

O ensaio do poder redutor também avalia a capacidade da amostra em doar

elétrons. Apesar de ter o mesmo objetivo que o teste de CAT, estes são realizados

em condições de reação diferentes, o que afeta a capacidade da amostra em atuar

como agente redutor.

O resultado deste ensaio é expresso em porcentagem de atividade mostrada

pelo ácido ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL, um antioxidante padrão. Para a

maioria dos extratos pode-se observar uma resposta dose-dependente (p<0,01)

neste ensaio de atividade antioxidante.

O perfil do gráfico de poder redutor (figura 17) pode ser considerado bem

semelhante ao de CAT, os ME de D. cilliolata, D. menstrualis e C. prolifera

continuaram apresentando os maiores valores de atividade, entretanto os ME de

outras algas não apresentaram desempenho semelhante ao que foi observado no

CAT. O resultado mais marcante é o do extrato da alga C. cupressoides que no CAT

RESULTADOS


53

apresentou um valor que se assemelhou ao de alguns valores obtidos com os ME de

algumas algas marrons, e agora neste teste foi bem menos pronunciado.

Figura 17.Poder redutor dos extratos metanólicos de algas tropicais.Poder redutor

é expresso em porcentagem de atividade mostrada em 0,2 mg/mL de ácido ascórbico . Os dados são

expressos como média ± desvio padrão. a,b,c

Indicam diferença significativa (p < 0.01) entre as

diferentes concentrações do mesmo extrato de alga.x,y,z,w ,k

Indicam diferença significativa (p < 0.01)

entre a mesma concentração dos extratos de diferentes algas.

4.4.3Sequestro dos radicais Superóxido (O2•-) e Hidroxila (OH ·)

Um agente antioxidante pode atuar não somente como doador de elétrons,

mas também, como sequestrador de substâncias reativas. Por esse motivo avaliou-

se a capacidade dos ME em sequestrar os radicais superóxido e hidroxila. Uma

análise dos dados mostrou que nenhum dos extratos apresentou atividade

antioxidante pelo mecanismo de sequestro desses radicais até a concentração

máxima testada (2 mg/mL) (dados não mostrados).

4.4.4. Quelação Férrica

Diante da importância da atividade quelante de metal (em especial o Fe2+) foi

realizado o teste de quelação férrica. Neste ensaio, a ferrozina forma um complexo

RESULTADOS


54

com o íon Fe2+ (proveniente do FeCl2), de coloração rosa. A diminuição dessa

coloração, monitorada por espectrofotometria a 562 nm, é indicativa de atividade.

Em virtude dos ME de algumas algas (principalmente as marrons) terem uma

coloração que interfere com a visualizada no ensaio não foi possível à realização

desse teste para eles, evitando assim um viés no resultado. Dessa forma, os ensaios

foram realizados com apenas oito dos extratos avaliados neste trabalho eos

resultados estão sumarizados na figura 18.

Os extratos das algas marrons, da única alga vermelha avaliada e de C.

sertulariodes e C. isthimocladum apresentaram baixa atividade quelante. Já os

extratos de C. prolifera e C. cupressoides apresentaram atividade intermediáriaentre

os extratos, em torno de 50% de quelação na maior concentração testada. O

destaque foi o extrato da alga verde C. racemosa que apresentou quase 100 % de

atividade quelante de íons ferro na concentração de 2,0 mg/mL.

Figura 18. Quelação férrica dos extratos metanólicos de algas tropicais.Os dados

são expressos como média ± desvio padrão. a,b,c

Indicam diferença significativa (p < 0.01) entre as

diferentes concentrações do mesmo extrato de alga.x,y,z

Indicam diferença significativa (p < 0.01)

entre a mesma concentração dos extratos de diferentes algas.

RESULTADOS


55

4.5 CITOTOXICIDADE

4.5.1 Efeito de ME em células HeLa

A fim de analisar o efeito dos ME na viabilidade de células tumorais uterinas

(HeLa) estas foram tratadas com diferentes ME de algas e sua viabilidade foi

determinada usando o ensaio colorimétrico de MTT.

Os extratos das algas vermelhas promoveram uma inibição (10 a 20%) da da

viabilidade das células HeLa. No caso do ME de B. occidentalis, não foi possível

identificar claramente se esse efeito foi dose e/ou tempo dependente. Porém, o ME

de B. occidentalis apresentou atividade inibitória com 24 h de aproximadamente 10%

que posteriormente tendeu a aumentar com o tempo até cerca de 20% (Figura 19 a;

b). Com relação ao ME de A. spicifera observou-se uma da viabilidade (~20%) já na

menor concentração testada, porém esta atividade não aumentou com o aumento da

concentração ou tempo de exposição ao extrato.

Os ME das algas verdes também foram capazes de diminuir a taxa de

viabilidade das células HeLa. Contudo, esta inibição em nenhuma das condições

avaliadas chegou a ultrapassar o valor de 35%. Contudo, o padrão de inibição não

foi semelhante entre os extratos. Os ME das algas C. prolifera e C. sertularioides na

maioria das condições testadas apresentaram, efeito inibitório. Contudo, em muitos

casos este efeito não se mostrou diferente significativamente dos controles. Apesar

disto, eles apresentaram uma tendência de atividade inibitória dose e tempo

dependente. Já o ME de C. racemosa no tempo de 24 e 48 horas não apresentou

atividade inibitória, mas no tempo de 72 h ele apresentou atividade inibitória média

de 20%, entretanto, este efeito não foi dose dependente. O ME de C. isthimocladum

no tempo de 72 h também apresentou atividade inibitória dose não dependente em

torno 20%, porém diferente do ME de C. racemosa, ele também apresentou

atividade inibitória dose não dependente (~22 %) com 48 h de experimento. O ME

de C. cupressoides foi o que aprestou maior taxa de inibição da proliferação das

células HeLa, em trono de 32%, porém, como os dois ME anteriores ele também

apresentou um efeito apenas tempo dependente.

