bio aula01

Engenharia de Cultivos Celulares Engenharia de Cultivos Celulares para a Produpara a Produo de o de BiofBiofrmacosrmacos

Profa. Leda CastilhoCOPPE/UFRJ - Programa de Engenharia Qumica

Escola Piloto Virtual 2008

Aula 1: Introduo

IntroduIntroduoo

BiotecnologiaBiotecnologia

9Definio:

z Emprego de clulas ou componentescelulares para a obteno de produtos de utilidade para o homem

ProcessosProcessos biotecnolbiotecnolgicosgicos

BiologiaBiologia xx BiotecnologiaBiotecnologia

Umaidia

Umapatente

Um artigocientfico

Um processo

Vaifuncionar?

Funcionouuma vez

Funcionoutrs vezes

Funcionasempre

Produtos Produtos biotecnolbiotecnolgicosgicos

ProteinsPolypeptides

VP 2

VP 1

VirusesCapsidsCapsidomers

DNAPlasmids

Antibiotics and othersecundary metabolites

O

N

H

N

S CH3

MeOO

H H

Antibiticos e outrosmetablitos secundrios

Protenas DNAPlasmdeos

Vrus

ValorValor agregadoagregado de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos

1

100

10.000

1 milho

100 milhes

Efluentes tratados

Protena de unicelular

Levedura de panificao

Vitamina B12

Protenas teraputicas obtidas pelocultivo de clulas animais

Penicilina

Preo por tonelada (US$) Produto

ValorValor agregadoagregado de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos

Valor agregado

Escala deproduo Grau de pureza

EstruturaEstrutura geralgeral de um de um bioprocessobioprocesso

Organismo sobconservao

Preparo domeio de cultivo

Propagao do inculoem escalas crescentes

Esterilizao do meioe de equipamentos

Biorreator

RPB1RPB2RPB3RPBn

Processos de recuperao e purificao de biomolculas (RPB)Formula-

o e em-balagem

Produto


Organismo sobconservao

Preparo domeio de cultivo

Propagao do inculoem escalas crescentes

Esterilizao do meioe de equipamentos

Biorreator

RPB1RPB2RPB3RPBn

Processos de recuperao e purificao de biomolculas (RPB)Formula-

o e em-balagem

Produto

Todas as reas do desenvolvimento de bioprocessosso interdependentes: a clula ou enzima empregada,

as condies de cultivo, os equipamentos de fermentao, as operaes de RPB.

Uma melhoria em uma rea pode gerar desvantagensem outras, logo o desenvolvimento de bioprocessos

deve ser feito de forma integrada.


Preparo edesenvolvimento

do inculo

Preparo eesterilizao

do meio de cultivo

Processos de recuperao e purificao do produto (downstream processing)Cultivo(biossntese)

SSntesentese ququmicamica x x biossbiossntesentese

Matria-prima Intermedirios Produto

AC D E

B

9Molculas obtidas por converso qumica

9Produtos biotecnolgicos

F

Matria-prima Clula Produto

A F

ProdutosProdutos biotecnolbiotecnolgicosgicos

9Exemplos de frmacos obtidos por sntese qumicaz Paracetamol (analgsico) MM = 151,16 Daz Cetamina (anestsico) MM = 237,74 Daz Aciclovir (anti-viral) MM = 225,20 Daz Zidovudine (anti-viral) MM = 267,20 Daz Misoprostol (anti-lcera) MM = 382,50 Da

9Exemplos de biofrmacos produzidos por via biotecnolgicaz Insulina tratamento de diabetesz Enzimas agentes trombolticos, digestivos, etc.z Fatores sanguneos tratamento de hemofiliaz Anticorpos tratamento de diferentes tipos de

cncer


Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40(frmula da sequncia de aminocidos)

(MM = 146.000)

O

O

OH

O

cido acetil saliclicoC9H8O4

(MM = 180)


Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40(frmula da sequncia de aminocidos)

(MM = 146.000)

O

O

OH

O

O

O H

O

Colocandoem escala:

cido acetil saliclicoC9H8O4

(MM = 180)

Produtos Produtos biotecnolbiotecnolgicosgicosaplicados aplicados rea da sarea da sadede

9Produtos biotecnolgicos para a sade humana:z Biofrmacos

Protenas recombinantes

Anticorpos monoclonais

cidos nucleicos para terapia gnica ou RNAi

z Vacinas Virais

Bacterianas

Sub-unidade, recombinantes

Gnicas

z Molculas para diagnstico

z Terapias celulares

Principais Principais reas de aplicareas de aplicao de produtos o de produtos biotecnolbiotecnolgicos aplicados gicos aplicados rea da sarea da sadede

NBEs NCEs % NBEs(biol.) (qum.) (biol.)

