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Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento - Edição nº 30 - janeiro/junho 2003 1

2 Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento - Edição nº 30 - janeiro/junho 2003

Novas Aplicações paraa Engenharia Genética

Engenharia genética pode ajudar a prevenir e curar o câncer de mama

Entrevista

Entrevista concedida aMaria Fernanda Diniz

câncer de mama é um dos males que maisaflige a população feminina em todo omundo. A cada ano, 182 mil mulheres sãodiagnosticadas com câncer de mama e,dessas, 43 mil morrem. Apesar de ser umaenfermidade com grandes chances de cura,

quando detectada no início, ainda é a pior ameaça para asmulheres brasileiras, pois é o tumor maligno feminino demaior incidência e mortalidade no país. Nos últimos 20anos, segundo dados do INCA (Instituto Nacional doCâncer), a mortalidade por câncer de mama cresceu cercade 60%. A taxa de incidência desse câncer no Brasil foiestimada em 40,7 casos para cada 100 mil mulheres e a demortalidade em 10,3 para o mesmo número de mulheres.As causas para o aumento da incidência dessa doença nasúltimas décadas estão associadas aos estresses da vidamoderna e à mudança de comportamento das mulheres,que hoje ocupam grande parte do mercado de trabalho e consomem em muitomaior quantidade substâncias nocivas, como cigarros e bebidas alcoólicas.

A engenharia genética pode ser um caminho promissor para a prevençãoe a cura de muitas enfermidades, inclusive do câncer de mama. Diante disso,a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa, através daEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, uma de suas 40 unidades depesquisa, localizada em Brasília, DF; a Universidade de Campinas (Unicamp);a Universidade de Brasília (UnB) e a Universidade de Montevidéu, noUruguai, se uniram para desenvolver variedades de soja transgênica comanticorpos anticâncer contra o câncer de mama. Essas variedades serãoutilizadas para produção de fármacos que atuarão na prevenção e diagnósticoda doença e terão também potencial terapêutico, mesmo com o câncer emestágio avançado.. È importante ressaltar que elas não serão usadas na cadeiaalimentar, mas apenas como medicamentos

Os anticorpos monoclonais para uso clínico movimentam mais de US$1 bilhão nos EUA. No Brasil, a utilização desses anticorpos na área médicaainda é pequena. O principal anticorpo monoclonal usado clinicamente é oanti-CD3, que atua na prevenção da rejeição decorrente de transplantes deórgãos. O Instituto Butantã, de São Paulo, produz e distribui esse medicamen-to no Brasil. Os métodos e estratégias para produção de novos anticorposevoluíram, incorporando a manipulação genética, e a flexibilidade nessamanipulação fez desses anticorpos produtos de alto valor econômico e comgrandes perspectivas de utilização, especialmente para a prevenção etratamento de algumas enfermidades.

Para falar sobre essa pesquisa e outras questões relacionadas aodesenvolvimento de produtos transgênicos no Brasil, a revista BIOTECNO-

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LOGIA, CIÊNCIA & DESENVOLVI-MENTO entrevistou o pesquisadorda Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia, Elíbio Rech. Durantea entrevista, ele ressaltou os benefí-cios que a tecnologia do DNA re-combinante pode trazer para as áre-as de saúde e de alimentação, atra-vés da expressão de proteínas deinteresse em plantas e animais, quepassarão a atuar como biofábricas, oque certamente barateará os custosde produção, além de possibilitar aprodução em larga escala. Elíbioenfocou ainda questões polêmicas eatuais, como a rotulagem dos produ-tos transgênicos, entre outras. Ve-jam agora a entrevista:

BC&D – Em que ponto dedesenvolvimento está a pesquisapara produção da soja transgêni-ca com o anticorpo anticâncerde mama?

Elíbio Rech - A pesquisa estáem estágio avançado. Já temos se-mentes de soja em nossos laboratóri-os produzindo 25 mg de anticorposem uma semente, o que é um índicemuito bom. A estimativa é produziralguns quilos do anticorpo em ape-nas um hectare. O próximo passo épurificar as sementes (fazer um ex-trato a partir da semente, no qual sóo anticorpo é isolado) e enviá-las aoInstituto Pasteur para avaliação so-bre o potencial dessas sementes con-tra o câncer de mama. Eu acreditoque essa etapa esteja pronta até osegundo semestre de 2004.

BC&D - Como foi feito o pro-cesso de transformação genéticadessa soja?

Elíbio Rech - Os anticorposinseridos nas plantas de soja foramisolados na Universidade de Monte-vidéu a partir de camundongos. De-pois, eles passaram por um proces-so conhecido como “humanização”,ou seja, fazer com que sejam aceitospor seres humanos [A utilização defármacos à base de anticorpos re-combinantes vem se tornando umarealidade em todo o mundo]. Osprodutos humanizados também jáganham volume no mercado. Nos

EUA, vários anticorpos humaniza-dos já foram liberados pelo FDA(“Food and Drug Administration”) eum grande número se encontra emfase de testes clínicos, o que indicaque nos próximos dez anos, o mer-cado deverá estar repleto dessesanticorpos de última geração. A pers-

pectiva é de que a tecnologia deanticorpos recombinantes venha afornecer insumos para diversas áre-as da medicina, que incluem desdeagentes imunomoduladores até va-cinas recombinantes. Essa tecnologiatem sido utilizada no tratamento dedoenças graves como o câncer e aAIDS, além da prevenção de doen-ças bacterianas. É importante ressal-tar que o domínio de técnicas demanipulação genética foi fundamen-tal para a seleção, redefinição ehumanização desses anticorpos.

A inserção dos genes nas plan-tas de soja foi feita pela nossa equi-pe da Embrapa Recursos Genéticose Biotecnologia, que já domina astecnologias de transgenia. Além deagregar valor à soja, uma das nos-sas maiores preocupações é barate-ar os custos de produção dosfármacos a base de anticorpos. Aprodução de anticorpos recombi-nantes em plantas apresenta umgrande potencial biotecnológicodevido ao baixo custo de produçãoe à facilidade de introdução dotransgene.

BC&D – De que maneira aengenharia genética pode inten-sificar a utilização de anticorposno Brasil, já que apresentam bompotencial para cura de muitas en-fermidades?

Elíbio Rech - A utilização deanticorpos sempre mostrou bom po-tencial para o diagnóstico e trata-mento de muitas doenças, mas anti-gamente eles tinham que ser utiliza-dos em sua forma integral, o queonerava e dificultava o processo. Aengenharia genética tornou possí-vel a geração de anticorpos recom-binantes, desenvolvidos em labora-tório, que se constituem em peque-nos fragmentos capazes de expres-sar suas características de interessenas plantas. Além de diminuírem oscustos do processo, esses fragmen-tos, conhecidos como anticorpos mo-dernos, conseguem penetrar os tu-mores sólidos e praticamente nãocausam efeitos colaterais. Por isso,eu acredito que esse é um dos cami-nhos mais promissores da medicinano futuro. A tecnologia de desenvol-vimento dos anticorpos monoclo-nais recombinantes e sua eficiênciajá estão mais do que comprovados,mas é preciso desenvolver a suaprodução em larga escala a custosmenores. Os produtos à base deanticorpos existentes hoje no mer-cado brasileiro, como o Zenapax e aHerceptina têm custos muito altos esão inacessíveis para a maior parteda população.

BC&D – Existem outras pes-quisas nessa linha sendo desen-volvidas no Brasil?

Elíbio Rech - A manipulaçãogenética pode ser uma boa opçãopara reduzir os custos e otimizar aprodução de medicamentos. E, porisso, o desenvolvimento das plantasde soja com os anticorpos anticâncernão são a única pesquisa da Embrapanessa linha. Na verdade, a Empresa,através de três de suas unidades depesquisa – Embrapa Recursos Gené-ticos e Biotecnologia, EmbrapaInstrumentação Agropecuária (SãoCarlos, SP), e Embrapa Soja (Londri-na, PR) – a Unicamp, a Universidadede Brasília (UnB), a Universidade deSão Paulo (USP), a Universidade deMontevidéu e o Instituto Butantã for-maram uma rede para produção debiomoléculas voltadas para a saúdehumana e animal. O objetivo é de-senvolver plantas e animais que atu-

“O objetivo é desenvolver plantas eanimais que atuem como biofábricas,ou seja, que expressem característi-cas de interesse para os seres huma-nos e os animais.”

“... esses fragmentos, conhecidos comoanticorpos modernos, conseguem pene-trar os tumores sólidos e praticamentenão causam efeitos colaterais.”


em como biofábricas, ou seja, queexpressem características de interes-se para os seres humanos e os ani-mais. Atualmente, além das plantasde soja com os anticorpos anticâncer,estão sendo desenvolvidas tambémplantas de soja com o hormônio docrescimento humano; dois outros an-ticorpos com a UnB; alface e tomatetransgênicos com uma proteína anti-diarréica; além de animais transgêni-cos com características de interesseno leite. Dessas pesquisas, a que estáem fase mais adiantada é a sojatransgênica com os anticorpos contrao câncer de mama.

É muito importante ressaltar quenenhuma dessas plantas vai fazerparte da cadeia alimentar. Todaselas serão utilizadas para a produ-ção de fármacos.

BC&D – Recentemente, amídia divulgou amplamente umapesquisa baseada na utilização deproteínas da teia de aranha e quepode beneficiar vários setores daindústria. Em que estágio se en-contra essa pesquisa?

Elíbio Rech – Essa pesquisa émuito interessante e está sendoconduzida em parceria com o Insti-tuto Butantã, Universidade de SãoPaulo (USP), Unicamp e com aEmbrapa Instrumentação Agropecu-ária, em São Carlos, SP. Trata-se doestudo das proteínas que compõemas teias de aranhas e que pode ser achave para incrementar diversossetores da indústria, além da áreamédica. A pesquisa na EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologiaestá sendo conduzida por mim epelo pesquisador Francisco Aragão,além dos técnicos e estudantes quecompõem a nossa equipe. A mani-pulação das proteínas encontradasnas teias de algumas aranhas brasi-leiras permitiu entender o funciona-mento das folhas alfa e beta, que sãoas responsáveis pela rigidez e elas-ticidade dos fios. Esse estudo vaigerar benefícios para a indústria devestuário, através da fabricação denovos tipos de tecidos, sem falar naárea médica, que vai poder contarcom fios mais finos e resistentes,muito úteis para a sutura. A pesquisa

ainda está em fase inicial. No mo-mento, estamos empenhados nabusca de genes que são expressosnas glândulas das aranhas brasilei-ras, com o objetivo de formar umbanco genético na Unidade. Algu-

mas espécies potencialmente inte-ressantes já foram coletadas e en-contram-se no Butantã.

BC&D – O grande avanço daindústria farmacêutica, que se en-contra em poder das multinacio-nais, tem feito com que as pesso-as se esqueçam do grande poten-cial dos remédios fitoterápicos.Na sua avaliação, os produtos ge-neticamente modificados compropriedades medicinais podem

vir a sofrer algum tipo de boicotepor parte dessas grandes empre-sas que, potencialmente, perde-riam mercados?

Elíbio Rech – Essa questão temdois pontos importantes, que de-vem ser enfatizados. Um se refereaos medicamentos fitoterápicos, quetêm sido utilizados principalmentepor comunidades locais e indígenascom sucesso porque os povos des-sas comunidades detêm o conheci-mento tradicional e conhecem osefeitos e formas de utilização dasplantas medicinais. Mas, do ponto

de vista da medicina, o ideal é queesses produtos passem por testescientíficos para que se conheçam afundo as suas propriedades medici-nais. Muitos deles não apresentamnenhum efeito do ponto de vista daciência e os seus resultados sãopuramente de caráter somático. Osfitoterápicos e seus efeitos precisamser estudados. Daí a importância daciência e da tecnologia, quedisponibilizam as ferramentas ne-cessárias para estudar e conhecer asaplicações de diferentes produtosoriundos de plantas.

O segundo ponto está relacio-nado à indústria farmacêutica. Eu,particularmente, não acredito emboicote. O que eu acho que existe éuma certa inércia da indústria para acriação de novas fábricas, que hojesão muito necessárias em função dadescoberta cada vez mais ágil denovas moléculas, oriundas da biodi-versidade, e em alguns casos até apartir de fitoterápicos. As empresasteriam que mudar toda a sua estrutu-ra e até que ponto será que elasestão interessadas nessa vantagemcomercial e vão estimular o estabe-lecimento de novas fábricas? Na ver-dade, o cenário mundial hoje seconstitui de sistemas já estabeleci-dos para produção de proteínas re-combinantes, como por exemplo, avacina da hepatite B, a insulina e ohormônio do crescimento humano,entre outros. Essas proteínas sãovendidas na farmácia, mediante pres-crição médica. Elas já existem nomercado, são fabricadas por diver-sas empresas e estão à disposiçãodos consumidores.

A tecnologia do DNA recombi-nante permite a geração de novasmoléculas oriundas da biodiversi-dade em ritmo cada vez mais acele-rado. Por exemplo, nós estamostestando, em parceria com a USP,uma nova molécula chamadagomesina, um peptídeo isolado deuma aranha, e que tem potencialcontra bactérias e, por isso, podeser usado para a fabricação de anti-bióticos, e é eficiente também con-tra alguns fungos. O nosso objetivoé desenvolver um sistema paraexpressá-la porque até hoje ela nun-ca foi expressa em nada, a não ser

“O que eu acho que existe é uma certainércia da indústria para a criação denovas fábricas, que hoje são muito ne-cessárias em função da descoberta cadavez mais ágil de novas moléculas, oriun-das da biodiversidade, e em alguns ca-sos até a partir de fitoterápicos.”

“... essa tecnologia de plantas transgê-nicas vai exatamente ao encontro deuma demanda da sociedade, que é aredução da utilização de defensivos quí-micos com a conseqüente redução deseus efeitos para o meio ambiente. Nãoexiste nenhum antagonismo entre ostransgênicos e o meio ambiente, muitopelo contrário.”


na aranha. Estamos buscando for-mas para expressá-la em plantas ouno leite de animais. Mas esse éapenas um exemplo de um merca-do que está em expansão porquenovas moléculas potencialmente in-teressantes estão sendo constante-mente descobertas e precisam serproduzidas. Existem algumas fábri-cas de produção já estabelecidas,mas são muito caras e já estãoatingindo o seu limite de produção.Então têm que ser criadas novasfábricas, o que pressupõe grandeinvestimento, já que a montagemde cada uma delas envolve milhõesde dólares. A possibilidade deproduzí-las em biofábricas -plantasou animais – reduz os custos deprodução e, conseqüentemente, doproduto final. Pelo que eu sei, jáexiste em nível internacional umreconhecimento por parte das in-dústrias de que muitas moléculasestão chegando e que as fábricas jáestabelecidas não serão capazes deproduzí-las. Os sistemas de expres-são alternativos, como as biofábri-cas, também já são reconhecidospela indústria como uma potencialsolução para suprir a demanda acustos mais baixos, mas como eudisse anteriormente, ainda existeuma certa inércia em mudar toda aestrutura já existente.

BC&D – As vacinas transgêni-cas podem ajudar a controlar ou-tras doenças que afligem a popu-lação mundial, como a gripe e atuberculose?

Elíbio Rech – Sem dúvida. Éimportante lembrar que cada caso éum caso, mas existem duas aplica-ções básicas. A primeira é a produ-ção de medicamentos em larga esca-la. A grande vantagem da produçãoem planta é que não há o perigo decontaminação, como aconteceu coma doença da vaca louca, por exem-plo. Se o hormônio do crescimentohumano for produzido em planta,depois de purificado, o ser humanopode ter segurança total de que nãoserá contaminado por nenhum ví-rus. Mas quando é produzido emanimais, o controle na purificaçãotem que ser muito mais rígido, já que

normalmente o processo é feito commamíferos e nós também somos ma-míferos, então há mais chance deque microrganismos passem para asmoléculas. Logo, a produção dessasmoléculas em plantas é uma segu-

rança adicional para o consumidor.Mas, se todas as regras de segurançaforem seguidas à risca, o processopode ser feito também com animaise bactérias sem riscos para os sereshumanos. No caso de vacinas, asituação é um pouco diferente, jáque são feitas na maior parte emplantas. Mas há um ponto que eugostaria de enfatizar novamente: ne-nhum desses produtos vai entrar nacadeia alimentar. Serão utilizados

somente como fármacos. Eles vãointegrar a cadeia de medicamentos,o que implica alguns cuidados espe-ciais, como por exemplo, no trans-porte, que tem que ser feito emcaminhão fechado para não correr orisco de que alguma planta de sojacaia na estrada e possa ser plantada.Quanto às plantas-vacinas transgê-nicas, há ainda outra questão impor-tante a ser ressaltada: elas nuncaserão vendidas em feiras ou comofitoterápicos. Serão vendidas na far-mácia, como medicamentos, sobprescrição médica. É claro que porexemplo o alface transgênico paracombater a leishmaniose não serávendido em folha na farmácia. Asfolhas serão liofilizadas (processo

em laboratório pelo qual se transfor-ma a folha em pó), quantificadas,padronizadas e colocadas dentro decápsulas para serem vendidas.

BC&D – Enquanto se fala mui-to das plantas transgênicas, des-via-se a discussão dos males cau-sados pelos agrotóxicos tantopara o meio ambiente quanto paraa saúde da população. Você con-corda?

Elíbio Rech – Sem dúvida, con-cordo, claro. A questão é a seguinte:essa tecnologia de plantas transgê-nicas vai exatamente ao encontro deuma demanda da sociedade, que é aredução da utilização de defensivosquímicos com a conseqüente redu-ção de seus efeitos para o meioambiente. Não existe nenhum anta-gonismo entre os transgênicos e omeio ambiente, muito pelo contrá-rio. Uma questão, entretanto, quedeve ser amplamente debatida pelasociedade, e não tem sido, é comrelação aos produtos orgânicos. Porque? A base desses produtos é oesterco. E o esterco, tanto de gali-nha, quanto de bovinos normalmen-te apresenta grande quantidade deantibióticos, principalmente no casodas aves, que ficam depositados nosolo. Os produtos orgânicos, comoqualquer outra tecnologia, têm queser devidamente regulamentados, oque não tem acontecido no Brasil,onde são vendidos livremente emfeiras, sem nenhum tipo de selo. Emalguns lugares, como supermerca-dos e em grande parte das feiras deSão Paulo, esses produtos já sãoregulamentados, mas na maior partedos estados brasileiros, isso nãoacontece. Então,eu acho que a po-pulação se engana redondamentecom relação aos alimentos orgâni-cos, por exemplo, que podem ser dealto risco se não forem fiscalizados.Hoje existe a noção errada de quetudo que é natural é bom. Nemsempre é assim. Enquanto a atençãoda sociedade está desviada para osprodutos transgênicos, que hoje sãoos vilões de plantão, os produtosorgânicos são aceitos sem restri-ções, quando deveriam ser muitomais questionados.

“Hoje existe a noção errada de que tudoque é natural é bom. Nem sempre éassim. Enquanto a atenção da socieda-de está desviada para os produtos trans-gênicos, que hoje são os vilões de plan-tão, os produtos orgânicos são aceitossem restrições, quando deveriam sermuito mais questionados.”

“... a rotulagem vai enfrentar algumasdificuldades, como controlar alimentosque são vendidos em lugares alternati-vos. Como saber, por exemplo, se apamonha vendida na beira da estradaé feita a partir de milho transgênico?”


BC&D – Na sua avaliação,quais as vantagens práticas e po-tenciais que as plantas transgê-nicas têm em relação às conven-cionais?

Elíbio Rech – Depende, a situ-ação deve ser avaliada caso a caso.Mas no contexto atual podem serressaltadas as seguintes característi-cas: tolerância a herbicidas, resis-tência a insetos e vírus, e modifica-ção da qualidade protéica. A quali-dade nutricional beneficia direta-mente o consumidor. As outras não,beneficiam o produtor através daredução de custos de produção;melhor competitividade no merca-do externo e a redução no uso dedefensivos agrícolas. Sem falar nosbenefícios para o meio ambiente. Oagronegócio é que tem impulsiona-do esse país. Então, é fundamentalintegrar tecnologia ao sistema deprodução de alimentos.

BC&D – As sementes devemser consideradas patrimônio dahumanidade. No seu ponto devista, esses mesmos princípios po-dem ser empregados também nocaso das sementes transgênicas?

Elíbio Rech – Veja bem, sópara fazer uma comparação. A nossaLei de Proteção de Cultivares dáprerrogativa ao produtor – especial-mente para o pequeno, que só usaaquela semente para o seu sustento– de comprar a semente, plantar,colher e utilizá-la no ano seguintenovamente. Então, ele não precisacomprar. Nos EUA, a legislação nãooferece essa prerrogativa e, por isso,as sementes têm que ser compradastodos os anos. É claro que as situa-ções dos dois países são completa-mente diferentes. Nos EUA, a agri-cultura é extremamente subsidiada,além de outras vantagens. Mas oideal seria que o agricultor brasileirotambém pudesse comprar as semen-tes todos os anos porque a qualida-de da semente se torna bem melhor.Então, respondendo a pergunta, éclaro que qualquer tipo de sementerepresenta uma agregação de valore soberania para os países. Não seicomo essa situação vai ficar no futu-

ro, mas hoje, com a Lei de Proteçãode Cultivares, é possível fazer ummapeamento da planta, de formaque se alguém utilizá-la no futuro, apessoa que a desenvolveu tem comolocalizá-la e cobrar o que é devido.

Então, eu acho que sim, tanto faz sea semente for transgênica ou não.

BC&D – A SBPC (SociedadeBrasileira para o Progresso da Ci-ência), em texto publicado a res-peito de OGM’s diz que: “a intro-dução de OGM’s na cadeia de pro-dução de alimentos para uso hu-mano requer a divulgação atravésda rotulagem de cada produto,dando informações detalhadas ecompreensíveis. Como você ana-lisa essa questão?

Elíbio Rech – A rotulagem éum direito do consumidor. E é umaquestão que o país deve decidir. Seo Brasil decidir rotular, tudo bem.Mas para mim essa não é a questãoprincipal. O fato de o produto serrotulado não diz se ele é seguro. Eé isso o que o consumidor devesaber de fato: se os produtos quechegam às prateleiras dos super-mercados são seguros. Além disso,é importante que as pessoas sai-bam que a rotulagem vai enfrentaralgumas dificuldades, como con-trolar alimentos que são vendidosem lugares alternativos. Como sa-ber, por exemplo, se a pamonhavendida na beira da estrada é feitaa partir de milho transgênico? NosEUA, onde a população confia nosórgãos de fiscalização e regulamen-tação, os produtos não são rotula-dos. A sociedade não exigiu isso.Então, o que eu acho é que a soci-edade tem que confiar em duasinstâncias: primeiro, nos cientistas.Segundo, nas instituições de regu-

“Os transgênicos no Brasil foram colo-cados no banco do réus, sem nenhumaacusação concreta. Ou seja, estão se-guindo o caminho inverso ao aceitável:são culpados até que se prove sua ino-cência. Como é que uma sociedade podeevoluir nesse sentido?”

lamentação e fiscalização federaise estaduais. A sociedade deve exi-gir segurança. Eu participei recen-temente de um seminário internaci-onal em São Paulo, no qual foilevantada uma questão muito inte-ressante: nos EUA, todo produto éseguro até que se prove o contrário;na França, é o contrário. Já noBrasil, a situação é inédita, poisaqui os produtos transgênicos sãoseguros e inseguros, ao mesmo tem-po. Isso porque a polarização – afavor e contra esses produtos – fazcom que sejam taxados de segurospor um grupo e de inseguros poroutro. E o consumidor fica perdidono meio, sem saber o que fazer. Ostransgênicos no Brasil foram colo-cados no banco do réus, sem ne-nhuma acusação concreta. Ou seja,estão seguindo o caminho inversoao aceitável: são culpados até quese prove sua inocência. Como é queuma sociedade pode evoluir nessesentido? A sociedade brasileira temque confiar mais nas suas institui-ções. Se não existe essa confiança,então o problema é mais sério etranscende os produtos transgêni-cos. Nesse caso tem que haver co-brança, pressão para que as autori-dades melhorem o sistema, comopor exemplo, com a contratação demais fiscais. Por outro lado, eu achoque essa discussão sobre os produ-tos transgênicos é muito importan-te para a nossa sociedade porque éum exercício de avaliação crítica.Esses produtos abriram o caminhopara que qualquer nova tecnologiaque venha a “bater à nossa porta”daqui pra frente seja questionada.Eu torço para que a sociedadedirecione brevemente esse questio-namento para os produtos orgâni-cos, como eu já disse no iníciodessa entrevista. Será que são tãonaturais assim? O aprimoramentodo senso crítico em uma sociedadesó traz benefícios. A discussão soci-al é sempre muito saudável, mas apopulação deve ficar atenta porqueo que não é nada saudável é excluiro Brasil da tecnologia de desenvol-vimento de produtos transgênicos,que é fundamental para o seu de-senvolvimento e competitividadeinternacional.

Carta ao Leitor

Prezados Leitores,

Como já informamos, a revista Biotecnologia foireestruturada desde a edição anterior e está sendo editadaapenas em sua versão on line, disponível no sitewww.biotecnologia.com.br, à toda comunidade científica,com duas edições anuais, tanto em formato html comotambém em pdf, e obedecendo os mesmos critérios eobjetivos que nortearam nosso trabalho desde sua funda-ção, em 1997, como a indexação e a divulgação dapesquisa no país.

Nesta edição, contamos com a prestigiosa colaboração doDr. Elíbio Rech, pesquisador da Embrapa Cenargen, queem nossas páginas verdes nos conta a respeito não apenassobre novas aplicações dentro das múltiplas possibilida-des da engenharia genética, como dá sua opinião sobretemas tão polêmicos, como a rotulagem dos produtostransgênicos, e até mesmo sobre os alimentos orgânicos,tão em moda em nossos dias.

Esperamos que nossos leitores continuem tambéminteragindo conosco, para que possamos aperfeiçoar cadavez mais.

Dr. Henrique da Silva Castro

BIOTECNOLOGIA Ciência & DesenvolvimentoKL3 Publicações

FundadorDr. Henrique da Silva Castro

Direção Geral e EdiçãoAna Lúcia de Almeida

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Os artigos assinados são deinteira responsabilidade

de seus autores.

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Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência &Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS(International Information System for the Agricultural Sciencesand Technology) da FAOepara aAGROBASE (Base deDados daAgriculturaBrasileira).

Conselho CientíficoDr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Henrique da Silva Castro - Saúde;Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia

Fundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto Rogero

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJ

Colaboraram nesta edição:

Alexander Machado Cardoso, Anderson Brito da Silva ,André Vitor Chaves de Andrade, Aneli de Melo Barbosa,Ariadne Cristiane Cabral da Cruz, Ariane Maria Leoni,Carlos de Oliveira Paiva Santos, Celso Omoto, ChristianePhilippini Ferreira Borges, Cláudio Lúcio, FernandesAmaral, Cosme Damião Cruz, Danielle Patrice AlexandreLima, Elias da Costa, Elíbio Rech, Ellen Cristine Giese,Elza Fernandes de Araújo, Ester Ribeiro Gouveia, FábioAndré dos Santos, Gláucia Manoella de Souza Lima, HuiI Tsai, Humberto Miguel Garay, Iracema Mª Castro CoimbraCordeiro, Iulla Naiff Rabelo de Souza Reis, Janete Magalide Araújo, João de Deus Medeiros, João Marcelo Ochiucci,Joel Majerowicz, Jorge Fernando Pereira, José CaetanoZurita da Silva, José Ernesto Belizário, Juliano Alves, LaraTschopoko Pedroso Pereira, Lexandra Novaki, Loiva MariaKarnopp, Mª Fernanda Diniz, Manoel Teixeira SouzaJúnior, Marcelo Poletti, Maria de Lourdes Corradi da Silva,Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira, Maria do SocorroDuarte, Marisa Vieira de Queiroz, Mariza Boscacci Marques,Natália Florêncio Martins, Naysa B. Mandetta Clementino,Odílio B. G. Assis, Orlando Bonifácio Martins, Osmar AlvesLameira, Renato Molica, Ricardo Pilz Vieira, Rodrigo BarrosRocha, Rodrigo Volcan Almeida, Sylvia M. CampbellAlqueres, Welington Inácio de Almeida

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PPPPPesquisaesquisaesquisaesquisaesquisaPredição do Potencial de Alergenicidade em OGMs - estudo de caso 10Resistência de Inimigos Naturais a Pesticidas 16O Mapeamento Genético no Melhoramento de Plantas 27Filmes Comestíveis de Quitosana 33Bactérias Produtoras de Biossurfactantes 39Marcadores Microssatélites em Espécies Vegetais 46Biovidros 51Melhoramento Biotecnológico de Plantas Medicinais 55Degradação Seletiva de Proteínas e suas Implicações no Câncer 60Archaea: Potencial Biotecnológico 71Otimização da Propagação In vitro de Curauá (Ananas erectifolius L. B. SMITH) 78Cianobactéria Invasora 82Marcadores Moleculares e Geminivírus 91Glucanases Fúngicas 97Biossegurança em Biotérios 105A Biotecnologia e a Extinção de Espécies 109


Alergia, biossegurança deOGMs e uso de

Bioinformática napredição de proteínas

alergênicas

Um dos pontos principais para agarantia de biossegurança de alimentosgeneticamente modificados (OGMs), tam-bém conhecidos como transgênicos, é aavaliação do potencial de alergenicidadedas proteínas codificadas pelos genesinseridos. Modificações genéticas po-dem afetar a alergenicidade dos OGMsde duas formas principais: pela introdu-ção de alérgenos ou pela modificação donível ou da natureza de alérgenos intrín-secos. Os alérgenos podem ser introdu-zidos pela expressão de proteínas trans-gênicas, uma vez que as proteínas têmsido apontadas como agentes causado-res de diversas alergias (alimentar,esporos, pólen, etc.) (Kleter et al., 2002).

O potencial de alergenicidade deuma proteína não é um parâmetro facil-mente previsível, sendo dependente dadiversidade genética e da variabilidadeda resposta de IgEs 1 específicas. Dada afalta de previsibilidade da alergenicida-de, faz-se necessário obter evidênciasque minimizem as dúvidas quanto aopotencial alergênico da proteína emquestão, o que é feito mediante umprocesso de acessar riscos compostos dediversos passos (European Comission,2003).________________________________________1 A principal barreira imunológica a proteínas estranhas é a secreção de moléculas IgA, nointerior do intestino, a qual se complexa com as proteínas estranhas e bloqueia a sua absorção.As proteínas estranhas que conseguem chegar à circulação são recebidas por anticorpos daclasse IgA e IgG, os quais são eliminados do organismo pelo sistema retículo endotelial. Pessoasnormais geram anticorpos da classe IgA, IgM e IgG em minúsculas quantidades em reação aantígenos alimentares. Reações mediadas por IgE liberam histamina, prostaglandinas eleucotrienos, produzindo uma reação alérgica típica imediata, com sintomas que aparecem emminutos.

Reações não mediadas por IgE produzem os sintomas em horas ou dias. Reações não mediadaspor IgE e de mecanismo desconhecido causam um aumento da reatividade a um determinadoalimento sem o envolvimento do sistema imune, as quais chamamos de intolerância alimentar.(Theron G. Randolph: An Alternative Approach to Allergies - The New Field of Clinical Unravelsthe Environmental Causes of Mental and Physical Ills. Harper & Row, Publishers, New York,1989).

Pesquisa

Predição do Potencialde Alergenicidade emOGMs - estudo de caso

Gene da capa protéica de Papaya ringspot virus em mamoeiro transgênico

Manoel Teixeira Souza Júnior, Ph.D.Pesquisador em Biotecnologia/Genômica daEmbrapa Recursos Genéticos e [email protected]

Natália Florêncio Martins, Ph.D.Pesquisadora em Bioinformática da EmbrapaRecursos Genéticos e [email protected]

Ilustrações cedidas pelos autores

Em 2001, a FAO e a OMS defini-ram como árvore de decisão paraalergenicidade (Ver anexo) uma sériede condições que definem o potenci-al alergênico de uma nova proteínaintroduzida em alimentos genetica-mente modificados. Esse enfoque uti-liza estratégias que investigam a fontedo gene, a homologia da seqüênciacom alérgenos conhecidos, as rea-ções de associação com IgEs de fontesorológica de indivíduos alérgicos einvestiga algumas propriedades físi-co-químicas da proteína codificadapelo gene introduzido.

A análise bioinformática das se-qüências é fundamental para detectare prever propriedades estruturais, re-ações adversas e o potencial de aler-genicidade dessas proteínas. A FAO ea OMS recomendam uma padroniza-ção nas metodologias utilizadas paraa árvore de decisão.

A comparação das seqüências deinteresse com bancos de dados dealergênicos como o Structural Databaseof Allergenic Proteins - SDAP (http://fermi.utmb.edu/SDAP/index.html), eoutros servidores disponiveis nainternet, usando algoritmos de buscascomparativas como o FASTA e BLAST,é o método internacionalmente reco-nhecido para tal detecção. O métodoatual permite encontrar medidas desimilaridade e/ou identidade com pro-teínas conhecidas como alergênicas.


________________________________________2 Epitopos – O epitopo é constituído por um grupo de átomos, que formam configurações específicas tridimensionais, esterioespecíficas de tamanholimitado (em média na ordem de um tri a um hexassacarídeo, ou de um tri a um decapeptídeo), na superfície da molécula imunogênica. São asestruturas que induzem a imunogenicidade de uma molécula (regiões ditas imunopotentes) e seus determinantes específicos antigênicos (epitoposou locais conformacionais ou seqüenciais) relacionam-se mais com zonas distintas da moléculas. Atualmente, somente algumas moleculas de plantassão conhecidas como epitopos - que têm afinidade por IgEs. Uma coleção dessas moléculas foi organizada na forma de uma base de dados disponívelno endereco: http://www.csl.gov.uk/allergen/Index.htm.

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g1MUec7MUoRsahnilertneotnemazurc82PTPaparbmE 1R h6MUoRahniladadalortnocoãçadnucefotuaedairánigirooãçalupoP

Similaridades em seqüências primári-as podem sugerir reações alérgicasdecorrentes do aparecimento de regi-ões específicas de apresentação àsimuno-globulinas epitopos2.

Quanto à análise de homologiaem seqüências de proteínas introdu-zidas, recomenda-se o uso de bancosde dados internacionalmente conhe-cidos como o SwissProt, TrEMBL,que contêm seqüências de amino-ácidos da grande maioria dos alérge-nos dos quais se conhecem as rea-ções alérgicas.

A avaliação das seqüências atravésdas ferramentas da bioinformática auxi-liam na predição de reações cruzadas ede eventuais reconhecimentos pelasimunoglobulinas do tipo IgE. O CODEXalimentarius considera como potencial-mente alergênica a proteína que possuir35% de identidade com uma extensão(janela) de 80 aminoácidos ao longo detoda a seqüência protéica; contudo, esseparâmetro ainda está sendo discutidopela comunidade internacional (Hilemanet al., 2002). Já organizações internacio-nais como a FAO e a OMS sugerem oito

aminoácidos contíguos como o númeroideal, enquanto que o ILSI/IFBC deter-mina seis aminoácidos contíguos. Osegmento idêntico deve ser consideradocom base na similaridade química dosaminoácidos, cientificamente justificadade modo que evite resultados falso-positivos (European Comission, 2003).

Recentemente, Hileman e colabo-radores, que buscavam identidades emsegmentos contíguos de 6, 7 e 8 amino-ácidos idênticos, compararam, usandoo algoritmo FASTA, seqüências de seisendotoxinas de Bacillus thuringiensis(inseticidas), três seqüências de proteí-nas alimentares não alergênicas e 50proteínas de milho selecionadas aleato-riamente. Os autores concluíram que oalgoritmo usado é o mais eficiente e oque melhor prediz para reações cruza-das entre proteínas alergênicas, e suge-re que o segmento de oito aminoácidosestabeleça uma margem maior de segu-rança para a predição de alergenicida-de. Além disso, os autores apontaramque o segmento de seis aminoácidosidênticos foi o que produziu um maiornúmero de falsos positivos.

Epitopo potencialmentealergênico na capaprotéica do Papaya

ringspot virus (PRSV)

Recentemente, Kleter ePeijnenburg publicaram um trabalhona revista BMC Structural Biology(Kleter et al., 2002). Nessa publicaçãoos autores propõem uma metodologia

Figura 1 .Alinhamento de seqüências de aminoácidos das proteínas capsídicas dosisolados brasileiro (BR) e havaiano (HA5-1) de Papaya ringspot vírus (PRSV) utilizadoscomo doadores de gene cp para a produção dos mamoeiros transgênicos do Brasil edos EUA, respectivamente. Tarja vermelha mostra localização do epitopo EKQKEK naproteína capsídica do isolado havaiano.


Anexo I

Árvore de Decisão FAO

Figura 2. Estrutura secundária das proteínas capsídicas dos isolados brasileiro (BR) ehavaiano (HA5-1) de Papaya ringspot vírus (PRSV) utilizados como doadores de genecp para a produção dos mamoeiros transgênicos do Brasil e dos EUA, respectivamente.

de avaliação de casos potencialmentealergênicos e estendem as buscas com-parativas a bancos de dados, incluídoo pipeline, a predição de alergenicidadepelo método de Hoop & Woods (1981)e testes sorológicos para proteínas cujaidentidade com alergênicos fosse deseis ou sete aminoácidos.

Naquele artigo, a metodologia pro-posta foi aplicada em 33 proteínas trans-gênicas e suas predições de alergenici-dade foram discutidas. O procedimentofoi dividido em duas partes: primeira-mente, foi extraída da literatura interna-cional uma busca de epitopos lineares,em particular, de proteínas alergênicas;em seguida, a lista de proteínasalergênicas foi comparada com o con-junto de proteínas transgênicas.

O segundo passo da análise foi apredição de alergenicidade através doalgoritmo computacional descrito emHoops & Woods (1981). Subseqüen-temente, foi verificado se a regiãopredita como antigênica da proteínacoincidia com a seqüência de proteí-na alergênica. Esse passo foi particu-larmente útil para os casos onde osdados da literatura eram escassos.

Como resultado da metodologiaaplicada, 22 proteínas apresentaramresultados positivos com segmentos deseis ou sete aminoácidos. Três dessasforam identificadas como potencialmen-te alergênicas [PRSV CP - proteínacapsídica do Papaya ringspot vírus(PRSV) (gi593497), acetolactato sintaseGH50 e glicofosfato oxidoredutase. Osdemais casos foram claramente negati-vos, como a Cry1Ac.

A análise da capa protéica (CP)do vírus causador da doença deno-minada “Mancha Anelar” ou “Mosai-co”, o PRSV, em especial o isolado dopapaya havaiano HA 5-1, doador dogene de resistência nas variedadestransgênicas Rainbow e SunUp, cul-tivadas no Havaí desde 1998, apre-sentou o segmento EKQKEK idênti-co a uma proteína alergênica de ne-matóide, sendo assim classificadocomo potencialmente alergênicopelo método de predição. Para aseqüência EKQKEK, não foram en-contrados dados na literatura quedescrevam a potencial associação aIgEs. Portanto, os autores sugeriramque o potencial alergênico da prote-ína transgênica presente nos mamo-eiros havaianos fosse confirmado portestes clínicos e/ou sorológicos.


Figura 4. Gráfico de antigenicidade gerado pelo método Hopp e Woods (1981) da seqüênciadas proteínas capsídicas codificadas pelos genes cp de Papaya ringspot vírus presente nosmamoeiros transgênicos brasileiros e havaianos. O quadro superior mostra a antigenicidadeda proteína do isolado PRSV BR (Souza Jr., 1999), e o quadro inferior mostra a antigenicidadeda proteína do isolado PRSV HA 5-1 (Acesso gi593497 no http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Avaliando a presença doepitopo EKQKEK na capa

protéica dos isoladosbrasileiros de PRSV, e nosmamoeiros transgênicosproduzidos pela Embrapa

Há pouco mais de dez anos, aEmbrapa, por intermédio de suas uni-dades de Cruz das Almas (EmbrapaMandioca e Fruticultura) e Brasília(Embrapa Recursos Genéticos e Bio-tecnologia), realiza um trabalho decooperação técnica com a New YorkState Agriculture Experiment Station,Cornell University, na cidade deGeneva, no estado de New York, nosEUA, com vistas a desenvolver mamo-eiros (C. papaya) transgênicos resis-tentes à Mancha Anelar, que é um dosprincipais fatores limitantes dessa cul-tura no Brasil.

Em abril de 2001, foram incorpora-das pela Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia, no programa de melho-ramento genético de mamoeiro, desen-volvido na Embrapa Mandioca e Fruti-cultura, treze populações de mamoei-ros transgênicos (Tabela 1). Os traba-lhos de pesquisa da última fase dedesenvolvimento de mamoeiro trans-gênico resistente à PRSV feitos pelaEmbrapa compõem um dos projetosque fazem parte [“Avaliação de segu-rança alimentar e ambiental de mamo-eiro geneticamente modificado para re-sistência ao vírus da mancha anelar(PRSV)”] da rede de Biossegurança deOrganismos Geneticamente Modifica-dos, aprovada em 2002, no Macropro-grama 1 da Embrapa.

O gene cp utilizado nas constru-ções gênicas aplicadas na transforma-ção genética de mamoeiros das varie-dades ‘Sunrise’ e ‘Sunset’ Solo, quevisam à resistência a isolados brasilei-ros de PRSV, foi obtido a partir de umisolado de PRSV coletado na região deNova Viçosa, no Estado da Bahia. Aspopulações transferidas para aEmbrapa Mandioca e Fruticultura fo-ram originadas de plantas que conti-nham uma das três versões do genecp, e são elas: UM (untranslatablemedium), TS (translatable short) e TL(translatable large) (Souza Jr., 1999).“Untranslatable” significa não-tradu-zido, isto é, o gene é transcrito, mas omRNA produzido a partir dele nãogera proteína devido à presença decódon terminador inserido a alguns

Figura 3. Hidrofobicidade das proteínas capsídicas codificadas pelos genes cp de Papayaringspot vírus presente nos mamoeiros transgênicos brasileiros e havaianos. O quadrosuperior mostra a hidrofobicidade da proteína do isolado PRSV BR (Souza Jr., 1999), e oquadro inferior mostra a hidrofobicidade da proteína do isolado PRSV HA 5-1 (Acessogi593497 no http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).


Anexo II

O que é alergia alimentar?

Nosso corpo se protege de infecções através do sistema imunológico. Nós produzimos moléculas, chamadasanticorpos, que reconhecem o agente causador da infecção. Existem diferentes tipos de anticorpos: aqueles queestão envolvidos em reações alérgicas chamam-se IgE. Nós sabemos que as moléculas de IgE são normalmenteproduzidas em resposta a infecções causadas por parasitas, como o agente causador da malária, por exemplo. Aindanão conhecemos a causa, mas algumas pessoas produzem IgE para outros agentes não parasitas, como o polén ealguns alimentos. Nessas reações de reconhecimento são deflagrados os sintomas de alergia, como febre, tontura,dores de cabeça e outros.

As moléculas de IgE agem como etiquetas que se aderem às moléculas advindas do alimento ou do pólen,chamadas alérgenos. Quando alguém tem uma alergia alimentar e ingere o alérgeno, as IgEs atacam as moléculas« invasoras » e disparam as reações em cascata as quais caracterizam o processo alérgico. Um dos efeitos comunsdas IgEs associadas às células basófilas é a liberação de grânulos de histamina, que, por sua vez, causam as reaçõesinflamatórias que são percebidas pelos sintomas alérgicos.

Alergia ou Intolerância?

A tolerância imunológica é definida como a incapa-cidade específica adquirida, total ou parcial, por umindivíduo que desenvolve uma resposta imune humoralnormal ou a mediação celular a um antígeno ou a diversosepitopos de um certo antígeno contra o qual ele normal-mente não desenvolveria. Um indivíduo dito tolerantepossui a capacidade de responder a outros antígenosadministrados ao mesmo tempo que o primeiro, quepode ou não bloquear seu potencial de resposta imune.Em outras palavras, a tolerância imunologica é tambémespecífica a um antígeno.

Uma outra coleção de sintomas são relatados empessoas que são sensibilizadas por alimentos, comodores de cabeça, dores musculares e nas juntas e fadiga.Esse conjunto é comumente conhecido como intolerân-cia alimentar. Ainda assim, conhece-se muito pouco dasreações que causam a intolerância e que podem seagravar para o diagnóstico de alergia.

Existem exceções : conhece-se bem a doençaCelíaca (http://www.concordia.psi.br/~celiaco/doenca.htm) e a intolerância à lactose. Na doençaCelíaca, as reações alérgicas são deflagradas pela ingestãode glúten (derivado de trigo, aveia e outros cereais). Aintolerância à lactose não se caracteriza como alergia,mas causa alguns sintomas como a alergia ao leite comdores abdominais e diarréia. (http://www.celiac.org).

códons após o códon iniciador.“Translatable” significa que há a tra-dução completa desse gene.

A versão do gene cp do isoladoPRSV HA 5-1 utilizado para a produ-ção do mamoeiro transgênico havaiano(Fitch et al., 1992) é uma versão curtado gene cp (Ling et al., 1991) e nãoapresenta a seqüência de nucleotíde-os necessária para traduzir a sua extre-midade N. Essa é a razão para a faltados dezenove primeiros aminoácidosque estão presentes na proteínacapsídica do isolado Brasil. Bahia - ouPRSV BR (Figura 1).

Sob a ótica do método de prediçãodescrito por Kleter et al. (2002), analisa-mos a presença do epitopo EKQKEK edo potencial alergênico deste na prote-ína expressa pelo gene da capa protéica(cp) encontrado nos mamoeiros trans-gênicos desenvolvidos por Souza Jr.(1999) e liberados para o programa demelhoramento genético de C. papayadesenvolvido na Embrapa Mandioca eFruticultura. Quanto à presença doepitopo, observamos que o alinhamen-to das seqüências de aminoácidos dasproteínas do capsídeo dos isolados BRe HA 5-1 mostra que o epitopo EKQKEK

não está presente no isolado brasileiro(Figura 1). No lugar dele, é encontradoo epitopo EKQKKK. O gráfico doalinhamento mostra que as regiões va-riáveis da proteína são pontuais e distri-buídas ao longo da seqüência. Algumasmutações observadas entre os residuos33, 38, 44 e 54 são mais significativaspara a estrutura da proteína.

A predição da estrutura secundáriadas proteínas do isolado do Havaí indi-ca que os resíduos do epitopo exibemuma tendência a construírem uma es-trutura em forma de alça (loop). En-quanto a análise da proteína do isolado


Figura 5. Alinhamento de seqüências de aminoácidos – 60 primeiros aminoácidos do terminal N - das proteínas capsídicas de 13 isoladosbrasileiros de Papaya ringspot vírus (PRSV). O isolado Brasil é o doador do gene cp utilizado para produzir os mamoeiros transgênicosbrasileiros. Denominação dos isolados: DF P (Brasília, biótipo P), DF W (Brasília, biótipo W), CE P (Guaiúba, Ceará, biótipo P), CE W(Aracoiaba, Ceará, biótipo W), BA-CA (Cruz das Almas, Bahia), BA-IT1 (Itabela, Bahia – isolado 1), BA-IT2 (Itabela, Bahia – isolado 2),ES (Linhares, Espírito Santo), PB (Alhandra, Paraíba), PE (Camaragibe, Pernambuco), SP (Piracicaba, São Paulo), PR (Paranavaí, Paraná).A tarja vermelha mostra a posição do primeiro epitopo, enquanto a tarja azul mostra a posição do segundo epitopo.

Figura 6. Estrutura tridimensional prevista pelo método de modelagem molecular porhomologia dos peptídeos das proteínas capsídicas codificadas pelos genes cp de Papayaringspot vírus presente nos mamoeiros transgênicos brasileiros e havaianos.

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do Brasil, doador do gene cp presentenas plantas transgênicas, mostra umatendência a formar uma estrutura emforma de hélice (Figura 2).

A predição de hidrofobicidade eantigenicidade para a proteína docapsídeo do isolado brasileiro e doisolado havaiano (gi 593497) de PRSVfoi realizada usando o algoritmo deHoop & Woods (1981) e o resultadodo cálculo é apresentado nas figurasde 3 a 5.

Uma análise da presença desseepitopo2 EKQKEK na proteína docapsídeo de 13 isolados brasileiros dePRSV, cuja seqüência é conhecida e seencontra disponível na literatura (SouzaJr., 1999; Lima et al., 2002) ou na internet(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), revelouque esses isolados podem ser agrupa-dos em três classes: os que não apresen-tam o epitopo (Brasil.Bahia, BA-CA ePR), os que apresentam uma cópia do

epitopo (PE, ES e CE-P), e os queapresentam duas cópias deste (DF-P,DF-W, CE-W, BA-IT1, BA-IT2, PB e SP)(Figura 5).

A predição da estrutura tridimen-sional do segmento em questão cor-roborou a predição da estrutura se-cundária, onde ocorre uma alça naseqüência EKQKEK e forma uma es-trutura secundária estável em formade alfa-hélice para a seqüência domamão brasileiro (Figura 6).

Referências Bibliográficas

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SOUZA JR., M. T. Analysis of the


Pesquisa

Resistência de InimigosNaturais a Pesticidas

Marcelo PolettiDoutorando em Entomologia, Departamento deEntomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola,Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”(ESALQ - USP)[email protected]

Celso OmotoProfessor Doutor, Departamento de Entomologia,Fitopatologia e Zoologia Agrícola, Escola Superiorde Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ - USP)[email protected]


Exploração de Inimigos Naturais Resistentes a Pesticidas em Programas de Manejo Integrado de Pragas

Introdução

A utilização de pesticidas comoestratégia de controle de pragas naagricultura moderna tem se contra-posto à teoria preconizada pelo Ma-nejo Integrado de Pragas (MIP) (Kogan,1998) devido à maneira e intensidadesob as quais tem sido empregada. Ofreqüente uso de produtos de largoespectro de ação, além de afetar odesenvolvimento da dinâmica popu-lacional de inimigos naturais em cam-po, interferindo sobre o equilíbrio dosmais variados organismos, noagroecossistema, também está associ-ado a outros problemas entre os quaisa evolução da resistência de insetos eácaros a pesticidas.

