biodistribuição de células mononucleares de medula óssea
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE RADIOLOGIA
Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular
para o acidente vascular cerebral
Paulo Henrique Rosado de Castro
Tese submetida ao Corpo Docente da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à obtenção do
Grau de Doutor em Medicina (Radiologia). Área de
Concentração: Medicina Nuclear.
Orientadores: Profa Dra Lea Mirian Barbosa da Fonseca
Profa Dra Rosalia Mendez Otero
Rio de Janeiro
2013
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FICHA CATALOGRÁFICA
Rosado de Castro, Paulo Henrique Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular para o acidente vascular cerebral / Paulo Henrique Rosado de Castro. -- Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2013. xi, 95 f. : il. ; 31 cm. Orientadores: Lea Mirian Barbosa da Fonseca e Rosalia Mendez Otero Tese (doutorado) – UFRJ / Faculdade de Medicina / Radiologia, 2013. Referências bibliográficas: f. 54-71 1. Biodistribuição. 2. Células-tronco. 3. Tecnécio-99m. 4. Terapias celulares. 5. Acidente vascular cerebral. 6. Radiologia - Tese. I. Barbosa da Fonseca, Lea Mirian. II. Mendez Otero, Rosalia. III.Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Radiologia. IV. Título.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE RADIOLOGIA
Biodistribuição de células mononucleares de medula óssea marcadas com tecnécio-99m após terapia celular
para o acidente vascular cerebral
Paulo Henrique Rosado de Castro
Orientadores: Profa Dra Lea Mirian Barbosa da Fonseca
Profa Dra Rosalia Mendez Otero
Banca Examinadora: Profa Dra Bianca Gutfilen
Profa Dra Maria Célia Resende Djahjah
Prof. Dr. Sergio Augusto Lopes de Souza
Prof. Dr. Gabriel Rodriguez de Freitas
Profa Dra Maria Carolina Pinheiro Pessoa Landesmann
Professores Suplentes: Prof. Dr. Antonio Carlos Pires Carvalho
Prof. Dr. Alysson Roncally Silva Carvalho
Rio de Janeiro
2013
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DEDICATÓRIA
À minha mãe, Marilda, pelo amor infinito, incentivo e
exemplo de fé, honestidade, alegria e dedicação à vida
profissional e à família.
À minha noiva, Evelyn, melhor companheira de estudos,
com quem tenho a felicidade de compartilhar a vida, pelo
amor, incentivo e compreensão.
Ao meu pai, José, pelo amor, apoio e exemplo de fé,
honestidade e bom humor.
Ao meu segundo pai, Raul, pelo carinho, compreensão e
exemplo de tranquilidade e resiliência.
Ao meu irmão, Pedro, meu melhor amigo e companheiro
nos momentos mais difíceis.
À minha madrinha, Patrícia, pelo carinho e exemplo de
dedicação aos pacientes e à Medicina.
Aos meus avós, em especial meu avô José (in
memoriam), pelo exemplo de esforço e integridade.
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AGRADECIMENTOS
Às minhas orientadoras e mentoras, Professoras Lea Mirian Barbosa da Fonseca
e Rosalia Mendez Otero, exemplos de profissionais íntegras e dedicadas pelas quais
tenho a mais profunda admiração e que despertaram o interesse que possuo hoje pela
Medicina Nuclear e Terapia Celular. Será eterna minha gratidão por todas as
oportunidades e ensinamentos não apenas técnicos, mas de vida, ao longo desses
anos.
Aos Professores Bianca Gutfilen, Sergio Augusto Lopes de Souza e Gabriel
Rodriguez de Freitas, cujo empenho e dedicação foram absolutamente essenciais desde
o planejamento inicial até o desenvolvimento e conclusão desta pesquisa. Agradeço
imensamente por todo o apoio, ensinamentos e estímulo.
Aos Professores Antonio Carlos Pires Carvalho, Maria Célia Resende Djahjah e
Maria Carolina Landesmann, pelos conselhos e incentivo desde a graduação a
pesquisar nos campos da Radiologia e Medicina Nuclear e pelas correções para a
qualificação desta Tese.
Ao Professor Alysson Roncally Carvalho, pela pronta aceitação em participar
desta banca e pelas correções para a qualificação desta Tese.
Aos Professores e Pesquisadores com os quais tive o privilégio de trabalhar e
cujo empenho foi fundamental para o desenvolvimento dos diferentes projetos ao longo
do Doutorado: Alane Ramos, Andreia de Vasconcelos dos Santos, Angelo Maiolino,
Charles Andre, Eduardo Wajnberg, Emerson Gasparetto, Felipe Schmidt, Leandro Vairo,
Louise Moraes, Maurício Friedrich, Pedro Brasil, Pedro Pimentel Coelho, Rafaella
Monteiro Silva, Regina Goldenberg, Roberto Coury Pedrosa, Ronaldo de Souza Leão
Lima, Sergio Salles Xavier, Soniza Leon, Taís Kasai-Brunswick e Valeria Battistella.
Às equipes do Laboratório de Marcação de Células e Moléculas e do Laboratório
de Neurobiologia Celular e Molecular, pelo auxílio na execução dos trabalhos e
colaborações.
Aos Professores Mario Fiorani, Juliana Soares e Ricardo Gattass e à equipe do
Laboratório de Fisiologia da Cognição, pelo primeiro estímulo à pesquisa na iniciação
científica.
À minha família e amigos, pelo apoio em todas as etapas da minha formação.
A Douglas, Aquemi, Lillian e Sue e às famílias Simabuguro e Chinem, pelo
carinho com que me acolheram.
À Coordenação do Curso de Pós Graduação em Radiologia, pela oportunidade e
suporte oferecidos desde o início do projeto.
6
À equipe do Departamento de Radiologia da UFRJ, em especial Dalila e Lucia,
sempre dispostas a ajudar em todos os momentos.
Às equipes dos Serviços de Medicina Nuclear e Radiologia do HUCFF, que
possibilitaram a realização dos exames necessários para este trabalho.
Aos pacientes incluídos neste estudo e seus familiares, que nos motivam a
continuar pesquisando para melhorar o tratamento do AVC.
Às agências de fomento CAPES, CNPq e FAPERJ (Proc E-26/110.776/2010),
pelo financiamento a esta pesquisa.
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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACA - artéria cerebral anterior
ACM - artéria cerebral média
AVC - acidente vascular cerebral
BHE - barreira hemato-encefálica
CMN - células mononucleares
CTM - células tronco mesenquimais
CTH - células tronco/progenitoras hematopoiéticas
CTN - células tronco/progenitoras neurais
ECD – etilenocisteína dietil éster
FDA - Food and Drug Administration (Agência de Administração de Alimentos e
Medicamentos dos Estados Unidos)
18F-FDG - fluordesoxiglicose marcada com flúor-18
G-CSF - granulocyte colony-stimulating factor (fator estimulador de colônias de
granulócitos)
111In - índio-111
iPS - induced pluripotent stem cells (células-tronco pluripotentes induzidas)
NIHSS - National Institutes of Health Stroke Scale (escala de AVC dos Institutos
Nacionais de Saúde dos Estados Unidos)
NT2N - neurônios derivados de uma linhagem celular de teratocarcinoma
humano
PET - positron emission tomography (tomografia por emissão de pósitrons)
RM - ressonância magnética
SDF-1 - stromal derived factor-1 (fator derivado do estroma-1)
SPECT - single photon emission computed tomography (tomografia por emissão
de fóton único)
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99mTc - tecnécio-99m
TC - tomografia computadorizada
tPA - tissue plasminogen activator (ativador do plasminogênio tecidual)
VEGF - vascular endothelial growth factor (fator de crescimento de endotélio
vascular)
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RESUMO
As terapias celulares, que foram desenvolvidas há mais de 40 anos para
aplicação em doenças malignas, vem sendo estudadas com resultados
promissores em diferentes enfermidades, incluindo o acidente vascular cerebral
(AVC). Os objetivos deste estudo foram avaliar a exequibilidade do
acompanhamento de células mononucleares (CMN) de medula óssea marcadas
com tecnécio-99m (99mTc) após injeção intra-arterial ou intravenosa em pacientes
com AVC isquêmico e analisar as diferenças na biodistribuição das células nos
dois grupos. Foram incluídos 12 pacientes neste estudo aberto, não-
randomizado, sendo 7 no grupo intra-arterial e 5 no grupo intravenoso. A terapia
celular foi realizada 19 a 89 dias após o AVC, e a dose de células injetadas
variou de 1 x 108 a 5 x 108. Foram realizadas cintilografias de corpo inteiro 2 e 24
horas e Tomografias por Emissão de Fóton Único (SPECT, do inglês Single
Photon Emission Computed Tomography) 2,5 horas após a terapia celular.
Foram aperfeiçoados métodos de quantificação para avaliação da captação nos
diferentes órgãos de interesse e realizadas fusões de imagens SPECT com as
de Tomografia Computadorizada (TC) ou Ressonância Magnética (RM). A
quantificação das imagens de corpo inteiro indicou que a via intra-arterial
resultou em maior captação no fígado e baço e menor captação nos pulmões em
comparação com a via intravenosa após 2 e 24 horas. Além disso, o grupo
intravenoso teve um aumento na porcentagem de captação no fígado e baço e
uma redução nos pulmões nas imagens de 24 horas em comparação com as
imagens de 2 horas. A quantificação das imagens SPECT 2,5 horas após a
terapia celular indicou que a injeção intra-arterial resultou em maior captação no
hemisfério ipsilateral do que a injeção intravenosa, com grande variação entre os
pacientes. Apesar das imagens SPECT com 2,5 horas demonstrarem maior
captação no hemisfério ipsilateral, a captação no cérebro em relação ao corpo
inteiro foi baixa e não apresentou diferença estatística entre os grupos. Em
conclusão, foi possível realizar o acompanhamento de CMN de medula óssea
marcadas com 99mTc até 24 horas após injeção intra-arterial ou intravenosa em
pacientes com AVC isquêmico.
10
ABSTRACT
Cell therapies, developed more than 40 years ago for malignant diseases,
have been studied with promising results for different ailments, including stroke.
The objectives of this study were to evaluate the feasibility of tracking bone
marrow mononuclear cells labeled with Technetium-99m (99mTc) after intra-
arterial or intravenous injection in patients with ischemic stroke and analyze the
differences in the biodistribution of cells between both groups. Twelve patients
were included in this open, non-randomized study, 7 in the intra-arterial and 5 in
the intravenous group. Cell therapy was performed 19 to 89 days after the stroke
and the amount of cells varied from 1 x 108 to 5 x 108. Whole body scintigraphies
were performed at 2 and 24 hours and Single Photon Emission Computed
Tomographies (SPECT) were performed at 2,5 hours. The quantification methods
for evaluation of uptake in the different organs were improved and fusions of
images with Computed Tomography or Magnetic Resonance images. The
quantifications of whole body images indicated that the intra-arterial route
resulted in higher uptake in the liver and spleen and lower uptake in the lungs in
comparison with the intravenous injection after 2 and 24 hours. Furthermore, the
intravenous group had an increase in the percentage of uptake in the liver and
spleen and reduction in the lungs at 24 hours in comparison with 2-hour images.
The quantification of SPECT images 2,5 hours after cell therapy indicated that the
intra-arterial infusion resulted in higher uptake in the ipsilateral hemisphere in
comparison with the intravenous route, with great variation between patients.
Although SPECT images at 2,5 hours demonstrated higher uptake in the
ipsilateral hemisphere, the total uptake in the brain in comparison with the whole
body was low and didn`t have statistical difference between groups. In
conclusion, it was possible to track bone marrow mononuclear cells labeled with 99mTc up to 24 hours after intra-arterial or intravenous injections in patients with
ischemic stroke.
11
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ................................................................................................................................. 4!AGRADECIMENTOS ........................................................................................................................ 5!LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ..................................................................... 7!ABSTRACT ..................................................................................................................................... 10!SUMÁRIO ....................................................................................................................................... 11!1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ..................................................................................................... 1!
1.1. Introdução .............................................................................................................................. 1!1.2. Objetivos ................................................................................................................................ 3!
2. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................................ 4!2.1. O acidente vascular cerebral .................................................................................................. 4!
2.1.1. Penumbra isquêmica ............................................................................................................................................. 5!2.1.2. Abertura da barreira hemato-encefálica após o AVC ............................................................................................ 5!2.1.3. Avaliação neurológica do AVC .............................................................................................................................. 6!2.1.4. Tratamento do AVC ............................................................................................................................................... 6!2.1.5. Potencial regenerativo do cérebro ........................................................................................................................ 7!
2.2. As células-tronco .................................................................................................................... 8!2.2.1. Terapias celulares ................................................................................................................................................. 8!2.2.2. Marcação de células-tronco para imagem in vivo ................................................................................................. 9!
2.3. Terapias celulares para o AVC em modelos animais .......................................................... 11!2.3.1. Tipos celulares utilizados .................................................................................................................................... 11!
2.3.1.1. Células-tronco/progenitoras neurais ............................................................................................................ 11!2.3.1.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais .................................................................................................... 13!
2.3.2. Mecanismos potenciais das terapias celulares para o AVC ............................................................................... 13!2.3.2.1. Células-tronco/progenitoras neurais ............................................................................................................ 13!2.3.2.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais .................................................................................................... 15!
2.4. Estudos clínicos publicados em terapia celular para o AVC ................................................ 16!2.4.1. Ensaios com administração intracerebral ........................................................................................................... 19!
2.4.1.1. Neurônios derivados de teratocarcinoma humano ...................................................................................... 19!2.4.1.2. Células fetais porcinas ................................................................................................................................ 20!2.4.1.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 20!
2.4.2. Ensaios com administração intratecal ................................................................................................................. 21!2.4.2.1. Células fetais humanas ............................................................................................................................... 21!2.4.2.2. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 22!2.4.2.3. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical alogênico .................................................... 22!
2.4.3. Ensaios com administração intra-arterial ............................................................................................................ 22!2.4.3.1. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 22!2.4.3.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical alogênico .................................................... 24!
2.4.4. Ensaios com administração intravenosa ............................................................................................................. 24!2.4.4.1. Células monunucleares de sangue de cordão umbilical alogênico ............................................................. 24!2.4.4.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea autóloga ......................................................... 25!2.4.4.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga .................................................................................... 26!2.4.4.5. Células-tronco progenitoras hematopoiéticas CD34+ autólogas ................................................................ 27!
2.5. Estudos clínicos registrados em terapia celular para o AVC ............................................... 28!3. PACIENTES, MATERIAL E MÉTODO ....................................................................................... 31!
3.1. Pacientes .............................................................................................................................. 31!3.2. Aspirado da medula óssea e marcação com Tecnécio-99m ............................................... 32!3.3. Citometria de fluxo ............................................................................................................... 33!3.4. Terapia celular ...................................................................................................................... 33!3.5. Exames de imagem .............................................................................................................. 34!3.6. Avaliação neurológica .......................................................................................................... 35!3.7. Análise estatística ................................................................................................................ 35!
4. RESULTADOS ............................................................................................................................ 36!4.1. Características dos pacientes .............................................................................................. 36!4.2. Exames de imagem .............................................................................................................. 37!4.3. Avaliação neurológica .......................................................................................................... 43!
5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 46!6. CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 53!7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 54!ANEXO 1 ......................................................................................................................................... 72!ANEXO 2 ......................................................................................................................................... 75!ANEXO 3 ......................................................................................................................................... 79!ANEXO 4 ......................................................................................................................................... 80!ANEXO 5 ......................................................................................................................................... 81!ANEXO 6 ......................................................................................................................................... 83
1
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
1.1. Introdução
O acidente vascular cerebral (AVC) é a segunda maior causa de
mortalidade no mundo depois das doenças isquêmicas do coração, sendo
responsável por aproximadamente 11,1% das mortes, segundo as últimas
estatísticas do Estudo sobre a Carga Global de Doenças de 2010 (do inglês
Global Burden of Disease Study 2010)113. Após um AVC, cerca de um quarto dos
pacientes vai a óbito dentro de um mês, e metade dentro de um ano49. Estima-se
que em 2005 ocorreram 16 milhões de novos AVCs e 5.7 milhões de mortes no
mundo168. Estes números devem aumentar para 23 milhões de novos AVCs e 7.8
milhões de mortes em 2030168. No Brasil, as doenças cerebrovasculares são a
maior causa de morte, a frente das doenças isquêmicas do coração, tendo o
número de mortes aumentado de 84.713, em 2000, para 99.732, em 2010124.
Atualmente, o ativador do plasminogênio tecidual (tPA, do inglês tissue
plasminogen activator) é o único agente farmacológico aprovado para o
tratamento do AVC agudo. Outras estratégias que podem ser utilizadas incluem a
administração de aspirina dentro de 48 horas do início do quadro, a
implementação de unidades especializadas para o tratamento de AVC e o uso da
descompressão hemisférica em pacientes jovens com AVC maligno no território
da artéria cerebral média (ACM) e edema cerebral. No entanto, diante das
limitações dos tratamentos atuais na redução da mortalidade e incapacidade
causados pelo AVC, há uma constante busca por novas terapias. A lesão
causada pelo AVC está praticamente completa depois de 24 a 48 horas, e
terapias neuroprotetoras que precisam ser administradas em janelas terapêuticas
de poucas horas são difíceis de aplicar na prática clínica78.
