BIOLOGIA CELULAR

Ingeniería en Biotecnología

1.- Introducción

1. Que es la Biología Celular.2. Aspectos Históricos de la Biología Celular.3. Teoría Celular.• Concepto de célula• Evolución de la teoría celular4. principales herramientas• Microscopia.• Técnicas histológicas

1.1. Biología celular.

• disciplina científica que se encarga de estudiar las propiedades, la estructura, las funciones y el ciclo vital de las células.

La citología o biología celular es la rama de la biología que estudia las células en lo que concierne a su estructura, sus funciones y su importancia en la complejidad de los seres vivos.

1.2. Aspectos históricos de la biología celular

• Ya en la antigüedad, los filósofos y naturalistas habían llegado a la conclusión de que tanto los animales como los vegetales, estaban constituidos por diversos elementos comunes.

• Estos elementos eran las estructuras macroscópicas, como raíces, tallos y flores en los vegetales y segmentos y órganos en los animales

• Como en esta época no existían aparatos ni técnicas para observar las estructuras microscópicas, los componentes celulares más importantes pasaron inadvertidos.

• En el siglo XVII, con el invento del microscopio, fue posible aumentar la imagen de los materiales vivientes, lo que permitió establecer las bases de la Biología Celular, disciplina moderna que apoya en la bioquímica, genética, fisiología, biofísica e histología, para dilucidar la estructura, organización y funcionamiento de la célula. Así se ha logrado describir el movimiento de diferentes moléculas hacia adentro y fuera de la célula a través de la membrana en apariencia, impermeable. El transporte de sustancias es vital, pues proporciona a la célula compuestos que proveen energía y, por otra parte, elimina aquellos que resulta nocivos.

1665 Empleó por primera vez la palabra célula. observó al microscopio un corte de corcho que describió como una estructura formada por huecos o espacios similares a las celdillas de un panal.

1675 Holandés Antonio van Leeuwenhoek, contribuyó de manera especial al desarrollo de la Biología Celular con el descubrimiento de los microbios en el agua.

1824 Investigador francés H. Dutrochet, observó al microscopio porciones de plantas y animales, después de lo cual propuso que éstas se encontraban formadas por células, las que constituían las unidades básicas de la estructura de los seres vivos.

1831 inglés Robert Brown en 1831, fue el primero en reconocer el núcleo celular, lo descubrió en estructuras vegetales como una estructura central y pequeña

1839 Jan E. Purkinje, fisiólogo checo, acuñó el término protoplasma para designar el contenido vivo de la célula

ACTIVIDAD 1

• Realizar una línea del tiempo con los acontecimientos mas importantes en la historia de la biología celular.

1.3 Teoría Celular.

1838 1839

Mathias Schleiden, botánico alemán y Theodor Schwann zoólogo de la misma nacionalidad, relacionaron todos los descubrimientos anteriores y los ampliaron con sus propias observaciones en tejidos vegetales y animales, lo que los llevó elaborar la Teoría Celular.

Esta teoría constituye uno de los conceptos generales y fundamentales de la Biología y establece que la célula es la Unidad Básica Estructural y Funcional de los seres vivos, y que todos los organismos están constituidos por una o más células.

A mediados del siglo XIX, se amplió la investigación celular. Rudolf Virchow, investigador alemán, aplicó la teoría celular al estudiar las células de tejidos enfermos, consideró a la célula como la Unidad Estructural, y también estableció que todas las células se originan a partir de otras.

En 1855, escribió el tratado Omnis cellula e cellula (Toda célula proviene de otra célula).

Tamaño celular

• Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 µm), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia; si hay dos líneas a 200 µm de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolución.

• La invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico simple, examinó un corte de corteza, encontró que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cámaras, que llamó “células”, en realidad sólo vió las paredes celulares, ya que este tejido está muerto a la madurez y las células ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporáneos observaron células vivas.

http://www.biologia.arizona.edu/

4.-Principales herramientas• 1.4.1. Microscopía• Microscopía (o también sin tilde «microscopia») es el

conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeñez están fuera del rango de resolución del ojo normal.

• Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del mismo se requiere para producir las imágenes adecuadas, de todo un conjunto de métodos y técnicas afines pero extrínsecas al aparato.

• Algunas de ellas son, técnicas de preparación y manejo de los objetos de estudio, técnicas de salida, procesamiento, interpretación y registro de imágenes, etc.