Imunologia/ 28 23 55InflamaoVirologia* 19 28 40Oncologia 40 76 34Cardiovascular 8 40 17Pneumologia 5 30 14Metabolismo 7 53 12Genito-Urologia 3 27 10ZNS 5 89 5Outros 21 48 30

136 414

*principalmente vacinas NCE: new chemical entity; NBE: new biological entity

AplicaAplicaeses do do cultivocultivo de de cclulaslulasanimaisanimais in vitroin vitro

Vacinas (viraise recombinantes)

Terapia gnica Terapias celularese clulas tronco

Diagnstico (in vitro e in vivo)

Protenase anticorposteraputicos

Cultivo de clulas animais

9Protenas teraputicas:z avanos no entendimento da base molecular das doenas

revelaram a existncia de protenas de potencialteraputico

z produzidas naturalmente pelo organismo em mnimasquantidades inicialmente desincentivou a sua produopara aplicao mdica em larga escala

9Produo em larga escala possibilitada a partir de:z tecnologia do DNA recombinantez tecnologia de hibridomas

ProteProtenas teraputicasnas teraputicas

9Protenas teraputicas obtidas por meio que no a extrao a partir de fontes naturais biofrmacos

9Usados no tratamento de doenas importantes:z cncer (anticorpos monoclonais)z anemia (eritropoetina, EPO)z hemofilia (fatores de coagulao VIII e IX recombinantes)z neutropenia (estimulantes hematopoticos: G-CSF e

GM-CSF)z infarto agudo do miocrdio (ativador de plasminognio

tecidual, t-PA)

ProteProtenas teraputicasnas teraputicas

O O exemploexemplo do do FatorFator IX IX humanohumano

-carboxi-lao (Gla)

Glicosilao(CHO), sulfatao(SO3) e fosforilao(PO3)

Hidroxilao(OH)

O O exemploexemplo dada EPO EPO recombinanterecombinante

Eritropoetina

N-Glicosilao: Asn (24,38,83)

Nac-Glc

Nac-Glc

1-4Fuc1-6

1-4Man

ManMan

1-6 1-3Nac-Glc

Nac-Glc Nac-Glc

Nac-Glc

1-6

1-2 1-2

1-4

Gal Gal

Gal Gal

1-4

1-41-4

1-4

S

S S

S

2-3

2-3 2-3

2-3

Fonte: Kratje (2004)

O-Glicosilao:

Ser (126)

Nac-Gal

Gal

S

2-3

1-3S2-6

TecnologiaTecnologia do DNA do DNA recombinanterecombinante

9 Empregada, entre outrascoisas, para expressarprotenas humanas de interesse mdico-farmacutico em diferenteshospedeiros, tais comomicrorganismos e clulasanimais

9 Permite a produo destasprotenas em larga escala

HibridomasHibridomas e e anticorposanticorposmonoclonaismonoclonais

9 Hibridomas (Khler e Milstein, 1975):z clulas hbridas: fuso de mielomas, linfcitos tumorais de

crescimento infinito que perderam a capacidade de produziranticorpos, com linfcitos B normais, extrados do bao (de roedores) que, antes da fuso, tm vida em cultura in vitrolimitada

9 Anticorpos monoclonais (AMs):z derivados de 1 nico clone, com especificidade nica ao seu

alvo, menor risco de reaes adversasz normalmente murinos:

dificuldades de obteno de AMs humanos devido instabilidade de mielomas humanos e dificuldade de imunizar voluntrios humanospara muitos imungenos

risco de resposta HAMA (human anti-mouse antibody) reduo da HAMA atravs da humanizao de

AMs murinos

TecnologiaTecnologia de de hibridomashibridomas((anticorposanticorpos monoclonaismonoclonais))

AnticorposAnticorpos monoclonaismonoclonaisquimquimricosricos e e humanizadoshumanizados

~30% murino

5 a 10% murino

Fonte: Maranho e Brgido (2001)

CClulaslulas animaisanimais -- HistHistricoricoAno Evento

1949 Crescimento de vrus em cultivo de clulas (Enders e col.)

1954 Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cl. rim de macaco)

1955 Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cl. rim de macaco)

1963 Vacina contra o sarampo (clulas de embrio de galinha)

1964-69 Vacinas contra raiva, caxumba e rubola (cl. WI-38)

1975 Produo de anticorpos monoclonais (Khler e Milstein)

1979 Primeira linhagem de clula recombinante

1980 Ampliao para escala de produo de 8.000 L (vac. febre aftosa)

1981 Primeiro kit diagnstico com anticorpo monoclonal

1982 1 frmaco oriundo da tecnologia do rDNA (insulina; microrganismo)

1986 1 biofrmaco produzido em clulas animais (CHO): t-PA recombin.