As terapias celulares, que foram desenvolvidas há mais de 40 anos para
aplicação em doenças malignas, vem sendo estudadas com resultados
promissores em diferentes enfermidades27, 96. Para o AVC, as terapias celulares
buscam aumentar mecanismos regenerativos como angiogênese, neurogênese e
sinaptogênese78, 120. As terapias celulares endógenas são aquelas que visam
estimular, por exemplo, a migração de células da medula óssea para a corrente
sanguínea, com agentes farmacológicos como o fator estimulador de colônias de
2
granulócitos (G-CSF, do inglês granulocyte colony-stimulating factor). As terapias
celulares exógenas envolvem a injeção de uma variedade de células para
produzir benefícios estruturais ou funcionais. Nesse sentido, tem sido
demonstrado que células de diferentes origens podem apresentar efeitos positivos
em modelos pré-clínicos de AVC agudo e crônico19, 120. Além disso, pequenos
ensaios clínicos foram realizados para estudar a segurança e possível eficácia da
terapia celular em pacientes com AVC, mas pouco se sabe sobre a migração e
biodistribuição destas células nos pacientes
Nesse cenário, as técnicas não-invasivas de imagem in vivo podem ser
utilizadas para aumentar o entendimento das diferentes vias de injeção existentes
e sua correlação com a avaliação funcional dos pacientes. A marcação com
radioisótopos é um método já estabelecido na prática clínica que permite o
monitoramento sistêmico de células no corpo. Uma de suas aplicações, a
cintilografia com leucócitos marcados, vem sendo utilizada há mais de 30 anos
para detecção de diferentes infecções, como por exemplo as pulmonares,
cardiovasculares e musculoesqueléticas139. A técnica desenvolvida por Gutfilen e
cols. para marcação de leucócitos mononucleares com tecnécio-99m (99mTc) e
cloreto estanoso permitiu também o estudo da migração destas células em
doenças inflamatórias como a Doença de Crohn e a Retocolite Ulcerativa, além
de processos infecciosos, com baixo custo e de forma reprodutível68, 69, 70, 164.
Posteriormente, esta técnica foi aplicada com sucesso na marcação de células de
medula óssea em terapias celulares para modelos experimentais de cirrose
hepática30, 144, silicose98, colite31 e AVC isquêmico173 e para pacientes com cirrose
hepática40 e miocardiopatia chagásica crônica10. O conhecimento acumulado
nestes trabalhos permitiu a aplicação desta técnica no presente estudo clínico de
terapia celular para pacientes com AVC isquêmico.
3
1.2. Objetivos
Objetivo principal
Avaliar a exequibilidade do acompanhamento da migração de células
mononucleares (CMN) de medula óssea marcadas com 99mTc após injeção intra-
arterial ou intravenosa em pacientes com AVC isquêmico.
Objetivos secundários
Desenvolver ou aperfeiçoar os métodos de quantificação e avaliar as
diferenças na biodistribuição das CMN nos grupos intra-arterial e intravenoso 2 e
24 horas após a injeção das células.
Analisar a viabilidade de protocolos de fusão das imagens SPECT com as
de tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM).
4
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O acidente vascular cerebral
Embora exista a previsão de leve queda nas taxas de mortalidade
específicas por idade entre 2005 e 2030, o envelhecimento da população mundial
irá resultar em um aumento no número de mortes para todas as idades de 89 por
100.000 em 2005 para 98 por 100.000 em 2030. Em 2005 estimou-se que 87%
das mortes por AVC ocorreram em países de média e baixa renda, e este número
aumenta para 94% se consideradas as mortes em pessoas abaixo de 70 anos. A
mortalidade deve aumentar mais rápido em países de baixa e média renda em
comparação com os de alta renda168. O AVC foi responsável por 102 milhões de
anos de vida perdidos por incapacidade em 2010, um aumento da quinta para a
terceira maior causa em 20 anos130. No mundo, os AVCs são responsáveis por 2
a 4% dos custos totais de saúde, enquanto nos países industrializados este valor
supera os 4%. Nos Estados Unidos, os custos para a sociedade em 2009 foram
estimados em 38.6 bilhões de dólares63. No entanto, a proporção de fundos de
pesquisa direcionados para AVC permanece muito pequena150.
Os AVCs hemorrágicos respondem por aproximadamente 20% dos casos
e seu mecanismo mais comum é a doença hipertensiva em pequenos vasos, que
causa pequenos aneurismas que se rompem subseqüentemente.
Aproximadamente 2/3 dos pacientes com hemorragia intracerebral primária são
hipertensos. Os outros pacientes podem apresentar malformações vasculares
intracranianas (angiomas cavernosos ou malformações arteriovenosas),
angiopatia amilóide cerebral ou infartos prévios com consequente hemorragia
secundária.
Os AVCs isquêmicos respondem por cerca de 80% dos casos. A
classificação TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) divide os
mecanismos responsáveis pela oclusão vascular em: 1) aterosclerose de grandes
artérias; 2) cardioembolismo; 3) oclusão de pequenas artérias (lacunas); 4) AVC
de outras etiologias determinadas; 5) AVC de causa indeterminada49.
As fases do AVC podem ser divididas em aguda (dias), subaguda
(semanas) ou crônica (meses). Os eventos isquêmicos que duram menos de 24
5
horas são definidos como Ataque Isquêmico Transitório, porém esta distinção é
arbitrária e dano cerebral pode ser visto em RM em pelo menos 25% destes
pacientes90.
2.1.1. Penumbra isquêmica
Quando a oclusão de um vaso ocorre, um determinado volume de tecido
ao redor do centro isquêmico é afetado funcionalmente, porém não
estruturalmente57. Este tecido é conhecido como penumbra isquêmica e é alvo de
intervenções terapêuticas uma vez que sua recuperação está associada com
melhora neurológica49. O dano funcional com integridade estrutural pode ser
avaliado através de RM até 24 horas e através da Tomografia por Emissão de
Pósitron (PET, do inglês Positron Emission Tomography) até 48 horas após o
AVC118.
Na área de penumbra isquêmica, uma cascata de eventos neuroquímicos
começa com a depleção de energia, seguida pela perda da homeostase de íons,
liberação de glutamato, disfunção dos canais de cálcio, liberação de radicais
livres, rompimento da membrana, alterações inflamatórias e ativação de morte
celular por necrose e apoptose47.
2.1.2. Abertura da barreira hemato-encefálica após o AVC
A barreira hemato-encefálica (BHE) é uma barreira de permeabilidade
entre o sangue e o cérebro, onde as células endoteliais dos capilares cerebrais
formam junções de oclusão67. A isquemia cerebral leva à disfunção da BHE14, 46.
Em pacientes com AVC agudo, o aumento na permeabilidade da BHE
determinado por TC foi notado 12 horas após o início dos sintomas44. Foi
demonstrado que após uma oclusão da ACM em ratos ocorre aumento na
permeabilidade da BHE a partir de 3 horas este fenômeno pode persistir até 5
semanas14, 167. Em um estudo com RM, a disfunção na BHE foi evidenciada em
47 (33%) de 144 pacientes com AVC isquêmico179. A disfunção da BHE
apresentou associação com a transformação hemorrágica e pior desfecho
6
clínico179. Além disso, tanto a transformação hemorrágica quando a disfunção
precoce da BHE foram mais comuns em pacientes tratados com tPA179.
2.1.3. Avaliação neurológica do AVC
A aplicação de resultados de ensaios clínicos na prática médica requer a
interpretação e integração de medidas de desfecho. A escala dos Institutos
Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NIHSS, do inglês National Institutes of
Health Stroke Scale) consiste na avaliação de 15 itens e permite uma avaliação
quantitativa de componentes fundamentais do exame neurológico (anexo 2). A
escala NIHSS avalia o nível de consciência, os movimentos extraoculares, o
campo visual, o funcionamento da musculatura facial, a força nas extremidades,
sensibilidade, coordenação (ataxia), linguagem (afasia), discurso (disartria) e
negligência89. O Índice Barthel mede 10 aspectos básicos da atividade
relacionada ao auto-cuidado e mobilidade (anexo 3). A pontuação normal é de
100, e pontuações menores indicam maior grau de dependência89. A escala
modificada de Rankin é utilizada para avaliar o grau de incapacidade após o AVC
(anexo 4). Ela é dividida em 7 pontuações, sendo que 0 indica a ausência de
sintomas, 5 indica incapacidade grave e 6 indica morte89.
2.1.4. Tratamento do AVC
A trombólise com tPA tem importantes limitações, principalmente a curta
janela terapêutica de até 4,5h, o que limita seu uso a uma minoria (2 a 4%) dos
pacientes126. Além disso, o tPA previne a incapacidade em apenas 6 pacientes
para 1000 AVCs isquêmicos, e não reduz a mortalidade73. O pior efeito colateral
da trombólise é a possibilidade de hemorragia intracerebral sintomática, que
ocorre em 6 a 7% dos pacientes.
A administração de aspirina dentro de 48h do AVC reduz a mortalidade e
incapacidade em 9 pacientes por 1000 tratados, provavelmente por prevenção
secundária49.
7
O maior avanço no tratamento do AVC foi o tratamento dos pacientes em
unidades especializadas, que é efetiva e apropriada para todos os tipos de AVC.
O manejo dos pacientes nestas unidades reduz a mortalidade em 20% e melhora
o estado funcional em outros 20%. Ainda que os componentes precisos das
unidades ainda não estejam claros, a melhora do controle da pressão arterial, a
mobilização precoce e a aderência às melhores práticas clínicas foram
identificados como alguns dos componentes necessários. Foi demonstrado que
uma unidade de AVC pode prevenir morte ou incapacidade em 50 para 1000
AVCs49.
Além destas medidas, em pacientes jovens com AVC maligno no território
da ACM e edema cerebral, a descompressão hemisférica deve ser realizada. Isso
pode ocorrer 2 a 5 dias após o AVC em 1-10% dos pacientes com AVC
supratentorial49.
2.1.5. Potencial regenerativo do cérebro
Até recentemente, acreditava-se que as células do sistema nervoso central
eram incapazes de se regenerar. No entanto, durante a última década, evidências
da neurogênese no cérebro humano adulto foram demonstradas no giro dentado
do hipocampo e na zona subventricular em torno dos ventrículos laterais41, 52, 165.
Isto constituiu a base para que trabalhos experimentais investigassem a terapia
celular como potencial tratamento de doenças neurológicas, em particular o AVC.
Estudos recentes com pacientes que sofreram AVC isquêmico foram
capazes de demonstrar evidência de neurogênese na penumbra isquêmica, onde
as células se localizaram preferencialmente na proximidade dos vasos
sanguíneos86, 116, 123, 191. Estes resultados sugerem a ocorrência de neurogênese
compensatória induzida pelo AVC, que pode contribuir para a recuperação pós-
isquêmica, e representam, portanto, um alvo potencial para a terapia do AVC.
8
2.2. As células-tronco
As células-tronco podem ser definidas como células clonogênicas que têm
a capacidade de auto-renovação e diferenciação em múltiplas linhagens de
células180. As células-tronco estão presentes ao longo da vida, embora as
diferenças de potencial de diferenciação permitam sub-classificações.
As células-tronco totipotentes são capazes de dar origem a um organismo
inteiro e podem ser derivadas a partir de oócitos fertilizados e do zigoto até a fase
de oito células. As célula-tronco pluripotentes podem dar origem a todos os tipos
de tecidos, de qualquer uma das três camadas germinativas, mas ao contrário
das células totipotentes não podem dar origem a um organismo inteiro. As
células-tronco multipotentes são mais diferenciadas. Elas são capazes de se
diferenciar em vários tipos de células dentro de um sistema (por exemplo, do
sangue). Células-tronco oligopotentes e unipotentes tem diferenciação de
potencial mais restrito, sendo a primeira capaz de produzir mais do que um tipo
de célula (por exemplo, de células progenitoras mielóides), e a segunda capaz de
produzir apenas um tipo de célula madura180.
As células progenitoras são células geradas por células-tronco, que
passam a se diferenciar em células maduras (por exemplo, as células
progenitoras endoteliais). Ao contrário das células-tronco, que podem replicar por
tempo indeterminado, as células progenitoras só podem se dividir um número
limitado de vezes e, portanto, se encontram em uma posição intermediária entre
as células-tronco e células maduras totalmente diferenciadas180.
2.2.1. Terapias celulares
Embora as pesquisas com células-tronco tenham recebido muita atenção
recentemente, o primeiro transplante bem sucedido de células-tronco
hematopoéticas derivadas da medula óssea ocorreu no final dos anos 1960 e deu
ao seu autor, Donnall Thomas, o Prêmio Nobel de Medicina em 1990. O
transplante de células-tronco hematopoiéticas autólogas ou alogênicas é agora
um procedimento de rotina e é utilizado com sucesso clinicamente para o
tratamento de doenças tais como linfoma, mieloma múltiplo, leucemia,
9
neuroblastoma, tumores de células germinativas, certos tipos de anemias tais
como anemia falciforme ou anemia aplástica, transtornos auto-imunes como lúpus
eritematoso sistêmico, amiloidose e outras discrasias sanguíneas135. Em 2006,
foram realizados cerca de 50.000 transplantes de células-tronco hematopoiéticas
no mundo66.
Além de doenças malignas e auto-imunes, estudos experimentais e
ensaios clínicos com terapias celulares tem sido realizados em outras
enfermidades como as doenças cardíacas isquêmicas e doença arterial periférica.
Uma meta-análise de 50 estudos clínicos com terapias celulares para doenças
cardíacas isquêmicas agudas e crônicas, com um total de 2.625 pacientes
concluiu que o tratamento de células de medula óssea melhora a fração de
ejeção, volume diastólico final e volume sistólico final do ventrículo esquerdo e
reduz o tamanho do infarto84. Um estudo recente que investigou a injeção
transendocárdica de células de medula óssea autóloga ou alogênicas em 30
pacientes com cardiomiopatia isquêmica indicou melhora no remodelamento
ventricular, capacidade funcional e qualidade de vida, com 13 meses de
acompanhamento76. Já em relação à doença arterial periférica, uma meta-análise
de 37 estudos envolvendo injeção de células da medula óssea, sangue periférico
ou G-CSF indicou que as terapias celulares melhoraram significativamente os
índices de isquemia, como o índice tornozelo-braquial, tensão transcutânea de
oxigênio e ausência de dor a curta distância. Também houve melhora da
cicatrização da úlcera e redução do número de amputações53. Nenhum desses
benefícios ocorreu com o G-CSF.
2.2.2. Marcação de células-tronco para imagem in vivo
A marcação de células pode ser realizada através de radiofármacos para
detecção em Medicina Nuclear ou um contraste exógeno para ser detectado por
RM. A marcação celular com radioisótopos tem sido usada por décadas para
monitorar células sistemicamente em estudos de Medicina Nuclear como na
cintilografia com leucócitos marcados139, 149. A meia-vida de 6 horas do 99mTc é
uma importante vantagem sobre a fluordesoxiglicose marcada com flúor-18 (18F-
FDG), que possui meia-vida de 110 minutos. O índio-111 (111In), outro
10
radiofármaco que pode ser usado para marcação de células, permite estudos por
até 96 horas, porém resulta em imagens de pior resolução e acarreta alta dose
de radiação para o paciente e para as células transplantadas139. Vários relatórios
têm indicado danos celulares pela marcação com 111In24, 35, 61, 136. O 99mTc, por sua
vez, permite imagens por 24 horas e resulta em menor radiação para o paciente e
maior resolução espacial139.
Uma outra possibilidade de marcação de células é com nanopartículas de
ferro. As nanopartículas de óxido de ferro foram desenvolvidas inicialmente para
detecção de lesões hepáticas após injeção intravenosa e foram posteriormente
utilizadas para marcação de células. Em modelos pré-clínicos, a marcação de
células com nanopartículas permite o rastreamento por dias ou mesmo semanas
após terapias celulares, melhor resolução espacial e correlação anatômica26, 101.
Alguns ensaios clínicos com um pequeno número de pacientes realizaram a
marcação de diferentes tipos de células-tronco ou progenitoras28, 88, 190. No
entanto, a marcação de células com nanopartículas sofre de limitações comuns a
outros métodos de marcação exógena, como a diluição do meio de contraste com
a divisão celular e a possibilidade da transferência das nanopartículas para
macrófagos. Além disso, estudos recentes indicaram que nanopartículas podem
alterar eventos celulares56, 91, e estas técnicas de marcação não foram aprovadas
pela Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados
Unidos (FDA, do inglês Food and Drug Administration) ou pela Anvisa.
Outra abordagem para marcação de células in vivo é a transfecção de
genes repórteres para estudos de imagem por bioluminescência, medicina
nuclear ou RM. Esta abordagem é extremamente valiosa, uma vez que só revela
a atividade de células marcadas que sejam viáveis e metabolicamente ativas.
Além disso, a transfecção de células permite a expressão a longo prazo do gene
repórter, evitando o problema visto com contrastes exógenos que são diluídos
com a proliferação celular. A imagem por bioluminescência tem sido utilizada com
sucesso para investigar a distribuição de células marcadas até 30 dias após
terapias celulares em modelos animais de isquemia cerebral42, 141 . No entanto,
apesar da bioluminescência permanecer uma técnica extremamente importante
em estudos experimentais de terapias celulares, tem resolução espacial (2-3mm)
11
e profundidade de penetração limitadas (1 cm) e não pode ser utilizada na prática
clínica.
Do mesmo modo, em Medicina Nuclear, uma interação específica entre o
produto do gene repórter e uma sonda administrada pode ser usado para gerar
um sinal que pode ser detectado por Tomografias por Emissão de Fóton Único
(SPECT, do inglês Single Photon Emission Computed Tomography) e PET4 . Num
exemplo, um ensaio humano recente descreveu que células T transduzidas com
um vírus herpes simplex tipo 1 puderam ser detectadas no cérebro e em outras
partes do corpo, após infusão intracraniana em pacientes com glioma através de
PET182. A transfecção de genes também pode ser utilizada para facilitar a
absorção de ferro pelas células injetadas e, portanto, gerar um sinal que pode ser
distinguido em RM, dispensando a necessidade de agentes de contraste
exógenos60. Entretanto, mesmo sendo técnicas promissoras, novos estudos são
necessários para determinar a segurança do uso de vírus para transfecção e a
modificação do metabolismo do ferro intracelular.
