bio informatica

12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 29

Pesquisa

Um guia básico e amplo sobre os diversos aspectos dessa nova ciência

Bioinformática:Manual do Usuário

Ilustrações cedidas pelos autores

Figura 1: O Dogma Central daBiologiaMolecular

Francisco ProsdocimiMestrando emGenética e Especialistaem Bioinformá[email protected]

Gustavo CoutinhoCerqueiraBacharel emCiência da Computação eEspecialista em Bioinformá[email protected]

Eliseu BinneckDoutor em Ciência e Tecnologia deSementes e Especialista emBioinformáticaEmbrapa [email protected]

Acácia Fernandes SilvaMestre em Agronomia e Especialistaem BioinformáticaEmpresaPernambucanadePesquisaAgropecuá[email protected]

Adriana Neves dos ReisBacharel em Informática e Especialistaem BioinformáticaUniversidade do Vale do Rio dos [email protected]

Ana Carolina MartinsJunqueiraMestre emGenética e BiologiaMoleculareEspecialistaemBioinformáticaUniversidade de [email protected]

Ana Cecília Feio dos SantosMestranda emGenética e BiologiaMoleculareEspecialistaemBioinformáticaUniversidade Federal doPará[email protected]

Antônio Nhani JúniorDoutor em Bioquímica e Especialistaem Bioinformá[email protected]

Charles I. WustMestrando em Ciências da Computa-ção e Especialista em BioinformáticaUniversidade Federal de [email protected]

Fernando Camargo FilhoMestrando em Biotecnologia Vegetal eEspecialista em BioinformáticaUniversidade de Ribeirão [email protected]

Jayme Lourenço KessedjianAnalista de sistemas e Especialista emBioinformáticaEmbrapa [email protected]

Jorge H. PetretskiProf. Associado e Especialista emBioinformáticaUniversidade Estadual [email protected]

Luiz Paulo CamargoAnalista de Sistemas e Especialista emBioinformáticaUniversidade de Ribeirão [email protected]

Ricardo de Godoi MattosFerreiraBacharel emCiênciasBiológicas e Especia-lista em BioinformáticaUniversidadedeSã[email protected]

Roceli P. LimaMestrando em Informática e Especialistaem BioinformáticaUniversidade do [email protected]

Rodrigo Matheus PereiraMestrando emMicrobiologia e Especialistaem Bioinformá[email protected]

Sílvia JardimMestre emFarmacologia e Especialista emBioinformáticaEmbrapa Milho e [email protected]

Vanderson de Souza SampaioMestrando emGenética e BiologiaMoleculareEspecialistaemBioinformáticaUniversidade Federal doPará[email protected]

Áurea V. Folgueras-FlatschartDoutora emMicrobiologia e Especialistaem Bioinformá[email protected]

INTRODUÇÃO

Do início até meados do século passado osgeneticistas e químicos se questionaram sobre anatureza química domaterial genético. Das pes-quisas desenvolvidas, surgiu a conclusãodequeo DNA era a molécula que armazenava a infor-mação genética e, em 1953, sua estrutura quí-mica foi desvendada no clássico trabalho deWatson e Crick. Com a posterior descoberta docódigo genético e do fluxo da informação bioló-gica, dos ácidos nucléicos para as proteínas, taispolímeros passarama constituir os principaisobjetos de estudo de uma nova ciência, a Biolo-giaMolecular. Logo surgirammétodos de se-qüenciamentodesses polímeros, principalmentedo DNA, que permitiam a investigação de suasseqüênciasmonoméricas constituintes.Desdeentão, mais de 18 bilhões dessas seqüências jáforamproduzidas e estão disponíveis nos ban-cos dedadospúblicos.

Na segunda metade da década de 90, com osurgimento dos seqüenciadores automáticos deDNA, houve uma explosão na quantidade deseqüências a seremarmazenadas, exigindo recur-soscomputacionais cadavezmaiseficientes.Alémdo armazenamento ocorria, paralelamente, a ne-cessidade de análise desses dados, o que tornavaindispensável a utilizaçãodeplataformas compu-tacionais eficientespara a interpretaçãodos resul-tadosobtidos.

Assimnascia abioinformática. Essanova ciên-ciaenvolveria auniãodediversas linhasdeconhe-cimento � a engenharia de softwares, a matemá-tica, a estatística, a ciência da computação e abiologiamolecular.Osprimeiros projetos na áreaeram compostos por profissionais de diferentes

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áreas da biologia e informática epercebia-se uma certa dificuldadede comunicação: enquantoobiólo-go procurava uma solução que le-vasseemconsideraçãoas incertezase erros que ocorrem na prática, ocientista da computação procuravauma solução eficiente para umpro-blemabemdefinido.Assim, surgiuanecessidade de um novo profissio-nal, que entendesse bem ambas asáreas e fizesse a ponte entre elas: oBioinformata. Esse profissional de-veria ter o conhecimento suficientepara saberquais eramosproblemasbiológicos reais e quais seriam asopções viáveis dedesenvolvimentoe abordagem computacional dosproblemas emquestão.

Dado o sucesso e a importânciaque alcançaram os projetos Geno-ma e seus desmembramentos, obioinformata temsidoumprofissio-nal requisitado e raro. No exterior,podemser encontradospelomenos122cursosde formaçãoembioinfor-mática, em sua grandemaioria cen-tradosnaAméricadoNorteeEuropa(http://linkage. rockefeller.edu/wli/bioinfocourse/).NoBrasil, entretan-to, até o início deste ano, não existi-am cursos que formassem tais pro-fissionais especializados. Políticascientíficas governamentais têmpro-curado incentivara formaçãodegru-pos de pesquisa e de pessoal nessaárea, financiandoprojetos e criandocursos depós-graduação. Em2002,foi implantado o primeiro Curso deEspecialização (pós-graduação latosensu) do LNCC (http://www.lncc.br/~biologia) - do qual forma-mos a segunda turma. Ainda nesteano foi autorizada pela CAPES acriaçãodedois cursosdedoutoradoem Bioinformática, um na USP eoutro na UFMG (http://www.capes.gov.br/).

Parece-nos que cada vez mais abioinformáticavaisernecessáriaparaa análise de dados embiologiamo-lecular e, nesse sentido, o presenteartigo foi escrito com o intuito deconter as informaçõesmais relevan-tes para quem deseja começar atrabalhar na área. Assim, tentamosapresentar os principais conceitosrelacionadosàbiologiaeàcomputa-ção, os softwaresmais utilizados, os

sitesmais freqüentados e asprincipaisáreas de interesse.

Sistemasoperacionais

O sistema operacional (SO) é oprincipal programa de um computa-dor. Ele é responsável pelo gerencia-mento da memória, pelo acesso aosdiscos e também intermedeia todoacesso aos componentes físicos damáquina(hardware).

Os SOs mais conhecidos e utiliza-dossãoaquelesbaseadosnoWindows,Unix e MacOS. Muitas das aplicaçõesutilizadas embioinformática são com-piladas e distribuídas para a execuçãoem plataformas derivadas do Unix,portanto o conhecimento desse siste-maoperacional édegrande importân-ciapara aquelesquedesejamaprofun-dar-se na área. Apreferência por siste-masbaseadosemUnixdeve-se ao fatode que tais sistemas são normalmentemais confiáveis, gerenciam melhor otrabalho comgrandes quantidades dedadosequealgumasdesuasvariantes,comooLinux,possuemcódigoabertoedistribuiçõesgratuitas.

Linguagens de programação

Umprofissionalembioinformática,além de saber utilizar os programasproduzidosporoutrosprogramadores,deve também ser capaz de desenvol-ver programas aplicativos para lidarcom os mais diversos problemas en-contrados durante a análise de dadosembiologiamolecular. Paradesenvol-ver, portanto, tais programas, o bioin-formata deve ter conhecimento sobrealgum tipo de linguagem de progra-mação.

As Linguagensdeprogramação fo-ram criadas para facilitar a especifica-çãode tarefas a umcomputador. Exis-temmilharesde linguagensdeprogra-mação e cada uma delas possui umconjuntodecomandosespecíficosquecriamesta interfacehomem-máquina.Das linguagens de programaçãomaisutilizadas,podemoscitar:basic,pascal,C, C++, java, cobol e fortran. Entretan-to, a linguagem mais utilizada pelosbioinformatas é, sem sombra de dúvi-da, o PERL.

O PERL (Practical Extract andRe-port Language) é uma linguagem de

programação, simples e muito rica,alémdedisponível gratuitamente. Foicriada por Larry Wall, originalmentepara produzir relatórios de informa-ções de erros, que a disponibilizou naInternet no espírito freeware, pensan-doquealguémpudesseachá-laútil.Aolongo dos anos esta linguagem con-quistoumilhares de adeptos e, atravésde várias colaborações recebidas paraseu aprimoramento, o PERL é hojeconceituado como uma linguagemsofisticada, que possui como pontoforte amanipulaçãode texto,masque,alémdisso,possui todasas característi-cas de uma linguagem de alto-nívelgenérica. Éessagrande facilidadeparaa manipulação de texto que fez doPERL a linguagem mais utilizada notratamentodedadosde seqüências deDNA e proteínas.