Os ME das algas marrons S. schröederi e S. filipendula não apresentaram

atividade citotóxica em todas as condições testadas. Já o ME de D. mertensii só

apresentou atividade significativa com 72 h de experimento e nas duas maiores

RESULTADOS


56

concentrações avaliadas. O ME de D. delicatula apresentou uma taxa de inibição da

viabilidade em torno de 22% com 48 h de exposição. Contudo, esta taxa não se

alterou com 72 h. Também, não se observou um efeito dose dependente. Os ME

mais potentes foram as das algas D. cilliolata (MEDC) e D. mentrualis (MEDM).

MEDC apresentou um efeito tempo de pendente e chegou a uma taxa de inibição da

viabilidade celular de cerca de 50% após 72 h de experimento (200 µg/mL). Já

MEDM apresentou um efeito dose e tempo dependente chegando ao máximo de

inibição com 200 µg/mL após 48 h de exposição.

RESULTADOS


57

Figura 19. Influência de ME de algas tropicais na viabilidade de células HeLa

após 24, 48 e 72 h de incubação.Dados são expressos em média± desvio padrão. * Indica

diferença significativa (p <0.01) entre diferentes concentrações de ME no tempo de 24 horas. # Indica

diferença significativa (p <0.01) entre diferentes concentrações de ME no tempo de 48 horas. + Indica

diferença significativa (p <0.01) entre diferentes concentrações de ME no tempo de 72 horas.

4.5.2 Efeito de MEDC e MEDM nas Células 3T3

Como MEDM e MEDC exibem atividade inibitória contra células tumorais

HeLa, resolveu-se avaliar o efeito destes extratos frente uma linhagem de células

não tumorais, no caso fibroblastos 3T3. Como observado na figura 20 a taxa de

viabilidade celular das células 3T3 não foi afetada pela presença dos extratos em

todas as condições avaliadas.

RESULTADOS


58

Figura 20.Influência de MEDM eMEDC na viabilidade de células normais 3T3

depois de 24, 48 e 72 horas de incubação. Dados são expressos em média ± desvio

padrão. Não houve diferenças significativas entre as diferentes concentrações dos ME nos tempos de

24, 48 e 72 horas (p< 0.01).

4.6 CARACTERIZAÇÃO DO EFEITO DE MEDC E MEDM NAS CÉLULAS HELA

4.6.1 Efeito de MEDC e MEDM na morfologia das Células HeLa

Os ensaios posteriores com células foram realizados com MEDC e MEDM,

pois estes dois extratos foram os ME mais potentes como agentes citotóxicos.

Análises de microscopia de luz foram realizadas para se observar as

mudanças morfológicas nas células HeLa induzidas pelos tratamentos com MEDC e

MEDM. Como visto na figura 21, células HeLa não tratadas exibem um padrão típico

de morfologia normal em todos os tempos analisados, evidenciados pelo aspecto

celular fusiforme, com uma distribuição poucohomogênea em relação ao tamanho,

além de apresentarem várias projeções demembrana (filopódios e lamelipódios)

evidenciando motilidade celular.

Por outro lado, células tratadas com MEDM e MEDC mostraram uma clara

mudança morfológica que pode ser caracterizada pela diminuição do tamanho

RESULTADOS


59

celular (redução dos contatos célula-célula). Além disso, a freqüência de células

redondas (provavelmente células mortas) aumentou com o aumento do tempo de

exposição à MEDM e MEDC.

Figura 21. Mudanças morfológicas de células HeLa após o tratamento com

MEDC e MEDM em diferentes tempos. Células HeLa foram tratadas com 0,2 mg/mL de

extrato. Após incubação, as células foram examinadas em microscópio de luz. Os dados são

representativos para testes em duplicatas. Ampliação, ×100.

4.6.2 Mudanças na morfologia nuclear

As células HeLa foram tratadas com extratos a 0,2 mg/mL de concentração

por 24 h, e a morfologia nuclear foi observadaapós coloração com DAPI.

Na figura 22 observa-se células HeLa tratadas com extratos apresentando

núcleos com cromatina condensada e corpos apoptóticos de diferentes

tamanhos,que são características típicas de apoptose. Estas modificações

RESULTADOS


60

morfológicas foram observadas com maior freqüência quando MEDC foi utilizado, o

que fortalece a hipótese de que a atividade citotóxica destes dois extratos está

relacionada com indução de apoptose nas células HeLa.

Figura 22. Mudanças morfológicas em células HeLa após o tratamento com

MEDC e MEDM por 24h seguido de marcação com DAPI. (A) Fotografias de

microscopia de fluorescência de células HeLa não tratadas, (B) células tratadas com 0,2 mg/mL de

MEDM e (C) células tratadas com 0,2 mg/mL de MEDC. Setas indicam condensação de cromatina e

corpos apoptóticos de fragmentação nuclear. Amplificação, × 200.

4.6.3Efeito do MEDC e MEDM na marcação das célulascom iodeto de

propídeo e anexina V.

Anexina V e iodeto de propídeo (PI) são dois marcadores muito utilizados

para se diferenciar células em apoptose e em necrose. Geralmente, células

marcadas com anexina V são indicativo de apotose inicial, células marcadas com PI,

indicativo de necrose, e células positivas para anexina e PI são indicativo de

apoptose tardia.