2.3. Terapias celulares para o AVC em modelos animais
2.3.1. Tipos celulares utilizados
2.3.1.1. Células-tronco/progenitoras neurais
As células-tronco/progenitoras neurais (CTN) são células com capacidade
de auto-renovação e potencial de gerar neurônios e células da glia. As CTN
podem ser isoladas do cérebro fetal ou de um dos dois nichos neurogênicos que
persistem no cérebro adulto: a zona subventricular dos ventrículos laterais e a
zona subgranular giro dentado do hipocampo5, 95, 153. Apesar da evidência que as
CTN fetais transplantadas podem se integrar funcionalmente no cérebro de
pacientes com doença de Parkinson108, ainda há muitos obstáculos para o uso de
células destas duas fontes em ensaios clínicos para o AVC. Por exemplo, a
necessidade de múltiplos fetos para tratar um único paciente é de difícil
implementação em grandes ensaios clínicos, além de ser complexa do ponto de
vista ético. Além disso, o isolamento de CTN adultas para transplante autólogo
12
necessitaria de biópsias cerebrais e muitos dias em cultura para expansão e teria
outras limitações, porque são especializadas em gerar um número limitado de
subtipos neuronais, mesmo depois de uma isquemia cerebral110.
CTN também podem ser geradas de células pluripotentes, incluindo
células-tronco embrionárias (derivadas de blastocistos) e células-tronco
pluripotentes induzidas (iPS, do inglês induced pluripotent stem cells, obtidas por
reprogramação epigenética de células adultas através de uma combinação de
fatores de transcrição). Em todos esses casos, as CTN podem ser expandidas in
vitro, formando aglomerados de células chamados neuroesferas, compostas por
uma população heterogênea de células em proliferação, que podem ser induzidas
à diferenciação em diversos fenótipos de linhagens neuronais ou gliais. No
entanto, o uso clínico de CTN derivadas de embriões ainda está associado com o
risco de formação de teratomas, se células indiferenciadas persistirem em meio
às células transplantadas159. O transplante de CTN alogênicas também requer
imunossupressão, o que está associado com diversos efeitos colaterais.
CTN podem ser obtidas após reprogramação de células somáticas do
próprio paciente, permitindo um transplante autólogo. Ainda que um estudo
recente tenha alertado para a possibilidade de teratomas derivados de células iPS
desencadearem imunogenicidade em camundongos189, a resposta imune pode
não ocorrer quando células totalmente diferenciadas derivadas de células
embrionárias ou iPS são transplantadas3. A criação de bancos públicos de
linhagens celulares derivadas de células embrionárias ou iPS pode ser uma forma
mais prática de gerar estas células utilizando boas práticas de fabricação, no
tempo adequado para o transplante e, ao mesmo tempo, reduzir a
imunogenicidade das CTN54.
Outras potenciais fontes de células neurais para transplante são neurônios
e CTN induzidas gerados diretamente de fibroblastos ou outras células por uma
combinação de fatores de transcrição, sem ter que passar pelo estágio de iPS74,
115, 176. Neurônios derivados de teratocarcinomas humanos também já foram
usados em ensaios clínicos para AVC como será discutido posteriormente93, 94, 119,
131, 132.
13
2.3.1.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais
Células-tronco mesenquimais (CTM) e células-tronco/progenitoras
hematopoiéticas (CTH) são os dois tipos não-neurais mais utilizados em estudos
pré-clínicos e clínicos para o AVC.
CTH podem ser isoladas da medula óssea ou do cordão umbilical, ou
podem ser mobilizadas para a corrente sanguínea através da administração de
agentes farmacológicos como o G-CSF. A maioria dos estudos em modelos
animais realizou o transplante da fração mononuclear de uma destas fontes, que
também contém outros tipos celulares incluindo monócitos e linfócitos, além de
CTM, CTH e progenitoras endoteliais142. Alternativamente, um grupo menor de
estudos transplantou CMN humanas CD34+, uma subpopulação enriquecida com
CTH e progenitoras endoteliais.
As CTM são multipotentes com a capacidade de gerar linhagens
osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas. As CTM também podem ser
isoladas e expandidas em cultura a partir de diversos tecidos, incluindo a medula
óssea, tecido adiposo e cordão umbilical.
Apesar de um grupo de critérios mínimos definidos pela Sociedade
Internacional para Terapia Celular (International Society for Cellular Therapy) ser
usado para identificar as CTM, existem diferenças funcionais e fenotípicas entre
as CTM de diferentes fontes48, 188.
2.3.2. Mecanismos potenciais das terapias celulares para o AVC
2.3.2.1. Células-tronco/progenitoras neurais
CTN administradas por via intracerebral migram para o sítio de isquemia
cerebral72, onde elas sobrevivem por até dois meses e se diferenciam em
neurônios, astrócitos e oligodendrócitos funcionais43. Porém, a necessidade de
gerar diferentes subtipos de neurônios que devem emitir longos axônios e formar
as sinapses apropriadas ainda é um dos maiores desafios da medicina
regenerativa109, 112.
14
Além do potencial das CTN de substituir neurônios perdidos, estudos pré-
clínicos recentes observaram que parte dos efeitos terapêuticos das CTN no
cérebro isquêmico pode ser atribuída a mecanismos parácrinos, uma vez que
CTN secretam fatores neurotróficos e de crescimento in vitro2, 77, 114. Por exemplo,
foi demonstrado que o transplante de CTN aumenta a neovascularização e
melhora a integridade da BHE após o AVC através de um mecanismo dependente
de fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF, do inglês vascular
endothelial growth factor)80. VEGF é também um dos principais fatores envolvidos
no papel modulatório do meio condicionado derivado de CTN na função da
microglia129. Da mesma forma, CTN permanecem em contato próximo com
células da microglia, mesmo quando injetadas no cérebro de animais controle72,
sugerindo que um mecanismo parecido pode ocorrer in vivo129.
De maneira interessante, o transplante de CTN contribui para a
recuperação funcional de animais com isquemia cerebral, independente da via de
injeção6, 71, 163. As CTN migram para o sítio de lesão, mesmo quando injetadas por
via intra-arterial, e este recrutamento é dependente de receptores de citocinas1, 71.
Por outro lado, o transplante intravenoso de CTN resulta apenas na migração
marginal das células para o cérebro lesionado e em um modelo de hemorragia
intracerebral, as CTN migram principalmente para o baço. Entretanto, o
tratamento resultou em redução da inflamação, formação de edema e apoptose
no cérebro. Como estes efeitos não foram observados em animais
esplenectomizados, os autores sugeriram que as CTN podem promover
neuroproteção pela modulação da resposta inflamatória do baço100.
Similarmente, apesar dos baixos níveis de migração e diferenciação
neuronal no cérebro isquêmico, as CTN adultas transplantadas demonstraram
efeitos neuroprotetores e anti-inflamatórios em um modelo animal de AVC6.
Em conjunto, estes estudos fornecem evidências que, além de substituição
neuronal, as CTN podem contribuir para a recuperação funcional após o AVC por
uma combinação de mecanismos, incluindo neuroproteção e imunomodulação. As
CTN podem também estimular mecanismos endógenos de plasticidade e
regeneração cerebral, aumentando a neurogênese no hipocampo140, estimulando
o reparo neurovascular80, resgatando o transporte axonal e induzindo a
plasticidade dendrítica e axonal2.
15
2.3.2.2. Células-tronco/progenitoras não-neurais
Embora tenha sido proposto que as CTH e CTM podem diferenciar-se em
células neuronais in vitro, os neurônios derivados de CTH ou CTM não disparam
potenciais de ação11, 151 e este fenômeno não foi reproduzido in vivo158, 171. Um
estudo estimou que apenas uma pequena fração (cerca de 0,02%) de CTH
derivadas de medula óssea injetadas por via intravenosa migraram para o cérebro
isquêmico, onde a maioria das células transplantadas adotou um fenótipo de
macrófago / microglia. Apesar disto, o transplante de CTH diminuiu a dimensão do
AVC e reduziu a inflamação no cérebro e baço dos animais tratados158. Além
disso, tem sido observado que as CTM se localizam apenas transitoriamente no
cérebro isquêmico após uma infusão intra-arterial125 e que as CMN de sangue de
cordão umbilical promovem recuperação funcional no modelo animal de AVC,
apesar da baixa migração celular21. Em resumo, as CTM e as CMN de medula
óssea ou cordão umbilical podem melhorar a função neurológica em vários
modelos de isquemia cerebral, através de uma combinação de efeitos, tais como
a neuroproteção, imunomodulação e estímulo da plasticidade neural7, 23, 37, 45, 62,
133, 137, 174, 175, 181, 185, e estes efeitos não são necessariamente devido à presença
das células no local da lesão. Além disso, o transplante de CTM e CTH pode
também induzir angiogênese e neurogênese no cérebro isquêmico9, 170, dois
processos que estão intimamente ligados por vários mecanismos de regulação64.
Estes mecanismos de ação parecem basear-se na secreção de fatores
neurotróficos e moléculas imunomoduladoras pelas células transplantadas107, 147,
um efeito que pode ainda ser modulado pelo microambiente hospedeiro. Deste
modo, a migração transitória das células transplantadas e as mudanças
dinâmicas que ocorrem no cérebro isquêmico durante o processo de reparação
sugerem que múltiplas injeções podem ser necessárias para otimizar a liberação
dos fatores apropriados pelas células injetadas 172. Além disso, a inflamação
sistêmica induzida pelo AVC também pode modular o fenótipo das populações de
CMN de medula óssea, melhorando a sua capacidade de induzir a recuperação
após a isquemia cerebral, quando as células são coletadas e transplantadas no
16
primeiro dia após o insulto184. Por isso, é necessário avaliar o melhor momento
para a coleta de células da medula óssea, no caso de transplante autólogo.
Por último, as células progenitoras endoteliais podem ser isoladas a partir
do sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical e expandidas em cultura.
Estas células migram para o cérebro isquêmico através de um mecanismo
dependente de fator derivado do estroma-1 (SDF-1, do inglês stromal derived
factor-1), reduzindo o tamanho da lesão e melhorando o resultado neurológico em
camundongos55. A co-administração de células progenitoras derivadas do
endotélio e do músculo liso de células de sangue de cordão umbilical também
aumentam angiogênese e neurogênese em um modelo animal de AVC134. Assim,
estudos pré-clínicos que comparem a eficácia de células progenitoras endoteliais,
CTM, e CTH de diferentes fontes são necessários. Nesse sentido, tem sido
demonstrado que a administração intravenosa de CTM derivadas de medula
óssea promove um grau semelhante de recuperação funcional ao que é
observado após o transplante de CMN derivadas de medula óssea em um modelo
animal de AVC, quando a dose é ajustada para cada tipo celular45. Outro estudo
mostrou que não havia nenhuma diferença nos efeitos terapêuticos das CTM
derivadas de medula óssea ou de cordão umbilical em um modelo de isquemia
focal187.
2.4. Estudos clínicos publicados em terapia celular para o AVC
Encontramos 27 artigos no idioma inglês envolvendo 19 ensaios diferentes
de terapias celulares, com um total de 231 doentes tratados. Doze ensaios foram
para AVC isquêmico, 2 para hemorrágico e 5 para isquêmico ou hemorrágico
(Tabela 1). Seis ensaios realizaram transplantes intravenosos, 5 injetaram células
no parênquima, 5 utilizaram a via intra-arterial e 3 efetuaram administrações
intratecais (Tabela 1).
17
Tabela 1. Ensaios clínicos com resultados publicados
Referência do estudo/ País
Desenho do estudo
Via de injeção
Tipo celular Subtipo de AVC Variação de idade (média)
Tempo entre o AVC e terapia celular
No. de paciente tratados (no. de controles)
No. de células injetadas
Volume, taxa e velocidade de infusão
Seguimento
Kondziolka e cols., 200094 / Estados Unidos
Fase I, não randomizado, simples cego
IC Células NT2N
Isquêmico nos gânglios da base (8 casos) ou córtex e gânglios da base (4 cases)
44-75 7 a 55 meses (média 27 meses)
12 (sem controles)
2!106 (8 pacientes); 6!106 (4 pacientes)
Não especificado
52-60 meses
Rabinovich e cols., 2005146 / Rússia
Case series, não randomizado, aberto
IT Células fetais humanas
Hemorrágico (3 casos) na ACM e isquêmico (7 casos) na ACM ou ACM+ACA
35-56 4 a 24 meses (média 12,1 meses)
10 (10 controles históricos)
1 (5 pacientes) ou 2 (5 pacientes) injeções de 2!108
Não especificado
6 meses
Kondziolka e cols., 200593 / Estados Unidos
Fase II, randomizado, simples cego
IC Células NT2N
Isquêmico (9 casos) ou hemorrágico (9 casos) em gânglios da base
40-70 1 a 5 anos (média 3,5 anos)
14 (4 controles sem injeção)
5!106 (7 pacientes); 1!107 (7 pacientes)
Não especificado
18 a 29 meses
Savitz e cols., 2005155 / Estados Unidos
Fase I, não randomizado, aberto
IC Células fetais porcinas
Isquêmico em estriado 25-52 (média 39,8)
4 a 10 anos (média 4,9 anos)
5 (sem controles)
Até 5 injeções de 107
10 µL/min, 106 células/ µL
4 anos
Man e cols., 2006117 / China
Série de casos, não randomizado, aberto
IV CMN de sangue de cordão alogênico
Isquêmico (6 casos) ou hemorrágico (4 casos)
35- 75 (média 56)
3 meses a 7 anos (média 23.5 meses)
10 (sem controles)
6 infusões de " 1!108, 1 a 7 dias de intervalo
Não especificado
3 meses
Mendonça e cols., 2006121; Correa e cols., 200739 / Brasil
Relato de caso, fase I, não randomizado, aberto
IA CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico de ACM 54 e 37 5 (1 paciente) and 9 dias (1 paciente)
2 (sem controles)
1!108 (1 paciente) e 3!107 (1 paciente)
3 mL in 10 min (primeiro paciente)
2-4 meses
Suárez-Monteagudo e cols., 2009169 / Cuba
Série de casos, não randomizado, aberto
IC CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico ou hemorrágico no tálamo, gânglios da base ou córtex
41- 64 (média 51,4)
3 a 8 anos (média 5 anos)
5 (sem controles)
1,4!107 a 5,5!107 (média 3.4 !107)
8 injeções de 2,5 #L
1 (4 casos) e 5 anos (1 caso)
Lee e cols., 201099 (cont. de Bang e cols., 20058) / Coréia do Sul
Fase I/ II, randomizado, simples cego
IV CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico de ACM Média 64 Injeções 19 a 37 dias (mediana 32,5 dias) e 2 semanas depois
16 (36 controles sem injeção)
5!107 (2 doses com 2 semanas de intervalo)
Não especificado
5 anos
Honmou e cols., 201179 / Japão
Fase I, não randomizado, aberto
IV CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico em substância cinzenta, branca ou lesões mistas
41- 73 (média 59,2)
36 a 133 dias (média 68 dias)
12 (sem controles)
0,6!108 a 1,6!108 (média 1,1!108)
Em 30 min; volume não especificado
12 meses
ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano.
18
Tabela 1. Ensaios clínicos com resultados publicados (continuação)
Referência do estudo/ País
Desenho do estudo
Via de injeção
Tipo celular Subtipo de AVC Variação de idade (média)
Tempo entre o AVC e terapia celular
No. de paciente tratados (No. de controles)
No. de células injetadas
Volume, taxa e velocidade de infusão
Seguimento
Savitz e cols., 2011156 / Estados Unidos
Fase I, não randomizado, aberto
IV CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico de ACM Média 55 24 a 72 h 10 (79 controles históricos)
7!108/kg a 1!109/kg (média 9,6!108/kg)
Em 30 min; volume não especificado
6 meses
Han e cols., 201175 / Coréia do Sul
Não especificado IT CTM de cordão umbilical alogênico
Isquêmico na ponte, mesencéfalo e cerebelo
17 35 dias 1 (sem controles)
3,6!107 Não especificado
2 meses
Bhasin e cols., 201117, 201216, 201315 / India
Fase I, não randomizado, simples cego (RM)
IV CTM ou CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico ou hemorrágico em ACM
Média 45 média 9,6 meses
20 (14 CMN de medula óssea; 6 CTM de medula óssea; 20 controles sem injeção)
5!107 a 6!107 250 mL em 3 h (1.4 mL/min)
6 meses
Friedrich e cols., 201259 / Brasil
Fase I/II, não randomizado, simples cego (TC)
IA CMN de medula óssea autólogas
Isquêmico de ACM 30-78 (média 63)
3 a 10 dias (média 6 dias)
20 (sem controles)
5 ,1!107 a 6!108 (média 2,2!108)
15 mL em 30 min (0,5 mL/min)
6 meses
England e cols., 201251 / Reino Unido
Sub-grupo de Fase IIb, randomizado
IV CTH CD34+ autólogas
Isquêmico Não especificado for sub-grupo
3 a 30 dias 8 (6 G-CSF; 2 placebo;sem controles)
2!107 a 4,3!108
Não especificado
3 meses
Sharma e cols., 2012160 / Índia
Não especificado IT CMN de medula óssea autóloga
Hemorrágico em tálamo
69 1 ano 1 (sem controles)
5!107 Não especificado
Não especificado
Moniche e cols., 2012127 / Espanha
Fase I/II, não randomizado, simples cego
IA CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico de ACM Média 66,9 5 a 9 dias (média 6,4 dias)
10 (10 controles )
média 1,6!108 0,5 a 1 mL/min; duração não especificada
6 meses
Prasad e cols., 2012143 / Índia
Fase I, não randomizado, aberto
IV CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico de ACM ou ACM+ACA
30-70 (média 51,5)
8 a 29 dias (média 17 dias)
11 (sem controles)
1,9!108 a 1,9!109 (média 8!107)
Em 5 min; volume não especificado
12 meses
Li e cols., 2012106 / China
Fase I, não randomizado, simples cego
IC CMN de medula óssea autóloga
Hemorrágico em Gânglios da base
39-74 (média 56,3)
5 a 7 dias (média 5,9 dias)
60 (40 controles com salina)
2,5!108 a 2,3!109 (mediana 1,3!109)
3,5 mL; duração não especificada
6 meses
Jiang e cols., 201285 / China
Fase I, não randomizado, aberto
IA CTM de cordão umbilical alogênico
Isquêmico (3 cases) ou hemorrágico (1 case) em ACM
40-59 (média 49)
11 a 50 dias (média 25,5)
4 (sem controles)
2!107 20 mL em 20 min (1 mL/min)
6 meses
ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano.