OPERLpode ter suas funcionalida-des acrescidas através de módulos,que são distribuídos gratuitamente.Existem módulos para uma gama deaplicações, desdemétodosestatísticosclássicos, aplicações gráficas em 3D,até acesso a internet via programaçãoPERL. O site CPAN (ComprehensivePerl Archive Network � http://www.cpan.org) éoprincipalpontodedistri-buiçãodemódulos e de suas respecti-vas documentações. Alguns destesmódulos são especialmente dirigidospara aplicações em Bioinformática,destacando-se os módulos bioperl ebiographics,queapresentamferramen-tas bastanteúteis para asmais diversasaplicações nesta área.

Umaboa interconectividade combancos de dados é outra característi-ca desejada em uma linguagem deprogramação.A linguagemPERLatende muito bem a esta demandaatravés da biblioteca PERL-DBI, umconjunto demódulos que forneceuma interface consistente para solu-ções de integração com bancos dedados.

Bancos de dados

Emconseqüência da grandequantidade de informações de se-qüências de nucleotídeos e de ami-noácidosque sãoproduzidas atual-mente, principalmente em projetosGenoma, TranscriptomaeProteoma,o uso dos bancos de dados vem as-


sumindouma importância crescentenabioinformática.

Um banco de dados pode serconsideradoumacoleçãodedadosinter-relacionados,projetadoparasuprir as necessidades de um grupoespecífico de aplicações e usuários.Um banco de dados organiza e es-trutura as informações demodo afacilitar consultas, atualizações ede-leções de dados.

A grandemaioria dos bancos dedados é atrelado a um sistema deno-minado SGBD (Sistema de Gerencia-mento de Banco de Dados). Estesistema é responsável por intermedi-ar os processos de construção,mani-pulação e administração dobanco dedados solicitadospelosusuáriosouporoutras aplicações.

Existem vários sistemas de geren-ciamento de banco de dados, sendoque cada sistema possui seus prós econtras. Omysql é um sistema muitoutilizadopela comunidadeacadêmicae em projetos genoma por ser gratui-to, possuir código aberto e acessoveloz aos dados,mas apresenta certaslimitações em suas ferramentas. OpostgreSQL também é um SGBD gra-tuito, com ferramentasmuitopodero-sas, entretanto não é muito utilizadopela dificuldadeno seugerenciamen-to.Os SGBD�sOraclee SQLServer sãorobustos e sofisticados,masdevidoaoalto custo de suas licenças possuemseuuso limitadoàsgrandes empresas.

Bancos de dados públicosembioinformática

O investimento contínuo na cons-trução de bancos de dados públicos éum dos grandes motivos do sucessodos projetos genoma e, em especial,doProjetogenomaHumano.Devidoàmagnitudedoconjuntodedadospro-duzidos torna-se fundamental a orga-nização desses dados em bancos quepermitamacessoon-line.

Os bancos de dados envolvendoseqüências de nucleotídeos, de ami-noácidos ou estruturas de proteínaspodemser classificados embancosdeseqüências primários e secundários.Osprimeiros são formadospeladepo-sição direta de seqüências de nucleo-tídeos, aminoácidosouestruturaspro-téicas, sem qualquer processamento

BOX1 - Exemplo de programa PERL para obter a fita reversa-complementar a partir de uma seqüência de DNA desejada.

#!/usr/bin/perl# Seqüência que se deseja utilizar$meuDNA= �TTCCGAGCCAATTGTATCAGTTGCCAATAG�;# Inverte a ordem da seqüência de DNA$RevCom = reverse $meuDNA;# Troca as bases produzindo a fita complementar$RevCom =~ tr/ACGT/TGCA/;print �Minha seqüência invertida é: \n $RevCom�;

A primeira linha é obrigatória e diz ao programa o caminho onde seencontra o interpretador PERL para que o programa possa achá-lo na horade sua execução. As linhas seguintes que se iniciam com o sinal de �#�representam linhas de comentário. As variáveis em PERL são sempreseguidas do sinal de �$� e não precisam ser declaradas, cabe aoprogramador saber como e em que contexto devem ser utilizadas. Oscomandos terminam sempre com ponto-e-vírgula e o sinal de �=~� estárelacionado àutilizaçãodeumaexpressão regular.

BOX2 - Principais Sistemas de Gerenciamento de Bancos de dados

MySQLhttp://www.mysql.orgAcesso livre para download do gerenciador MySQL, como também a váriasferramentasdeconexãocomo:DBI, Java,ODBCeetc.Apresentadocumentaçãocompleta.PostgreSQLhttp://www.pgsql.com/Acesso livre para download do gerenciador PostgreSQL, como tambémalgumas ferramentas. Apresenta documentação completa.ORACLEhttp://www.oracle.comInformações comerciais sobre obancodedados.MicrosoftSQLServerhttp://www.microsoft.com/sql/Informações comerciais sobre obancodedados.

BOX3 - Bancos de Dados mais utilizados em bioinformática

Genbankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Banco de dados americano de seqüências de DNA e proteínas.EBIhttp://www.ebi.ac.uk/Banco de dados europeu de seqüências de DNA.DDBJhttp://www.ddbj.nig.ac.jp/Banco de dados japonês de seqüências de DNA.PDBhttp://www.rcsb.org/pdbArmazenaestruturas tridimensionais resolvidasdeproteínas.GDBhttp://gdbwww.gdb.org/Banco de dados oficial do projeto genoma humano.TIGRDatabaseshttp://www.tigr.org/tdb/Banco com informações de genomas de vários organismos diferentes.PIRhttp://www-nbrf.georgetown.edu/Bancodeproteínas anotadas.SWISS-PROThttp://www.expasy.ch/spro/Armazena seqüências de proteínas e suas respectivas característicasmoleculares, anotadomanualmente por uma equipe de especialistas.INTERPROhttp://www.ebi.ac.uk/interpro/Bancode dados de famílias, domínios e assinaturas de proteínas.KEGGhttp://www.genome.ad.jp/kegg/Banco comdados de seqüências de genomas de vários organismos diferen-tes e informações relacionadas às suas viasmetabólicas.


ou análise. Os principais bancos dedadosprimários sãooGenBank, oEBI(European Bioinformatics Institute),o DDBJ (DNA Data Bank of Japan) eo PDB (Protein Data Bank). Os trêsprimeiros bancos são membros doINSDC (International Nucleotide Se-quenceDatabaseColaboration)ecadaumdessescentrospossibilita a submis-são individual de seqüências deDNA.Eles trocam informações entre si diari-amente, de modo que todos os trêspossuem informações atualizadas detodas as seqüências deDNAdeposita-das em todo o mundo. Apesar disso,cada centro apresenta seus dados deforma particular, apesar de bastantesemelhante. Atualmente amaioria dasrevistas exige que as seqüências iden-tificadaspelos laboratórios sejamsub-metidas a um destes bancos antesmesmodapublicação do artigo.

Os bancos de dados secundários,como o PIR (Protein Information Re-source)ouoSWISS-PROT, sãoaquelesque derivam dos primários, ou seja,foram formados usando as informa-ções depositadas nos bancos primári-os. Por exemplo, o SWISS-PROTéumbanco de dados onde as informaçõessobre seqüências de proteínas foramanotadas e associadas à informaçõessobrefunção,domíniosfuncionais,pro-teínas homólogas e outros.

Os bancos de seqüências tambémpodemser classificados comobancosestruturais ou funcionais. Os bancosestruturais mantêm dados relativos àestrutura de proteínas. Embora a se-qüência de nucleotídeos, a seqüênciade aminoácidos e a estruturadeprote-ína sejam formas diferentes de repre-sentar o produto de um dado gene,esses aspectos apresentam informa-ções diferentes e são tratadospor pro-jetos diferentes, que resultamemban-cos específicos.

Dos bancos funcionais, o KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes) é um dos mais utilizados.Disponibiliza links para mapas meta-bólicos de organismos com genomacompletamente ou parcialmente se-qüenciados apartir de seqüências edebusca atravéspalavras-chave.

Comocrescentenúmerodedadosbiológicos que vem sendo gerados,vários bancos de dados têm surgido eanualmente a revista Nucleic Acids

Figura 2 � Alinhamento de duas seqüências de proteínas

Research(http://www3.oup.co.uk/nar/database/)publicauma listaatualizadacomaclassificaçãode todososbancosdedadosbiológicosdisponíveis.

