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Novas ideias para quantificação em microvolumes

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A quantificação de DNA em microvolumes é uma aplicação de rotina em muitos laboratórios de biosciências. Assim como a verificação de pureza de dsDNA, é uma etapa chave antes da execução de experimentos como PCR, qPCR, sequen-ciamento de nova geração, imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento em larga escala (ChIP Seq). O sucesso de tais experimentos requer a quantificação exata e precisa do dsDNA na amostra inicial. Além disso, o alto custo dos reagentes torna a exatidão da quantificação inicial ainda mais importante. Os cientistas também necessitam da flexibilidade para trabalhar com altas concentrações oferecida pela cubeta BioDrop 125, bem como volumes maiores utilizados em espectrofotometria. As opções atuais para quantificação direta de dsDNA são espectrofotômetros convencionais ou instru-mentos dedicados a microvolumes. A espectroscopia UV/Vis convencional exige a diluição da amostra, o que torna mais demorada a etapa de quantificação e aumenta a proba-bilidade de erros devido à manipulação da amostra. Os instrumentos para microvolumes existentes no mercado tem várias desvantagens, como possível variação do caminho óptico e baixa exatidão nos limites de detecção, bem como problemas com contaminação e formação de bolhas que interferem na análise.

Para resolver esses problemas, a BioDrop desenvolveu um novo instrumento para microvolumes, o BioDrop DUO. O BioDrop DUO é um espectrofotômetro UV/Vis que tem uma plataforma de amostras exclusiva, com caminho óptico fixo de 0,5 mm, além de um compartimento para acomodar a cubeta BioDrop 125 ou cubetas convencionais de 10 mm. A plataforma de amostras simplifica a medição de amostras de DNA, RNA, oligonucletídeos e proteínas altamente concentradas ou em baixos volumes, enquanto que a opção de análise com a cubeta BioDrop dá aos cientistas a flexibilidade de quantificar amostras ainda mais concentradas. Devido ao fato do BioDrop DUO ter caminho caminho óptico fixo consegue-se excelentes resultados, dispensando totalmente a

necessidade de calibração do caminho óptico. As concentrações são obtidas rapidamente utilizando o display touchscreen para selecionar métodos pré-programados no software interno. Importante ressaltar que os usuários não precisam perder tempo diluindo as amostras.Uma aplicação chave de medição direta de microvolumes é a quantificação de dsDNA. Para demonstrar a performance do BioDrop DUO, foi realizada uma série de experimentos visando determinar o volume mínimo de amostra, limites de detecção, reprodutibilidade, linearidade e contaminação entre amostras.

BioDrop™ DUO Nota de Aplicação para dsDNA

Utilizando o espectrofotômetro BioDrop DUO para quantificar dsDNA em amostras de microvolumes

Tabela 1. Resumo dos Resultados

Cubeta BioDrop 125

Limite de Detecção de DNA (ng/µL) 1,0 7,1

Volume Mínimo (µL) 0,5 0,6

Concentração Máxima (ng/µL) 2.500 12.000

Caminho Óptico (mm) 0,5 0,125

DUO application note_revised:Layout 1 09/11/2012 16:28

Plataforma de amostras



Espectrofotometria UV/Vis - BioDrop DUO

O BioDrop DUO é um espectrofotômetro UV/Vis de feixe dividido (split-beam), que utiliza uma lâmpada de Xenônio e um detector CCD de 1024 elementos. Essa tecnologia entrega resultados rápidos e de alta qualidade. Detalhes das especificações técnicas podem ser vistos na Tabela 2.

O BioDrop DUO gera resultados rápidos: não é necessário tempo para aquecimento e o instrumento é prontamente controlado por um display touchscreen colorido de alta resolução. As amostras são pipetadas diretamente na plataforma ou na cubeta para serem, então, avaliadas.