19
2.4.1. Ensaios com administração intracerebral
2.4.1.1. Neurônios derivados de teratocarcinoma humano
Kondziolka e cols.94 realizaram o primeiro ensaio clínico de terapia celular
para AVC. O estudo envolveu o transplante de neurônios derivados de uma
linhagem celular de teratocarcinoma humano (NT2N). Este estudo de fase I, não-
randomizado, observador-cego incluiu 12 pacientes com AVC dos gânglios da
base e déficits motores fixos que ocorreram 6 meses a 6 anos antes do
transplante. Oito pacientes receberam um total de 2 milhões de células na área da
lesão, e os outros 4 pacientes receberam 6 milhões de células. Imunossupressão
com ciclosporina A foi iniciada uma semana antes da cirurgia e continuou durante
8 semanas. Um paciente teve uma única crise convulsiva generalizada 6 meses
após a cirurgia, e outro paciente teve um novo AVC distante da área do
transplante de células neuronais. No entanto, estas complicações não foram
avaliadas pelos autores como tendo relação com o transplante, e não foram
observados efeitos adversos nos 5 anos de seguimento. Sete de 11 exames PET
realizados 6 meses após a injeção das células mostraram um aumento na
absorção de 18F-FDG no local do implante, ao passo que com 12 meses este
número diminuiu para 3119. Os autores sugeriram que este achado poderia estar
relacionado com a viabilidade das células na área do AVC, ou, alternativamente, a
uma maior atividade metabólica devido a um processo inflamatório, embora
nenhuma modificação indicativa de inflamação tenha sido observada na RM. O
procedimento foi avaliado como seguro e viável, e a autópsia de um doente que
morreu de enfarte do miocárdio 27 meses após o transplante de células mostrou
que as células NT2N teriam sobrevivido no cérebro131.
Este estudo foi seguido por um estudo de fase II, randomizado, duplo-cego,
que incluiu 9 pacientes com AVC isquêmico e 9 com AVC hemorrágico 1-6 anos
antes, e com um déficit motor fixo que fosse estável durante pelo menos 2
meses93. Sete pacientes receberam 5 milhões de células e outros 7 pacientes 10
milhões de células, enquanto 4 pacientes serviram como grupo de controle não
cirúrgico. Todos os sujeitos participaram de um programa de reabilitação para
20
AVC. Um paciente sofreu uma crise convulsiva no dia após a cirurgia, e outro
apresentou drenagem de um hematoma subdural crônico assintomático um mês
após a cirurgia. Não houve melhora significativa nos desfechos primários, o
escore motor da Escala Européia de AVC (European Stroke Scale) ou Avaliação
de Fugl-Meyer, mas houve melhora no Teste da Ação da Extremidade Superior
(Action Research Arm Test) em comparação com os valores basais.
2.4.1.2. Células fetais porcinas
Savitz e cols.155 efetuaram o implante estereotáxico de células fetais
porcinas em 5 pacientes com AVCs dos gânglios da base. Não foram
administrados imunossupressores. Um paciente apresentou deterioração
transitória dos déficits motores 3 semanas após o implante de células e outro
paciente teve convulsões uma semana após a terapia. O estudo foi inicialmente
concebido para incluir 12 pacientes, mas a FDA terminou o mesmo em função de
preocupações com a segurança.
2.4.1.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga
Suarez-Monteagudo e cols.169 realizaram um ensaio clínico com o
transplante intracerebral de CMN de medula óssea, que incluiu 3 pacientes com
AVC isquêmico no tálamo, estriado ou córtex, e 2 pacientes com AVC
hemorrágico no tálamo ou estriado, de 3 a 8 anos após a lesão. Um total de 1,4 x
107 a 5,5 x 107 CMN de medula óssea foram estereotaxicamente implantadas ao
longo de vários sítios de injeção em torno da lesão. Não houve efeitos adversos
importantes durante o seguimento de 1 ano. Os autores também relataram
melhora neurológica significativa após 12 meses, com uma redução no déficit
motor avaliado pela Escala de Ashworth para Espasticidade; capacidade funcional
aumentada avaliada pelo Índice de Barthel; e melhora na condição neurológica
avaliada pela Escala NIHSS e Escala Escandinava de AVC, e melhor equilíbrio e
locomoção, avaliada pela Escala Tinneti. O mesmo grupo25 relatou
posteriormente o seguimento neuropsicológico de 5 anos de um dos pacientes do
21
estudo anterior e avaliou que as alterações cognitivas positivas em funções
verbais e executivas foram mantidas e pareciam estar relacionadas com aumento
do fluxo sanguíneo para as áreas pré-frontais. No entanto, a ausência de
cegamento, a falta de um grupo controle e o pequeno tamanho da amostra não
permite conclusões definitivas em relação à eficácia.
No maior ensaio clínico até agora, Li e colegas106 descreveram um estudo
de fase I, não-randomizado, duplo-cego no qual 60 pacientes receberam uma
injeção intraparenquimatosa de CMN de medula óssea 5 a 7 dias após AVC
hemorrágico em gânglios da base, e 40 pacientes formaram o grupo controle.
Doses administradas variaram de 2,5 x 108-2,3 ! 109 células. Seis meses após o
transplante, a pontuação NIHSS nos pacientes tratados foi significativamente
menor do que no grupo controle, enquanto que as pontuações no Índice de
Barthel foram maiores. Além disso, houve melhora neurológica e funcional
significativa nos pacientes tratados com CMN de medula óssea (86,7% versus
42,5% no grupo controle, p = 0,001).
2.4.2. Ensaios com administração intratecal
2.4.2.1. Células fetais humanas
Rabinovich e cols.146 relataram uma série de casos, não-randomizados,
abertos, que incluiu três pacientes com AVC hemorrágico no território da ACM e 7
pacientes com AVC isquêmico no território da ACM, com ou sem envolvimento
adicional do território da artéria cerebral anterior (ACA). Injeções subaracnóides
de 2 ! 108 células fetais humanas foram feitas entre 4 e 24 meses após o início
da doença. As células foram obtidas a partir de fetos humanos após aborto
espontâneo ou induzido por prostaglandinas, e foram descritas como uma razão
de 10:1 de células nervosas para células hematopoiéticas hepáticas. Os autores
relataram que alguns pacientes tiveram febre e meningismo 48 h após o
transplante. Embora um grupo de controle retrospectivo de 11 pacientes tenha
sido descrito, os parâmetros de melhora não foram devidamente explicados, não
permitindo comparações entre os dois grupos. Além disso, o estudo não teve uma
caracterização detalhada do fenótipo das células transplantadas.
22
2.4.2.2. Células mononucleares de medula óssea autóloga
Sharma e cols.160 descreveram um relato de caso em que 5 ! 107 CMN de
medula óssea foram injetadas por via intratecal em um paciente 1 ano após um
AVC hemorrágico. Mesmo não havendo um grupo controle e com apenas 1
paciente incluído, os autores atribuíram melhorias na cognição, função motora, e
atividades da vida diária ao transplante de células e o período de
acompanhamento não foi especificado.
2.4.2.3. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical
alogênico
Han e cols.75 realizaram uma injeção intratecal de 3,6 ! 107 CTM de cordão
umbilical em um paciente 35 dias após dissecção da artéria basilar que causou
um infarto na ponte, mesencéfalo e cerebelo. Duas outras injeções foram
realizadas 15 e 41 dias após o primeiro tratamento. Embora as neuroimagens e o
acompanhamento tenham sido realizados em apenas um paciente e por apenas 2
meses, os autores concluíram sem fundamentos que a melhora dos sintomas
clínicos e uma recanalização da artéria basilar foram ajudadas pelo transplante de
células.
2.4.3. Ensaios com administração intra-arterial
2.4.3.1. Células mononucleares de medula óssea autóloga
Os primeiros relatos de estudos utilizando terapias com CMN de medula
óssea para o AVC foram publicados de 2005 a 200738, 39, 121 e faziam parte de um
estudo de fase I, não-randomizado, aberto. No primeiro relato de caso38, 121, uma
paciente de 54 anos foi tratada com injeção intra-arterial de 3 ! 107 CMN de
medula óssea 5 dias após um AVC isquêmico na ACM. O PET realizado 7 dias
após o transplante com CMN de medula óssea demonstrou metabolismo
23
aumentado no córtex parietal esquerdo, o que pode ter ocorrido na presença das
células transplantadas ou devido a processos inflamatórios locais. No segundo
relato de caso39 um paciente de 37 anos de idade recebeu 3 ! 107 CMN de
medula óssea 9 dias após um AVC isquêmico na ACM. Cerca de 1% das células
foram marcadas com 99mTc por incubação com hexametilpropilenoaminooxima e
injetadas com o restante das células. Imagens do corpo inteiro demonstraram
migração elevada para o hemisfério esquerdo, baço e fígado. O SPECT 8 h após
o transplante de células mostrou que a migração de células marcadas ocorreu
principalmente para o território do ramo anterior da ACM, enquanto o AVC era no
ramo posterior da ACM esquerda. Isso aconteceu provavelmente devido à
oclusão do ramo posterior. É importante notar que estes pacientes foram
transplantados nos primeiros 10 dias após o AVC, no período agudo. A
experiência obtida com este estudo permitiu a implementação do presente
protocolo em pacientes com AVC não-agudo. e o resultados clínicos dos
primeiros 6 pacientes do grupo intra-arterial indicaram a segurança e
exequibilidade da terapia celular nesta fase do AVC12, 13.
Em um estudo realizado por Friedrich e cols.59, 20 pacientes com AVC
isquêmico moderado a grave na ACM receberam CMN de medula óssea por via
intra-arterial entre 3 e 7 dias após o AVC. A dose injetada foi de 5 x 107 a 6 x 108
células. Não houve eventos adversos relacionados ao procedimento, e 8
pacientes (40%) apresentaram boa evolução clínica, definida como uma
pontuação na escala modificada de Rankin " 2 após 90 dias. Embora o nível de
mortalidade tenha sido inferior ao nível esperado para populações semelhantes,
não havia grupo controle, e os autores não puderam excluir a possibilidade de
que os bons resultados tenham ocorrido por acaso.
Moniche e cols.127 realizaram um estudo de fase I / II não-randomizado,
simples-cego, em que 10 doentes receberam uma injeção intra-arterial de CMN
de medula óssea 5-9 dias depois de um AVC isquêmico na ACM, com um grupo
controle de 10 pacientes. A dose média infundida foi de 1,6 ! 108 células. Dois
indivíduos que receberam CMN de medula óssea apresentaram convulsões
parciais isoladas 3 meses após o transplante, que foi considerado um evento
adverso grave. Em ambos os pacientes uma medicação anticonvulsivante foi
iniciada, sem crises recorrentes. Não ocorreram outros eventos adversos graves
24
durante os 6 meses de seguimento. Não houve melhora significativa na avaliação
neurológica, em comparação com o grupo controle. Mesmo não tendo ocorrido
associação entre melhora neurológica e o número de CMN de medula óssea
injetadas, os autores relataram uma tendência à melhora um mês após a terapia,
principalmente no Índice de Barthel, quando uma quantidade maior de células
CD34+ foi injetada. Além disso, concentrações mais elevadas de fator de
crescimento do nervo foram observadas no soro de pacientes tratados 8 dias
após o transplante de células.
2.4.3.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical
alogênico
Jiang e cols.85 incluíram 3 pacientes com AVC isquêmico e 1 com AVC
hemorrágico da ACM. Uma dose de 2 ! 107 CTM derivadas de cordão umbilical
alogênico foram injetadas na ACM 11-50 dias após o início da doença. Não foi
realizada imunossupressão e o acompanhamento neurológico não foi claramente
definido, sendo a pontuação na escala modificada de Rankin a única escala
neurológica analisada. Nenhum AVC novo, febre ou morte foram observados
durante os 6 meses de seguimento. Os autores relataram que 2 dos pacientes
isquêmicos demonstraram melhora nos escores da Escala Modificada de Rankin,
enquanto não houve melhora nos outros 2 pacientes. Os autores interpretaram
esses achados como uma indicação de que as células-tronco melhoraram a
função neurológica após o AVC isquêmico, mas não depois de AVC hemorrágico.
No entanto, o pequeno número de pacientes e a ausência de um grupo controle
não permitem tal conclusão acerca da eficácia da abordagem.
2.4.4. Ensaios com administração intravenosa
2.4.4.1. Células monunucleares de sangue de cordão umbilical alogênico
Man e cols.117 incluíram 6 pacientes com isquemia e 4 com AVC
hemorrágico que ocorreram 3 a 7 anos antes do transplante, em um ensaio clínico
utilizando infusão intravenosa de CMN de sangue de cordão umbilical humano
25
alogênico. Cada paciente recebeu 6 infusões de # 1 ! 108 células, de 1 a 7 dias
de intervalo. Drogas imunossupressoras não foram utilizadas, e não houve
eventos adversos relacionados às células durante os 3 meses de seguimento. Os
pacientes tiveram uma melhora significativa no déficit neurológico, pela Avaliação
de Fugl-Meyer e Índice de Barthel, mas não havia grupo controle para
comparação.
2.4.4.2. Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea autóloga
Bang e cols.8 descreveram o primeiro ensaio com CTM de medula óssea
autóloga. No primeiro relatório deste estudo de fase I/II, randomizado e
controlado, 30 pacientes foram prospectivamente e aleatoriamente alocados no
sétimo dia de internação após o AVC. Cinco pacientes receberam duas injeções
intravenosas de 5 ! 107 células, após expansão em cultura em soro bovino fetal,
de 4 a 5 e de 7 a 9 semanas após o AVC isquêmico em ACM. Vinte e cinco
pacientes serviram como controle, e todos os pacientes foram submetidos a
terapia de reabilitação. Em 1 ano de acompanhamento, não houve efeitos
adversos relacionados ao transplante e houve uma tendência não significativa
para melhora do Índice de Barthel e da Escala Modificada de Rankin. Mais tarde,
o mesmo grupo99 incluiu um número maior de pacientes no mesmo protocolo de
tratamento, com 5 anos de acompanhamento. Dezesseis pacientes foram
tratados e 36 doentes serviram como controles. Nenhum efeito colateral
significativo foi observado durante o acompanhamento, e eventos como
convulsões e AVCs recorrentes foram semelhantes entre os grupos. Verificou-se
uma diminuição na Escala Modificada de Rankin dos pacientes tratados em
comparação com o grupo controle. Também foi notado que a recuperação
neurológica em pacientes tratados estava relacionada com o grau de
envolvimento da zona subventricular do ventrículo lateral e com os níveis
plasmáticos de SDF-1.
Em outro estudo, Honmou e cols.79 incluíram 12 pacientes com isquemia
de substância cinzenta, branca, e lesões mistas em um ensaio não-randomizado
e aberto para analisar os efeitos das CTM de medula óssea autóloga expandidas
em soro humano, sem um grupo de controle. Eles verificaram que a expansão
26
das células no soro humano foi maior do que no soro bovino fetal, o que reduziu o
tempo de preparação das células. Além disso, salientaram que a utilização de
soro humano reduziu o perigo de transmissão de doenças tais como encefalopatia
espongiforme bovina. CTM de medula óssea foram infundidas 36-133 dias após o
infarto cerebral. Não foram observados efeitos secundários relacionados com as
células. As análises indicaram que o volume médio da lesão avaliada por RM
diminuiu em 20% ou mais 1 semana após a terapia celular. Além disso, a taxa
média diária de mudança na NIHSS aumentou na primeira semana após o
transplante de células, e houve tendência à correlação com a diminuição do
volume da lesão.
Bhasin e cols.17 conduziram um estudo de Fase I, não-randomizado,
simples-cego (para interpretação de imagens funcionais), onde 6 pacientes com
AVC isquêmico ou hemorrágico de ACM variando de 7 a 12 meses antes foram
incluídos, enquanto 6 pacientes serviram como grupo controle. Após cultura das
células durante 3 semanas, em meio isento de soro animal (Stem Pro SFM), uma
injeção intravenosa de CTM de medula óssea autóloga foi administrada. Não
houve eventos adversos relacionados às células durante os 6 meses de
acompanhamento. Embora tenha havido uma melhora na Escala de Fugl-Meyer e
Índice de Barthel modificado aos 2 e 6 meses, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre o grupo tratado e o grupo controle. Também
não houve diferença estatística na análise de RM funcional entre o pacientes
tratados e o grupo controle.