Alinhamento de seqüênciasOalinhamentode seqüênciaspos-

sui uma diversidade de aplicações nabioinformática,sendoconsideradaumadasoperaçõesmais importantes destaárea.Estemétododecomparaçãopro-curadeterminarograude similaridadeentre duas ou mais seqüências, ou asimilaridade entre fragmentos destasseqüências. No caso de mais de duasseqüências oprocesso édenominadoalinhamentomúltiplo.

É bom lembrar que similaridade ehomologia sãoconceitosdiferentes.Oalinhamento indica o graude similari-dadeentre seqüências, já a homologiaé uma hipótese de cunho evolutivo, enãopossui gradação: duas seqüênciassão homólogas caso derivem de umancestral comumou, casoesta hipóte-se não se comprove, simplesmentenãosãohomólogas.

Existemvários programasde com-putador que realizam esta tarefa e agrandemaioria deles pode ser utiliza-do on-line, sem a necessidade de ins-talação. Comoexemplo temosospro-gramas: ClustalW, Multialin, FASTA,BLAST 2 sequences, etc.

Oprocesso consiste em introduzirespaços (gaps) entre os monômerosde uma ou mais seqüências a fim deobter omelhor alinhamento possível.A qualidade de um alinhamento édeterminada pela soma dos pontosobtidos por cada unidade pareada(match) menos as penalidades pelaintrodução de gaps e posições nãopareadas (mismatch).

Matrizesdesubstituição

Matrizes de substituição são umaalternativa aos valores fixos depontu-ação paramatches emismatches. Es-

Figura 3. Parte de uma matriz desubstituição BLOSUM62, utilizadaem alinhamentos de seqüências deproteínas. As letras representam osaminoácidos e os números indicamos pontos a serem contabilizados naocorrência de match (diagonalprincipal) ou mismatch

tas matrizes indicam os diferentes va-lores a seremcontabilizadospara cadapar deunidades.

Asmatrizesdesubstituiçãosãonor-malmente utilizadas no alinhamentode seqüênciasprotéicas.Assimovalorde cada uma de suas células indica achance da ocorrência da substituiçãocorrespondente ao par de aminoáci-dos destemismatch.

As matrizes de substituição maisutilizadas são aquelas pertencentes àsfamílias de matrizes PAM (Point Ac-ceptedMutation) eBLOSUM.AmatrizPAM1 foi construída atravésda análisedemutações entre proteínas homólo-gas com 1% de divergência (1% dosaminoácidos diferentes). As outrasmatrizes, PAM50, PAM100, PAM250são extrapolações damatriz PAM1.Asmatrizes BLOSUM foram construídastendo como base os alinhamentos dobanco demotivos BLOCKS. Umama-triz BLOSUM62 é definida através daanálisedas substituiçõesnas seqüênci-as de BLOCKS que possuem menos


que62%de similaridade.As seqüênci-as que ultrapassam este limite sãomescladas, e participam da definiçãoda matriz como se fossem uma únicaseqüência.

Alinhamento global e local

Quantoàregiãoanalisada,oalinha-mentode seqüênciaspodesergrossei-ramente classificado em dois tipos, oalinhamento global e o alinhamentolocal. No alinhamento global, as se-qüênciasenvolvidasdevemseralinha-das de um extremo ao outro, dandoorigem a apenas um resultado. Já noalinhamento local, procura-se alinharapenas as regiões mais conservadas,independente da localização relativadecada regiãoemsuaseqüência.Con-sequentemente, este alinhamento temcomo resultado uma ou mais regiõesconservadas entre as seqüências.

Oalinhamento global é freqüente-mente utilizado para determinar regi-ões mais conservadas de seqüênciashomólogas. Exemplo de programasqueutilizamestealinhamentosãoClus-talWeMultialin.Oalinhamento local égeralmente utilizado na procura porseqüências homólogas ou análogas(funcionalmente semelhantes) embancodedados.Oalgoritmoutilizadopelo programa BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool) realiza estetipode alinhamento.

Figura 4: Exemplos de alinhamento global e local. No alinhamentoglobal as seqüências são alinhadas do início ao fim, já noalinhamento local alinha-se as subseqüências conservadas

BOX4-Softwaresmaisutilizadosparaoalinhamentodeseqüências

ClustalWhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.htmlVersãowebdeumdosprogramasde alinhamentomúltiplomais utilizados(Clustal). Fornece ao usuário uma grande quantidade de parâmetros e desaídas diferentes. Possui interface gráfica ondeos alinhamentospodemservisualizados de forma agradável e alterados.Multialinhttp://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmlProgramade alinhamentomúltiplo bastante conhecido. Fácil e rápido.Fastahttp://www.ebi.ac.uk/fasta33/Precursor dosprogramasdealinhamento.Promove serviço de busca em banco de dados de ácidos nucléicos eproteínas.BLAST,BLAST2sequenceshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/BLAST é o programa de alinhamento mais utilizado no mundo. Realiza abuscapor seqüências homólogas embancodedadosde ácidosnucléicos eproteínas.OprogramaBLAST2sequencesconsistenoalgoritmoBLASTparaalinhamentodeduas seqüências.

Projetos genoma e transcriptoma

Grande parte dos bioinformatasmodernos trabalha comdadosdepro-jetos genoma ou transcriptoma. Emprojetos genoma adota-se a aborda-gemde fragmentar todo o genoma deumorganismoempequenos pedaçose de seqüenciar tais pedaços, utilizan-do programas computacionais paramontá-los e reconstituir a informaçãogenômica inicial. Essaestratégiaéado-tadaprincipalmentedevidoà restriçãodo tamanho da seqüência que podeser lidanos seqüenciadores.Mesmoosmaismodernos conseguem ler apenascerca de 1000 pares de base em cada

corrida.Emprojetos genomasdeprocario-

tos, normalmente realiza-se a quebradoDNAinteirodoorganismodesejadoem fragmentos pequenos (através datécnica de shotgun) que são clonadosem vetores plasmidiais que serão se-qüenciados em suas extremidades.Após uma primeira etapa de monta-gemdesse genoma, fragmentosmaio-res são clonados em cosmídeos e se-qüenciados. Essa segunda etapa é im-portantepara amontagemdogenomacompleto do organismo, já que a pri-meira normalmente produz uma se-qüência incompleta, apresentandoal-guns buracos de seqüência (gaps).

Já em projetos genomas de orga-nismos eucariotos, que possuem fre-qüentemente uma enorme quantida-de de DNA, normalmente prefere-seadotar uma técnica conhecida comoshotgun hierárquico. Nessa técnica, oDNA inteiro doorganismoéprimeira-mente inserido emgrandes vetores declonagem,comocromossomosartifici-ais de bactérias (BACs) ou de levedu-ras (YACs). Depois então é realizadoum shotgun desses grandes fragmen-tos dos vetores, gerando fragmentosmenores que são agora clonados emvetores plasmidiais para o sequencia-mento. Portanto, tais projetos consis-tem de duas etapas, a montagem decada um dos grandes fragmentos clo-nadosnosBACseYACseamontagemfinal que reunirá as seqüências com-pletas dos BACs e YACs montadospara a reconstituição da informaçãogenômica inicial.


Figura 5. a) Na estratégia de shotgun, todo o DNA genômico de umorganismo é fragmentado em pequenos pedaços (1), que são clonadosem vetores de pequeno porte, como plasmídeos, para o posterior se-qüenciamento. b) Na estratégia de shotgun hierárquico, normalmenteutilizada para grandes genomas, realizam-se dois passos. (1) Primei-ramente fragmenta-se o genoma em grandes pedaços, que são clona-dos em vetores de grande porte, como BACs ou YACs. (2) Posterior-mente realiza-se uma segunda etapa de shotgun, onde as seqüênciascontidas nesses vetores são fragmentadas em pequenos pedaços e clo-nadas em vetores de pequeno porte, que serão sequenciados

Muitas vezes, ao invés de ser reali-zado o seqüenciamento genômico deum organismo eucarioto, prefere-serealizar o seqüenciamento sódas regi-ões gênicas, utilizando informaçõesoriundasdeRNAmensageiro (mRNA).Dessa formaérealizadaumabibliotecade cDNA, representando o conjuntode mRNAs de uma célula, que sãoclonados em vetores plasmidiais. Osinsertos de cDNA presentes em taisvetores são então seqüenciados apar-tir de suas extremidades 5� ou 3�,produzindopequenas seqüênciasqueirão representar pedaços dos genesexpressosnomomentodaextraçãodomRNA da célula em questão. Essespedaços seqüenciados representametiquetas degenes expressos, ouESTs(ExpressedSequenceTags) e umaaná-lise dos genes expressos é uma abor-dagem bastante utilizada na tentativade entender o funcionamento dome-tabolismo dos mais diversos organis-mos.Comoexemplo,noBrasil aborda-gens transcriptômicas já foramutiliza-dasem largaescalanoprojetodacana-de-açúcar e vêm sendo utilizados emorganismos parasitas, como é o casodos projetos de seqüenciamento deESTs de SchistosomamansoniemSãoPaulo e emMinas Gerais.