Assim, as células HeLa foram incubadas com MEDC e MEDM (0,2 mg/mL)por

24 h, e posteriormente foram marcadas com PI e anexina V. Os dados obtidos são

visualizados nafigura 23. Tanto MEDM e MEDC diminuíram o número de células

viáveis em comparação com o controle de 99% para ~70%. Contudo, pode-se

também observar que o tratamento com MEDM aumentou principalmente a

percentagem de células positivas (16%) para anexina (anexina V-FITC + / PI-), com

apenas cerca de 3% de células positivas para PI (anexina V-FITC-/PI +), sugerindo

RESULTADOS


61

uma apoptose inicial. Enquanto que o tratamento com MEDC, apesar de mostrar um

percentual (17,4%) semelhante de células positivas para anexina (anexina V-FITC +

/ PI-) ao do tratamento com MEDM, o tratamento com MEDC também aumentou a

percentagem de células positivas PI (7,99%) (anexina V-FITC-/PI +), o que sugere

tanto a presença de células em apotose inicial como células em necrose.

Figura 23. Análises de citometria de fluxo de células HeLa tratadas com MEDC

e MEDM. (A) Os gráficos de pontos exibem a morte de células HeLa tratadas com 0,2 mg/mLde

ME. (B) Cada barra representa a média ± desvio padrão. A significância foi determinada por ANOVA

com pós teste de Tukey (*, p < 0.01 vs. controle negativo; **, p < 0.01 vs. ME). Anexina-/PI- (Q4),

células viáveis; Anexina+/PI- (Q3), células em apoptose; Anexina+/PI+ (Q1), células em estágio final

de apoptoose; Anexina+/PI+ (Q2), células em necrose. Estes gráficos de pontos são representativos

de três ensaios independentes.

RESULTADOS


62

4.6.4 Efeito dos extratos no ciclo das células HeLa

Para determinar se o tratamento nas células com MEDC e MEDM resultou em

uma alteração na progressão do ciclo celular, os padrões do ciclo celular das células

HeLa foram examinados. Blots representativos são mostrados na figura 24a e os

resultados de quantificação são fornecidos na tabela 24b.

Análises do ciclo celular por citometria de fluxo mostraram que após o

tratamento das células HeLa com os extratos, houve uma mudança no perfil de

distribuição das células pelas diferentes fases do ciclo celular. Os dois extratos

provocaram uma diminuição na quantidade de células na fase G1 e aumentaram o

número de células na fase S do ciclo celular, principalmente MEDC. Contudo, os

efeitos dos extratos na quantidade de células na fase G2/M foram diferentes,

enquanto MEDC praticamente não afetou o percentual de células nesta fase, MEDM

provocou uma redução do número de células nesta fase.

O tratamento com os dois extratos provocou também um aumento marcações

positivas em sub G1, principalmente MEDM, o que é mais um indício que estes

extratos possuem atividade antiproliferativa por induzirem apoptose.

RESULTADOS


63

B

Figura 24. Análises de ciclo celular de células HeLa por citometria de fluxo

após 24h de tratamento. Após o tratamento com MEDM e MEDC, as células foram recolhidas

e coradas com PI e, em seguida análise de citometria de fluxo foi realizada. (A) representação de Dot

plots obtidos após análise no FlowJo (B) A tabela sumarizaas médias dos valores obtidos em três

determinações ± desvio padrão.

4.6.5 O tratamento com MEDC e MEDM promove ativação das caspases

em células HeLa

Para a execução da apoptose, a ativação de uma família de caspasesse faz

necessário. Como o iniciador, pró-caspases-9 são ativadas por auto-

processamentos e clivam a jusante procaspase-3 para tornar-se ativa na forma

dimérica da caspase-3 como executor da apoptose (KWON et al., 2007).

Para verificar se MEDC e MEDM induzem a ativação destas caspases (9 e 3),

células HeLa foram tratadas com MEDC e MEDM por diferentes tempos e atividades

Amostras Sub-G1

Ciclo Celular

G0/G1 S G2/M

Controle 1,90 ± 0,23 69,4 ± 0,31 18,4 ± 0,27 8,6 ± 0,05

MEDM 14,9 ± 0,17 57,6 ± 0,10 24,2 ± 0,18 2,49 ± 0,16

MEDC 4,32 ± 0,07 52,9 ± 0,18 33,9 ± 0,13 7,80 ± 0,02

RESULTADOS


64

destas enzimas foi avaliada. Como observado na figura 25 os dois extratos

promovem o aumento da atividade capase-3 e caspase-9 de forma tempo

dependente.

Figura 25. Efeito de MEDC e MEDM na ativação de caspases. Atividade da caspase-3

(A) e caspase-9 (B) em diferentes tempos em células HeLa após 24h de tratamento. A significância

foi determinada pelo t-test de Tukey (*, p < 0.01 vs. controle negativo; **, p < 0.01 vs. ME).

A

B

RESULTADOS


65

4.7 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO DE PEARSON

Para verificação de uma possível correlação entre as atividades encontradas

e os compostos quantificados nesse estudo, determinou-se o índice de correlação

de Pearson (ρ).Na tabela IV estão os índices encontrados para a quantidade de

açúcares nos extratos e as respectivas atividades de cada classe de algas.

Enquanto que na tabela V estão sumarizados os índices obtidos para a correlação

entre atividades e compostos fenólicos. As correlações entre as algas vermelhas não

puderam ser feitas devido ao número restrito (duas) de algas estudadas.