2.4.4.3. Células mononucleares de medula óssea autóloga
Savitz e cols.156 relataram os resultados de um estudo no qual 10 pacientes
receberam uma infusão intravenosa de 7 ! 106/kg a 1 ! 107/kg CMN de medula
óssea 24 a 72 horas após acidentes vasculares cerebrais isquêmicos em ACM.
Dois pacientes foram submetidos a hemicraniectomia após o transplante das
células, devido a expansão do AVC entre a inscrição no protocolo e a coleta de
medula óssea. Um doente morreu de embolia pulmonar, 40 dias após a terapia
celular, o que foi considerado como não relacionado com o procedimento. Não
houve eventos adversos graves relacionados com o estudo.
27
Prasad e cols.143 realizaram um estudo de Fase I, não-randomizado,
aberto, onde 11 pacientes receberam uma infusão intravenosa de CMN de
medula óssea entre 8 e 29 dias após AVC em ACM com ou sem lesão em ACA.
Não houve grupo de controle e a dose injetada foi de 1,9 x 108-1,9 ! 109 células.
Nenhum evento adverso grave foi observado durante o estudo. Sete pacientes
tiveram uma evolução clínica favorável, definida como escala modificada de
Rankin " 2 ou pontuação do Índice de Barthel de 75 a 100 seis meses após o
transplante de células.
Após um primeiro relato de casos sobre o transplante de CTM de medula
óssea para 6 pacientes com AVC isquêmico ou hemorrágico de ACM17, Bhasin e
cols. descreveram o transplante intravenoso de CMN de medula óssea para 12
pacientes, entre 3 e 14 meses após um AVC isquêmico em ACM 16. Doze
pacientes serviram como controles. Melhora estatisticamente significativa foi vista
no Índice de Barthel modificado em 6 meses. O mesmo grupo publicou também
um estudo onde analisou em conjunto os 6 pacientes tratados com CTM de
medula óssea com 14 pacientes tratados com CMN de medula óssea e seus
respectivos grupos controles15. Neste estudo, eles também encontraram melhora
estatisticamente significativa no Índice de Barthel modificado dos pacientes
tratados com CMN de medula óssea em relação aos controles 6 meses após a
terapia. Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre os grupos CMN de
medula óssea e CTM de medula óssea. Não se observaram reações adversas em
qualquer dos grupos, durante o seguimento.
2.4.4.5. Células-tronco progenitoras hematopoiéticas CD34+ autólogas
England e cols.51 publicaram um estudo em que 40 pacientes foram
incluídos 3 a 30 dias depois de um AVC isquêmico ou hemorrágico, para receber
injeções subcutâneas de G-CSF uma vez por dia durante 5 dias, e 20 doentes
foram tratados com placebo. Oito pacientes (6 do grupo G-CSF e 2 do grupo
placebo) com AVCs isquêmicos concordaram em participar num sub-estudo e, no
6o dia após a injeção de G-CSF foram submetidos a coleta de sangue periférico
com separação imunomagnética subsequente de células CD34+ com anticorpos
contendo nanopartículas de óxido de ferro revestidas com dextran. Estas CTH de
28
sangue periférico foram injetadas por via intravenosa. Devido à marcação com
nanopartículas, foi possível realizar o rastreamento das células por RM. Os
pacientes do grupo G-CSF receberam 5,0 x 105-4,3 x 106 CTH de sangue
periférico, enquanto o grupo placebo recebeu 2-7 ! 104 células. Hipodensidade
consistente com deposição de ferro na região do AVC foi observada em um
paciente tratado com G-CSF, após 10 e 90 dias.
2.5. Estudos clínicos registrados em terapia celular para o AVC
Uma pesquisa no registro de ensaios clínicos do National Institutes of
Health (http://www.clinicaltrials.gov) indicou 25 estudos concluídos (mas não
publicados) ou em curso, com previsão de incluir 1.046 pacientes (Tabela 2).
Destes, uma administração exclusivamente intravenosa, intracerebral ou intra-
arterial foi escolhida por 13, 7 e 3 estudos, respectivamente, enquanto um estudo
optou pelas vias intravenosa e intratecal, e outro pelas vias intravenosa ou intra-
arterial. A maioria dos estudos está sendo conduzida nos Estados Unidos e na
China, e 16 dos 25 estudos foram iniciados em 2011 e 2012.
29
Tabela 2. Ensaios clínicos registrados no site Clinicaltrials.gov
No de registro / País
Via de injeção
Desenho do estudo Tipo celular Tipo de AVC Idade Tempo entre AVC e terapia
No de tratados (controles)
No de células injetadas
Início Estágio atual
NCT00950521 / Taiwan
IC Fase II, randomizado, aberto
CTHs autólogas Isquêmico na ACM 35-70 6 - 60 meses 15 (15 controles)
2!106 a 8!106 06/2009 Completo
NCT01151124/ Reino Unido
IC Fase I, não randomizado, aberto
CTN alogênicas (CTX0E03)
Isquêmico (substância branca subcortical ou gânglios da base)
60-85 6 meses–5 anos
12 (sem controles)
4 grupos: 2, 5, 10 ou 20!106
06/2010 Recrutando
NCT01287936 / Estados Unidos
IC Fase I/IIA, não randomizado, aberto
SB623 (CTM de medula óssea alogênica modificadas)
Isquêmico na ACM ou lenticuloestriadas
18-75 6 - 36 meses 18 (sem controles)
3 grupos: 2.5, 5 ou 10!106
01/2011 Recrutando
NCT01327768 / Taiwan
IC Fase I, randomizado, simpes-cego
Células-tronco olfativas autólogas
Isquêmico na ACM 35-70 6 - 60 meses 6 (sem controles)
2!106 a 8!106 01/2011 Recrutando
NCT01438593 / China
IC Fase I, não randomizado, aberto
CMN de sangue de cordão alogênico
Isquêmico na ACM 35-75 6 - 60 meses 6 (sem controles)
5!106 01/2013 Não recrutando
NCT01673932 / China
IC Fase I, randomizado, aberto
CMN de sangue de cordão alogênico
Isquêmico na ACM 35-65 6 - 60 meses 12 (no de controles não especificado)
1!107± a 4!107 10/2012 Não recrutando
NCT01714167 / China
IC Fase I, não randomizado, aberto
CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico ou hemorrágico 40-70 3 - 60 meses 30 (no de controles não especificado)
2!106 a 4!106 06/2012 Recrutando
NCT00535197 / Reino Unido
IA Fase I/II, não randomizado, aberto
CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico na ACM 30-80 7 dias 10 (sem controles)
Não especificado
09/2007 Recrutando
NCT01273337 / Estados Unidos
IA Fase II, randomizado, duplo-cego
ALD-401 (separadas de medula óssea autóloga)
Isquêmico na ACM 30-83 13 - 19 dias 60 (40 controles)
Não especificado
03/2011 Recrutando
NCT01518231 / China
IA Fase I, randomizado, aberto
CTHs autólogas Isquêmico 40-70 < 1 ano 20 (20 controles)
4!106 01/2012 Recrutando
NCT00859014 / Estados Unidos
IV Fase I/IIa, não randomizado, aberto
CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico 18-83 24 – 72 h 30 (no de controles não especificado)
Não especificado
01/2009 Não recrutando
NCT00875654 / França
IV Fase I/IIa, randomizado, aberto
CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico 18-65 <6 semanas 30 (no de controles não especificado)
Não especificado
08/2010 Recrutando
NCT00908856 / Estados Unidos
IV Fase I, randomizado, duplo-cego
CMN ou CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico supratentorial 18-85 4 dias (CMN de medula óssea) 23 dias (CTM)
33 (no de controles não especificado)
Não especificado
01/2014 Não recrutando
NCT01028794 / Japão
IV Fase I/II, não randomizado, aberto
CMN de medula óssea autóloga
Isquêmico 20-75 7-10 dias 12 (no de controles não especificado)
Não especificado
05/2008 Recrutando
ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; CTN, células tronco/progenitoras neurais; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano
30
Tabela 2. Ensaios clínicos registrados no site Clinicaltrials.gov (continuação)
No de registo / País
Via de injeção
Desenho do estudo
Tipo celular Tipo de AVC Idade Tempo entre AVC e terapia
No de tratados (controles)
No de células injetadas
Início Estágio atual
NCT01091701 / Malásia
IV Fase I/II, randomizado, duplo-cego
CTM alogênicas Isquêmico 20-80 <10 dias 78 (no de controles não especificado)
4!106/kg 12/2011 Não recrutando
NCT01297413 / Estados Unidos
IV Fase I/II, não randomizado, aberto
CTM de medula óssea alogênica
Isquêmico >18 >6 meses 35 (no de controles não especificado)
0.5!106/kg a 1.5!106/kg
02/2011 Recrutando
NCT01310114 / Estados Unidos
IV Fase IIa, randomizado, duplo-cego
PDA001 (derivadas de placenta humana)
Isquêmico na ACM
18-80 Agudo (não especificado)
34 (10 controles)
2!108 a 8!108; 1-2 injeções
03/2011 Não recrutando
NCT01389453 / China
IVe IT Fase II/ não randomizado, aberto
CTM de cordão umbilical alogênico
Isquêmico ou hemorrágico
40-65 IV, 7–21 dias; IT, 1 semana após IV
100 (20 controles)
Não especificado
04/2011 Recrutando
NCT01436487 / Estados Unidos
IV Fase II, randomizado, duplo-cego
MultiStem® (fonte não especificada)
Isquêmico cortical
18-79 24-48 h 140 (no de controles não especificado)
Não especificado
10/2011 Recrutando
NCT01453829 / México
IV ou IA Fase I/II, não randomizado, aberto
CTM autólogas derivadas de tecido adiposo
Isquêmico ou hemorrágico
18-80 Não especificado 10 (sem controles)
Não especificado
05/2011 Recrutando
NCT01461720 / Malásia
IV Fase II, randomizado, aberto
CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico 30-70 1 - 8 semanas 50 (no de controles não especificado)
Não especificado
03/2011 Recrutando
NCT01468064 / China
IV Fase I/II, randomizado, duplo-cego
CTM de medula óssea autóloga; células progenitoras endoteliais
Isquêmico na ACM
18-80 5 semanas 90 (no de controles não especificado)
2.5!106/kg 11/2011 Recrutando
NCT01501773 / Índia
IV Fase II, randomizado, aberto
CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico na ACM ou ACA
18-70 Não especificado 60 (60 controles)
3!107 a 5!108 10/2008 Completo
NCT01678534 / Bolívia
IV Fase IIa, randomizado, duplo-cego
CTM alogênicas derivadas de adipócitos
Isquêmico na ACM
60-80 < 14 dias 20 (no de controles não especificado)
1!106/kg 10/2012 Recrutando
NCT1716418, Coreia do Sul
IV Fase III, randomizado, aberto
CTM de medula óssea autóloga
Isquêmico na ACM
30-75 < 90 dias 60 (no de controles não especificado)
Não especificado
11/2012 Recrutando
ACM, artéria cerebral média; ACA, artéria cerebral anterior; CMN, células mononucleares; CTM, células tronco mesenquimais; CTH, células tronco/progenitoras hematopoiéticas; CTN, células tronco/progenitoras neurais; IA, intra-arterial; IC, intracerebral; IT, intratecal; IV, intravenosa; NT2N, neurônios derivados de teratocarcinoma humano
31
3. PACIENTES, MATERIAL E MÉTODO
3.1. Pacientes
Este ensaio clínico Fase I, aberto e não-randomizado foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (CEP no
169/03) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Protocolo de Pesquisa
no 10385 - CONEP) sob o título “Terapia celular pelo transplante autólogo de
células-tronco de medula óssea em pacientes com AVC isquêmico”. O estudo
também foi registrado no Portal Clinicaltrials.gov sob o número NCT00473057.
Todos os pacientes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(anexos 5 e 6). Os pacientes foram incluídos se apresentassem os seguintes
critérios:
a) Idade entre 18 e 75 anos;
b) AVC isquêmico acometendo o território da ACM, com até 90 dias de
evolução;
c) Exame de neuroimagem com sinais de infarto cerebral envolvendo o
território da ACM;
d) Doppler transcraniano evidenciando patência do vaso relacionado à área
isquêmica,
e) Pontuação na escala NIHSS entre 4 e 20;
f) Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido; no caso de
incapacidade do paciente assinar o Termo de Consentimento (ex. afasia,
diminuição do nível de consciência), a assinatura foi realizada por seu
representante legal.
Os pacientes foram excluídos se apresentassem as seguintes características:
a) Piora na escala NIHSS em 4 ou mais pontos, no período de 24 horas,
atribuíveis a edema e/ou hemorragia cerebral;
b) Sepse;
c) Neoplasias malignas;
32
d) Desordens auto-imunes,
e) Doenças neurodegenerativas;
f) Insuficiência cardíaca aguda ou descompensada;
g) Doenças hematológicas primárias;
h) Osteopatias com aumento de risco à punção medular;
i) Coagulopatias;
j) Insuficiência hepática;
k) Insuficiência renal moderada (creatinina acima de 2 mg/dl);
l) Dependência de suporte orgânico, como circulatório ou ventilatório;
m) Gravidez;
n) Participação em outro ensaio clínico.
3.2. Aspirado da medula óssea e marcação com Tecnécio-99m
O aspirado da crista ilíaca posterior da medula óssea (80 mL) foi realizado
sob anestesia local em centro cirúrgico. As CMN foram isoladas por gradiente de
densidade Ficoll a 400 x g por 30 minutos (Ficoll-Hypaque Plus 1.077, 1:2,
Amersham Biosciences, São Paulo, Brasil). As CMN foram lavadas em solução
salina contendo 5% de seroalbumina humana e passadas através de um filtro de
100 !m para remover agregados celulares. Após lavagem, contagem e testes de
viabilidade celular, as células foram ressuspendidas em 10 mL de solução salina
com 5% de soro autólogo. Para cada paciente, 2 x 107 células foram marcadas
com 99mTc de acordo com protocolos publicados previamente 30, 69, 70, 111, 144.
Todos os procedimentos para separação e marcação celular foram realizados em
capela de fluxo laminar. Para marcação das células, 500 µl de solução estéril de
SnCl2 foram adicionadas à suspensão de células em solução salina, e a mistura
foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. Então, 45 mCi de 99mTc
foram adicionados e a incubação continuou por mais 10 minutos. Após
centrifugação (500 x g por 5 minutos), o sobrenadante foi removido e as células
foram lavadas novamente em solução salina. O precipitado foi ressuspendido em
33
solução salina. A viabilidade das células foi avaliada pelo teste de exclusão vital
com azul de tripan, e foi estimada como superior a 93% em todos os casos. A
eficiência de marcação foi calculada através da atividade no precipitado dividida
pela soma da radioatividade no precipitado mais o sobrenadante, e foi estimada
como sendo maior que 90% em todos os casos.
3.3. Citometria de fluxo
As CMN isol+adas foram caracterizadas por análise por citometria de fluxo
de antígenos de superfície específicos. As células foram incubadas por 20
minutos a temperatura ambiente com anticorpo primário conjugados com
isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina, aloficocianina e proteína peridinina-
clorofila. Após a marcação, os eritrócitos foram lisados com solução tampão de
lise B&D. A aquisição dos dados foi realizada em um citômetro BD FACS CANTO
(Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) e analisada com um software “Paint-a-
Gate”.
3.4. Terapia celular
As células marcadas foram adicionadas ao restante da suspensão de CMN
(volume final de 10 mL). No grupo intra-arterial, punções de artéria femoral foram
realizadas utilizando um cateter guia 6F (Envoy®, Cordis, Miami, Florida ou
Guider Softip®, Boston Scientific, Fremont, Califórnia). Uma injeção intravenosa
de heparina foi utilizada para obter anticoagulação com tempo de coagulação de
2 a 3 vezes o normal. Uma angiografia cerebral digital (Angiostar®, Siemens
Medical Systems, Erlangen, Alemanha) foi realizada para possibilitar a
visualização da vasculatura intracraniana antes da infusão e para o
monitoramento da normalidade do fluxo e patência vascular. Um micro cateter (SL
1018®, Boston Scientific, Fremont, Califórnia) foi então posicionado na porção M1
da ACM. No grupo intravenoso, as células foram administradas na veia cubital
mediana. Em ambos os grupos a injeção foi realizada na velocidade de 1 mL por
minuto.
34
3.5. Exames de imagem
Imagens cintilográficas foram realizadas em uma gama câmera Millenium
GE de duas cabeças com colimador de alta resolução e baixa energia (General
Electric Medical Systems, Milwaukee, Wisconsin). Imagens foram adquiridas 2 e
24 horas após a terapia celular, com o paciente em posição supina. Imagens de
corpo inteiro foram adquiridas por 20 minutos nas projeções anterior e posterior.
Imagens planares da cabeça foram adquiridas por 10 minutos, em matriz de
256x256 em projeções laterais esquerda e direita, anterior e posterior. Imagens
SPECT foram feitas com 2,5 horas através da rotação dos 2 detectores
posicionados a 180°. O software e hardware usados para reconstrução das
imagens SPECT foram o da estação de processamento Xeleris-GE. Cada
detector rodava 180o para completar 360o em órbita circular, e as projeções foram
adquiridas em 24 minutos. O algoritmo de Maximização de Expectativa de
Subconjunto (OSEM, do inglês Ordered Subset Expectation Maximization) foi
usado para reconstruir as imagens volumétricas com suavização axial e filtro
Butterworth com ordem de 5 e corte de 0.45. Imagens volumétricas eram
compostas de voxels de 64 x 64 x 64 com 4.38 mm3 cada. A distância para o
detector variava de 14 cm a 20 cm durante a rotação, o que resultou em uma
resolução espacial full width at half-max de aproximadamente 12 mm. Não foi
possível obter imagens SPECT para todos os pacientes no tempo de 24 horas
devido ao baixo número de contagens.