Como já foi mencionado anterior-mente, normalmente adota-se a estra-tégia de seqüenciamento genômico

em organismos cujo genoma é peque-no e que contém baixa quantidade deseqüências repetitivas. Entretanto, aestratégia de seqüenciamentodo trans-criptoma, ouaproduçãodeESTs, nãoéutilizada apenas quando o genoma doorganismoémuitogrande.Essaestraté-gia é importante tambémparaestudarodesenvolvimentodosorganismos, pro-duzindobibliotecas de diferentes fasesdedesenvolvimentoeobservandoquaisgenes são expressos em cada momen-to. Tal abordagem tambémé importan-te para estudarmos como ocorre a ex-pressão diferencial de genes em dife-rentesórgãosdeummesmoorganismo,para que possamos entender a funçãodesses órgãos ou como eles realizamfunçõesconhecidas. Portantopodemosdizer que as estratégias de seqüencia-mento de genomas e transcriptomassão complementares e ambas devemser realizadas, quando possível, paraque possamos obter informações rele-vantes sobre os organismos que esta-mosestudando.

Base calling

Os dados brutos provenientes doseqüenciadordeDNAsãonormalmentesubmetidos diretamente a algum pro-grama de base calling. O base callingconsiste no processo de leitura dos da-dos do seqüenciador e identificaçãodaseqüência de DNA gerada, atribuindo

ainda um valor de qualidade para cadaposição nucleotídica identificada. Nor-malmente cada seqüenciador apresentaumprogramadebasecallingassociado.Entretanto, o programa mais utilizadonessa etapa é o PHRED.

O PHRED reconhece dados de se-qüências a partir de arquivos SCF (Stan-dard Chomatogram Format), arquivosdecromatogramadosanalisadoresauto-máticosdeDNAABIearquivosMegaBA-CE ESD. Este software reconhece a se-qüência de nucleotídeos a partir do ar-quivodedadosbrutosdo seqüenciador,atribui valores de qualidade às basesconstituintesdaseqüêncianucleotídicaegera arquivos de saída contendo infor-mações sobre o basecall eos valores dequalidade.O valor de qualidade das se-qüênciasanalisadaspodeserencontradonos arquivos FASTA e PHD.

De acordo comEwing etal (1998) asatribuiçõessegurasdevaloresàs seqüên-cias nucleotídicas são proporcionadaspela implantação de um algoritmo quetem como base os métodos de AnálisedeFourier.Oalgoritmoanalisa asquatrobases e prediz a provável região centraldospicoseasdistâncias relativasentreospicos da seqüência de DNA. O valor dequalidadeatribuídoacadabaseéobtidopela fórmula a seguir, que calcula aprobabilidadedeerronobasecall, ondeoPeéaprobabilidadedeumabaseestarerrada.

PHRED Quality = -10 log (Pe)

Aspontuações inseridasnosarquivosde saída do PHRED representam a pro-babilidade logarítmicanegativaemesca-la de erro de um base call; portanto,quanto maior o valor de qualidade doPHRED, menor a probabilidade de terocorridoumerro. Sócomoexemplo,umvalordePHRED20paraumadetermina-daposiçãonucleotídica significaqueelaapresenta uma chance em 100 de estarerrada. Já um valor de PHRED 30 signi-fica que determinada base apresentauma chance em 1000 de ter havido umerro no base calling. Esses valores sãoimportantes para determinar se uma re-giãoprecisa ser resseqüenciada.

Mascaramento de vetores

A estratégia freqüentemente adota-da após a realização do base calling é a


procurapor regiõesde contaminantesna seqüênciaproduzida. Regiões con-taminantes são partes da seqüênciaobtidaquenão representamoDNAouo cDNA que se deseja analisar. Taisregiões representam, normalmente,partes dos vetores de clonagem ondeas seqüências de interesse foram inse-ridasoupedaçosdeDNAadaptadoresutilizados durante a construção dasbibliotecas. Como essas regiões nãorepresentam as seqüências que sedeseja analisar, elas devem ser retira-dasoumascaradasporumprograma.Eaqui, o programa mais utilizado é oCross_match. Esse é, na verdade, umprogramapara a comparação de duasseqüências e é preciso utilizar comoentrada um arquivo apresentando aseqüência dos vetores que se desejamascarar. O que o Cross_match faz écomparar a seqüência desejada comoarquivo de seqüências de vetores e,ondeoprogramaencontrar similarida-deentreas seqüências, ele irámascarar(acrescentando letras X) a seqüênciadeentrada.Assim,osnucleotídeosdasseqüênciasdeentrada similares a regi-ões de vetores de clonagem serãoalteradosparaXenão atrapalharãoosprocessosposteriores de análise com-putacional.

Agrupamento de seqüências

Após a geração de arquivos semcontaminantes, contendoa identifica-çãodasbaseseaqualidade, todasessasinformações são repassadas a um sof-twaredemontagemcomooPHRAP,oCAP3ouoTIGRAssembler.O softwa-remaisutilizadonessaetapa,oPHRAP(Phragment Assembly Program) é oprograma responsável pela leitura dasinformações do basecall emontagemdos pequenos fragmentos de DNAseqüenciadosemseqüênciasmaiores,os contíguos (contigs). Este programapossui diversos pontos chaves para aobtençãoderesultado final satisfatório,como: construção de seqüência docontíguo através de um mosaico departes das seqüências com alta quali-dade; utilização de informações daqualidade dos dados computados in-ternamente e de implementações fei-tas pelos usuários para aumentar aqualidadedamontagem;apresentaex-tensivas informações sobre a monta-

gem realizada (incluindo valores dequalidadesparaa seqüênciadoscontí-guos). Emprojetos genomaespera-seobter, na saídadoPHRAP, a seqüênciamontadadocontíguogenômico. Jáemprojetos trancriptoma esperamos ob-ter as seqüências de cada dos genesexpressos após a execução deste sof-tware de montagem.

Avisualizaçãoeediçãodasseqüên-cias geradas após a montagem sãorealizadas normalmente através doprogramaPhrapviewouConsed.

Figura 6: Interface do programa Consed

BOX5-Programasmaisutilizadosemprojetosgenomaetranscriptoma

PHREDhttp://www.phrap.orgSoftware para a realização do base calling e a produção do cromatogramaprocessado.CROSS-MATCHhttp://www.phrap.orgSoftware para a comparação entre duas seqüências de DNA. Normalmenteutilizadopara omascaramentode regiões representando vetores em seqüên-cias genômicas ou de cDNA. Distribuído juntamente com o PHRAP.PHRAPhttp://www.phrap.orgSoftware mais utilizado para a realização do agrupamento de seqüências(clustering analysis) e montagem de contíguos genômicos.CAP3http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.htmlSoftware utilizado para o agrupamento de seqüências e montagem decontíguos genômicos. Utiliza umalgoritmodiferente doPHRAP.CONSEDhttp://www.phrap.orgSoftwaremaisutilizadoparaavisualizaçãodos resultadosobtidospor softwaresdeagrupamentodeseqüências.Permiteaediçãodasbases seqüenciadas, alémdediversos outros recursos.

O processo de anotação gênica

Uma vez obtidos os dados doseqüenciamento dasmoléculas deDNAé preciso saber o que representa cadaumadas seqüênciasnucleotídicasprodu-zidas.Aanotaçãoconsiste simplesmenteno processo de identificação dessas se-qüências. Emprojetos genoma, estepro-cesso normalmente é realizado em trêsetapas: anotação de seqüências denucleotídeos, de seqüências protéicas edeprocessosbiológicos.


Figura 7: Etapas da anotação em projetos genoma e as perguntas quese deseja responder em cada uma delas

Apartir da anotaçãode seqüênciasnucleotídicasprocura-se,primeiramen-te, identificar anaturezadeumadeter-minada seqüência. Devemos desco-brir se tal seqüência está inserida emuma região gênica, se representa umamolécula de RNA transportador ouRNAribossômico, sepertenceaalgumtipo de região repetitiva já descrita ouseapresenta algummarcadorgenéticoconhecidoemseu interior.Oprincipalobjetivo dessa etapa é construir ummapadogenomadoorganismo, posi-cionandocadaumdospossíveisgenese caracterizando as regiões não-gêni-cas. Nesta fase, alguns programas depredição gênica são usados para alocalização depossíveis genes nas se-qüências de DNA. A procura por ele-mentos comoocódonde iniciaçãodeproteínas (a trinca de nucleotídeosATG)e códonsde terminaçãonames-ma fase de leitura são utilizados poralguns desses programas. O tamanhodelimitado por esta janela de leitura éfreqüentemente utilizadopara definiruma determinada região como sendogênica ou não. Alguns outros progra-mas sãocapazesde identificar, depen-dendo do genoma analisado, regiõesgênicas codificadoras (éxons) e nãocodificadoras (íntrons). Alguns exem-plos são oGenomeScan e oGenScan.Em projetos de trancriptômica, ondese utiliza a abordagem de seqüencia-mento de ESTs, essa etapa não érealizada, uma vez que todas as se-qüências produzidas se restringem aregiões gênicas.