A resistência, por definição, é odesenvolvimento de uma habilidadeem uma determinada linhagem de umorganismo em tolerar doses de tóxicosque seriam letais para a maioria dapopulação suscetível da mesma espé-cie. Trata-se de uma característica he-reditária sendo um termo que se aplicaintraespecificamente. O processodeterminante no desenvolvimento daresistência é a pressão de seleção,dada pelo uso freqüente de um mesmopesticida ou de pesticidas pertencen-tes a um mesmo grupo químico. Deacordo com Roush & Mckenzie (1987),no início da evolução da resistência,estima-se que a freqüência dos alelosque conferem essa característica a umapopulação é bastante baixa (10-2 a 10-

13). No entanto, devido ao uso contínuode um mesmo pesticida, a freqüênciade resistência poderá aumentar emníveis em que a eficácia do produto éafetada devido a esse fato (freqüênciacrítica de resistência).

Até o final da década de 80, onúmero de casos de resistência docu-mentados era de 504 espécies de inse-tos e ácaros, sendo considerado muitobaixa a porcentagem de detecçõesassociadas aos inimigos naturais(Georghiou & Lagunes-Tejeda, 1991)(Figura 1). Dados mais recentes mos-traram que os casos de resistência têmaumentado para 540 (Whalon et al.,2003). As hipóteses da pré-adaptaçãodiferencial e da limitação do alimentotêm sido apresentadas com o intuito dejustificar essa baixa taxa de detecçãoda resistência para os agentes do con-trole biológico (Croft & Morse, 1979).

A hipótese da pré-adaptação dife-rencial baseia-se no fato de que aspragas estão melhor pré-adaptadas asobreviver à aplicação de produtosquímicos do que seus inimigos natu-rais, sendo que este fato está associadoà capacidade intrínseca das mesmasem lidar com estresses bioquímicosassociados a suas fontes de alimento.Uma possível explicação é que essahabilidade tenha sido desenvolvidadurante o processo de co-evoluçãoplanta-hospedeira inseto-praga, poden-do ocorrer diferenças nos processos dedestoxificações hidrolítica e oxidativaentre o grupo das pragas e dos inimi-gos naturais (Plapp & Bull, 1978).

Quanto à hipótese da limitação doalimento, sustenta-se no fato de que osinimigos naturais que sobreviveram àaplicação de um determinado produtopoderiam sofrer falta de alimento devi-do à baixa disponibilidade da presa.Dessa forma, os indivíduos sobrevi-ventes não se reproduziriam com efici-ência, ou, então, poderiam emigrarpara áreas não tratadas ocorrendo con-seqüentemente diluição da resistência


devido à introgressão com populaçõessuscetíveis. Nesse caso, o princípiodessa hipótese é que a evolução daresistência nas espécies fitófagas devepreceder a evolução nos inimigos na-turais (Baker & Arbogast, 1995).

A resistência entre os artrópodesfitófagos e seus inimigos naturais apre-senta efeitos contrastantes, sendo quepara os fitófagos a resistência intensifi-ca sua condição de praga reduzindo aspossibilidades de manejo. Por outrolado, a evolução da resistência empopulações de inimigos naturais podecontribuir de maneira significativa como MIP pela conservação desses orga-nismos mesmo após aplicações deprodutos considerados nocivos a eles(Croft, 1990). Sendo assim, o presentetrabalho tem como objetivo relacionaralguns casos de detecção da resistên-cia a pesticidas em artrópodes inimi-gos naturais, e sua utilização no MIP,bem como enfatizar a possibilidade doemprego da biotecnologia para a ob-tenção de linhagens resistentes.

Resistência de ÁcarosFitoseídeos a Pesticidas

Os ácaros fitoseídeos (Acari:Phytoseiidae) têm constituído o grupode inimigos naturais mais exploradoem estudos dirigidos à resistência. Es-ses predadores apresentam parâme-tros intrínsecos que favorecem a evo-lução dessa característica, destacando-se o alto potencial reprodutivo e orápido ciclo de vida, além do fato dealgumas espécies reproduzirem-se porparahaploidia ou pseudo-arrenotoquia.Neste tipo de reprodução, machos efêmeas são originados de ovos diplóides(2n) fecundados. No entanto, duranteo processo embrionário, ocorre a per-da de um conjunto de cromossomos deorigem paterna nos ovos que darãoorigem aos machos haplóides (n) (Hoy,

1985a). Análises genéticas realizadascom Galendromus (=Metaseiulus)occidentalis, espécie que se reproduzpor parahaploidia, demonstraram queos machos herdaram de suas mães aresistência a inseticidas carbamatos(Roush & Hoy, 1981a; Roush & Plapp,1982). Um outro fator que se relacionacom o aumento na freqüência de ácarosfitoseídeos resistentes a pesticidas é aocorrência de espécies generalistasquanto ao hábito alimentar. Neste caso,essas espécies são capazes de sobrevi-ver e reproduzir-se com eficiência,alimentando-se de pólen e exudatosde plantas, além de fungos e pequenosinsetos (McMurtry, 1997). Esse fatoneutraliza a possibilidade da limitaçãodo alimento após a aplicação de umpesticida, ocorrendo dessa forma apreservação da população resistenteem campo.

O primeiro relato de sobrevivênciaem populações de ácaros fitoseídeosapós pulverizações com inseticidas delargo espectro de ação em campo foiefetuado no início dos anos 50 para G.occidentalis (Huffaker & Kennett, 1953).No entanto, esse fato foi associado àresistência somente no final da décadade 60, quando trabalhos realizados emlaboratório confirmaram a ocorrênciada variabilidade intraespecífica na sus-cetibilidade de populações de G.occidentalis e Neoseiulus (=Amblyseius)fallacis a inseticidas organofosforados(Motoyama et al., 1970; Croft & Jeppson,1970). Posteriormente, resistência aparation foi detectada em populaçõesde Amblyseius hibisci coletadas empomares de citros na Califórnia/EUA(Kennett, 1970). A partir disso, inúme-ros trabalhos de detecção e seleçãopara a resistência a pesticidas em po-pulações de ácaros fitoseídeos foramefetuados em todo mundo (Quadro 1).Quanto aos pesticidas, ênfase tem sidodada aos inseticidas carbamatos, orga-

nofosforados e piretróides, pelo fatode apresentarem elevada toxicidadepara a maioria das espécies de ácarospredadores em campo.

Durante a década de 70 foramrealizadas várias detecções de resistên-cia aos inseticidas organofosforados:azinfosmetil, diazinon, fosmet, paration,TEPP e fosalone em diferentes popula-ções de G. occidentalis coletadas nasregiões produtoras de frutas nos Esta-dos Unidos (Croft, 1990). Em laborató-rio, após processo de pressão de sele-ção com carbaril (carbamato), Roush &Hoy (1980) obtiveram linhagens de G.occidentalis resistentes a esse produ-to. Posteriormente, realizando estudosem condições de laboratório, casa devegetação e campo esses autores veri-ficaram que essa linhagem apresentouum aumento na razão sexual (maiornúmero de fêmeas) quando compara-do com a linhagem suscetível de refe-rência No entanto, esse fato não afetouo desempenho da mesma no controlebiológico de ácaros fitófagos nas con-dições avaliadas (Roush & Hoy, 1981b).

O monitoramento da resistênciade G. occidentalis a metomil edimetoato também foi efetuado pelosmesmos autores (Roush & Hoy,1981b). Neste caso foram avaliadas asrespostas de várias populaçõescoletadas em pomares de maçã, pêra,amora e uva, sendo que todas apre-sentaram baixa razão de resistência aesses dois produtos. De acordo comRoush & Plapp (1982) a linhagem deG. occidentalis resistente a carbariltambém apresentou elevada resistên-cia a propoxur. Hoy & Knop (1981)também selecionaram para resistên-cia a permetrina populações de G.occidentalis coletadas em pomares demaçã situados em Washington/EUA.

Resistência múltipla a organofos-forados, cabamatos, piretróides, enxo-fre e ao acaricida abamectin foi detec-tada em diversas populações dessaespécie em campo. Esse fato tem sidointensivamente explorado dentro domanejo integrado em várias culturasnos Estados Unidos (Croft, 1990). Emoutros países, tal como a Rússia, linha-gens resistentes de G. occidentalis ainseticidas como os organofosforadose piretróides também têm sido explo-radas em estudos visando o manejo deácaros-praga (Petrushov, 1991).

Figura 1. Porcentagem relativa dos casos detectados de resistência de artrópodes apesticidas de acordo com a importância econômica (Georghiou & Lagunes-Tejeda, 1991).


Assim como G. occidentalis, oácaro N. fallacis é um dos fitoseídeosmais explorados em estudos de resis-tência a pesticidas, sendo uma espé-cie muito empregada para o controlebiológico de ácaros tetraniquídeos,especialmente T. urticae (Croft, 1990).Resistência múltipla ou cruzada a vá-rias classes de produtos como DDT ealguns de seus derivados, carbamatos,organofosforados e piretróides, tam-bém foi detectada em muitas popula-ções desse ácaro (Croft, 1983). Devi-do à ocorrência generalizada de po-pulações resistentes dessa espécie avários pesticidas em campo, algunspesquisadores têm encontrado algu-ma dificuldade no estabelecimento depopulações suscetíveis de referênciapara estudos de laboratório (Croft etal., 1976a).

Quanto à resistência aos insetici-das piretróides, Fitzgerald & Solomon(1992) realizando bioensaios para de-terminar a resposta de populações de N.fallacis a deltametrina, relataram a ocor-rência de uma linhagem, cuja razão deresistência obtida foi de aproximada-mente quatro vezes. De acordo comThistlewood et al. (1992), esse fatopode ser atribuído à intensa pressão de

seleção com inseticidas piretróides nasáreas onde foi realizada a coleta dessapopulação. Ainda, para essa mesmaespécie, Thistlewood et al. (1995) veri-ficaram que após 55 pressões de sele-ção com permetrina sobre uma deter-minada população, pôde-se evidenciarum aumento de 964 vezes na resistênciada mesma a esse produto em condiçõesde laboratório.

Uma outra espécie de ácarofitoseídeo que se destaca no númerode trabalhos relacionados à resistên-cia é Phytoseiulus persimilis, sendocomumente utilizado para o controlede T. urticae em cultivos protegidosde ornamentais em países da Europa.A resistência de P. persimilis a inseti-cidas organofosforados foi relatadapor Schulten et al. (1976). Esses auto-res observaram que populações libe-radas em cultivos protegidos naHolanda apresentaram elevada resis-tência a paration. Quanto à resistênciamúltipla, tem sido detectada com fre-qüência em populações coletadas emcampo em alguns países da Europa(Croft, 1990). A introdução de umalinhagem de P. persimilis resistente aorganofosforados foi realizada no Egi-to para o controle de T. urticae na

cultura do pepino, evidenciando-seuma elevada efetividade desse preda-dor quando foram realizadas libera-ções de dez indivíduos por planta(Rasmy & Ellaithy, 1988).

Casos de resistência a pesticidastambém têm sido relacionado comfreqüência à Typhlodromus pyri, sen-do essa espécie considerada de gran-de importância para o controle dePanonychus ulmi e T. urticae emmacieira na Europa (Vidal & Kreiter,1995). A primeira detecção de popu-lações resistentes a organofosforadosfoi realizada na Nova Zelândia, verifi-cando-se que inicialmente a intensi-dade de resistência detectada foi bai-xa (Hoyt, 1972). No entanto, obser-vou-se que após sucessivas pressõesde seleção com azinfosmetil, em ummesmo pomar, houve um incrementoprogressivo na freqüência de resistên-cia in loco. Desde então, essas popu-lações resistentes a pesticidas têmsido freqüentemente empregadas emprogramas de manejo de P. ulmi empomares de maçã na Nova Zelândia(Collyer, 1980). No Canadá, estudosdirigidos a linhagens de T. pyri, queapresentavam resistência múltipla aorganofosforados e piretróides, mos-

.odnumonsadicitsepasetnetsiser)eadiiesotyhP:iracA(soedíesotifsoracáedsosacedsolpmexesnuglA-1ordauQ

eicépsEadicitseP

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1 ,ovitaetneidergni=.A.I 2 ;adicitesni=I,adicignuf=F,adiciraca=A 3 =A;sodarsofsofonagro=O,,sediórterip=P,sotamabrac=C.)otamabracoitid(siboneliuqla


em populações de Amblyseiuswomersleyi (importante predador deTetranychus kanzawai na cultura dochá nesse país) coletadas em diferen-tes áreas, concluiu que a resistênciaobservada em uma dessas popula-ções relacionou-se diretamente como número de aplicações desses pro-dutos realizadas em campo. Sato etal. (2000) realizando quatro pressõesde seleção em laboratório commetidation obtiveram um aumentode aproximadamente 21 vezes narazão de resistência de uma popula-ção de A. womersleyi a esse produto.

No Brasil, Sato et al. (2002) reali-zaram coleta de uma população deNeoseiulus californicus (Figura 2) emcultivo de morango na região deAtibaia/SP e observaram que ela apre-sentou elevada tolerância a diversospesticidas como o acaricida propargitee o inseticida dimetoato. Neste caso, osautores sugerem que tal fato podeestar associado às pressões de seleçãoexercidas pelas aplicações desses pro-dutos em campo, o que pode ter con-tribuído para a evolução da resistênciana população avaliada. Poletti et al.(2003) avaliaram a suscetibilidade àdeltametrina nessa mesma populaçãode N. californicus, coletada em moran-go (Atibaia/SP) e mantida na EstaçãoExperimental do Instituto Biológico(Campinas/SP) desde 1999, e em umapopulação dessa mesma espécie, oriun-da de um pomar comercial de maçã emFraiburgo/SC. Evidenciou-se que apopulação proveniente de Atibaia/SP(morango) foi aproximadamente 24mais tolerante à deltametrina do que apopulação coletada em maçã. De acor-do com Monteiro (2001), o inseticidadeltametrina foi extremamente tóxicopara uma população de N. californicuscoletada em pomar de maçã situadoem Vacaria/RS. Dessa forma, pode-sesugerir que a exploração de linhagensresistentes de N. californicus a delta-metrina ou outros inseticidas nocivospode ser uma ferramenta importantedentro do manejo integrado em maçãna região sul do Brasil.

Em citros, Poletti (2002) detectouresistência a deltametrina em popula-ções de Euseius concordis (Figura 3) eIphiseioides zuluagai (Figura 4)coletadas em diferentes pomares situ-ados no Estado de São Paulo, fato que

também esteve associado ao históricode pulverizações com deltametrina emcada local onde foram efetuadas ascoletas. De acordo com Moraes & Sá(1995) os ácaros fitoseídeos são osprincipais inimigos naturais do ácaroda leprose dos citros, Brevipalpusphoenicis, praga-chave nesta cultura.Sendo assim a preservação desses pre-dadores por ocasião da realização depulverizações com produtos nocivos éextremamente conveniente. Tambémfoi possível detectar variabilidadeinterespecífica na suscetibilidade a del-tametrina entre essas duas espécies,verificando-se que E. concordis apre-sentou-se 50 vezes mais tolerante aesse produto do que I. zuluagai (Poletti,2002). Variabilidade interespecífica nasuscetibilidade de ácaros fitoseídeos ainseticidas piretróides também foi rela-tada por Marwick (1986), o qual verifi-cou que P. persimilis apresentou-semenos tolerante a cipermetrina, delta-metrina e fenvalerate do que T. pyri.Com relação à deltametrina, a razão detolerância observada para essas duasespécies atingiu valores de aproxima-damente 314 vezes.

Liberação eEstabelecimento de

Linhagens de FitoseídeosResistentes a Inseticidas

Em 1972, uma linhagem de G.occidentalis resistente a organofosfo-rados foi enviada da América do Nortepara a Austrália. Segundo Readshaw(1975) citado por Gerson et al. (2003)este foi o primeiro relato de transferên-cia intercontinental de inimigos natu-rais resistentes no mundo. Linhagemde G. occidentalis resistente a organo-fosforados, também foi introduzida naantiga União Soviética (URSS) no iníciodos anos 80 para o controle biológicode Tetranychus pruni obtendo-se umgrande sucesso no estabelecimento damesma (Petrushov, 1987). Hoy et al.(1983) também obtiveram sucesso naliberação e estabelecimento de linha-gens resistentes de G. occidentalis aorganofosforados e piretróides em po-mares de maçã e pêra nos EstadosUnidos, sugerindo uma relação entre adensidade populacional da praga emcampo e o estabelecimento das popu-lações de fitoseídeos liberadas.

traram uma possibilidade viável noemprego do manejo integrado de P.ulmi em maçã (Hardman et al., 2000).

Kostiainen & Hoy (1994a) detec-taram variabilidade intraespecífica ainseticidas organofosforados emAmblyseius finlandicus (Oudemans),importante predador de P. ulmi eácaros eriofídeos em maçã na Finlân-dia. Os autores evidenciaram que osvalores estimados para CL

50 (concen-

tração que mata 50% dos indivíduosem uma determinada população) namaioria das populações coletadas empomares comerciais apresentaram-secinco vezes superior ao valor obtidopara linhagem suscetível de referên-cia. Também verificaram que a resis-tência detectada em algumas popula-ções avaliadas permaneceu estávelmesmo na ausência de pressão deseleção (Konstiainen & Hoy, 1994b).

No Japão, Mochizuki (1994) ava-liando a ocorrência da variabilidadeintraespecífica a cipermetrina,permetrina, fenvalerate e fluvalinate

Figura 4 - Iphiseiodes zuluagaifoto: Heraldo Negri

Figura 3 - Euseius concordisfoto: Heraldo Negri

Figura 2 - Neoseiulus californicusfoto: Heraldo Negri


Strickler & Croft (1981, 1982) estu-dando a variabilidade intraespecíficade doze populações de N. fallacisobservaram que duas dessas apresen-taram resistência a elevadas concentra-ções de permetrina, e que após 12pressões de seleção com esse produtoem casa de vegetação, a razão deresistência atingiu valores de 64 vezes.Quando essas populações resistentesà permetrina foram liberadas em po-mares comerciais de maçã, pôde-seevidenciar o sucesso no estabeleci-mento delas. Whalon et al. (1982) apósselecionarem duas populações de N.fallacis para resistência a inseticidaspiretróides em condições de casa devegetação, verificaram que essas so-breviveram a aplicações de permetrinaquando liberadas em um pomar co-mercial de maçã, porém só uma delasresistiu à aplicação de fenvalerate.

Falhas no estabelecimento de umapopulação de N. fallacis resistente àpermetrina em campo foi relatado porCroft & Whalon (1983). Segundo essesautores, tal fato pode ter ocorrido de-vido a um grande fluxo de indivíduossuscetíveis para dentro das áreas ondeforam realizadas essas liberações. As-sim, devido a esse fato, poderia terocorrido hibridação, o que fatalmenteocasionou redução na freqüência deresistência. Por outro lado, esses auto-res observaram que em laboratório aresistência permaneceu estável até a25a geração nessa população, mesmona ausência de pressão de seleção.

Com relação a T. pyri linhagensresistentes a organofoforados foramintroduzidas com sucesso na Inglaterrano final da década de 70 (Kapetanakis& Cranhnam, 1983). Em experimentosrealizados em pomares comerciais demaçã com diferentes regimes de pul-verizações no Canadá, Hardman et al.(1997, 2000) também puderam eviden-ciar sucesso na liberação de uma linha-gem de T. pyri resistente a piretróidese organofosforados introduzida da NovaZelândia. Dessa forma, os autores con-cluíram que esses organismos apre-sentaram potencial para serem utiliza-dos em programas de manejo de ácarosnessa cultura. Em muitos países daEuropa, o manejo do ácaro vermelhoeuropeu, Panonychus ulmi, e doeriofiideo Aculus schelechtendali empomares de maçã e uva, têm-se base-

ado em liberações constantes de linha-gens resistentes a inseticidas organo-fosforados e carbamatos, sendo essauma condição primordial para o con-trole desses ácaros-praga (Blommers,1994). Na Holanda, por exemplo, bro-tos de plantas de maçã contendo T.pyri são transportados de um pomar aoutro por ocasião da poda realizada noverão (Blommers, 1994). De formasintética, a introdução de linhagens deácaros predadores fitoseídeos resisten-tes a pesticidas, têm sido muitas vezesefetiva, sendo essa tática uma formaanáloga ao controle biológico clássico,utilizando-se, porém, um biótipo dife-renciado de inimigo natural (Dunley elal., 1991).

Em termos práticos, Hoy (1985b)propôs um programa de manejo deácaros na cultura da amêndoa(Califórnia/EUA) baseando-se na libe-ração de linhagens de G. occidentalisresistentes a inseticidas, associados àutilização de acaricidas seletivos. Umaeconomia de aproximadamente 60-110dólares/ha/ano foi estimada para cadaprodutor de amêndoa, que aderiu aoprograma de liberações de linhagensresistentes, observando-se que a maioreconomia foi devido à redução nosgastos com acaricidas (Headley & Hoy,1987). A estimativa mais recente feitapor Hoy (2000) associou os resultadosdeste projeto a um benefício, desde oinício do programa, de aproximada-mente 20 milhões de dólares.

Avaliação doEstabelecimento de

Linhagens Resistentes deFitoseídeos Introduzidas

em Campo

O monitoramento da freqüênciade resistência é considerado uma im-portante ferramenta para avaliar oestabelecimento de linhagens defitoseídeos selecionadas em laborató-rio e introduzidas em condições emcampo. Para isso, a técnica mais em-pregada tem-se baseado na realizaçãode bioensaios toxicológicos para asestimativas da CL

50 e intensidade de

resistência (CL50

da população em es-tudo / CL

50 da linhagem suscetível de

referência). No entanto, para a reali-zação destes bioensaios algumas eta-pas como a coleta de um grande

número de indivíduos em campo,para preservar a variabilidade genéti-ca dentro da população em estudo, ea necessidade do estabelecimento damesma em laboratório (através decriações) pode afetar o dinamismodeste trabalho. Um fator que é impor-tante e deve estar associado ao moni-toramento após a liberação de inimi-gos naturais em campo é a possibili-dade de ocorrer diluição da resistên-cia na linhagem selecionada devidoao fluxo gênico com populações nati-vas, suscetíveis, presentes em campopor ocasião da liberação.

A utilização de análise deeletroforese de isoenzimas, apesar deser um método menos acurado do queoutros testes moleculares, em algunsestudos têm mostrado certa viabilida-de para avaliação da liberação de li-nhagens resistentes de fitoseídeos emcampo. Whalon et al. (1982) foram osprimeiros pesquisadores a testaremessa ferramenta como método de mo-nitoramento de liberações de linha-gens de N. fallacis resistentes apesticidas em campo. A utilização des-sa técnica permite que sejam examina-das amostras coletadas diretamenteem campo, eliminando os problemasrelacionados à manutenção de cria-ções em laboratório. Outra vantagemrelacionada à eletroforese de isoenzi-mas tem sido a possibilidade de explo-rar a análise da estrutura genética daspopulações presentes em campo antesda liberação da linhagem resistente e,após esse processo, podendo-se inferira respeito de parâmetros importantescom relação à estabilidade da resistên-cia em campo.

Recentemente, Navajas et al.(2001) realizaram trabalho de monito-ramento do estabelecimento de linha-gens de N. fallacis resistentes apiretróides em pomares de maçã noCanadá, empregando bioensaiostoxicológicos e eletroforese de isoen-zimas. Através dos resultados obtidosnesse estudo foi comprovado que estatécnica molecular é bastante adequa-da. Ressalta-se que tentativas da utili-zação de outras técnicas molecularespara o monitoramento em fitoseídeos,tal como marcadores de RAPD e análi-se de seqüências de microssatélites,não têm alcançado êxito (Perrot-Minnot& Navajas, 1995; Navajas et al., 1998).


Resistência de InsetosParasitóides e Predadores a

Pesticidas

Apesar do número de casos deresistência a pesticidas em insetosparasitóides e predadores não ser tãoexpressivo quanto para os ácarosfitoseídeos, alguns trabalhos têm mos-trado que há possibilidade de popu-lações desses organismos responde-rem à pressão de seleção com algunsprodutos tanto em laboratório comoem campo (Quadros 2 e 3).

Strawn (1978) citado por Hoy(1990) realizou estudos com intuitode avaliar a variabilidade na suscetibi-lidade a inseticidas organofosforados

em diferentes populações do parasi-tóide Aphytis melinus, inimigo naturalda cochonilha vermelha, Aonidiellaaurantii, importante praga em poma-res de citros nos Estados Unidos. Ape-sar das populações avaliadas terem seapresentado distintas com relação àsrespostas aos inseticidas testados, ne-nhuma delas mostrou-se resistente àsconcentrações utilizadas em campo.Rosenhein & Hoy (1986) realizarammonitoramento da resistência acarbaril, clorpirifós, dimetoato,malation e metidation, em 13 popula-ções de A. melinus coletadas em po-mares de citros na Califórnia. Os re-sultados obtidos indicaram a ocorrên-cia de diferentes níveis de resistência

entre as populações avaliadas, sendoque os dados corroboraram com oregime de pulverizações (pressão deseleção) adotado em cada proprieda-de onde efetuaram as coletas. Posteri-ormente foi realizada a seleção deuma linhagem de A. melinus resisten-te a carbaril (Rosenheinberg & Hoy,1988). Neste caso foi proposta a libe-ração desta linhagem inserindo essatática dentro de um programa integra-do, o qual foi amplamente adotadopor vários citricultores na Califórnia(Hoy, 1990).

No início da década de 80, Grafton-Cardwell & Hoy (1985) realizarammonitoramento da suscetibilidade dediferentes populações de Chrysoperla

.odnumonsadicitsepasetnetsiser)sediótisarap(siarutansogiminisotesniedsosacedsolpmexesnuglA-2ordauQ

eicépsEadicitseP


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eicépsEadicitseP


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1 ,ovitaetneidergni=.A.I 2 ;adicitesni=I 3 odarolconagro=CO;sodarsofsofonagro=O


carnea, crisopídeo, coletadas em dife-rentes áreas produtoras de alfafa situ-adas na Califórnia, a seis inseticidascomumente utilizados nesta cultura(carbaril, metomil, permetrina,fenvalerate, diazinon e fosmet). Aspopulações avaliadas responderam demodo distinto a todos produtos testa-dos, sendo que esta variabilidade foiconsiderada suficientemente promis-sora para seleção artificial de popula-ções de C. carnea para resistência aalguns produtos, fato que incentivou acontinuidade deste projeto. No entan-to, liberações efetivas de linhagensresistentes de C. carnea em campo nãotêm sido relatadas, apesar da realiza-ção de seleção de linhagens resistentesa alguns produtos como carbaril(Grafton-Cardwell & Hoy, 1986).

Desvantagem AdaptativaAssociada à Resistência

A desvantagem ou custo adaptati-vo é uma característica que pode estarassociada à resistência em populaçõesde artrópodes pragas ou inimigos natu-rais (ácaros ou insetos). Devido à pos-sibilidade do menor valor adaptativodos indivíduos resistentes estar associ-ado a uma menor viabilidade total,menor fecundidade, menor tempo paradesenvolvimento, menor competitivi-dade para o acasalamento, entre ou-tros parâmetros biológicos importan-tes, no caso das pragas essa é umacondição favorável à adoção de estra-tégias de manejo.

No entanto, com relação aosinimigos naturais, o fato da linhagemselecionada apresentar alterações emalguns de seus parâmetros biológi-cos pode afetar diretamente o de-sempenho dela como agente de con-trole biológico. Duso et al. (1992)observaram uma redução na fecundi-dade em linhagens dos fitoseídeos T.pyri e Amblyseius andersoni resis-tentes a inseticidas organofosfora-dos. No entanto, Fitzgerald & Solomon(2000) evidenciaram que uma popu-lação de T. pyri resistente a organofos-forados, coletada em um pomar naInglaterra, apresentou uma maior fe-cundidade do que a população toma-da como suscetível de referência.Fournier et al. (1988) comparandoparâmetros relacionados à tabela de

vida e a capacidade de predação,dentre outros, entre linhagens do ácaropredador P. persimilis resistente e sus-cetível ao inseticida metidation, nãoobservaram custo adaptativo associa-do à linhagem selecionada. Grafton-Cardwell & Hoy (1986) também nãoobservaram ocorrência de custo adap-tativo associado a linhagens de C.carnea resistentes a carbaril. Apesarde vários relatos estarem associados àausência de custo adaptativo em ini-migos naturais resistentes a pesticidas,a realização de estudos prévios relaci-onados aos parâmetros biológicos,bem como a capacidade de predaçãoou de parasitismo na linhagem seleci-onada é de primordial importância,pois este fato pode comprometer di-retamente a implementação de pro-gramas baseados na introdução des-ses organismos (Hoy, 1990).

Mecanismos de Resistênciaem Inimigos Naturais

Os principais mecanismos pelosquais os artrópodes podem expressarresistência são a redução na penetra-ção cuticular do produto, aumento nadestoxificação metabólica e reduçãona sensibilidade do sítio de ação.

Os indivíduos resistentes devidoà redução na penetração cuticularrecebem uma menor quantidade detóxico no sítio de ação do produto. Jáa resistência conferida devido ao au-mento na destoxificação metabólicaocorre quando os indivíduos são ca-pazes de degradar a molécula químicaem compostos inertes com maior efi-cácia do que os indivíduos suscetí-veis. Vários grupos enzimáticos(monooxigenases dependentes docitocromo P-450, esterases, GSH-trnasferase, etc.) estão envolvidos nometabolimos de pesticidas e têm sidoidentificados como mecanismo de re-sistência em várias espécies deartrópodes. Com relação aos indiví-duos resistentes devido à redução nasensibilidade do sítio de ação, elesapresentam uma alteração deste, mos-trando uma menor sensibilidade aoproduto químico.

De acordo com Motoyama et al.(1971) o mecanismo de resistência deN. fallacis a azinfosmetil foi relacionadoà enzima glutation S-transferase. No

caso de A.womersleyi a degradaçãooxidativa foi o mecanismo primário daresistência a metidation, detectadas empopulações desse ácaro (Sato et al.,2001). Uma ampla discussão dos meca-nismos de resistência associados aosácaros fitoseídeos pode ser evidenciadaem Croft (1990). De um modo geral,deve-se enfatizar que os mecanismosrelacionados à resistência de inimigosnaturais a pesticidas são os mesmos quetêm sido estudados para os artrópodes-praga, destacando-se o aumento nadestoxificação metabólica.

Biotecnologia na Obtençãode Linhagens de Inimigos

Naturais Resistentes aPesticidas

A seleção artificial de linhagensde inimigos naturais resistentes apesticidas nem sempre tem sido efe-tivada com sucesso. De acordo comHoy (1990) algumas técnicas como aindução artificial de mutagênese ou atécnica do DNA recombinante pode-riam ser ferramentas exploradas nomelhoramento de inimigos naturaisresistentes a pesticidas.

Com relação à indução demutagênese visando à resistência, podeser realizada utilizando-se substânciasquímicas ou irradiação-X (Hoy, 1990).Sabendo-se que as mutações ocorremao acaso, e podem resultar na produ-ção de linhagens com genes deletéri-os, com relação à indução de inimigosnaturais mutantes, esse fato pode serindesejável, principalmente quando ointuito da seleção dessa linhagem é aprodução massal desses organismospara a introdução em campo.

A utilização da técnica do DNArecombinante tem sido considerada amais viável para a implementação daresistência em inimigos naturais. Vári-as etapas envolvem esse processo,sendo necessário inicialmente reali-zar a identificação dos genes quegovernam a resistência, posteriormen-te devem ser clonados e inseridos noorganismo (inimigo natural) geralmen-te através de microinjeção. Após aincorporação no genoma esse genedeve estabilizar, se expressar apropri-adamente e ser transmitido às progê-nies. G. occidentalis foi o primeiroinimigo natural melhorado através


desta técnica (Presnail & Hoy, 1994).Uma série de critérios foram listadospor Hoy (1992) visando minimizar osriscos de introdução de inimigos natu-rais geneticamente modificados emcampo. Um dos fatores que visou àsegurança da introdução desse orga-nismo transgênico em campo foi arealização de estudo em áreas úmidasda Flórida/EUA, local onde essa espé-cie não sobrevive devido à sua espe-cialização a climas secos. Hoy (2000)enfatiza que os riscos devido à libera-ção da linhagem transgênica de G.occidentalis em campo, para fins ex-perimentais, foram ínfimos. Todo oprocesso para a liberação deste estu-do foi monitorado pelo Departamen-to de Agricultura dos Estados Unidos(USDA). Rigorosas precauções devemser tomadas com relação à criação demanutenção de inimigos naturais trans-gênicos, incluindo a utilização de ins-talações adequadas e pessoal treina-do (Hoy, 2000).

Perspectivas paraExploração de InimigosNaturais Resistentes em

MIP no Brasil

Apesar do elevado número decasos de implementação de progra-mas de manejo de pragas baseados naliberação de linhagens resistentes deinimigos naturais (destacando-se osácaros fitoseídeos) em vários países,no Brasil esse assunto ainda éincipiente. No entanto, as possibilida-des de exploração desta ferramenta,que agrega harmoniosamente o con-trole químico ao biológico, parecempromissoras. No caso do emprego deN. californicus para o controle de P.ulmi em pomares de maçã no RioGrande do Sul (Monteiro, 2002), autilização de linhagens resistentesdesse predador poderia contribuir paraa preservação contínua dessa espécienos pomares, inclusive durante aspulverizações para o controle de inse-tos comumente associados a essa cul-tura como Grapholita molesta.

A implementação de programasde manejo de ácaros-praga em cultivoprotegido também emerge como umapossibilidade para a exploração delinhagens resistentes de inimigos natu-rais no Brasil, podendo reduzir o nú-

mero de pulverização com acaricidas,e conseqüentemente os custos de pro-dução e quantidade de resíduos noproduto final, acompanhando dessemodo as exigências de um mercadoque vem se tornando a cada dia maisexigente. Em citros, estudos revelaramque a evolução para a resistência aoinseticida deltametrina em algumas po-pulações de ácaros fitoseídeos podeestar sendo responsável pela perma-nência deles em algumas áreas, contri-buindo dessa forma para o controlebiológico efetivo de ácaros-praga comoB. phoenicis (Poletti, 2002).


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Pesquisa

O Mapeamento Genético noMelhoramento de Plantas

Teoria e aplicações inseridas em um programa de melhoramento de plantas

Rodrigo Barros RochaBiólogo, Mestrando em Genética e Melhoramento, [email protected]

Jorge Fernando PereiraBiólogo, MS em Microbiologia Agrícola;Doutorando em Microbiologia Agrícola; [email protected]

Cosme Damião CruzEngenheiro Agrônomo, DS em Genética eMelhoramento na ESALQ - USP; Professor Titular doDepartamento de Biologia Geral da [email protected]

Marisa Vieira de QueirozBióloga, DS em Genética e Melhoramento ESALQ -USP; Professora Adjunta do Departamento deMicrobiologia da [email protected]

Elza Fernandes de AraújoBióloga, DS em Genética, UFRGS; Professora Titulardo Departamento de Microbiologia da [email protected]


Resumo

Os mapas genéticos idealizadoshá quase um século, tiveram suaimportância aumentada para progra-mas de melhoramento de plantascom a utilização dos marcadoresmoleculares, que, entre outras inova-ções, podem ser obtidos em númeropraticamente ilimitado. Inúmerosmapas de ligação que foram constru-ídos com a utilização de diferentespopulações e estratégias estão dis-poníveis na literatura para todas asgrandes culturas vegetais. Detectarloci que afetem a expressão de carac-terísticas quantitativas tem sido con-siderado por vários autores comouma das aplicações de maior retornoda utilização de mapas genéticos nomelhoramento de plantas.

1 - Histórico

Práticas que visam o melhora-mento de plantas não são recentes etêm sido realizadas desde osprimórdios da civilização (BORÉM,1999). O avanço genético resultadodessas práticas depende de duas ca-racterísticas populacionais principais;primeiro: da existência de variabili-dade genética na população; e se-gunda: da herdabilidade das caracte-rísticas desejadas (CRUZ & CARNEI-RO, 2003).

Historicamente, foram pouco uti-lizados os mapas de ligação no auxílioà seleção em programas de melhora-mento, até mesmo em espécies bemestudadas como milho, Zea Mays, e

tomate, Lycopersicum spp. (ROCHA etal., 2003a, LEE, 1995). O tipo demarcador utilizado para o mapeamen-to (alterações citológicas estruturais) ea falta de mapas integrados que relaci-onem vários tipos de marcas são, se-gundo MOREAU et al. (2000), LANDER& BOTSTEIN, (1989), as principaisdificuldades para a utilização de mapasgenéticos no auxílio à seleção.

O desenvolvimento da metodo-logia de construção de mapas genéti-cos remonta do início do século pas-sado. Após a redescoberta do trabalhode Mendel (MENDEL, 1866) em 1900,trinta e quatro anos depois de suapublicação, várias pesquisas foramrealizadas com vistas a ampliar e vali-dar suas conclusões a respeito domecanismo de herança de caracterís-ticas qualitativas. BATESON e PUNNET(1905), citados por STUTERVANT(1965), trabalhando com as caracterís-ticas cor da flor e formato do grão depólen, em ervilha, publicaram um dosprimeiros relatos de ligação gênica(“linkage”). No entanto, o primeirotrabalho a sugerir que a distribuiçãogênica não independente é devida àlocalização dos genes nos cromosso-mos e a eventos de trocas de segmen-tos entre essas moléculas foi publica-do por MORGAN (1910). Ao analisaro padrão de herança de um genemutante ligado ao sexo, para a cor dosolhos em Drosophila melanogaster,MORGAN fornece a primeira evidên-cia de que os genes estão localizadosem posições definidas nos cromosso-mos e que podem ser manipulados eavaliados experimentalmente.


O mapeamento genético basea-do na análise da freqüência dosfenótipos recombinantes foi idealiza-do e desenvolvido por STUTERVANT(1913), que publicou o primeiro mapagenético. Alfred H. Stutervant traba-lhou com seis genes ligados ao sexoem Drosophila melanogaster e elenão apenas produziu o primeiro mapagenético com todos os genes na suaposição correta, como também pro-pôs o princípio básico do mapeamen-to genético, da utilização da freqüên-cia de recombinantes para estimar adistância entre dois genes e, em ho-menagem a seu orientador THOMASH. MORGAN, denominou a unidadede mapa de CENTI-MORGAN. Embo-ra a teoria cromossômica da herançatenha sido confirmada por BRIDGES(1914), somente no ano seguinte,STUTERVANT observou que deveri-am ocorrer eventos de permutas du-plas entre dois genes e que a ocor-rência de permuta em uma região docromossomo deve afetar a ocorrên-cia de permuta em uma região adja-cente, fenômeno este chamado deinterferência.

O mapa de ligação de uma espé-cie pode ser definido com um arranjolinear de um grupo de genes ou mar-cadores adjacentes. Dois genes marca-dores são ditos “ligados” sempre quemenos de 50% dos gametas produzi-dos apresentarem genótipos recombi-nantes para esses dois genes(STUTERVANT, 1913). O uso de mar-cadores na genética e no melhoramen-to de plantas remonta ao início doséculo, quando BATESON e PUNNET(1905), citados por STUTERVANT(1965), perceberam que a herança dacor da flor e do formato do grão depólen em ervilha não são independen-tes. Até a década de 80, a seleção emprogramas de melhoramento genéticodependeu unicamente da avaliação decaracterísticas fenotípicas para identifi-cação dos indivíduos superiores(GRATAPAGLIA & SEDEROFF, 1994).

2 - Etapas da construção deum mapa genético.

Em geral, o primeiro passo naconstrução de um mapa de ligação

está relacionado com a escolha dosgenitores a serem cruzados, de formaque maximize o polimorfismo gené-tico (GRATAPAGLIA & SEDEROFF,1994, VERHAEGEN et al., 1997). Umavez selecionados os genitores, é ne-cessário o desenvolvimento de umaprogênie segregante, composta depouco mais do que uma centena deindivíduos.

A escolha dos genitores e dapopulação de mapeamento é umadas etapas mais importantes do pro-cesso. O número de marcadores po-limórficos depende do polimorfismogenético entre os genitores e a preci-são das estimativas de recombinaçãoe aspectos práticos do processo, comonúmero de indivíduos a serem anali-sados, estratégias de recombinação ecuidados em campo, entre outras,dependem da escolha da população.

Nesse contexto, a diversidadedos sistemas reprodutivos das es-pécies vegetais permite o desen-volvimento de vários tipos de po-pulações de mapeamento (BOREM,1999). Cada progênie apresenta ca-racterísticas próprias, que devemser consideradas pelo pesquisadorno momento da escolha de suapopulação. Geralmente, as popula-ções segregantes analisadas na cons-trução de mapas de ligação são aspopulações F2 derivadas de F1 porautofecundação; as populações deR.I.L. (“Recombinant InbreedLines”); as obtidas por retrocruza-mento; e as populações duploshaplóides, resultado da duplicaçãoartificial do genoma haplóide (RO-CHA et al., 2003b). Estratégias queenvolvam a necessidade de poucasgerações resultam em significati-vos ganhos de tempo para espéciesde ciclo de vida longo, como, porexemplo, as espécies florestais.GRATAPAGLIA & SEDEROFF(1994) sugerem a utilização de po-pulações F1 derivadas do cruza-mento entre genitores geneticamen-te contrastantes.

Após a escolha dos genitorese o desenvolvimento da populaçãosegregante, a etapa seguinte envol-ve a obtenção de marcas contras-tantes entre os genitores que apre-

sentem segregação mendeliana napopulação de mapeamento. A es-tratégia de busca pelas marcaspolimórficas depende, principal-mente, do tipo de marcadores utili-zados e da diversidade genética daespécie estudada.

Dentre os tipos de marcadoresdisponíveis se destacam aquelesbaseadas na reação de PCR(“Polymerase Chain Reaction”). Areação de PCR permite a replicação“in vitro” de fragmentos de DNA, oque resulta em grandes quantida-des desses fragmentos a partir depoucas moléculas iniciais de DNA.A técnica de PCR, conforme ideali-zada e desenvolvida por KaryMullis, envolve a amplificação deuma região específica do DNA, deseqüência conhecida, que utilizaoligonucleotídeos complementaresque flanqueiam a região alvo(MULLIS & FALOONA, 1987). OPCR ocorre em três ciclos de tem-peratura, onde oligonucleotídeosde seqüência específica são utili-zados como iniciadores para a sín-tese de uma fita de DNA comple-mentar da região alvo. O conheci-mento prévio da região a seramplificada é uma das principaislimitações da técnica, pois impos-sibilita o estudo simultâneo de mui-tos loci.

Por sua praticidade e capacida-de de discriminação simultânea devários loci, os marcadores RAPD(Random Amplified PolimorphicDNA), baseados na reação de PCR(WILLIAMS et al., 1990), estão entreos mais utilizados para o mapeamentogenético vegetal. Esses são marcado-res dominantes (não permitem a dis-criminação do genótipo heterozigo-to), de seqüência desconhecida, am-plificados aleatoriamente no genoma.A Figura 1 mostra o padrão de ampli-ficação de genitores Eucalyptusgrandis e Eucalyptus urophylla e seisindivíduos de uma progênie de 110indivíduos. A amplificação conjuntado DNA total dos dois genitores e deseis indivíduos da população F1 fazcom que a probabilidade de detecçãoda segregação de um marcador po-limórfico seja superior a 98%.


Após a escolha dos marcadorespolimórficos é necessária à análisedo padrão de amplificação dos indi-víduos do restante da população demapeamento e a obtenção das esti-mativas de recombinação. Para cons-truir um mapa genético, todos osmarcadores devem ser analisados doisa dois, verificando a independênciaou a existência de ligação entre eles(LIU, 1998). Com base no princípiode que os genótipos recombinantesalterados por permuta simples oupor permuta dupla são gerados emfreqüências diferentes, utiliza-se oteste de aderência χ2 (qui-quadrado)para confirmar a ligação entre osmarcadores. O teste de χ2 é qualitati-vo, pois apenas comprova a existên-cia ou não de ligação gênica. Esseteste permite calcular o desvio entreos resultados esperados, sem a ocor-rência de permutas, com os resultadoobservados, sendo sensível à magni-tude do desvio e ao número degenótipos amostrados (FALCONER,1987). A Figura 2 mostra o padrão desegregação de alguns marcadoresúteis para o mapeamento em 28 indi-víduos da progênie F1.

Uma vez confirmada a existên-cia da ligação entre duas marcas, éindispensável adotar métodos quan-titativos para estudar o grau deassociação entre essas marcas. Ametodologia de Máxima Verossimi-lhança é utilizada no mapeamentogenético para a obtenção de váriasestimativas, inclusive as da freqüên-cia de recombinação (LIU, 1998). Ométodo da Máxima Verossimilhan-ça permite a obtenção de estimado-res consistentes, de distribuiçãonormal, eficiência assintótica evariância mínima. A confiabilidadedo posicionamento das marcas aolongo do grupo de ligação pode seravaliada considerando as variânciasassociadas às estimativas de recom-binação (LIU, 1998).

Como proposto por STUTERVANT,a freqüência de recombinação (r) podeser utilizada para estimar a distânciaentre pontos do cromossomo; no en-tanto, a ocorrência de permutas du-plas faz com que essa unidade nãoseja aditiva. As permutas duplas ten-

dem a recompor a fase de ligaçãopresente no genótipo parental; nessecontexto, somente alguns tipos depermutas geram gametas recombi-nantes, resultando em uma tendênciade subestimar a freqüência de recom-binação quando são considerados mai-ores valores de distância (GARDNER& SNUSTAD, 1996). O problema danão aditividade da unidade “r” é con-tornado com a utilização de funçõesde mapeamento, que, semelhante auma transformação de dados, resultaem uma alteração de escala. Existemdiferentes funções de mapeamento,sendo que as mais utilizadas são aque-

las propostas por Haldane e porKosambi. A função de Kosambi éconsiderada mais completa porqueleva em consideração o fenômeno dainterferência entre os eventos de per-muta adjacentes (LIU, 1998).

Finalmente, para compor umgrupo de ligação, conhecendo-seas freqüências de recombinaçãoentre diversos loci, é possível esti-mar, com um certo grau de preci-são, a ordem desses loci no grupode ligação. Por exemplo, em seutrabalho, STUTERVANT (1913) esti-mou a freqüência de recombinaçãoentre seis genes determinantes de

Figura 1 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% da reação de amplificação utilizandoos oligonucleotídeos OPB01, OPB02, OPB03. P1 e P2 indicam os genitores E. grandise E. urophylla e os números de 1 a 6, indivíduos da F1 escolhidos aleatoriamente. Omarcador utilizado é o DNA do fago λ clivado com as enzimas EcoRI, BamHI, HindIII.As setas em vermelho indicam alguns marcadores polimórficos entre os genitores eem segregação 1:1 na progênie.

Figura 2 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% da reação de amplificação utilizando ooligonucleotídeo OPAB-05. P1 e P2 indicam os genitores E. grandis e E. urophylla,respectivamente, e os números de 1 a 28, indivíduos da progênie F1. As setas vermelhasindicam marcas polimórficas entre os genitores de segregação 1:1, e a seta amarela indicamarcas não polimórficas entre os genitores de segregação 3:1. O teste de aderência doχ2 deve ser utilizado para confirmar a segregação mendeliana das marcas.


características qualitativas ligadasao sexo. A freqüência de recombi-nação (r) entre os loci B (“Blackfactor”, gene que define a cor docorpo), C (gene que define a pig-mentação dos olhos) e P (olhosvermilion) foram respectivamente(r

BC = 1 u.m; r

CP = 30.7 u.m.; r

BP =

31.7 u.m.). Tais índices permitemdeterminar um único ordenamentopara os três loci: B-C-P. A estima-ção de três pontos, como é conhe-cida, é de fácil aplicação, porém élimitada quando muitos loci sãoconsiderados simultaneamente.Normalmente, o ordenamento dosloci é feito determinando-se a or-dem de maior verossimilhança ouutilizando-se a metodologia dedelineação rápida de cadeia. A or-dem de máxima verossimilhança éo critério preferido, pois é o quegera a ordem de máxima probabili-dade de ocorrência para o conjuntode dados analisados, porém é umametodologia computacional demo-rada, uma vez que o crescimento nonúmero de ordens possíveis éexponencial em função do aumen-to no número de loci (BEARZOTI,2000).

Uma alternativa para esses doismétodos é a metodologia dedelineação rápida em cadeia. Esseprocedimento é bastante simples econsiste na obtenção de uma ordempreliminar a partir de uma matrizque contenha os valores de recom-binação entre os pares de marcas,seguido de tentativas de inversõesmúltiplas entre conjuntos de trêsmarcas. Para ilustrar o que foi dito,vamos considerar a matriz que con-tém valores de r entre os marcadoresA, B, C, D (TABELA 01). A primeiraetapa consiste em identificar o me-nor valor de r.

A seguir, toma-se um locos àesquerda de B ou à direita de D,escolhendo aquele com o menor va-lor de freqüência de recombinação“r”. Nesse caso, o menor valor de rentre as marcas está entre B e C.

Posicionando a única marca quefalta:

O próximo passo consiste emfazer permutações de marcas adja-centes. Se o somatório dos valores de“r” diminuir, deverá ser feita umatroca entre as ordens.

Para ilustrar a precisão associadaàs metodologias de construção demapas genéticos, foi simulado umpequeno genoma, utilizando-se o pro-grama GQMOL, em desenvolvimentona Universidade Federal de Viçosa(disponível em http://www.ufv.br/dbg/gqmol/gqmol.htm). Genoma esseconstituído por apenas dois grupos deligação, cada um com 200 unidadesde mapa de tamanho; e 27 e 20 marcasdominantes, respectivamente, em cadagrupo de ligação. A partir dessegenoma artificial, foram gerados doisgenitores contrastantes e uma progê-nie F2, constituída de 100 indivíduos.A Figura 3 mostra o genoma simuladoao lado das estimativas de recombina-ção e das ordens dos marcadoresestimadas; utilizando a metodologiade Máxima Verossimilhança para aobtenção das estimativas de recombi-nação e a metodologia da delineaçãorápida em cadeia para obter a ordemdas marcas. Boas aproximações emrelação aos valores paramétricos fo-ram obtidas para esse tipo de popula-ção, considerando as metodologiasutilizadas e o número de indivíduosanalisados, com destaque para a or-dem estimada dos marcadores ao lon-go do grupo de ligação idêntica àordem simulada.

3 - Aplicações dos mapasgenéticos inseridos em

programas demelhoramento vegetal.