1986 1 AM de uso teraputico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.)

desde Testes clnicos e aprovao de diversos produts oriundos da1990 tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas

(fatores sanguneos VIII e IX, AMs, interferon, EPO)

LinhagensLinhagens celularescelulares comumentecomumenteempregadasempregadas

Linhagem Tecido de origem Aplicaes

CHO Ovrio de hamster chins Prot. recombinantes

BHK-21 Rim de filhote de hamster Vacinas veterinrias

Prot. recombinantes

Vero Rim de macaco verde africano Vacinas p/ humanos

HeLa Tumor humano Estudos

HEK-293 Rim de embrio humano Terapia gnica

Estudos

ProduProduoo de de proteprotenasnas recombinantesrecombinantesemem cclulaslulas animaisanimais

9Sistema de expresso preferido para a produo de protenas recombinantes de uso teraputico:

z secretam a protena no meio de cultivo facilidade de purificao

z modificaes ps-traducionais carboxilao, hidroxilao, sulfatao, fosforilao e

especialmente a glicosilao

conferem atividade biolgica e estabilidade

sua ausncia pode causar problemas de imunogenicidade

CHO.K1 BHK-21

GlicosilaGlicosilaoo

9 Em glicoprotenas, a glicosilao influi fortemente sobre a atividade biolgica da protena, a sua eficcia in vivo e o seu perfil teraputico

9 Bactrias no glicosilam, leveduras tm padres distintos de glicosilao

9 Nenhum sistema heterlogo de expresso realiza a glicosilao de modo absolutamente idntico ao da fonte original da protena

9 Clula hospedeira mais usada: clulas CHO (Chinese hamster ovary cells)z padro de glicosilao adequadoz baixa susceptibilidade a vrus que afetam humanos

ExemplosExemplos de de proteprotenasnas jj aprovadasaprovadasProduto Indicao Clula Aprov.

Avonex (-interferon) esclerose mltipla CHO 1996Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997

Epogen (EPO) anemia CHO 1989

TNKase (t-PA) doenas cardacas CHO 2000

Herceptin/Trastuzumab (AM) cncer de seio CHO 1998

Refacto (fator de coagulao) hemofilia A CHO 2000

Prosta Scint (AM diagnstico in vivo) cncer de prstata n.d. 1996Simulect/Basixilimab (AM) rejeio a mieloma

transplante de rim de rato1998

Campath (AM) leucemia CHO 2001

Avastin/Bevacizumab (AM) cncer colorretal CHO 2004

Xolair/Omalizumab (AM) asma CHO 2003

Soliris/Eculizumab (AM) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007

AspectosAspectos de de mercadomercado

Mercado Mercado biofarmacuticobiofarmacutico mundialmundial

(~10-15% das vendas mundiais da indstria farmacutica)

Worldwide revenues of $41.3 billion2002 Canada

4%

Asia/Pacific3%

U.S.73%

Europe20%

Mercado Mercado biofarmacuticobiofarmacutico mundialmundial

*estimadoem 2000

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45S

a

l

e

s

(

b

i

l

l

i

o

n

U

S

D

)

andere (1500 Firmen)Top 4 - 10Top 3

andere (1500 Firmen) 2 2.5 3 2.5 5 12 9Top 4 - 10 1.5 2 2 3.5 4 10 17Top 3 4.5 4.5 5 6 7 16 15

1996 1997 1998 1999 2000 2005* 2002 IST

V

e

n

d

a

s

(

1

0

9

U

S

$

)

Outros .

Outros .

Os dez biofOs dez biofrmacos rmacos mais vendidos no mundo (Top 10)mais vendidos no mundo (Top 10)

Nome comercial Empresa Produto

Erypo/Procrit Amgen Eritropoetina Epogen Amgen Eritropoetina Remicade Centocor AM InfliximabNeupogen Amgen G-CSFMabThera/Rituxan Genentech AM RituximabAvonex Biogen Interferon--1aEnbrel Amgen TNF--ReceptorViraferon Schering-Plough Interferon--2bBetaferon Chiron Interferon--1bHumalog Eli Lilly Insulina

Dados de 2002

AprovaAprovaoo de de produtosprodutosbiotecnolbiotecnolgicosgicos

9 Atualmente, ~30% dos produtos aprovados so de origembiotecnolgica

9 Em 2010, este nmero deve chegar a 50%

0

5

10

15

20

25

30

35

94-95 96-97 98-99 00-01 02-03

Ano

F

r

a

o

d

e

p

r

o

d

u

t

o

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a

p

r

o

v

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q

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b

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o

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m

a

c

o

s

(

%

)

Fonte: Pharma Projects (2003)