Mapeados os genes, a etapa se-guinte consiste em identificar quaisproteínas são codificadas, enisso con-siste o processo de anotação das se-qüências protéicas. Nessa etapa, pro-cura-semontarumcatálogodosgenespresentesnoorganismoestudado,dan-do-lhes nomes e associando-os a pro-váveis funções. No caso de projetosgenoma, deseja-se identificar onúme-ro total degenespresentesnoorganis-

mo seqüenciado, já que há informaçãoda seqüência de DNA de todo o geno-ma. Já em projetos transcriptoma, atarefa consiste em identificar os genesexpressosnoorganismoemumadeter-minada condição. Apesar de não sercapaz de identificar todos os genes deumdeterminadoorganismo,osprojetosde transcriptômica podem permitir aidentificação de genes expressos emdiferentes tecidos e fases de desenvol-vimento, alémdepermitir a observaçãodaqueles que apresentam variantes desplicing. Portanto,nessaetapadaanota-ção, o principal objetivo é identificar ecaracterizar cadaumadasproteínas co-dificadas pelos mRNAs presentes noorganismo estudado em determinadacondição.

A parte mais interessante e desafia-dora dosprocessos de anotaçãogênicaé relacionar, finalmente, a genômicacomos processos biológicos, e essa é aetapadeanotaçãodosprocessosbioló-

gicos. Essa etapa é comum a projetosgenomae transcriptoma. Identificadosos genes, devemos agora tentar relaci-oná-losdemodoaobtermosummapafuncionaldoorganismoestudado.Nes-se pontodeve-se identificar quais viasbioquímicas estão completas ou in-completas no organismo e quais viasalternativas ele possui. Aqui é funda-mental a participação de biólogos es-pecialistas emdiversas áreas para quese possa descobrir como ometabolis-modoorganismopode influenciar seumodo de vida e seu comportamento.Esse é o momento onde é possívellevantar várias hipóteses que relacio-nemo funcionamentodosorganismoscomseusdadosgenômicos.Taishipó-teses devem ser testadas experimen-talmente, por pesquisadores que tra-balhemcomoorganismoestudado.

Como é realizada a anotação

Até aqui foi mostrado o que énormalmente feito em um processode anotação gênica. Vejamos agoracomo tal processoé realizado. LincolnSteindefiniumuitobemcomoaconte-ce a sociologia dos projetos de anota-ção gênica. Ele dividiu o processo deanotação de genomas em três etapas:a fábrica, o museu e a festa.

BOX6 � Principais softwares utilizados durante a anotação gênica

RepeatMaskerhttp://repeatmasker.genome.washington.edu/Utilizado para a identificação e omascaramento de regiões repetitivasfreqüentemente encontradas em genomas.Genscanhttp://genes.mit.edu/GENSCAN.htmlUtilizado para a predição de genes em genomas eucarióticos. Seu método depredição é baseado em cadeias escondidas deMarkov.tRNAscan-SEhttp://www.genetics.wustl.edu/eddy/tRNAscan-SE/Utilizado para encontrar genes de tRNA em uma seqüência genômica.BLASThttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTUtilizadopara encontrar similaridades entre seqüências denucleotídeos eproteínas contra bancos de dados com grande número de seqüências dosmais diversos organismos. É umdosprincipais programas utilizados naidentificaçãodos genes.Interprohttp://www.ebi.ac.uk/interproUtilizadopara realizar buscas contra diferentes bancos dedados dedomíniose famílias de proteínas. Integra os serviços do Pfam, PRINTS, ProDom,PROSITE, SMART, TIGRFAMs e SWISS-PROT.GeneOntologyhttp://www.geneontology.orgConsórcio destinado a produzir umvocabulário comuma ser aplicado para aclassificação dos genes presentes em organismos eucarióticos. Cada gene éclassificado em três níveis: funçãomolecular, processos celulares elocalizaçãocelular.


Na primeira etapa trabalham ape-nas as ferramentas de bioinformática,funcionando em larga escala, comoumafábrica.Assim,as seqüênciasobti-daspassamporumagrandediversida-dedeprogramas,quedevemajudarosanotadoresa identificá-laseagrupá-laspara a próxima fase.

A segunda etapa necessita de es-pecialistas que observem os dadosobtidos na primeira etapa pelas ferra-mentas automáticas eque, comocura-dores de um museu, identifiquem asseqüências de acordo com critériospré-definidos.

Após a identificação dos genes, éfeita a anotação dos processos. Nessemomento deve-se promover a intera-ção entre vários anotadores, bioinfor-matas ebiólogosespecialistas emdife-rentes áreas enoorganismoestudado.Nessa festa deve-se discutir como asinformaçõesobtidasnas etapas anteri-ores podem estar relacionadas com abiologia doorganismoemquestão.

A era pós-genômica

Umadas característicasmais fasci-nantes da explosão, ocorrida nos últi-mos 10 anos, de projetos e consórciosdestinados a compor o genoma com-pletodosmaisdiversosorganismos, foio estabelecimento de abordagens etecnologias que permitiram um estilo�linha-de-montagem�naobtenção,emtemposcadavezmais curtos, dequan-tidades �industriais� de seqüências deácidos nucleicos (DNAeRNA). Agoracomeçamosaenfrentaroproblemadeinterpretar e adicionar significado aessas seqüências. Temos agora que, apartir dos bancos dedados existentes,processarecorrelacionarosdadosbru-tos transformando-oseminformaçãoeapartir desta informaçãogerar conhe-cimento, que é a informação testadaexperimentalmente.Nofinal, estanovaetapa promete ser uma jornada, pro-vavelmente sem fim, através das pro-teínas, suas estruturas e funções, viasmetabólicase interaçõescelulares.Estamudança do foco de atenção, dos áci-dos nucleicos para as proteínas, temsido utilizada para batizar esta novaetapa da pesquisa biológica em largaescalacomo�EraPós-Genômica�.Con-tudo, trata-se apenas de mais umaetapa e, certamente, não aúltimapara

que os frutos dos programas de se-qüenciamento de genomas possamser colhidos. Etapas estas que foramprevistas pelo Projeto do GenomaHumano. Das cinco metas a serematingidas, o estudo da expressão deproteínas e a obtenção de mapas deinteraçãoproteína-proteínaocupamosegundoe terceiro estágios, dos quaisseesperaomaior impactoeconômico,levandoàdescoberta denovasdrogase reduzindo o seu tempo de entradanomercado.

Resumidamente,naEraPós-Genô-mica procura-se estudar a expressãodos genes codificados pelo genomados organismos, tecidos, células oucompartimentos celulares em deter-minadas condições fisiológicas (porexemplo, uma doença, uma situaçãode estresse ou ainda a administraçãode uma droga). Tentando entender aresposta a essas condições, são alvosdeestudos: a ativaçãoou repressãodedeterminados genes, a indução demudanças no estado pós-traducionaldasproteínasequalquerprocessoqueresulte na modificação do número e/ou da composição das proteínas exis-tentes.

Análise da Expressão Gênica

Lembrando do dogma central dabiologia (DNA→mRNA→Proteína),é facil perceberquepodemosavaliar aexpressãogênica atravésdaanálisedetranscritos (mRNA).

Emorganismoseucariotos, a facili-dadede isolamentodosmRNAs (usan-dooligonucleotídeospoli-T para cap-turar os mRNAs pela cauda poli-A), apossibilidadeda transcrição reversadomRNA para cDNA (usando a técnicade RT-PCR) e o domínio das técnicasde seqüenciamento emmassa de cD-NAs tornarampossível a análise quali-tativa e quantitativa, em larga escala,dos genes transcritos em organismos,tecidos e células. Desta forma, nosprojetos Transcriptoma, como já co-mentado, é feito o seqüenciamentoparcial de cDNAs representativos dapopulação de mRNA de maneira apermitir a identificação de diferentestranscritos (pela comparação das se-qüências do cDNA) e sua abundânciana população (pelo número de vezesem que cada transcrito é seqüencia-

do). As técnicasmais usadas são as deESTs e SAGE (Serial Analysis of GeneExpression).Nestaúltima técnica,maisrecente, são gerados e seqüenciadosconcatâmeros de fragmentos de cD-NAs com apenas 10 ou 17 nucleotíde-os de cada mensageiro, respectiva-mentedenominadosSAGEtagseSAGElong tags.