Mapas de ligação integrados,construídos com marcas morfológi-cas, bioquímicas e moleculares jáestão disponíveis na literatura paravárias espécies vegetais, com desta-que para as espécies tipicamenteagronômicas. Embora de fácil iden-tificação, o número reduzido dosmarcadores morfológicos faz comque a probabilidade de evidenciarcorrelações entre esses marcadorese características de importância eco-nômica seja reduzida (FERREIRA &GRATAPAGLIA, 1998). O adventodas técnicas de marcadores molecu-lares, em meados da década de 80,resultou em aumento significativoda importância dos mapas genéti-cos no auxílio à seleção em progra-mas de melhoramento (LEE, 1995).Atualmente, diversas técnicas per-mitem a obtenção de um númeropraticamente ilimitado de marcado-res genéticos neutros, cuja herançapode ser acompanhada sem influên-cia do ambiente e avaliados emqualquer fase do desenvolvimento.

O desenvolvimento de mapasgenéticos permite a predição de des-cendências de cruzamentos controla-dos, localização das regiões dogenoma responsáveis pela expres-são das características e quantificaçãoda sua importância para a expressãodo fenótipo. Tais informações po-dem ser utilizadas na decomposiçãoda herança complexa das caracterís-ticas quantitativas. A identificação demarcas relacionadas com regiões-cha-ve do genoma para a expressão decaracterísticas quantitativas (QTL´sQuantitative Traits Loci) é um dosprincipais objetivos da utilização demapas genéticos inseridos em pro-

saertneoãçanibmoceredserolavodnetnocalebaT-10ALEBAT

.DeC,B,Asacram

A B C D

A 0 43,0 94,0 52,0

B 0 51,0 90,0

C 0 42,0

D 0


gramas de melhoramento. De acordocom DUDLEY (1993), a seleção assis-tida para características quantitativaspor marcadores consiste de dois pas-sos: identificação de associações en-tre marcadores e QTLs e o uso dessasassociações para desenvolvimento depopulações melhoradas.

A utilização de marcadores mo-leculares para auxiliar procedimen-tos de seleção baseia-se na premis-sa de ligação gênica entre o locosmarcador e as regiões do genomarelacionadas com a expressão decaracterísticas de interesse econô-mico (LANDE & THOMPSON, 1990).A identificação e a caracterização demarcas moleculares próximas às re-giões do genoma determinantes da

expressão de características de inte-resse estão diretamente relaciona-das com a eficiência da seleção as-sistida por marcadores moleculares.Nesse contexto, a condução de ex-perimentos que possibilitem o isola-mento do efeito ambiental, junta-mente com a análise exaustiva dealgumas centenas de genótipos, per-mite o desenvolvimento de marca-dores com alta eficiência de seleção.

A possibilidade de monitora-mento da incorporação de genes deinteresse por retrocruzamento, a se-leção precoce baseada no índice deheterose entre os indivíduos e apresença das marcas molecularespara as características desejadas sãoutilizações que, potencialmente, po-

dem acelerar e aumentar a eficiênciada seleção em programas de melho-ramento. (MURO_ABAD, 2000 ,LANDE & THOMPSON, 1990). Aconstrução de mapas de ligação vi-sando à seleção assistida por marca-dores moleculares é considerada poralguns autores como uma das apli-cações de maior impacto: é o resul-tado da utilização da tecnologia demarcadores moleculares associadoa programas de melhoramento ge-nético (FERREIRA & GRATAPAGLIA,1998, MURO_ABAD, 2000).

Além do estudo e da localizaçãodos QTLs e da determinação de seusefeitos, é interessante considerar queo desenvolvimento de um mapa ge-nético permite estudos em várias

Figura 3 - Grupos de ligação 1 e 2 paramétricos (à direita) e estimados (à esquerda), utilizando a metodologia de MáximaVerossimilhança para a obtenção das estimativas da freqüência de recombinação “r” e a metodologia da delineação rápida em cadeiapara o ordenamento dos locos. Para isso, foi gerada uma população F2, constituída de 100 indivíduos, com 47 marcas dominantes.

Genoma simulado, constituído de doisgrupos de ligação com 200 unidades demapa de tamanho, que apresenta, res-pectivamente, 27 e 20 marcadores do-minantes.

Estimativas de máxima verossimilhançados grupos de ligação obtidas a partir deprogênie F2, constituída de 100 indiví-duos, originada do cruzamento de geni-tores de genótipo contratantes.


outras áreas como, por exemplo, oesclarecimento da estrutura dogenoma, a clonagem de blocos degenes de interesse, e os estudos desintenia (relativo à localização dedois ou mais genes em um mesmocromossomo) em espécies relaciona-das (LIU, 1998).

O cruzamento das informaçõesobtidas com o mapeamento genéticotradicional e com o mapeamento físi-co do genoma deve facilitar a carac-terização de genes e de regiões dogenoma críticas para a expressãofenotípica, dando subsídios para aclonagem de blocos de genes desejá-veis. A relação entre as unidades demapa e a distância em pares de basenão é uma constante entre as espéci-es e depende, principalmente, dasaturação do mapa e do tamanho dogenoma da espécie considerada. Taisestudos associados a sintenia entreas espécies podem facilitar o enten-dimento de muitos processos fisioló-gicos e de diferenças entre espécies,fornecendo a base teórica para aseleção e manipulação genética deespécies relacionadas.

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Pesquisa

Filmes Comestíveisde Quitosana

Ação biofungicida sobre frutas fatiadas

Odilio B. G. Assis, Dr.Embrapa Instrumentação Agropecuá[email protected]

Ariane Maria LeoniBióloga - Estagiária,Embrapa Instrumentação Agropecuá[email protected]

Ilustrações: Embrapa Instrumentação Agropecuária

Introdução

sar revestimentos e co-berturas em frutas e ve-getais com o objetivo deaumentar seu período depreservação não consis-

te em prática recente. SegundoHardenburg (1967), emulsões deri-vadas de óleos minerais têm sidoempregadas desde o século 13 naChina, na conservação de frutos cí-tricos e em outros produtos queeram transportados por longas dis-tâncias por via marítima. Na décadade 1950, a cera de carnaúba foiintroduzida para esse fim, mas, de-vido à aparência fosca resultante desua aplicação, foram misturados compolietileno e parafina. Nos anos de1960, ceras e vernizes processados apartir de gomas solúveis em água setornam populares no revestimentode cítricos e frutas em geral.

As coberturas denominadas “co-mestíveis” como hoje conhecemossão mais recentes, e datam das déca-das finais do século passado , quan-do os produtores tiveram seu inte-resse pó elas aumentado devido àexpansão da oferta de produtos pro-cessados. A indústria dos chamadosalimentos minimamente processa-dos foi inicialmente desenvolvidacom o objetivo de suprir restauran-tes, hotéis e instituições similares.Nas últimas décadas, contudo, emfunção das conveniências da vidamoderna, os produtos processadosexperimentaram uma significativaexpansão, com oferta de opções novarejo e facilidade de escolha para oconsumo direto.

As mudanças nos padrõesnutricionais e os benefícios credita-dos a uma alimentação saudável for-maram a grande força impulsionadoradesses produtos e têm refletido, des-de então, em âmbito mundial, umaatenção para as pesquisas de novosmateriais e agentes com proprieda-des preservativas e bactericidas natu-rais que possam ser conveniente-mente empregados em alimentos.

Em particular os seguimentos de“fresh-cut” e “ready-to-eat” são os querequerem uma tecnologia específicapara a manutenção apropriada de suasqualidades nutricionais (Wiley, 1997).

De acordo com Clemente (1999),frutas e vegetais minimamente pro-cessados foram timidamente intro-duzidos no Brasil no início da décadade 1990 em São Paulo. Estima-se hojeum crescimento na taxa de, pelomenos, 20% ao ano, tendo movimen-tado, em 1998, cerca de R$ 450 mi-lhões, só no mercado nacional devegetais minimamente processados(Fares & Nantes, 2001).

Os revestimentos comestíveissobre alimentos devem apresentarcertas peculiaridades como sereminvisíveis, terem aderência suficientepara não serem facilmente removi-dos no manuseio e não introduziremalterações no gosto.

Embora atributos de qualidadesejam os objetivos principais de umrevestimento, dá-se uma ênfase na-tural às características visuais. Comodados apresentados nos trabalhosde Ahvenainen (1996) e de Nassu etal., (2001), a principal preocupaçãodos consumidores está em adquirirprodutos com aparência de frescos,


cor aceitável e razoavelmente livresde defeitos.

O principal papel de uma cober-tura comestível, no entanto, é atuarcomo uma barreira à perda de umida-de, controlar a respiração do fruto eevitar contaminações microbiológicase químicas. Durante a respiração,glucose é metabolizada em dióxidode carbono (CO

2) por meio da intera-

ção do ácido tricarboxílico, o que gerao amadurecimento e deterioração na-tural do fruto. A atmosfera modificadacriada pelo revestimento gera um apri-sionamento físico do CO

2 dentro do

fruto. Se a permeação de oxigênio(O

2) para seu interior é reduzida,

ocorrerá um prolongamento do tem-po de maturação. Além disso, os re-vestimentos comestíveis têm a vanta-gem da biodegradabilidade que ostorna “ambientalmente corretos”.

Lipídios, polissacarídos e proteí-nas são os produtos comumente em-pregados na formação das coberturascomestíveis sobre frutas, com vanta-gens e desvantagens específicas decada material (Baldwin et al., 1995).Têm sido tentativas recorrentes napesquisa de superfícies ativas a depo-sição de multicamadas ou de estrutu-ras compósitas e combinações destesou adição de demais materiais.

Respiração em Frutos

Sob condições ideais, a maioriadas plantas, incluidos seus frutos,respira aerobicamente. A respiraçãoaeróbica envolve a quebra de molé-culas de carboidratos obtidos duran-te a fotossíntese. A queima lentadesses compostos ricos em energia,dos quais um dos mais simples é aglicose, constitui atividades metabó-licas bem conhecidas e são usadas naformação de adenosina trifosfatada(ATP). Durante o processo respirató-rio normal, a planta usa o oxigênio daatmosfera como um aceptor de elé-trons no processo de fosforilação elibera dióxido de carbono.

Quando o fruto é colhido, háuma interrupção no balanço gasoso,ocorrendo um alto influxo do oxigê-nio com proporcional perda do CO

2.

Nessa nova condição (alta concen-tração de O

2 com baixa de CO

2), as

células internas não são mais reno-

vadas e a respiração aumenta, o queprovoca uma queda metabólica le-vando o fruto a um gradual amadu-recimento e eventual senescência.Com o revestimento ocorre entupi-mento parcial dos poros, reduzindo,dessa forma, a troca gasosa, ou seja,reduzindo a taxa de respiração, oque permite um prolongamento davida do fruto.

RevestimentosHidrocolóides

Um dos materiais de interesseno processamento de coberturas sãoos hidrocolóides. Hidrocolóides sãopolímeros solúveis em meios aquo-sos, estabilizados em géis que nor-malmente, solidificam e formam fil-me por evaporação direta dosolvente. Os revestimentos dehidrocolóides constituem excelentebarreira aos gases, mas oferecemfraca proteção à migração do vaporde água, dada a sua naturezahidrofílica.

Os hidrocolóides utilizados napreparação de filmes comestíveis po-dem ser classificados segundo a suacomposição, massa molecular e solu-bilidade. De acordo com Donhwe eFennema (1994), os filmes hidroco-loidais mais utilizados são osglucídicos e os protéicos. Os glúcidosmais utilizados são os derivados decelulose, os alginatos, as pectinas, agoma-arábica e o amido ou amidomodificado. A proteína de soja, oglúten, a zeína e o soro de leite sãoalgumas das proteínas freqüentemen-te utilizadas na preparação de reves-timentos comestíveis.

Polissacarídeos de origem ani-mal têm sido avaliados como umaalternativa consideravelmente eco-nômica e eficiente para esse fim,sendo a quitosana o composto maisestudado (Coma et al., 2002).

A quitosana

A quitosana é um polímero natu-ral derivado do processo de desaceti-lação da quitina, que é tido como osegundo polissacarídeo mais abun-dante da natureza, atrás apenas dacelulose. Sua estrutura é formada pelarepetição de unidades beta (1-4) 2-amino-2-deoxi-D-glucose (ou D-glucosamina) e apresenta uma cadeiapolimérica quimicamente similar à dacelulose, conforme expressa na Figu-ra 1. Devido a suas característicasatóxicas e de fácil formação de géis, aquitosana tem sido considerada hádécadas como um composto de inte-resse industrial e especialmente deuso farmacêutico (Campana-Filho &Desbrières, 2000). Recentemente, con-tudo, uma série de estudos tem sidopublicada caracterizando o uso daquitosana como cobertura de alimen-tos ou revestimentos protetores emfrutas e legumes processados (Shahidiet al., 1999; Coma et al., 2002). Essestrabalhos enfocam, essencialmente,as propriedades antifúngicas eantibacterianas da quitosana, confor-me demonstrado por No et al., (2002),indicando por conseguinte o seu usopotencial sobre superfícies cortadasou sobre frutos com alta taxa dematuração pós-colheita. Como aquitosana constitui-se de fibras nãodigeríveis, não apresenta, portanto,valor calórico, independentemente daquantidade ingerida, o que é mais umatrativo para a indústria alimentar.

As diferentes características doproduto comercial tornam-se um dosaspectos que têm dificultado seu ple-no uso na industria alimentícia. Asquitosanas disponíveis, principalmen-te no Brasil, são de procedênciasdiversas e apresentam diferentesgraus de pureza e densidade molar,além de não seguirem industrialmen-te um procedimento comum de desa-

Figura 1. Representação esquemática da estrutura primária da quitosana, sendo n ograu de polimerização.


cetilação, o que torna os materiaiscomerciais consideravelmente dife-rentes entre si. Esse fato dificulta oestabelecimento de um processamen-to padrão de géis e a obtenção defilmes e revestimentos com caracte-rísticas reprodutíveis (Assis & Alves,2002). Outro aspecto importante éque as quitosanas comerciais sãosolúveis somente em pHs ácidos, oque pode gerar reações com a super-fície a ser revestida, alterando o as-pecto e o sabor da polpa. Alteraçõesna seqüência de desacetilação oumudanças estruturais introduzidas nacadeia da quitosana já processada,como o derivado N-carboximetilqui-tosana, podem gerar produtos solú-veis em pH neutro. De um modogeral, contudo, a quitosana tem sidointernacionalmente aceita como ma-terial promissor para revestimentode frutas e de alimentos diversos.

Metodologia paraFormação de Géis e

Revestimento

A quitosana empregada nestaavaliação foi obtida em farmácias demanipulação, sendo, segundo infor-mação inscrita, procedente da purifi-cação de quitinas extraídas de cascasde camarão. Esse material apresentaaspecto granular, ligeiramente ama-relado e pode ser classificado comode média massa molar (Signini &Campana-Filho, 1998).

Os géis foram preparados pordissolução sob agitação moderada emácido acético 0,5 M até equilíbrio empH próximo a 3. Estudos preliminaresindicaram que os melhores resultadosna formação de filmes são consegui-dos com soluções com concentraçõesde quitosana próximos a 20 g/L (Assis& Pessoa, 2003). São necessários pe-ríodos superiores a 12 horas de agita-ção para obter uma total homogenei-zação da solução. Para simplificar oprocesso, todo o procedimento foirealizado sob temperatura ambiente.

Frutos comerciais de maçãs da cv.Gala, foram secionadas ao meio, doisprocedimentos de revestimentoadotados: i) as amostras foram imersascom a ajuda de um suporte metálico nasolução filmogênica e ii) as amostrasforam revestidas por nebulização, com

Figura 2 – Procedimentos de revestimento adotados.

Figura 3. Seqüência empregada para processamento de gel e depósito.


sistema de pressão manual (spray). Aconsecução de uma nebulização per-feita e a de forma manual são depen-dentes, evidentemente, da viscosidadeda solução empregada.

Após o escoamento do excessode gel, foram deixadas secar em condi-ção ambiente. A cura (polimerização)do filme dá-se espontaneamente comoconseqüência da evaporação dosolvente. A Figura 2 ilustra os procedi-mentos adotados, cuja seqüência estáesquematizada na Figura 3.

Como resultado da aplicação, éobservada uma ligeira mudança nacoloração da superfície cortada, emambos os processos, com tendência aum tom tirante a amarelo ou a verdesuave. Após a secagem, os filmes

resultantes apresentam boa aderên-cia, sendo totalmente transparentes.

As maçãs naturalmente apresen-tam um escurecimento superficial sobas faces cortadas, em função da açãoenzimática da polifenoloxidase(PPO), em diferentes intensidades,como medido por Sapers e Douglasem 1987. Contudo, em meio ácido,que é necessário para que a quitosanase dissolva em condição não-altera-da, essa reação é potencializada. Noentanto, foi observado que o tempode imersão das amostras (de 3 a 8segundos) aparentemente não afetaa coloração final resultante. A exten-são dos danos provocados pela açãoácida pode ser, em princípio, atenu-ada pelo uso de agentes alcalinos

que, misturados ao gel, ajustam o pHem níveis menos agressivos ou que,por alterações estruturais prévias daquitosana, que a torna solúvel empHs mais alcalinos. Um revestimentopolimérico ideal para uso em alimen-tos, evidentemente deve ser comple-tamente inerte, com ausência de im-pacto sobre a polpa ou introdução ealteração de cores na casca ou nasdemais partes do fruto.

Têm sido conduzidas análisesdetalhadas dos filmes, tanto por mi-croscopia eletrônica de varredura(MEV) como por microscopia de for-ça atômica (AFM), (Assis, et al., 1999;Assis, et al, 2002) indicando estrutu-ras descontínuas, que caracterizamcerta porosidade residual no filmeformado, conforme imagens típicasapresentadas na Figura 4, obtidas porAFM (sistema TopoMetrix Discover -imagens geradas por programa SPIP2.1 - Scanning Probe Image Proces-sor). Os filmes apresentam espessu-ras variáveis, dependente da posiçãono fruto, mas de uma forma geral, sãoextremamente finos, não superioresa 1,5 mm. Como citado, coberturastotalmente densas e impermeáveissão indesejáveis para coberturas defrutos, pois é necessário que haja nosrevestimentos a manutenção de umarespiração mínima.

A literatura tem mostrado quepolímeros hidrofílicos, especialmen-te os altamente polares como aquitosana, podem, em função daumidade relativa do ar, mudar signi-ficativamente sua permeabilidade agases. Resultados apresentados porMcHugh & Krochta, em 1994, mos-traram que, para uma porosidadeespecífica, a permeação é sensivel-mente reduzida com o abaixamentoda concentração de água adsorvidapela película. Na realidade, a per-meabilidade do filme pode ser alte-rada devido, não somente à umida-de ambiental, mas, principalmente,pela incorporação de elementosaquosos celulares oriundos da pol-pa da fruta (Baldwin et al, 1996).

Características Protetoras

Com respeito à ação protetorados revestimentos de quitosana, éobservada pouca diferença como re-

Figura 5. Perda relativa de massa em função do tempo de armazenamento emcondições não controladas. Amostras fatiadas e revestidas por imersão.

Figura 4. Imagens típicas de filmes de quitosana, obtido por microscopia de forçaatômica. O aspecto microscópico dos filmes formados indica estrutura descontínua comporosidade residual, mais acentuado para os revestimentos obtidos por nebulização.


sultado dos processos de deposição.A Figura 5 apresenta a perda de massarelativa, obtidas em amostras cobertaspor imersão, para 10 dias de armaze-namento em condições não controla-das (temperaturas entre 25oC -30oCem ambiente com iluminação natu-ral). Ao final desse período, temosuma preservação média de massa su-perior a 10% para as amostrasrecobertas. Os dados referem-se amedidas realizadas diariamente paravalores estimados pela média de 8amostras.

Worrell at al., (2002) demons-tram que uma das principais caracte-rísticas de um filme protetor na redu-ção de perda de massa é o estabele-cimento de uma boa diferença nosvalores de pressão de vapor entre ofruto e sua vizinhança. Apesar daquitosana ser um material hidrofílicocom significativa taxa de absorção deágua (Assis & Silva, 2003) o efeitoredutor da perda de massa é efetivoe claramente observado. Resultadossimilares foram coletados para asamostras revestidas por spray.

O caráter anti fúngico daquitosana foi avaliado qualitativa-mente através do acompanhamen-to fotográfico de colônias esponta-neamente crescidas sobre as super-fícies cortadas. Embora não tenhasido realizado um acompanhamen-to rigoroso das culturas e das espé-cies de fungos, de modo geral, osfilmes apresentaram boa açãoantifúngica. Fica visualmente claraessa ação na comparação das ma-çãs revestidas com as não revestidas.Faces não recobertas apresentamproliferação de fungos a partir doquinto dia, com progressão signifi-cativa nos períodos seguintes. AFigura 6 apresenta exemplo da apa-rência das faces após o oitavo diade estocagem.

O efeito fungicida da quitosanaé atribuído à ação de enzimasquitonolíticas, como a quitinase,que degradam as paredes celula-res dos fungos e provocam a extra-ção de agentes antimicrobianoscomo a fitoalexina e a pisatina(Hirano & Nagao, 1989, Coma etal., 2002). A quitinase pertence auma família de proteínas denomi-nada proteínas relacionadas com apatogênese (conhecidas como pro-teínas de defesa) ou proteínas PR(Pathogenesis Related proteins).Essas proteínas formam um grupoestrutural e funcionalmente hete-rogêneo que são capazes de inibiro crescimento da hifa.

Essas atividades antifúngicassão freqüentemente influenciadaspelo pH local. Estudos conduzidospor Sudarshan e colaboradores(1992) indicaram que a interaçãoentre quitosana positivamente car-regada (o que ocorre em meio áci-do) e resíduos ou superfíciesmicrobianas negativamente carre-gadas são fundamentais para umaefetiva ação inibitória do cresci-mento de microorganismos. Fenget al., 1994, também mostraram quea atividade microbiana da quitosanaaumenta com o porcentual de desa-cetilação, que, normalmente, se en-contra entre 65% a 85%. Jung, et al.,(1999) resumem as atividadesantimicrobianas da quitosana emdois principais mecanismos: i) Anatureza catiônica da quitosana, que

Figura 6. Aspecto genérico das faces cortadas (revestidas e não-revestidas) após ooitavo dia de armazenamento.


favorece ligações com o ácido siáliconos fosfolipídios, e conseqüente-mente, restringe o movimento desubstâncias microbiológicas; e ii) Apenetração através da parede celu-lar que impede a transformação doDNA em RNA. Ou seja, a atividadeantimicrobiana se dá por interaçãodos grupos amino livres da cadeiapolimérica da quitosana.

O uso de substâncias polissaca-rídeas abundantes e bioativas como aquitosana, que, além de atóxicas,reduzem a maturação e atuam ouinduzem defesas a microorganismos,são potencialmente interessantes paraaplicações em biotecnologia e mere-cem ser mais bem avaliadas comopotencial material para revestimen-tos comestíveis de uso genérico.

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Bactérias Produtorasde Biossurfactantes

Ester Ribeiro GouveiaDepartamento de Antibióticos – UFPEDoutora em Engenharia Quí[email protected]

Danielle Patrice Alexandre LimaDepartamento de Antibióticos – UFPEBacharel em Ciências Bioló[email protected]

Maria do Socorro DuarteDepartamento de Antibióticos – UFPEMestre em Biotecnologia de Produtos [email protected]

Gláucia Manoella de Souza LimaDepartamento de Antibióticos – UFPEMestre em Biotecnologia de Produtos [email protected]

Janete Magali de AraújoDepartamento de Antibióticos – UFPEDrª Profª adjunta da [email protected]


Produção de biossurfactantes por bactérias isoladas de poços de petróleo

Pesquisa

Resumo

Os biossurfactantes são molé-culas produzidas por bactérias, fun-gos ou leveduras, que apresentampropriedades biológicas aplicáveisa várias indústrias, tais como, a in-dústria farmacêutica, de cosméticos,de petróleo e de alimentos. Estescompostos, nos últimos anos, têmrecebido atenção especial devido àsua biodegradabilidade, baixatoxicidade e conseqüente aceitabili-dade ecológica. Os biossurfactantessão classificados em glicolipídeos,lipopeptídeos e lipoproteínas,biossurfactantes poliméricos, fosfo-lipídeos e ácidos graxos. Dentre osglicolipídeos, os mais estudados sãoos raminolipídeos, produzidos porPseudomonas aeruginosa. Este tra-balho teve como objetivo a produ-ção de biossurfactantes raminolipí-dico por bactérias isoladas de poçosde petróleo. Inicialmente, 40 bacté-rias isoladas de poços de petróleono Canto do Amaro/RN foram isola-das e caracterizadas como produto-ras ou não de raminolipídeos, utili-zando-se um ensaio primáriosemiquantitativo. Destas bactérias,13 deram resultado positivo e foramidentificadas como Pseudomonasaeruginosa, com exceção de duasbactérias, que foram identificadasapenas como Pseudomonas. Na se-gunda etapa foram realizados culti-vos em frascos agitados com meiode cultura contendo glicose ouglicerol como fontes de carbono. Oglicerol foi uma fonte mais apropri-ada, com produtividade de raminosemaior que aquela encontrada na lite-ratura utilizando o mesmo meio eoutra linhagem isolada de outro lo-cal. Na etapa seguinte, foram realiza-

dos experimentos de degradação depetróleo bruto pelas 13 bactérias.Estes resultados mostraram o poten-cial destas linhagens em produzirbiossurfactantes raminolipídico, uti-lizando petróleo bruto como fonte decarbono o que apresenta ser de gran-de importância para a biorremedia-ção de áreas contaminadas por derra-mamento de petróleo.

1. Introdução

Os surfactantes compreendemuma classe importante de compostosquímicos muito utilizados em diversossetores industriais, uma vez que atuamcomo dispersantes e/ou solubilizantesde compostos orgânicos, apresentan-do baixa solubilidade em água. A im-portância comercial dos surfactantestorna-se evidente a partir da tendênciado mercado que vem aumentando suaprodução em decorrência da diversi-dade de aplicações industriais.

Os surfactantes possuem estrutu-ra molecular com grupos hidrofílicose hidrofóbicos que exibem proprieda-des como adsorção, formação demicelas, formação de macro e microemulsões, ação espumante ouantiespumante, solubilidade e deter-gência. Um dos índices mais utiliza-dos para avaliação desta atividadesurfactante é a concentração de micelascríticas (CMC) que é a solubilidade deum surfactante dentro da fase aquosaou a concentração mínima requeridapara atingir a mais baixa tensão super-ficial ou interfacial (Lin, 1996). A efi-ciência e a efetividade são caracterís-ticas básicas essenciais que determi-nam um bom surfactante. A eficiênciaé medida através da CMC que varia de1 a 2000 mg/l, enquanto que aefetividade está relacionada com as


Figura 1. Diâmetro dos halos azuis das bactérias caracterizadas como produtoras deraminolipídeo.

anaiborcimmegiroedsetnatcafrusededadisreviD-1alebaT

.)1002,.atenagilluM(

somsinagrorciM setnatcafrussoiBsimrofinehcilsullicaB oedítpepopiL

silitbussullicaB anitcafruS.pssullicaB oedípilonimaR

locibmobadidnaC oedípilorofoSacitylopiladidnaC 719-Y oedípilorofoS

musoidisnimuiretcabenyroC oedípilofsoFasonigureasanomoduesP oedípilonimaRsneceroulfsanomoduesP oedítpepopiL

.pssuccocodohR oedípilocilG

tensões superficiais e interfaciais asquais devem atingir valores menoresque 30 e 1 mN/m, respectivamente(Muligan, 1993).

Um outro parâmetro muito utili-zado para avaliar o comportamentodo surfactante é o valor do balançohidrofílico - lipofílico (HLB). Segun-do Parkinsom (1985) surfactantes comHLB menor que 6 são mais solúveisna fase oleosa, enquanto valores en-tre 10 e 18 exibem característicasopostas (Desai e Banat, 1997). Aadição de um bom surfactante naágua pode diminuir a tensão superfi-cial e interfacial a 200C de 72 para 30mN/m (Kosaric, 1996).

Os surfactantes são aplicados emáreas como agricultura para a formu-lação de herbicidas e pesticidas, naindústria alimentícia como aditivo emcondimentos, nas indústrias farma-cêuticas, têxtil e cosmética (Yamane,1987; Lin et al., 1993; Shephord et al.,1995). Entretanto, o maior mercadopara os surfactantes é na indústriapetrolífera, onde são amplamente uti-lizados para a recuperação terciáriado petróleo (MEOR - MicrobialEnhanced Oil Recovery), como na

remoção e mobilização de resíduosde óleo e biorremediação (Desai eBanat, 1997; Ron e Rosenberg, 2002).

Surfactantes microbianos ou bios-surfactantes são metabólitos microbia-nos de superfície ativa, que apresen-tam moléculas com porções hidrofílicase hidrofóbicas que tendem a se distri-buir nas interfaces entre fases fluídascom diferentes graus de polaridade(óleo/água e água/óleo). Estas propri-edades promovem a redução da ten-são superficial e interfacial, conferindoa capacidade de detergência, emulsifi-cação, lubrificação, solubilização e dis-persão de fases (Desai e Banat, 1997).A porção hidrofílica é constituída porgrupamentos aniônicos, catiônicos,não-aniônicos ou anfóteros, enquantoque, a parte hidrofóbica, geralmente éum hidrocarboneto linear ou ramifica-do apresentando ou não duplas liga-ções e/ou grupos aromáticos (Georgiouet al., 1992). Os surfactantes microbia-nos são produzidos principalmente porbactérias, embora fungos e levedurastambém os produzam (Fiechter, 1992).

A maioria dos surfactantes utili-zados comercialmente é sintetizadaa partir de derivados do petróleo.

Entretanto, nos últimos anos o inte-resse por surfactantes de origemmicrobiana tem aumentado signifi-cativamente em decorrência de se-rem naturalmente biodegradáveisdiminuindo assim o impacto ambi-ental (Makkar e Cameotra, 2002).Os biossurfactantes apresentam inú-meras vantagens sobre os surfactan-tes de origem química, tais como,baixa toxicidade, tolerância à tem-peratura, pH e força iônica, além deserem biodegradáveis na água e nosolo (Lin, 1996).

Segundo Georgiou et al. (1992),uma grande variedade de microrga-nismos produz biossurfactantes, sen-do que o tipo, a quantidade e aqualidade do biossurfactante são in-fluenciados pela natureza do substra-to, concentração de íons como P, N,Mg, O

2, e Fe- no meio de cultura,

além das condições de cultivo.Os surfactantes sintéticos são

classificados pela natureza do seugrupo polar, enquanto que os bios-surfactantes são diferenciados porsua natureza bioquímica e pela espé-cie microbiana produtora (Desai &Desai, 1993). As principais classesincluem os glicolipídeos, lipopeptí-deos e lipoproteínas, biossurfactan-tes poliméricos, fosfolipídeos e áci-dos graxos (Georgiou et al., 1992;Desai e Banat, 1997).

Uma ampla diversidade de bios-surfactantes de origem microbianapode ser observada na Tabela 1.

A classe dos glicolipídeos com-preende um grupo dos mais conheci-dos e estudados, apresentando lon-gas cadeias de ácidos alifáticos ouácidos hidroxialifáticos. Nesta classedestacam-se os raminolipídeos,trealolipídeos e soforolipídeos (Reis,1998).

Os raminolipídeos são formadospor uma ou duas moléculas deraminose, ligadas a uma ou duas molé-culas de ácido b-hidroxidecanóico(Desai e Banat, 1997). Foram isoladospela primeira vez por Bergstrom et al.(1946) de Pseudomonas pyocyanea.Posteriormente, Jarvis e Johnson em1949 mostraram uma ligação glicosídicade b-hidroxidecanoil-b-hidroxidecano-ato com duas moléculas de raminoseem cultivo de P. aeruginosa com 3%(v/v) de glicerol.

Os raminolipídeos produzidospor Pseudomonas spp. têm a capaci-dade de diminuir a tensão interfacial


Figura 4. Produtividade em raminose obtidas durante as fermentações com as 13bactérias produtoras de raminolipídeos.

Figura 2. Tensão superficial obtida durante cultivo em frascos agitados em meio MLRcontendo glicose como fonte de carbono.

Figura 3. Tensão superficial obtida durante cultivo em frascos agitados em meio MGcontendo glicerol como fonte de carbono.

contra n-hexadecano para 1 mN/m ea tensão superficial para 25 a 30mN/m (Lang e Wagner, 1987). Alémde reduzirem a tensão superficial,estabilizam emulsões e são geral-mente atóxicos e biodegradáveis(Banat et al., 2000). Estes biossur-factantes também são uma fonte deL-raminose, usada na produção decondimentos de alta qualidade etambém como matéria-prima para asíntese de alguns compostos orgâni-cos (Linhardt et al., 1989).

Embora o potencial de produ-ção seja determinado pela genéticado microrganismo, outros fatorescomo as condições ambientais e anatureza do substrato também influ-enciam no nível de expressão(Rahman et al., 2002). P. aeruginosapode utilizar substratos comoalcanos, piruvato, glicerol, succinato,frutose, óleo de oliva, glicose emanitol para produzir raminolipíde-os (Mulligan et al., 2001).

Em decorrência da importânciados biossurfactantes, este trabalhoteve como objetivo investigar a pro-dução destes compostos por bactéri-as isoladas de poços de petróleo.

2. Materiais e Métodos

Microrganismos

Foram utilizadas 40 bactérias, 20Gram-positivas e 20 Gram-negativas,pertencentes à coleção de culturas demicrorganismos do Departamento deAntibióticos da UFPE (DAUFPE), iso-ladas de poços de petróleo de Cantodo Amaro/Mossoró/RN (Tabela 2).

Meios de Cultura

A manutenção das bactériasGram-negativas foi realizada em meiode cultura MPK (King et al., 1954) edas bactérias Gram-positivas em meioTriptona de Soja Ágar - TSA, quecontém (em g/l): Tripticase - 15; NaCl- 5; Peptona de soja - 5; Ágar – 15 epH 7,0.

Na seleção primária de bactériascomo produtoras de raminolipídeosfoi utilizado o meio MMR como pro-posto por Siegmund e Wagner (1991).

A investigação sobre a biode-gradação de hidrocarbonetos foi rea-lizada utilizando-se o meio mineralBuchnell e Haas (BH), adicionado depetróleo como fonte de carbono.


odoelórtepedsoçopedsadalosisavitisop-marGesavitagen-marGsairétcabsadoãçaleR.2alebaT.ohlabartetsensadazilitue)NR(oramAodotnaC

savitagen-marGsairétcaB savitisop-marGsairétcaBoãçeloCadº.N

*EPFUADedsoçoP

megirOogidóC

oãçeloCadº.N*EPFUAD

edsoçoPmegirO

ogidóC

905 92-PA 4G 115 92-PA 2H865 44-PA 1BD 225 92-PA B1965 44-PA 1A1D 325 92-PA C1075 44-PA 2AB 925 92-PA 12175 44-PA 2A1D 035 92-PA 6275 44-PA 2BB 235 92-PA 81375 44-PA 1AD 435 92-PA B9475 44-PA 1B1D 535 92-PA A42575 44-PA 2B1D 935 92-PA A31295 44-PA C71 045 92-PA B31206 44-PA B52 445 92-PA 41016 491-PA 5A 545 92-PA 52116 491-PA 4B 085 44-PA B32216 491-PA 1C 885 44-PA B6316 491-PA 2C 985 44-PA C6416 491-PA 2D 695 44-PA 42516 491-PA 2E 895 44-PA B92816 491-PA )BAS(5A 995 44-PA A41126 491-PA 4D 106 44-PA A52825 92-PA C5 306 44-PA C52

.EPFUadsocitóibitnAedotnematrapeDodsarutluCedoãçeloC:EPFUAD*

Para a produção de raminolipí-deos tendo glicerol como fonte decarbono foi utilizado o meio descritopor Santa Anna et al. (2002). O meiodescrito por Abu-Ruwaida et al. (1991)foi utilizado quando glicose foi afonte de carbono.

Seleção Primária paraCaracterização das Bactérias

como Produtoras deBiossurfactante Raminolipídico

Neste ensaio semiquantitativo,segundo a metodologia descrita porSigmund e Wagner (1991), oraminolipídeo aniônico forma um pariônico insolúvel com o brometo decetiltrimetilamônio (CTAB), na pre-sença de azul de metileno, formandoum halo azul escuro em volta dacolônia.

Um volume de 3 µl de suspensãode bactéria a 109 Unidades Formado-ras de Colônias por ml (UFC/ml), decada linhagem, foi inoculada em meiosólido contendo CTAB e azul demetileno. Em seguida as placas foramcultivadas a 300C por 120 horas.

Identificação das Bactérias

As bactérias Gram-negativas, ini-cialmente selecionadas como produ-toras de raminolipídeos, foram iden-

tificadas através das característicasbioquímicas, com a utilização do KitBac Tray III específico para bactériasGram-negativas (Difco).

Cultivos em Frascos Agitados

A investigação da produção debiossurfactantes raminolipídicos foirealizada através de cultivos em mesaincubadora rotativa. Inicialmente asbactérias foram cultivadas em meiosólido MPK a 300C. Após 24 horas,foram inoculadas em frascos Erlen-meyers de 250 ml contendo 50 ml domeio de produção e incubadas sobagitação, a 300C, 250 rpm durante 24horas. Após este período, 2 ml decada bactéria foi inoculado em 48 mldo meio de produção, contidos emfrascos Erlenmeyer de 250 ml a incu-bação foi realizada nas mesmas con-dições da etapa anterior. Durante oscultivos foram retiradas amostras emintervalos de 24 horas, as quais foramcentrifugadas a 11.000 rpm durante 5minutos e submetidas às seguintesanálises:

a) Tensão superficial - a tensãosuperficial do caldo livre decélulas foi medida usando umtensiômetro CSC-Du Nouy (705)à temperatura ambiente;b) Concentração de raminose - a

quantificação de raminolipídeosexpressa em raminose, foi avali-ada pelo método colorimétricodo fenol ácido sulfúrico (Duboiset al., 1956);c) Concentração de biomassa –um volume conhecido da amos-tra foi centrifugado em tubos deeppendorfs (pesados previamen-te – P1) a 11000 rpm, durante 5minutos. O sobrenadante foi re-colhido para análises posterio-res e os tubos de eppendorfscontendo a biomassa foram co-locados em estufa a 800C. Após24 horas, os tubos foram pesa-dos (P2). A concentração debiomassa expressa em g.l-1 foiobtida pela equação: (P

2-P

1)/

V(L), onde V foi o volumecentrifugado em litro.

Degradação de Petróleo

No ensaio de degradação de pe-tróleo foi utilizada a metodologia deBrown e Braddock (1990) modificada,uma vez que no presente trabalho oensaio foi realizado em tubos e aconcentração de raminose foi determi-nada. Os tubos de ensaio continham omeio BH, o inóculo e o petróleo bruto.O tubo controle negativo não continhainóculo. Todos os tubos foram incuba-dos a 30°C por 20 dias.


Figura 5. Biomassa obtida durante os cultivos em frascos agitados em meio MGcontendo glicerol como fonte de carbono.

salepoelórtepedoãçadargededsoiasnesodsodatluseR.4alebaT

edsarotudorpomocetnemlaicinisadanoicelessairétcab31

.ocidípilonimarsetnatcafrussoib

adºN

EPFUADoãçelocogidóC

edoãçadargeD

oturboelórtep016 5A ++116 4B +++075 2AB ++275 2BB ++216 1C +++316 2C +++416 2D +++375 1AD +++965 1A1D ++175 2A1D +++575 2B1D +++516 2E +++115 2H ++

latotoãçadargeD+++;laicrapoãçadargeD++

seõçatnemrefsaetnarudaditbolaicifrepusoãsnetadoãçudereesonimarmeedadivitudorP.3alebaT.soedípilonimaredsarotudorpomocsadaziretcaracsairétcab31samoc

ansadanoicelessairétcaBairámirpoãçeles

meedadivitudorP)l/g(esonimaR

laicifrepuSoãsneT)m/Nm(laicinI

laicifrepuSoãsneT)m/Nm(laniF

oãsneTadoãçudeR)%(laicifrepuS

.pssanomoduesP 2E-516 9900,0 00,04 00,92 05,72-asonigurea.P 2BB-275 2900,0 05,53 00,03 05,51-asonigurea.P 2A1D-175 3800,0 55,33 08,92 81,11

.pssanomoduesP 2AB-075 9700,0 00,73 54,92 14,02-asonigurea.P 2C-316 8700,0 05,73 00,03 00,02-asonigurea.P 4B-116 1700,0 52,63 02,82 12,22-asonigurea.P 1C-216 8600,0 56,44 50,43 47,32-asonigurea.P 2B1D-575 6600,0 2,33 7,82 55,31

asonigurea.P 5A-016 6500,0 00,04 05,83 57,3-asonigurea.P 2D-416 5500,0 03,54 03,82 35,73

asonigurea.P 1A1D-965- 5300,0 00,14 00,04 54,2asonigurea.P 1AD-375- 5200,0 05,93 00,53 04,11

.pssullicaB 2H-115- 51000,0 00,53 00,03 92,41

3. Resultados e Discussão

Caracterização das BactériasIsoladas de Poços de Petróleo

Na seleção primária das bactériaspara a caracterização como produtorasde biossurfactantes raminolipídicos,27,5% (11) das bactérias Gram-negati-vas deram resultados positivos após 72horas de cultivo (Figura 1).

Das 20 bactérias Gram-positivasutilizadas, apenas a linhagem DAUFPE-511 (H2) foi caracterizada como produ-tora de biossurfactante raminolipídico.Por outro lado, das 20 linhagens Gram-negativas, 12 (60%) exibiram a forma-ção de halo azul nessa seleção primária.

A identificação bioquímica das12 bactérias Gram-negativas permi-tiu o conhecimento da espécie. Comexceção das bactérias Pseudomonassp. 570-BA2, e Pseudomonas sp. 615-E2, todas foram identificadas comoPseudomonas aeruginosa.

Produção de BiossurfactantesRaminolipídico em Frascos

Agitados

A partir da seleção primária, as 13linhagens positivas para raminolipídeoforam utilizadas para a investigaçãoda produção deste biossurfactante emmeios líquidos contendo glicose ouglicerol como fontes de carbono.

Uma vez que os biossurfactantespodem ser produzidos em substratossolúveis em água, inicialmente, as 13bactérias foram cultivadas em meio


Figura 6. Aspecto macroscópico de degradação do petróleo pelas bactérias P.aeruginosa 573-DA1 e Pseudomonas sp. 615-E2.

Figura 7. Produção de biossurfactante raminolipídico produzido pelas 13 bactérias emmeio mineral BH contendo petróleo.

MLR, contendo glicose como fonte decarbono e tensão superficial de 58mN/m. Nos resultados apresentados naFigura 2, a tensão superficial alcançouo valor mínimo de 30mN/m para asbactérias BB2, D1A1 e H2.

Na Figura 3 podem ser observadasas tensões superficiais obtidas duranteo cultivo em frascos agitados em meioMG contendo glicerol como fonte decarbono. Estes resultados comparadoscom aqueles obtidos com o meio MRL(Figura 2) indicam o glicerol como umafonte de carbono mais apropriada paraa produção de raminolipídeo do que aglicose. A análise destes resultados indi-ca que estas linhagens se destacamcomo boas produtoras de raminolipídeoquando a fonte de carbono é glicerol,corroborando com os resultados obti-dos por Mulligan e Gibbs (1989), osquais comprovaram que a composiçãodo meio de cultura influencia direta-mente na produção do biossurfactante.

Com relação à quantificação daraminose, apenas as amostras dosensaios com o meio MG foram utiliza-das. A Figura 4 apresenta os valoresde produtividade em raminose obti-dos durante as fermentações com as13 bactérias produtoras de raminolipí-deo em meio MG. A produtividade emraminose foi calculada considerandoo maior valor de concentração dividi-do pelo respectivo tempo, sendo otempo de produção máxima entre 72e 96 horas de cultivo.

Os maiores valores foram obser-vados para as bactérias Pseudomonassp. 615-E2, P. aeruginosa-572-BB2,Pseudomonas sp. 570-BA2, P.aeruginosa-613-C2 e P. aeruginosa-571-D1A2. Todas estas bactérias pro-duziram valores superiores a 0,007g/l.h. A produtividade obtida por SantaAnna et al. (2002) utilizando o mesmomeio de cultura e Pseudomonasaeruginosa PA1 foi de 0,0069g/l.h.Valores superiores de produtividadesão geralmente obtidos em cultivos embatelada alimentada. Rahman et al.(2002) obtiveram produtividade maiorque 0,03g/l.h quando foram adiciona-dos óleo de soja ou glicerol após 46,144 e 192 horas, em cultivos comPseudomonas aeruginosa DS10-129.

A Tabela 3 apresenta os valoresde tensão superficial e de produtivi-dade em raminose obtidos nos ensai-os com o meio MG. Observa-se nestaTabela que nem sempre os maioresvalores de concentração de raminose

correspondem aos menores valoresde tensão superficial, indicando aimportância de quantificar a produ-ção de raminolipídeo. A medida datensão superficial serve apenas comouma medida indireta da produção debiossurfactantes.

Santa Anna et al. (2002) tambémobservaram que quando utilizaramóleo parafínico como fonte de carbo-no para a produção de raminolipídeospor Pseudomonas aeruginosa PA1, aredução da tensão superficial foi deapenas 4,4%, sendo produzido 260mg/l; por outro lado, quando a fontede carbono foi n-hexadecano, a redu-ção da tensão foi de 47,4% e a concen-tração de raminose igual a 130 mg/l.

Conforme a Tabela 3, as linha-gens 611-B4, 575-D1B2 e 614-D2 apre-sentaram os menores valores de ten-são superficial, 28,2; 28,7 e 28,3 mN/m, respectivamente. Segundo Desai eBanat (1997), a tensão superficial du-rante a produção de raminolipídeospor P. aeruginosa pode chegar a 29mN/m, de forma que os valores míni-mos de tensão superficial encontra-dos no presente trabalho são similaresaos relatados na literatura.

A maioria das bactérias apresen-tou crescimento máximo com 48 ho-ras de cultivo, sendo a maior concen-tração de biomassa observada (Figura5) para a linhagem P. aeruginosa-575-D1B2, que alcançou 2,53 g/l . Con-


centração de biomassa maior que 5g/l foi encontrado na literatura apenasquando glicerol foi adicionado após afase exponencial de crescimento du-rante fermentação com P. aeruginosaem meio contendo glicose como fon-te de carbono (Rahman et al., 2002).

A produção de biossurfactante ra-minolipídico foi não associada ao cres-cimento, tendo em vista que sua con-centração máxima foi obtida durante afase estacionária de crescimento, típicode um metabólito secundário. Outrosautores também observaram produçãode raminolipídeos na fase estacionária(Ron e Rosemberg, 2002; Santa Anna etal., 2002; Rahman et al., 2002).

Experimentos para aDegradação de Petróleo

As 13 linhagens caracterizadascomo produtoras de biossurfactan-tes raminolipídico foram utilizadasnos ensaios de degradação de petró-leo. O petróleo foi totalmente ouparcialmente degradado como po-dem ser observados na Figura 6 e naTabela 4, pelo desaparecimento eemulsificação do óleo.

Para confirmar se durante a de-gradação do petróleo ocorreu a pro-dução do biossurfactante raminoli-pídico foi determinada a concentra-ção de raminose. De acordo com osresultados apresentados na Figura7, as bactérias produziram biossur-factante raminolipídico. Nestes re-sultados vê-se o potencial destaslinhagens em produzir biossurfac-tantes raminolipídico, utilizando pe-tróleo bruto como fonte de carbono,o que apresenta ser de grande im-portância para a biorremediação deáreas contaminadas por derrama-mento de petróleo. Segundo Rahmanet al. (2003), bactérias Gram-negati-vas como Pseudomonas aeruginosa,produzem raminolipídeo pela utili-zando hidrocarbonetos.

A importância de determinar aconcentração de raminose consistiuno fato de que a análise visual apre-sentada na Tabela 4 não concordacom os resultados apresentados naFigura 7, para todas as bactériasinvestigadas. A bactéria P. aeruginosa610-A5, por exemplo, apresentou re-sultado visual parcial e um dos mai-ores valores de concentração deraminose. Brown e Braddock (1990)não determinaram a concentração de

raminose, apresentando apenas o re-sultado visual.

Das 40 bactérias isoladas de dife-rentes poços de petróleo, 13, sendo 12Gram-negativas e 1 Gram-positiva, fo-ram caracterizadas como produtorasde biossurfactantes raminolipídico tantoutilizando glicerol, como petróleo bru-to, como fonte de carbono.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq(Conselho Nacional de

Desenvolvimento e Pesquisa) peloapoio financeiro recebido.


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Marcadores Microssatélitesem Espécies Vegetais

Glaucia Salles Cortopassi Buso, Dra.Pesquisadora do Laboratório de Genética Vegetalda Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,Brasí[email protected]

Ana Yamaguishi Ciampi, Dra.Pesquisadora do Laboratório de Genética Vegetalda Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,Brasí[email protected]

Marcio de Carvalho Moretzsohn, M.Sc.Pesquisador do Laboratório de Genética Vegetalda Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,Brasí[email protected]

Zilneide Pedrosa de Souza AmaralLaboratório de Genética Vegetal da EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia, Brasí[email protected]

Rosana Vianello Brondani, Dra.Pesquisadora da Embrapa Arroz e Feijão, Goiâ[email protected]


Pesquisa

Desenvolvimento e caracterização de marcadores microssatélites em espécies vegetais tropicais

Introdução

Marcadores moleculares podemser derivados de qualquer tipo dedado molecular que forneça um poli-morfismo detectável entre os organis-mos a serem comparados. Os marca-dores moleculares têm sido utilizadosem análise genética com as mais di-versas finalidades, tais como identifi-cação de clones, linhagens, híbridos,cultivares, paternidade, estimativas dediversidade, fluxo gênico, taxa decruzamento, parentesco e na constru-ção de mapas genéticos. Devido aodesenvolvimento nos campos da bio-logia molecular e genética, uma gran-de variedade de técnicas para analisarpolimorfismos genéticos tem sidodisponibilizada. Esses marcadorespodem diferir com respeito a caracte-rísticas importantes como abundânciagenômica, nível de polimorfismo de-tectado e informação genética, espe-cificidade dos locos, reprodutibilida-de, requerimentos técnicos e investi-mento financeiro.

Uma das técnicas mais indicadaspara estudar polimorfismos entre se-qüências de DNA é SSR (“SimpleSequence Repeats”) ou microssatéli-tes (Litt e Luty, 1989; Weber e May,1989). Essa técnica baseia-se no usode pares de primers na reação de PCRpara detectar variações em locos deseqüências repetitivas. Estas são cons-tituídas de 1 a 6 nucleotídeos que serepetem lado a lado no genoma deeucariotos. A técnica de SSR revelapolimorfismo em um loco devido adiferenças no número de vezes (n)em que, por exemplo, um dinucleo-tídeo (AG)

n se repete naquele loco.