TiposTipos de de produtosprodutos aprovadosaprovados nosnosltimosltimos anosanos

9Produtos biotecnolgicos aprovados em 2004 (UE e EUA)

z 12 produtos

z ~60% produzidos em clulas animais

z anticorpos monoclonais: 50%

z 1 oligonucleotdeo sinttico

ProdutosProdutos aprovadosaprovados e e ememdesenvolvimentodesenvolvimento

1

Fonte: Walsh (2003)

ProdutosProdutos emem desenvolvimentodesenvolvimento clclniconicoporpor tipotipo de de molmolculacula

Total: ~370

Fonte: Walsh (2003)

Desenvolvimento de anticorpos Desenvolvimento de anticorpos monoclonais teraputicosmonoclonais teraputicos

Probabilidade de aprovao de anticorpos monoclonaisTarget

ValidationLead

CompoundPreclinic

29%Phase I

23%Phase II

53%Phase III

55%Registration

95%

0 100 200 300

Preclinic

Phase I

Phase II

Phase III

MAb Murine Chimar Human Other

0100020003000400050006000700080009000

1995

1996

1997

1998

1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005

Vendas de monoclonais teraputicos (em milhes de US$)

Monoclonais teraputicos em desenvolvimento (2002)

Fonte: Pharma Projects (2003)

Mercado Mercado brasileirobrasileiro

9Produtos de elevado valor agregado:z princpios ativos importados em sua totalidadez incio da produo em 2009/2010: EPO e IFN na Fiocruz

9Altos gastos do Ministrio da Sade:z medicamentos excepcionais (EPO, G-CSF, interferons, etc)z fatores de coagulao sangunea

17,80727,059

48,88839,581

47,125

81,36388,284

010,00020,00030,00040,00050,00060,00070,00080,00090,000

Mil R$

1

9

9

5

1

9

9

6

1

9

9

7

1

9

9

8

1

9

9

9

2

0

0

0

2

0

0

1

Gastos do Governo Federal apenas com eritropoetina (EPO):


Jornal do Brasil, 13/03/2004

Jornal do Brasil, 27/07/2004


Jornal do Brasil - 05/04/2003

Jornal do Brasil - 10/04/2004G-CSF, GM-CSF, EPO, monoclonais

Grande Grande demandademanda porpor um AM um AM antianti--cncercncer jj aoao longolongo de de seuseu

ciclociclo de de desenvolvimentodesenvolvimento

1

10

100

1000

10000

100000

Pr-Clnica Fase I/II Fase II/III Comercial I Comercial II

Fase do desenvolvimento

D

e

m

a

n

d

a

(

g

)

Como Como produzirproduzir emem grandesgrandesquantidadesquantidades??

1

10

100

1000

100 1000 10000 100000

Volume do(s) biorreator(es) (L)

P

r

o

d

u

o

a

n

u

a

l

(

k

g

)

10 mg/L/dia

30

50

100

300

500

t*V*adeprodutividanual.prod biorreat=

Como Como aumentaraumentar a a produtividadeprodutividade??

9Otimizao do meio de cultivo

9Engenharia metablica

9Otimizao da expresso de protenas

9Otimizao de biorreatores

9Otimizao do modo de operaode biorreatoresz processos em perfuso

9Otimizao das etapas de recuperao e purificao

Engenharia de cultivos celulares!

Patentes expirando: inovao tecnolgica

Engenharia de Cultivos Celulares para a Produo de BiofrmacosIntroduoBiotecnologiaProcessos biotecnolgicos Biologia x BiotecnologiaEstrutura geral de um bioprocessoEstrutura geral de um bioprocessoEstrutura geral de um bioprocessoSntese qumica x biossnteseProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicosProdutos biotecnolgicos aplicados rea da sadePrincipais reas de aplicao de produtos biotecnolgicos aplicados rea da sadeAplicaes do cultivo de clulas animais in vitroProtenas teraputicasProtenas teraputicasO exemplo do Fator IX humanoO exemplo da EPO recombinanteTecnologia do DNA recombinanteHibridomas e anticorpos monoclonaisTecnologia de hibridomas(anticorpos monoclonais)Clulas animais - HistricoLinhagens celulares comumente empregadasProduo de protenas recombinantes em clulas animaisGlicosilaoExemplos de protenas j aprovadasAspectos de mercadoMercado biofarmacutico mundialMercado biofarmacutico mundialAprovao de produtos biotecnolgicosTipos de produtos aprovados nos ltimos anosProdutos aprovados e em desenvolvimentoProdutos em desenvolvimento clnico por tipo de molculaMercado brasileiroMercado brasileiroMercado brasileiroGrande demanda por um AM anti-cncer j ao longo de seu ciclo de desenvolvimentoComo produzir em grandes quantidades?Como aumentar a produtividade?

bio aula01

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