Acúcares PT aPTT CAT Poder Redutor Quelação Férrica MTT HeLa

Algas verdes 0,4867 0,9355 0,6286 0,9721 0,1159 0,5161

Algas marrons 0,1392 0,4305 0,7876 0,3398 - 0,4321

Tabela IV. Índices de correlação entre a quantidade de açúcares nos extratos e

as respectivas atividades de cada classe de algas

Compostos Fenólicos

PT aPTT CAT Poder Redutor Quelação Férrica MTT HeLa

Algas verdes 0,6737 0,2620 0,5148 -0,2431 -0,3263 0,3462

Algas marrons -0,1274 -0,4310 -0,0658 0,0085 - 0,3712

Tabela V. Índices de correlação entre a quantidade de compostos fenólicos

nos extratos e as respectivas atividades de cada classe de algas

DISCUSSÃO


66

5. DISCUSSÃO

No estado do Rio Grande do Norte há registro de mais de cem diferentes

espécies de macroalgas marinhas, entretanto, poucas algas tiveram seus compostos

avaliados no que diz respeito à descoberta de polímeros com atividades biológicas,

o que não se justifica, pois cada alga apresenta pelo menos um composto inerente a

sua espécie, não encontrado em outras espécies, e, portanto, pode possuir

atividades farmacológicas diferentes e/ou mais potentes do que outros compostos.

Então, o trabalho de prospecção de descoberta de fitoquímicos bioativos nessas

espécies poderá propiciar o desenvolvimento de produtos de utilização farmacologia

e/ou nutricional a partir desses compostos. Bem como poderá dar um valor agregado

a uma espécie que atualmente não possui valor comercial, constatando seu valor

como matéria-prima o que poderá desencadear um evento em cadeia que

proporcionará o desenvolvimento de toda uma atividade econômica em torno da

espécie e da região em que ela se encontra (ROCHA, 2011).

O grupo em que se insere esta dissertação há mais de uma década vem

extraindo, purificando e caracterizando estruturalmente polissacarídeos sulfatados

de algas marinhas (ROCHA et al., 2001; ROCHA et al., 2005; BARROSO et al.,

2008; ALMEIDA-LIMA et al., 2010, CAMARA et al., 2011; COSTA et al., 2012).

Contudo, avaliação da outros compostos das algas estudadas pelo grupo, como

compostos fenólicos, ainda não foi realizada. Portanto, o desenvolvimento desta

dissertação foi o primeiro passo pelo grupo para começar a compreender o potencial

de outras moléculas, que não polissacarídeos sulfatados, das algas marinhas

encontradas no litoral do Rio Grande do Norte.

A escolha da alga seguiu os critérios definidos na seção de Materiais e

Métodos. Portanto, algumas algas, cujos polissacarídeos sulfatados já tinham sido

estudados pelo grupo e que tinham sido escolhidas por critérios semelhantes, foram

inclusas nesta dissertação. Além disso, tentou-se coletar algas das três classes:

marrons, verdes e vermelhas; por isso, algas que ainda não tinham sido estudadas

pelo grupo, como D. ciliolata, C. prolifera, B. occidentalis foram incluídas neste

estudo.

As análises químicas dos extratos metanólicos de todas as algas levaram a

observação que açúcares, proteínas e compostos fenólicos estavam presentes em

DISCUSSÃO


67

todos estes extratos. Contudo, a proporção destes constituintes variou de alga para

alga. Como foram mantidas todas as condições de obtenção dos ME constantes,

acredita-se que estas diferenças ocorreram devido às diferenças individuais das

espécies de algas analisadas. A presença destes constituintes em extratos

metanólicos de algas, mesmo de açucares que se encontrou em altas concentrações

em algumas algas, não foi uma surpresa tento em vista que as algas são ricas em

compostos fenólicos, proteínas e principalmente grandes quantidades de açucares

(STENGEL, CONNAN E POPER, 2011). Mas, não foi objetivo, durante o

desenvolvimento desta dissertação, caracterizar os constituintes glicídicos, nem os

tipos de polifenóis presentes nos ME. Contudo, açúcares são moléculas que

apresentam várias atividades farmacológicas, portanto pretende-se posteriormente

isolar estes compostos dos ME e avaliar seu potencial farmacológico.

Com relação aos compostos fenólicos, apenas o ME de C. sertularioides

apresentou um valor elevado de compostos fenólicos, os demais extratos

apresentaram concentrações de compostos fenólicos em torno de 20 mg de

equivalentes de ácido gálico/g de extrato, valor este abaixo do encontrado para

extratos metanólicos de outras algas (DEVI et al, 2006). Vários trabalhos mostram o

isolamento e identificação de uma série de compostos polifenólicos de algas;

catequinas, flavonóis e glicosídeos flavonóides já foram descritos emalgas

vermelhase marrons (YOSHIE et al, 2000; YOSHIE-STARK et al, 2003). Outro

trabalho de Santoso e colaboradores em 2004 fez uma caracterização dos

compostos fenólicos existentes em 12 algas da Indonésia e do Japão, e dentre elas

a C. sertularioides. Estes autores mostraram que esta alga sintetiza isômeros de

catequina: galocatequina, epicatequina e catequina galato. Uma análise das

publicações sobre esse assunto indica que há um consenso comum: as classes de

compostos fenólicos e a quantidade de cada um deles nas algas variam entre cada

espécie e para mesma espécie em diferentes localidades. Portanto, pretende-se

futuramente identificar e purificar os principais compostos fenólicos encontrados nas

algas avaliadas nesta dissertação.