Essas variações no número de repe-tições constituem-se, em última aná-lise, em variações no comprimentodo segmento detectado pela reaçãode polimerase em cadeia e na sepa-ração de fragmentos amplificados emgel de eletroforese.

Os marcadores SSR caracteri-zam-se por serem codominantes, ba-seados em PCR, abundantes, apa-rentemente distribuídos por todo ogenoma, multialélicos e dependen-tes de pequena quantidade de DNAdos indivíduos analisados. O con-teúdo genético informativo de umloco SSR é bastante alto, por setratarem de seqüências de alta taxaevolutiva. Mesmo em comparaçõesde germoplasma com estreita basegenética, geralmente detecta-se umalto número de alelos em um locoSSR. A grande limitação do uso emlarga escala de marcadores SSR é aobtenção dos primers que serão usa-dos na PCR para amplificar alelosem cada loco. Trata-se de uma técni-ca de elevado custo e intensiva emmão-de-obra, considerando-se todasas etapas de seu desenvolvimento(incluindo construção de bibliotecagenômica, seleção de clones positi-vos, desenho e teste de primers). Emgeral, somente cerca de 10% a 20 %dos primers são informativos, o quetorna SSR uma técnica de custo ele-vado e intensiva em trabalho. O usode bibliotecas enriquecidas e doconceito de “primers ancorados” temfacilitado o trabalho envolvido, ereduzido o custo de obtenção deprimers informativos em, pelo me-nos, 5 vezes (Scott Tingey, informa-ção pessoal).


No entanto, uma vez obtidos osprimers informativos para uma espé-cie, os custos e a demanda de mão-de-obra são reduzidos drasticamente, e osensaios laboratoriais são rápidos, au-mentando a acessibilidade da técnica.SSR constitui uma ferramenta extrema-mente eficiente na identificação e nadiferenciação de indivíduos. Os mar-cadores SSR apresentam diversas van-tagens em relação aos RFLPs, entreessas: são baseados em PCR, menoslaboriosos, de menor custo, não de-mandam o uso de radioatividade, alémde serem geralmente mais polimórfi-cos. SSRs podem ser trocados entrelaboratórios, uma vez que cada loco édefinido pelas seqüências dos primersque flanqueiam a região repetitiva. Osensaios com SSRs são mais robustos doque com RAPD e mais versáteis do quecom AFLP. A natureza codominantedos microssatélites é uma vantagemsobre os marcadores RAPD e AFLP(dominantes), principalmente paramapeamento genético.

Powell et al (1996) examina-ram a utilidade dos marcadoresRFLP, RAPD, AFLP e SSR para aná-lise de germoplasma de soja, avali-ando o conteúdo de informação(heterozigosidade esperada), o nú-mero de locos analisados simulta-neamente por experimento (taxade multiplex) e a efetividade naanálise de relação entre acessos. Osmarcadores SSR tiveram a maiorheterozigosidade esperada, enquan-to os marcadores AFLP tiveram amaior taxa de multiplex.

O Laboratório de Genética Vege-tal da Embrapa Recursos Genéticos eBiotecnologia tem desenvolvido mar-cadores SSR para várias espécies, atra-vés de um protocolo otimizado pelaDupont (Rafalski et al., 1996), queutiliza bibliotecas enriquecidas, e quefoi adaptado para nossas condições.Já foram desenvolvidos primers paraeucalipto (Brondani, et al., 1998),pequi (Collevatti et al., 1999), palmi-to (Gaiotto, et al., 2000), mogno (Le-mes, et al., 2002), arroz (Brondani, etal., 2001), Magnaporthe grisea (Gar-rido, 2001), melão (Ritschel, et al.,2002), amendoim, sumaúma, cedro,pau-brasil, pupunha, cerejeira,cumaru, parapará, tatajuba, andiroba,anani e maçaranduba (ainda não pu-

blicados). O objetivo do presentetrabalho foi desenvolver marcadoresmicrossatélites para 5 espécies deplantas tropicais, a saber: pimentão,feijão, coco, copaíba e jatobá. Oslocos microssatélites identificados ecaracterizados servirão, entre outrasaplicações, para: (a) analisar a diver-sidade de coleções de germoplasma;(b) identificar acessos duplicados;(c) estudar a estrutura genética depopulações; (d) estudar paternidade;(e) desenvolver mapas genéticos; (f)utilizar em experimentos de seleçãoassistida por marcadores e analisar“pedigrees”.

Material e Métodos

Material experimental

O desenvolvimento de marca-dores SSR requer uma quantidademínima de 50 µg de DNA de boaqualidade. Para a extração de DNAna grande maioria das espécies vege-tais, tem sido utilizado o protocolocom o detergente CTAB (“cationichexadecyl trimethyl ammoniumbromide”), como descrito por Ferreira& Grattapaglia (1998). O DNA foiextraído de folhas jovens de um aces-so de cada uma das cinco espécies:pimentão (Capsicum annuum), fei-jão (Phaseolus vulgaris), coco (Cocosnucifera), copaíba (Copaiferalangsdorffii) e jatobá (Hymenaeacourbaril).

Construção de bibliotecagenômica enriquecida para SSR

Na construção de bibliotecagenômica enriquecida para SSR, foiutilizado o protocolo desenvolvidopor Rafalski et al. (1996), com algu-mas adaptações. Foram testadas di-gestões do DNA genômico com trêsenzimas de restrição, MseI, Sau3AI eTsp509I para se obterem fragmentosentre 300 e 800 pares de bases. Parapimentão, feijão e coco, o DNAgenômico foi digerido com Tsp509I,para copaíba e jatobá, com Sau3AI eos fragmentos de tamanho entre 300e 800 bp foram recuperados em mem-brana de celulose (DEAE-celuloseNA-45), via eletroforese em gel deagarose. Aproximadamente 30 µg dos

fragmentos foram recuperados e li-gados com T4 DNA ligase (a 12 oC,durante a noite) a adaptadores quecontinham o sítio de restrição dasrespectivas enzimas (Figura 1). Umtotal de 200 pmol de oligonucleotí-deos biotinilizados (TC)

13 foi ligado a

1 mg de contas magnéticas ligadas aestreptavidina em 400 µl de tampãoBW 2x (Tris HCl 10 mM pH 7,5, EDTA1 mM, NaCl 2 mM) em temperaturaambiente, sob agitação por uma hora.O excesso de sonda foi removido porlavagem com 400 µl de BW 1x e 400µl de SSPE 5x contendo SDS a 0,1 %.O DNA ligado foi então hibridizadoao complexo sonda-contas magnéti-cas a 65 oC por 90 min, em umvolume total de 300 µl (150 µl deSSPE 10x, SDS 0,2% e 150 µl de DNAmais adaptador). As contas magnéti-cas foram repetidamente sedimenta-das por aplicação de um campo mag-nético e lavadas duas vezes por 5 minem SSPE 2x, SDS 0,1% a temperaturaambiente, uma vez por 15 min emSSPE 2x, SDS 0,1% a 65 oC. As contasmagnéticas foram então ressuspensasem 200 µl de H

2O estéril.

Seleção de clones positivos

O DNA ligado às contas magné-ticas foi amplificado com a utiliza-ção de primers complementares àsseqüências dos adaptadores via PCRe os produtos da amplificação forampurificados utilizando-se o kit depurificação de PCR Qia-quick(QIAGEN). O DNA purificado foiclonado em plasmídeo pGEMT. Cé-lulas de E. coli (XL1-Blue) foramtransformadas por eletroporação ouchoque térmico, plaqueadas em meioLB + ampicilina e crescidas durantea noite a 37 oC. As placas foramtransferidas para membranas denitrocelulose e processadas por 5min nas seguintes soluções: desna-turante (NaOH 0,5 M e NaCl 1,5 M),neutralizante (Tris-HCl 0,5 M e NaCl1,5 M). Em seguida, o DNA foi fixa-do às membranas através de luzultra violeta e pré-hibridizadas (3h a65 oC, em SSC 5x, N-laurylsarcosine0,1%, SDS 0,02%, “blocking” 1%).Sondas poli AG/CT marcadas comdigoxigenina foram então desnatu-radas e hibridizadas às membranas


Figura 1 . Etapas do desenvolvimento de primers microsatélites (Cortesia de André Beló)

por 12 horas. Após lavagens de altaestringência (2 vezes por 5 min comSSC 2x, SDS 0,1% em temperaturaambiente; 2 vezes por 15 min comSSC 0,1M, SDS 0,1% a 65 oC), asmembranas foram lavadas e prepa-radas para detecção quimiolumines-cente e, então, expostas a filmes deraio X. As placas que continhamclones positivos para SSRs foramidentificadas por autoradiografia. Osclones positivos foram submetidos areações de PCR-ancorado (Taylor etal., 1992; Rafalski et al., 1996) paraverificação da presença, da orienta-ção e do tamanho do inserto de SSR(Figura 1).

Seqüenciamento dos clonespositivos e desenho de primers

Os clones selecionados cresce-ram em meio Lb + ampicilina e tiveramos respectivos DNAs isolados por lisealcalina (Sambrook et al, 1989). Osinsertos foram então amplificados viaPCR usando-se primers complementa-res às seqüências dos vetores. O pro-duto da amplificação foi purificado eforam executadas reações de seqüen-ciamento com kits de Dye-terminator(Applied Biosystems/ABI). Foram,então, desenhados primers específicospara cada região flanqueadora das se-qüências SSR utilizando-se para isso osprogramas Primer (Lincoln et al., 1991)e Primer 3 (Whitehead Institute ofBiomedical Research) (Figura 2). Nodesenho dos primers, foram utilizadosos seguintes critérios: temperatura mé-dia de anelamento de 52 oC a 58 oC(diferença máxima de 3 oC na tempe-ratura de anelamento entre cada primerdo par) e conteúdo de GC entre 40% e60% e ausência de complementaridadeentre os pares de primers.

Otimização dos “primers”desenvolvidos

As PCRs para testes dos primerssintetizados foram realizadas emvolumes totais de 13 ul, contendo:0,3 uM de cada primer, 1 unidadede Taq DNA polimerase, 0,2 mM decada dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,3,1,5 mM MgCl

2, DMSO 50% (1,3 ul)

e 7,5 ng do DNA. A reação deamplificação seguiu os seguintes

passos: 94 oC por 5 min, seguido de30 ciclos de 94 oC por 1 min, 54-62oC por 1 min, 72 oC por 1 min; e umaextensão final a 72 oC por 7 minu-tos. A temperatura de anelamentofoi otimizada para cada par deprimers. Os fragmentos amplifica-dos foram visualizados em géis deagarose a 3,5% de concentração,corados com brometo de etídio (Fi-gura 1).

Caracterização dos locos

Após a definição das tempera-turas de anelamento, foram analisa-das amostras de pimentão, feijão ecoco em gel de poliacrilamida a 4%,corado com nitrato de prata (Bassamet al., 1991). Para copaíba e jatobá,os primers foram marcados comfluorescência e as análises realiza-das em seqüenciador automático(ABI 377). Os programas GeneScane Genotyper foram utilizados paraessas análises. Para cada loco fo-ram observados o número de alelos(A) e a diversidade alélica ou hete-

rozigosidade h = 1- Σ pi2 (onde pié a freqüência do iésimo alelo). Ostamanhos dos fragmentos foram es-timados por comparação com pa-drões obtidos com DNA ladder 10-bp (Gibco BRL).

Resultados e Discussão

A eficiência do enriquecimento,da seleção por hibridização e daseleção de clones que continhamseqüências hipervariáveis por PCR-ancorado resultou na obtenção deum grande número de clones positi-vos a serem seqüenciados, evidenci-ando-se a abundância de elementosrepetitivos no genoma das espéciesanalisadas (Tabela 2). As bibliotecasenriquecidas foram hibridizadas coma sonda AG/TC, para detecção demicrossatélites e foram selecionados575 clones para pimentão, 286 parafeijão, 115 para coco, 270 para copaíbae 235 para jatobá. Após seleção porPCR-ancorado, 475 clones da biblio-teca de pimentão, 100 de feijão, 76 decoco, 156 de copaíba e 86 de jatobá


mostraram-se adequados ao seqüen-ciamento. Destes, 259 para pimen-tão, 28 para feijão, 43 para coco, 156para copaíba e 86 para jatobá mostra-ram-se adequados para o desenho deprimers (Tabela 1). Em vários casos,a limitada distância entre a seqüênciaflanqueadora e a região SSR mostrou-se insuficiente para o desenho dosprimers. A maioria dos SSRs detecta-dos continha repetições AG e TC,apesar de também terem sido detec-tados SSRs com repetições TA e CA.Os microssatélites variaram em com-primento, alguns tendo 40 repetiçõesperfeitas. Microssatélites que contêmrepetições AG/TC são comuns emvárias espécies de plantas (Gupta &Varshney, 2000), o que parece tam-bém ser o caso das espécies trabalha-das neste estudo.

Para a determinação da tempe-ratura ótima para cada par de primers,foram utilizadas amostras das espé-cies em estudo. Inicialmente, todosos primers foram testados com atemperatura de anelamento a 56oC.Essa temperatura foi então aumen-tada ou diminuída de acordo com oproduto gerado na PCR. A não am-plificação ou amplificação de ban-das fracas indicou a necessidade dereduzir a temperatura de anelamentodo primer. Por outro lado, a presen-ça de várias bandas indicou a ampli-ficação de produtos inespecíficos,tornando necessário o aumento datemperatura de anelamento.

Para pimentão, até o momento,118 tiveram as condições de PCRotimizadas e geraram produtos comboa resolução. Para feijão foramotimizados 25, para coco, 16, paracopaíba, 36 e para jatobá, 26 pares de“primers”.

Após otimização, para cada locofoi determinado o número de alelos(A) e a diversidade alélica (D) ouheterozigosidade (h). Essas estima-tivas foram calculadas utilizando-

se 48 indivíduos de pimentão, 85 defeijão e 96 de coco, jatobá e copaíba(Tabela 2).

Para pimentão, até o momento,foram caracterizados 51 locos, sen-do 3 monomórficos e 48 polimórfi-cos. A diversidade alélica foi de 0,3a 0,83 e o número de alelos variouentre 2 e 11, com uma média de,aproximadamente, 6 alelos por loco.Cerca de 48 % dos locos possuem 6ou mais alelos, o que os torna pro-

Figura 2. Seqüenciamento. A determinação da seqüência foi realizada a partir de fitasimples usando o kit “dye-terminator” em ABI Prism 377. Esta seqüência apresenta umSSR, com repetição (AAC)17 ao lado de uma repetição (AGC)8.

senolc,)sRSSmoc(sovitisopsenolc,CT/GAadnosamocsodazidirbihsenolcedsoremúN-1alebaT.seicépse5sadamuadacarapsodahnesedsremirpedesodaicnêüqes

eicépsEsenolC

sodazidirbihsovitisopsenolC

senolCsodaicneüqes

sremirPsodahnesed

muunnamucispaC 575 574 952 811siragluvsuloesahP 682 001 82 52

areficunsocoC 511 67 34 61iiffrodsgnolarefiapoC 072 651 651 54lirabruocaeanemyH 532 68 68 15

soremún,socifrómilopsremirpedoremún,)n(eicépseropsodasilanasoudívidniedoremúN.2alebaT.)h(acilélaedadisrevidede)A(ocolropsodacifilpmasolelaedsoidémesominím,somixám

eicépsE n sremirP A hmuunnamucicspaC 84 84 )06,5(11-2 )06,0(38,0-03,0siragluvsuloesahP 58 11 )10,7(01-3 )36,0(38,0-12,0

areficunsocoC 69 01 )52,8(41-2)86,0(78,0-74,0 a

)73,0(77,0-00,0 b

iiffrodsgnolarefiapoC 69 8 )25,42(72-91 )88,0(19,0-18,0lirabruocaeanemyH 69 8 )52,9(31-8 )67,0(28,0-27,0

a .)somagóla(setnagigsopitócesoarapsoditboserolaVb .)somagótua(seõnasopitócesoarapsoditboserolaV


missores para estudos de caracteri-zação de germoplasma e mapea-mento genético.

Para feijão, 25 locos foram ca-racterizados e 8 mostraram-se mo-nomórficos. Os outros 17 locos fo-ram caracterizados e amplificaramde 3 a 10 alelos por loco. A diversi-dade alélica variou de 0,21 a 0,83,com média de 0,63. Esses resulta-dos são um bom indicativo do altonível de polimorfismo dos locosSSR para essa espécie autógama edo potencial desses marcadores paraestudos genéticos de espécies cul-tivadas e silvestres de Phaseolus.

Para coco, dos 16 “primers”SSR testados, 3 mostraram-se mo-nomórficos e 3 não apresentaramresoluções de bandas satisfatórias.Para os demais 10 “primers”, foramdetectados de 2 a 14 alelos porloco, com uma média de 8,25. Aheterozigosidade variou de 0,47 a0,86, com uma média de 0,68, entreos ecótipos de gigante (alógamos),enquanto a diversidade gênica (h)variou de 0,00 a 0,77, com umamédia de 0,37 entre os ecótipos deanões (autógamos).

Para jatobá, foram escolhidosos 8 primers mais polimórficos paracaracterização dos locos SSRs. Foidetectada uma média de 9,25 alelospor loco e uma heterozigosidademédia de 0,76.

Para copaíba, utilizando-se os 8primers mais polimórficos com óti-ma resolução, foram observados de19 a 27 alelos por loco e heterozigo-sidade média de 0,88 (espécie pre-ferencialmente alógama). Esses mar-cadores permitiram a análise deta-lhada de parentesco, cuja magnitu-de da probabilidade de identidadecombinada foi de 1,1 x 1015 e opoder de exclusão combinado de99,9999%, evidenciando que essesmarcadores permitem estimar rela-ções precisas de parentesco em po-pulações naturais de copaíba.

Esses microssatélites, desenvol-vidos para as espécies tropicais estu-dadas, são de extrema importânciana obtenção de informações genéti-cas para dar suporte aos programasde melhoramento genético, coleta,conservação e manejo de recursosgenéticos vegetais.

Agradecimentos

Este trabalho teve o apoiofinanceiro do PRODETAB,

Programa Avança Brasil (MAPA) ePROBIO (MMA)


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Pesquisa

Biovidros

Elias da CostaCentro Interdisciplinar de Pesquisa ePós-Graduação – CIPP-UEPG

Lexandra NovakiDepartamento de Química – DEQUIM-UEPG

Hui I TsaiCentro Interdisciplinar de Pesquisa ePós-Graduação – CIPP-UEPG

Lara Tschopoko Pedroso PereiraDepto. de Engenharia de Alimentos, DEA-UEPG

André Vitor Chaves de AndradeDepto. de Física – DEFIS-UEPG

Carlos de Oliveira Paiva SantosInstituto de Química de AraraquaraUNESP , Físico-Química

Christiane Philippini Ferreira BorgesDepto. de Química – DEQUIM-UEPG

Mariza Boscacci MarquesDepto. de Química – DEQUIM-UEPG

Ariádne Cristiane Cabral da CruzCentro Interdisciplinar de Pesquisa e Pós-Graduação – CIPP-UEPG

Fábio André dos SantosCentro Interdisciplinar de Pesquisa ePós-Graduação – CIPP-UEPG

José Caetano Zurita da SilvaDepartamento de Química – [email protected]


Sinterização de biovidros na forma de partículas e do tipo espuma

Resumo

Vitrocerâmicas do sistemaNa

2O - CaO - P

2O

5 - SiO

2 têm bom

desempenho e biocompatibilida-de como material de implantes.Preparou-se um biovidro com com-posição 12% Na

2O - 28% CaO -

10% P2O

5 - 50% SiO

2 a partir de

óxidos puros via fusão, obtendo-se material não-cristalino com ca-racterísticas físicas e químicas ade-quadas. Amostras de biovidro fo-ram preparadas na forma de vi-dro-espuma (“Foam-Glass”) com-binando a matriz vítrea com oaditivo de B

4C. Essas amostras

sinterizadas no intervalo de tem-peraturas de 600 e 840°C apresen-taram baixa densidade e indica-ram evolução na fase cristalinacom presença de SiO

2, Ca

2P

2O

7,

Na2Ca

3 Si

6O

16, CaSiO

3 e uma quan-

tidade de material não cristalino.Ensaios “in-vitro em meio de SBFforam realizados com blocos debiovidro puro e levados a estufa a37ºC. Posteriormente ao ensaio,observou-se por microscopia ele-trônica de varredura (MEV) pe-quenos cristais na superfície dosblocos e dos pós, indicando ho-mogeneidade na superfície daamostra. A análise de MEV do“Foam-Glass” em SBF tambémapresentou camada de cristais nasua superfície indicando que omaterial tem característica de bio-atividade.

Introdução

Dentre os diversos biomateriaisdesenvolvidos, atualmente, existemos biovidros sintetizados para tercomportamento fisiológico específi-co como material constituinte deaparelhos protéticos ou como mate-rial de preenchimento para repara-ção de defeitos ósseos.

Diversas composições de bio-vidros foram preparadas porHench e colaboradores(1,2) à basede SiO

2 - Na

2O - CaO - P

2O

5, em

diferentes composições, e são co-nhecidas por serem particuladosaltamente bioativos, e têm sidousados em clínicas como preen-chedor ósseo de cavidades e comosubstituto de massa óssea perdidaem determinados traumas. Essesbiovidros são indutores de forma-ção de trabéculas, no osso emalgumas regiões, num período de2 a 7 dias, e de partes de osso quesão formados num maior períodode tempo(3). Entretanto, análisesqualitativa e quantitativa de en-saios in-vivo na geração de ossossão importantes para se estabele-cer a propriedade aloplástica domaterial de implante(4). Os biovi-dros à base de 45% SiO

2 -24,5%

Na2O -24,5% CaO - 6% P

2O

5 apre-

sentam bioatividade quando inse-ridos em meio aquoso, nos ensai-os in-vitro em fluido de corposimulado. Esses biovidros perdemíons sódio para o meio e formam


um filme superficial rico em SiO2,

o que provoca a formação de umacamada de gel de fosfato de cál-cio, inicialmente amorfo e quegradualmente evolui para uma ca-mada policristalina de aglomera-dos de apatita, os quais podem serincorporados a compostos orgâni-cos, por exemplo, no colágeno.Essa camada formada é importan-te para que o processo de dissolu-ção do vidro se estabilize, e pos-sibilite que processos físico-quí-micos ocorram e formem ligaçõesquímicas entre a superfície vítreae o tecido ósseo recém-formadona região de intervenção cirúrgi-ca(5). O fenômeno de osteogênesedirecionada por partículas de bio-vidros ativos com uma larga dis-tribuição granulométrica tem sidoexplicado por Scheppers et al(6). Atroca iônica interfacial entre aspartículas de biovidros e os flui-dos dos tecidos vizinhos resultamna formação de uma sílica gel, aqual é coberta rapidamente poruma camada rica em cálcio-fósfo-ro(7).

Recentemente, a cadeia desilicatos minerais como wollastonita(CaSiO

3) (8), e diopsida (CaMgSi

2O

6)

(9), têm sido preparados sintetica-mente para uso como materiaiscerâmicos bioativos. Inicialmente,a superfície cerâmica reage com ofluido fisiológico das vizinhanças,portanto, a natureza do sólido for-mado na superfície é determinadapela química da cerâmica e os cons-tituintes do fluido de corpo simula-do(10). Um novo processo de prepa-ração in-situ de cerâmicas bioativasporosas com porosidade interco-nectada em cerâmicas densas foidesenvolvido usando uma solidifi-cação lenta da composição eutéticado sistema CaSiO

3-Ca

3(PO

4)

2 que

são as chamadas cerâmicas bioeu-téticas, e possuem a habilidade dereestruturar sua morfologia quandoimersos em meio de fluido de corposimulado(11). O trabalho em estudotem aplicação na área de implantesdentais, onde biovidros e cerâmi-cas do sistema Na

2O-CaO-SiO

2-P

2O

5

apresentam uma boa bioatividade euma biocompatibilidade para usocomo material de preenchimentoósseo. O objetivo foi a preparaçãode um biovidro do tipo vidro-espu-ma, com a caracter ís t ica deosteocondução no interior dos po-ros do biovidro possibilitando, por-tanto, um crescimento ósseo e le-vando a uma melhor fixação domaterial na matriz óssea.

Materiais e Métodos

Preparação do pó do biovidroe moagem

Preparou-se uma mistura depó, com composição 12% Na

2O,

28% CaO, 10% P2O

5 e 50% SiO

2 em

peso, partiu-se de reagentes purose anidros: Na

2CO

3, CaO, Na

2HPO

4,

SiO2. Colocou-se o pó dentro de

um cadinho de platina e levou-separa fusão em um forno elétrico a1450°C por um período de 4 horas.Retirou-se rapidamente o fundidodo forno e colocou-se dentro deum recipiente contendo água des-tilada, assim formaram-se grânu-los de vidro não cristalino. Emseguida os grânulos foram tritura-dos em um jarro de polietilenocontendo cilindros de zircônia du-rante 6 horas.

Caracterização dos pós puros esinterizados

Os pós de biovidros foram ca-racterizados por fluorescência deraios X (FRX), difratometria de rai-os X (DRX), picnômetro de hélio,análise termogravimétrica (TG/DTA) e microscopia eletrônica devarredura (MEV-EDX).

Preparação do vidro-espuma(Foam-Glass)

A matriz vítrea foi misturada comdiferentes percentagens de aditivode B

4C, em moinhos de bolas de

zircônia por 6 horas, e em seguida omaterial foi peneirado e caracteriza-do física e quimicamente.

Compactação e sinterização

A sinterização de amostras debiovidro (BV) puro e biovidro +carbeto de boro (B

4C) foi realizada

em forno elétrico, no intervalo de600oC a 840°C por 2 horas paracada amostra.

Preparação de Solução deFluido de Corpo Simulado

(SBF)

A preparação de solução fisio-lógica bioativa foi realizada con-tendo os seguintes componentes:0,2 g KCl, 8,0 g NaCl, 0,2 g CaCl

2.2

H2O, 0,05 g NaH

2PO

4, 1,0 g NaHCO

3,

0,1 g MgCl2.6H

2O e 1,0 g de glicose

para 1000 mL de água.

Ensaios in-vitro em meio deSBF

Os blocos ou pós sinterizadosforam limpos e desengorduradosem ultra-som e lavados com águadeionizada, secos em estufa a 120oC,e tratados em autoclave. Os experi-mentos foram realizados em tubosde polipropileno de 15 mL cuidado-samente limpos, com tampa de ros-ca contendo 10 mL de solução emantidos a uma temperatura cons-tante de 37 oC em estufa elétrica. Asuperfície das amostras foi analisa-da em um microscópio eletrônicode varredura após os períodos de 3e 10 semanas de imersão no SBF.


A caracterização química porfluorescência de raios X mostra acomposição de: 26,1%CaO, 55,5%SiO

2, 13,1%Na

2O, 10,1%P

2O

5, indi-

cando que as partículas de biovidroem estudo estão situadas na faixade bioatividade, segundo o diagra-ma de fases(5).

Inicialmente o biovidro purofoi caracterizado por uma análisetermogravimétrica (TG/DTA) epode-se observar que temperaturade transição vítrea assim como astemperaturas de nucleação e de


Figura 3 - MEV de uma amostra deBiovidro + 3 % de B

4C.


4C.


4C.

cristalização apresentam-se na fai-xa de 680-800ºC, a partir destesdados pode-se arbitrar uma tempe-ratura para a sinterização dos biovi-dros tipo espuma em 750ºC. Porém,em análises realizadas em biovi-dros com outros tipos de aditivosverifica-se outras temperaturas denucleação e de cristalização. Por-tanto, a temperatura de sinterizaçãopara a obtenção do biovidro tipoespuma depende da natureza doaditivo a ser misturado.

As amostras sinterizadas foramcaracterizadas por DRX, os resulta-dos obtidos são apresentados naFigura 1. A análise de DRX

(SHIMADZU-XRD-6000) indica pou-ca evolução de fases cristalinas, ouseja apresenta uma extensa faixade material não-cristalino, isto édevido ao curto período desinterização. Os picos mostram fa-ses cristalinas bem distintas e níti-das de sílica em sua forma deCristobalita (SiO

2), fosfato de cálcio

(Ca2P

2O

7), silicato de cálcio (CaSiO

3)

e devitrita ( Na2Ca

3Si

6O

16). O

difratograma mostra também picosde boro em sua fase única, indican-do que nem todo boro reagiu coma massa do biovidro, porém a inten-sidade desse pico aumenta emamostras com maior teor de B

4C.

A composição elementar dosbiovidros sinterizados foi analisadaatravés de MEV-EDX como pode serobservado na Figura 2. Verifica-seque o biovidro não apresenta impu-rezas, sendo visualizados somenteos elementos formadores da compo-sição do material em estudo. Nestamesma análise o elemento Boro nãopode ser identificado, pois o apare-lho utilizado não possui detectorespecífico para esse elemento.

As micrografias obtidas pormicroscopia eletrônica de varredura(MEV) mostram as microestruturasporosas das amostras. Esses porospodem ser observados nas figuras 3,

Figura 1 - Difratograma de raios X de amostras de biovidro (BV) do tipoespuma, sinterizados a 750°C: A - BV + 7% de B

4C; B - BV + 5% de B

4C;

C - BV + 3% de B4C.

Figura 2 – EDX obtido de uma amostra de biovidro + 3 % de B4C.


4 e 5, e são interconectados e devários tamanhos. Esse fato não des-carta a hipótese destes biovidros pos-suírem poros fechados em sua estru-tura. O mecanismo de formação deporos na estrutura do biovidro podeser explicado pela evolução de ga-ses, os quais levam à formação debolhas deixando o material poroso.Como encontrado na literatura, algu-mas soluções aquosas de carbonatosde metais polivalentes são utilizadospara a produção destes materiaisporosos devido à sua fácil descarbo-nização(4), esse é um dos motivos doestudo do aditivo carbeto de boro nobiovidro. Outro mecanismo que podetambém ser responsável pela dimi-nuição da densidade do biovidro, é aentrada do elemento boro nas redescristalinas de silicatos e fosfatos fa-zendo com que essas estruturas sedeformem ocasionando aumento dovolume no material.

Outra característica que podeser analisada nas micrografias des-tas amostras é a alta densificaçãoobservada nas regiões em volta dosporos que, provavelmente, são de-vidas a regiões onde houve umamaior reação química com o boro, eo gás que se difundiu provocou ummaior empacotamento da matriz ví-trea e ao mesmo tempo expandindocom a formação de microporos.

Ensaios in-vitro de amostrassinterizadas indicam que o biovidropuro e biovidro contendo carbeto deboro apresentam uma camada su-perficial pouco cristalina, na formade fosfato de cálcio, a qual com opassar do tempo (envelhecimento)se tornam cristalinas. Análise porMEV-EDX da película indica a pre-sença de cálcio e fósforo na superfí-cie e verifica-se que está fortementeaderido em sua superficie.

Os biovidros produzidos foramtambém caracterizados quanto à suadensidade aparente usando picnô-metro de hélio, considerando-sesomente o volume do sólido e dosporos abertos, desconsiderando ovolume relativo aos poros fechados.Os dados obtidos estão relaciona-dos na tabela a seguir, Tabela 1:

Os dados da Tabela 1 são mui-to significativos, pois os valores dedensidade média obtidos variamem função da percentagem decarbeto de boro, indicando umamenor densidade para amostra com3% de carbeto de boro.

Conclusão

Após a análise dos resultadosobtidos, conclui-se que o biovidroproduzido do tipo espuma apresen-tou pouca evolução de fases e pode-se constatar que a mistura deaditivos ao biovidro provoca a for-mação de poros de tamanhos vari-ados e interconectados. Portanto, oobjetivo de se obter um biovidrotipo espuma foi alcançado obtendoestrutura microporosa pouco den-sa. Ensaios in-vitro das amostrasmostram que ocorre formação deuma película à base de fosfato decálcio na sua superfície indicandoque o material é bioativo.

Agradecimentos

Ao CNPq-PIBIC, FundaçãoAraucária e IQAr-UNESP.

Palavras-chave: Biovidros,vidro-espuma, bioatividade


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ordivoibedsartsomasadetnerapaedadisnededserolaV-1alebaT.oiléhedortemôncipmesaditbo

artsomA )3mc/g(edadisneDorobedotebrac%7+ordivoiB 34,1orobedotebrac%5+ordivoiB 83,1orobedotebrac%3+ordivoiB 62,1

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Pesquisa

Melhoramento Biotecnológicode Plantas Medicinais

Produção de alcalóides e óleos essenciais

Cláudio Lúcio Fernandes AmaralDoutor em Genética e Melhoramento pelaUniversidade Federal de Viçosa.Professor do Departamento de Ciências Biológicasda Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.Líder do Grupo de Pesquisa Biotecnologia, GenéticaVegetal e Melhoramento de Plantas. Membro doInstituto Baiano de Biotecnologia. Coordenador dePesquisa da Universidade Estadual do Sudoeste daBahia. Coordenador da Área de Genética daUniversidade Estadual do Sudoeste da [email protected]

Anderson Brito da SilvaEspecialista em Genética pela Universidade Estadualdo Sudoeste da Bahia. Professor do Departamentode Ciências Biológicas da Universidade Estadual doSudoeste da Bahia. Membro do Grupo de PesquisaBiotecnologia, Genética Vegetal e Melhoramento dePlantas, Membro da Área de Genética daUniversidade Estadual do Sudoeste da [email protected]


Introdução

A conversão das plantas e desuas partes, cujo valor medicinal te-nha sido confirmado pelas pesqui-sas, em fármacos para a populaçãoesbarra na dificuldade de se obtermatéria-prima na quantidade e quali-dade necessária para suprir a deman-da requerida pelo mercado nacionale internacional. Porém, não se cogitafazer uma incursão na já tão devasta-da natureza, pois, além dos danosecológicos que essas coletas poderi-am provocar, sem deixar de mencio-nar que diversas plantas já se extin-guiram e que várias outras se encon-tram ameaçadas de extinção, o con-trole qualitativo e quantitativo dosseus princípios ativos, seria muitodifícil, uma vez que existem varia-ções nos tipos e nos teores de subs-tâncias ativas, devido à interação dogenótipo com o meio ambiente. Des-te modo, recomenda-se o cultivo deplantas medicinais.

Para se ter uma produçãoconfiável de drogas terapêuticas comouma espécie recentemente adaptadaàs práticas de cultivo, faz-se necessá-rio acompanhar esse cultivo; sendoque, se se tratar de plantas anuais, otempo para o seu cultivo leva de 3 a5 anos, enquanto que se tratar deplantas perenes, de 10 a 12 anos. Emgeral, dos princípios ativos aos medi-camentos são gastos cerca de 10 a 15anos, com o custo entre 100 a 500milhões de dólares na elucidaçãoquímica, testes pré-clínicos e clíni-cos. Reconhecendo-se que uma plantaproduza 10g de massa seca e quenessas 10g se obtenha 0,3g da droga

isolada e que sejam necessários, paraatender ao mercado, 30kg dessa subs-tância, então será preciso 100.000plantas só nesse primeiro momento,o que se torna extremamentedispendioso. Uma possível soluçãopara esse problema é o fitomelhora-mento, que pode ser clássico oumoderno.

O melhoramento genético deplantas medicinais, apesar de estarem sua fase embrionária, tem conse-guido avanços; principalmente noque refere-se às plantas produtorasde alcalóides e óleos essenciais. Es-ses compostos são amplamente dis-tribuídos no reino vegetal. As famíli-as Apocynaceae, Euphorbiaceae eSolanaceae destacam-se como pro-dutoras de alcalóides; já as famíliasCompositae, Lamiaceae e Umbellife-rae apresentam-se como produtorasde óleos.

Melhoramento GenéticoClássico e Moderno

Os trabalhos que envolvem sele-ção de genótipos superiores, comsubsequentes cruzamentos, com vistasa obter híbridos ou cultivares, sãoincipientes. Com relação a composi-ção e conteúdo de moléculas terapêu-ticas, encontraram-se altas herdabili-dades para essas substâncias, o quefacilita o melhoramento por seleção.Por esse meio, têm, freqüentemente,sido desenvolvidas e produzidas emlarga escala cultivares de Achillea,Chamomilla, Lavandula, Melissa,Mentha e Thymus. Com vistas à produ-ção qualitativa e quantitativa de princí-pios ativos tem-se conseguido êxito


com a seleção de clones superiores(ex.: Artemisia annua - Artemisia) oucom a introdução de novos acessos(ex.: Chamomilla recutita - Camomila),seguidos de seleção e hibridação (ex.:Catharanthus roseus x Catharanthustrichophyllus). Entretanto, com relaçãoa diversificação estrutural e funcionaldos fitofármacos, pode ser que oshíbridos apresentem características iné-ditas às dos parentais (ex.: Menthaaquatica x Mentha longifolia).

A biotecnologia compõe-se ba-sicamente das seguintes tecnologias:biologia molecular, engenharia ge-nética, transformação genética e cul-tura de tecidos. A biologia molecularpermite identificar, isolar e caracteri-zar o gene de interesse. A engenhariagenética possibilita clivar, por meiode enzimas de restrição, seqüênciasnucleotídicas específicas de ácidosnucléicos pela geração de extremi-dades aderentes de fitas simples damolécula de DNA de uma espécieque se associam a fragmentos deDNA de outra espécie clivados poressas mesmas enzimas. O gene sele-cionado é inserido enzimaticamenteem um plasmídeo em particular deuma bactéria específica e, subseqüen-temente, introduzido por transfor-mação genética em uma célula vege-tal. Entretanto, torna-se necessárioregenerar a planta a partir da célulaque foi geneticamente modificada, oque pode ser feito por cultura detecidos. Assim, espera-se que o genepara o caráter almejado seja passado,através da reprodução sexuada eassexuada, dos parentais transforma-dos para as progênies que expressa-rão também esse gene, significandoque tal habilidade constitui valiosacontribuição para a obtenção rápida,segura e eficiente de fármacos.

Cultura de Tecidos eTransformação Genética

Cultura de tecidos é um proces-so, por meio do qual fragmentosvegetais ou suas partes denominadasexplantes são isolados dos organis-mos ou obtidos a partir destes, sendoassepticamente cultivados em meiode cultura apropriado sob condiçõesadequadas. Esse termo é genérico,referindo-se a cultura de células, te-

cidos, órgãos, embriões e plântulas.Essas técnicas consistem em selecio-nar explantes, desinfestá-los e cultivá-los em meio nutritivo mantido sobcondições assépticas, sendo a multi-plicação dos propágulos feita atravésde sucessivos subcultivos em meiopróprio. Os brotos desenvolvidos emum meio são transferidos a outromeio para formação das raízes, ob-tendo-se, assim, plantas inteiras. Es-sas são cultivadas no laboratório emsubstrato de aclimatação e, conse-qüentemente, levadas à casa de ve-getação antes de serem transferidaspara o campo definitivamente.

Entre as principais funções datécnica de cultura de tecidos cabe darênfase à produção de (a) clones (ex.:Aloe vera - Babosa), ou seja, materialhomogêneo e uniforme, em larga es-cala, de rápida propagação, livre depatógenos, vigoroso e produtivo; (b)híbridos, por hibridação somática, atra-vés de fusão de protoplastos (ex.:Nicotiana tabacum - Tabaco); (c)haplóides (ex.: Hyosciamus niger -Meimendro negro); (d) mutantes por-tadores de caracteres desejáveis, pormeio do uso de agentes mutagênicosou por variação somaclonal (ex.:Datura innoxia - Datura); (e) plantas-biorreatoras (ex.: Atropa belladonna -Beladona); (f) plantas geradoras devacinas (ex.: Solanum tuberosum -Batata); bem como (g) conservaçãode germoplasma vegetal por criopre-servação ou por manutenção do ma-terial vegetal, durante períodos pro-longados, sob condições limitantes decrescimento e desenvolvimento (ex.:Hyosciamus muticulus - Hiosciamus)e, finalmente, (h) biotransformaçãode compostos pouco interessantes emcompostos muito interessantes sob oaspecto econômico [ex.: Digitalislanata (Digitalis) e Digitalis purpurea(Dedaleira)].

A cultura de tecidos permite inter-ferir nas rotas metabólicas vegetaismediante o cultivo de plantas em meiopreparado com agentes estressantes,elicitores e mutagênicos, que afetamqualitativa e quantitativamente os prin-cípios ativos produzidos, e altera acomposição e/ou o teor, como foiobservado em Atropa belladonna(Beladona), Catharanthus roseus (Vin-ca) e Digitalis lanata (Digitalis) ou

Rosmarinus officinalis (Alecrim), Rutagraveolens (Arruda).

A cultura de células vegetais cons-titui uma fonte potencial de síntese demoléculas altamente valiosas às in-dústrias de alimentos, comésticos,fármacos e têxteis, as quais têm utili-zado as plantas como matéria-primabásica para seus produtos (Quadro 1).

Em cultura de células, podem-seproduzir metabólitos especiais compropriedades terapêuticas (Quadro 2).

Além disso, verificou-se que subs-tâncias que não são, usualmente, en-contradas em plantas foram identifi-

-ocamráfsotsopmoC-2ordauQetnemlamronsodizudorpsovita

satnalpsalep

saicnâtsbuS sailímaF

sediólaclA ,eaecanicopAeaecanaloS

sediónovalF eaecatuR

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anisorcipE acitpileaisorhcO

)9991(laramA:etnoF


cadas, isoladas e caracterizadas nessetipo de cultura in vitro. Soma-se a issoo fato de que foram obtidos, emcultura de células, compostos inteira-mente novos (Quadro 3).

Além de sintetizarem e acumula-rem metabólitos secundários designificância comercial, as células ve-getais podem ser usadas devido aapresentarem capacidade de realizarcertas alterações estruturais nesses com-postos. A biotransformação envolveprocessos bioquímicos de epoxidação,esterificação, glicosilação, hidroxilação,isomerização, oxidação, redução,saponificação, etc (Quadro 4).

Em geral, a produtividade decompostos fitoterapêuticos é menorem cultura de células se comparada ade tecidos sintetizadores nas plantas,o que provavelmente pode ser expli-cado pela perda da diferenciação detecidos e de órgãos das culturas desuspensão de células e de calos emmeio líquido. Acredita-se que issoseja devido à distribuição insuficien-te de enzimas necessárias para asíntese e ao acúmulo de metabólitossecundários ou, simplesmente, seriareflexo do estado de não totipotênciadas células desenvolvidas em taisculturas. Desse modo, os calos emfase de diferenciação de raízes deAtropa belladonna são capazes deproduzir atropina, enquanto os calosnão diferenciados não produzem. Poroutro lado, plantas inteiras de Coptisjaponica produzem 5% de berberinaem 5 ou 6 anos de cultivo, enquantosuspensão celular de linhagens não-selecionadas e selecionadas produ-zem, respectivamente, 5% e 13% des-sa substância em apenas 3 semanas,o que reflete em produção rápida eeconômica. Esse é um entre váriosoutros exemplos (Quadro 5).

A cultura de células mostra-sebastante promissora para a produçãode princípios ativos, apresentando,porém, alguns inconvenientes quelimitam seu uso, pois há compostosfármaco-ativos que só são produzi-dos em plantas intactas ou em teci-dos e órgãos, mas não em célulasisoladas. Tem-se, como exemplo,vimblastina e vincristina, obtidos deCatharanthus roseus. Nesse caso,pode-se induzir, a partir das célulasem cultura, a organogênese ou a

embriogênese somática de forma quea capacidade biosintética do vegetalseja restaurada.

A produção em larga escala demetabólitos secundários em cultura decélulas depende de algumas estratégi-as que tenham chance de se viabilizaremeconomicamente, e, entre elas, estão:

• Melhorar a estabilidade e aviabilidade da linhagem celu-lar, selecionando plantas comalta produtividade;• Selecionar meio de culturamais adequado para o máximocrescimento;• Minimizar a contaminaçãomicrobial;• Identificar rotas bioquímicasque levem as células da plantaà produção dos metabólitos de-sejáveis;• Estabelecer métodos para au-mentar a produção de metabólitossecundários;• Determinar meios para au-mentar a excreção de metabólitossecundários;• Estudar os mecanismosregulatórios associados;• Obtenção de produtos dascélulas em suspensão, viaexcreção natural ou induzida;

• Otimização da produção média;• Obtenção de extratos das cé-lulas organizadas quando elasmesmas forem utilizadas.

Diante do exposto, sugere-se umesquema básico que permita produzirprincípios ativos por meio de culturade células, para contornar alguns pro-blemas peculiares a esse sistema deprodução, o qual, em suma, segue osseguintes passos: seleção do materialvegetal, introdução “in vitro” de plan-tas altamente produtivas, indução decalos com separação de linhas celula-res estáveis, otimização das condiçõesde cultivo, re-seleção de linhas celula-res superiores, cultura em massa embiorreatores, isolamento e purificaçãodos metabólitos desejáveis e, final-mente, comercialização (Figura 1).

A produção de metabólitos espe-ciais com propriedades fitoterápicasem cultura de células diferenciadas(tecidos e órgãos) é mais previsível doque em células indiferenciadas (célu-las em suspensão e calos). A diferenci-ação associa-se, usualmente, a umamelhor produção qualitativa e quanti-tativa. O teor e a composição defitofármacos em órgãos, tais comoraízes, são comparáveis àqueles dasplantas intactas. Generalizando-se, tem-

alepsieváivetnemlaicremocsatnalpedsalulécedarutluC-4ordauQoãçamrofsnartoib

seicépsE seõçaeR sotartsbuS sotudorPavitassibannaC oãçadixO loinareG loreN

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)9991(laramA:etnoF

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seicépsE saicnâtsbuS )%(ovivnioãçudorP )%(ortivnioãçudorPsunimmurtcilaT anirebreB 08,0 00,1enirapamuilaG anoniuqartnA 34,0 00,02ailofirticadniroM anoniuqartnA 05,2 00,8

iemulbsueloC odicÁociníramsoR 06,3 00,5

mumrepsohtiLnozihrorhtyre aninociX 57,2 00,41

aiflowuaRanitnepres anielimoV 60,0 00,15

)9991(laramA:etnoF


se que raízes não transformadas apre-sentam crescimento lento, desenvolvi-mento retardado e menor produtivida-de de fitoterápicos, ao passo que raízestransformadas possuem crescimentorápido, desenvolvimento acelerado emaior produtividade de fitoterápicos(Quadro 6). As raízes não-transgêni-cas, ao contrário das transgênicas, ne-cessitam ser cultivadas em meio prepa-rado com substâncias reguladoras decrescimento. Cabe enfatizar que o usode raízes, transformadas ou não, élimitado àqueles biofármacos sinteti-zados somente em raízes. Entretanto,plantas inteiras podem ser regenera-das a partir dessas raízes.

A tecnologia transgênica ofereceenormes oportunidades para o me-lhoramento de plantas. Para manipu-lar o metabolismo produtor de princí-pios ativos nas plantas, têm sido feitosmuitos esforços. Não é fácil controlara produção dessas substâncias, atémesmo por meio de métodos molecu-lares sofisticados; devido a esses com-postos serem sintetizados em diver-sos passos enzimáticos que ocorremem vários tipos celulares.

A manipulação desse metabolis-mo pode-se dar por estímuloanabólico por meio da inclusão derotas metabólicas feita pela tecnolo-gia super-expressora , ou pordesestímulo catabólico por meio daexclusão de vias feita pela tecnologiasupressora-senso ou supressora anti-senso. Um dos pré-requisitos para osucesso da manipulação genética éidentificar, isolar e caracterizar osgenes envolvidos na biossíntese deprincípios ativos e o outro pré-requi-sito é compreender os mecanismosde regulação espaço-temporal des-ses genes em fases distintas de cres-cimento e desenvolvimento vegetal.Concomitantemente, faz-se necessá-rio desenvolver protocolo de regene-ração e de transformação. Embora,isso nem sempre seja possível, al-gum progresso tem sido, recente-mente, alcançado. Esse avanço en-volve duas categorias: cultura de ór-gãos transformados e plantas trans-gênicas.

Em cultura de células, suspen-sões celulares podem passar por cres-cimento em larga escala em biorrea-tores, usando-se, para tal fim, linhas

celulares superiores,isto é, estáveis e comalta produção em de-trimento de linhas ce-lulares inferiores, ouseja, instáveis e combaixa produção. Essetipo de cultura podeser manipulado su-plementando-se oseu meio com elicito-res, tais como: prepa-rações fúngicas; o queé exemplificado porTagetes patula, cujacultura de células pro-duziu, ao ser subme-tida a extratos dePhytophthora sp., ní-veis significativos depolienos. Contudo,em cultura de célu-las, instabilidade ebaixa produtividade é regra e estabi-lidade e alta produtividade é exce-ção. Além disto, verificou-se, nessetipo de cultura, compostos que nãosão, usualmente, encontrados emplantas, como os tarenosídeos emGardenia jasminoides.

Há substâncias terapêuticas quenão são produzidas em cultura decélulas, mas só em órgãos e emcultura destes, ou em plantas intei-ras, a exemplo dos alcalóidesvimblastina e vincristina, encontra-dos em Catharanthus roseus.

A cultura de órgãos não transfor-mados apresenta produção estável emédia, com crescimento lento, menorramificação lateral e meio acrescidocom reguladores de crescimento; aopasso que a cultura de órgãos transfor-mados possui produção estável e alta,com crescimento rápido, maior ramifi-cação lateral e meio não acrescido comreguladores de crescimento.

Brotos tumorados como os deMentha citrata são menos usados queas raízes em cabeleira como as deScopolia japonica, pois é mais fácilestabelecer raízes do que brotos emcultura em meio líquido. A cultura deórgãos não é manipulada como acultura de células, ao se alterarem ascondições do meio. Entretanto, a adi-ção de chitosan elevou a produção dehiosciamina em Hyosciamus multicus.

Cabe enfatizar que, em se tra-tando de viabilidade comercial daprodução de princípios ativos, deve-se considerar não apenas a produtivi-dade, mas também a liberação dosprincípios ativos no meio de cultivo,no sentido de se colherem os com-postos fitoterápicos sem danificar oudestruir o material biológico que osproduz. Em Duboisia leichhardtii,75% de escopolamina é liberado nomeio em 4 semanas. Todavia, háprodutos, como os fitocomplexos,

edarutlucmesoirádnucessotilóbatemedetnedecxeoãçudorP-6ordauQsadamrofsnart-oãnsezíaredamocadarapmocsadamrofsnartsezíar

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annodallebaportA animalopocsE %73,0animaicsoiH %59,0

muinomartsarutaD animalopocsE %65,0animaicsoiH %03,0

acinopajailapocS animalopocsE %05,0animaicsoiH %03,1

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que não são obtidos em órgãos, po-rém só em plantas intactas.