Regiões de interesse foram desenhadas para o cérebro, fígado, pulmões,
baço, rins e para o corpo inteiro, e as contagens radioativas foram
automaticamente quantificadas para essas regiões nas imagens planares
anteriores e posteriores do corpo inteiro 2 e 24 horas após a infusão das células.
A média geométrica das projeções anterior e posterior foi calculada para obter o
número de contagens por órgão. Nas imagens SPECT de 2,5 horas, regiões de
interesse correspondendo aos hemisférios direito e esquerdo foram selecionadas
e as contagens radioativas automaticamente quantificadas. As migrações para os
hemisférios ipsi e contralateral à lesão foram definidas como a porcentagem das
contagens originadas do hemisfério analisado em comparação com o total de
contagens nos dois hemisférios.
35
TC ou RM foram realizadas antes dos procedimentos e com 7, 30, 90 e
180 dias. As TC foram realizadas em um aparelho de 40 detectores (Brilliance-40,
Philips Medical Systems, Cleveland, Ohio). As RM foram realizadas em um
aparelho de 1.5T (Magnetom Avanto, Siemens, Erlangen, Alemanha). As imagens
de SPECT, TC e RM foram exportadas por protocolo de comunicação de imagens
digitais em medicina (DICOM, do inglês Digital Imaging Communications in
Medicine) e a fusão de SPECT/CT ou SPECT/RM foi realizada em um software
dedicado de processamento de imagens (Leonardo, Siemens, Erlangen,
Alemanha).
Além das imagens de TC e RM, foram realizadas também na admissão e
180 dias após a terapia celular cintilografias para avaliação da perfusão cerebral
com etilenodicisteína dietil éster marcado com 99mTc (ECD-99mTc).
3.6. Avaliação neurológica
Todos os pacientes foram avaliados por um neurologista na admissão, no
dia do transplante de células e com 1, 7, 30, 60, 90, 120 e 180 dias após a injeção
das células, aplicando a escala NIHSS, o Índice de Barthel e a Escala Modificada
de Rankin. Análises laboratoriais (hemograma completo e análises bioquímicas
da úreia, creatinina e eletrólitos) também foram feitas nos mesmo momentos. Um
eletroencefalograma foi realizado dentro de 7 dias da terapia celular e em
qualquer momento que houvesse piora do estado neurológico.
3.7. Análise estatística
A análise foi principalmente descritiva. O teste Ranksum foi usado para
comparar diferentes variáveis entre os grupos intra-arterial e intravenoso (idade,
NIHSS na admissão, volume da lesão, tempo do AVC até a injeção, número de
células injetadas e migração para os diferentes órgãos com 2 e 24 horas). Os p
valores abaixo de 0.05 foram considerados estatisticamente significativos. O
software R foi usado para a análise dos dados 145.
36
4. RESULTADOS
4.1. Características dos pacientes
Doze pacientes foram incluídos no estudo, sendo 7 no grupo intra-arterial e
5 no grupo intravenoso. As características dos pacientes estão listadas na Tabela
3. A terapia celular ocorreu 19 a 89 dias após o AVC, e a dose de células
injetadas variou de 1 x 108 a 5 x 108. A fração mononuclear continha uma
mediana de 1,33% CTH, 0,02% CTM e 0,01% células progenitoras endoteliais.
Tabela 3. Características dos pacientes
Paciente Gên. Hemisf. do AVC
Fator de
risco
Subtipo de AVC
(TOAST) Idadeee NIHSS
admissão
Volume de lesão
(cc)
Tempo do AVC à terapia (dias)
No de
CMN (x108)
IA 1 M E FOP Cardioemb. 24 7 116 67 5,00
IA 2 M D DM, HAS
Grande artéria 65 9 47 82 1,25
IA 3 M E HAS Outro* 47 4 17 62 3,90
IA 4 M E DM, FA Cardioemb. 65 13 71 72 4,00
IA 5 M D HAS Grande artéria 57 9 181 59 3,20
IA 6 M D DM, HAS
Grande artéria 47 13 213 73 1,00
IA 7 M D DM, HAS Criptogênico 60 12 2 19 1,30
IV 1 M E DM, HAS Cardioemb. 63 19 162 89 3,00
IV 2 M E HAS Cardioemb. 63 16 106 89 5,00
IV 3 M D HAS Criptogênico 68 11 95 39 1,40
IV 4 F D NDN Criptogênico 39 15 144 20 1,50
IV 5 F E HAS, DM Cardioemb. 57 11 39 25 5,00
Grupo IA 57 (47-62,5)
9 (8-12,5)
71 (32-148,5)
67 (60,5-72,5)
3,2 (1,3-4)
Grupo IV 63 (57-63)
15 (11-16)
106 (95-144)
39 (25-89)
3 (1,5-5)
Ambos os grupos 58,5
(47-63,5) 11,5
(9-13,5) 100,5
(45-148,5) 64,5
(35,5-75,2) 3,1
(1,4-4,2)
p valor 0,567 0,073 0,745 1 0,513
Resultados expressos como mediana (IQR). O teste Ranksum foi usado para comparar os grupos intra-arterial e intravenoso. Gên: Gênero; Hemisf: Hemisfério; Cardioemb: Cardioembólico; FA: Fibrilação atrial; CMN: células mononucleares; DM: Diabetes Mellitus; F: Feminino; IQR: Intervalo interquartil; IA: Intra-arterial; IV: Intravenoso; M: Masculino; E: Esquerda, D: Direita; Outro*: Durante clipping de aneurisma; FOP: Forame oval patente.
37
4.2. Exames de imagem
A quantificação das imagens de corpo inteiro 2 e 24 horas após a terapia
celular indicou que a via intra-arterial resultou em maior migração para o fígado e
baço e menor migração para os pulmões em comparação com a via intravenosa
(Tabelas 4, 5 e 6). Além disso, o grupo intravenoso teve um aumento na
porcentagem de biodistribuição no fígado e baço e uma redução nos pulmões nas
imagens de 24 horas em comparação com as imagens de 2 horas (Tabelas 4, 5 e
6).
Tabela 4. Quantificação da captação em diferentes regiões 2 horas após a terapia celular IA1 IA2 IA3 IA4 IA5 IA6 IA7 IV1 IV2 IV3 IV4 IV5
Captação nas imagens de corpo inteiro (%)
Cérebro/ Corpo inteiro 5,2 0,8 0,6 0,8 0,4 0,8 1,1 0,7 0,9 0,7 0,8 1,1
Fígado/ Corpo inteiro 29,1 40,7 48,4 40,6 48,9 35,8 25,7 13,5 14,0 11,6 13,4 15,3
Baço/ Corpo inteiro 13,0 6,0 5,8 6,5 5,7 5,5 4,1 2,3 2,2 1,6 2,0 1,7
Pulmões/ Corpo inteiro 8,2 7,1 6,6 7,3 6,5 6,8 9,7 21,2 20,9 14,6 21,1 18,2
Rins/ Corpo inteiro 3,2 4,6 5,0 2,5 4,2 9,3 4,2 3,9 2,8 3,3 7,2 1,9
Captação nas imagens SPECT (%)
Hemisfério Ipsilateral/ Cérebro 97,0 54,2 79,4 68,1 57,9 77,0 65,1 50,5 53,1 53,4 60,5 56,5
Tabela 5. Quantificação da captação em diferentes regiões 24 horas após a terapia
celular IA1 IA2 IA3 IA4 IA5 IA6 IA7 IV1 IV2 IV3 IV4 IV5
Captação nas imagens de corpo inteiro (%)
Cérebro/ Corpo inteiro 2,2 0,6 0,5 0,4 0,3 0,8 1,0 0,8 1,0 1,1 0,9 0,7
Fígado/ Corpo inteiro 38,7 42,4 54,7 47,5 53,2 46,9 27,5 17,3 18,5 13,7 22,9 26,3
Baço/ Corpo inteiro 15,5 5,7 8,1 7,4 6,5 5,1 4,7 3,4 1,9 3,2 3,4 3,2
Pulmões/ Corpo inteiro 4,0 4,2 3,3 4,9 4,3 4,4 5,1 7,9 6,6 7,8 8,6 6,0
Rins/ Corpo inteiro 6,6 9,8 7,3 6,4 7,6 10,3 10,5 7,9 7,0 6,9 7,0 4,8
38
Tabela 6. Comparação entre a captação em diferentes regiões 2 e 24 horas após a
terapia celular
2 h 24 h
IA IV p valor IA IV p valor
Captação nas imagens de corpo inteiro (%)
Cérebro/ Corpo inteiro 0,8 (0,7-1) 0,8 (0,7-0,9) 1 0,6 (0,4-0,9) 0,9 (0,8-1) 0,254
Fígado/ Corpo inteiro 40,6 (32,5-44,5)
13,5 (13,4-14)
0,006 46,9 (40,5-50,4)
18,5 (17,3-22,9)
0,006
Baço/ Corpo inteiro 5,8 (5,6-6,2) 2 (1,7-2,2) 0,006 6,5 (5,4-7,8) 3,2 (3,2-3,4) 0,006
Pulmões/ Corpo inteiro 7,1 (6,7-7,8) 20,9 (18,2-21,1)
0,006 4,3 (4,1-4,7) 7,8 (6,6-7,9) 0,006
Rins/ Corpo inteiro 4,2 (3,7-4,8) 3,2 (2,8-3,9) 0,329 7,6 (6,9-10,1)
7 (6,9-7) 0,255
Captação nas imagens SPECT (%)
Hemisfério Ipsilateral/ Cérebro 68,1 (61,5-78,2)
53,4 (53,1-56,5)
0,023 NA NA NA
Resultados expressos como mediana (IQR). O teste Ranksum foi usado para comparar os grupos intra-arterial (IA) e intravenoso (IV). NA: não aplicável–não foi possível obter imagens SPECT para todos os pacientes com 24h devido ao baixo número de contagens neste momento.
As Figuras 1 e 2 mostram imagens planares da cabeça representativas de
pacientes dos grupos intra-arterial e intravenoso, respectivamente. As Figuras 3 e
4 mostram imagens de corpo inteiro representativas de pacientes dos grupos
intra-arterial e intravenoso, respectivamente.
A quantificação das imagens SPECT 2,5 horas após a injeção indicou que
a injeção intra-arterial resultou em maior migração para o hemisfério ipsilateral do
que a injeção intravenosa. No entanto, houve grande variação dos valores no
grupo intra-arterial, de 97% do total no cérebro no paciente de maior migração
(IA1) e 54% no paciente de menor migração (IA2). Já nos pacientes do grupo
intravenoso, foi de 60,5% do total no cérebro na paciente de maior migração e
50,5% no paciente de menor migração. As Figuras 5 e 6 demonstram
cintilografias de perfusão cerebral com ECD-99mTc e com CMN de medula óssea
marcadas com 99mTc do paciente IA1, respectivamente.
39
Figura 1. Imagens planares
da cabeça do paciente IA3
nas projeções anterior e
lateral esquerda 2 horas (A
e B, respectivamente) e 24
horas (C e D,
respectivamente) após a
terapia celular. Foi possível
observar migração focal das
células para o hemisfério
esquerdo, onde ocorreu a
lesão isquêmica.
Figura 2. Imagens planares
da cabeça do paciente IV3
nas projeções anterior e
lateral esquerda 2 horas (A
e B, respectivamente) e 24
horas (C e D,
respectivamente) após a
terapia celular. Não foi
possível distinguir área de
migração significativa para o
hemisfério direito, onde
ocorreu o AVC.
C DB
A B
C DB
A B
C DB
40
Figura 3. Imagens do corpo inteiro do
paciente IA5 na projeção anterior 2
horas (A) e 24 horas (B) após a terapia
celular. Não ocorreu migração
significativa para o hemisfério direito,
onde houve a lesão. No entanto, foi
possível observar biodistribuição intensa
para fígado e baço com 2 e 24 horas. A
migração das células após 2 horas foi
menor para o pulmão e sofreu grande
redução nas imagens de 24 horas.
Figura 4. Imagens do corpo inteiro do
paciente IV5 na projeção anterior 2
horas (A) e 24 horas (B) após a terapia
celular. Não foi possível individualizar
migração das células para o hemisfério
esquerdo, onde aconteceu o AVC.
Porém, houve intensa migração para os
pulmões com 2 horas, que diminuiu de
forma significativa nas imagens de 24
horas. A migração para o fígado e baço,
apesar de menor que a pulmonar com 2
horas, sofreu aumento na porcentagem
comparada com o corpo inteiro após 24
horas.
A B
A B
41
Figura 5. Cortes transversais (A),
sagitais (B) e coronais (C) da SPECT
de perfusão cerebral com ECD-99mTc
do paciente IA2 antes da terapia
celular. As imagens indicam área
extensa de hipocaptação do
radiotraçador no hemisfério esquerdo,
onde ocorreu o AVC.
Figura 6: Cortes transversais (A),
sagitais (B) e coronais (C) do SPECT
2 horas após a injeção de CMN de
medula óssea marcadas com 99mTc do
paciente IA1. As imagens indicam a
migração do radiotraçador no
hemisfério esquerdo, onde houve a
lesão isquêmica.
A
BC
CCC
A
BC
CCC
42
As Figuras 7 e 8 demonstram fusões de SPECT/RM representativas de pacientes
dos grupos intra-arterial e intravenoso, respectivamente. A Figura 9 mostra uma
fusão SPECT/CT de um paciente representativo do grupo intra-arterial.
Figura 5. Cortes transversais de
imagens SPECT (A), RM (B) e
fusão SPECT/RM (C) do paciente
IA2. Observou-se migração das
células marcadas para o hemisfério
direito, onde ocorreu a lesão
visualizada na RM.
Figura 6. Cortes transversais de
imagens SPECT (A), RM (B) e
fusão SPECT/RM (C) do paciente
IV2. Não foi possível notar
biodistribuição significativa para o
hemisfério esquerdo, onde houve o
infarto.
A
BC
CCC
A
BC
C
43
Figura 9. Cortes transversais de
imagens SPECT (A), CT (B) e
fusão SPECT/CT (C) do paciente
IA6. Observou-se migração das
células marcadas para o
hemisfério direito, onde ocorreu a
lesão visualizada na RM.
Apesar das imagens SPECT com 2,5 horas demonstrarem maior migração
para o hemisfério ipsilateral, a migração para o cérebro em relação ao corpo
inteiro foi baixa e não apresentou diferença estatística entre os grupos. Com
exceção do paciente IA1, que apresentou biodistribuição no cérebro de 5,2% do
total para o corpo inteiro com 2 horas e 2,2 % com 24 horas, todos os pacientes
apresentaram biodistribuição no cérebro menores ou iguais a 1,1% do total para o
corpo inteiro com 2 e 24 horas (Tabelas 4 e 5).
4.3. Avaliação neurológica
Não houve alterações hemodinâmicas ou clínicas significativas durante a
injeção das células. Não houve óbitos ou recorrência do AVC nos 6 meses de
acompanhamento. No entanto, 2 pacientes do grupo intra-arterial e 5 pacientes do
grupo intravenoso tiveram convulsões que foram controladas com medicação
antiepilética. Uma paciente (IV5) apresentou piora neurológica depois de sofrer
uma convulsão parcial com generalização secundária 111 dias após a terapia
A
BC
CCC
44
celular. A paciente apresentava um NIHSS de 11 que havia reduzido para 3 com
90 dias porém, após a convulsão, retornou para 11 com 120 dias e depois reduziu
para 8 com 180 dias (Figura 10). As escalas NIHSS e modificada de Rankin e o
Índice de Barthel podem ser encontrados nas Tabelas 7, 8 e 9.
Figura 10. Evolução neurológica de acordo com o NIHSS para os grupos intra-
arterial e intravenoso.
Tabela 7. Escala NIHSS
Paciente 1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias 180 dias
IA 1
7 5 5 4 4 4 4
IA 2
9 8 6 6 6 6 6
IA 3
4 3 3 3 3 3 3
IA 4
13 12 11 9 10 10 10
IA 5
9 5 3 4 4 1 1
IA 6
13 12 12 12 12 11 11
IA 7
12 12 12 12 11 11 8
IV 1
19 19 15 16 15 15 14
IV 2
16 16 16 14 14 12 11
IV 3
11 11 11 9 9 9 9
IV 4
15 16 9 9 5 4 5
IV 5
11 11 8 4 3 11 8
45
Tabela 8. Índice de Barthel
Paciente 1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias 180 dias
IA 1
100 100 100 100 100 100 100
IA 2
35 35 50 55 65 75 80
IA 3
95 95 100 100 100 100 100
IA 4
25 25 25 30 35 35 35
IA 5
30 30 50 90 90 100 100
IA 6
10 15 25 30 30 50 50
IA 7
40 40 40 40 40 40 40
IV 1
45 45 70 70 70 70 70
IV 2
10 10 10 35 50 65 65
IV 3
35 70 90 85 85 85 85
IV 4
40 45 70 80 85 85 85
IV 5
35 40 70 75 80 75 80
Tabela 9. Escala Modificada de Rankin
Paciente 1 dia 7 dias 30 dias 60 dias 90 dias 120 dias 180 dias
IA 1
2 2 1 1 1 1 1
IA 2
4 4 4 4 3 3 3
IA 3
1 1 1 1 1 1 1
IA 4
5 5 4 4 4 4 4
IA 5
4 4 3 1 1 0 0
IA 6
5 5 5 5 5 3 3
IA 7
4 4 4 4 4 4 4
IV 1
4 4 4 3 3 3 3
IV 2
4 4 4 4 3 3 3
IV 3
4 4 3 2 2 2 3
IV 4
4 4 4 3 3 3 3
IV 5
4 4 3 3 3 3 3
46
5. DISCUSSÃO
Diferentes modelos animais de AVC sugeriram que há melhora funcional
e/ou estrutural após injeção intravenosa, intra-arterial ou intracerebral de
diferentes tipos celulares32, 34, 36, 45, 62, 87, 104, 105. Uma vantagem importante das
células de medula óssea utilizadas no presente estudo é a existência de grande
quantidade de dados de segurança de estudos clínicos com estas mesmas
células em doenças malignas e não-malignas27, 148. Estudos pré-clínicos
mostraram que elas aumentam a recuperação após isquemia cerebral aguda,
subaguda ou crônica, mas não está claro quais tipos celulares são responsáveis
por este efeito, uma vez que a melhora funcional foi relatada com diferentes
células19, 120.