DNA chips e Microarrays

Uma outra forma de análise detranscritos, que permite a busca detranscritos de genes específicos napopulaçãodosmRNAsexpressos, usao já conhecidoprincípiodahibridaçãodeDNAasondasmoleculares.Asmaisnovas versões da técnica são os DNAchips eosmicroarrays, quepermitema análise simultânea da expressão demilhares de genes. Nestas duas técni-cas, respectivamente,oligonucleotíde-osou fragmentosdecDNAconhecidossão ligados a uma lâmina de vidro e,em cada experimento de hibridação,osmRNAsdedois tipos celulares dife-rentes ou de células em duas condi-ções patológicas ou tratamentos sãoanalisados. As duas populações demRNAs são amplificadas e marcadascomdiferentes corantes fluorescentes(cianinas ou Cys), um verde e outrovermelho. Ao hibridarem com cadagene (oligo ou cDNA) aplicado sobrea lâmina de vidro, a cor verde ouvermelha de cada ponto (ou spot)indicaráqueessegeneestá sendomaistranscrito em um tipo ou condiçãocelular doquenooutro. A cor amarelaindicará que o gene é transcrito igual-mente em ambos os tipos ou condi-ções celulares. Alémdisso, amaior oumenor intensidadedecadacor indicarámaioroumenornível deexpressãodogene.

A enorme quantidade de dadosgeradanosexperimentosdeDNAchipsemicroarrays são analisados por sof-twares específicos que envolvemmétodosde inferência estatística.Umaetapa bastante importante na fase deanálise dos resultados é a que chama-mos de normalização. Usando comoreferência os spots de genes controles(sabidamente expressos ou reprimi-dosnos tecidosoucélulas estudados),o que se busca é, basicamente, retirardosvaloresdecada spota influênciade


manchas espúrias (background) e devariações do processo de hibridação.Desta forma, apósanormalização, tor-na-se possível a comparação de spotsde uma mesma lâmina ou de experi-mentosdiferentes. Emumaetapapos-terior, programasde clusteringprocu-ram identificar e agrupar os spots su-per-expressos, reprimidosouquenãotemexpressão alteradanos tecidos oucélulasanalisadas.Apesardosmétodosde análise empregados, a falta de re-produtibilidadedos resultados aindaéumaqueixabastantecomum.Ousodemaior númerode réplicas de cada spote/ouabuscademétodosde inferênciaestatística mais adequados parecemser úteis para a validaçãodestes resul-tados.

Mais recentemente, comnovas téc-nicas para isolamento de mRNA deprocariotos, projetos de ESTs e demicroarray também têm sido desen-volvidosparaestesorganismos.Váriosgrupos de pesquisa em todo o Brasilestão iniciando projetos nesta área.Apenas como exemplo, entre os vári-osprojetosbrasileirosnestaárea temoso projeto Cooperation for Analysis ofGene Expression (CAGE) (http://bioinfo.iq.usp.br/ehttp://www.vision.ime.usp.br/~cage/) e oProjetoGeno-ma Raízes da Embrapa Soja (http://www.cnpab.embrapa.br/pesquisas/gp.html).

Projetos Proteoma

Um problema que surge com aabordagem descrita acima, de avalia-ção da expressão gênica a partir daanálise dos mRNAs transcritos, é quenemsempreaquantidadedeummRNAreflete a quantidade da proteína cor-respondente expressa na célula e, as-sim, não podemos relacionar direta-mente essa proteína a uma funçãonascélulas.Por isto,umaoutraabordagem,embora muito mais trabalhosa, temsido usada para avaliar a expressãogênica: a análisedasproteínas expres-sas. Esta �contrapartida protéica� dogenomaéconhecida comoproteoma.Por permitir relacionar diretamente aumaproteínadeterminada função,estaabordagem constitui um instrumentoparticularmente poderoso para eluci-darosmecanismoscelulares relaciona-

BOX7 � Exemplos de Projetos Transcriptoma:

Procuram avaliar quais são os genes expressos, e quanto deles é expresso,a partir do seqüenciamento parcial dosmRNAs transcritos.Dadosobtidospela técnicadeSAGEpodemser consultadosnapáginahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/. JánobancodbESTestãodepositadasESTsdediversosProjetosTranscriptomadesenvolvidos em todoomundo (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/).Mais informações sobre DNA Chips eMicroarraysNestas técnicas, a verificação da expressão de genes específicos é feita emexperimentos de hibridação em lâminas de vidro contendo milhares defragmentos de DNA.Na página http://cmgm.stanford.edu/pbrown/, do pioneiro da técnica demicroarray,Dr. PatrickBrown,hámais explicações, um forumdediscussãoe bancos de dados demicroarrays. Na página http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/array.html há informações sobre os equipamentes necessários,uma tabeladecomparaçãodosprogramasdeanálisemaisusados,noçõesdeestatística aplicadas amicroarrays, sugestões de bibliografia, etc.Programa gratuíto para análise demicroarraysScanAlyse: escrito porMichael Eisen, o programa pode ser obtido gratuita-mente napágina http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm.Assinandoum ter-mo de compromisso, o autor permite, inclusive, o acesso ao código-fonte.

dos ao desenvolvimento de doenças,ao mecanismo de funcionamento decompostos químicos (por exemplo,fármacos) e identificar novos alvosterapeuticos.

As bases experimentais daproteô-mica não são novas e pertencem aoarsenal �clássico� da bioquímica, mashouve, nos últimos anos, um saltoqualitativo e quantitativo sem prece-dentes.Esse salto foi resultadodegran-des investimentos privados na buscade abordagensmais agressivas e rápi-das no isolamento, identificação e ca-racterização de proteínas, no mesmoestilo �industrial� que caracterizou aera genômica.O isolamentodeprote-ínas em grande número, inicialmenterepousavanas técnicaseletroforéticas,comoaeletroforesemonoebi-dimen-sional em géis de poliacrilamida. Em-bora tais técnicas certamente semprevenhama ter umpapel importante emqualquer laboratório de proteômica,nota-se hoje uma tendência cada vezmaior nousoda cromatografia líquidadealtaeficiência, comousodecolunascapilares, no desempenho desta tare-fa.A identificaçãoecaracterizaçãodasproteínasdependedeumconjuntodetecnologias (com certeza as que mais

sofreram incrementonodesempenho)envolvendo a espectrometria de mas-sa, a ressonância magnética nuclear,alémde recursos computacionais paraaarmazenagem,análise e compartilha-mento dos diversos tipos de dadosgeradosporestas tecnologias (imagensdegéisbidimensionais, sequênciaspro-téicas, estruturas protéicas, espectrosde massa, etc.).

Nos últimos anos a espectrometriademassa, emconjunto comacromato-grafia líquidadealtaperformance, vemse tornando a abordagem preferidapara identificarecaracterizarproteínas,devido essencialmente a três motivos.O primeiro é o desenvolvimento denovosmétodospara ionizaçãodepro-teínas e peptídeos, especialmente oMALDI e o ESI (Matrix-Assisted LaserDessorption-IonizationeElectroSprayIonization). O segundo é o desenvol-vimentode recursosdabioinformática,permitindo a análise de dados obtidospor espectrometria demassas emban-cos genômicos ede sequências protéi-cas. Eo terceiro éque a espectrometriademassas fornece informaçãodetalha-da de modificações pós-traducionais,emparticular as fosforilações e glicosi-lações.


BOX8 � MALDI e ESI

MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption-IonizationUmaamostra deproteína oupeptídeo émisturada comum largo excesso deumamatriz, formadaporumasubstânciaqueabsorvenoultra-violeta, epostapara secar. Um laser comumcomprimento de onda que seja absorvido pelamatriz, em um compartimento sob vácuo, incide sobre a amostra seca efragmentos ionizadosda amostra são carreadospela vaporizaçãodamatriz ecapturados por um campo elétrico do analisador demassas.ESI - ElectroSpray IonizationUmvoltagemaplicada emuma fina agulha contendo uma solução protéica,gera uma névoa de pequenas gotículas da solução, contendo pequenonúmero de moléculas protéicas. A redução das gotículas por evaporaçãoacaba colocando em fase gasosa as proteínas ionizadas. Elas são entãocapturadas pelo analisador de massas. A grande vantagem desta técnica épermitir oacoplamentodiretodeumsistemacromatográficodealtaeficiênciaao espectrômetro demassas, possibilitando a análise em fluxo contínuo demisturas protéicas complexas.

No Brasil, apenas agora começa-mos a montar grupos de pesquisanesta área. Merecem destaque as re-desdeproteômicaemSãoPaulo, sedi-ada no Laboratório Nacional de LuzSíncrotron (http://www.lnls.br/), enoRiode Janeiro (http://www.faperj.br/interna. phtml?obj_id=219).