De longe, a atividade mais estudada de extratos aquosos ricos em glicídeos

de algas é a atividade anticoagulante. Contudo, como pode ser observado na tabela

III, nenhum dos extratos apresentou esta atividade nas condições testadas. Não há

relatos de estudos que avaliam a atividade anticoagulante de extratos metanólicos

DISCUSSÃO


68

de algas, mas para plantas alguns estudos foram feitos. Por exemplo, Zheng et alem

1998 obtiveram triterpernóides (pertencem à classe dos terpenos) do

extratometanólico de Geum japonicum, que mostraram significante

efeitoanticoagulante na via extrínseca da coagulação (ZENG et al., 1998). Neste

mesmo ano Dong et al. (1998) isolaram sete taninos desta planta, destes um tem

efeitoinibitório competitivo diretamente contra a trombina, quatro tiveram

efeitoinibitório não competitivo e os demais não apresentaram

atividadeanticoagulante.

Assim, acredita-se que as moléculas obtidas a partir da metodologia

empregada de extração provavelmente não têm estruturas favoráveis para interagir

com proteínas envolvidas no processo de coagulação e, portanto, não apresentam

atividade anticoagulante ou se tiverem, foram obtidas em baixa concentração o que

impediu a detecção da atividade anticoagulante nos extratos.

Outra atividade que nos últimos anos vem recebendo destaque para

compostos extraídos de algas é a atividade antioxidante.Existem diversos métodos

para a determinação das atividades antioxidantes. A complexidade química dos

extratos, muitas vezes uma mistura de compostos com diferentes grupos funcionais,

polaridade e comportamento químico, pode levar a resultados dispersos,

dependendo do teste utilizado. Portanto, uma abordagem com múltiplos ensaios

para avaliar o potencial antioxidante dos extratos seria mais informativo e até mesmo

necessário.

Dessa forma, o primeiro ensaio a ser realizado foi o de CAT, baseadona

redução de Mo+6 para Mo+5 pelos compostos antioxidantes, e a formação

decomplexos verdes com o molibdênio reduzido. O complexo colorido verde é

bastante estável e não é afetado por vários solventes orgânicos, como o metanol,

que foi utilizado nesta dissertação para extração (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006).

Uma análise dos dados mostra que os ME das Caulerpaceaes apresentaram

um valor de EAA muito próximo. O que parece indicar que os vários representantes

da família Caulerpaceae sintetizam moléculas muito semelhantes no tocante a

capacidade de reduzir o molibdênio. Além disso, todas apresentaram um valor de

EAA maior do que o da outra alga verde analisada neste estudo, a C. isthmocladum.

Não foi possível encontrar outros artigos que avaliassem o CAT de ME de outras

Caulerpaceaes. Contudo, Costa et al., 2010 mostraram que extratos aquosos ricos

DISCUSSÃO


69

em polissacarídeos de C. cupressoides, C. prolifera e C sertularioides apresentam

um valor de CAT em torno de 20 mg EAA /g, que são inferior aos valores

observados para ME das mesmas algas. O que indica o potencial destes ME como

potentes fornecedores de compostos antioxidantes de algas.

Os ME das algas vermelhas apresentaram um valor de EAA mais baixo do

que as outras algas. Porém, estes valores foram superiores daqueles observados

para os ME das algas vermelhas Gracilaria edulis e Euchema kappaphycus, cujo os

valores de CAT foram respectivamente 0,31 e 7,2 mg EAA/g (CHANDINI et al., 2008;

GANESAN et al., 2008).

Com relação às algas marrons, as Dictyotaceaes apresentaram melhor

atividade, a exceção foi o ME de S. schröederi. Porém, todos os ME apresentaram

valores de CAT superior a aqueles encontrados na literatura para ME de outras

algas marrons, como Padina tetrastomatica (CAT 0,31 mg EAA/g) (CHANDINI et al.,

2008) e mesmo de extratos aquosos de algas como os dePadina tetrastomatica e

Turbinaria conoides que apresentaram CAT de 9,79 e 9,65 mg EAA/g

respectivamente (KUMAR et al., 2008). Vale salientar que o ME da alga S.

filipendula apresentou um valor de CAT em torno de 15 mg EAA/g, que foi inferior a

aquele obtido como extrato aquoso da mesma alga, que foi em torno de 30 mg

EAA/g (COSTA et al., 2010).

Muitos trabalhos encontraram uma correlação positiva entre compostos

fenólicos de extratos de algas e suas propriedades antioxidantes (JIMENEZ-ESCRIG

et al, 2001; KUDAet al, 2006; GANESANet al, 2008; WANGet al, 2009). Porém há

trabalhos que afirmam não existir correlação entre oteor de fenólicos totais ea

capacidade de seqüestro de radicais livres (YU et al, 2002), por isso é muito

importante analisar a correlaçãoentre o conteúdo de fenólicos totais/ teor de açúcar

e atividade antioxidante das algas estudadas.

Análises do coeficiente de correlação mostraram uma correlação positiva

entre o teor de açúcar do extrato de algas e CAT. A tendência foi considerada forte

em algas marrons (ρ = 0,7876) e moderada para algas verdes (ρ = 0,6285), o que

pode explicar o fato de as algas marrons terem apresentado melhor CAT. Não houve

correlação entre o conteúdo de compostos fenólicos e CAT. Infelizmente essas

análises não puderam ser feitas com as algas vermelhas, pois foram estudados

extratos de somente duas espécies.

DISCUSSÃO


70

O teste de CAT avalia o poder de doar elétrons em pH ácido, porém existe

outro teste com a mesma finalidade mas em pH neutro. O teste de poder redutor,

desta forma, pode gerar um resultado diferente do encontrado para o teste de CAT

numa mesma amostra. Como aconteceu nesta dissertação, os ME das algas D.

cilliolata, D. menstrualis e C. proliferativeram sua atividade pronunciada quando

comparada a CAT enquanto que alguns extratos diminuíram sua atividade (figura

16).