Embora os resultados clínicos com outras doenças isquêmicas e estudos
pré-clínicos até o momento sejam encorajadores, ainda há muitas perguntas
sobre os possíveis mecanismos de ação das células e sobre o protocolo de
tratamento ideal. Um dos principais pontos é qual o tipo celular mais adequado.
Uma recente meta-análise de 117 estudos pré-clínicos de AVC indicou que, para
efeitos estruturais, as células-tronco autólogas foram mais eficazes do que as
células alogênicas, enquanto, para efeitos funcionais, as células alogênicas foram
mais eficazes102. Curiosamente, os autores não encontraram diferença entre
células embrionárias e adultas alogênicas tanto para os resultados estruturais ou
funcionais. Isto reforçaria o uso de células adultas, uma vez que seriam evitadas
as preocupações de ordem ética associadas com as células embrionárias ou
fetais. Além disso, células da medula óssea podem ser colhidas a partir do
paciente para terapia autóloga, evitando a necessidade de agentes
imunossupressores19, 78.
De modo a aperfeiçoar as terapias celulares futuras para o AVC, é
necessário elucidar os mecanismos moleculares que controlam a interação das
células enxertadas com o cérebro isquêmico. A isquemia cerebral é
imediatamente seguida por uma disfunção microvascular, estresse oxidativo,
ruptura da BHE e excitotoxicidade. Estes eventos são acompanhados pela
liberação de sinais endógenos para o meio extracelular, pela ativação do sistema
imune inato e pela infiltração de leucócitos do sangue para o cérebro81. Neste
cenário, a interação das células transplantadas com o tecido isquêmico é mediada
47
por uma vasta gama de receptores, tais como receptores toll-like, receptores de
adenosina e receptores de quimiocinas, que são ativadas após a exposição a
mediadores inflamatórios liberados durante as fases aguda / subaguda do AVC.
Foi demonstrado que vários receptores de quimiocinas estão envolvidos no
recrutamento de CTM de medula óssea e CTN para o cérebro isquêmico82, 178.
Assim, o ambiente pós-isquêmico pode afetar a função das células-
tronco/progenitoras, o que por sua vez, pode modular a resposta inflamatória do
micro-ambiente local, como discutido acima. Embora tenha sido demonstrado que
CTN e células neuroepiteliais derivadas de iPS humanas podem dar origem a
neurônios funcionais quando transplantadas 48 horas após isquemia cerebral em
ratos122, 138, pouco se sabe ainda sobre como o ambiente pós-isquêmico afeta a
sobrevivência, a proliferação e a diferenciação das CTN transplantadas. Em um
estudo interessante, por exemplo, o pré-condicionamento com interleucina-6
aumentou a sobrevivência de CTN transplantadas na zona de penumbra
isquêmica 6 horas após a lesão152, sugerindo que manipulações farmacológicas
ou genéticas podem ser usadas para melhorar a eficácia de terapias celulares.
Quanto ao momento do transplante, a maioria dos estudos experimentais
realizou o transplante celular nos primeiros 3 dias após a isquemia cerebral. Isto
já representaria um grande avanço no tratamento do AVC porque aumentaria a
janela terapêutica de 4,5 horas necessária para a trombólise com tPA. Além da
fase aguda, os estudos pré-clínicos têm demonstrado que a terapia celular
aumenta a recuperação funcional após o AVC subagudo e crônico 19. Entretanto,
poucos estudos compararam janelas de tempo diferentes, com resultados
divergentes de acordo com o modelo e tipo de célula estudado. Num modelo
animal de isquemia focal, de Vasconcelos dos Santos e cols.45 encontraram uma
melhora significativa no teste de cilindro após a injeção intravenosa de CTM de
medula óssea 1 dia ou de CMN de medula óssea 1 ou 7 dias após a isquemia. No
entanto, a melhora não ocorreu quando os animais foram tratados 30 dias após a
lesão. Em um modelo de oclusão da ACM, Yang e cols.183 descreveram melhora
nos testes de cilindro se a injeção fosse realizada entre 1 e 3 dias, mas não 28
dias após a lesão. Ainda em um modelo de oclusão de ACM, Komatsu e cols. 92
encontraram uma redução de volume da lesão isquêmica se a terapia com CTM
de medula óssea era realizada 7 dias após a lesão mas não aos 14 ou 28 dias,
48
enquanto que a melhora na angiogênese e no teste da esteira ocorreram se as
células eram injetadas até 28 dias após a oclusão da ACM. Além de Komatsu e
cols., Shen e cols.161 e Yasuhara e cols.185 também encontraram efeitos positivos
quando a terapia celular era realizada 1 mês após o AVC. Não obstante, em sua
meta-análise de diferentes estudos pré-clínicos, Lees e cols.102 encontraram uma
redução absoluta na eficácia de 1,5% por cada dia de atraso do tratamento para o
resultado estrutural, enquanto a melhora do resultado funcional ocorreu nas
janelas precoces e tardias102.
A injeção intravascular das células-tronco nas fases aguda e subaguda
pode se beneficiar do período em que a BHE está aberta, o que permitiria a
atração das células por citocinas produzidas na área da lesão20. A abertura da
BHE também facilitaria a entrada das células ou de fatores produzidos por elas20.
Na fase crônica, a utilização de agentes permeabilizadores da BHE como o
manitol poderia ser necessária20. No entanto, um ponto interessante foi que no
presente estudo a migração das CMN de medula óssea para a região do AVC
ocorreu mesmo após quase 3 meses da lesão isquêmica, indicando que ainda
existe estímulo para a migração celular neste momento, apesar da grande
variabilidade entre pacientes. Entretanto, não foi possível esclarecer quais
subtipos celulares da medula óssea migraram para o cérebro ou para os outros
órgãos. É possível que a biodistribuição encontrada no cérebro seja pelos
diferentes subtipos de forma homogênea ou que algum subtipo celular como o
monócito tenha maior afinidade pela área da lesão, e este ponto ainda precisará
ser investigado em futuros estudos.
A dose apropriada que deve ser usada em ensaios clínicos também
permanece indefinida. As diretrizes da Conferência Stem Cell Therapies as an
Emerging Paradigm in Stroke (STEPS) recomendam uma translação da dose de
células por peso baseada nos estudos animais. Em estudos clínicos de infarto
agudo do miocárdio, uma meta-regressão indicou uma correlação dose-resposta
entre a quantidade de células CD34+ injetada e a melhora na fração de ejeção do
ventrículo esquerdo. Uma correlação dose-resposta também foi relatada por
diversos estudos pré-clínicos para o AVC102, 154, 183.
A utilização de técnicas não invasivas de imagem in vivo podem melhorar a
compreensão de várias perguntas não resolvidas na campo da terapia celular,
49
incluindo questões tais como (1) o efeito das diferentes doses e/ou das diferentes
vias de injeção sobre a migração e proliferação celular, (2) reações adversas
como formação de tumores ou novos AVCs; (3) efeitos positivos morfológicos que
podem ser analisados em TC ou RM; (4) efeitos positivos funcionais que podem
ser analisados por RM funcional, SPECT ou PET; (4) a programação do intervalo
entre as doses e o número de células a ser transplantado.
Um pequeno número de estudos pré-clínicos comparou diferentes vias de
injeção, com resultados discordantes, dependendo do modelo experimental e
momento do transplante. O transplante intracerebral pode permitir uma maior
retenção do que a injeção intravascular, porém é um método invasivo e que leva a
distribuição inadequada das células no local da lesão conforme demonstrado em
estudos animais103, 177. Um estudo pré-clínico realizado por Walczak e cols.
indicou que poderia ocorrer oclusão vascular analisada por Doppler e um
aumento na mortalidade após o transplante intra-arterial de CTMs de medula
óssea para um modelo de AVC isquêmico (67% de mortalidade nos animais
tratados em comparação com 7% dos animais não submetidos à terapia
celular)177. Os autores indicaram que o diâmetro das CTMs poderia ter relação
com a retenção das células no lúmen vascular e consequente redução do fluxo
cerebral. De forma similar, Li e cols. observaram uma alta taxa de mortalidade
após administração intra-arterial de CTNs (41%) em comparação com as vias
intracerebral (17%) e intravenosa (8%)103. Por outro lado, células de diâmetros
menores que as CTMs e CTNs apresentaram resultados diferentes. Kamiya e
cols.87 demonstraram que a injeção intra-arterial de CMN de medula óssea
resultou em melhores resultados funcionais em comparação com injeção
intravenosa em um modelo de isquemia transitória. Vasconcelos-dos-Santos e
cols.173 relataram que as infusões intravenosa e intra-arterial dessas células
levaram à recuperações funcionais equivalentes e baixa retenção das células no
cérebro num modelo de isquemia permanente. Zhang e cols.186 também relataram
que injeções intra-arteriais, intravenosas, intracerebrais, intra-cisterna magna e
intratecais de células derivadas do tecido umbilical humano em um modelo de
AVC levaram a melhoras estruturais semelhantes. A única meta-análise de
estudos pré-clínicos para o AVC não encontrou nenhum impacto importante da
via de administração na eficácia da terapia celular 102.
50
Um estudo pré-clínico recente de Janowski e cols.83 trouxe informações
interessantes em relação ao risco de redução no fluxo cerebral após injeção intra-
arterial. Neste artigo foram injetados salina, precursores gliais ou CTM de medula
óssea na carótida comum ou na carótida externa de animais normais. Os autores
concluíram que não só o diâmetro e número de células influenciava na redução
do fluxo cerebral, mas também a velocidade de injeção. Quando foi realizada a
infusão na velocidade de 3mL/min houve ocorrência de AVCs até mesmo com
salina pura. Ao realizar o transplante de 2x106 precursores gliais, a redução na
velocidade de 3mL/min para 0,2 mL/min fez com que o número de AVCs caísse
de 75% para zero. No caso das CTM, houve AVCs mesmo injetando 0,2 mL/min,
mas quando reduziram o número de células para 1x106 o número de AVCs
também foi reduzido, de 87,5% para zero.
Outros aspectos que devem ser esclarecidos são os efeitos da velocidade
de injeção e do uso de heparina ou contraste iodado nas células. Um estudo pré-
clínico por El-Khoury e cols.50 mostrou que taxas de infusão intra-arterial de 5
mL/min reduziram a viabilidade das CMN de medula óssea 19%, enquanto as
taxas de 2 mL/min não afetaram a viabilidade ou produção de citocinas. No
entanto, ainda que o iodo e baixas doses de exposição a heparina não tenham
reduzido a viabilidade das células, doses elevadas de heparina foram citotóxicas.
No que diz respeito à administração por via intravenosa e intracerebral, faltam
informações sobre os efeitos da velocidade de injeção a partir de estudos pré-
clínicos. Além disso, a maioria dos ensaios clínicos publicados até o momento
não reportaram o volume ou a duração da injeção, como mostrado na Tabela 1
desta Tese.
Além dos diferentes aspectos mencionados anteriormente, é extremamente
importante avaliar, acima de tudo, a segurança das terapias celulares. Embora a
maioria dos estudos clínicos publicados indique que as terapias celulares são
seguras e viáveis, há falta de dados científicos robustos e muitas perguntas
continuam sem resposta. Um dos pacientes do grupo intra-arterial deste ensaio
clínico e um do grupo intravenoso haviam apresentado convulsões precoces
(menos de 2 semanas após o AVC) antes de serem incluídos no estudo. Ainda
que não seja possível excluir a possibilidade que as convulsões neste estudo
tenham ocorrido por acaso ou pela presença de fatores de risco, a ocorrência de
51
convulsões em 7 de 12 pacientes (58%) aponta para a necessidade de cautela. A
proporção de convulsões tardias (mais de 2 semanas após o AVC) foi estimada
de 3 a 67%, com grandes variações entre as séries29. Um grande número de
fatores de risco foram relacionados com as convulsões tardias, incluindo
localização cortical, AVCs de grande extensão e a ocorrência de convulsões
prévias18, 29, 97. Os pacientes incluídos neste ensaio clínico apresentavam grandes
infartos, não-lacunares, em território de ACM, o que pode explicar parcialmente a
elevada proporção de convulsões no grupo intravenoso, que apresentava lesões
de maior gravidade do que o grupo intra-arterial. Não obstante, também é
possível que as células injetadas tenham ativado mecanismos de reparação
cerebrais e modificado a excitabilidade nas áreas perilesionais levando às
convulsões, e esta possibilidade merece investigação em estudos futuros. Nesse
sentido, é importante ressaltar as limitações do presente estudo. Além de não ter
sido possível seguir as células marcadas por períodos maiores, o número de
pacientes foi pequeno, como aprovado pela Comissão Nacional de Ética em
Pesquisa para um estudo introdutório. É importante ressaltar também que, em
função do tamanho da amostra e da ausência de grupo controle, este estudo não
teve como objetivo avaliar a eficácia da terapia celular. Qualquer melhora nas
escalas neurológicas pode ser atribuída à recuperação espontânea que pode
ocorrer após um AVC. Portanto, a estudos randomizados e controlados serão
necessários para evitar estas limitações e permitir a análise de fatores como o
número de células injetadas e a via e momento de administração.
Em futuros estudos, também é importante avaliar a influência de variáveis
clínicas, tais como a presença de co-morbidades. Um estudo pré-clínico por Chen
e cols. 33 indicou que a injeção de CTM de medula óssea 24 horas após oclusão
da ACM não melhorou o resultado funcional em ratos diabéticos de tipo 1 e
aumentou a aterosclerose, mas esse aspecto ainda necessita ser melhor
avaliado. Outra faceta que merece atenção é a influência da administração de
fatores tais como G-CSF. Estudos clínicos com a injeção de G-CSF em pacientes
com AVC indicam que o processo parece ser seguro22, 51, 58, 128, 157, 162, 166, mas
somente o estudo de England e cols.51 avaliou os efeitos do transplante de
células CD34 + após a injeção de G-CSF. Outros atributos de segurança, tais
como a estabilidade genética e a imunogenicidade de células também devem ser
52
observados e foram revistos em uma excelente publicação por Goldring e cols.65.
A observância destes aspectos não significará um atraso para a área e, ao
mesmo tempo, vai permitir um desenvolvimento responsável e adequado das
terapias celulares para o AVC.
53
6. CONCLUSÕES
Foi possível realizar o acompanhamento de CMN de medula óssea
marcadas com 99mTc até 24 horas após injeção intra-arterial ou intravenosa em
pacientes com AVC isquêmico.
Foram aperfeiçoados métodos de quantificação para avaliação da
biodistribuição nos diferentes órgãos de interesse. Além disso, através da fusão
de imagens SPECT e TC ou RM, foi possível analisar a biodistribuição das células
no cérebro em correlação com a lesão isquêmica.
Apesar da maior migração relativa nos pacientes do grupo intra-arterial
para o hemisfério isquêmico comparado com o contralateral 2 horas após a
injeção, a migração total para o cérebro comparada com o corpo inteiro foi
pequena e semelhante entre as duas vias de injeção com 2 e 24 horas.
As maiores diferenças na biodistribuição das CMN foram observadas nos
outros órgãos, com a injeção intravenosa demonstrando menor migração para o
fígado e baço e maior migração para os pulmões, nos períodos analisados.
54
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189. Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature 2011;474:212-215.
190. Zhu J, Zhou L, XingWu F. Tracking neural stem cells in patients with brain trauma. N Engl J Med 2006;355:2376-2378.
191. Ziemka-Nalecz M, Zalewska T. Endogenous neurogenesis induced by ischemic brain injury or neurodegenerative diseases in adults. Acta Neurobiol Exp (Wars) 2012;72:309-324.
72
ANEXO 1
Artigos publicados relacionados à Tese
1. Rosado-de-Castro PH, Pimentel-Coelho PM, Barbosa da Fonseca LM, de
Freitas GR, Mendez-Otero R. The rise of cell therapy trials for stroke:
review of published and registered studies. Stem Cells Dev 2013;22:2095-
2111.
2. Ramos AB, Vasconcelos-Dos-Santos A, Lopes de Souza SA, Rosado-de-
Castro PH, Barbosa da Fonseca LM, Gutfilen B, Cintra WM, Mendez-Otero
R. Bone-marrow mononuclear cells reduce neurodegeneration in
hippocampal CA1 layer after transient global ischemia in rats. Brain Res
1522:1-11.