As técnicas experimentais expos-tas acima, alémdeofereceremrespos-tas à curiosidadehumana, constituemformas inovadoras napesquisa para ocombate de problemas globais comodiabetes, câncer, hemofilia, etc... Naprática, independentemente do nú-

BOX9 - Links interessantes

Eletroforese bi-dimensional em géis de poliacrilamida (PAGE-2D)http://us.expasy.org/ch2d/protocols/http://www.aber.ac.uk/parasitology/Proteome/Tut_2D.htmlCromatografia líquida de alta eficiência, com o uso de colunascapilares (HPLC)http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/rphplc.htmhttp://www.ionsource.com/tutorial/capillary/introduction.htmEspectrometria deMassas (MS)http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/ms/ms.htmSoftware gratuíto para análise de PAGE-2D - MelanieDesenvolvidonoSwissProt, estádisponíveldiretamentenapáginadoSwissProt, http://www.expasy.org/ ou num link na página http://www.science.gmu.edu/ ~ntongvic/Bioinformatics/software.html, que dáacesso amuitos outros programas debioinformática.

mero de proteínas codificadas pelogenoma da espécie humana (o queainda hoje é discutido), é previsívelque em alguns anos possamos co-nhecer de 4000 a 10000 proteínas-alvo, sobre as quais medicamentospoderão agir. Para termos uma idéiada grandeza destes números, todo o

arsenal terapêuticoqueconhecemoshoje atua sobre apenas 500 delas. Onúmero de drogas disponíveis hojenosEUA,derivadasdestasnovas tec-nologias, chegoua103noanopassa-do (21 delas foram aprovadas em2000).

Modelagemmolecular

Aindaneste sentido, procurandoassociar proteínas a suas funções, abioinformáticapodeedeverá trazer,nas próximasdécadas, suasmaiorescontribuições àbiologia.Oconheci-mento da estrutura terciária de umaproteína constitui uma informaçãovaliosa para determinação de suafunção,poispodepermitir a identifi-caçãodedomíniosconhecidos,comosítios catalíticos, sítios de modifica-ção alostérica e outros.

Além disso, tendo as estruturastridimensionais das proteínas deter-minadas, podemos então realizarpesquisasmais direcionadasno sen-tidodeencontrar inibidores, ativado-res enzimáticos eoutros ligantesquepermitam a produção de fármacosmais eficientes eespecíficos: o alme-jado Desenvolvimento Racional deFármacos (RationalDrugDesign).

Atualmente a abordagem maiseficaznadeterminarçãodaestruturaterciáriadeproteínaséaquelaque seutiliza de técnicas experimentaiscomoNMR (RessonânciaMagnéticaNuclear) e cristalografiapordifraçãode raios-X. Dezenas de milhares deprotéinas tiveramsuasestruturas ter-ciáriasconhecidasatravésdestesmé-todos e têm fornecido dados para odesenvolvimento de programas demodelagem e para a modelagempor homologia. Entretanto osméto-dos experimentais são, frequente-mente,procedimentosdispendiosose de difícil execução. Além disso,existem limitações técnicas quedifi-cultamadeterminaçãodeváriaspro-teínas. A obtenção de cada proteínapura é um desses fatores limitantes.Outro fator é a dificuldade de crista-lizaçãodasproteínas, etapanecessá-ria para a determinaçãode estruturapor difração de raios-X. Este é umproblema comum em proteínas demembrana ou glicosiladas. Mesmousandorobôsparaaceleraroproces-so experimental, estas e outras difi-culdades fazem com que a determi-nação de novas estruturas protéicasnãoconsigaacompanhar avelocida-de de obtenção de dados dos proje-tos genoma.


Figura 8: Estrutura terciária equaternária daDeoxi-hemoglobinahumanaobtidapor Difração de Raios X edepositada no PDB. Amolécula é um tetrâmero,composta por 4 cadeias, eligada a 4 átomos de ferro

A modelagem molecular é ummétodo alternativo, não experimental,que permite, com base nos conheci-mentos da estereoquímica dos amino-ácidos e nas informaçoes adquiridasdas estruturas terciárias já resolvidas,prever a conformação de proteínas apartir da seqüência primária dos ami-noácidos.

Uma das formas de se realizar amodelagem de proteínas é utilizarcomo referência uma ou mais protéi-nas homólogas e de estrutura terciáriajá conhecida. Este tipo de modelagemé conhecido como modelagem porhomologia ou modelagem comparati-va, e, por enquanto, é a abordagemque obtém melhores resultados. Oprimeiro passo do processo é a pequi-sa de proteínas homólogas em bancosde dados de estruturas terciárias deproteínas. O PDB (Protein DatabaseBank) é o mais utilizado para este fim.A seguir, deve ser realizado o alinha-mento das seqüências de aminoácidosdas protéinas homólogas e a proteína-alvo (o programa Clustal, citado ante-riormente no artigo, pode ser usado). Amodelagem, propriamente dita, é rea-lizada através de softwares como oModeller, SWISS-MODEL, 3D-PSSM,dentre outros. Esses programas nor-malmente procuram encontrar a estru-tura terciária que melhor se aproximeda disposição dos átomos das proteí-nas utilizadas comomodelo, e aomes-mo tempo atenda às restrições este-

reoquímicas. Após a definição de umaestrutura candidada, esta pode ser ava-liada através de outros softwares deverificação de restrições estereoquími-cas, como o programa Procheck.

A modelagem por homologia é umprocesso iterativo de ajuste de parâ-metros e verificação dos resultados.Normalmente é necessário que o pro-cesso seja repetido várias vezes atéque uma estrutura terciária adequadaseja obtida. Além disso, a modelagemde proteínas, como um todo, é umatécnica heurística: mesmo que a estru-tura obtida concorde perfeitamentecom todas as restrições impostas, nãohá garantias de que esteja correta.Deve-se lembrar que uma estruturabastante semelhante à real pode ser osuficiente para formulação de novashipóteses e atingir as expectativas dousuário desta técnica.

Uma abordagem recente, que pos-sui um crescente números de adeptose acumula bons resultados, é a mode-lagem através de threading de prote-ína. Esta técnica é baseada na compa-ração da proteína em questão commodelos descritivos dos enovelamen-tos de proteínas homólogas. Nessesmodelos sãodescritas: a distância entre

os resíduosde aminoácidos, a estruturasecundária de cada fragmento e ascaracterísticas fisico-químicas de cadaresíduo.

Entretanto, um grande desejo dosque trabalham com proteínas é o de-senvolvimento deprogramas realmen-te eficientes para a modelagem abinitio, ou seja, que sejam capazes depredizer a estrutura terciária de umaproteína, tendo como informação ape-nas a seqüênciados resíduosdeamino-ácidos e suas interações fisico-quími-cas, entre si e com o meio. Programasassim existem hoje mas têm muito amelhorar para que possamos confiarunicamente no seu resultado.

No geral, a modelagem de proteí-nas através de programas de computa-dor é um campo de pesquisa recentee aindanãogerou softwares de eficiên-cia comprovada. Para estimular o de-senvolvimento de programas de mo-lelagem molecular de proteínas, foicriado um evento para a avaliaçãodesses softwares denominado CASP(Critical Assesment of Structural Pre-diction). A cada dois anos este eventoreúneosmais conhecidos pesquisado-res desta área, que são desafiados esuas diferentes metodologias avalia-

BOX10 � Programas e sites relacionados commodelagem e estrutu-ras de proteínas

PDBhttp://www.rcsb.org/pdb/Mais famoso e completo banco de dados de estrutura de proteínas.Proteinexplorerhttp://molvis.sdsc.edu/protexpl/Programaderivado doRasMol para a visualização de estruturas de proteínas.SWISS-PDBviewerhttp://www.expasy.org/spdbv/Programa para a visualização e análise da estrutura de várias proteínas aomesmo tempo. Permite a realização de mutações de aminoácidos, altera-ções em pontes de hidrogênio, ângulos de torção e distâncias entre átomos.Modellerhttp://guitar.rockefeller.edu/modellerUm dos programas mais utilizados para a modelagem de proteínas porhomologia.SWISS-MODELhttp://www.expasy.org/swissmodPrograma via web para a modelagem de proteínas por homologia.PROCHECKhttp://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/procheck.htmlPrograma que checa a qualidade estereoquímica de uma estrutura de prote-ína, gerando análises gráficas sobre a geometria espacial da proteína, resí-duopor resíduo.Librahttp://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/libra/LIBRA_I.htmlPrograma on-line que utiliza threadingpara encontrar uma seqüência deresíduos de aminoácidos quemelhor se adequem a uma estrutura terciáriaconhecida e vice-versa.CASPhttp://predictioncenter.llnl.gov/Center.htmlCritical Assesment of Structural Prediction. Competição que avalia ossoftwares de predição de estrutura de proteínas.


das. Nesta competição cada grupo re-cebe seqüências de proteínas tiveramsua estrutura resolvida experimental-mente por NMR e/ou cristalografia pordifração de raios X, mas que ainda nãoforam publicadas. Vence o grupo queconseguir prever ab initio, com maiorexatidão, a estrutura do maior númeroproteínas. Apesar dos esforços, atéhoje não houve 100% de acerto.