Estudos que envolvam plantastransgênicas regeneradas a partir deórgãos transformados são escassos.Em plantas medicinais transformadaspor Agrobacterium spp. tem-se, prefe-rencialmente, usado a Agrobacteriumrhizogenes para transformar aquelascujos princípios ativos se encontramem suas partes subterrâneas, como ahiosciamina nas raízes de Ajuga reptanse a Agrobacterium tumefaciens paratransformar aquelas cujos princípiosativos se encontram em suas partesaéreas, como a artemisinina nas folhasde Artemisia annua. Entretanto, essacondição não constitui uma regra, oque significa que esses sistemas po-dem ser usados independentementedo local de síntese dos compostosfarmacoativos nos vegetais, o que temsido verificado em Catharanthusroseus. No que tange aos princípiosativos, a transformação pode levar àprodução acentuada ou atenuada.

Em plantas medicinais, há exem-plos de ganhos obtidos pelatecnologia transgênica, quais sejam:no que se refere a plantas produtorasde alcalóides, tem-se em Atropabelladonna a conversão de hioscia-mina, pela enzima hiosciamina 6βhidroxilase, cujo gene é oriundo deHyosciamus niger, em escopolamina.Já no tocante às plantas produtorasde isoprenóides, tem-se em Menthaspicata a conversão de limoneno,pela enzima limoneno 3 hidroxilase,cujo gene é oriundo de Menthapiperita, em Mentol.

Há, também, exemplos de perdasobtidas pela tecnologia transgênica, asquais se tem, no que diz respeito àsplantas produtoras de isoprenóides, aredução dos teores de glicirrizina, tan-to em Glycyrrhiza glabra quanto emGlycyrrhiza uralensis.

Atualmente, vem-se tentandotransformar outros caracteres de plan-tas medicinais que não a produtivida-de, como é o caso da resistência.Transferiu-se para Atropa belladonnao gene bar, que codifica para enzimafosfinotricina acetil transferase, a qualconfere resistência ao herbicidafosfinotricina. O problema é que, aoinvés de uma correlação positiva, obte-ve-se uma correlação negativa entre a

produtividade e a resistência; resultan-do em plantas resistentes com menosprincípios ativos e em plantas suscep-tíveis, com mais princípios ativos.

Conclusões

As possibilidades de obterem-senovas moléculas terapêuticas destina-das à produção de fármacos tornam abiotecnologia imprescindível ao de-senvolvimento técnico-científico dosprogramas de melhoramento genéticodo país, e tem como conseqüência amelhoria na qualidade de vida, princi-palmente na área da saúde da popula-ção brasileira. Portanto, diversos avan-ços foram alcançados e vários desafiostêm sido subjulgados; mas, decerto, háainda bastante para se fazer em setratando de biotecnologia no melhora-mento de medicinais.


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Pesquisa

Degradação Seletivade Proteínas e suas

Implicações no Câncer

Humberto Miguel GarayAluno de Doutorado do Programa de Farmacologiado Instituto de Ciências Biomédicas - USP

Juliano AlvesAluno de Doutorado do Programa de Farmacologiado Instituto de Ciências Biomédicas - USP

João Marcelo OchiucciAluno de Iniciação Científica do Depto. deFarmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas - USP

José Ernesto BelizárioProfessor Assistente do Depto. de Farmacologiado Instituto de Ciências Biomédicas - [email protected]


Papel do sistema ubiquitina-proteasoma e enzimas caspases

As proteínas são responsáveispela forma e pela função das células.Elas são sintetizadas e destruídas pormecanismos distintos em resposta auma diversidade de sinais externos einternos, que incluem a secreção dehormônios e a restrição alimentar. Adegradação de proteínas determina oinício ou o término de eventos bio-químicos que controlam a prolifera-ção, a diferenciação e a morte celularpor apoptose. Por esse motivo, oaumento de suscetibilidade ou deresistência à degradação pode levarao ganho ou à perda de atividadebiológica de proteínas, influencian-do diretamente nos processos queelas estão envolvidas. Os cientistas jáidentificaram dezenas de proteínasque se tornaram oncogênicas (isto é:provocaram a transformação celular)após sofrerem modificações em se-qüências, domínios e regiões quecontrolam a sua estabilidade ou des-truição. Elucidar os mecanismosmoleculares pelos quais as proteínasaumentam sua suscetibilidade ou suaresistência à degradação é o grandedesafio da biologia contemporâneapós-genoma. As pesquisas nessa áreatêm por objetivo não apenas enten-der como as proteínas são destruídas,mas quando falhas nesse processodão origem a células imortais, isto é,ao câncer. Neste artigo serão revisa-dos, primeiramente, os recentes avan-ços na elucidação das bases bioquí-micas e genéticas que são envolvidasna transformação de uma célula nor-mal em célula tumoral. Em seguida,serão revisadas as recentes desco-bertas sobre os mecanismos bioquí-micos de reconhecimento e de de-gradação de proteínas intracelularespela via ubiquitina-proteasoma e a

importância dos aminoácidos prolina,ácido glutâmico, serina e treonina(região PEST) como sinais para de-gradação rápida de certas proteínas.Finalmente, será discutida a utiliza-ção de bancos de dados de genomahumano e de proteoma - em constru-ção, e como os programas de compu-tador para armazenamento, manipu-lação e mineração de seqüência degenes provenientes de amostras detecido tumoral, poderão ajudar oscientistas, principalmente os bioin-formatas, na descoberta de novosoncogenes e métodos de prevençãoe tratamento do câncer.

1. Biologia da CélulaTumoral

Nas últimas décadas, com a in-trodução de novas tecnologias deseqüenciamento do DNA, expressãoe análise computacional de genes, foipossível que se vislumbrassem váriaspistas que poderão levar a um me-lhor entendimento da biologia dacélula tumoral. O câncer é considera-do uma doença genética - isto é, elepode ser transmitido para uma célulanormal através da transferência degenes tumorais ou oncogenes (Hahn& Weinberg, 2002). Oncogenes sãocópias de genes normais que sofre-ram mutações, e dessa forma, quan-do transcritos, provocam a síntese deproteínas que apresentam perda ouganho de função biológica. Mutaçõessão causadas por modificações nasbases de DNA, em particular, nasposições O6 e N7 da guanina. Acarcinogênese é um processo quepode ser dividido em três fases: inici-ação, promoção e progressão, e podedurar de 1 a 30 anos. Durante esse


tempo, ocorre um acúmulo de muta-ções no genoma celular, em especial,em genes que garantem a ordem doseventos do ciclo celular e a mitose,ou executam reparo de eventuaiserros na replicação do DNA, ou ain-da, que promovem e mantêm o esta-do de diferenciação celular (Hanaham& Weinberg, 2000, Hahn & Weinberg,2002).

Na maioria dos casos, osoncogenes capazes de induzir a trans-formação celular funcionam aos pa-res, e seus produtos são fatores decrescimento, receptores da mem-brana plasmática, fatores de trans-crição e enzimas quinases de vias desinalização intracelular implicadasno controle positivo ou negativo dociclo celular (Hanaham & Weinberg,2000, Evan & Vousden, 2001). Emgeral, as mutações encontradas emoncogenes alteram os nucleotídeos,os quais codificam os aminoácidosde importância crítica para sua ati-vação ou o arranjo tridimensionalda sua estrutura molecular. A defor-mação de elementos estruturais im-pede que a proteína estabeleçainterações proteína-proteína e pro-teína-DNA e, conseqüentemente,exerça adequadamente a sua funçãobiológica. Por exemplo, formasmutantes da proteína RAS permane-cem constantemente ativadas devi-do à substituição de um aminoácidoindispensável na interação RAS-GAP.GAP é uma proteína que estimula ahidrólise de GTP, uma molécula queativa RAS. A estimulação contínuada cascata de enzimas serina-treonina-quinases: Raf-MEK-ERK-MAPK, induzida pela forma mutantede RAS, faz com que os eventosbioquímicos de controle positivo dociclo celular tornem-se constantes ea proliferação celular ininterrupta(Hahn & Weinberg, 2002).

Por outro lado, as deleções deéxons em genes, ou ainda, o seusilenciamento (metilação das basesnitrogenadas), são ocorrências co-muns em genes que codificam osfatores supressores de tumor queatuam no controle negativo do ciclocelular. Nesse caso, a desregulaçãode crescimento e divisão celularacontece porque a célula deixa dechecar os erros e as falhas que pro-vocariam bloqueio no ciclo celular,reparo no DNA e indução de morte

celular por apoptose. O exemplomais estudado é o gene que codificao fator supressor de tumores chama-do p53, cuja função principal é atranscrição de genes de reparo e daapoptose (Hanahan & Weinberg,2000, Evan & Vousden, 2001).

Recentemente houve uma ex-plosão de trabalhos que mostraramvias alternativas de estimulação daproliferação celular e indução de cân-cer. Os novos oncogenes identifica-dos têm papel no reparo do DNA,apoptose, reconhecimento célula-cé-lula, mecanismo de adesão célula-matriz extracelular, angiogênese,metástase e degradação de proteí-nas. O que chamou maior atençãodos investigadores foi a descobertaque para a tranformação de célulashumanas é necessário ativação detelomerase, o que causa a suaimortalilzação, e a inativação das viasdo p53 e RB (Hahn & Weinberg,2002).

2. O Ciclo Celular

O crescimento e a divisão celu-lar de células somáticas dependemde uma série complexa de reaçõesbioquímicas que ocorrem em umperíodo de 24 a 48 horas, denomina-do ciclo celular. O ciclo celular com-preende os processos de duplicaçãodo DNA e divisão nuclear (mitose), edele resulta a produção de uma novacélula. Para iniciar um ciclo, a célulaem repouso (fase Go) precisa serestimulada por fatores de crescimen-to (exemplos, PDGF, EGF, insulina),hormônios esteróides e citocinas pro-duzidas por elas mesmas ou célulasao seu redor. Esses fatores ligam-seaos seus receptores de membrana,deflagrando uma série de reaçõesquímicas que causam, em última ins-tância, a ativação de fatores de trans-crição (exemplos: c-myc, c-jun, c-fos), os quais promovem a síntese deRNA, mensageiros de dezenas deenzimas que promovem a síntese doácido deoxiribonucléico (DNA), taiscomo diidrofolato redutase, DNApolimerases e topoisomerases. Essacascata de eventos químicos e morfo-lógicos ocorre de uma maneira orde-nada e sucessiva, fazendo com que acélula avance da fase Go para asfases G1-S-G2 e para a mitose(Malumbres & Barbacid, 2001).

A execução das reações e doseventos de cada fase do ciclo celularé mediada por dezenas de fatores,cuja síntese e destruição ocorrem emmomentos determinados. Os princi-pais são os seguintes: ciclinas A, B eD, enzimas quinases dependentes deciclinas: CDK-1, 2, 4 e 6, fosfatases:cdc-25 A, B e C, proteínas inibidorasde CDKs: p21, p27, p57, p16, p18, efatores de transcrição: c-myc, E2F, Rbe p53. Os complexos formados porCDK/ciclina/inibidor de CDK são ina-tivos e a sua ativação requer elimina-ção, por degradação, do inibidor deCDK associado a ele (por exemplo:p21, p27), um evento que ocorredurante as transições de fases. Aativação dos complexos CDK-4/ciclina D, CDK-4/ciclina-6, CDK-2/ciclina A, CDK-2/ciclina E aumenta aatividade quinase dessas enzimas eprovoca a fosforilação progressiva deRB. Isto causa a dissociação do com-plexo E2F/RB, permitindo que E2Finicie a transcrição de genes da faseS. Mais tarde, a ativação do complexoCDK-1/ciclina B promove a fosforila-ção de várias proteínas nucleares, acondensação dos cromossomas, aformação do fuso e o início da mitose.A atividade enzimática do complexocessa após a degradação da ciclina B,e esse evento marca o fim do ciclocelular (Malumbres & Barbacid, 2001).(Figura 1)

As reações e eventos do ciclocelular são interrompidos em mo-mentos específicos nas transições dasfases Go/G1 (ponto de restrição R1),fases G1/S e G2/mitose. Durante es-ses períodos críticos denominados“pontos de checagem”, a célula deci-de se inicia o ciclo (ponto de restri-ção R1) ou se avança para a faseseguinte, continuando o processo deproliferação, ou se sai do ciclo, inici-ando o processo de diferenciaçãocelular, se estiver passando pelamitose, ou ainda, entra em apoptose.

Esse mecanismo de checagem édependente de reações em cascatasmediada por enzimas quinases efosfatases. Os exemplos mais estuda-dos de vias de checagem e de reparosão: a via ATM, a via Chk1/Chk2 e avia cdc-25/14-3-3. Em resposta àativação de uma dessas vias, sãosintetizadas as enzimas que fazemreparo, recombinação, junção ou per-mutação de nucleotídeos e que estão


envolvidas nos processos de reco-nhecimento e de correção de erros efalhas no DNA em síntese. São exem-plos importantes a GADD45, poli-(ADP-ribose) polimerase (PARP),MSH2 e MLH1. Na maioria das vezes,a ativação das vias de checagem éiniciada pelo fator supressor de tu-mores p53, que atua na transcriçãode dezenas de genes, incluíndo ogene da proteína p21. A p21 bloqueiao ciclo celular e inibe a atividade deenzimas CDKs, que são responsáveispelo controle positivo do ciclo celu-lar. O bloqueio do ciclo celular étransiente e precisamente regulado(Malumbres & Barbacid, 2001,Hoeijmakers, 2001, Hahn & Weinberg,2002).

Estudos recentes mostraram quea degradação de várias proteínas re-guladoras do ciclo celular, em espe-cial as proteínas p21, p27, ciclinas Ae B, Rb, E2F, MDM2 e p53, é mediadapelo sistema ubiquitina-proteasoma,caso a decisão seja a proliferaçãocelular; e pela família caspase de

enzimas proteases, caso a decisãoseja a apoptose. Como era lógicopressupor, esse mecanismo deregulação mostrou também que podeser alterado em células neoplásicaspara impedir a deflagração dos sinaisque ativam a apoptose. Vários exem-plos serão apresentados nesse textoem favor dessa hipótese.

3. A morte celular porapoptose

A morte celular programada ouapoptose é um processo fisiológicode morte celular pelos quais as célu-las que perderam suas funções ouapresentam defeitos são eliminadasdo organismo. Durante a embriogê-nese, a morte por apoptose de célu-las embrionárias precursoras é es-sencial para o acabamento final deórgãos e membros. Além disso, aapoptose atua na seleção e depleçãode clones de células do sistemaimunológico e de células em exces-so, deixando em perfeito equilíbrio

as populações de células dos tecidosdurante a vida adulta dos mamíferos(Earnshaw et al., 1999). Desta forma,estão implicadas em muitas doençasaberrações genéticas que alteram oprocesso da apoptose, incluindo-seaí o câncer, as doenças auto-imunes,doenças cardiovasculares e neuro-degenerativas.

Vários oncogenes que causam,em células malignas, desregulaçãono seu ciclo celular atuam ora esti-mulando, ora inibindo a apoptose,dependendo do estágio de desenvol-vimento do tumor (Evan & Vousden,2001). Mutações oncogênicas, quelevam ao aumento da expressão dosgenes c-myc, E2F, E1A (proteína viral)e Ras, ou à perda da expressão dogene Rb, desencadeiam a apoptose.Mas esse fenômeno não é aparenteem populações de células malignasporque elas contêm mutações queinativam os oncogenes p53 e MDM2,ou mutações que aumentem a ex-pressão de genes Bcl-2, ou ainda,mutações que acarretem a produçãoexcessiva dos fatores de crescimen-to: IGF-1, PDGF, NGF e IL-3. A liga-ção desses fatores de crescimentoaos seus receptores provoca a ativa-ção da cascata de enzimas, quinases,entre elas, a fosfoinositol-3-quinase(IP3), Ras, Raf e a proteína serina-treonina quinase B/Akt, como tam-bém a do fator de transcrição NF-kB.Esses fatores atuam em reações ouvias de sobrevivência e resistência àapoptose (Evan & Vousden, 2001).

Em vários estudos ficou eviden-ciado que as células, quando enfren-tam situações fisiológicas e patológi-cas adversas, tais como, infecção pormicroorganismos, estresse oxidativoe outras formas moderadas de injú-ria, somente permanecem vivas se osefeitos pró-apoptóticos gerados nes-sas situações forem contrabalancea-dos pelos efeitos anti-apoptóticos,mediados pelas vias de sobrevivên-cia. Esse mecanismo de sinalizaçãodual exerce um papel chave no con-trole da proliferação e morte celular(Evan & Littlewood, 1998). Assim,para o processo de proliferação tersucesso, é preciso que a célula ativeas duas vias de sinalização: a desobrevivência, que atua suprimindoa maquinaria da apoptose, e a deproliferação, que desencadeia o cres-cimento celular. Esta intercomunica-

Figura 1 - Esquema representativo mostrando as interações entre as proteínas das viasde sinalização de controle positivo e negativo do ciclo celular. Notar no esquema quedurante as transições (pontos de checagem) das fases Go, G1, S, G2 e Mitose, a ativaçãodestas proteínas reguladoras é dependente da fosforilação/defosforilação mediada porenzimas quinases e fosfatases, enquanto a inativação é mediada pelo sistemaproteasoma que degradada seletivamente proteínas marcadas com ubiquitina.


ção entre ciclo celular e a apoptose ésem dúvida o fator determinante nasvariações de sensibilidade à apopto-se entre as células tumorais. Estesuposto sistema regulador tem servi-do como base estrutural para unir agenética e a terapia do câncer.

A apoptose é caracterizada poreventos morfológicos e bioquímicosque ocorrem de uma forma ordenadana célula em degeneração. Esses even-tos são regulados por genes preser-vados em vários organismos, incluí-das leveduras, parasitas, plantas einsetos. Mais de 200 genes já foramidentificados e classificados com baseem domínios específicos, como exem-plos: DED, DD e CARD (Aravind &Koonin, 2001). Essas seqüências con-servadas de aminoácidos estão rela-cionadas com a função específicaque a proteína exerce no processo,como, por exemplo: ligante, recep-tor, adaptador, inibidor, protease,quinase, etc. Os estudos de cristalo-grafia, ressonância magnética nucle-ar e difração de raios X têm mostradoem detalhe como os complexos pa-drões de interação entre essas prote-ínas, através de seus diferentes domí-nios, atuam nas vias de sinalizaçãopositiva e negativa da apoptose (Fesik,2000).

A apoptose é desencadeada porduas vias principais. Na primeira via,o sinal vem do lado externo e por issoé denominada via extrínseca. Na se-gunda, o sinal vem de dentro dacélula, e por isso é denominada viaintrínseca. A via extrínseca é iniciadaatravés da ativação de receptores demembrana, denominados receptoresde morte celular. A via intrínseca éiniciada pela liberação de fatoresmitocondriais. Em ambos os casos, oresultado imediato é a ativação deenzimas proteases da família caspase(Figura 2).

As caspases são expressas naforma de pró-enzimas (ou zimógeno)e podem ter uma massa molecularentre 30-60 kDa. A clivagem desseprecursor ocorre pela ação de umacaspase iniciadora, que cliva a prote-ína em duas regiões específicas, paragerar uma subunidade grande de 20kDa (cadeia α externa) e uma peque-na de 10 kDa (cadeia β interna). Aforma ativa da enzima possui duassubunidades grandes e duas peque-nas, i.e., um tetrâmero α1β1β2α2

, en-

tre as quais formam-se os dois sítiosativos da enzima (Earnshaw et al.,1999).

As caspases foram divididas emtrês grupos com base na função queelas exercem no processo. No grupoI, estão incluídas as caspases pró-inflamatórias: caspases -1, -4, -5 e -13, envolvidas no processamento ena geração das citocinas IL-1 e IL-18.No grupo II, as caspases iniciadoras:-2, -8, -9 e -10, atuam na iniciação dacascata de ativação das caspases exe-cutoras -3, -6 e -7. Essas caspasesfazem parte do grupo III e são res-ponsáveis pela clivagem de dezenasde proteínas vitais ao metabolismo eà estrutura da célula (Earnshaw et al.,1999).

As caspases também foram clas-sificadas em relação à especificidade

na clivagem de peptídeos sintéticosem testes in vitro (Thornberry et al.,1997, Garcia-Calvo et al., 1998). Se-gundo esses estudos, o grupo I éformado pelas caspases -1, -4 e -5,que são as enzimas que têm prefe-rência pela seqüência WEHD. Opeptídeo DExD é reconhecido pelascaspases -3, -7 e -2, os principaismembros do grupo II. O grupo III éformado pelas caspases -6, -8 e -9,enzimas que clivam preferencialmen-te peptídeos que contenham a se-qüência (LV)ExD. Hoje sabemos queseqüências adjacentes ao sítio decaspases, tanto à direita como à es-querda, também influenciam naclivagem do substrato, como serádiscutido abaixo.

A ativação das caspases inicia-doras -8, -2 e -10 inicia-se com a

Figura 2 - Esquema representativo das vias de sinalização da apoptose e a ativação emcascata das caspases iniciadoras (2, 8, 9, 10) e efetoras (3, 6, 7) que causam a degradaçãode proteínas intracelulares. A via extrínseca de ativação da apoptose ocorre com ainteração de citocinas aos seus receptores de membrana e conseqüente ativação dacaspase-8, 2 ou 10. Na via intrínseca, os eventos químicos e físicos mediados pelaproteínas da família BCL-2/BAX provoca a liberação do citocromo c, que provoca aativação da caspase-9. Na quadra da direita são apresentados os símbolos querepresentam os principais domínios ou “motifs” das proteínas envolvidas na apoptose.


ligação das citocinas da família TNF,Fas ou TRAIL aos seus receptores demembrana, identificados pelas si-glas: TNFR1, Fas, DR-3, DR-4 ou DR-5 (Ashkenazi & Dixit, 1998). Essesreceptores contêm, em sua estruturapolipeptídica, o domínio DD (deathdomain), que permite sua associa-ção às proteínas adaptoras FADD eTRADD, que também possuem do-mínio DD. Esse complexo, por suavez, interage com a pró-caspase-8através do domínio DED (deatheffector domain), para juntos forma-rem um complexo supramoleculardenominado apoptosoma. Dentrodesta estrutura multimérica, ocorrea aproximação e a oligomerizaçãode moléculas de pró-caspase-8, asquais promovem sua clivagem e ati-vação. Uma vez ativa, a caspase-8inicia a cascata de ativação das pró-caspases executoras; caspases -3, -6e -7.

A ativação de caspases pela viaintrínseca requer a liberação docitocromo c armazenado nas mito-côndrias (Adams & Cory, 2001). Asaída de citocromo c é dependentede uma série de eventos elétricos equímicos, sendo os mais estudados:a queda do potencial de transição depermeabilidade iônica, abertura demegaporos e a ruptura pontual deuma região da membrana externa.Esses eventos são modulados pelainteração de proteínas inibidoras deapoptose da família Bcl-2 (principaismembros: Bcl-2-W, Bcl-xl, MCL-1) epor proteínas indutoras de apoptoseda família Bax (principais membros:Bad, Bid e Bak), capazes de interagircom elementos estruturais da mem-brana externa das mitocôndrias,como, por exemplo, as porinas quesão poros de transição de permeabi-lidade para várias moléculas, incluí-das a H

20 e Ca2+. Essa classificação

em indutoras ou supressoras temcomo base a presença do domínioBH, que é dividido em BH-1, -2, -3 e-4. Esses domínios provocam a ho-modimerização de moléculas simila-res e a formação de poros quepermeiam a passagem do citocromoc da mitocôndria para o citosol. Poroutro lado, a formação de heterodí-meros do tipo Bcl-2/Bax evita a for-mação dessa estrutura e, conseqüen-temente, a morte celular (Adams &Cory, 2001).

No citoplasma, as moléculas decitocromo c interagem, via domínioCARD, com os complexos formadospela pró-caspase-9 e Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1). A união dessas proteínas formaum apoptosoma de aproximadamente700 kDa, permitindo a aproximaçãoe a oligomerização de moléculas depró-caspase-9 e sua auto-clivagem eativação. A caspase-9 livre poderecrutar e ativar as caspasesexecutoras -3, -6 e -7 e as caspasesiniciadoras -8,-2 e -10.

Encontradas nos diversos com-partimentos celulares, as caspasesexecutoras podem atuar sobre as pro-teínas estruturais, proteínas de sina-lização, fatores de transcrição e vári-as enzimas envolvidas na síntese ereparo do RNA e DNA. Na tabela I,estão apresentadas algumas das de-zenas de proteínas-substrato decaspases. Segundo uma revisão re-cente, o número de proteínassubstratos de caspases é de aproxi-madamente 280 proteínas (Fischer etal., 2003). A função e os efeitoscausados à célula após a clivagemforam também sumarizados no arti-go. Em vários casos, a clivagem resul-ta na inativação das proteínas, mashá também outros casos em que aproteína clivada é ativada. Um exem-plo em que a clivagem resulta naativação é o da ativação da própriacaspase. Um outro exemplo é o daproteína ICAD/DFF45 (Enari et al.,1998), um inibidor da nuclease CAD(caspase activated deoxyribonuclea-se), a enzima responsável pela frag-mentação do DNA durante a apopto-se. Em células não apoptóticas, CADestá presente como um complexoinativo com ICAD (inhibitor of caspaseactivated deoxyribonuclease). Apósa indução da apoptose, ICAD éinativada pelas caspases -3 e -7, dei-xando CAD livre para funcionar comouma nuclease.

As caspases clivam várias prote-ínas envolvidas na regulação docitoesqueleto, incluindo gelsolina,fodrina, Gas-2, proteína quinase deadesão focal (FAK), proteína quinasep21, isoformas da proteína quinase Ce MEKK-1. A destruição da rede demicrotúbulos provoca o arredonda-mento e o deslocamento da célula dotecido. Várias alterações típicas namorfologia do núcleo apoptótico são

dependentes da ação da caspase-6, acaspase que degrada as lâminas A, Be C do envoltório nuclear. O rompi-mento dessa estrutura parece facilitaro acesso e degradação das fitas deDNA na região internucleosomal pelanuclease CAD.

A clivagem de substratos decaspases ocorre de uma maneira tem-po- dependente e pode anteceder ouproceder à morte por apoptose. Con-tudo, ainda não se sabe ao certo se aclivagem de uma proteína-chave po-deria servir de catalisador do proces-so, i.e., o processo não se desencade-aria sem a sua degradação. Váriaslinhas de evidências mostraram quea apoptose de células que encontra-ram defeitos ou erros na replicaçãodo DNA durante a proliferação édependente da degradação da Rb,fatores inibidores de CDK, p21 e p27e da proteína MDM2, um inibidor daatividade de p53 (Levkau et al., 1998,Belizário et al., 1991, Belizário et al.,1999, Hiesh et al., 1999). Este postu-lado foi confirmado em alguns estu-dos com mutantes das proteínasMDM2 e Rb, nos quais os aminoáci-dos DEVD - o sítio preferencial declivagem pela caspase-3 - foram subs-tituídos por aminoácidos neutros.Como era esperado, na ausência dedegradação dessas proteínas, as cé-lulas resistiram à apoptose induzidapor vários agentes fisiológicos e far-macológicos (Tan et al., 1997, Fattmanet al., 2001). Não há, entretanto,evidências de que uma pressão sele-tiva na população de células malig-nas de um tecido tumoral produzacélulas cujas proteínas apresentemmutações em sítios de clivagem deenzimas caspases como um fenôme-no geral de resistência à apoptose.

4. O sistema ubiquitina-proteasoma

O sistema ubiquitina-proteaso-ma é responsável pela degradaçãode proteínas intracelulares, cuja or-ganização genética e funcional estápreservada em certas bactérias, le-veduras e organismos multicelula-res. Na célula, a proteólise é essen-cial não apenas para a eliminaçãoseletiva de proteínas defeituosas,como também de proteínas que atu-am como reguladores de processosbioquímicos, tais como a prolifera-


ção, diferenciação, biogênese deorganelas, resposta imunológica einflamatória (Ciechanover, 1998,Weissman, 1997, Goldberg et al.,2001). Doenças genéticas, neurode-generativas e tumores malignos sãoinduzidos quando certos componen-tes desse sistema de degradaçãoestão ausentes ou desregulados(Ciechanover, 1998).

Diferentemente do processo dedegradação mediado por proteasespresentes nos lisossomas, a degrada-ção de proteínas por esse sistemarequer a energia de ATP e envolvedois passos distintos e sucessivos.No primeiro passo, uma proteínachamada ubiquitina, de peso mole-cular de 8.5 kDa, é covalentementeadicionada à proteína-alvo. No se-gundo, a proteína-alvo é degradadaapós ser desenovelada e fragmenta-da ao atravessar uma estrutura emforma cilíndrica oca denominadaproteasoma (Figura 3).

O proteasoma é constituído deuma parte central que contém 4unidades que formam um anel, sen-do que cada anel é formado por 7cadeias α e 7 cadeias β distintas.Essa estrutura pode ser representa-da pela fórmula α1−7β1−7β1−7α1−7. Ocoeficiente de sedimentação doproteasoma é igual a 20S. As subuni-dades β possuem atividade proteo-lítica e, dessa forma, atuam direta-mente na degradação de proteínas.Essas proteases têm especificidadedistintas; a primeira possui ativida-de similar à tripsina, a segunda simi-lar à quimiotripsina e a terceira,similar à glutamil peptidil hidrolases.Durante a resposta imunológica, osistema ubiquitina-proteasoma é ati-vado pelo interferon-γ. Essa citocinainduz a síntese de três subunidadeβ, LMP2, LMP7 and MECL-1, quefavorecem a geração de peptídeosda classe I do sistema histocompati-bilidade humana (MHS).

Nas extremidades inferior e su-perior dessa estrutura de 20S, estãoacopladas duas estruturas regulado-ras de massa molecular igual a 19S.Essas unidades contêm enzimasATPases, que promovem o desnove-lamento das proteínas que sofrerama degradação. A união dessas trêsestruturas 19S-20S-19S dá origem aum complexo supramolecular de co-eficiente de sedimentação 26S e,

aproximadamente, 1500-2000 kDa(Weissman, 1997, Ciechanover,1998).

A conjugação da ubiquitina aosubstrato é feita em um mecanismode três etapas e requer a participa-ção de três classes de enzimas deno-minadas E1, E2 e E3. Primeiro, amolécula de glicina da porção C-terminal da ubiquitina forma umaligação tio-éster com o resíduo decisteína da enzima ativadora de ubi-quitina E1. Essa reação requer ahidrólise de ATP. Até o momento,apenas uma enzima E1 de 117 kDafoi identificada no genoma humano.Em seguida, a ubiquitina ativada étransferida para uma enzima conju-gadora de ubiquitina ou E2, tambémconhecidas por UBCs (ubiquitin-conjugating enzymes). Mais de 25genes de E2 estão presentes nogenoma humano. Em seguida, a E2transfere a ubiquitina para umaenzima ubiquitina ligase ou E3(Ubiquitin-protein ligases). As E3ligam-se ao substrato de uma manei-ra específica e promovem a transfe-rência da ubiquitina da E2 para ogrupamento ε-amino de uma lisinana proteína-susbtrato. Reações su-

cessivas podem ocorrer, levando àformação de substrato com cadeiaslineares ou de múltiplas seqüênciasde ubiquitina (Weissman, 1997,Ciechanover, 1998).

A família de enzimas E3 ligasesé a mais abundante na célula huma-na; são mais de 600 genes preditos;entretanto, até o momento, somen-te cinco classes principais foramdescri tas (Ciechanover, 1998,Joazeiro & Weissman 2000). Emgeral, as E3s são identificadas pelapresença dos domínios Ringer Finger(RF), F-box e WD40, que atuam norecrutamento e na apresentação deproteínas-substrato ao proteasoma(Ciechanover, 1998, Vodermaier,2001). Ao contrário do que se pen-sava, as E3 ligases podem reconhe-cer mais de uma proteína, inclusiveproteínas não ubiquitinadas.

No primeiro grupo, estão asenzimas da família E3α/E3β. EssasE3 reconhecem proteínas que con-tenham na porção N-terminal umaminoácido básico (exemplo: Arg,Lys, His) ou um aminoácidohidrofóbico volumoso (exemplo:Phe, Leu, Trp, Tyr, Ile). Essa regra dereconhecimento é denominada “N-

Figura 3 - Esquema representativo mostrando as etapas de ubiquitinação e reconhec-imento de uma proteína-substrato pelas enzimas E1, E2 e E3. As proteínas ubiquitina-das são degradadas ao passarem por dentro do proteasoma por enzimas proteolíticasespecíficas, gerando peptídeos entre 7-12 aminoácidos.


end rule” ou regra do aminoácido N-terminal (Varshavky, 1992).

O segundo grupo de enzimasE3 tem como membro principal aproteína E6-AP (E6 associatedoncoprotein), que foi identificadaem um complexo formado com aproteína E6 do papiloma vírus. Ocomplexo recruta e promove a de-gradação da proteína p53. A degra-dação de p53 também é promovidapela E3 denominada MDM2 (veradiante). Essas proteínas, emborade tamanho variados, apresentamum domínio comum na porçãocarboxi-terminal denominado HECT(homology to the E6-AP carboxylterminus). Um grande número deproteínas com o domínio HECT jáfoi identificado.

O terceiro grupo de E3 ligasesatuam na degradação de proteínasenvolvidas no controle da entrada esaída da mitose. Alguns exemplos desubstratos dessas E3 ligases são asciclinas A e B, securina, cdc5, cdc6,entre outras. A E3 mais estudadanesse grupo é o complexo denomi-nado ciclosoma (C) ou APC (anaphasepromoting complex). O complexopode ter até 10 subunidades (exem-plos: cdc16, 20, 26, 27, Apc4, 5, 6)cuja síntese e degradação ocorre deuma maneira dependente dos even-tos do ciclo celular (Zacharia &Nasmyth, 1999).

O grupo quatro tem como exem-plo mais estudado o complexo “Skp-1-cullin-F-Box” ou SCF (Pray et al.,2002). A parte central do complexoé formado pelas proteínas Cul1(culina 1) e Roc1 (proteína “Ringerfinger”) e Skp1. A Skp1 é um dosmembros da família de proteínas F-Box. Essas proteínas ligam-se espe-cificamente às proteínas-substratosde E3 ligase. As E3 ligases da famíliaSCF atuam na degradação de com-ponentes do ciclo celular que con-trolam a transição G1/S. Entre elesestão os inibidores de enzimas CDKs,p21 e p27, e as ciclinas A e E. Emgeral, essas proteínas são fosforiladaspelos complexos CDK/ciclina antesde serem reconhecidas pelas prote-ínas F-Box do complexo E3 (King etal., 1996). Recentemente foi demons-trado que o complexo SCF tambémpode participar na ubiquitinação dasproteínas β-catenina e IkB (Winstonet al., 1999).

O quinto grupo de E3 possuivários membros cuja característicaprincipal é a presença do domíno“Ring Finger” (RF). O domínio RF,definido como uma seqüência linearde extensão e estrutura variável,que pode ser representada pela se-guinte fórmula: Cx2Cx(9-39)Cx(1-3)Hx(2-3)C/Hx2Cx(4-48)Cx2C, ondeC corresponde aos resíduos decisteína e H aos resíduos de histina,e X a qualquer outro aminoácido. Aprincipal propriedade química daregião RF é a captura de duas molé-culas de zinco. Não obstante, a mai-oria das proteínas com domínio RFapresenta atividade E3 e auxilia natransferência de ubiquitina de umamolécula E2 para a proteína-substrato (Joazeiro & Weissman,2000; Freemont, 2000). Exemplos demoléculas E3 com domínio RF são asproteínas MDM2, BRCA e Siah-1.Um outro exemplo de proteína comdomínio RF e atividade E3 é a proteí-na VHL, responsável pela síndromevon Hippel Lindau (pVHL). A pro-teína VHL pode se associar àselonginas B, C e culina2, dandoorigem ao complexo VBC, que temas mesmas características dos com-plexos APC e SCF.

Survivin, XIAP-1, IAP-1 e c-IAP-2 fazem parte da família IAPs(inhibitor-of-apoptosis), que atuamcomo inibidores da ativação dasenzimas caspases, e que tambémapresentam, na porção C-terminal, odomínio RF (Deveraux & Reed, 1999).Além disso, essas proteínas são iden-tificadas por apresentarem, na porçãoN-terminal, uma seqüência de amino-ácidos chamada de domínio BIR. Odomínio BIR é representado pela ex-pressão: Cx2Cx6Wx3Dx5Hx6C. A pre-sença de resíduos de cisteína ehistidina pressupõe uma possívelestrutura ligadora de zinco, mas nãose sabe ao certo se outras proprieda-des do domínio BIR seriam responsá-veis pela inibição da atividade enzi-mática das caspases. Por outro lado,está bem estabelecido que o domínioRF tem papel no processo deubiquitinação de várias caspases(Huang et al., 2000; Joazeiro &Weissman, 2000). A ubiquitinação éuma evidência experimental que su-gere a degradação de caspases viaubquitina-proteasoma, mas isto ain-da não foi amplamente estudado.

5. A degradação seletica deproteínas e suas

implicações no câncer

A falha na ubiquitinação e con-seqüente ausência de degradaçãopelo sistema ubiquitina-proteasomapode modificar a atividade de pro-oncogenes e facilitar o desenvolvi-mento de tumores malignos. Muta-ções e deleções que interferem nadegradação foram encontrados nosseguintes pro-oncogenes: β-catenina,p53, c-Jun, E2F, ciclinas A, B, D e E ep27 (Loda et al., 1997, Rubinfeld etal., 1997, Gstaiger et al., 2001).

A proteína β-catenina é um doscomponentes de uma via de sinaliza-ção que promove a ativação dosfatores de transcrição LEF e TCF.Esses fatores atuam na proliferaçãode linfócitos T, e, em particular, naindução da síntese dos genes daciclina D e c-myc. Foi verificado quecertas mutações na β-catenina au-menta sua estabilidade e o tempo desinalização de proliferação celular nacélula mutante. A estabilidade daproteína β-catenina também é modi-ficada por mutações encontradas emum outro gene que participa dessavia de sinalização, o gene APC(adenomatous polyposis coli). O APCé um fator supressor de tumores etem papel chave na indução depolipose e adenoma do cóloninstestinal (Fodde et al., 2001). Alémdisso, a mutação de β-catenina tam-bém interrompe a via de sinalizaçãoda proliferação mediada pela E-caderina da membrana celular e dasproteínas da matriz extracelular(Rubinfeld et al., 1997).

Recentemente descobriu-se quea agressidade de carcinoma do cólonretal, carcinoma da mama e carcino-ma da próstata está associada ao au-mento da degradação da p27, o inibidorde CDKs que controla o ciclo celular(Loda et al., 1997). O mecanismo peloqual isto acontece ainda não está bemdefinido, mas estudos recentes mos-traram que a proteína Skp2, uma F-box proteína, envolvida no reconhe-cimento da proteína p27, parece terum papel chave na oncogênese(Gstaiger et al., 2001). GSTAIGER ecolaboradores mostraram que o genedessa proteína é superexpressado emdisplasias da epiderme e no carcino-ma epitelial da boca. Mais importante


ainda, eles mostraram que fibroblastosnormais, que expressam os genes H-Ras mutados, e o Skp2, adquiriram aspropriedades biológicas de uma célu-la tumoral nos testes in vitro e in vivo.Quando essas células eram injetadasem camundongos nude, observou-setambém a rápida formação de tumo-res malignos (Gstaiger et al., 2001).

Em aproximadamente 90% doscânceres da cervix é detectada aexpressão das proteínas E6 e E7 depapiloma vírus tipos 16 e 18 (Evan &Voudsden, 2001). Como discutido,as proteínas E6 são homólogas a umaclasse de proteínas E3, denominadaE6-AP, as quais atuam no recruta-mento e ubiquitinação da p53. Aprodução excessiva de proteína E6em células infectadas pelo papilomae a subseqüente degradação de p53,via ubiquitina-proteasoma, são even-tos iniciais na transformação tumoralmediada por esses vírus (Huibregtseet al., 1995).

Várias proteínas E3, incluindoMDM2, BRCA, Siah-1, Cb1 e PML,foram envolvidas direta ou indireta-mente na transformação celular(Freemont, 2000). Foi observado queuma mutação pontual no domínio RFda BRCA1 – uma proteína envolvidano reparo do DNA, predispõe as mu-lheres portadoras desta mutação aocâncer de mama e de ovário (Baer &Ludwig, 2002). Outro exemplo é aproteína VHL, responsável pelasíndrome von Hippel Lindau. Muta-ções no gene da VHL bloqueiam suaação E3, responsável pela inativaçãodo fator HIP (hipoxia inducing factor).Com o aumento de estabilidade doHIP, é possível o desenvolvimento decertos tumores malignos em indivídu-os portadores dessa síndrome (Tyers& Jorgensen, 2000).

Survivina, uma E3 da família IAPde inibidores de caspases, parece terum papel relevante na indução decâncer. Foi observado que sua ex-pressão é aumentada na transiçãoG2/M do ciclo celular quando ela seliga aos fusos de microtúbulos doaparato mitótico. Esta associação pre-vine a apoptose induzida pelo taxol.Sabe-se também que a superexpres-são de IAP é um marcador de prog-nóstico ruim de evolução da doençasem pacientes portadores de neuro-blastoma, cânceres do colo uterino egástrico (Deveraux & Reed, 1998).

6. A região PEST como umsinal que promove adegradação rápida de

proteínas

Além da ubiquitinação, a pre-sença de certas regiões e seqüênciasna estrutura primária das proteínaspode funcionar como um sinal quedefine o seu tempo de meia-vidadentro da célula. Várias seqüênciasde aminoácidos foram identificadascomo “sinais proteolíticos” para adegradação por enzimas lisosomais(exemplo, catepsina), calpainas e sis-tema ubiquitina-proteasoma (Dice,1990, Rechsteiner & Rogers, 1996).

Correlacionando as taxas de de-gradação de dezenas de proteínas eas suas seqüências de aminoácidos,ROGERS, WELLS e RECHSTEINER(1986) mostraram que as proteínas,com um tempo médio de degradaçãoinferior a 2 horas, apresentam umgrupo conservado de aminoácidos.Essa região, que pode ter de 10 a 50aminoácidos, é rica em prolina (P),ácido glutâmico (E), serina (S) etreonina (T), e flanqueada na extre-midade N e C-terminal, por umaminoácido positivo, como a arginina,

lisina ou histidina. A região PEST,como foi chamada, tem um número ea ordem de aminoácidos variável,bem como a sua extensão (Figura 4).Ela pode estar presente 5 vezes emuma proteína de 300 aminoácidos.Devido às características químicasdesses aminoácidos de carga negati-va, a região PEST aumenta a retençãode moléculas de H

20 e íons Ca2+

(Rechsteiner & Rogers, 1996). Alémdisso, os aminoácidos serina etreonina das proteínas contendo aregião PEST são alvos de fosforilaçãopor várias enzimas quinases. Comoas regiões PEST nunca são seqüênci-as repetitivas e idênticas, acredita-seque a estrutura secundária, em formade laço (loop), sirva como local deligação de outras proteínas ouenzimas, em particular, E3 ligases,mas isto ainda não foi definido.

Após essa descoberta, váriosgrupos mostraram que a deleção oua substituição de aminoácidos daregião PEST aumenta a estabilidadeda proteína, isto é, impede a suarápida degradação. Em geral, afunção biológica da proteína sem oPEST é dramaticamente aumentada(Rechsteiner & Rogers, 1996).

Figura 4 - Diagrama representativo de uma região PEST. Nesta seqüência aleatória deaminoácidos estão intercalados os aminoácidos designados pelos seus símbolos alfabéti-cos citados ou figuras representativas (– , + , • ). As proteínas MCL1, caspase-9 e IF116Bsão exemplos de proteínas que apresentam regiões PEST com um índice PEST indicado.


A região PEST está presente emvárias proteínas diretamente envol-vidas na etiologia do câncer. Exem-plos mais relevantes são MYC, RAS,FOS, JUN, PTEN, p53, EIA, ciclinas A,B, inibidores de CDKs, p21 e p27, β-catenina e NF-kB (Rechsteiner &Rogers, 1996).

A PTEN é um fator supressor detumores, cujo gene aparece deletadoou mutado em gliomas e cânceres doendométrio. A proteína PTEN atuacomo enzima fosfatase e, sob suaação, o fosfolípideo PIP

3 (fosfoinosi-

tol-3-fosfato) é desfosforilado, tornan-do-se inativo. O PIP

3 atua na ativação

da enzima quinase B (PKB), maisconhecida por Akt. A Akt exerce umafunção anti-apoptótica, promovendoa fosforilação e inativação da caspase-9 e BAD, um dos membros da famíliaBAX de proteínas pró-apoptóticas(Cardone et al., 1998). Mutações nogene PTEN, que causam gliomas ecâncer do endométrio, geralmenteocorrem na região PEST. A oncogêne-se, nesse caso, é, em parte, produzidapela produção excessiva de PIP3 (fos-foinositol) e a ativação contínua da via

Akt de sobrevivência celular. De fato,estudos de mutações sítio-dirigidasmostram que a ausência da regiãoPEST provoca a desestabilização daestrutura secundária da proteína ecompromete sua atividade enzimática(Georgescu et al., 1999).

7. A região PEST e o sítiode clivagem de enzimas

caspases

Através da consulta de vários ban-cos de dados do genoma humano(exemplo: National Center ForBiotecnology Information, NCBI) e ouso do programa PESTFind (Rechsteiner& Rogers, 1996) e um programa similardesenvolvido em nosso laboratório re-alizamos um estudo para identificar apresença da região PEST dentro dosítio de clivagem em uma amostragemde proteínas-substrato de enzimascaspases. A motivação para este estu-do veio de uma descoberta inicial feitadurante a análise da presença de re-gião PEST na família de enzimascaspases. Nesse grupo particular deproteínas notou-se que o sítio de

clivagem (exemplo; DEVD) encontra-va-se dentro da região PEST em 10 deum total de 12 enzimas caspases ana-lisadas. Desta forma, a hipótese é queo sítio de reconhecimento de caspasenão seja de apenas 4 aminoácidos, masuma região estendida de 20 a 30 ami-noácidos, i.e., a região PEST.

Em seguida, foram analisadastodas as proteínas-substrato decaspases descritas na literatura. Nes-se grupo de 144 proteínas, a presen-ça do sítio de clivagem dentro daregião de PEST foi detectada em 63%(90/144) da amostragem de proteí-nas. No restante, 37% (54/144) dasproteínas-substrato de caspases, osítio de clivagem foi encontrado emum local distante da região PEST(Tabela 1). Estas proteínas foramagrupadas em 8 categorias, de acor-do com as funções que exercem emdiferentes processos biológicos comoapoptose, ciclo celular, doenças neu-rodegenerativas, ou localização celu-lar (Tabela 1). Algumas dessas prote-ínas foram identificadas no quadro.Elas podem atuar como citocinas,receptores de membrana, fatores de

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sairogetacsartuO1-PSARG,esaPTA-oicláC,56PSARG,APMArotpecer,edadisocilG-O,82AP 3 5 9

siatoT 09 45 441snegatnecroP %36 %73 %001


transcrição, enzimas quinases, prote-ases, proteínas do citoesqueleto,citoplasmáticas, nucleares, e váriasoutras funções não especificadas.

A presença do sítio de clivagemde caspases dentro da região PESTdeve ter uma finalidade biológica queainda não se conhece. Uma hipótese éque essa região determinaria a degra-dação rápida da proteína pela via ubi-quitina-proteasoma. De fato, estudosjá mostraram que as IAP funcionamcomo E3 ligases, promovendo a ubi-quitinação de caspases (Huang et al.,2000). Estudos em andamento no nos-so laboratório mostraram que a substi-tuição de certos aminoácidos (S199A,T201A) da região PEST da caspase-7impedem a sua autoativação. É possí-vel, portanto, que a região PEST funci-one como um sítio de regulação deativação de caspase. Possivelmente, oPEST funcionaria como um elementoestrutural de reconhecimento que in-duz a ativação intra ou intermolecularda proforma da enzima.

Em resumo, os dados apresenta-dos nesse estudo revelaram váriaspistas ou hipóteses a serem confirma-das através de trabalhos de bancadaque envolvem a mutação sítio-dirigidade genes e a produção de proteínasmodificadas para realização de ensai-os funcionais. Acredita-se que essesensaios possam revelar fatos impor-tantes sobre o potencial oncogênico

das proteínas que contenham regiõesPEST ainda não reveladas em estudosconvencionais de investigação cientí-fica (Figura 5). Ressalte-se que existeuma predição de que, pelo menos,um terço das proteínas codificadaspelo genoma humano, isto é, 10 milproteínas de um universo de 30 milproteínas possuam regiões PEST(Rechsteiner & Rogers, 1996).

8. Perspectivas

Os bancos de dados gerados porseqüenciamento de genes provenien-tes de tecido normal e tumoral sãoexelentes provedores de informaçõespara os estudos que visem à análise depossíveis alterações funcionais de pro-teínas devido a defeitos nos mecanis-mos que levam à sua destruição. Estaanálise tem sido facilitada pelo conhe-cimento de sítios, regiões e seqüênciasde reconhecimento de degradação deproteínas, bem como pela identifica-ção de dezenas de famílias de proteí-nas e enzimas envolvidas nos diferen-tes processos de proteólise via ubiqui-tina-proteasoma e a proteólise media-da por enzimas caspases. A identifica-ção destas modificações poderia aju-dar a predizer falhas nas interaçõescom os elementos da maquinaria dedegradação celular; desenvolver estra-tégias de inibição ou de ativação dosprocessos; e, finalmente, propor novas

alternativas profiláticas e terapêuticas.Entender a origem e a progres-

são do câncer através da análise deseqüências, regiões e domínios naestrutura das proteínas que servemde sinalização e reconhecimento parasua degradação é o grande desafio domomento. Para vencer esse desafio épreciso ter a cooperação de váriosgrupos de cientistas especializadosem seqüenciamento e clonagem degenes, expressão de proteínas re-combinantes e, em especial, a coo-peração de uma nova classe de pes-quisador, o bioinformata, cuja princi-pal ferramenta é o computador. Cabea esse profissional a análise de con-juntos de dados em grande escala e aformulação de hipóteses que serãoexecutadas por seus colegas. Essaforma inovadora de pesquisa é deci-siva para entender a biologia da célu-la em toda a sua complexidade.