Materiais e Métodos

O dsDNA purificado de esperma de salmão (Sigma-Aldrich ref. D1626-250MG) foi ressuspendido diretamente em água HyPure Molecular Biology Grade (GE Healthcare) antes da quantificação utilizando o espectrofotômetro BioDrop DUO.

O caminho óptico de 0,5 mm foi selecionado no menu do software interno, para medições utilizando a plataforma de amostras do BioDrop DUO. Alternativamente, o caminho óptico de 0,125 mm foi selecionado para análise utilizando a cubeta BioDrop 125. As concentrações de DNA foram calculadas automaticamente utilizando o método pré-programado para quantificação de DNA: a absorbância é medida em uma varredura de 230 a 320 nm. A concentração de dsDNA foi determinada subtraindo a absorbância em 320 nm da absorbância em 260 nm e, então, multiplicando a absorbância corrigida pelo fator de concentração de DNA (50 µg/mL) e pelo fator de normalização do caminho óptico (20, no caso da plataforma e 80, no caso da cubeta BioDrop 125).

Múltiplos instrumentos foram testados para determinar limites de detecção, volume mínimo de amostra, linearidade, reprodutibilidade e contaminação entre amos-tras. Dados representativos do grupo-teste são apresen-tados nas Figuras 1 a 3.

Os limites de detecção foram determinados realizando uma série de vinte medições na plataforma de amostras, utilizando o método para DNA pré-programado no software interno.

O volume mínimo de amostra foi avaliado realizando uma série de medições com uma microseringa de 1 µL. A reprodutibilidade da medição em volumes decrescentes foi determinada pelo cálculo da média e desvio padrão.A linearidade do instrumento foi determinada plotando a concentração medida em relação à diluição da amostra.

Por fim, a contaminação entre amostras foi avaliada alternando medições de água e soluções de dsDNA. A plataforma de amostras foi simplesmente seca com lenços que não soltam fiapos (tipo KimWipes® ou similares) entre as medições para avaliar a eficácia da limpeza entre as amostras.

Tabela 2. Especificações Técnicas

Display Touchscreen capacitivo colorido de 5,7”

Fonte de luz Lâmpada pulsada de Xenônio com 3 anos de garantia

garantiaDetector CCD com 1024 elementos

Faixa de Comprimentos de Onda

Exatidão do Caminho ÓpticoPlataforma de amostras tem exatidão de ±5 µm

Exatidão do Comprimento de Onda

±2 nm

Reprodutibilidade do Comprimento de Onda

nda±1 nm

Largura de Banda Espectral 5 nm

Luz Espúria <0,5%T em 220 nm e 340 nm utilizando NaNO2

Faixa de Absorbância -0,3A a 2,5A, 0 a 199%T

Exatidão da Absorbância

Reprodutibilidade da Absorbância

ância±0,003A (0 a 0,5A), ±0,007A (0,5 a 1,0A)

Ruído 0,005A pico a pico, 0,002A RMS

Saída de Dados Saída USB para pendrive e saída USB para PC

Energia 90 a 250V, 50/60 Hz, Máx. 30VA

Dimensões 420 x 260 x 185 mm

Peso Aprox. 3 kg

Software Life Science para PC

DNA, RNA, oligo, eficiência de marcação com sondas, cálculo de Tm,

métodos colorimétricos e UV direto para proteínas, densidade celular

Materiais e Métodos


±0,005A ou 1% da leitura, o que for maior em 546 nm

190 a 1100 nm

Inglês, Francês, Alemão, Espanhol e Chinês Simplificado

Idiomas do Software Interno



Linearidade das Medições do BioDrop DUO

Foram avaliadas amostras em uma faixa de concentrações de DNA. A concentração de cada amostra foi medida cinco vezes. Foi calculada a média para cada concentração e, então, plotada em função do fator de diluição. O BioDrop DUO apresentou excelente linearidade até 2500 ng/µL, como pode ser observado pelo valor de R2=0,9998 na Figura 1. O valor de R2 se refere à exatidão das medições em uma linha, na qual medições apresentando boa linearidade tem valor de R2 entre 0,9 e 1,0.