• la microscopía generalmente implica la difracción, reflexión o refracción de algún tipo de radiación incidente en el sujeto de estudio

• Microscopía óptica• Microscopía óptica (microscopía de luz clásica),

consiste en hacer pasar luz visible de una fuente (difractada, reflejada o refractada en el sujeto de estudio) a través de lentes ópticos simples o múltiples, para lograr una vista ampliada de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo humano, impresa en una placa fotográfica o registrada y mostrada digitalmente.

Microscopio estereoscópico

• El microscopio óptico compuesto tiene los siguientes Sistemas o partes:

1.- SISTEMA MECÁNICO:• Soporte • Brazo• Base ó pie• Tubo del ocular• Cabezal• Revolver• Platina• Tornillos de enfoque:

Tornillo macrométricoTornillo micrométrico

SISTEMA MECANICO

SISTEMA OPTICO

• Ocular • Objetivos

Sistema de iluminación

• Condensador•Diafragma• Portafiltro• Espejo• Fuente de Luz

ACTIVIDAD 2

• Realizar una investigación de los diferentes tipos de microscopios.

Existen distintas variantes de observación en MO

Traqueidas del leño de PinusColoración: safranina

• Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera

• Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.

• El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.

• Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo

que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.

• Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

• Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosos: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante.

Células epiteliales , triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes),

actina (rejo). 200X (izq.) y 1000X (der.).

1.4.2 Técnicas histológicas

• Se denomina técnica histológica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada (tejido biológico), a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano.

• Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.

• Obtención del material histológico Los tejidos se pueden obtener de diferentes

formas:• Biopsia- Biopsía excisional - Biopsia incisional - Biopsía

endoscópica - Biopsia colposcópica - Punción aspiración con aguja fina (PAAF) - Biopsia por punción con aguja gruesa (Tru-cut)

• Abiopsia• Necrocirugía (llamada vulgarmente autopsia)

Sinopsis generalPaso Objetivos Medios usuales

Obtención -Proveer el material para su estudio al microscopio

- Biopsia- Resección quirúrgica- Autopsia

Fijación - Preservar el material- Evitar la autólisis- Eliminar los m.o.

- Formol al 10 %- Bouin- Glutaraldehído

Inclusión - Embeber el material en un medio fácil de cortar en fetas muy delgadas

- Parafina- Acrílicos- Resinas Epoxi

Corte - Lograr láminas muy delgadas que sean atravesadas por la luz

- Micrótomo rotatorio- M. de deslizamiento- Ultramicrótomo

Coloración - Visualizar los tejidos- Identificar moléculas en ellos(Histoquímica)

- Hematoxilina - eosina- Tricrómicos- Histoquímica

Montaje - Preservar el corte, manteniéndoloaislado del aire y deshidratado

Bálsamo del Canadá- Medios plásticos

•Proceso de fijación• La fijación es en esencia un método para la preservación de la

morfología y la composición química de las células y los tejidos.• Consiste en que las células conserven su estructura con un

mínimo de modificaciones.• Asimismo algunos métodos tratan de conservar intacta su

composición química.• La fijación debe realizarse inmediatamente de extraer las

células del organismo, para evitar las lesiones , cambios osmóticos y luego alteraciones estructurales y bioquímicas más profundas, autolisis.

• Deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeños de tejidos (como regla general menos de 1 cm cúbico), para que la difusión del fijador desde las superficies.

• Propiedades de los fijadores:- Producen una rápida muerte celular, evitando la

autólisis- Preservan la morfología celular y tisular- Preservan la composición química- Penetran a los tejidos con relativa rapidez- Facilitan la coloración posterior- Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la

putrefacción- Aumentan la consistencia de los tejidos- Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos.

• Efectos indeseables de algunos fijadores:- Retraen los tejidos- Precipitan en forma de cristales- Endurecen demasiado las muestras- Poseen olor desagradable e irritan la piel y las

mucosas- Producen alteraciones importantes a nivel

molecular- Producen alteraciones importantes a nivel

ultraestructural

Clasificación general fijadores

Físicos - Calor- Desecación- Microondas

Químicossimples

- Alcoholes

- Aldehídos

- Ácidos

- Sales

-Metanol-Etanol

- Formaldehído-Glutaraldehído- Acético- Pícrico-Osmico- Bicromato de potasio-Bicloruro de mercurio

Mezclas dequímicos

CarnoyBouinZenker

FaGlu

Alcohol etílico +Acido acéticoAcido pícrico + Formol +Acido acéticoBicromato de potasio +Bicloruro de mercurio +Acido acéticoFormaldehído +Glutaraldehído

• LavadosSe debe lavar el tejido para quitar el exceso de

fijador.Generalmente se emplea agua destilada o agua

corriente a chorro medio, para no eliminar la preparación.