Um resultado semelhante foi encontrado para Costa e colaboradores (2010),

que trabalhando com extratos aquosos de onze espécies de algas marinhas

verificou que aquele obtido da alga Gracilaria caudata apresentava maior atividade

no CAT, mostrando um valor quase duas vezes maior a aqueles obtidos com as

demais algas. Entretanto, sua atividade no teste do poder redutor foi menor do que

aquela observada para o extrato de outras sete algas (COSTA et al., 2010).

O índice de correlação de Pearson entre poder redutor e açúcares totais dos

extratos de algas verdes foi de 0,9720, considerado forte, enquanto que para algas

marrons foi considerada fraca (0,3397). Mais uma vez não foi encontrada correlação

entre a atividade dos extratos e seu conteúdo de compostos fenólicos.

Radicais ânions superóxidos atuam como um oxidante, mas sendoaltamente

instáveis, imediatamente são dismutados espontaneamente ouenzimaticamente no

meio intracelular. Embora o superóxido seja umantioxidante de meia-vida

relativamente curta, ele é decomposto na formaextremamente reativa, a espécie

reativa radical hidroxila. Entre as espéciesreativas do oxigênio, o radical hidroxila é o

mais quimicamente reativo. Essesradicais podem, por exemplo, subtrair átomos de

hidrogênio de grupos tióis de moléculas biológicas e formar radicais sulfidrilas, que

são capazes de secombinar com oxigênio para gerar radicais oxisulfidrilas e

danificar moléculasbiológicas (SUDHAKAR; SINGH, 2008).

Infelizmente, os ensaios realizados com ME frente a esses dois radicais não

trouxeram resultados positivos. Porém, esta capacidade pode ser encontrada em

outras algas, como mostra o estudo da atividade sequestradora de radicais hidroxila

do extrato metanólico da alga Gracilaria filicina, este apresentou um resultado de

69% de sequestro, sendo esse 37% maior que BHA e 38% maior que BHT,

antixidantes sintéticos utilizados na indústria alimentícia (Athukorala, Lee, Song, et

al., 2003). O que leva a hipótese de queé possível que existammoléculas nos

DISCUSSÃO


71

extratos capazes de seqüestrar o radical hidroxila, mas que seencontram em

pequenas quantidades, e que por isso não tiveram sua atividadedetectada. Espera-

se que no futuro com a aplicação de passos de separação epurificação dos

compostos bioativos encontrados nestes extratos, se possacomprovar ou não esta

hipótese.

Radicais hidroxilas são os radicais livres mais agressivos, no entanto, o

sequestro destes radicaisin vivo não é muito eficaz, pois ele necessita de poucos

milissegundos para reagir com moléculas biológicas, o que torna quase inviável o

combate deste após sua formação pelo organismo (FERREIRA & MATSUBARA,

1997).Outra forma de se combater os males provocados pelo radical hidroxila é

impedir a sua formação e o principal mecanismo que suprime a geração de radicais

hidroxila é através da atividade de quelação de íons, principalmente de ferro, uma

vez que íons de metais de transição também podem reagir com H2O2 gerando o

radical hidroxila (JOMOVA et al., 2010). Além disso, alguns antioxidantes inibem a

interação entre metais de transição e lipídeos pela sua interação com íons de ferro,

por impedimento estérico ou levando a formação de complexos insolúveis (JOMOVA

& VALKO, 2011).Portanto, a atividade quelante de metal éuma propriedade bastante

interessante para um extrato ou composto,pois confere a ele a capacidade de

impedir a formação de EROs e consequentemente o dano oxidativo (KUMAR;

GANESAN; RAO, 2008).

Diversos relatos de extratos de algas com capacidade de quelar íons ferro

são encontrados na literatura (QI et al., 2005, WANG et al., 2008, CAMARA et al.,

2011), indicando que este parece ser um dos principais mecanismos de ação

antioxidante destes biopolímeros.

O excelente resultado apresentado neste trabalho (figura 18) para o ME da

alga verde C. racemosa (quase 100 % a 2,0 mg/mL) foi bastante diferente do

encontrado para mesma alga por Chew e colaboradores em 2008. Utilizando uma

massa de 2,0 mg, a atividade quelante de seus extratos metanólicos não chegou a

10%, o que pode ser explicado pela diferença na metodologia de extração (CHEW et

al., 2008). Chew e colaboradores usaram 50% de metanol para extração enquanto

que nesta dissertação utilizou-se 100% de metanol, o indica que a extração utilizada

neste trabalho favorece a liberação de compostos quelantes das algas. Corrobora

isso o fato de que Chew e colaboradores também trabalharam com extratos

DISCUSSÃO


72

metanólicos de K. alvarezii e obtiveram resultados inferiores aos de Kumar e

colaboradores em 2008, que utilizaram um método de extração semelhante ao desta

dissertação (KUMAR; GANESAN; RAO, 2008; CHEW et al., 2008).

O estudo de Kumar em 2008 avaliou extratos obtidos de diferentes solventes

da alga vermelha Kappaphycus alvarezii e encontrou atividade quelante de

aproximadamente 20% para o extrato metanólico a uma concentração de 2,0 mg/mL

(KUMAR; GANESAN; RAO, 2008), resultado semelhante ao encontrado nesta

dissertação com a única alga vermelha analisada neste ensaio, a A. spicifera. Esse

mesmo estudo notou uma resposta dose-dependente, nas concentrações de 0,5 até

5 mg/mL, porém apesar de ter ocorrido um aumento na atividade quelante para o

ME de A. spicifera, esta resposta não pode ser observado para um nível de

significância de p < 0.01.