A linearidade da cubeta BioDrop 125 também foi avaliada no BioDrop DUO. As concentrações medidas foram plotadas em função dos fatores de diluição. Foi obtida uma excelente linearidade, como demonstrado pelo valor de R2=0,9997.

Resultados

Figura 1: A linearidade da plataforma de amostras foi determinada plotando as concentrações em função dos respectivos fatores de diluição.

Linearidade da Plataforma de Amostras

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

0 500 1000 1500 2000 2500

Concentração (ng/µL)

Fato

r de

Dilu

ição

R² = 0,9998

Concentração (ng/µL)

Figura 2: A linearidade da cubeta BioDrop 125 foi determinada

plotando as concentrações em função dos fatores de diluição.

Linearidade da Cubeta BioDrop 125

1,00,90,80,70,60,50,40,30,20,10,0

0 1000 2000 3000 4000 5000

Fato

r de

Dilu

ição

R² = 0,9997

Limite de Detecção de dsDNA da Plataforma de Amostras

O limite de detecção de dsDNA da plataforma de amostras do BioDrop DUO é uma especificações importante, que informa o usuário da concentração mínima que pode ser medida. Um baixo limite de detecção permite que os usuários utilizem o volume mínimo de amostra nas medições, deixando maior quantidade de amostra disponível para experimentos subsequentes. O limite de detecção da plataforma de amostras foi repetidas vezes menor que 1 ng/µL, a melhor especificação da categoria, como pode ser visto na Figura 3. O limite de detecção ao utilizar a cubeta BioDrop 125 foi de 7 ng/µL.

Con

cent

raçã

o (n

g/µL

)

Plataforma 1 Plataforma 2 Plataforma 3

Figura 3: Análise do limite de detecção de três plataformas de amostras.

o f t h e In -B u iltS

C

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00

Limite de Detecção de dsDNA da Plataforma de Amostras




Reprodutibilidade e Contaminação Mínima Entre Amostras

Foram feitas medições para determinar se há contaminação entre amostras subsequentes. Uma simples secagem com lenço que não solta fiapos é suficiente para reduzir a contaminação entre amostras a valores não detec-táveis, como demonstrado na Figura 4. A cubeta BioDrop 125 foi avaliada quanto à contaminação entre amostras na Figura 5.

Volume Mínimo de Amostra

Outro parâmetro chave para quantificação de microvolumes de dsDNA é o volume mínimo que pode ser pipetado e mensurado para se conseguir resultados reprodutíveis e exatos. Para tanto, foi utilizada uma microseringa de 1 µL para pipetar dsDNA em volumes decrescentes. A Figura 6 mostra que o volume mínimo que pode ser pipetado na plataforma de amostras é de 0,5 µL, mantendo excelente desempenho nas medições.

Wat DNA

Reprodutibilidade e Contaminação da Plataforma de Amostras

Figura 4: A contaminação com DNA foi analisada medindo concentrações de amostras (na plataforma de amostras), seguidas imediatamente por amostras de água.

1200

1000

800

600

400

200

0

Con

cent

raçã

o (n

g/µL

)

Água DNA Água DNA Água

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0DNA DNA Wat

Reprodutibilidade e Contaminação da Cubeta BioDrop 125

Figura 5: A contaminação com DNA foi analisada medindo concentrações de amostras (na cubeta BioDrop 125), seguidas imediatamente por amos-tras de água.

170

145

120

95

70

45

20

-5Con

cent

raçã

o (n

g/µL

)

Água DNA Água DNA Água

Con

cent

raçã

o (n

g/µL

)

Figura 6: Foram efetuadas medições de volume mínimo <1 µL para ava-liar a reprodutibilidade em baixos volumes.