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Figura 5. O esquema mostra possíveis etapas na regulação da proliferação e morte celularque quando alteradas por degradação seletiva e inapropriada, ou, a ausência dedegradação, pode levar a produção de proteínas oncogênicas. Uma condição específicaque pode levar as estas disfunções é a alteração por mutações ou deleção de aminoácidosda região PEST, um elemento chave para o reconhecimento e eliminação de proteínasoncogênicas pelas enzimas caspases e sistema ubiquitina-proteasoma.


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Pesquisa

Archaea: Potencial Biotecnológico

Utilização e aplicação de arqueas na biotecnologia

Alexander Machado CardosoDepartamento de Bioquímica Médica,Instituto de Ciências Biomédicas, [email protected]

Maysa B. Mandetta ClementinoDepartamento de Microbiologia, Instituto Nacionalde Controle de Qualidade em Saúde, [email protected]

Orlando Bonifácio MartinsDepartamento de Bioquímica Médica,Instituto de Ciências Biomédicas, [email protected]

Ricardo Pilz VieiraDepartamento de Biologia Marinha,Instituto de Biologia, [email protected]

Rodrigo Volcan AlmeidaPrograma de Engenharia Química,COPPE, [email protected]

Sylvia M. Campbell AlqueresDepartamento de Bioquímica Médica, Instituto deCiências Biomédicas, [email protected]

Welington Inácio de AlmeidaDepartamento de Bioquímica Médica,Instituto de Ciências Biomédicas, [email protected]


1. Introdução

O domínio Archaea é formadoprincipalmente por organismosextremofílicos, isto é, microrganismosque não apenas toleram, mas crescemotimamente em ambientes normalmen-te considerados inóspitos para a vida,como fontes termais, águas extrema-mente salgadas, temperaturas baixas econdições extremas de pH. Pode-sedizer que certas espécies de arqueasdefinem claramente os limites de tole-rância biológica nos extremos físicos equímicos da vida. O estudo dos micror-ganismos provenientes desses ambi-entes extremos pode nos fornecer in-formações valiosas acerca da origemda vida na Terra, bem como das estra-tégias adaptativas aos ambientes ondeesta prosperou (Woese, 1998).

A adaptação de organismos aesses ambientes obrigou-os a desen-volver componentes celulares e estra-tégias bioquímicas para sua sobrevi-vência. Por outro lado, devido àscaracterísticas “exóticas” que têm, eàs suas propriedades únicas, essesmicrorganismos geram bioprodutosque podem ser empregados em con-dições drásticas, que freqüentementeocorrem em processos industriais. Oscomponentes moleculares deles reti-rados possuem muitas vezes proprie-dades que os tornam especialmenteadequados para serem utilizados nes-ses processos. Nesse contexto, é hojegeralmente aceito que esses micror-ganismos constituem um preciosorepositório de moléculas de interesseindustrial e um excelente recurso parao desenvolvimento de novas aplica-ções biotecnológicas.

Os benefícios científicos espera-dos de um conhecimento maior dabiologia das arqueas incluem, entreoutros, a compreensão das funçõesexercidas por esses organismos nosambientes aquáticos e terrestres, bemcomo suas interações com outros com-ponentes da biodiversidade. Os bene-fícios econômicos e estratégicos estãorelacionados com a descoberta de mi-crorganismos potencialmente explo-ráveis nos processos biotecnológicospara obtenção de agentes terapêuti-cos, probióticos, produtos químicos,enzimas e polímeros para aplicaçõesindustriais e tecnológicas, biorremedi-ação e biolixiviação de poluentes erecuperação de minérios. Outros be-nefícios incluem a otimização da capa-cidade microbiana para processamen-to de alimentos, tratamento e/ouremediação de resíduos (esgoto do-méstico e lixo). Embora ainda nãosejam totalmente conhecidas as estra-tégias moleculares para sua sobrevi-vência em tais ambientes inóspitos,sabe-se que esses organismos possu-em enzimas adaptadas a tais ambien-tes, e isso desperta o interesse tantoacadêmico quanto industrial.

2. Filogenia e Fisiologia

Há cerca de vinte anos, CarlWoese e colaboradores sugeriramque os organismos vivos fossemclassificados em três grupos princi-pais: Archaea, Bacteria e Eukarya,com base no estudo das seqüênciasdas moléculas do gene 16S do RNAribossomal (16S rRNA). Esses gru-pos são chamados de domínios eacredita-se que surgiram através de


.soinímodsêrtsoertnesiatnemadnufsaçnerefiD:1alebaT

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vias evolutivas distintas a partir deum ancestral comum. A noção dedicotomia da vida entre eucariontese procariontes, que ainda domina abiologia e influencia, em particular,a percepção sobre o domínioArchaea, está sendo lentamente re-vista por grupos atuantes emmicrobiologia. A diversidade e abiologia das arqueas representamuma enorme contribuição à compre-ensão da Ecologia Microbiana(Woese et al., 1990).

O domínio Archaea consiste detrês divisões: Crenarchaeota, quecontém as arqueas hipertermofílicasredutoras de enxofre; Euryarchaeota,que compreende uma grande diver-sidade de organismos, incluídas asespécies metanogênicas, as halofílicasextremas e algumas espécieshipertermofílicas; e Korarchaeota,uma divisão descrita mais recente-mente, que engloba organismos hi-pertermofílicos pouco conhecidos,identificados a partir de seqüênciasdo gene 16S do rRNA isolados defontes termais terrestres, porém ain-da não cultivados em laboratório.

Após serem divididos os trêsgrandes domínios a partir do seqüen-ciamento do 16S rRNA, estudos sub-seqüentes mostraram que cada do-mínio está associado a uma série defenótipos. Alguns desses fenótipos

são únicos de cada domínio, enquan-to outros são compartilhados entredois ou até entre todos os três domí-nios, como pode ser observado naTabela 1.

3. Ambientes extremos

Os primeiros organismos identi-ficados pertencentes ao domínioArchaea viviam em ambientes extre-mos de temperatura, salinidade ouacidez, sugerindo que a preferênciapor tais hábitats, era um traço carac-terístico do grupo. Estudos mais re-centes mostraram várias eubactériase organismos eucarióticos que sobre-vivem também em ambientes extre-mos, como observaram igualmente apresença de arqueas em ambientesmais amenos, demonstrando, dessaforma, a contribuição desse grupo nabiomassa global (Forterre, 1997). En-tretanto, as arqueas parecem ser osúnicos organismos descobertos até opresente momento que podem so-breviver a temperaturas acima de95ºC, e o fenótipo hipertermofílicosó é encontrado nesse domínio davida. Uma outra característica exclu-siva de Archaea é o metabolismometanogênico: não se conhecemeubactérias nem eucariotos capazesde produzir metano como resíduo deseu metabolismo.

O hábitat das arqueas halofílicasextremas é hipersalino e as espéciesem cultivo laboratorial requerem parao crescimento, entre 1,5 a 4 M deNaCl, o que significa um ambientecom cerca de 10 vezes a salinidadeencontrada na água do mar. Asmetanogênicas são organismos obri-gatoriamente anaeróbios e liberamgás metano (CH

4) como resíduo me-

tabólico. São encontradas em ambi-entes com ausência de oxigênio eabundância de matéria orgânica,como pântanos, açudes, lagos, sedi-mentos marinhos e rúmen de bovi-nos. Elas retiram hidrogênio e gáscarbônico desses ambientes e os uti-lizam em seu metabolismo. Vivemcomo simbiontes de uma grande va-riedade de protozoários tambémanaeróbicos, convertendo produtosfinais de fermentação em gás metano.São de grande importância ao ambi-ente em que vivem pela alta eficiên-cia de sua enzima hidrogenase que,mantendo uma baixa pressão parcialde H

2 para que a metanogênese ocor-

ra, permite que os demais organis-mos fermentadores façam reoxida-ção do NADH, o que corresponde aum maior rendimento de ATP e umaumento da biomassa (Brock et al.,1994).

As arqueas termoacidófilas com-põem um grupo heterogêneo, defini-


.somertxesetneibmasoasaeuqrasadoãçatpadaedsaigétartsE:2alebaT

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sarutarepmetsaxiaB saníetorpsadoãçavitanI

eoteflussid,oinêgordihedsetnopededaditnauqroneM

adedadilibixelfaatnemuaeuqo,sacibófordihseõçaretni

aníetorp

do pela capacidade dos organismosde crescerem em altas temperaturasque vão de 55ºC a 85oC, com pH quevaria de 1,0 até 6,0. O gênero Sulfolobusapresenta parede celular compostaprincipalmente por lipoproteína ecarboidratos; oxidam H

2S, mas o prin-

cípio para essa oxidação ainda não foiesclarecido. Os principais substratosde crescimento parecem ser fontesquentes e também solos quentes quecontenham enxofre, e que, então,oxidam tal elemento em ácido sulfú-rico, responsável pela acidez desseshábitats. O grupo dos termoplasmas écaracterizado pela ausência de pare-de celular e é encontrado em minas decarvão, com quantidades substanciaisde sulfeto ferroso.

Uma das perguntas que maisintrigam os pesquisadores é comoesses incríveis organismos conse-guem viver em tais ambientes? Dei-xam constantemente uma interroga-ção sobre qual será o limite para odesenvolvimento da vida. Emboramuitas dúvidas ainda pairem sobreos mecanismos de adaptação a taisambientes hostis, muitos fatores jásão apontados como os responsá-veis pela resistência desses organis-mos. A Tabela 2 reúne os principaismecanismos de adaptação aos pro-blemas causados pelos ambientesextremos.

A pesquisa envolvendo esses or-ganismos tem sido intensificada nasduas últimas décadas por duas razõesprincipais: pelo conhecimento das con-dições sob as quais a vida pode existiratravés do estudo de muitos hábitatsnunca antes explorados e pelo atualreconhecimento do potencial biotec-nológico desses organismos, bemcomo de seus produtos.

4. AplicaçõesBiotecnológicas

A tecnologia enzimática experi-mentou um grande avanço quando asenzimas microbianas passaram a serutilizadas, principalmente por causada grande variedade de reações queessas enzimas são capazes de catalisar.Com o descobrimento dos microrga-nismos extremofílicos (em sua maioriaarqueas), o que ampliou ainda mais a

Meios de Cultivo para Arqueas Termofílicas

diversidade microbiana, a potencialfaixa de processos para utilização deenzimas também se ampliou, princi-palmente porque as extremozimas(enzimas provenientes de microrga-nismos extremófilos) sendo natural-mente estáveis em ambientes extre-mos, vieram suprir a demanda industri-al, para a qual, de certa forma, sempreestiveram em desvantagem as enzimastradicionais. Um problema inerente àsextremozimas é a dificuldade de pro-duzi-las utilizando microrganismos sel-vagens, já que estes, em geral, neces-sitam de condições especiais para sereproduzirem, como ambientesanaeróbios estritos, altas temperatu-ras, meios definidos, etc. Contudo esseproblema pode ser contornado ex-pressando essas enzimas em outrosorganismos de mais fácil manipulação,já que existem vários exemplos emque essas enzimas, quando expressasem microrganismos heterólogos, man-têm suas características originais(Eichler, 2001).

Dentre as enzimas de arqueas degrande potencial para a aplicaçãobiotecnológica, destacam-se ashipertermofílicas, psicrofílicas,alcalofílicas, halofílicas e barofílicas.

Entre as enzimas de arqueasque têm recebido maior atenção, estãoas termozimas, sendo que os princi-pais processos de potencial utilização


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sesanalulupolimA susoirufsuccocoryP 501 °C 0,6 gnoD late 7991,.

dessas enzimas são o beneficiamentodo amido, a manufatura e o branquea-mento da polpa para produção depapel e a bem estabelecida práticalaboratorial da reação em cadeia dapolimerase (PCR), entre outras.

4.1. Processamento doAmido

O amido é um dos polímeros maisabundantes na natureza, estando pre-sente principalmente nos vegetais, ondeele é utilizado para o armazenamentode energia na forma de grânulos inso-lúveis, compostos basicamente deamilose e amilopectina, que são dife-rentes polímeros de glicose. Além deservir diretamente como alimento nadieta animal, o amido presente nosvegetais pode ser hidrolisado, gerandoglicose, maltose e xarope de oligossa-carídeos, que, por sua vez, são utiliza-dos para produção de outros químicosou como substratos em fermentações(Bentley e Willians, 1996; Vieille eZeikus, 2001).

De uma forma geral, o processode hidrólise do amido envolve aliquefação e a sacarificação, as quaisocorrem em altas temperaturas. Du-rante a liquefação, os grãos de amidosão gelatinizados em soluções aquo-sas entre 105ºC e 110°C, num pHentre 5,8 a 6,5 , quando então, sãoutilizadas a-amilases termoestáveis a95°C, que hidrolisam parcialmenteas ligações a-1,4. Nesse processo, ocontrole de temperatura e pH é mui-to importante pois, se a temperaturaestiver abaixo de 105°C, a gelatiniza-ção ocorre parcialmente, e se aumen-tar muito, há a inativação das a-amilases; se o pH estiver mais ácidoque 5,5 também ocorre a inativaçãodessas enzimas, mas, se vai acima de6,5 são gerados muitos subprodutos.Após a liquefação, o produto é con-

vertido a sacarídeos de baixo pesomolecular e, posteriormente, emglicose, utilizando-se pululanase eglicoamilase, e em maltose, utilizan-do-se pululanase e β-amilase.

Nesse processo, potencialmentepoderiam ser feitas duas melhoriascom a utilização de extremozimas: aprimeira seria a utilização de a-amilaseshipertermofílicas com maior tempode resistência, de forma que não senecessitasse gastar energia com oresfriamento de 105ºC para 95oC, dagelatinização para a liquefação. A se-gunda seria a em que o pH natural desoluções de amidos gelatinizados, queé de, aproximadamente, 4,5 e queforça o ajuste para 5,8 na liquefação,e, posteriormente, redução para 4,2;na sacarificação, de maneira que umaa-amilase apta a trabalhar em pHsmais baixos reduziria, em muito, oscustos do processo.

A Tabela 3 mostra algumasenzimas isoladas de arqueas com gran-de potencial de aplicação na indústriade processamento de amido. Emboranenhuma dessas reúna todas as carac-terísticas necessárias apontadas aci-ma, elas indicam, no entanto, quecom técnicas de engenharia de prote-ínas, esses catalisadores poderiam seraperfeiçoados.

4.2. Manufatura do Papel

O processo de manufatura dopapel envolve, de uma maneira geral,dois estágios: o polpeamento e o bran-queamento. O polpeamento é o está-gio no qual a estrutura macroscópicada fibra da madeira é quebrada, remo-vendo-se dela a lignina, gerando daíuma fibra mais maleável e com carac-terísticas próprias para a produção dopapel (Tolan, 1996; Vieille e Zeikus,2001). Esse processo é conduzido me-cânica ou quimicamente por adição de

ácidos (processo Sulfite) ou bases (pro-cesso Kraft) em altas temperaturas. Osprocessos de polpeamento, por envol-verem condições muito drásticas(160ºC-190oC em concentrações eleva-das de álcalis ou ácidos), são potenci-almente próprios para utilização deenzimas extremofílicas. Embora ascelulases sejam bem distribuídas entreos domínios Eukarya e Bacteria, so-mente uma celulase de Archaea érelatada, a endoglicanase de Pyrococcusfuriosus, que é capaz de hidrolisarligações b,1-4 com uma atividade óti-ma ocorrendo em 100oC e pH 6,0(Bauer e Kelly, 1998). Contudo, segun-do Eichler (2001), várias arqueas termoe hipertermofílicas possuem enzimasβ-glicosídicas.

A polpa resultante de um dosprocessos acima é levada ao branque-amento, que ocorrerá em menor oumaior grau dependendo da utilizaçãodo papel. Nesse processo, a quantida-de remanescente de lignina dopolpeamento é retirada com a utiliza-ção, dependendo do processo, de:cloro, dióxido de cloro, ozônio,peróxido de hidrogênio e altas tempe-raturas. A utilização desses agentesoxidantes acaba gerando uma quanti-dade muito grande de poluentes, e,por isso, vem sofrendo sanções dasagências ambientais. Uma das alterna-tivas pesquisadas para reduzir essescompostos, principalmente os deriva-dos de cloro, é a utilização de enzimas.Entre as enzimas pesquisadas, as xila-nases, segundo Tolan (1996), são asque possuem uma boa aceitação in-dustrial e têm sido utilizadas em indús-trias onde está havendo um decrésci-mo na utilização dos oxidantes, daordem de 10% a 15%. Ainda segundoesse autor, as características ótimaspara uma xilanase seriam sua ação emtemperaturas por volta de 70°C e pHentre 10-12, o que abre uma excelente


oportunidade para a exploração dexilanases de arqueas extremofílicascomo as de Pyrococcus furiosus,Thermococcus sp. e Thermococcuszilligii (Eichler, 2001).

Um outro problema na fabricaçãode papel, principalmente pelopolpeamento mecânico, é a deposiçãodo “pitch”, denominação atribuída aoconjunto de substâncias hidrofóbicasda madeira, principalmente triglicerí-deos e graxas, que causam muitosproblemas na manufatura da polpa edo papel (Jaeger e Reetz, 1998). Aslipases já vêm sendo utilizadas naremoção dessas substâncias. Gutierrezet al. (2001) comentam que muitosestudos estão sendo realizados, pormeio de técnicas de engenharia deproteínas, no intuito de aumentar aamplitude de substratos hidrolisáveis,atividade e estabilidade em pH e tem-peratura elevados, sendo importanteque a enzima esteja ativa a altas tempe-raturas, uma vez que para um desem-penho ótimo, a lipase deveria ser adi-cionada à polpa a uma temperatura de,aproximadamente, 85oC. Nosso labo-ratório vem trabalhando no isolamen-to, clonagem, expressão e caracteriza-ção de uma enzima lipolítica de arqueacuja atividade já foi testada a 80oC(manuscrito em preparação).

4.3. Utilização dePolimerases

A reação em cadeia da polimera-se (PCR) revolucionou a prática dabiologia molecular, ou seja, a surpre-endente replicação in vitro de se-qüências específicas de DNA possi-bilitou que o isolamento de genes,seu seqüenciamento e mutações es-pecíficas, antes uma prática laborio-sa, se tornasse uma atividade cotidi-ana de qualquer laboratório de enge-nharia genética. O método da reaçãoem cadeia da polimerase, por suavez, foi extremamente simplificadocom a utilização de enzimashipertermofílicas. Embora a princi-pal DNA polimerase termofílica utili-zada seja a de uma bactéria (Thermusaquaticus), as DNA polimerases dearqueas, como as de Pyrococcusfuriosus, Pyrococcus woesei e outras,apresentam uma vantagem sobre aTaq polimerase, pois elas possuem

uma maior capacidade de correçãode pareamentos errôneos, diminuin-do a freqüência de erros na replicaçãoin vitro (Lundberg et al., 1991).

Não somente as enzimas adapta-das às altas temperaturas têm potencia-lidades biotecnológicas. As enzimas deorganismos que crescem entre 5ºC e25oC (Psicrofílicos) podem ser empre-gadas em vários processos e produtos,como proteases, lipases, amilases, b-glicanases em detergentes, pectinasesem sucos de frutas, b-galactosidasespara produção de leite deslactosado,lipases para maturação de queijos(Herbert, 1992; Eichler, 2001).

4.4. Arqueossomos

As aplicações biotecnológicas dasarqueas não se restringem a produ-ção, expressão heteróloga e purifica-ção de extremozimas. Pelo menosuma outra potencialidade biotecnoló-gica deve ser ressaltada. A utilizaçãodos arqueossomos (preparação delipídeos de membrana arqueana),como coadjuvantes em formulações

de vacinas, proporciona captação 3 a50 vezes maior pelas células fagocíticasdo sistema imune quando compara-das com formulações de lipossomosconvencionais, além de geração deresposta imune prolongada (Tolson etal., 1996; Sprott et al., 1997; Krishnanet al., 2000). Todos os estudos realiza-dos in vitro e in vivo indicam que osarqueossomos são moléculas segurase não invocam nenhuma toxicidadeem ratos. Em geral, os arqueossomosdemonstram alta estabilidade aoestresse oxidativo, à alta temperatura,ao pH alcalino, à ação de fosfolipases,de sais biliares e de proteínas do soro.Algumas formulações podem ser es-terilizadas em autoclave, sem proble-mas como fusão ou agregação dasvesículas (Patel e Sprott, 1999).

5. Genômica

Uma nova era sobre o conheci-mento das arqueas começou em 1996em decorrência do seqüenciamentocompleto do primeiro genoma dearquea (Bult et al., 1996). Com o sub-seqüente desenvolvimento de novosprojetos de seqüenciamento de outrosorganismos pertencentes ao domínioArchaea, foi produzida uma ricaamostragem de genomas desse grupotaxonomicamente bastante diversos.Esse repertório de genomas completa-mente seqüenciados inclui múltiplosrepresentantes das duas maiores divi-sões de arqueas estabelecidas pelaanálise filogenética dos genes de rRNA:a Euryarchaeota e Crenarchaeota, bemcomo as principais variantes ecológi-cas de arquea: os hipertermofílicos,termofílicos moderados e mesofílicos,assim como halofílicos e metanogêni-cos, formas autotróficas e heterotrófi-cas, e múltiplas espécies que represen-tam organismos anaeróbios e aeróbios.Infelizmente os bancos de dados aindanão contam com seqüências genômi-cas de alguns organismos pertencen-tes a ramos de arquea potencialmenteimportantes, como as misteriosasKorarchaeota, que devem ter divergi-do das demais arqueas nos primórdiosda evolução, e a igualmente intrigantenanoarchaea, que parece ter o menorgenoma entre todos os organismos devida livre já descritos (Huber et al.,2002)

Pyrodictium abyssi


A comparação dos genomas jáseqüenciados de arqueas e bactériaspermite concluir que a diferençamais marcante entre os domíniosArchaea e Bacteria está na organi-zação de seus sistemas de processa-mento de informações. A estruturados ribossomas e da cromatina, apresença de histonas, assim como asimilaridade entre seqüências dasproteínas envolvidas na tradução,transcrição, replicação e reparo doDNA; todos esses pontos apontampara uma maior proximidade entrearqueas e eucariotos. Por outro lado,alguns componentes chaves da ma-quinaria de replicação de DNA nãosão homólogos nos eucariotos nemnas bactérias. Essa observação per-mite sugerir a hipótese de que areplicação da dupla fita de DNAcomo principal forma de replicaçãodo material genético dos seres vivospode ter, na sua evolução, surgido,independentemente, duas vezes:uma nas bactérias e uma outra noancestral de arqueas e eucariotos.No entanto, muitas, mas não todasas rotas metabólicas de Archaea,são mais parecidas com as de bacté-rias que as de eucariotos. Essesestudos são concordes quanto aoposicionamento das arqueas comoum domínio distinto da vida, comconecções específicas com oseucariotos, e enfatizam a naturezamisteriosa e única dos genomas dasarqueas (Gaasterland, 1999).

Quando analisamos os 18 geno-mas de arqueas seqüenciados total-mente até hoje, podemos concluirque 16 proteínas são exclusivas dearqueas, enquanto 61 são exclusivasde arquea-eucariotos. Interessante-mente, desses 61 genes, apenas 2não pertencem à maquinaria do pro-cessamento de informação. Portanto,a análise genômica das arqueas já

seqüenciadas corrobora a identifica-ção destas como um grupo de orga-nismos que têm uma base sólida eestável de genes, os quais, primaria-mente, codificam proteínas envolvi-das na replicação e expressão dogenoma. Além desses, existe um se-gundo grupo de genes que é compar-tilhado pelas arqueas e eucariotos,genes que são claramente associadosao processamento da informação. Ofato da afinidade arquea-eucarióticaser quantitativamente pequena, de-monstra, no entanto, que o processode evolução tem sido mais comple-xo que a simples herança vertical, etem envolvido uma extensiva trans-ferência lateral de genes entreArchaea e Bacteria. Após a diver-gência evolutiva entre as linhagensde arqueas e bactérias, vem ocor-rendo uma grande mistura de genescodificantes para enzimas metabóli-cas, componentes estruturais da cé-lula e outras proteínas que não par-ticipam da maquinaria central deprocessamento da informação (Nel-son et al., 1999).

Além dos estudos funcionais, agenômica de Archaea é fundamen-tal para o conhecimento que temosde duas transições cruciais na evolu-ção da vida: a primeira é a divergên-cia entre as linhagens de bactérias eas de arquea-eucarióticas, que podeter envolvido a origem da maquina-ria de replicação de DNA. A segundaé a origem dos eucariotos. Em rela-ção a esse ponto, a arquea é umafonte fantástica de informação, par-ticularmente porque, em muitas si-tuações, ela tem retido as caracterís-t icas primitivas , enquanto oseucariotos têm sofrido modificaçõesmuito maiores. Um exemplo carac-terístico é a subunidade menor daDNA polimerase, que possui todasas marcas de uma fosfatase ativa emarqueas, mas não em eucariotos,onde a atividade fosfatásica estáprovavelmente inativada. Sem som-bra de dúvidas, arquea representaum ancestral comum das linhagensarquea-eucarióticas descendentes.Portanto, a genômica de arquea é anossa melhor oportunidade de re-construir essa fase intermediária crí-tica da evolução da vida (Makarovae Koonin, 2003) .

6. Considerações Finais

Estudos que envolvem o domí-nio Archaea vêm confirmando as duashipóteses iniciais de Woese e Fox(1977), isto é, que as arqueas exibemuma diversidade fenotípica no míni-mo comparavél àquela apresentadapelo domínio Bacteria e que os orga-nismos do domínio Archaea serãocaracterizados por aspectos únicosem âmbito molecular. Outrossim, ofato de Archaea exibir um mosaicocontendo características dos dois ou-tros domínios continua a estimulardiscussões entre os evolucionistas(Forterre et al, 2002).

No contexto de extremofilia, adescoberta contemporânea mais sur-preendente foi, sem dúvida, a dosorganismos hipertermófilos, queextendeu a sobrevivência desse or-ganismo para cerca de 121ºC de tem-peratura em que células vivas proli-feram eficientemente. Essa caracte-rística notável implica na estabiliza-ção de todos os componentes celula-res, de modo que a sua funcionalida-de seja mantida em condições detemperatura que seriam danosas paraa maioria das biomoléculas dos orga-nismos mesófilos. A elucidação dasestratégias usadas na estabilizaçãode componentes celulares e, em es-pecial, de proteínas, representa umdesafio fascinante para a biologiaatual (Kashe e Lovley, 2003).

Os microrganismos apresentamuma imensa diversidade genética edesempenham funções únicas e deci-sivas na manutenção de ecossistemas,como componentes fundamentais decadeias alimentares e ciclos biogeo-químicos. É importante ressaltar quegrande parte dos avanços da biotec-nologia moderna e da agricultura éderivada das descobertas recentes nasáreas de genética, fisiologia e metabo-lismo de microrganismos.

Considerando que o Brasil pos-sui uma grande extensão territorialcom inúmeros e variados ambientesextremos, como: águas termais, sali-nas, inúmeras estações de tratamentode esgoto, rejeitos industriais, entreoutros. A biodiversidade microbianabrasileira, ainda não explorada, pode-se tornar uma fonte para o desenvol-vimento biotecnológico do país.

Métodos de Preservação de Arqueas


Estamos em plena era biotecnoló-gica, quando os processos bioquími-cos são cada vez mais utilizados para aprodução de agentes terapêuticos, pro-dutos químicos e biocatalisadores. Ogrande desafio será incorporar a infor-mação decorrente do estudo dessesorganismos extremofílicos em novastecnologias, utilizando o enorme po-tencial de suas enzimas e biomoléculas.


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Pesquisa

Otimização da PropagaçãoIn vitro de Curauá (Ananas erectifolius L. B. SMITH)

Propagação massal de plantas através da cultura de tecidos

Osmar Alves LameiraEngº Agronômo/Pesquisador Dr.Embrapa Amazônia [email protected]

Iulla Naiff Rabelo de Souza ReisGraduanda/Bolsista PIBIC/CNPq/UFRA

Iracema Mª Castro Coimbra CordeiroEngª Florestal, MSc Bolsista/CNPq


Resumo

A propagação vegetativa utilizan-do técnicas de cultura de tecido podeser um valioso instrumento na propaga-ção clonal rápida de mudas de curauá,em larga escala. O trabalho teve comoobjetivo otimizar a propagagação invitro do curauá. Foram realizados doisexperimentos: No primeiro, os explantesforam inoculados em frascos contendo5,0; 7,5; 10,0 e 15,0 ml do meio líquidoMS, suplementados com 2,5 mg.L-1 deBAP (6-Benzilaminopurina). No segun-do, os explantes foram inoculados emfrascos contendo 15ml do meio líquidoMS, suplementado com 0; 1,5; 2,5; 3,0;3,5 e 4,5 mg.L-1 de BAP. Nos doisexperimentos a condição de incubaçãofoi realizada sob fotoperíodo de 16h luzbranca fria e irradiância de 25 µmol.m-

2.s-1. Os tratamentos contendo 10 e 15ml do meio líquido de cultura MS,suplementado com 2,5 mg.L-1 de BAP,foram mais eficientes na proliferação debrotos de curauá.

1. Introdução

Na Amazônia várias são as espé-cies de plantas fibrosas com utilizaçãoatual. Dentre elas destaca-se o curauá(Ananas erectifolius L. B. Smith), plan-ta nativa da região do Lago Grande deCuruai no Município de Santarém (PA)sendo cultivada principalmente porpequenos produtores e utilizada nafabricação de cordas, sacos e utensíliosdomésticos (Medina, 1959).

O curauá é planta pertencente afamília bromeliacea distribuída nos Es-tados do Pará, Acre, Mato Grosso,Goiás, Amapá e Amazonas. Há duasvariedades distintas do curauá, uma defolha roxa-avermelhada, chamada de

“curauá roxo” e outra de folha verde-claro, denominada de “curauá branco”(Ledo, 1967), ambas são relativamentepouco exigentes, não necessitando desolos férteis para o seu cultivo. Poden-do ser plantada em solos arenosos, emplantios solteiros ou em consórcio comculturas anuais ou perenes e no apro-veitamento de áreas degradadas (Oli-veira et al 1991).

Estudos recentes têm demonstra-do o grande potencial desta plantacomo produtora de fibra de excelentequalidade, podendo ser utilizada naindústria automobilística, por apresen-tar boa resistência, maciez e peso redu-zido (Ledo, 1967). Além dessas razões eprincipalmente pela exigência do mer-cado consumidor, grupos empresariaisestão preocupados na utilização de pro-dutos naturais biodegradáveis. Ademais,o cultivo dessa espécie impulsionará odesenvolvimento do Estado e ao mes-mo tempo cria uma perspectiva demelhoria da qualidade de vida dospequenos produtores.

Atualmente a demanda por fi-bras de curauá para industriaautomotiva e téxtil é superior a 500ton/mês, entretanto, no momento oEstado consegue produzir até 8 ton/mês. Um dos problemas para a forma-ção de áreas de cultivo dessa plantaestá na dificuldade de formação demudas pelo método convencional.Nesse sentido, a propagação vegetati-va, através da cultura de tecidos, apre-senta-se como alternativa na propaga-ção clonal rápida de mudas de curauá.

Visando equacionar este proble-ma, a Embrapa Amazônia Oriental atra-vés do Laboratório de Biotecnologia dePlantas, realizou coletas da espécie nosmunicípios paraense de Santarém eBragança, para formação de um banco


de germoplasma visando trabalhos depropagação in vitro, caracterizaçãomolecular e melhoramento genético dacultura. A utilização da técnica de cultu-ra de tecidos possibilita a produção emlarga escala e manutenção das caracte-rísticas fenotípicas e genotípicas dasplantas doadoras (Giacometti, 1990).

O processo de micropropagaçãode plantas envolve etapas definidascomo, estabelecimento de explantes,multiplicação, subcultivos e enraiza-mento in vitro. Entretanto, após defini-do um protocolo de micropropagaçãode qualquer espécie, este pode serotimizado com redução e até mesmosubstituição de substâncias utilizadasno processo, como é o caso da fonte decarbono, e também pela supressão dafase de enraizamento in vitro, o quediminui sobremaneira os custos de pro-dução de mudas por esta técnica. Assimsendo, o trabalho teve como objetivootimizar a propagação in vitro de curauá.

2. Metodologia

O trabalho foi desenvolvido nolaboratório de Recursos Genéticos eBiotecnologia da Embrapa AmazôniaOriental utilizando-se inicialmente plan-tas do curauá oriundas do banco degermoplasma da referida Instituição(Figura 1). Após a retirada das folhas,o caule foi lavado com água corrente esabão neutro. As gemas axilares foramexcisadas e passaram pelo processo dedesinfestação com lavagem em águacorrente e imersão em solução dehipoclorito de sódio (NaOCl) a 2 % porquinze minutos, sendo cinco minutosem agitação. Após o desenvolvimento,as plântulas obtidas in vitro serviramcomo fonte de explantes primário,para os experimentos (Figura 2).

Das plântulas obtidas in vitro fo-ram retiradas o excesso de folhas ecortadas em segmentos de 2 cm decomprimento ficando com pelo menosuma gema lateral. Para o estabeleci-mento da cultura, os explantes utiliza-dos nos experimentos foram inocula-dos em frascos contendo meio líquidoMS (Murashige e Skoog, 1962). O meiode cultura foi ajustado a um pH de 5,8utilizando-se NaOH (hidróxido desódio) e/ou HCl (ácido clorídrico) emsolução 0,5 N e autoclavado a 121°Cdurante 15 minutos.

Foram realizados dois experimen-tos em delineamento inteiramente

casualizado. O primeiro foi compostode 4 tratamentos com 6 repetições ondeforam testadas as quantidades 5,0; 7,5;10,0 e 15,0 ml do meio de cultura,suplementado com 2,5 mg.L-1 de BAP (6- Benzilaminopurina). O segundo ex-perimento foi composto de 6 tratamen-tos com 5 repetições onde se testou asconcentrações 0; 1,5; 2,5; 3,0; 3,5 e 4,5mg.L-1 de BAP. Nos dois casos as condi-ções de incubação foram realizadas sobfotoperíodo de 16h luz branca fria eirradiância de 25 µmol.m-2.s-1 e tempera-tura de 26 ± 1°C. Trinta dias após ainoculação foi realizada a avaliação. Avariável número de brotos foi transfor-mada em x+5,0 e avaliada atravésda análise de variância e comparação de

médias pelo teste de Duncan ao nívelde 5% de probabilidade.

As plântulas micropropagadas fo-ram transferidas para bandejas de plás-tico de 24 células contendo substratoorgano-vegetal e colocadas em ambi-ente de telado com sombrite a 70% sobirrigação intermitente até a completaformação de mudas. Após 30 dias asmudas foram cultivadas no campo.

3-Resultados e Discussão

O efeito da quantidade de meiode cultura sobre a produção de bro-tos de curauá pode ser observado naFigura 3. Aos trinta dias de cultivo, foiobservado que houve formação de

Figura 2 - Plântulas de Curauá obtidas in vitro. Embrapa Amazônia Oriental. Belém,PA, 2003.

Figura 1 - Banco de Germoplasma de Curauá Roxo e Verde. Embrapa AmazôniaOriental. Belém, PA, 2003.


brotos em todos os tratamentos, ediferenças significativas entre os mes-mos. Os tratamentos mais eficientesforam os que continham 10 e 15 mldo meio de cultura MS, produzindoem média 1,21 e 1,54 brotos/explante,respectivamente. Os tratamentos con-tendo 5 e 7,5 ml do meio de culturaMS, foram os menos eficiente, nãodiferindo estatisticamente entre si.

Na Figura 3, é possível observarque a produção de brotos foi diretamen-te proporcional a quantidade de meiode cultura, ou seja, quanto maior aquantidade de meio de cultura maior foio número de brotos obtidos por explante.Este fato, muito provavelmente podeser decorrente da maior disponibilidadede nutrientes às plantas.

É importante ressaltar que o au-mento na quantidade de meio talvezpossa tornar possível a redução naconcentração de regulador de cresci-mento. Este fato foi evidenciado porPreece (1995) em trabalho sobre acomposição de meio de cultura, noqual observou que com a otimizaçãode nutrientes salinos é possível reduzira concentração ou até mesmo eliminara suplementação de reguladores decrescimento. Segundo Ammiranto(1983), meios de cultura contendo altaconcentração salina, como o meio MS,pode otimizar o crescimento e desen-volvimento de plantas, principalmentepela presença do nitrogênio sob aforma de nitrato de amônia.

Estudos sobre a quantidade ide-al de meio de cultura para o cultivode curauá inexistem, encontrando-sena literatura apenas informações so-bre concentrações e tipos de regula-dores de crescimento. Embora não sepossam oferecer explicações satisfa-tórias a respeito do assunto, os resul-tados obtidos evidenciaram o efeitopositivo na proliferação de brotos decurauá com o aumento da quantida-de do meio líquido de cultura MS.

Na Tabela 1, são apresentadosos resultados obtidos com as diferen-tes concentrações de BAP na prolife-ração de brotos de curauá a partir deexplantes obtidos de plântulas invitro. Houve diferenças significativasentre as concentrações utilizadas.

O tratamento mais eficiente foi oque continha o meio de cultura MSsuplementado com 2,5 mgL-1 de BAP,produzindo em media 4,15 brotos/explante, não diferindo porém do que

continha 3,5 mgL-1 de BAP, que produ-ziu em média 3,34 brotos/explante. Otratamento menos eficiente foi aquelena ausência de BAP, produzindo emmédia 0,71 brotos/explante. Resulta-dos similares foram obtidos por Rios(2002) em seu trabalho sobre a eficiên-cia do BAP na proliferação de brotosde curauá.

Conforme a Figura 4, além daproliferação de brotos maior que 1cmde comprimento, houve a proliferaçãoem grande número de brotos na formade rosetas na presença do meio decultura MS, suplementado com 2,5mgL-1 de BAP. Marciani-Benzedeu et al(1990) quando utilizaram a cultivar deabacaxizeiro Smooth Cayenne obteve-ram maior número de brotos quando aconcentração de BAP foi aumentada.Estudos realizados por Lemos et al(1998) revelaram que o BAP adiciona-do ao meio de cultura foi eficiente naproliferação in vítro de brotos deabacaxizeiro, cultivar Cabeça-de-onça,ocorrendo maior taxa de multiplicaçãoa medida que a concentração do regu-lador de crescimento foi aumentada.

Por outro lado, Menezes et al (1999)em resultados preliminares sobre mi-cropropagação de curauá observaramque houve intensa proliferação de bro-tos com a concentração de 3mg.L-1 deBAP, porém, ocorreu intensa oxidaçãonos explantes. Bonilla (2002) estudouo efeito do BAP adicionado aos meiosMS e WPM sobre a indução de brotaçõesem segmentos nodais de Rudgeaviburnoides, observando maior taxade brotações em ambos os meios decultura na presença de 2mg.L-1 de BAP.

Tem sido reportado que o efeitobenéfico do BAP na multiplicação debrotações relaciona-se com a influen-cia deste regulador de crescimento nadivisão celular e na liberação das ge-mas auxiliares imitidas pela dominân-cia apical. Nesse sentido, supõe-seque, plantas que não apresentam umadivisão celular eficiente, o uso de altasdosagens de BAP em diferentes meiode cultura proporcionaria aumento namultiplicação de brotos. Entretanto,algumas espécies são sensíveis a altasconcentrações de reguladores de cres-cimento, sendo necessário estudos para

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Figura 3 - Efeito da quantidade de meio de cultura na formação de brotos de curauáaos 30 dias de cultivo. Embrapa Amazônia Oriental. Belém, PA, 2003.


determinar qual o meio de cultura e oregulador de crescimento adequadopara cada espécie.

As plântulas formadas foram leva-das para aclimatação e apresentaramcrescimento e desenvolvimento uni-forme, conforme pode ser observadona Figura 5. Após, 30 dias de cultivo asmudas foram cultivadas no campo. Oíndice de sobrevivência no campo aos6 meses de cultivo foi de 100%, nãosendo observada deficiência ou defor-midade nas plantas (Figura 6).

Figura 4 - Proliferação de brotos de curauá cultivado em meio MS na presença de 2,5mgL-1 de BAP. Embrapa Amazônia Oriental, Belém, PA, 2003.

Figura 5 - Vista parcial de mudas decurauá em fase de aclimatação. EmbrapaAmazônia Oriental. Belém, PA, 2003.

Figura 6 - Mudas de curauá cultivadas nocampo. Embrapa Amazônia Oriental.Belém, PA, 2003.

4. Conclusão

As quantidades de 10 e 15 ml domeio líquido de cultura MS, suple-mentado com 2,5 mg.L-1 de BAP sãomais eficientes para proliferação debrotos de curauá;

Mudas de curauá provenientesda micropropagação podem ser cul-tivadas no campo com 100% de so-brevivência.

Palavras-chave: Cultura de te-cidos, reguladores de crescimento,Ananas erectifolius.


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Pesquisa

CianobactériaInvasora

Aspectos moleculares e toxicológicos de Cylindropermopsis raciborskii no Brasil

Maria do Carmo Bittencourt-OliveiraProfa. Dra. do Departamento de Ciências BiológicasLaboratório de Cianobactéria, ESALQ - [email protected]

Renato MolicaCoord. do Lab. de Ecofisiologia de Microalgas (LEMI),Instituto de Tecnologia de Pernambuco (ITEP)[email protected]


A poluição presente nas baciashidrográficas decorrente de fontesantropogênicas tem restringido a qua-lidade e, conseqüentemente, a utili-zação das águas para o abastecimen-to das populações humanas, ocasio-nando sérios problemas à saúde pú-blica e ao meio ambiente. Um doseventos ocorrentes nos ecossistemasaquáticos mais comumente associa-dos a estas cargas poluidoras forma-das, principalmente, por compostospolifosfatados e nitrogenados, são asflorações de cianobactérias (Figura1). Florações são crescimentos popu-lacionais massivos e descontroladosdestes microorganismos em ecossis-temas aquáticos ocasionados por al-terações ambientais.

As florações de cianobactériaspodem causar gosto e odor desagra-dáveis na água, além de alterar oequilíbrio ecológico do ecossistemaaquático. O maior problema, entre-tanto, está no fato de produziremtoxinas (cianotoxinas) extremamen-te potentes atingindo um conjuntode organismos muito além daquelespresentes nas comunidades aquáti-cas. As cianotoxinas podem ser acu-muladas na rede trófica, ocasionan-do diferentes sintomas de intoxica-ção e efeitos crônicos, muitas vezes,difíceis de serem diagnosticados.Mortandades de peixes e animaissilvestres e domésticos já foramregistrados em diversas partes domundo (Carmichael 1992).

Toxinas de cianobactérias

As cianobactérias produzem dife-rentes metabólitos secundários, sendoalguns deles possuidores de açãotóxica sobre diferentes organismos e

tipos celulares. As neurotoxinas ehepatotoxinas, entretanto, podem serconsideradas os principais agentes tó-xicos produzidos pelas cianobactérias,pois causam sérios danos à vida ani-mal e à saúde humana, podendo atémesmo levar a morte.

As neurotoxinas conhecidas atéhoje são: anatoxina-a, anatoxina-a(s), saxitoxina e neosaxitoxina (Figu-ra 2). Apesar de agirem de mododistinto, têm como ação final a para-lisação da atividade muscular, levan-do o animal à morte por paradarespiratória após poucos minutos deexposição. As saxitoxinas foram inici-almente caracterizadas em espéciesde dinofíceas marinhas e foram res-ponsáveis por diversos casos de into-xicação humana através do consumode mariscos contaminados.

As hepatotoxinas são as toxinasproduzidas por cianobactérias maiscomumente relacionadas com casosde envenenamento animal e humanoem todo o mundo. As principaishepatotoxinas são as microcistinas,nodularinas - de natureza peptídica –e cilindrospermopsina (Figura 3), umalcalóide que também inibe a síntesede proteínas (Tabela 1).

O Brasil possui um recente histó-rico de relatos de contaminações porcianotoxinas, porém, muitos não fo-ram comprovados. Um dos eventosocorridos, mas não comprovadamen-te associado às cianotoxinas, aconte-ceu na Bahia, onde oitenta e oitopessoas morreram devido ao consu-mo de água proveniente do reservató-rio de Itaparica (Teixeira et al. 1993).

Contudo, o caso mais grave en-volvendo a população humana foi achamada “Síndrome de Caruaru” ocor-rida na cidade de Caruaru, nordeste


do Brasil em 1996, quando 761 paci-entes de uma clínica de hemodiáliseforam a óbito (Jochimsen et al. 1998;Carmichael et al. 2001). Este incidentelevou a Fundação Nacional da Saúde,em colaboração com a OrganizaçãoPanamericana da Saúde, à revisão daportaria 36/MS/90, que definia as nor-mas e os padrões de potabilidade daágua para consumo humano no Bra-sil. Através da homologação da Porta-ria nº 1469/00/MS de 29/12/2000, aAgência Nacional de Vigilância Sani-tária passou a exigir dos órgãos com-petentes e responsáveis pelo trata-mento e fornecimento de água o mo-nitoramento da ocorrência decianobactérias e algumas cianotoxi-nas, tanto na água bruta do manancialutilizado para a captação de água,como na água tratada para consumo(Brasil 2001).

A Portaria no 1469/00 tornouobrigatória a análise de microcistinae recomenda a análise de saxitoxinase cilindrospermopsina na água trata-da quando for comprovada atoxicidade da floração no manancialde abastecimento através de bioen-saios com camundongos. Os valoresmáximos permitidos (VMP) dessastoxinas na água tratada são de 1,0,3,0 e 15,0 µg.L-1 de microcistina,equivalentes de saxitoxina e cilin-drospermopsina, respectivamente.Esses valores, que resultaram de es-tudos anteriores, levam em conside-ração a toxicidade dessas moléculasem testes com animais, além de fato-

O que são cianobactérias?

Cianobactérias são microrganismos procariotos, de origem extre-mamente remota, geralmente aquáticos, que realizam fotossíntesecom liberação de oxigênio, diferente de outras bactérias fotoautotróficas.Devido ao fato de serem fotossintetizantes, aquáticas e possuírem umpigmento azulado (ficocianina), são tradicionalmente chamadas de“algas azuis”, apesar da distante relação filogenética com outrosgrupos de organismos também denominados de “algas”. Acredita-seque elas foram as responsáveis pelo início da formação da atmosferaatual, rica em oxigênio, e pela evolução de todos os organismosfotossintetizantes, visto que formas relacionadas às atuais cianobactérias,provavelmente, originaram os cloroplastos através de um eventoendossimbiótico.

As cianobactérias são predominantes no fitoplâncton de águascontinentais, alcançando uma ampla diversidade de formas, devido àsadaptações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas adquiridas duran-te sua longa estória evolutiva. Algumas cianobactérias, tais como osgêneros Microcystis, Cylindrospermopsis, Anabaena, Aphanizomenone Planktothrix formam florações onde há a liberação de toxina atravésda lise celular.

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___________________________________________________________

1 Dos 131 pacientes da clínica, 116 apresentaram sintomas de intoxicação. Destes, 100 desenvolveram problemas hepáticos e 76faleceram ao longo do estudo, que durou até outubro 1997. Destes 76, foram analisadas 52 amostras de fígado de 39 pacientes (todaspositivas para microcistina) (Carmichael et al. 2001).

Figura 1. Amostra de floração da cianobactéria Microcystis aeruginosa (Kütz.) Kütz.coletada no reservatório de Carpina em 2002. b) Banhistas no reservatório de Ingazeira,em 1998, com floração neurotóxica (presença de saxitoxinas) de Cylindrospermopsisraciborskii . Ambos no estado de Pernambuco nordeste do Brasil. Fotos dos autores.


res de risco, que são aplicados nocálculo da dose máxima, entre eles,a variabilidade inter e intra-espéciee, no caso da microcistina, seu po-tencial carcinogênico. Em relação àcilindrospermopsina, alguns autores,baseados em resultados recentes quemostram um potencial genotóxico,vêm sugerindo que o VMP deva sermenor, em torno de 2 µg/L.

Cepas brasileiras deCylindrospermopsis

raciborskii produzemsaxitoxinas

A espécie Cylindrospermopsisraciborskii (ordem Nostocales) é umcomponente importante entre as es-pécies formadoras de florações, poispode produzir hepatotoxinas,neurotoxinas e citotoxinas (Chorus &Bartram 1999).

O primeiro caso de intoxicaçãohumana provocada por esta espécieocorreu em 1979, na Austrália, quan-do 141 pessoas, sendo a maioria cri-anças, após consumirem água de umreservatório que havia sido tratadocom algicida para eliminar umafloração, apresentaram sintomas dehepatoenterite (Hawkins et al 1985).Até então, essa espécie era considera-da como não-tóxica. Análises posteri-ores demonstraram que o compostoresponsável pela intoxicação haviasido a cilindrospermopsina (Ohtaniet al 1992). Também na Austrália, em1992, uma floração de C. raciborskiiprodutora de cilindrospermopsinacausou a morte de bovinos. Apenas ascepas australianas e uma tailandesade C. raciborskii, até hoje, demons-traram produzir cilindrospermopsinae um análogo não tóxico, denomina-do deoxicilindrospermopsina.

Em análises realizadas pelo La-boratório de Ecofisiologia deMicroalgas, do Instituto Tecnológicodo Estado de Pernambuco, com amos-tras de florações de C. raciborskiique ocorreram entre 10 de abril e 24de maio de 2002 no reservatórioTapacurá (São Lourenço da Mata,PE) que abastece cerca de 1,3 milhãode habitantes na Região Metropolita-na de Recife, foi demonstrado efeitosneurotóxicos em bioensaios com ca-mundongos. Análises realizadas porcromatografia líquida de alta eficiên-cia (CLAE) indicaram a presença de

Figura 2. Estrutura das neurotoxinas produzidas pelas cianobactérias. a) anatoxina-a,b) anatoxina-a(s) e c) saxitoxinas. Alterações em R1, R2, R3, R4, R5 geram mais de 20variantes conhecidas com diferentes toxicidades.