Nas últimas décadas, polissacarídeos solúveis em água, como

polissacarídeos sulfatados, e muitos compostos fenólicos, como fluorotaninos e

flavonóides, são representativos como substâncias anticâncer extraídos de algas

marinhas (Birt et al., 2001; Anastyuk et al., 2012; Namvar, 2012).

Como polissacarídeos e compostos fenólicos foram identificados no ME das

algas estudadas no presente estudo também se investigou o potencial dos ME em

alterar a viabilidade das células da linhagem tumoral do colo do útero humano

(HeLa). Estas células foram escolhidas porque o câncer cervical é um grave

problema de saúde pública. Em todo o mundo, a cada ano, em torno de 500.000

mulheres adquirem esse tipo de câncer e quase 275.000 destas morrem acometidas

dessa doença (WHO, 2009). Ele também é considerado o segundo tipo mais comum

de câncer entre as mulheres e o tipo mais comum em mulheres de países

subdesenvolvidos e em desenvolvimento (WHO, 2010).

Atividade citotóxica dos extratos analisados nesse estudo, particularmente

MEDC e MEDM, pode ser consideravelmente alta quando comparada a outros

extratos de algas marrons, por exemplo, Laminaria setchellii, Macrocystis integrifolia

e Nereocystis leutkeana que não mostraram mais que 20% de inibição naviabilidade

de células HeLa, até a concentração de 5 mg/mL (YUAN & WALSH, 2006).

As análises dos coeficientes de correlação dos extratos das algas marrons e

verdes mostraram uma relação positiva entre a inibição da viabilidade de células

HeLa e o conteúdo, tanto de açúcar como de polifenóis.Porém, estas correlações

DISCUSSÃO


73

variaram entre fraca e moderada. É possível que a inibição da vibilidade celular

observada seja fruto de uma combinação dessas duas classes de compostos que

podem agir em conjunto para otimizar essa atividade (WAGNER & ULRICH-

MERZENICH, 2009).

Alguns relatos mostram que compostos antioxidantes apresentam atividade

citotóxica frente a linhagens tumorais (ATHUKORALA; KIM; JEON, 2006, SUN et al.,

2009, YE et al., 2008). Contudo, os ensaios celulares com os ME não mostraram

qualquer correlação direta com a atividade citotoxica apresentada por esses extratos

(YUAN; WALSH, 2006; YE et al., 2008).

Afim de se avaliar se a atividade citotóxica dos extratos estava relacionada

com capcidade de diminuir a proliferação celular e indução de morte celular, os dois

mais potentes extratos (MEDC e MEDM) foram selecionados para determinação

do(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação frente a linhagem celular tumoral

HeLa. Baseados nos resultados obtidos no ensaio de MTT, as análises posteriores

foram realizadas na concentração de 0.2 mg/mL e no tempo de 24 horas.

O desenvolvimento de compostos que apresentem característica de inibir ou

retardar a proliferação de células tumorais sem afetar células normais do organismo

é um dos grandes desafios atuais na elaboração compostos anticancerígenos não

tóxicos.Diante disso, realizou-se o mesmo ensaio de MTT frente à linhagem de

células fibroblásticas normais (3T3) que se apresenta com um bom modelo para

observação de citotoxicidade em células normais, tendo em vista que outros

trabalhos também a utilizam como referência(PELCZYNSKA et al., 2006;OLIVEIRA

et al., 2008; MELO-SILVEIRA et al., 2012).

A ausência da influência na morte das células 3T3 pelos ME aliado ao fato

que em contrapartida, frente as células tumorais HeLa os ME tiveram boa atividade

mostra que o efeito citotóxico de MEDC e MEDM também é dependente do tipo

celular e o fato de somente células tumorais estarem sendo afetadas pelos extratos

sugere que as substâncias ativas nos extratos afetam receptores específicos de

células tumorais, moléculas de expressão de células cancerosas ou de expressão do

gene que desencadeiam mecanismos que causam a morte de células tumorais.

Corrobora a nossa observação, o fato de que extratos alcoólicos da alga

vermelha Eucheuma cottonii, não apresentaram efeito tóxico em células normais de

rim do macaco verde (Vero), mas foram citotóxicas para células da linhagem de

DISCUSSÃO


74

câncer de mama MCF-7 (NAMVAR et al., 2012).

Tendo em vista o efeito citotoxico que MEDC e MEDM exerceram sobre as

células HeLa, pôde-se deduzir que alguma via de morte celular foi ativadapor estes

extratos. E, portanto, outros ensaios foram realizados para que esse processo fosse

mais bem compreendido. A morte celular pode ser classificada de acordo com a

aparência morfológica, critérios enzimológicos, aspectos funcionais ou

características imunológicas celular. A análise da morfologia celular é uma

ferramenta rápida e muito utilizada como uma das formas de diferenciação dos

diferentes tipos de morte celular: apoptose, necrose, autofagia, dentre outros

(KROEMER, 2009; MELINO, 2001).

Os dados obtidos com as análises morfológicas (microscopia de luz e

fluorescência) mostraram várias estruturas características de células, inclusive

nucleares, em apoptose que são comumente descritos pro vários autores

(CUMMINGS ET AL., 1997; DOONAN & COTTER, 2008; FALCIERI ET AL., 1994;

DOONAN & COTTER, 2008). Análises por citometria de fluxo após tratamento das

células HeLa com MEDC e MEDM mostraram dados (aumento de células positivas

para anexina V e aumento de marcações positivas em Sub-G1) que indicam que

estes extratos induzem morte celular por ativar apoptose.