Volume Mínimo na Plataforma de Amostras

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

1000

800

600

400

200

0

Volume (µL)




Tabela 3. Principais Ensaios em Biologia Molecular que Requerem Quantificação de DNA

Sequenciamento 125 ng / 20 µl (6ng / µl)

Sequenciamento de Nova Geração 10 ng / µl

Transfecções 5 - 30 µg /100 µl(50 - 300ng / µl)

Vacinas de DNA* 0,5 - 2 mg

PCR 2ng / µl

qPCR 200ng/100µl(2 ng / µl)

Microarranjos de DNA > 2 µg

siRNA 7,5 µg / µl

Captura de Conformação Cromossômica

2 - 3 ng / µl

Métodos que Requerem Medições de Microvolumes

A Tabela 3 destaca as principais aplicações pós-quantificação. Estes ensaios requerem amostras em altas concentrações e baixos volumes.

Software BioDrop Resolution

O BioDrop Resolution Life Science é um software poderoso e intuitivo para PC que acompanha o BioDrop DUO. O software BioDrop Resolution Life Science permite medições rápidas e eficientes, bem como análise dos resultados. O software contém métodos para análise de DNA, RNA, oligonucletídeos e proteínas, entre outros. A Tabela 4 resume as principais características do software BioDrop Resolution.

Tabela 4. Software BioDrop Resolution

Métodos Life ScienceMedidas de concentração e pureza de DNA, RNA, oligonucleotídeos e proteínas, entre outros.

Desenvolvedor de Métodos

Desenvolva seu próprio protocolo de experimentos. Customize a análise para atender às suas necessidades.

Leitura RápidaMeça a absorbância de amostras desconhecidas antes de experimentos adicionais.

Varredura RápidaFaça uma varredura de comprimentos de onda de amostras de absorbância desconhecida para confirmar picos de absorção.

Análise de Cy dyeMedições de abosrbância para verificar a eficiência de marcação de amostras de DNA e/ou proteínas.

A BioDrop também fornece um módulo CFR (opcional), para laboratórios que necessitam estar em conformidade total com a parte 11 do Título 21 do Código de Regulamentos Federais dos EUA (21 CFR part 11).


Cristalografia de proteínas 50 ng / µl

* Utilizando cubeta BioDrop 125.



Conclusão

O BioDrop DUO é um instrumento dedicado a microvolumes que representa um nítido avanço em relação aos instrumentos existentes. Sem o uso de partes móveis, o BioDrop DUO possui uma plataforma de amostras exclusiva, que apresenta limite de detecção de dsDNA de 1 ng/µL. Pode-se atingir a concentração máxima de 2.500 ng/µL de dsDNA. Utilizando a cubeta BioDrop 125 no BioDrop DUO, a faixa de medição é extendida a até 12.000 ng/µL, com o uso de apenas 0,6 µL de amostra. A plataforma de amostras é fácil de utilizar e podem ser pipetados e medidos com exatidão volumes tão baixos quanto 0,5 µL. Importante ressaltar que a plataforma é fácil de limpar, prevenindo assim contaminação entre amostras. Em suma, o BioDrop DUO é intuitivo, fácil de usar e possui especificações excelentes, além de poderosos recursos. O BioDrop DUO representa um novo padrão de excelência na medição de microvolumes e você nunca irá precisar calibrá-lo.

Software Interno

O BioDrop DUO pode ser controlado por meio do display touchscreen colorido para análise independente de PC. O software interno é intuitivo, fácil de navegar e fornece análises quantitativas e qualitativas dos dados, tornando as medições e análises simples e eficientes.O método para análise de DNA utiliza uma varredura de comprimentos de onda para quantificar e avaliar pureza. São apresentadas quatro medidas de absorbância:

1. A230nm - Pico de absorbância de possíveiscontaminantes da etapa de preparo da amostra, como fenol e clorofórmio, entre outros.

2. A260nm - Pico de absorbância do DNA.

3. A280nm - Pico de absorbância de proteínas.

4. A320nm - Utilizado como correção de fundo.

BioDrop

Tel: +44 (0)203 301 2504

Email: [email protected]

Web: www.biodrop.co.uk


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