Figura 3. Estrutura geral das microcistinas, nodularinas e cilindrospermopsina. a)Microcistina um heptapeptídeo cíclico. X e Z representam os dois L-aminoácidos quepodem variar e R1 e R2 são H ou CH

3. b) Nodularina um pentapeptídeo cíclico. Z

representa um L-aminoácido que pode variar e R1 e R

2 são H ou CH

3. c) Cilindrops-

ermopsina é um alcalóide.


saxitoxinas em amostra de água bru-ta (Figura 4).

Cepas brasileiras de C. raciborskiiisoladas de diferentes regiões do paísdemonstraram produzir saxitoxinas(Lagos et al. 1999, Molica et al. 2002,Bernard et al. 2003, Pomati et al. 2003).As variantes de saxitoxinas caracteri-zadas a partir de amostras de cepasbrasileiras de C. raciborskii até o mo-mento foram: saxitoxina, neosaxitoxi-na, dc-saxitoxina, dc-neosaxitoxina,GTX-2, GTX-3, GTX-6 e uma novavariante ainda não descrita.

Cepas européias de C. raciborskii(alemãs, francesa, húngaras e portu-guesas) demonstraram ter efeitos tóxi-cos quando testadas em bioensaioscom camundongos. Dependendo dacepa, observou-se danos causados aofígado ou efeitos neurotóxicos emneurônios de moluscos (Bernard et al2003, Saker et al 2003, Kiss et al 2002).Em todos esses casos, entretanto, nãose identificou a produção de cilindros-permopsina, nem tampouco de saxito-xinas por essas cepas. Provavelmentetrata-se de um novo composto, cujaestrutura química e atividade toxicoló-gica ainda precisam ser determinadas.

Figura 4. Análise de saxitoxinas por cromatofrafia líquida de alta eficiência (CLAE) com detectorde fluorescência e derivatização pós-coluna de acordo com método descrito por Oshima (1995).Amostra de 8 de maio de 2002 da floração de C. raciborskii do reservatório Tapacurá (a). Foramidentificados três picos, cujos tempos de retenção coincidem com os tempos de retenção dospadrões (b e c). Neosaxitoxina (NeoStx), saxitoxina (Stx) e dc-saxitoxina (dc-Stx).

Figura 5: Ocorrência de C. raciborskii no mundo segundo Padisák (1997). 1. Indonésia. 2. Filipinas. 3. Bruma. 4. China. 5. Índia. 6. Sri Lanka. 7. Austrália.8. República Democrática do Congo, Malaui, Quênia, Ruanda, Zambia, Zimbabue, Uganda. 9. África do Sul. 10. Nigéria. 11. Rio Nilo. 12. Moldávia,Turquimenistão, Afeganistão, Cazaquistão, Rússia, Usbequistão, Mar Cáspio. 13. Alemanha, Áustria, França. 14. Espanha. 15. Grécia. 16. Hungria. 17.Minenesota, EUA. 18. Kansas, Estados Unidos 19. Texas, Estados Unidos. 20. Flórida, Estados Unidos. 21. México. 22. Nicarágua. 23. Cuba. 24. Venezuela.25. Brasil. a. Lago Paranoá, DF; b. Lago da Pampulha, MG; c. Reservatório de Itaipú, PR; d. Lagoa dos Patos, Lago Chinês e Lago Gaúcho, RS.


A invasão deCylindrospermopsis

raciborskii

A espécie Cylindrospermopsisraciborskii (Woloszynska) Seenayya etSubba Raju foi descrita pela primeiravez em Java e adjacências e tornou-seextremamente invasiva, ocorrendo tan-to em águas de regiões tropicais esubtropicais como temperadas (Padisák1997, Bouvy et al. 2000) (Figura 5).Apesar de poderem ser dominantesdurante o ano todo, são mais comumenteencontrados em períodos restritos, ge-ralmente secos e de baixa pluviosidade.Esta cianobactéria possui múltiplas es-tratégias adaptativas, tais como resis-tência à herbivoria, tolerância às baixasirradiações, possibilidade de migraçãona coluna d´água buscando estratosricos em nutrientes e luz, tolerância àsaltas concentrações iônicas, armazena-mento e utilização de reservasintracelulares de fósforo, alta afinidadeao NH

4+ que é a forma energeticamente

mais acessível de nitrogênio, ou na suafalta, podem fixar o N

2 atmosférico e

flexibilidade às grandes variações decondutividade elétrica.

Nas duas últimas décadas docu-menta-se a freqüente ocorrência de C.raciborskii nas águas dos reservatóriose açudes em diversos estados do Brasil(Tabela 2). Uma das regiões com in-tensos registros de sua presença é aNordeste, mais especificamente o esta-do de Pernambuco (Bouvy et al. 1999,2000; Huszar et al. 2000). Os reservató-rios desta região possuem excelentescondições para o desenvolvimentodesta espécie, tais como, corpos d´águarasos, estabilidade na coluna d´águadevido à pluviosidade baixa, longotempo de retenção da água (ou ausên-cia de renovação), irradiações e tem-peratura altas além de valores de pHacima de 8,0 (Bouvy et al. 2000).Segundo Bouvy et al. (2000), dos 39reservatórios amostrados por todo es-tado de Pernambuco, entre setembro enovembro de 1998, 31 apresentaramflorações de C. raciborskii e, em 17destes, esta cianobactéria representou50% da densidade do fitoplâncton to-tal. No mesmo período, situação seme-lhante foi relatada na Austrália noestado de Queensland entre outubrode 1997 e junho de 1999. Dos 47reservatórios de água amostrados, 35apresentaram populações de C.

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Figura 6. Filamentos retos e espiralados de C. raciborskii. a-d) Cepa espiralada Recife/PE-Brasil com heterocitos (célula especializada na fixação do N

2 atmosférico) terminais.

a e c. contraste de fase evidenciando os aerótopos que são responsáveis pela flutuaçãoe migração do filamento na coluna d´água. e) Cepa reta Arcoverde/PE-Brasil comheterocitos terminais. f) Material da natureza não cultivado coletado no reservatório deJucazinho-PE. Fotos dos autores.


raciborskii (McGregor & Fabbro 2000),sendo que em 15 esta espécie foidominante sazonalmente e em 1 du-rante o ano inteiro.

Morfologia deCylindrospermopsis

raciborskii

Segundo os critérios morfológi-cos tradicionais, a forma do filamentoé um caráter taxonômico que distin-gue espécies diferentes. SegundoKomarková (1998), as formas retassão identificadas como C. raciborskiie as espiraladas C. philippinensis(Taylor) Komárek e C. catemacoKomarková-Legnerová et Tavera. Noentanto, admite-se atualmente que épróprio de C. raciborskii apresentaruma extensa plasticidade fenotípicarefletindo-se em filamentos retos,sigmóides ou espiralados que podemocorrer simultaneamente (Figura 6).

Filamentos espiralados de C.raciborskii, apesar de distribuição maisrestrita no mundo, são freqüentemen-te relatados para o norte da Austrália,em Queensland (Fabbro et al 1996,McGregor & Fabbro 2000, Saker et al.1999, Dyble et al. 2002) e sudeste daAmérica do Norte, na Flórida. No Bra-sil, do nosso conhecimento, popula-ções de C. raciborskii com filamentosespiralados apenas foram registradospara a região Nordeste (Bouvy et al.1999, 2000) (Figura 6).

Populações com filamentos retose espiralados de um lago na Austráliaforam caracterizadas geneticamenteatravés das análises de seqüências do16SrRNA (Saker et al. 1999). Formasretas e espiraladas apresentaram-secom alta similaridade genética (99,8%)indicando que se tratava de uma únicaespécie, apesar dos seus comporta-mentos levemente diferenciados emtestes ecofisiológicos (Saker et al. 1999,Saker & Neilan 2001). Wilson et al.(2000), utilizando uma técnica maisdiscriminatória do que a anterior, en-contraram resultados semelhantes atra-vés de seqüências do rpoC1, que codi-fica para a subunidade γ da RNApolimerase, obtidas por iniciadoresdesenhados especificamente paraCylindrospermopsis. Entretanto, as ce-pas com morfologia espiralada foramagrupadas utilizando-se RAPD (randomamplified polymorphic DNA) e STRR(short-sequence tandem repeat region)

(Wilson et al. 2000, Neilan et al. 2003).Apesar de esta espécie ter sido

descrita como um táxon de interesseapenas em áreas tropicais, floraçõestêm sido freqüentemente registradasem regiões temperadas da Austrália,Europa e nas Américas do Norte e Sullevando pesquisadores de diversaspartes do mundo a se dedicarem aoestudo da espécie.

O uso de seqüências deDNA como ferramenta

básica no entendimento dadispersão e produção de

toxinas

Genes que codificam para a c-ficocianina como o cpcB e cpcA estãopresentes em todas as cianobactériase ausentes em outras bactérias emicroalgas. As regiões espaçadorasentre estes genes têm se tornado umaalternativa para a utilização daquelasaltamente conservadas. A região dolocus da ficocianina possui seqüênci-as com taxas de substituições maisaltas do que aquelas do 16S rDNA(Nelissen et al 1996, Ishida et al. 1997,Lyra et al. 2001).

Neste estudo foram utilizadas se-qüências inéditas obtidas do espaçadorintergênico do operon da ficocianina(cpcBA-IGS) de cepas C. raciborskiicom morfologias reta e espiralada dedois corpos d´água do nordeste doBrasil. Além destas, foram utilizadasseqüências de cepas australianas, eu-ropéias e americanas disponíveis noGenBank. Número de acesso às se-qüências estão na Figura 7.

As 19 cepas analisadas apresenta-ram-se com alta similaridade genéticamostrando tratar-se de uma única es-pécie (Figura 7). Porém, foram clara-mente distribuídas em dois grupos:Grupo 1) com cepas australianas,produtoras de cilindrospermopsina, eeuropéias (Alemanha, Hungria e Por-tugal), não-produtoras de cilindros-permopsina, mas sim de um compostotóxico ainda não caracterizado (Neilanet al. 2003); e Grupo 2) com cepasamericanas (EUA e Brasil). No grupo 1não foram evidenciadas distinções entreregiões geográficas, toxinas produzi-das e morfologias reta e espiralada.

O grupo 2 apresentou cepas dis-tribuídas segundo a região geográfica(Flórida e Brasil) e morfologia dofilamento (espiralado ou reto). Con-

tudo, a única exceção foi a cepaArcoverde/PE-Brasil que não se agru-pou segundo os critérios acima. Dascepas americanas, apenas as deBillings/SP-Brasil e Amparo/SP-Bra-sil (Lagos et al. 1999) tiveram suastoxinas analisadas através de CLAE econstatou-se a presença de saxitoxi-nas. Até o momento, em nenhumalinhagem analisada de C. raciborskiifoi constatada a presença de cilin-drospermopsina (Proença et al. 2000;Molica et al. 2002). Em bioensaioscom camundongos a cepa Arcoverde/PE-Brasil produziu efeitos neurotóxi-cos, enquanto a Recife/PE-Brasil foitóxica, porém não foi possível deter-minar a natureza da toxina. Todas ascepas brasileiras de C. raciborskiitóxicas analisadas até hoje foram pro-dutoras de saxitoxinas.

Considerações finais

As seqüências do cpcBA-IGS pos-sibilitaram, de uma forma geral, a dis-tinção entre regiões geográficas emorfologias espiralada e reta entre ascepas americanas, mas não entre asaustralianas e européias. Isto poderiaindicar que há outros fatores refletidosnas informações moleculares que esta-riam influenciando na topologia docladograma. Apesar da necessidade demaior detalhamento e número de isola-dos de C. raciborskii analisados emrelação aos seus aspectos moleculares,toxicológicos e ecofisiológicos, há indí-cios que haja uma ligação entre ocomposto tóxico produzido e sua dis-tribuição geográfica. Baseado nisto,pode-se propor que populações aus-tralianas, européias e americanas evo-luíram separadamente após a separa-ção dos continentes, contrariando asespeculações de Padisák (1997), se-gundo as quais, a Austrália e Áfricaseriam os centros de radiação de C.raciborskii para Europa e América porpossuírem ambientais mais favoráveisao desenvolvimento destas populações.

Segundo um modelo evolutivoproposto para eucariotos com reprodu-ção sexuada (Brussard 1984), popula-ções geneticamente diversas estão nocentro da variação de uma espécie,enquanto que aquelas às margens apre-sentam-se mais homogêneas. Para Dybleet al. (2002), a grande diversidade gené-tica encontrada entre as cepas america-nas quando comparadas com as austra-


lianas e européias, pode indicar intro-dução recente da espécie ou evoluçãomolecular acelerada. A diversidade ge-nética de cianobactérias no Brasil aindaé pouca estudada, mas há dados queevidenciaram a alta variabilidade emcepas de Microcystis nas quais genótiposdiferentes coexistem em diversos cor-pos d´água do Brasil, utilizando ocpcBA-IGS (Bittencourt-Oliveira et al2001) e o gene mcyB, que codifica paraa sintetase de microcistina (Bittencourt-Oliveira 2003).

C. raciborskii foi registrada pelaprimeira vez na América do Norte em1955 (Prescott & Andrews 1955) e, noBrasil, iniciaram-se os relatos de floraçõesapós o enchimento do lago Paranoá-DFem 1960 (Palmer 1969). Comparando-secom os primeiros registros de C.raciborskii no mundo (Padisák 1997) apresença desta cianobactéria na Améri-ca não é um evento recente, porém oaumento das florações parece estar rela-cionado ao favorecimento das condi-ções ambientais.

As populações presentes em cor-pos d´água americanos podem serresultados de uma evolução molecu-lar acelerada favorecida pelas condi-ções ambientais altamente propíciasà introdução de novas linhagens e oconstante intercâmbio genético pro-movido por aves migratórias entreAmérica do Norte e Sul. Diversasespécies de maçaricos (Scolopacidae)tais como Tringa solitaria, T. flavipes,T. melanoleuca etc., vindo da Amé-rica do Norte cruzam o Brasil emdireção ao sul com diversas paradaspara descanso e alimentação em águascalmas o que possibilitaria agiremcomo vetores na dispersão de esporos.

A diversidade genética encontra-da em determinadas regiões pode sero resultado de estresse ambiental(Dvornyk & Nevo 2003) causado pordiversos fatores naturais (por ex.: ElNiño) ou antropogênicos (por ex.:poluição). Além disso, mutações neu-tras, eventos de recombinação e ele-mentos móveis podem favorecer oestabelecimento de populações ge-neticamente polimórficas.

A invasão crescente de C.raciborskii, produtora de diversos com-postos tóxicos em corpos d´água portodo o mundo, principalmente em regi-ões onde não havia qualquer registrode sua ocorrência, alerta para a pre-mente necessidade de investigaçõesgenéticas em populações de diferentesregiões geográficas para subsidiar oentendimento atual em relação à pro-dução de toxinas, limites ecofisiológicose dispersão, visando o manejo destaspopulações na natureza.

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Figura 7. Cladograma obtido através do método de Neighbor-joining utilizando 576a 600 pares de base do cpcBA-IGS de cepas de C. raciborskii de diferentes regiõesgeográficas.CYL: presença de cilindrospermopsina. ND: presença de um composto novo nãodescrito e ausência de cilindrospermopsina. SXT: presença de saxitoxinas. Todas astoxinas confirmadas através de CLAE (segundo Neilan et al. 2003).

* Produziu efeitos neurotóxicos através de bioensaios com camundongos** Tóxica. Toxina não avaliada._________________________________________________________________________


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Marcadores Moleculares eGeminivírus

Loiva Maria Karnopp, Dra.Engenheira Agrônoma,Doutora em Ciências Biológicas.Laboratório de Genética Molecular - [email protected]; [email protected]

Ilustrações cedidas pela autora

Identificação de marcadores moleculares em populações de tomateiro resistentes a geminivírus

Pesquisa

Introdução

O processamento do tomate éum dos segmentos mais importantesda indústria agroalimentar brasileirae vem ganhando mais adeptos, já quea área plantada com tomate rasteirocresceu bastante na década de 90.Dos 60 mil hectares de tomateirocultivados, cerca de 40% são destina-dos à indústria. O valor global demercado foi de US$800 milhões navirada do milênio (Filgueira, 2000).As principais áreas de produção en-contram-se nas Regiões Nordeste,Centro-Oeste e Sudeste (Faria et al.,2000). O tomate é a hortaliça commaior volume de comercialização noBrasil – 3 milhões de toneladas porano (IBGE, 2000).

No início da década de 90, aagroindústria de tomate expandiu-separa novas regiões, especialmente noCerrado, compreendendo áreas dosEstados de Goiás e de Minas Gerais.Em 2000, o Cerrado tornou-se a maisimportante zona de produção de to-mate industrial do país, com 77% daárea plantada, seguido de São Paulo,com 14%, e da Região Nordeste, comapenas 9% (Melo, 2001). Naquele pe-ríodo, também houve um incrementoextraordinário da produtividade, que,de cerca de 34,6 t/ha, em 1990, foipara 67 t/ha, na safra de 2000.

Um fator limitante no cultivo dotomateiro são as doenças viróticas,principalmente, devido à dificuldadede seu controle. No submédio SãoFrancisco (PE e BA), os principaisproblemas estão relacionados com aestrutura produtiva, embora as condi-

ções agroecológicas locais sejam fa-voráveis à obtenção de matéria-primade elevado padrão de qualidade e acusto mais baixo que nas demaisáreas de produção do país, como SãoPaulo, Minas Gerais e Goiás. Nessaregião, a produção de tomate paraindústria está concentrada nas mãosde pequenos e médios produtoresque, por utilizarem um sistema demanejo tecnologicamente ineficiente,obtêm uma produtividade muito bai-xa, em torno de 30 t/ha nas últimassafras; enquanto, no interior de SãoPaulo, esse índice é de 65 t/ha sobcondições climáticas favoráveis.

A produção mundial de tomatepara processamento industrial nos últi-mos dez anos oscilou entre 22,6 e 29,6milhões de toneladas anuais. Entre osmaiores produtores estão os EstadosUnidos, a Itália, a Turquia, a Espanha,a Grécia e o Brasil (Silva & Giordano,2000). A previsão de safra do tomatepara consumo e para a indústria, parajaneiro de 2003, foi de 3.567,080 tone-ladas, com um rendimento médio de58.422 kg/ha e uma área plantada de61.057 hectares (IBGE, 2003).

A família Geminiviridae possuialguns dos fitovírus de maior impor-tância econômica no Brasil e no mun-do. Juntamente com os Tospovirus,os Geminivirus são considerados ví-rus emergentes, pois a incidência e aseveridade das doenças causadas poreles têm aumentado consideravel-mente nas últimas décadas, o queparece estar mais relacionado com aexplosão populacional de seus res-pectivos insetos vetores do que como vírus propriamente dito.


Fig. 1. Padrões de bandas de RAPD produzidos pelos primers OPP02, OPP03, OPP04, OPP05, OPP06 e OPP19. LA: linhagemLA3473, resistente a geminivírus, VIRA: cultivar Viradoro, suscetível a geminivírus, 1:10 e 1:50: diluições do DNA.

Os geminivírus, assim chama-dos por estar o seu DNA fita simplesdisposto em dois componentes cir-culares, são vírus transmitidos pormoscas-brancas do complexo Bemisiaspp. que infectam dicotiledôneas, eque têm .causado severos danos emdiversas culturas pelo mundo, princi-palmente nas regiões tropicais esubtropicais. Em muitas áreas, cons-tituem-se o mais grave entrave para aprodução de mandioca, feijão, pi-menta, tomate e algodão. No Brasil,como em toda a América Latina, osgeminivírus causam enormes prejuí-zos à produção de feijão, infectando-o com a doença conhecida comoBGMV ou Mosaico Dourado doFeijoeiro (Hanson & Maxwell, 1999).

A sintomatologia não é parâme-tro suficiente para identificar e dife-renciar os geminivírus porque os sin-tomas dependem da época de infec-ção da planta, do hospedeiro (culti-var), de fatores ambientais, como al-tas temperaturas e pouca chuva, que

favorecem o aparecimento do vetor eda ocorrência de infecção viral múlti-pla. As técnicas moleculares têm per-mitido o desenvolvimento de méto-dos de detecção universal para todauma família ou ordem, ou específicospara uma determinada espécie, deforma eficiente, rápida, acurada e deforma otimizada para vírus. A reaçãoem cadeia da polimerase (PCR) é umatécnica específica e extremamentesensível e tem sido utilizada para adetecção e o estudo da variabilidadegenética de geminivírus, tanto a partirde tecidos de plantas como de DNAextraído de insetos vetores (Mehta etal., 1994, entre outros).

Os insetos do gênero Bemisiasão polífagos, com, pelo menos, 506espécies de plantas hospedeiras dis-tribuídas em 74 famílias, entre mono-cotiledôneas e dicotiledôneas. Comohospedeiros preferenciais desse inse-to, estão as brássicas (brócolis, couve-flor, repolho), as cucurbitáceas (abo-brinha, melão, chuchu, melancia, pe-

pino), as leguminosas (feijão, feijão-de-vagem, soja), as solanáceas (berin-jela, fumo, pimenta, tomate, pimen-tão), o algodão, a uva e algumasornamentais, como o bico-de-papa-gaio (Euphorbia pulcherrima Willd.)e o crisântemo (Chrysantemummorifolium Ramat.). Tem sido tam-bém relatada a sua ocorrência emplantas daninhas, como, entre outras,o picão (Bidens pilosa L.), joá-de-capote (Nicandra physaloides (L.)Gaertn.), datura (Datura stramoniumL.) guanxuma (Sida rhombifolia L.),pinhão manso (Jatropha gossypifoliaL.) e Macroptilium lathyroides (L.)Urb. (França et al., 2000).

No Nordeste do Brasil, notada-mente no Estado do Piauí, o gêneroBemisia ocorre em vários hospedei-ros. No entanto, é na cultura do caupi(Vigna unguiculata (L.) Walp) queesse gênero tem maior importância,pois a espécie B. tabaci é citadacomo vetora do Mosaico Amarelo doCaupi (Santos, 1982).


Os danos causados por B.argentifolii podem ser de dois tipos:direto, pela sucção de seiva e açãotoxicogênica, além de liberação desecreções açucaradas que favorecemo desenvolvimento da fumagina, eindireto, pela transmissão de vírus,geralmente, pertencentes ao grupogeminivírus. Com a introdução doestilete no tecido vegetal, os insetos(adultos e ninfas) provocam altera-ções no desenvolvimento vegetativoe reprodutivo da planta, debilitando-a e reduzindo, conseqüentemente, aprodutividade e a qualidade dos fru-tos. Em altas densidades populacio-nais, as perdas podem chegar a 50%na produção. As manchas cloróticasnas folhas são causadas pela injeçãode saliva das ninfas e adultos durantea sucção. Infestações muito intensasocasionam murcha, queda de folhas eperda de frutos (França et al., 2000).

Na cultura do tomate, os danosdiretos causados pela mosca brancapodem ser visualizados externamenteatravés de anomalias ou desordensfitotóxicas caracterizadas pelo ama-durecimento irregular dos frutos, cau-sado pela injeção de toxinas durantea alimentação do inseto. Ao mesmotempo, as excreções açucaradas pro-duzidas pela mosca favorecem o de-senvolvimento da fumagina sobre osfrutos e folhas, reduzindo a capacida-de fotossintética da planta, e afetandoa qualidade e a produção dos frutos.A desuniformidade na maturação dosfrutos dificulta o reconhecimento doponto de colheita e reduz, no caso detomate para indústria, a qualidade dapolpa (Haji et al., 1997).

De maneira geral, a ação dos vírusapresenta como sintomas característi-cos o amarelecimento total da planta,nanismo acentuado e severo enruga-mento das folhas terminais das plantas,podendo ocasionar perda total da pro-dução (Haji et al., 1997). Quando ovírus infecta plantas ainda jovens, es-sas têm o crescimento paralisado e asperdas na produção podem variar de40% a 70%. Para o tomate industrial,também são relatados sintomas comoclorose, nanismo e encrespamento dasfolhas, pouca floração e amadureci-mento irregular dos frutos, causado,provavelmente, por toxinas injetadas

pelo inseto, o que dificulta o reconhe-cimento do ponto de colheita dessesfrutos e reduz a produção e a qualidadeda pasta, além de reduzir o grau brix.Internamente os frutos são esbranqui-çados, com aspecto esponjoso ou“isoporizados” (França et al., 2000).

Geminivírus no Brasil

O primeiro relato de geminiví-rus em tomateiro, no Brasil, é dadécada de 70 (Maytis et al., 1975).Seis diferentes vírus transmitidos pelamosca-branca foram observados, sem,entretanto, causarem danos de im-portância econômica.

Em 1994, no Distrito Federal, foiobservada a ocorrência de nova es-pécie de geminivírus não relatada emoutras regiões do mundo (Ribeiro etal., 1994). Em 1995, a virose expan-diu-se por toda a Região Centro-Oeste, causando perdas médias de40% a 100% (Bezerra et al., 1996).

Nos últimos anos, foram obser-vados em tomateiros, em várias regi-ões do Brasil, danos significativoscausados por geminivírus associadosà ocorrência de B. argentifolii (Françaet al., 1996). Em Minas Gerais, Rezendeet al. (1996) e Zerbini et al. (1996)observaram perdas superiores a 50%da produção no cinturão verde deBelo Horizonte e no Triângulo Minei-ro. A clonagem e o seqüenciamentode fragmentos de DNA dos compo-nentes A e B de geminivírus isoladosdessas duas regiões indicaram tratar-se de dois geminivírus distintos (Ri-beiro et al., 1998b). Em São Paulo, umnovo geminivírus em tomateiro foidescrito por Faria et al. (1997). Osurgimento quase simultâneo de no-vos geminivírus que infectaram toma-teiros na Região Sudeste sugere umamudança nas populações da mosca-branca, com maior predominância deB. argentifolii sobre B. tabaci. Essefato criaria condições para que vírusque infectam plantas selvagens inva-dam o tomateiro e, uma vez adapta-dos ao novo hospedeiro, dêem ori-gem a um novo vírus através derecombinação ou reagrupamento decomponentes. Ressalte-se que os ge-minivírus vêm sendo relatados emplantas daninhas amplamente disse-

minadas naquela região (Krause et al.,1998, entre outros).

Na Região Nordeste, o primeirorelato de geminivírus foi em 1996, nomunicípio de Seabra, na Bahia. Sinto-mas de mosaico amarelo foram obser-vados em uma plantação de tomateirocom incidência da doença em 100% dacultura. A análise de tecido de plantassintomáticas revelou a presença degeminivírus com genoma bipartido(Ribeiro et al., 1996). Naquelas áreas,100% das plantas com menos de doismeses após o transplante apresenta-vam-se infectadas (Bezerra et al., 1997).Semelhantemente ao relatado paraoutras regiões, o aparecimento degeminiviroses naquela área ocorreuapós o surgimento e a explosão dapopulação de B. argentifolii em 1995 eem 1996, em culturas de importânciaeconômica para a região, como melão,melancia e tomate.

Em 1997, a doença foi relatadano submédio São Francisco, a maiorregião produtora de tomate para pro-cessamento industrial do Brasil (Be-zerra et al., 1997). Até o momento, acaracterização molecular de geminiví-rus coletados no submédio São Fran-cisco mostra a presença de três novasespécies não relatadas em outras regi-ões do mundo. Foram encontradasinfecções mistas em uma planta, su-gerindo que a situação é mais comple-xa que a relatada até o momento emoutras regiões (Ribeiro et al., 1998a).De acordo com Faria et al., 1997,ainda naquele ano foi detectada umanova espécie de geminivírus, deno-minada risca amarela da nervura dotomateiro (tomato yellow vein streakvírus, TYVSV). No Estado do Rio dejaneiro, foi também observada a pre-sença de geminivírus em amostrascoletadas no município de Campos.

No ano de 1998, foi detectada apresença de geminiviroses em mate-rial coletado no Ceará (Bezerra et al.,1998). Considerando-se o alto graude severidade de doenças causadaspor esses vírus, a relativa inexistênciade fontes naturais de resistência noBrasil, a ampla gama de hospedeiros(plantas daninhas, silvestres e plan-tas ornamentais) e a pouca informa-ção referente às espécies encontra-das no país, essa é, atualmente, a


principal doença de tomate nas regi-ões produtoras dessa hortaliça paraprocessamento industrial.

Técnicas diagnósticas defitovírus

Os vírus de plantas são conheci-dos por sua extraordinária diversida-de genética, tanto dentro da mesmaespécie como entre espécies diferen-tes. Para o diagnóstico correto deuma doença viral, muitas vezes faz-se necessária a aplicação de dois oumais métodos para o diagnósticocorreto do vírus em estudo. A esco-lha deve ser função da sensibilidade,exatidão e reprodutibilidade do mé-todo, quantidade de amostras pro-cessadas em um determinado perío-do de tempo, custo do material utili-zado, sofisticação dos aparelhos eadaptabilidade às condições de tem-po (Zambolim, 1999). Diversos mé-todos têm sido empregados para de-tectar geminivírus em tomate, inclu-indo técnicas sorológicas e PCR.

O RAPD

O RAPD (“Random AmplifiedPolymorphic DNA”) é uma técnicaderivada da PCR. Uma das limitaçõesda PCR é a necessidade do conheci-mento prévio das seqüências de nu-cleotídeos que flanqueiam a seqüên-cia do DNA de interesse. Para que seconheçam essas seqüências, são ne-cessários a clonagem e o seqüencia-mento da região. Por isso, com exce-ção de alguns genes de seqüênciaconhecida, a PCR apresentou, inicial-mente, uso limitado como técnicapara a obtenção de marcadores mole-culares. O grande avanço na área demarcadores moleculares baseados emPCR ocorreu em 1990, com a idéia dese utilizar primers mais curtos e deseqüência arbitrária na reação de am-plificação, eliminando assim a neces-sidade do conhecimento prévio daseqüência. Essa técnica foi desenvol-vida, independentemente, por doisgrupos nos Estados Unidos. Williamset al., em 1990, patentearam a tecno-logia com o nome mais comumenteutilizado, RAPD, ou seja, DNA poli-mórfico amplificado ao acaso.

Objetivo

Através da técnica de RAPD, épossível distinguir cultivares resis-tentes de cultivares suscetíveis ageminiviroses, gerando um padrãode bandas específico para cada gru-po. Folhas jovens de plantas da linha-gem LA3473 e da cultivar Viradoroforam submetidas à análise por RAPDna tentativa de encontrar marcadoresque identificassem resistência ou sus-cetibilidade.

Material e métodos

Viradoro é uma cultivar desti-nada ao processamento industrial,resistente ao Viracabeça do toma-teiro (Tospovírus), à mancha-de-estenfílio (Stemphylium solaniWeber), à murcha-de-fusarium(Fusarium oxysporum (Schlecht.)f. sp. Lycopersici (Fol) (Sacc.) raça1) e ao nematóide das galhas(Meloidogyne spp.), porém suscetí-vel a geminivírus. Como caracterís-ticas principais dessa cultivar po-dem ser citados: hábito de cresci-mento determinado, excelente co-bertura dos frutos, sendo estes fir-mes e de formato quadrado-oblon-go, maturação uniforme, com colo-ração externa vermelho-escurobrilhante. O brix varia de 4,4% a4,7% e o peso médio dos frutos é de70 a 80 gramas. Em condições expe-rimentais, Viradoro tem alcançado aprodutividade de 90 toneladas porhectare. Essa cultivar foi seleciona-da a partir de cinco ciclos de autofe-cundação desenvolvidos após o quar-to retrocruzamento sucessivo para acultivar IPA-5, tendo como progeni-tor não recorrente a linhagem TSW-10, com resistência a Tospovírus.

A linhagem LA3473, resistente ageminivírus, possui hábito de cresci-mento determinado médio, porte mé-dio, frutos alongados de tamanhomédio, produz aproximadamente 15frutos por quilo e sua provável ori-gem é Israel. Essa linhagem possui ogene wilt, cujos sintomas são muitosemelhantes aos sintomas apresenta-dos pelas plantas infectadas com ge-minivírus (Ednardo Ferraz, comuni-cação pessoal).

Semeadura do material

Sementes da linhagem LA3473e da cultivar Viradoro foramsemeadas em bandejas de isoporpróprias para este fim e colocadasem casa de vegetação. A percenta-gem de germinação foi geralmentesuperior a 85%. A coleta do materialfoi efetuada após emissão da tercei-ra folha do tomateiro, em média,com 29 a 35 dias de idade, guardan-do-se em sacos plásticos individu-ais, etiquetados e armazenados emfreezer a temperatura de 80°C ne-gativos até o momento da extraçãodo DNA.

Extração de DNA total

Para a extração de DNA total,utilizou-se o protocolo de Dellaportaet al. (1983), com modificações. Umapequena amostra de tecido foliar jo-vem (dois discos foliares) foimacerada em nitrogênio líquido ecolocada em um tubo eppendorf de1,5 ml com 700 µl do tampão deextração (100 µM de EDTA, 2,5 M deNH

4A

c, 100 mM de tampão Tris, pH

8,0), sendo incubada em banho-mariaa 65°C. Após o resfriamento, adicio-naram-se-lhe 600µl de clorofil(clorofórmio:álcool isoamílico 24:1)e a mistura foi centrifugada por 5minutos a 14.000 rpm. A fase aquosafoi transferida para novos microtubose 1/10 do volume de SDS 20% + NaCl1,4M foi-lhe adicionado. Após a ho-mogeneização da solução, repetiu-sea extração com 600 µl de clorofil. Afase aquosa foi transferida para no-vos microtubos. Adicionou-se 2/3 dovolume da solução aquosa deisopropanol gelado (-20°C). A se-guir, os microtubos foram centrifuga-dos a 7.000 rpm por 4 minutos. Osobrenadante foi descartado cuida-dosamente. O pellet foi lavado duasvezes em 1 ml de etanol 70% e umavez em etanol 95%. O etanol foidescartado e o precipitado ficou atemperatura ambiente para secar e,posteriormente, foi ressuspenso em100 µl de tampão TE. Diversas dilui-ções do DNA foram testadas, entreelas: 1:10; 1:50; 1:100; 1:200; 1:500 e1:1000.


RAPD

Foram empregados 20 primers dasérie OPP (Operon Technologies Inc.)para a amplificação do material, cujamistura básica continha: 10 ng de DNA/ml, 2.5 µl do tampão de PCR (AmershamPharmacia) (10X); 1.7 µl de MgCl

2 (25

mM); 1.25 µl da solução de dNTPs(2mM cada); 2.5 µl do primer (4µM) e0.4 µl de Taq polimerase (5 U/ml); águaq.s.p. 25 µl. O material foi submetido àsseguintes etapas de amplificação: umciclo de desnaturação a 94oC por 3 min.seguido por 94oC por 15 seg., 42oC por30 seg. e 72oC por 1 minuto. As trêsúltimas etapas foram repetidas quaren-ta e três vezes. A amplificação foi con-cluída a 72oC por 7 minutos.

Visualização do produto deamplificação

Os amplicons foram separadosem gel de poliacrilamida 6%. Os géisforam fixados e digitalizados direta-mente em scanner de mesa ou foto-grafados sob transiluminação comluz branca e película em cores.

Estimativa da quantidadede DNA

A estimativa da quantidade deDNA foi efetuada em gel de agarose0,8% corado com brometo de etídeo,utilizando-se um volume conhecidode solução de DNA (marcador de 100pares de bases, Gibco) como padrãopara inferir a concentração de DNAnas amostras.


A técnica do RAPD é muito utiliza-da para o estudo da diversidade gené-tica, construção de mapas genéticos,identificação de marcadores ligados aresistência a bactérias, fungos, vírus,determinação da pureza e identifica-ção de híbridos, entre outros (Weikert-Oliveira et al., 2002; Carvalho et al.,2002). A velocidade, eficiência econfiabilidade da metodologia RAPDem conjunto com a análise numérica,torna essa técnica particularmente apro-priada na formulação de estratégiaspara um manejo efetivo de coleções de

germoplasma em termos de identifica-ção de duplicatas, estimativa da diver-sidade, monitoramento da erosão ge-nética e aumento do uso das coleções.

O método de extração usado paraobter DNA a partir de discos foliares detomateiros permitiu a obtenção de DNAcom grau de pureza elevado, que podeser empregado em reações de RAPD,sem inibição da Taq polimerase porcomponentes vegetais contaminantes.O rendimento do método permitiuobter uma quantidade bastante variá-vel de DNA, tipicamente entre 2 e 20µg de DNA, para cada 2 discos foliares.

Dos 20 primers constantes do kitOPP empregado, apenas 8 produziramprodutos de amplificação com DNA detomateiro. Ao se compararem os pa-drões de bandas obtidos pela separa-ção em eletroforese em SDS poliacrila-mida dos produtos de amplificaçãogerados no RAPD (Figura 1), 6 primersmostraram ser discriminativos, produ-zindo um padrão de bandas para acultivar Viradoro muito distinto daque-le obtido para a linhagem LA3473. Paratodos esses primers, não foram obtidasbandas para a linhagem LA3473 quan-do se empregou 1 µl de DNA de tomatepreviamente diluído 104 vezes em TE.Ao contrário, um padrão compostopor, pelo menos, 3 bandas nítidas foiobtido para a cultivar Viradoro nessascondições. A redução da quantidadede DNA alvo na reação, pela diluiçãoprévia do DNA extraído das plantas em5 x 104 vezes, resultou no aparecimen-to de uma a três bandas de poucaintensidade na amplificação do DNAobtido da linhagem LA3473 para 4primers, conservando o padrão com-plexo de bandas para a outra cultivar,para os 6 primers selecionados.

Os padrões de bandas obtidospara a cultivar Viradoro não foram idên-ticos quando foram empregadas duasdiluições distintas de DNA alvo: excetopara o primer OPP5, os padrões obtidostendiam a apresentar bandas de pesomolecular mais alto para a quantidademaior de DNA alvo. Fontes e concentra-ções de primers diferentes influenciamo padrão de bandas e certos primersproduzem padrões de bandas maisconfiáveis quando usados em concen-trações mais altas do que o usual,provavelmente porque o DNA genômico

usado possui uma freqüência muitorara de sítios de anelamento para essesprimers, de modo que sua concentra-ção efetiva para amplificação é diminu-ída no tubo da reação. Esse efeitotambém foi observado no mesmo labo-ratório quando se utilizou DNA de Musacom os mesmos primers. No presentetrabalho, foi observado efeito seme-lhante no padrão de bandas, com dife-rentes concentrações de DNA genômico,como, por exemplo, para a cultivarViradoro, à medida que havia um au-mento da concentração de DNAgenômico, bandas de maior peso mole-cular podiam ser visualizadas, com qual-quer um dos cinco primers emprega-dos, exceto o OPP5. A intensidade domarcador RAPD está associada ao graude homologia entre o primer e a amos-tra ou à amplificação de outros frag-mentos da amostra, o que pode explicaro aparecimento de bandas de menorintensidade no presente trabalho. Opoder discriminatório dos primers alea-tórios não depende somente do núme-ro de padrões gerados, mas também dafreqüência dos diferentes padrões.

Conclusão

Pode-se inferir deste trabalho quea metodologia utilizada mostrou-sesatisfatória para a discriminação deplantas de tomate resistentes e susce-tíveis a geminivírus, visto que foiobtido um padrão reproduzível debandas para o material suscetível.

Apoio Financeiro:

CAPES ( Coordenação deAperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior)


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Pesquisa

Glucanases Fúngicas

Ellen Cristine GieseBacharel em Química, Mestranda em Biotecnologiado Programa de Biotecnologia do Departamento deBioquímica, Universidade Estadual de Londrina - [email protected]

Aneli de Melo BarbosaFarmacêutica-Bioquímica, Dra em Bioquímica(UFPR), Pós-doutora em Biotecnologia (MurdochUniversity, Perth- WA, Austrália), Profa. Associado Cdo Departamento de Bioquímica - CCE, UniversidadeEstadual de Londrina - [email protected]

Maria de Lourdes Corradi da SilvaFarmacêutica-Bioquímica, Dra. em Bioquímica(UFPR), Pós-doutora em Bioquímica (Ohio StateUniversity, Columbus-OH,USA), Professora AssistenteDoutora do Departamento de Física, Química eBiologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia -UNESP/Presidente Prudente - [email protected]


Produção e aplicações das β-1,3 e β-1,6 glucanases

Introdução

Exopolissacarídeos são gomassolúveis em água, produzidos poruma ampla variedade de microrga-nismos e possuem propriedades físi-cas peculiares, que favorecem o em-prego nas indústrias alimentícias, far-macêuticas, petrolíferas, entre outras(Margaritis & Pace, 1985). Estesbiopolímeros podem ser degradadospor hidrolases específicas denomi-nadas polissacaridases (Sutherland,1999). Estas enzimas, amplamentedistribuídas em fungos, são classifi-cadas como β-glucanases quandohidrolisam ligações β-D-glicosídicas(Manners et al., 1976).

O crescente interesse no estudodas β-glucanases concentra-se no seupotencial de aplicação industrial, con-siderando a sua ação hidrolítica so-bre diversas substâncias naturais(Warren, 1996; Kirk et al., 2002).

A atividade das glucanases ocor-re em todos os estágios do ciclo devida fúngico, incluindo a autólise. Aresistência das hifas à lise celular temsido atribuída ao equilíbrio entre asíntese e a hidrólise de uma varieda-de de ligações β-glicosídicas (Whiteet al., 2002). As β-glucanases estãolocalizadas tanto no citoplasma dascélulas fúngicas, como também liga-das à parede celular (Santos et al.,1979).

O papel das β-1,3-glucanasesfúngicas na natureza parece estarassociado à morfogênese (Rapp,1992). Em leveduras, estas hidrola-ses têm sido estudadas devido ao seupapel na germinação, esporulação ecrescimento celular, sendo expres-

sas de diferentes maneiras durante ocrescimento vegetativo (McLeod etal., 2003).

As β-glucanases fúngicas estãoassociadas aos processos de sobrevi-vência, degradação de polissacaríde-os (Noronha et al., 2000), patogenici-dade (Vázquez-Garcidueñas et al.,1998), sendo que durante muito tem-po se acreditou que a função originaldestas enzimas estaria relacionada àpromoção do crescimento e divisãocelular (McLeod et al., 2003).

Alguns fungos, tais comoAspergillus, Fusarium, Rhizomucore Absidia, são patogênicos para hu-manos. Algumas drogas antifúngicasagem sobre estes microrganismos,estimulando a ação de enzimas en-volvidas no metabolismo de glucanas,como as exo-β-1,3-glucanases, queestão associadas com a diminuiçãoda resistência à fagocitose (Lupetti etal., 2003).

Em 1957, Stone descreveu a com-plexidade das β-glucanases deAspergillus niger, relatando a presen-ça de β-1,3-glucanases nas prepara-ções de celulases provenientes destefungo. Reese e Mandels (1959) seleci-onaram 140 fungos produtoresconstitutivos de β-1,3-glucanases e,através da análise por cromatografiaem camada delgada (TLC) dos produ-tos resultantes da hidrólise enzimáticade laminarina (β-(1→3)-glucana), pro-puseram dois mecanismos de açãopara estas enzimas: (a) Endo-, consti-tuindo uma ação randômica no subs-trato, resultando em oligossacarídeosde maior peso molecular e (b) Exo-,produzindo glucose como único pro-duto de hidrólise.


edsezapacsamizneedserotudorpsognufedsolpmexeesesadiracassilopsadoãçacifissalC.1alebaTrasilordih βββββ 1(- →→→→→ e-)3 βββββ 1(- →→→→→ sanaculg-)6

sesadiracassiloP somsinagrorciM saicnêrefeR

sesanaculg-3,1--oxe)85.1.2.3CE(

anaitrebilanitorelcS srennaM .late )6791(mucilatimuillicineP sotnaS .late )7791(assarcaropsorueN yeRleD .late )9791(reginsulligrepsA yréK late )9891(.mucilaxomuillicineP nostiP .late )1991(mucinaculgmuitorelcS )2991(ppaRmunaizrahamredohcirT ahnoroN .late )0002(

.psmuinomercA suyaJ .late )2002(snalullupmuidisaboeruA llebpmaC .late )3002(

mullerepsaamredohcirT araB .late )3002(

sesanaculg-3,1--odne)93.1.2.3CE(

uzihrrasupozihR )9591(sledneM&eseeRmunaizrahamredohcirT sañeudicraG-zeuqsáV .late )8891(mucinaculgmuitorelcS )2991(ppaR

sesanaculg-6,1--odne)57.1.2.3CE(

mucilatimuillicineP sotnaS .late )7791(assarcaropsorueN yeRleD .late )9791(mucinaculgmuitorelcS )9891(ppaRmunaizrahamredohcirT zurCaled .late )3991(

.psmuinomercA suyaJ .late )1002(alocignufmuillicitreV yemA .late )3002(

sesadisoculg-)12.1.2.3CE(

mucinaculgmuitorelcS )9891(ppaRmunicisrepmuinomercA )7991(.latenostiPedirivortaamredohcirT )1002(.lateilleznoD

A cromatografia em camada delga-da ainda é utilizada para determinar omodo de ação das β-glucanases.Campbell e colaboradores (2003) anali-saram os produtos de hidrólise dosfiltrados de meio de cultivo deAureobasidium pullulans incubadoscom laminarina, escleroglucana eepiglucana e verificaram moléculas deglucose como os maiores produtos dehidrólise. Esta observação sugere que ahidrolase produzida por Aureobasidiumpullulans é uma exo-β-1,3-glucanase.

Reese e colaboradores (1961)foram os primeiros pesquisadores aestudar as β-1,6-glucanases fúngicas,cuja atividade parece estar associadaà atividade de β-1,3-glucanase, emalguns microrganismos (Pitson et al.,1991). Estes pesquisadores observa-ram que a hidrólise da pustulana (β-(1→6)-glucana) através de β-1,6-glu-canases resultou em moléculas degentiotetraose, gentiotriose, gentio-biose e glucose, constatando queestas enzimas são do tipo endo eatuam randomicamente.

A ocorrência de glucanas dotipo β-(1→6) na natureza é rara,sendo que geralmente as ligaçõesglicosídicas deste tipo ocorrem emconjunto com ligações do tipo β-(1→3) em polímeros produzidos poralgas, leveduras, fungos e bactérias.

Em 1975, Villa e colaboradoreselaboraram uma hipótese sobre a exis-tência de uma exo-β-glucanase nãoespecífica, que apresentaria tanto ati-vidade hidrolítica nas ligações do tipoβ-(1→3) quanto β-(1→6), em filtra-dos da levedura Pichia polymorpha.Vários estudos foram desenvolvidossobre polissacaridases fúngicas comatividade de β-glucanases. A classifi-cação destas enzimas está apresenta-da na Tabela 1.

Produção e regulação dasíntese de βββββ-1,3 e βββββ-1,6-

glucanases

A relação entre a atividade dasβ-glucanases e a síntese e degrada-ção das β-glucanas por seus respec-tivos fungos produtores ainda não foiestabelecida (Pitson et al., 1991).

O fungo Sclerotium glucanicumé produtor de uma β-(1→3)(1→6)-glucana extracelular denominada es-cleroglucana. Rapp (1989) analisou aprodução desta β-glucana e as respec-tivas hidrolases deste fungo utilizandoglucose 1% (p/v) como única fonte decarbono; observou um decréscimo doEPS e da biomassa no meio de cultivo,acompanhado do aumento da ativida-de das glucanases no período em quea concentração do substrato diminuiu.

A ocorrência de atividade de β-1,3 e β-1,6-glucanase também foirelatada no fungo Acremonium.persicinum, o qual é produtor deuma β-(1→3)-glucana extracelular.Pitson e colaboradores (1991) veri-ficaram a presença destas polissa-caridases nos sobrenadantes domeio de cultivo, assim como nocitoplasma e na parede celularfúngica.

O fungo Acremonium sp. tam-bém é produtor de três β-1,3-gluca-nases e uma β-1,6-glucanase extra-celular somente na presença deindutores como a laminarina,pustulana ou escleroglucana. Jayus ecolaboradores (2002) analisaram aprodução de β-1,3 e β-1,6-glucana-ses por Acremonium sp.; sugeriramque a atividade de β-1,3-glucanaseencontra-se associada ao crescimen-to fúngico, ao contrário da atividadeda β-1,6-glucanase.

Pitson e colaboradores (1997)constataram que existe uma açãosinérgica entre β-glucanases e β-glucosidases em Acremonium.persicinum, ou seja, os produtos dehidrólise das β-1,3 e β-1,6-glucana-ses foram facilmente degradadospelas β-glucosidases, gerando prin-cipalmente glucose e também algunsoligossacarídeos.


A produção de β-1,3-glucanasespor fungos que não produzem polis-sacarídeos é geralmente estimuladapela presença de paredes celularespurificadas de outros microrganismos.Noronha e colaboradores (2000) veri-ficaram um aumento significativo des-tas enzimas pelo Trichodermaharzianum quando utilizaram pare-des celulares fúngicas purificadas dePythium sp., Rhizoctonia solani eSclerotium rolfsii como única fonte decarbono, o que também foi verificadopor Bara e colaboradores (2003) parao fungo Trichoderma asperellum. Es-tes resultados sugerem que a regulaçãoda expressão de β-1,3-glucanase nes-tes fungos pode ser influenciada pelaquantidade de β-glucana presente nomeio de cultivo, que atua como agen-te indutor.

O excesso de glucose ou outrafonte de carbono facilmente fermentá-vel reprime a produção de β-glucanasesem alguns microrganismos. Rapp (1989)observou que durante o crescimento doSclerotium glucanicum, em excesso deglucose ou xilose, a atividade de β-glucanase não foi detectada. A presençade glucose no meio de cultivo tambémreprimiu a produção de β-glucanasesem Acremonium persicinum (Pitson etal., 1991) e em Trichoderna harzianum(Noronha et al., 2000). A síntese de β-glucanases nestes microrganismos éregulada por repressão catabólica, sen-do que esta forma de controle tem sidoobservada em outros fungos, incluindoNeurospora crassa, Penicillium italicum,Sclerotium rolfsii e Schizophyllumcommune (Rapp, 1989).

A desrepressão da formação de β-glucanases em Sclerotium glucanicumdurante o crescimento em concentra-ções limitadas de glucose envolve ex-tensiva autólise dos micélios fúngicos

e a degradação da β-glucana produzi-da (Rapp, 1992). Durante a desrepres-são, os oligômeros gerados da paredecelular, durante a autólise, aumentama atividade das β-glucanases, devido aseu curto tempo de permanência nomeio de cultivo (White et al., 2002).

A regulação exercida pelaglucose envolve a repressão da ex-pressão dos genes que codificamestas enzimas. Uma vez consumida afonte de carbono, ocorre a desre-pressão, resultando na síntese das β-1,3-glucanases (Noronha et al., 2000).