Métodos emfilogenética molecular

Umadas aplicaçõesmais antigas dabioinformática é a de desenvolvimen-to de programas que, a partir dasseqüências deDNAou de proteínas dediferentes organismos, sejam capazesde reconstruir a relação de parentescoentre as espécies, o que chamamos desistemática molecular, ou de recons-truir o parentesco entre as espéciesassociando essas informações a umaescala temporal, o que chamamos defilogenia molecular. A representaçãográfica desses resultados é feita naforma de árvores filogenéticas.

Atualmente, árvores filogenéticassão extremamente comuns em artigosque abordam assuntos de biologiamolecular, refletindo o reconhecimen-to de que estas árvores representamuma maneira legítima de entender osprocessos biológicos e a evolução dosmais diversos caracteres. Estes estudose as ferramentas criadas para este fimtêm aplicações tão diversas como pro-curar entender a origem do homemoureconstituir a história epidemiológicada AIDS a partir de dados do genomado vírus HIV.

Para realizar inferências a respeitodas relações de parentesco entre orga-nismos, tomando comobase seqüênci-as de DNA ou proteínas, o primeiropasso é identificar seqüências de inte-resse que apresentem ancestralidadecomum, ou seja, que sejam homólo-gas. Para isto, muitas vezes estas se-qüências são escolhidaspor similarida-denos grandesbancosdedadosdispo-níveis na rede, sem que tenhamos,sobre elas, dados das funções bioquí-micas e biológicas que possam confir-mar sua homologia. Por isso, é impor-tante ressaltar que, ao fazermos umareconstrução filogenética, a escolha deseqüências homólogas é fundamentalpara gerar uma árvore confiável, poissó assim teremos certeza de que esta-

remos comparando um mesmo marca-dor que apresenta similaridades entrevários organismos a partir de uma ori-gem comum, garantindo que eles com-partilhamummesmoancestral.Quandonão se comparam caracteres homólo-gos, pode-se incidir no erro de conside-rar similaridades sem origem comum e,portanto, com histórias evolutivas dife-rentes. Uma das formas de avaliar estaescolhaé incluir nas análises, seqüênciasde grupos externos (organismos comhistoria evolutiva conhecida em relaçãoao grupo em estudo), que funcionamcomo controles no processo de recons-trução de parentescos.

Uma vez selecionadas as seqüênciashomólogas dos organismos de interessee de grupos externos, será necessáriorealizar o alinhamento múltiplo entreelas e então gerar árvores filogenéticasa partir de métodos de distância ou decaracteres discretos (máxima parcimô-nia ou máxima verossimilhança) parapodermos realizar a inferência filogené-tica desejada. Para tanto, os seguintesmétodos são freqüentemente utilizadospelos softwares:

Métodos de Distância

Funcionam basicamente em doispassos, sendo que o primeiro deles é aredução das variações entre seqüênciasalinhadas a valores de distância dispos-tos em uma matriz. No segundo passo,estes valores sãoutilizadosna reconstru-ção filogenética. Um dos métodos dedistância mais comuns é a chamadadistância p, que expressa o número desítios variáveis entre duas seqüênciascom relação ao total de sítios compara-dos. Além deste, existem também mui-tos outrosmodelos evolutivos utilizadospara o cálculo de distâncias genéticas,comoo Jukes-Cantor, Kimura 2 parâme-tros, Tajima e Nei e Tamura 3 parâme-tros. Na reconstrução filogenética, osalgoritmosmais utilizados sãooUPGMA(Unweighted Pair Group Method withArithmetic means) e o Neighbor-joi-ning, que realizamuma série de cálculoscom amatriz de distância gerada a partirdo alinhamento para estimar a árvorefilogenética.

Máxima Parsimônia (MP)

Este método baseia-se na teoria deque a melhor hipótese para explicar umprocesso é aquela que requer o menor

número de passos. Para a análise filoge-nética, isto significa que a árvore quepossuir ummenor númerodemudanças(substituições) para explicar os dadosdoalinhamento é a mais próxima da real.Na MP não há a fase de cálculo dedistância, sendo que as árvores são cal-culadas diretamente dos dados do ali-nhamento. Entretanto, estametodologiarequer muitomais tempo quando se usaa busca exaustiva de árvores, uma vezque o computador precisa reconstruirtodas as árvores possíveis para �esco-lher� aquelas com um número mínimode mudanças, que são chamadas deárvoresmaisparcimoniosas. Para contor-nar este problema do tempo, existemtambém algoritmos heurísticos de re-construção filogenética, mas é precisolembrar que, nestes casos, a árvore finalpode ser subótima.

Máxima Verossimilhança (MV)

Este método baseia-se na reconstru-ção filogenética através da busca porumaárvore quemaximize aprobabilida-dedos dados observados.Neste sentido,o método de MV calcula as probabilida-des associadas a diferentes topologias ecada uma delas com as variações nostamanhos dos ramos, considerando omodelo evolutivo escolhido. Portanto,encontrar a árvore mais verossímil en-volve não somente a análise das topolo-gias possíveis, mas também das varia-ções de comprimento de ramos paracada topologia. Destemodo, o empregode algoritmos heurísticos pode auxiliarenormemente na busca pela árvore ide-al, já que o tempo computacional au-menta de acordo com o número deespécies e de parâmetros consideradosna análise.

A cada vez que um programa defilogenia molecular é rodado para geraruma árvore sobre o conjunto de dadosescolhidos, o resultadopode ser diferen-te. Por isso, para validar uma árvorefilogenética, o que se faz é rodar repeti-das vezes o programa escolhido e, esta-tisticamente, testar cada ramopara esco-lher um a um aqueles commaior proba-bilidade de ocorrência para a composi-ção final da árvore. Ométodo estatísticomais usado nessas análises é o chamadobootstrap.

O bootstrap funciona gerando con-juntos modificados de dados, obtidosaleatoriamente a partir dos dados doalinhamento. Para cada conjunto aleató-


BOX11 - Programas mais utilizados na análise filogenéticaClustal

Programapara o alinhamentomúltiplo de seqüênciasAcessoon line - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/Downloaddo clustal X para diversas plataformas - http://inn-prot.weizmann.ac.il/software/ClustalX.htmlPAUP 4.0 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony and other methods) -http://paup.csit.fsu.edu/Análises filogenéticas utilizandométodosdedistância,máximaparcimôniaemáximaverossimilhançaPHYLIP (Phylogeny Inference Package) � inferências filogenéticashttp://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htmlMEGA (Molecular EvolutionaryGenomeAnalysis) - http://www.megasoftware.net/Inferências filogenéticas commétodos de distância e parcimônia.Downloadgratuito.Treeviewhttp://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeviewSoftware gratuito para edição gráfica e impressão de árvores filogenéticas

rio de dados obtidos é estimada umaárvore. As novas árvores, geradas apartir dos conjuntos modificados dosdados de entrada, são comparadas.Cada um dos ramos da árvore finalrecebe então um valor de probabilida-de, que é obtido do número de novasárvores onde esse ramoocorreudividi-do pelo número total de novas árvoresestimadas. Probabilidades altas indi-cam que, mesmo com algumas altera-ções, os dados suportam o ramo aoqual essa probabilidade se refere eprobabilidades baixas significam que,com a amostra analisada, não se podeter certeza de que determinado ramoseja correto.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Tentamos abordar nesse artigo osprincipais tópicos desenvolvidos embioinformática. Este artigo não preten-de esgotar cada um dos assuntos abor-dados,mas imaginamosqueos leitoresinteressados poderão encontrar maisinformações e trilhar seupróprio cami-nho visitando os links e observando asreferências sugeridas.

Agradecimentos

Sendo este trabalho fruto do apren-dizado obtido no II Curso de Especia-lização em Bioinformática, realizadode agosto a novembro de 2002 emPetrópolis - RJ, os autores gostariamdeagradecer principalmente ao CNPq

pelo suporte financeiro concedidoparaa realização do curso e ao LNCC (Labo-ratório Nacional de Computação Cien-tífica) por sediar este evento, em es-pecial à coordenadora do curso, AnaTerezaVasconcelos.Agradecemos tam-bém a todos os nossos professores:Darcy de Almeida, Richard Garratt,Glaucius Oliva, Patricia Palagi, MarieAnne Van Sluys, Cláudia Russo, Ana-maria Camargo, Helena Brentani, San-dro de Souza, Jorge de Souza, LuizGonzaga, Frank Alarcon, FernandaRaupp, Daniele Quintella, Helio Bar-bosa,AlexandrePlastino,Dorival Leão,MarcosGrivet, SimoneMartins e a todoo pessoal do Laboratório de Bioinfor-mática do LNCC.

Agradecemos também a nossosorientadores e às instituições e órgãosde financiamentonacionais e estaduaispelo apoio dado a cadaumdenósparaaparticipaçãonoCursodeEspecializa-ção em Bioinformática do LNCC.

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