3. Rosado-de-Castro PH, Schmidt FR, Battistella V, Lopes de Souza SA,
Gutfilen B, Goldenberg RC, Kasai-Brunswick TH, Vairo L, Silva RM,
Wajnberg E, Alvarenga Americano do Brasil PE, Gasparetto EL, Maiolino
A, Alves-Leon SV, Andre C, Mendez-Otero R, Rodriguez de Freitas G,
Barbosa da Fonseca LM. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells
after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients.
Regen Med 2013;8:145-155.
4. Moraes L, Vasconcelos-dos-Santos A, Santana FC, Godoy MA, Rosado-
de-Castro PH, Jasmin, Azevedo-Pereira RL, Cintra WM, Gasparetto EL,
Santiago MF, Mendez-Otero R. Neuroprotective effects and magnetic
resonance imaging of mesenchymal stem cells labeled with SPION in a rat
model of Huntington's disease. Stem Cell Res 2012;9:143-155.
73
5. Friedrich MA, Martins MP, Araújo MD, Klamt C, Vedolin L, Garicochea B,
Raupp EF, Sartori El Ammar J, Machado DC, Costa JC, Nogueira RG,
Rosado-de-Castro PH, Mendez-Otero R, Freitas GR. Intra-arterial infusion
of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with moderate to
severe middle cerebral artery acute ischemic stroke. Cell Transplant
2012;21 Suppl 1:S13-21.
6. Vasconcelos-dos-Santos A, Rosado-de-Castro PH, Lopes de Souza SA, da
Costa Silva J, Ramos AB, Rodriguez de Freitas G, Barbosa da Fonseca
LM, Gutfilen B, Mendez-Otero R. Intravenous and intra-arterial
administration of bone marrow mononuclear cells after focal cerebral
ischemia: Is there a difference in biodistribution and efficacy? Stem Cell
Res 2012;9:1-8.
7. Pimentel-Coelho PM, Rosado-de-Castro PH, da Fonseca LM, Mendez-
Otero R. Umbilical cord blood mononuclear cell transplantation for neonatal
hypoxic-ischemic encephalopathy. Pediatr Res 2012;71:464-473.
8. Battistella V, de Freitas GR, da Fonseca LM, Mercante D, Gutfilen B,
Goldenberg RC, Dias JV, Kasai-Brunswick TH, Wajnberg E, Rosado-de-
Castro PH, Alves-Leon SV, Mendez-Otero R, Andre C. Safety of
autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with
nonacute ischemic stroke. Regen Med 2011;6:45-52.
9. Barbosa da Fonseca LM, Xavier SS, Rosado de Castro PH, Lima RS,
Gutfilen B, Goldenberg RC, Maiolino A, Chagas CL, Pedrosa RC, Campos
de Carvalho AC. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells in
chronic chagasic cardiomyopathy after intracoronary injection. Int J Cardiol
2011;149:310-314.
74
10. Barbosa da Fonseca LM, Gutfilen B, Rosado de Castro PH, Battistella V,
Goldenberg RC, Kasai-Brunswick T, Chagas CL, Wajnberg E, Maiolino A,
Salles Xavier S, Andre C, Mendez-Otero R, de Freitas GR. Migration and
homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke after
intra-arterial injection. Exp Neurol 2010;221:122-128.
11. Barbosa da Fonseca LM, Battistella V, de Freitas GR, Gutfilen B, Dos
Santos Goldenberg RC, Maiolino A, Wajnberg E, Rosado de Castro PH,
Mendez-Otero R, Andre C. Early tissue distribution of bone marrow
mononuclear cells after intra-arterial delivery in a patient with chronic
stroke. Circulation 2009;120:539-541.
75
ANEXO 2
Escala NIHSS
(http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/consulta_publica_AVC.pdf)
Anexo 2
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ANEXO 3
Índice de Barthel
(http://www.pactoavc.com.br/downloads/anexos.pdf)
116
ANEXO 8
Índice de Barthel Modificado
Alimentação Totalmente dependente 0Necessita de ajuda (para cortar) 5Independente 10
Banho Não pode executar sem assistência 0Executa sem assistência 5
Toalete Pessoal Necessita de ajuda 0Lava o rosto, penteia cabelos e escova os dentes 5
Vestuário Totalmente dependente 0Necessita de ajuda, mas faz pelo menos a metade datarefa dentro de um período de tempo razoável 5Independente, amarra sapatos, fixa fivelas e coloca adaptações 10
Controle de Intestinos Acidentes freqüentes 0Acidentes ocasionais ou necessita auxílio comenema ou supositório 5Sem acidentes e independente no uso de enemasou supositórios, se for necessário 10
Controle da Bexiga Incontinência ou necessidade de uso de catéter 0Acidentes ocasionais ou necessita de ajuda com odispositivo 5Sem acidentes, capaz de cuidar do dispositivo de coleta,se for usado 10
Locomoção até o banheiro Não usa banheiro, restrito ao leito 0Necessita de ajuda para equilibrar-se, colocar as roupas,cortar o papel 5Independente no banheiro 10
Transferência da cama para a cadeira Restrito ao leito não é possível o uso da cadeira 0Capaz de sentar, mas necessita assistência máximana transferência 5Mínima assistência ou supervisão 10Independente, inclusive nas travas da cadeira de rodas elevantar o suporte do pé 15
Mobilidade e deambulação Senta na cadeira de rodas mas não se impulsiona 0Independente na cadeira de rodas por 50 m, nãoconsegue caminhar 5Caminha com ajuda por uma distância de 50 m 10Independente por 50 m, pode usar dispositivos de auxílio,sem ser o andador com rodas 15
Subir escadas Não sobe escadas 0Necessita de ajuda ou supervisão 5Independente, pode usar dispositivo de auxílio 10
TOTAL
80
ANEXO 4
Escala modificada de Rankin
(http://www.pactoavc.com.br/downloads/anexos.pdf)
115
ANEXO 7
Escala de Rankin Modificada
Grau 0 Sem sintomas
Grau 1 Nenhuma incapacidade significante, com capacidade para desempenhartodas as AVDs
Grau 2 Incapacidade leve, incapaz de realizar algumas atividades prévias de AVDs,mas com capacidade de cuidar de suas próprias atividades sem assistência
Grau 3 Incapacidade moderada, requerendo alguma ajuda mas com capacidade decaminhar sem assistência
Grau 4 Incapacidade moderadamente severa, incapacidade de caminhar e para atendera própria necessidade do corpo sem assistência
Grau 5 Incapacidade severa, confinado ao leito, incontinente e requerendo cuidados eatenção de enfermagem constante
Grau 6 Óbito
81
ANEXO 5
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Protocolo Intra-arterial
ANEXO 1 – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu fui convidado a participar do estudo "SEGURANÇA DO TRANSPLANTEAUTÓLOGO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA EMPACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICOSUBAGUDO". Em relação ao estudo, eu fui informado das seguintes questões:
1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital (n° 169/03) e pelaComissão Nacional de Ética em Pesquisa (n° 10385).
2. O objetivo deste estudo é avaliar se o transplante de células retirada da medula doosso é seguro no tratamento do AVC (acidente vascular cerebral, ou "derrame") em sereshumanos. O estudo está sendo realizado pois as células-tronco conseguiram ajudar narecuperação do AVC em ensaios em animais. Nesses ensaios, os animais que receberam ascélulas-tronco após o AVC tiveram menos seqüelas do que os animais que não receberamestas células. Não se sabe se as células-tronco se transformam em neurônios ou se produzemsubstâncias que ajudam na recuperação.
3. O estudo irá incluir apenas pessoas entre 18 e 75 anos que tenham apresentado umAVC isquêmico nos últimos 90 dias confirmado pela tomografia computadorizada de crânio.Não poderão ser incluídas pessoas que tenham alguma doença ou condição que possamdificultar a realização do estudo como, por exemplo, câncer, insuficiência do fígado, gravidez.
4. Uma vez que eu concorde em participar do estudo, eu serei submetido (a) aosseguintes procedimentos:a) Será realizada retirada de células através de punção da medula (parte interna) do osso dabacia, sob efeito de sedativos e analgésicos, por um especialista em hematologia. Esteprocedimento é semelhante aos já realizados para transplantes de medula utilizados em largaescala na medicina de hoje. Não constitui nenhuma novidade no meio médico, além deoferecer risco muito baixo de complicações. Estes riscos envolvem perfuração óssea einfecção do osso, e ocorrem em menos de 1% dos casos;b) O implante de células tronco ocorrerá no mesmo dia, e a via de administração será ocateterismo cerebral. O cateterismo consiste na colocação, após anestesia local, de um cateterem uma artéria na região da virilha, o que permite levar esse cateter até as artérias cerebraispara visualização destas e infusão das células-tronco de medula óssea. O cateterismo cerebralé o único procedimento do estudo que é considerado invasivo, porém é um procedimentoseguro, com risco de complicações em cerca de 1,4% dos casos. O cateterismo será realizadopor um especialista em radiologia intervencionista.c) Serão realizados dois exames de cintilografia cerebral para avaliar a "posição" das células-tronco no meu cérebro: 2 e 24horas após a injeção das células.
Eu vou ficar internado (a) no Hospital por dois dias após o implante de células troncoe, neste período serei submetido a novos exames de sangue, tomografia computadorizada (senecessário), eletroencefalograma, assim como escalas neurológicas para verificar o grau deindependência e recuperação. Depois da alta hospitalar, consultas e exames de sangue serãorealizados 7, 30, 60 e 120 dias após o transplante das células.
5. Eu estou consciente de que podem existir alguns efeitos colaterais relacionados aoestudo. Os riscos do implante de células em seres humanos são muito pouco conhecidos.Existem seres humanos que já receberam células parecidas com as da medula óssea nocérebro, em doenças degenerativas, como Doença de Parkinson através de procedimentocirúrgico, com implante direto. Outros pacientes já foram submetidos a implantes de célulasna fase aguda do acidente vascular cerebral. Não houve qualquer complicação relatada até omomento. Observe que apenas poucos pacientes já se submeteram a este procedimentopreviamente, o que é muito pouco para que possamos afirmar qualquer coisa com respeito às
82
complicações. No entanto, existe a possibilidade de algumas complicações, além das acima,ocorrerem: inflamação no cérebro, levando a aumento da lesão e inchaço no mesmo,sangramento cerebral,aparecimento de atividade epiléptica, infecção no cérebro e crescimentode tecidos não cerebrais no cérebro.
6. Eu estou consciente de que não existe remuneração referente à inclusão no estudo,nem ressarcimentos ou indenizações relacionadas às complicações dos procedimentos doestudo. Caso o paciente apresente alguma complicação, os investigadores serão responsáveispelo seu tratamento.
7. Eu estou consciente de que os pesquisadores do estudo terão acesso ao meuprontuário, para verificar doenças passadas ou futuras. A revisão dos prontuários e registrosmédicos será realizada de acordo com a legislação brasileira (resoluções do Conselho Federalde Medicina n° 1605/2000, 1638/2002, 1642/2002).
8. Eu estou consciente que, enquanto o estudo estiver sendo realizado, eu não sereiidentificado por quaisquer pessoas de fora do estudo, e de que os meus resultados serãoconfidenciais.
9.Eu estou consciente que posso me recusar a participar do estudo e que eu posso sairdo estudo quando quiser, e que isto não vai afetar o meu tratamento médico. Se eu apresentaralgum problema que eu suspeite que tenha resultado do meu envolvimento no estudo, euestou ciente que devo falar com meu neurologista. Conheço e posso telefonar, se necessário,para os Drs. Charles André (telefone pessoal: 9989.7937), Gabriel de Freitas (telefonepessoal: 9973.0164) e Valéria Battistella (telefone pessoal:9328.7596).
_____________________________________ _________________Assinatura do paciente ou responsável legal DataEu expliquei ao paciente ____________________________________________________ oprojeto de pesquisa e os efeitos do tratamento. Acredito que ele (a) tenha compreendido aminha explicação e que deu o seu consentimento de livre e espontânea vontade.
__________________________________ _________________ Gabriel R. de Freitas, CRM 52.60589-7 Data Charles André, CRM 52.38570-7 Valéria Battistella, CRM 52.70716-3
83
ANEXO 6
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – Protocolo Intravenoso
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu fui convidado a participar do estudo “TERAPIA CELULAR PELO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS TRONCO DE MEDULA ÓSSEA EM PACIENTES COM ACIDENTE VASCULAR CEREBRAL ISQUÊMICO”. Em relação ao estudo, eu fui informado das seguintes questões:
1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa.
2. O objetivo deste estudo é avaliar se o transplante de células retirada da medula do osso é seguro no tratamento do AVC (acidente vascular cerebral, ou “derrame”) em seres humanos. O estudo está sendo realizado pois as células tronco conseguiram ajudar na recuperação do AVC em ensaios em animais. Nesses ensaios, os animais que receberam as células tronco após o AVC tiveram menos seqüelas do que os animais que não receberam as estas células. Não se sabe se as células tronco se transformam em neurônios ou se produzem substâncias que ajudam na recuperação.
3. O estudo irá incluir apenas pessoas entre 18 e 75 anos que tenham apresentado um AVC isquêmico nos últimos 90 dias confirmado pela tomografia computadorizada de crânio ou por ressonância magnetica. Não poderão ser incluídas pessoas que tenham alguma doença ou condição que possam dificultar a realização do estudo como, por exemplo, câncer, insuficiência do fígado, gravidez.
4. Uma vez que eu concorde em participar do estudo, eu serei submetido(a) aos seguintes procedimentos:
a) Será realizada retirada de células através de punção da medula (parte interna) do osso da bacia, sob efeito de sedativos e analgésicos, por um especialista em hematologia. Este procedimento é semelhante aos já realizados para transplantes de medula utilizados em larga escala na medicina de hoje. Não constitui nenhuma novidade no meio médico, além de oferecer risco muito baixo de complicações. Estes riscos envolvem perfuração óssea e infecção do osso, e ocorrem em menos de 1% dos casos. b) O implante de células tronco ocorrerá no mesmo dia, e a via de administração será intravenosa. Eu vou ficar internado(a) no Hospital por 1 ou mais dias após a infusão de células tronco, e, neste período serei submetido à novos exames de cintilografia, eletrencefalograma, exames de sangue, assim como testes neuropsicológicos para avaliação da sua qualidade de vida e escalas neurológicas para verificarmos o grau de independência e recuperação. Depois da alta hospitalar, consultas, exames de sangue, exames de imagem e eletrencefalograma serão realizados 30, 60 e 120 dias após o transplante das células. 5. Eu estou consciente de que podem existir alguns efeitos colaterais relacionados ao estudo.
Os riscos do implante de células em seres humanos são muito pouco conhecidos. No Brasil 33 pacientes com acidente vascular cerebral isquemico ja receberam células de medula óssea injetadas através da artéria crebral media. Em nenhum destes pacientes houve qualquer complicacao que pudesse ser atribuída as células. Existem seres humanos que já receberam células parecidas com as da medula óssea no cérebro, em doenças degenerativas, como Doença de Parkinson através de procedimento cirúrgico, com implante direto. Outros pacientes já foram submetidos a implantes de células na fase crônica do acidente vascular cerebral. Não houve qualquer complicação relatada até o momento. Observe que apenas poucos pacientes já se submeteram a este procedimento previamente o que é muito pouco para que possamos afirmar qualquer coisa com respeito às complicações. No entanto, existe a possibilidade de algumas complicações, além das acima, ocorrerem: inflamação no cérebro, levando a aumento da lesão e inchaço no mesmo, sangramento cerebral, aparecimento de atividade epiléptica, infecção no cérebro e crescimento de tecidos não cerebrais no cérebro.
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6. As pessoas que receberão as células tronco através da veia serão comparadas a um grupo que recebeu as células através da artéria cerebral media para avaliar os benefícios e complicações do procedimento. O objetivo e comparar se as células injetadas através da veia também conseguem chegar ate a área do AVC.
7. Eu estou consciente de que não existe remuneração referente à inclusão no estudo, nem ressarcimentos ou indenizações relacionados a complicações dos procedimentos do estudo. Caso o paciente apresente alguma complicação, os investigadores serão responsáveis pelo seu tratamento.
8. Eu estou consciente de que os pesquisadores do estudo terão acesso ao meu prontuário, para verificar doenças passadas ou futuras. A revisão dos prontuários e registros médicos será realizada de acordo com a legislação brasileira (resoluções do Conselho Federal de Medicina nos 1.605/2000, 1.638/2002, 1.642/2002).
9. Eu estou consciente que, enquanto o estudo estiver sendo realizado, eu não serei identificado por quaisquer pessoas de fora do estudo, e de que os meus resultados serão confidenciais.
10. Eu estou consciente que eu posso me recusar a participar do estudo e que eu posso sair do estudo quando quiser, e que isto não vai afetar o meu tratamento médico.
11. Se eu apresentar algum problema que eu suspeite que tenha resultado do meu envolvimento no estudo, eu estou ciente que eu devo falar com o meu neurologista. Conheço e posso telefonar, se necessário, para os Drs. Charles André (telefone pessoal: 9989.7937) e Gabriel de Freitas (telefone pessoal: 9973.0164).
____________________________________ ______________ Assinatura do paciente ou responsável legal data Eu expliquei ao paciente __________________________________________________ o projeto
de pesquisa e os efeitos do tratamento, que leu este termo de consentimento e discutiu comigo detalhes e dúvidas. Acredito que ele (a) tenha compreendido a minha explicação e que deu o seu consentimento de livre e espontânea vontade.
_____________________________________ ________________ Gabriel R. de Freitas, CRM 52 60589-7 data Charles André, CRM 52 38570-7
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