A regulação e a síntese das β-glucanases estão sujeitas a diferentesmecanismos de controle, sendo queestas diferenças podem ser explica-das pelo papel metabólico exercidode acordo com cada microrganismo.No fungo Trichoderma viride, a sín-tese de β-1,3-glucanase acompanhaseu desenvolvimento celular (Del Reyet al., 1979), enquanto que emNeurospora crassa e Penicilliumitalicum a produção destas enzimasocorre paralelamente à redução doseu crescimento (Santos et al., 1977).

A glucose não reprime a produçãode β-glucanases pelo fungo filamentosoTrichoderma viride e as enzimas sãoproduzidas durante o crescimento napresença deste monossacarídeo. Nestefungo, as β-glucanases podem estarenvolvidas nos processos de formaçãoda parede celular, já que a atividadeespecífica destas enzimas aumenta du-rante o crescimento exponencial destemicrorganismo (Del Rey et al., 1979). Aglucose também não exerce repressãona produção de β-1,3-glucanases porleveduras, podendo atuar até comoagente indutor em alguns casos(Saligkarias et al., 2002).

Estudos sobre a regulação dasíntese de β-1,3-glucanases pela fonte

de nitrogênio também têm sido reali-zados (Pitson et al.,1996). O conheci-mento dos mecanismos controladoresda atividade destas polissacaridases éfundamental para se exercer o contro-le sobre a autólise dos fungosfilamentosos, seja para indução, noscasos de controle biológico, como naprevenção, para aumentar a produçãode metabólitos de interesse embioprocessos (White et al., 2002).

Beta glucanases:propriedades, atividade e

inibição

Laminarina e pustulana são ge-ralmente usadas como substratos nosensaios enzimáticos utilizados na de-terminação das atividades de β-1,3 eβ-1,6-glucanases, respectivamente(Rapp, 1989). Os parâmetros cinéticosdestas polissacaridases variam de acor-do com o microrganismo estudado.

A atividade das β-glucanasespode ser inibida pela presença decompostos como clorofórmio,benzenóides, organofosfatos, quelan-tes, entre outros, podendo ocorrerinibição devido a concentrações ele-vadas de substrato e também dosprodutos reacionais (Rana et al.,2003). Certos cátions e ânions assimcomo compostos quelantes e deter-gentes também podem inibir as β-glucanases em diferentes níveis. ATabela 2 mostra o efeito de diferen-tes metais e compostos inibidores deβ-glucanases fúngicas.

Notario e colaboradores (1976)verificaram que as β-glucanases sãoproteínas ácidas, carregadas negati-vamente. A composição em aminoá-cidos revelou alta porcentagem emaminoácidos ácidos além de glicina ealanina em grandes proporções.

.sacignúfsesanaculg-ßededadivitaaerbossotsopmocesiatemsetnerefidedotiefE.2alebaT

oãçA sotsopmoC omsinagrorciM saicnêrefeR

oãçibinIatlAuC +2 HN,

4+ ,ATDE,

gH +2 P,b+ SDS,

munaizrah.T

mucinaculg.S

regin.A

ueidrobuD .late )5891(

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anaR late )3002(oãçibinI

adaredoMnM +2 eF, +2 aN, + munaizrah.T

regin.A

hgniS late )0991(.

anaR .late )3002(

airótibinIoãNNC - OP,

4-3 oC, +2 ,

aC +2 nZ, +2

munaizrah.T

regin.A

ueidrobuD late )5891(.

hgniS late )0991(.

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Através da purificação das β-1,3-glucanases fúngicas, foi verificado queos microrganismos não produzem umaproteína específica, e, sim, um con-junto de proteínas com diferentesmassas moleculares, pH e temperatu-ra ótimos, porém, com a mesma espe-cificidade, ou seja, estes fungos pro-duzem β-1,3-glucanases diversas.

Os possíveis motivos da exis-tência desta multiplicidade enzimáti-ca inclui a expressão de genes dife-rentes e as possíveis modificaçõespós-traducional (Jayus et al., 2001).

O Trichoderma harzianum, porexemplo, é descrito na literatura comoprodutor de um complexo enzimáticoque contém pelo menos sete β-1,3-glucanases induzidas (Vázquez-Garcidueñas et al.,1998). Noronha eUlhoa (2000) purificaram uma β-1,3-glucanase de 29kDa produzida porTrichoderma harzianum; compara-ram os parâmetros cinéticos e deinibição enzimática desta hidrolasecom outras previamente purificadase concluíram que cada enzima pro-duzida por este microrganismo é di-ferente, e provavelmente, seja codifi-cada por genes diferentes. Bara ecolaboradores (2003) também purifi-caram as β-1,3-glucanases produzi-das por Trichoderma asperellum everificaram que este microrganismoé produtor de duas proteínas comesta atividade.

Jayus e colaboradores (2001)purificaram uma β-1,6-glucanaseproduzida por Acremonium sp.;verificaram que o peso molecular,

o pH e temperatura ótimos, eramsimilares a outras β-1,6-glucanasesmicrobianas estudadas, como asde Trichoderma harzianum eAcremonium persicinum.

Aplicações biotecnológicasdas polissacaridases

As aplicações biotecnológicasdos polissacarídeos são limitadas,devido aos problemas relacionadoscom as modificações físicas, quími-cas e enzimáticas, que são necessári-as para o desenvolvimento de novosprodutos (Ramesh & Tharanathan,2003).

Técnicas de fermentação e bio-tecnologia têm sido desenvolvidascom o objetivo de sintetizar e modi-ficar carboidratos, sendo baseadasessencialmente no uso de polissaca-rídeos. No entanto, há dificuldadesem tornar alguns processos econo-micamente viáveis e também de seobter enzimas específicas para a con-versão de determinados substratos(Vandamme & Soetaert, 1995).

A Tabela 3 apresenta algumasdas aplicações biotecnológicas dasβ-glucanases de origem fúngica.

O uso de enzimas pode repre-sentar uma via alternativa, devido àsua alta especificidade, na identifica-ção química das β-glucanas fúngicas(Sutherland, 1984).

As β-1,3-glucanases são específi-cas para substratos contendo seqüên-cias lineares de três ou mais unidadesde glucose unidas através por liga-

ções glicosídicas do tipo β-(1→3) con-tendo uma extremidade terminal não-redutora. No entanto, um grau desubstituição moderado de resíduos deglucose pode ser tolerado, e as β-1,3-glucanases podem atuar sobre β-(1→3)(1→6)-glucanas, por exemplo(Manners et al., 1976). Rapp (1992)analisou os produtos de hidrólise delaminarina e escleroglucana, utilizan-do a enzima parcialmente purificadaproduzida por Sclerotium glucanicum.Sob as condições da análise, a glucosefoi o único produto resultante dahidrólise da laminarina, enquanto queglucose e gentiobiose foram os pro-dutos formados na hidrólise da escle-roglucana.

Kéry e colaboradores (1991) uti-lizaram uma preparação enzimáticacontendo β-1,3-glucanases produzi-das pelo fungo Aspergillus niger,para degradar uma glucana insolú-vel de levedura, em fragmentos me-nores e solúveis em água. A hidróliseda parede celular de Saccharomycescerevisiae foi realizada no pH ótimode ação da β-1,3-glucanase utiliza-da. Os fragmentos obtidos foramseparados por cromatografia de ex-clusão molecular em Sephadex G-50, sendo que mudanças no pesomolecular dos fragmentos de glucanaforam observadas de acordo com otempo de hidrólise.

As β-(1→3)-glucanas têm sidoinvestigadas por apresentarem umavariedade de respostas biológicasde defesa. Estas moléculas de ca-deia linear e elevada massa molecu-

.acignúfmegiroedsesanaculg-ßsadsacigóloncetoibseõçacilpA.3alebaToãçacilpA megirO saicnêrefeR

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lar são insolúveis em soluções aquo-sas neutras, enquanto seus oligôme-ros de baixo peso molecular sãoaltamente solúveis (Ramesh &Tharanathan, 2003). A solubilidadeexerce influência significativa naeficiência da ligação do polissacarí-deo com o receptor, afetando o seuefeito imunológico (Tokunaka et al.,2002). Muitas β-glucanas fúngicaspossuem ação imunomoduladoraquando administradas de maneiraintravenosa ou intraperitonial. A uti-lização de β-glucanas insolúveispode resultar na formação degranulomas, inflamações e dor, quan-do administradas através da viaparental (Sandula et al. 1999).

Segundo Colleoni-Sirghie e co-laboradores (2003) propriedades físi-cas das β-glucanas, como a viscosi-dade e a solubilidade, dependemnão somente do grau de polimeriza-ção, como também das pequenasdiferenças estruturais de cada polis-sacarídeo. A substituição de resíduosβ-(1→6)-glicosídicos na cadeia po-lissacarídica favorece a solubilizaçãode β-(1→3)-glucanas em soluçõesaquosas. Estudos por RMN e difraçãode raio-x têm demonstrado que estassubstituições conferem às β-glucanasuma conformação em tripla hélice(Ramesh & Tharanathan, 2003).

A aplicação terapêutica dosexopolissacarídeos também depen-de da conformação espacial e daspropriedades reológicas específicasde cada macromolécula. A lentinana,uma β-(1→3)-glucana produzida porLentinus edodes, aumenta a resis-tência do organismo contra infec-ções por parasitas e sua formasulfatada está sendo estudada porexibir potente ação anti-HIV. Alaminarina, produzida pela algaLaminaria digitata, também é umaβ-(1→3)-glucana, porém, não exibeatividade biológica significativa(Ramesh & Tharanathan, 2003).

O mecanismo de ação das β-glucanas ainda não é conhecido, masacredita-se que seja dependente damassa molecular do exopolissacarí-deo, dos tipos de ligações glicosídicase resíduos presentes, além da suaconformação espacial (Freimunda etal., 2003). A atividade antitumoraltem sido atribuída à capacidade de

formação de gel de algumas glucanas,sendo que derivados sulfatados dealguns polissacarídeos possuem apli-cação oftalmológica (Ramesh &Tharanathan, 2003).

Estudos sobre sua estrutura econformação utilizando β-glucana-ses podem auxiliar no entendimentosobre o seu modo de atuação (Pitsonet al., 1993) e também na obtençãode oligossacarídeos que apresentemmaior atividade biológica (Miyanishiet al., 2003), visto que algumasglucanas fúngicas apresentam baixaatividade biológica devido à sua bai-xa solubilidade (Sutherland, 1998).

O basidiomiceto Schizophyllumcommune é produtor de uma β-(1→3)(1→6)-glucana extracelularque, especialmente na forma degra-dada, pode ser aplicada como agenteantitumoral, anti-hepatite, anti-HIV eantiviral (Münzberg et al., 1995).

Diferentes métodos, comohidrólise ácida e alcalina, digestãoenzimática e irradiação de ultra-som, têm sido aplicados na despolimeri-zação de biopolímeros, resultandoem fragmentos de menor massa mo-lecular (Sandula et al., 1999). Altera-ções estruturais envolvendo oxida-ção química das cadeias comperiodato e redução com boroidretopodem aumentar a atividade imuno-moduladora e antitumoral de algu-mas glucanas por proporcionarem oaumento da solubilidade das mes-mas (Sutherland, 1998).

Os carboidratos são usualmenteclassificados de acordo com o graude polimerização em açúcares, oli-gossacarídeos e polissacarídeos. Doponto de vista fisiológico, a classifi-cação é feita de acordo com adigestibilidade no intestino delgado,sendo que os carboidratos que apre-sentam menor digestão pelo organis-mo são divididos em amido resisten-te, polissacarídeos diferentes de ami-do e oligossacarídeos não fermentá-veis (Voragen, 1998).

Alguns oligossacarídeos nãofermentescíveis são denominados depré-bióticos e podem ser definidoscomo substâncias não digeríveis queafetam beneficamente o organismo,estimulando seletivamente o cresci-mento de um número limitado debactérias do trato intestinal, benefici-

ando a saúde. Estas substâncias, in-cluindo oligofrutoses, polióis e algunsoligossacarídeos, são fontes de ener-gia para a microflora benéfica doorganismo (Przemyslaw & Piotr, 2003).

Estudos têm sido realizados so-bre a ação destes compostos na pre-venção de infecções intestinais e cân-cer de cólon, na resposta imunológi-ca e na redução dos níveis decolesterol no soro (Holzapfel &Schillinger, 2002).

Frutooligossacarídeos retardama homeostase das células da paredeintestinal, enquanto oligossacaríde-os constituídos por manose podemimpedir a adesão de E. coli nasparedes do intestino (Przemyslaw &Piotr, 2003).

As inúmeras aplicações dos oli-gossacarídeos na agroindústria, nacosmetologia e na indústria alimentí-cia, e, particularmente, suas aplica-ções na área de saúde, tornam neces-sário o desenvolvimento de métodoseficientes para a produção destasmoléculas em escala industrial(Monsan & Paul, 1995).

Com o advento da glicotecnolo-gia, novas aplicações dos oligossacarí-deos têm sido desenvolvidas nas áreasde alimentos, rações animais, fármacos,cosméticos e também como agentesimunomoduladores e pré-bióticos, querequerem a síntese específica de oli-gossacarídeos através de processos téc-nica e economicamente viáveis(Remaud-Simeon et al., 2000).

Estudos investigativos sobre aação catalítica de algumas glicosida-ses na condensação de monossacarí-deos em oligossacarídeos e na trans-ferência de resíduos glicosídicos têmsido relatados (Pitson et al., 1993).Os oligossacarídeos podem ser obti-dos através de síntese enzimática porreações de polimerização, policon-densação e alongamento da cadeia;através da ação de glicosidases, gli-cosiltransferases, fosforilases eglicosintases artificiais. O maior pro-blema deste tipo de síntese é a dispo-nibilidade limitada de enzimas espe-cíficas (Kobayashi et al., 2001). Aincubação de β-glucanases com altasconcentrações de glucose podem re-sultar na produção de trealose, gen-tiobiose, isomaltose, celobiose e la-minaribiose. Heterooligossacarídeos


podem ser obtidos pela incubação deglucose com outros aceptoresglucosídicos (Pitson et al., 1993).

Ning e colaboradores (2003) pro-puseram que a atividade biológica dalentinana, uma β-(1→3)-glucana pro-duzida por Lentinus edotes, dependede sua estrutura em oligossacarídeos.Estudos anteriores relataram que so-mente frações de alta massa molecu-lar (>16kDa) obtidos através dehidrólise parcial com ácido fórmico,apresentaram atividade antitumoral(Sasaki appud Ning et al., 2003). Oli-gossacarídeos com ligações do tipo β-(1→3) e β-(1→6) foram sintetizados apartir de 1,2,5,6-di-O-isopropilideno-α-D-glucofuranose como aceptor gli-cosídico inicial, sendo que alguns oli-gossacarídeos sintetizados inibiram tu-mores em ratos, efetivamente. Sharp ecolaboradores (appud Ning et al.,2003) relataram que hexa- e heptassa-carídeos derivados de β-(1→3)(1→6)-glucanas apresentaram maior ativida-de biológica do que o próprioexopolissacarídeo.

A conversão enzimática dospolissacarídeos em seus respectivosmonômeros e/ou oligômeros podeser realizada pelo uso de hidrolases etransferases de origem microbiana.Enzimas como xilanases, inulinases,alginases, levanases e glucanaseshidrolisam seus respectivos polímerosde maneira específica (Vandamme &Soetaert, 1995).

Myanishi e colaboradores (2003)compararam o efeito de polímerosde β-(1→3)-glucana de Laminariadigitata e de seus oligômeros obti-dos pela ação de β-1,3-glucanasesde Bacillus clausii NM-1, emmielomas humanos. Os resultadossugeriram que a atividade citotóxicadetectada foi derivada dos monócitosestimulados pelos oligossacarídeos,uma vez que a despolimerizaçãoenzimática parece ter sido essencialpara a estimulação dos monócitospela β-(1→3)-glucana.

De acordo com esta revisão daliteratura, foi possível constatar queeste campo da biotecnologia temfuturo promissor, considerando queo desenvolvimento das pesquisas so-bre as polissacaridases irão vencer asbarreiras determinadas pela insolu-bilidade dos polímeros que apresen-

tam atividade biológica, gerando mo-léculas de pequena massa molecular,solúveis, mas que preservam estaatividade.

Portanto, além dos estudos paracompreender a atividade das glucana-ses, que são de extrema importânciaem todos os estágios do ciclo da vidafúngica, novos conhecimentos sobrea produção, síntese e regulação, porvia fermentativa dos microrganismosprodutores, são também de interessebiotecnológico, visto que estes pode-rão gerar novas tecnologias para aobtenção de fármacos, alimentos nu-tracêuticos e produtos que favoreçamo bem-estar da população.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPESpelo auxílio financeiro aoPrograma de Mestrado em

Biotecnologia do Departamento deBioquímica-CCE, da Universidade

Estadual de Londrina. EllenCristine Giese também agradeceao CNPq pela bolsa de mestrado

concedida.


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Pesquisa

Biossegurançaem Biotérios

Alergia: um risco sempre presente

Joel MajerowiczMédico Veterinário; Chefe do Laboratório deExperimentação Animal do Instituto de Tecnologiaem Imunobiológicos (Bio-Manguinhos) daFundação Oswaldo Cruz; Vice-Presidente doColégio Brasileiro de Experimentação Animal /[email protected]

Ilustrações cedidas pelo autor

As respostas alérgicas vão desdeespirros até anafilaxia sistêmica e mor-te. Aproximadamente 33% das pesso-as que desenvolvem alguma atividadeem biotérios apresentam reações dehipersensibilidade e isto constitui umsério problema de saúde ocupacional(Chan-Yeung & Malo, 1994). Esse per-centual é três vezes maior que emqualquer outra atividade.

Descamação da pele, pêlo, sali-va, soro, urina e tecidos animais sãoas principais fontes produtoras dealérgenos. O contato ocorre duranteas atividades de alimentação, limpe-za de ambientes e de materiais,inoculação, sacrifício, cirurgia, cole-ta de tecidos e fluídos corpóreos e notransporte de animais (Harries &Cromwell, 1982). Roedores possuemproteinúria persistente e a urina é amaior fonte de produção de alérge-nos das espécies desta Ordem.

Os alérgenos são proteínas es-pecíficas e, em sua maioria, já estãoidentificadas e caracterizadas.

No camundongo (Mus musculus)foram identificados três alérgenos re-levantes:

• Mus m1, uma pré-albuminaencontrada na urina, folículospilosos e descamação da pele.Essa proteína é produzida nascélulas do fígado e sua concen-tração no sangue e na urina éem torno de quatro vezes maiornos machos que nas fêmeas,devido ao gene responsável pela

sua produção ser testosteronadependente.• Mus m2, uma glicoproteínaoriginada nos folículos pilosose na descamação da pele, po-rém não encontrada na urina.• Mus m3, uma albumina quetem sido demonstrada em 30%dos pacientes alérgicos a ca-mundongo.

No rato (Rattus norvegicus), doisalérgenos foram identificados na uri-na, saliva e pele:

• Rat n 1A, uma pré-albuminaproduzida no fígado;• Rat n 1B, uma globulina tam-bém produzida no fígado.

Alérgenos da cobaia (Caviaporcellus) não estão bem caracteriza-dos, embora tenham sido identifica-dos dois fragmentos antigênicos Cavp 1 e Cav p 2. Ambos são encontradosna urina, no pêlo e na descamação dapele. No coelho (Oryctolaguscuniculus), dois alérgenos estão bemidentificados, Ory c 1 é encontradono pêlo, na descamação da pele e nasaliva; e o Ory c 2, que é encontradono pêlo, na descamação da pele e naurina (Bush et al., 1998).

Em geral, os alérgenos sãocarreados por pequenas partículas,que podem permanecer em suspen-são no ar por extensos períodos eserem facilmente respiráveis. A ina-lação é o meio mais comum de


sensibilização. O contato com mem-branas, mucosas e pele também sãovias de sensibilização, porém menoscomuns. Após um período de tempo,que pode ser de meses a anos, ouquando se inalam quantidades sufici-entes de alérgeno, desenvolve-se asensibilização do organismo. Quan-do exposto novamente a um alérgenoespecífico, os sintomas da alergiaaparecem (Bardana, 1992). Os sinto-mas variam de brandos, como corizae espirro (rinite alérgica); irritaçãoocular e lacrimejamento (conjuntivitealérgica); vermelhidão, prurido eerupção na pele (dermatite de conta-to); congestão nasal; resfriado pro-longado e repetitivo, a graves, quecaracterizam a asma alérgica, cujossintomas podem ser distinguidos pordificuldade respiratória, tosse eestertores pulmonares. Os sintomas,muitas vezes, aparecem rapidamenteapós a exposição ao alérgeno, mas,normalmente, ocorrem de duas a oitohoras após essa exposição.

Todas as pessoas que manusei-am animais estão propensas a desen-volverem sintomas alérgicos, porémaquelas que já demonstravam sinaisou sintomas alérgicos, antes de ativi-dades com animais, estão mais pro-pensas a desenvolverem alergias oumesmo a asma. Pessoas que desen-volvem sintomas de asma, proveni-ente de alérgeno animal, freqüente-mente melhoram ou se recuperamcompletamente se param de se ex-por ao contaminante.

Os fatores de risco estão relacio-nados com a susceptibilidade indivi-dual e à exposição aos alérgenos noambiente de trabalho. A susceptibili-dade é basicamente genética. A expo-sição aos alérgenos no ambiente detrabalho está diretamente relacionadacom o tipo de atividade desenvolvidae com o tempo de contato direto como animal ou com seus subprodutos.Não só as pessoas diretamente envol-vidas com os animais estão propensasa esse risco. Secretárias e pessoal daadministração, que trabalham em am-bientes no mesmo prédio do biotério,estão sujeitos ao contato com alérge-nos carreados por diversos meios.

A prevenção se baseia em evitaro contato com os alérgenos, uma vezque eles são constantemente produ-zidos pelos animais e estão semprepresentes no ambiente de trabalho.

No entanto, já estão definidos edisponíveis, procedimentos e equi-pamentos que podem reduzir, oumesmo eliminar, a exposição ao ris-co de sensibilização. São eles:

Uso de roupa apropriada e deuso exclusivo no biotério, as quaisnão devem ser utilizadas fora dessasinstalações, com vistas a não carrearalérgenos para outras áreas. Nãodevem ser lavadas em casa paraevitar a exposição dos familiares aesse risco. O ideal é que sejamhigienizadas por firmas especializa-das, as quais possuem métodos apro-priados para manuseio e higieniza-ção de uniformes.

A superfície do corpo deve serprotegida para que se evite o contatode alérgenos com a pele; recomen-da-se, portanto, além do uniforme, ouso de luvas, máscara e gorro sempreque houver manipulação de animaisou de seus subprodutos.

Manter sempre limpo ambientes,móveis e gaiolas de animais: O pó daração e da forração das gaiolas sãoveículos transportadores de alérge-nos. Manter o ambiente limpo é dimi-nuir a concentração de alérgenos,minimizando, conseqüentemente, orisco. Durante a limpeza, devem sertomados cuidados especiais para evi-tar a exposição aos alérgenos.

Na manipulação de animais e deseus derivados, fazer uso, sempre quepossível, de cabines de contençãobiológica ou de cabines de fluxolaminar. A cabine de contenção bioló-gica garante a segurança do operadorpela contenção de partículas e micro-organismos na área interna de traba-lho e filtra o ar de exaustão através defiltros de alto desempenho, o mesmoacontecendo com modelos de cabine

de fluxo laminar. Esses equipamentosdevem ser certificados a cada 12 me-ses se o propósito é somente a con-tenção de particulados.

Adequar, se necessário, o siste-ma de ventilação e exaustão mecâni-ca. A exposição aos alérgenos emsuspensão no ar é afetada pelo mo-delo de fluxo de ar, filtração, tipo dematerial usado na forração das gaio-las (“cama”) e umidade relativa. Orecomendado para se manter um ní-vel aceitável de alérgenos no ambi-ente é de 15 a 20 trocas de ar (volumedo ambiente por hora). A elevação da

Higienização de ambienteBio-Manguinhos / Fiocruz

Vestimenta Bio-Manguinhos / Fiocruz

Manejo animal sob cabine de contençãobiológica - IPEN/CNEN/SP


umidade relativa diminui o nível dealérgenos em suspensão no ar, po-rém, para a adoção dessa medida,deve-se considerar que a faixa deumidade relativa recomendada pararoedores é de 55% +/- 5%. O sistemade ventilação e exaustão das áreas deanimais deve ser independente deoutras áreas do biotério.

O direcionamento do ar deveser, sempre que possível, do opera-dor para a gaiola de animais.

O uso de microisolador (gaiolacom filtro), estante ventilada ou sis-tema de módulos para microisoladordiminui substancialmente a presençade alérgenos no ambiente. O princí-pio sobre o qual se baseia omicroisolador é muito similar à placade Petri usada em bacteriologia. Mé-todos físicos e/ou químicos são utili-zados para a esterilização da superfí-cie interna da gaiola, as quais sãomanipuladas posteriormente em sis-temas assépticos. Da mesma formaque o filtro impede a entrada decontaminantes na gaiola, também im-pede a saída, para o ambiente, departículas que carreiam alérgenos. Autilização de cabine de fluxo laminarou de cabine de contensão biológicana manipulação dos microisoladoresdeve garantir que a contaminaçãonão ocorra nesse momento, ou seja,esses equipamentos devem estar cer-tificados e com seus instrumentoscalibrados. A utilização de estante

ventilada com sistema de filtração dear permite o uso de gaiolas abertas.

Existem vários modelos de es-tantes para alojamento de animais ealgumas com portas. Esses equipa-mentos promovem um fluxo de arfiltrado nos compartimentos inter-nos que renovam o ar do interior dasgaiolas e possuem filtros de exaustão,garantindo a contensão dos alérge-nos. Esse sistema não garante acontenção de partículas para o am-biente quando as portas são abertas.O uso de microisoladores em con-junto com estantes ventiladas per-mite um controle mais efetivo dacontaminação do ambiente por alér-genos, bem como propiciam ummicroambiente mais favorável aosanimais, uma vez que a ventilaçãoforçada favorece a troca de ar, dimi-nui a umidade relativa e os odoresno interior da gaiola. Sistemas paramicroisoladores baseiam-se em in-jetar e exaurir o ar diretamente dosmicroisoladores e de forma indivi-dual. Dessa forma, o microambienteé individualizado, sendo que o siste-ma fechado garante a condição mi-crobiológica interna da gaiola e nãopermite a exteriorização doscontaminantes no ambiente. Tantoas estantes ventiladas como o siste-ma para microisoladores se tornamais efetivos no controle de alérge-nos quando o sistema de exaustão édirecionado para fora da edificação.

Outras práticas ou procedimen-tos que auxiliam no controle de alér-genos são:

• Diminuir a densidade animal(animal/m3).• Fazer uso de material absor-vente e não gerador de partícu-las na forração das gaiolas a fimde diminuir consideravelmentea concentração de alérgenos emsuspensão no ar. O sabugo demilho é preferível à maravalha

Cabine para descarte de rejeitos Bio-Manguinhos / Fiocruz

Microisoladores dentro de EstantesVentiladas - IPEN/CNEN/SP

Estantes ventiladasBio-Manguinhos/Fiocruz

Microisolador Centro de BiologiaMolecular – IPEN/CNEN/SP


de madeira devido a sua maiorcapacidade de absorção e seumenor percentual de pó.• Trabalhar, se possível, comespécies animais que produ-zam menos alérgenos, incluin-do os de sexo que tambémproduzam menos alérgenos.• Providenciar e colocar à dispo-sição todos os equipamentos deproteção individual. O uso deprotetores respiratórios pode seruma solução para certas situa-ções, porém não substitui as reco-mendações anteriormente citadas.• Treinar e educar todos osenvolvidos com animais ou comderivados de animais, bem comocom atividades correlacionadaspara esse tipo de risco.• Providenciar monitoramento desaúde de forma regular para todose apropriado aconselhamentomédico para os que desenvolve-

rem sintomas alérgicos. Essas duasações auxiliam na redução deefeitos adversos à saúde.

Finalmente, há casos em quesomente a mudança de atividade é asolução para o problema de saúde.


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Sistema de microisoladores (Racks ventilados)IPEN/CNEN/SP


Pesquisa

A Biotecnologia e a Extinçãode Espécies

João de Deus Medeiros, DrBiólogo, Doutor em Botânica,Professor do Depto. de Botânica,Diretor do Centro de Ciências Biológicas da [email protected]

Ilustrações cedidas pelo autor

Crise da modernidade

O fantasma da extinção de espé-cies biológicas torna-se cada vez maispresente e ameaçador. A drásticaredução das florestas tropicais ele-vou as taxas estimadas de extinçãode espécies biológicas a cifras signi-ficativamente altas. Ainda que essesnúmeros sejam imprecisos e mesmoconsiderando os processos naturaisde extinção de espécies, aventa-seque o homem tenha elevado essataxa de extinção para algo em tornode 100 a 1.000 vezes. Tomando-sepor base uma taxa anual da ordem deuma espécie para cada milhão deespécies, valor médio para todos osgrupos, cuja taxa de extinção estejabem documentada pelo registro fós-sil (WILSON, 1997; WILSON, 2002),SANDES e DI BLASI (2000), estimam-se que mil espécies sejam extintaspor ano no planeta, o corresponden-te a 3 espécies por dia. Afirmamainda que, se a destruição continuarno ritmo atual, até o ano 2015, de 4%e 8% de todas as espécies vivaspresentes nas florestas tropicais po-dem desaparecer; algumas sem nemmesmo terem sido descritas, catalo-gadas ou estudadas.

Os danos acumulados pela ondacrescente de extinção de espécies ede ecossistemas não podem ser repa-rados dentro de uma escala de tempotangível. A paleontologia revela quenovas faunas e floras levam milhõesde anos para atingir a diversidade quepossuíam na época em que o homemapareceu no planeta. Quanto maispermitirmos que as perdas se acumu-lem, maiores serão os prejuízos dasfuturas gerações, tanto os já conheci-dos quanto daqueles que serão certa-mente descobertos mais tarde.

Portanto, não restam dúvidasquanto à gravidade do quadro im-posto pelas interferências perpetra-das pelo homem nos ambientes natu-rais. A hecatombe de extinções deespécies da fauna e da flora, fenôme-no sem precedente histórico, atingehoje entre 70.000 a 240.000 espécies.O impacto maior, sem dúvida, é sen-tido nas florestas tropicais, que, co-brindo cerca de 7% da superfícieterrestre do planeta, abrigam, pelomenos, 50% de todas as espécies.Dados da FAO – Organização dasNações Unidas para a Alimentação eAgricultura, e o PNUMA – Programadas Nações Unidas para o Meio Am-biente, já indicavam, no inicio dadécada de 80, que, a cada ano, entre76.000 e 92.000 quilômetros quadra-dos de florestas tropicais eramdestruídos. Outros 100.000 quilôme-tros quadrados grandemente pertur-bados. O mais inquietante é consta-tar que nas décadas seguintes essasmédias continuaram aumentando.

As “Listas Vermelhas” da UniãoMundial para a Conservação da Na-tureza (IUCN), atualizadas ano aano, mostram a progressividade doproblema. A lista da Fauna Brasilei-ra Ameaçada de Extinção, editadaem 1989, relacionava 218 espécies.A lista atual, concluída em 2002,revela que 627 espécies estão ame-açadas, 2 extintas na natureza e 9definitivamente extintas. Na listaatual, encontramos 69 mamíferos,153 aves, 20 répteis, 15 anfíbios, 165peixes, 93 insetos, 21 invertebradosterrestres e 91 invertebrados aquáti-cos. Considerando a grandiosidadeda biodiversidade brasileira e osescassos investimentos aplicados no


seu estudo, fica evidente que osnúmeros apresentados mostram ape-nas uma débil aproximação do pro-blema. A lista oficial das espécies daflora brasileira ameaçada de extinção,editada em 1992 (Portaria IBAMA037-N), por sua vez, relaciona umtotal de 107 espécies. O grau deprecisão dessas listas é freqüente-mente questionado, o que ilustramais uma vez a carência de conhe-cimento sobre a nossa biodiversida-de. Por exemplo, no início da déca-da de 90, período em que se editoua lista oficial da flora, foi relaciona-do um número superior a 1.000 es-pécies raras e/ou ameaçadas deextinção, somente no Estado de SantaCatarina (KLEIN, 1990).

O Brasil é considerado o paísque apresenta a maior diversidadegenética vegetal do mundo, com cer-ca de 55.000 espécies catalogadas deum total estimado entre 350.000 e550.000 espécies (SANDES e DIBLASI, 2000). É interessante salientarque, como em outras partes do pla-neta, no Brasil também, a expansãoagrícola e a urbanização, com a con-seqüente eliminação dos hábitats,são as principais causas da elevaçãonas taxas de extinção das espécies.

Ainda que pareça paradoxal,uma das críticas que se fazem aoatual modelo de proteção das espé-cies da fauna ameaçada é a falta deuma política de regulamentação dacaça amadora e esportiva. Os argu-mentos utilizados em defesa da tesede que a caça amadora possa seruma estratégia de proteção às espé-cies ameaçadas de extinção basei-am-se no fato de os Estados Unidosda América manterem estável, hámais de duas décadas, o número deespécies de aves e mamíferos ame-açados, com o uso de um modelo deproteção baseado na caça amadora.Segundo seus defensores, esse mo-delo funciona porque a caça amadoraexige grandes investimentos e so-mente se sustenta com abundânciade caça durante décadas seguidas;ou seja, os investidores do setorpassam a ser os principais interessa-dos em que se mantenham popula-ções viáveis, a fim de garantir osucesso de seus empreendimentos.

O mesmo modelo é empregado napesca esportiva, mesmo no Brasil,onde regiões como a do Médio Ama-zonas e a do Pantanal já vêm sedestacando como pólos de atraçãode turistas provenientes das maisvariadas partes do mundo. Não po-demos esquecer, contudo, que essaestratégia normalmente direcionaseus esforços apenas para a prote-ção de algumas poucas espécies,não contemplando uma abordagemecossistêmica. Novamente o mode-lo norte-americano pode ser resga-tado a titulo de exemplo. O próprioU.S. Fish and Wildlife Service, ór-gão do Departamento do Interiorresponsável pela proteção das espé-cies ameaçadas, já em 1995 concluíaque menos de 10% das espécieslegalmente protegidas estavam au-mentando, 40% estavam diminuin-do e as espécies restantes permane-ciam na mesma ou sua situação eradesconhecida.

É inquestionável que o proble-ma da extinção crescente de espéci-es biológicas esteja ainda muito lon-ge de uma solução adequada e satis-fatória. É certo também que, consi-derando os danos já perpetrados,nunca teremos uma forma efetiva deremediação desse impasse criadopela espécie humana. Essa constata-ção, ainda que verdadeira, jamaisdeverá constituir um álibi para aacomodação e o descaso, notada-mente dos responsáveis pela formu-lação e operação de políticas públi-cas setoriais.

O Brasil ainda é consideradoum país ecologicamente vulnerável.No balanço de 2002, o país mostrourecordes nada invejáveis. Naqueleano registrou-se a maior apreensãode madeira de toda a história, na suamaior parte mogno (Swieteniamacrophylla), uma das espécies ma-deireiras mais visadas e ameaçadas.As queimadas também cresceramvertiginosamente naquele ano, algoem torno de 136% , considerando-sea média dos últimos cinco anos. Porcausa dos desmatamentos e das quei-madas na Amazônia, o Brasil estárapidamente se aproximando doslíderes na emissão dos gases deefeito estufa, como nos mostram os

dados revelados no Inventário Bra-sileiro de Emissões, elaborado peloIBGE – Instituto Brasileiro de Geo-grafia e Estatística.

Na Mata Atlântica, um dos biomasmais ameaçados do planeta, as pres-sões não cessaram, mesmo depois decinco séculos seguidos de explora-ção predatória e irracional, conformerelata detalhadamente DEAN (1998).Ainda que o ritmo de desmatamentonas áreas de florestas originais tenhadiminuído nos últimos anos, consi-derando-se os pequenos fragmentosde florestas e as áreas mais alteradas,esse ritmo ainda é o mesmo registra-do há 15 anos atrás. Segundo dadosdo Atlas dos Remanescentes Flores-tais da Mata Atlântica, publicação daFundação SOS Mata Atlântica e doInstituto Nacional de Pesquisas Espa-ciais (INPE), no período de 1995 a2000, a extensão da Mata Atlântica,nos seus remanescentes florestaisbem conservados, foi reduzida para7,1% da sua área original. Esse qua-dro é bastante grave e nos mostraque, a despeito da propaladaconscientização pública frente à fra-gilidade desse bioma, o desmata-mento se mantém; ou seja, nossaspráticas aparentemente pouco se al-teraram.

Como prenúncio de novos tem-pos, o século XXI é saudado com oCONAMA - Conselho Nacional doMeio Ambiente- estabelecendo, coma Resolução n° 278/2001, regras ediretrizes para o trato com espéciesda flora brasileira ameaçada deextinção. Posteriormente, com a Re-solução n° 317/2002, o CONAMAcomplementou essas diretrizes, de-terminando a realização de PlanosEstaduais de Conservação e Uso dasEspécies da Flora Ameaçada deExtinção na Mata Atlântica. É impor-tante lembrar que essa intervençãodo CONAMA numa questão, a rigortão preocupante, somente se deuapós inúmeras e insistentes provo-cações do movimento ambientalista.A absurda situação criada com aexploração florestal indiscriminadano sul da Bahia e em Santa Catarina,principalmente, foi a indutora dessapostura do CONAMA. A prévia inter-ferência do judiciário, com uma de-


cisão favorável ao pleito dos ambi-entalistas no caso da exploraçãomadeireira das espécies ameaçadasde extinção no Estado de SantaCatarina, teve um efeito bastantedecisivo, forçando objetivamente oCONAMA a se posicionar com aagilidade que o caso exigia. A lega-lização do processo de exploraçãomadeireira de espécies ameaçadasde extinção, dentro dos escassosremanescentes de Mata Atlântica,concedida pelo próprio IBAMA –Instituto Brasileiro do Meio Ambien-te e dos Recursos Naturais Renová-veis, órgão executivo do SISNAMA –Sistema Nacional do Meio Ambien-te, conferiu conotação verdadeira-mente escandalosa ao processo.

Em Santa Catarina, um dos últi-mos Estados a promover a instalaçãodo Comitê da Reserva da Biosfera daMata Atlântica, as apreensões de car-regamento de madeira e as notifica-ções de desmatamentos, infelizmen-te são ainda quase rotineiras. Bastauma rápida consulta aos jornais lo-cais para se constatar a preocupantefreqüência com que são apreendidoscarregamentos de pinheiro-brasilei-ro (Araucaria angustifolia), canela-preta (Ocotea catharinensis), imbuia(Ocotea porosa), sassafrás (Ocoteaodorifera), entre outras. São recor-rentes também os casos de desmata-mentos sem qualquer autorização,em geral para “limpar” áreas queserão usadas para receber o plantiode Pinus elliottis.

A extensiva progressão dos plan-tios de essências florestais exóticastem sido um dos fatores de maiorpressão sobre os remanescentes flo-restais nativos. Por um lado, argu-menta-se que o mercado de madeiraforça uma ampliação da área planta-da com espécies de rápido cresci-mento; por outro, sem qualquer basetécnica ou cientifica consistente, apre-goa-se a viabilidade de um pretensomanejo florestal sustentável nas áre-as de remanescentes naturais. Tantode um lado quanto de outro, a ampli-ação das áreas de risco das espéciesameaçadas torna-se a única garantia.

DOUROJEANNI (1987) relata,com base em uma revisão da situaçãodo manejo florestal no continentelatino-americano até 1986, que nãoexistia nenhum exemplo de manejoflorestal tecnicamente consistente.Mesmo que em alguns casos o suces-so inicial se mostrasse animador, nor-malmente isso não perdurava. Quasetodos os ensaios falharam ou foramabortados depois de uma ou duasdécadas, no máximo. Em geral, essasflorestas manejadas foram converti-das em pastagens ou destinadas àagricultura migratória.

Também no Estado de SantaCatarina, recentemente se explicitouuma situação que bem retrata a insu-ficiência de informações sobre a bio-diversidade, a precária divulgaçãodessas informações e o completodescompasso entre os discursos e a

prática. No processo de licenciamentopara a construção de uma pequenahidrelétrica no Rio Itajaí-açu, foi negli-genciada a citação de ocorrência alide uma espécie endêmica, no casouma planta arbustiva que explora asmargens pedregosas do rio, descritaem 1961 e denominada Raulinoaechinata (COWAN e SMITH, 1973).Não fosse a mobilização dos ambien-talistas locais, a espécie poderia estarhoje engrossando a lista daquelas de-finitivamente extintas. O episódio mos-tra a amplitude do problema, quandonão se inclui na análise as chamadasespécies endêmicas. Isso porquemuitos desses endemismos são ilus-trados por populações extremamenterestritas e, portanto, altamente sus-ceptíveis. Registra-se que a AméricaLatina é a região com a maior diversi-dade biológica e também com o maiornúmero de endemismos do planeta,ficando o Brasil com o quarto lugar nalista dos países detentores dos maio-res números de espécies endêmicas.

É necessário entender que o co-nhecimento por si só nada garante.Desde 1990, o Estado de SantaCatarina dispõe de uma listagem bas-tante abrangente de espécies rarasou ameaçadas de extinção (KLEIN,1990; KLEIN, 1996; KLEIN, 1997),onde se constata, com certa dose deindignação e surpresa, no item “me-didas conservacionistas tomadas”,uma avassaladora repetição do ter-mo Nenhuma.

Num cenário tão inquietante,com certa freqüência nos questiona-mos: Como prever o valor que umaespécie de animal, planta oumicroorganismo terá no futuro? Aspossibilidades estão distribuídas porum largo espectro de necessidadeshumanas, algumas já conhecidas emuitas outras ainda desconhecidas.Nosso conhecimento com relação àspróprias espécies é ainda por demaisinsatisfatório. Menos de dois milhõesestão catalogadas nos registros cien-tíficos, com um nome formal, en-quanto um número estimado entrecinco a cem milhões de espécies – oumais – esperam para ser descobertas.Das espécies conhecidas, menos de1% foi submetido a não mais que umexame sumário. No tocante às flores-

Foto 1: Regeneração in vitro de plântulas decedro (Cedrela fissilis) a partir da cultura desegmentos nodais.

Foto 2: Tronco de árvore antiga de pinheiro-brasileiro (Araucaria angustifolia). Exemplarescomo esse, encontrado nas florestas de Cam-pos Novos (SC), são cada vez mais raros.


tas tropicais, segundo KAGEYAMA eLEPSCH-CUNHA (2001), os estudosgenéticos em populações de espéci-es arbóreas tropicais são recentes eforam realizados com amostragemde espécies pouco representativasdas comunidades, servindo mais paraorientar os futuros trabalhos na áreado que para conclusões e orienta-ções de como utilizar esses dados,por exemplo, para programas deconservação.

Confirmada a manutenção dapressão antrópica sobre as espécies eos ecossistemas, pode parecer ilógi-ca a pretensão de se justificar esfor-ços na busca de alternativas tecnoló-gicas inovadoras para se conterem astaxas atuais de extinção. No entanto,assumindo-se o valor intrínseco quecada ser vivo possui, essa lógicatorna-se aceitável. Não é, contudo,generalizada a aceitação e o reco-nhecimento desse valor pela socie-dade moderna. Por essa razão, namaioria dos casos, os estudosbiotecnológicos, mesmo quando têm

por objeto espécies ameaçadas deextinção, procuram agregar justifica-tivas adicionais de ordem econômi-ca, buscando, assim, tanto maior fa-cilidade de financiamento quanto deaceitação, e, por conseguinte, maiordisseminação de seus resultados epotencialidades. Trabalhos comSwietenia macrophylla (LEE e RAO,1988), Cedrela odorata (MARUYAMAet. al., 1989; MARUYAMA et. al.,1997), e C. fissilis (foto 1)(NUNES et.al., 2002), mostram-nos alguns exem-plos, largamente enfatizados, compotencial para implantar refloresta-mentos comerciais, dinamizar pro-gramas de melhoramento genético,desenvolver técnicas de controlesilvicultural ou de obtenção deinsumos fitoquímicos e/ou farmaco-lógicos. KAGEYAMA e LEPSCH-CU-NHA (2001) afirmam que o fatoreconômico é determinante no inte-resse pelas florestas tropicais, nota-damente pelo uso potencial da biodi-versidade pela indústria farmacêuti-ca e química, através da biotecnologia.

A rigor, a valorização da biodi-versidade, por si só, pouca melhoriatem trazido para as espécies ameaça-das de extinção. Mesmo para espéci-es emblemáticas, como é o caso dopinheiro-brasileiro (Araucariaangustifolia) (foto 2), a ampliaçãodo seu valor econômico, que foiimpulsionado exatamente pela suaescassez crescente, só fez com quesuas derradeiras reservas naturaisfossem ainda mais dizimadas. KLEIN(1990), já alertava que o valor econô-mico, industrial, alimentar ou medi-cinal, de um número considerável deespécies pode condicionar o seu de-saparecimento. Entre essas espéciesKLEIN destaca o próprio pinheiro-brasileiro (Araucaria angustifolia),a imbuia (Ocotea porosa), a canela-preta (Ocotea catharinensis) (foto3), a canela sassafrás (Ocoteaodorifera), o palmiteiro (Euterpeedulis) e a erva-mate (Ilexparaguariensis). Mesmo com a con-corrência de uma legislação proteto-ra, a pressão econômica, aliando-se auma fiscalização deficitária e inerte,complementada com uma intrincadarede de corrupção, têm sido geradaspoucas perspectivas positivas para

as espécies ameaçadas de extinção,mesmo para aquelas oficialmente re-conhecidas nessa condição. LIMA(2001), numa avaliação minuciosa datutela jurídica das espécies da floraameaçada de extinção na Mata Atlân-tica, afirma que, ao continuar com aexploração econômica de tais espé-cies, sem qualquer estudo de viabili-dade ecológica e genética, certamen-te estaremos, todos nós, inclusive opróprio IBAMA, assistindo à exclu-são dessas espécies da lista oficial,pois estarão extintas em breve.

Mesmo considerando que osavanços tecnológicos possam me-lhorar o problema da crise deextinção, ou ainda que tecnologiasinovadoras venham suprir serviçosambientais outrora fornecidos porecossistemas, seria um erro de cálcu-lo, na visão de WILSON (1997), acre-ditar que a resposta esteja natecnologia.

Na preservação da biodiversida-de, o uso da tecnologia é o últimorecurso. Em situações cada vez maisfreqüentes, passa a ser o único. Afragmentação e o isolamento dos re-manescentes florestais podem deter-minar a inviabilidade da manutençãode populações inteiras de plantas e deanimais. Em casos assim, tecnologiasde intervenção são indispensáveis paraque se restabeleça um fluxo gênicominimamente satisfatório. O proble-ma maior é que grande parte dasperdas de biodiversidade e de servi-ços ambientais que já provocamos,estão muito além da capacidade hu-mana de recuperá-las. Adicionalmen-te, não podemos negligenciar o custoda utilização da alta tecnologia e ofato de que os recursos hoje disponí-veis se encontram quase sempre nospaíses ricos do norte, enquanto asgrandes perdas de biodiversidadeocorrem majoritariamente nos paísespobres dos trópicos. Assim, notada-mente para esses países megadiver-sos e pobres, a preservação de hábitaté vista como a estratégia viável erealística.

A clonagem de espécies critica-mente ameaçadas, quando os demaismétodos falharem, por exemplo, temsido indicada como estratégia de con-servação. Da mesma forma, a expan-

Foto 3: Fruto de canela-preta (Ocoteacatharinensis)


são de bancos de sementes e esporos,a manutenção de estoques de tecidose de embriões congelados em nitro-gênio líquido (-196 C) ou em seuvapor (-150 a -180 C). Pode-setambém criopreservar ápices, embri-ões somáticos encapsulados emalginato de sódio, técnica conhecidacomo encapsulação (VIEIRA, 2000).Esses métodos, contudo, são dispen-diosos e de eficácia relativa, notada-mente para bactérias, arqueanos,protistas, fungos, insetos e outrosinvertebrados que formam a base dabiosfera. A única forma segura desalvar espécies, além de ser a maisbarata e sensata, é preservar osecossistemas naturais em que vivematualmente essas espécies. Como afir-mam DOUROJEANNI e PÁDUA(2001), lamentavelmente, até agora, ogênio humano não descobriu outraforma mais eficiente que as Unidadesde Conservação para preservar a bio-diversidade.

Dizer que a conservação in situ éhoje a melhor estratégia para a prote-ção de espécies ameaçadas, não signi-fica dizer que outros esforços nãosejam técnica e eticamente defensá-veis e necessários. Precisamosimplementar e reforçar uma éticaconservacionista, calcada em o ho-mem admitir sua responsabilidade nacriação de uma crise planetária e deperceber inequivocamente que a mo-ral vigente não a tem admitido. Frentea esses pressupostos, torna-se absolu-tamente necessário rever nossos mo-dos de produção e consumo, fazendocom que, com esse novo paradigmahumano, se reflitam sobre as demaisespécies biológicas, e que, paralela-mente, se eliminem os antropocêntricosquestionamentos referentes aos inves-timentos direcionados para a proteçãodas espécies. O fato concreto é que, atéo momento, muito pouco se fez parafrear essa onda de extinções que amodernidade humana promoveu. In-vestimentos feitos, tanto pelos paísesricos quanto pelos pobres, empresaspúblicas ou privadas, são limitados einstáveis. Quase sempre insuficientese mal aplicados.

A tecnologia não deve ser en-tendida e propagada como uma pa-nacéia para o mal da extinção. Ainda

que como paliativo, deve ser perse-guida e aprimorada. Mesmo que,como ferramenta, se desenvolva apartir de nossos interesses de baseeconômica, suas possibilidades deuso na minimização do impacto daextinção de espécies biológicas pre-cisa ser cada vez mais considerado.Por outro lado, direcionar nossosesforços unicamente em torno dosinteresses econômicos da biodiversi-dade seria um grande equívoco. Pri-meiramente, porque nosso escassoconhecimento acerca da biodiversi-dade, fez, na prática, com que asociedade não identifique qualquervalor na imensa maioria das espéciesde plantas e animais viventes, e,adicionalmente, porque a lógica eco-nômica é essencialmente excludente,não mostrando a menor habilidadesequer de repartir seus benefíciosentre diferentes núcleos de popula-ções humanas.


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