Não há estudos que relatem a inibição da proliferação e indução da apoptose

em células HeLa por extratos metanólicos de algas. Porém, utilizando o alcool etílico

como solvente de extração, Kwon e colaboradores também constataram inibição da

proliferação e indução da apoptose em células HeLa contudo para alga vermelha

Corallina pilulifera (KWON, 2007). E ainda, a confirmação da apoptose foi feita no

estudo de Namvar em 2012 quando analisou a influencia de extratos etanólicos de

outra alga vermelha E. cottonii sobre o crescimento de células de linhagem de

câncer de mama estrogênio-dependente e estrogênio-independente, e que além da

apoptose, a diminuição do estresse oxidativo e regulação negativa da biossintese de

estrogênio endógeno agiam como principais mecanismos de ação in vivo contra o

câncer de mama induzido por LA7 (NAMVAR, 2012).

Um dado adicional que comprovou que extratos induzem apoptose foi a

verificação do aumento da atividade de caspase-3 e de caspase-9 das células HeLa

na presença dos extratos.Em mitocôndrias, caspase-9 é ativada para formar um

complexo com apoptossomo Apaf-1 para a ativação subsequente da caspase-3 e

DISCUSSÃO


75

execução da apoptose (WANG et al., 2005). Ou seja, os dados obtidos aqui indicam

fortemente que MEDC e MEDM promovem a morte celular das células HeLa por

induzirem apoptose e que isto acorreu através da via de sinal mitocôndria-

dependente.

Ativação da caspase-9 e caspase-3aparecem como o principal mecanismo

antitumoral de diversos polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas marrons

(AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007). Contudo, vale salientar que heterofucanas

sulfatadas da alga Sargassum filipendula induziram apoptose me HeLa por

promoveram a liberação do AIF mitocondrial para o citoplasma (fator indutor de

apoptose independente de caspases)(COSTAet al., 2011b). Portanto, outras vias de

indução de morte celular que poderiam servir para que MEDC e MEDM pudessem

exercer seus efeitos não podem ser ainda descartadas.

Com os dados atuais não se pode ainda afirmar quais seriam os

componentes de MEDC e MEDM que estariam envolvidos no processo de indução

de morte, nem o mecanismo completo pelo qual estes compostos estariam fazendo

isto, espera-se que com o continuar das pesquisas estes questões possam ser

respondidas.

Os estudos do efeito de MEDC e MEDM sobre o ciclo celular mostraram que

houve um aumento significativo nas populações de Sub-G1 para os tratamentos com

ambos os extratos, o que é outro indicativo os extratos promovem morte celular por

induzirem apoptose das células HeLa. Observou-se, também que extratos,

principalmente MEDC, promovem um aumento de células na fase S. A fase S faz

parte do ciclo de divisão celular e representa o período em que as células replicam o

seu DNA. Se a replicação de DNA é bloqueada por inibidores ou se o modelo de

replicação é danificado por alguns fatores, os sinais são gerados e podem induzir a

parada do ciclo celular ou apoptose (Du et al., 2011). Portanto, sugere-se que o

efeito inibitório do crescimento das células Hela pelos extratosfoi também resultado

de um bloqueio do ciclo celular durante esta fase S.

Em síntese, as células expostas a MEDM e MEDC exibem as alterações

morfológicas e bioquímicas, como mostrado pela perda de viabilidade celular

(Figura20 e 21), condensação da cromatina (Figura22), externalização de

fosfatidilserina (Figura23), acumulo de fragmentos de células na fase sub-G1 (Figura

24), e ativação das caspases 3 e 9 (Figura 25). Estes dados em conjunto levam a se

DISCUSSÃO


76

propor que o efeito antiproliferativo de MEDM e MEDC é devido principalmente a

capacidade destes induzirem apoptose celular dependente de caspases. Todavia,

observou-se um acúmulo das células tratadas pelos extratos na fase S, o que indica

que outros mecanismos de morte celular podem também ser ativados por esses

extratos.

CONCLUSÕES


77

6. CONCLUSÕES

Os extratos metanólicos foram obtidos de treze macroalgas marinhas das três

diferentes classes podendo ser observado seus potenciais anticoagulante,

antioxidante e/ou antiproliferativo em diferentes níveis de atividades;

Em geral, os ME são ricos em açúcares e compostos fenólicos e esses em

alguns casos estão intimamente relacionados com a presença de atividades

biológicas avaliadas nesse trabalho;

Nenhum dos ME apresentou atividade anticoagulante para os testes de PT e

aPTT;

Todos os extratos apresentaram atividade para três dos cinco diferentes

ensaios antioxidantes, entretanto, a quelação férrica aparece como o principal

mecanismo de ação antioxidante;

Todos os ME mostraram potencial antiproliferativo frente a linhagem celular

tumoral de cólon uterino (HeLa), com destaque para MEDC e MEDM;

Os MEDC e MEDM não afetaram a proliferação celular de células

fibroblásticas normais (3T3);

MEDC e MEDM induzem a apoptose em células HeLa através da ativação

das caspases 3 e 9 e ainda, MEDC induz a parada do ciclo celular na fase S;

Juntos, esses resultados mostraram que os extratos metanólicos de algas

marrom D. mentrualis e D. cilliolata podem conter agentes com potencial utilização

no combate de células de adenocarcinoma uterino humano. O presente estudo

também aponta para a necessidade de investigação mais aprofundadas no âmbito

fitoquímico e biológico para que se possa purificar produtos biologicamente ativos

desses extratos. Como continuação deste trabalho pretende-se isolar e purificar os

compostos ativos e elucidar melhor seus mecanismos de ação.

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