• Deshidratación.El exceso de fijador al momento de la infiltración,

incluso en la microtomía, podría afectar los cortes histológicos, y por ello se debe lavar. La deshidratación se hace empleando diferentes soluciones de alcohol de concentración creciente.

•Aclaramiento

• En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina. El más usado es el xilol (xileno) ya que como la muestra está deshidratada, el xilol entrará hasta lo más profundo del tejido. También el tejido pierde color y adquiere un tono acaramelado.

•Infiltración

• En este paso la muestra se coloca en parafina líquida, cabe mencionar que se debe usar parafina histológica. Como se ha dicho en el paso anterior el tejido está completamente lleno de xilol, ahora debido a ósmosis sale el xilol y entra la parafina.

• La deshidratación, aclaramiento e infiltración pueden ser realizadas manualmente pero hoy en día se realizan de modo automático en máquinas específicas.

•Inclusión

• Para la obtención de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del tejido, tanto más delgada resulta el corte histológico. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos métodos principales: la congelación o la inclusión

• El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte.

• Para el microscopio óptico se usa casi exclusivamente la parafina. después por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (aclarantes). O con acrílicos de bajo peso molecular como el

• metilmetacrilato, lo que permite obtener cortes más delgados.

• Para microscopía electrónica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi.

• Se deben poner a enfriar en un congelador para su corte.

• Proceso de fijación• Lavados• Deshidratación• Aclaramiento• Infiltración• Inclusión• Microtomía• Tinción• Observación • http://es.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_histol%C3%B3gica

•Microtomía

• Se realizan cortes histológicos muy delgados según lo requerido o la costumbre del laboratorio donde se realice la técnica. Los cortes van desde 0,5 micras hasta 8 u 10 micras. Los cortes se echan al baño de flotación y se pescan con un portaobjetos, se marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tinción con que se van a procesar. El ángulo de corte entre el cuchillo del microtomo y el bloque ha de estar entre 10º y 15º. Una vez realizado el corte se da un baño de agua destilada, para que la parafina se estire. Un buen corte histológico debe tener un grosor aproximado de 3-5 micras para que sea fácilmente atravesado por la luz.

•Los microtomos más usados son• Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en

parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 µm de grosor, para observar con el microscopio óptico.

• Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de µm de grosor, para observar con el microscopio óptico.

• Microtomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30 a unas 100 µm de material congelado para su observación con el microscopio óptico.

• Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el microscopio óptico.

• Ultramicrotomo: Con él se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.

• Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrónico de transmisión.

•Tinción

• Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en los tejidos las diferentes estructuras o sustancias.

• La tincion más usada o también llamada "de rutina" es la de hematoxilina y eosina (H&E). Se usa un colorante llamado hematoxilina que tiñe las sustacias ácidas o que las contengan, como el núcleo que contiene ácido desoxirribonúcleico (ADN) La eosina amarillenta tiñe las estructuras básicas como el citoplasma y demás orgánulos eosinofílicos de la célula.

•Ejemplos • Masson• PAS• Perls• Plata metenamina• Warthin-Starry• Ziehl-Neelsen• Van Gieson• Azul alcian• Sudán III• Rojo Congo• Tinciones diferenciales : Gram

•Histoquímica

• La histoquímica es el conjunto de técnicas de coloración destinadas a visualizar sustancias específicas en los tejidos.

• El método histoquímico en sentido estricto es microscópico debe cumplirse varias condiciones:

1) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su localización celular original

2) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea específico para ella o para el grupo químico al que pertenece

•Ubicación generalLípidos - Sudanes

- Aceite rojo 0- Tetróxido de osmio

Hidratos de carbono - PAS- Azul de Alcian- Metacromasia

Proteínas - Acidofilia y basofilia- Impregnación argéntica- Histoenzimología- Inmunohistoquímica

Acidos nucleicos - Verde de metilo - Pironina- Anaranjado de acridina- Reacción de Feulgen- Hibridación in situ

•Observación

• Es el ultimo paso de una preparación histológica que es muy empleada en laboratorios y hospitales, y se realiza a través del microscopio óptico o microscopio electrónico.

Actividad 3

• Realizar un cuadro sinóptico de técnica histológica.

• http://biologiadelacelula.files.wordpress.com/2008/04/senalizacion-celular.pdf

• http://bibliotecadeinvestigaciones.wordpress.com/biologia/la-biologia-celular/

• http://microscopia.galeon.com/productos1689173.html• http://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm• http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-fijacion.php• www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/.../3_tecnica_histologica.pdf• http://www.dermato101.com.ar/tecnica.pdf