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  • BICHO-MINEIRO DO CAFEEIRO: ANLISE DA DIGESTO E INIBIO DE TRIPSINA

    POR EXTRATOS DE FOLHAS DE MAMONA

    GUILHERME DUARTE ROSSI

    2007

  • GUILHERME DUARTE ROSSI

    BICHO-MINEIRO DO CAFEEIRO: ANLISE DA DIGESTO E INIBIO DE TRIPSINA POR EXTRATOS DE FOLHAS DE MAMONA

    Dissertao apresentada Universidade Federal de Lavras, como parte das exigncias do Curso de Mestrado em Agronomia, rea de concentrao em Agroqumica e Agrobioqumica, para obteno do ttulo de Mestre.

    Orientador Prof. Dr. Custdio Donizete dos Santos

    LAVRAS MINAS GERAIS - BRASIL

    2007

  • GUILHERME DUARTE ROSSI

    BICHO-MINEIRO DO CAFEEIRO: ANLISE DA DIGESTO E INIBIO DE TRIPSINA POR EXTRATOS DE FOLHAS DE MAMONA

    Dissertao apresentada Universidade Federal de Lavras, como parte das exigncias do Curso de Mestrado em Agronomia, rea de concentrao em Agroqumica e Agrobioqumica, para obteno do ttulo de Mestre.

    APROVADA em 16 de fevereiro de 2007.

    Dra. Celeste Maria Patto de Abreu DQI-UFLA

    Dr. Geraldo Andrade de Carvalho DEN-UFLA

    Prof. Dr. Custdio Donizete dos Santos DQI - UFLA (Orientador)

    LAVRAS

    MINAS GERAIS - BRASIL 2007

  • Ficha Catalogrfica Preparada pela Diviso de Processos Tcnicos da

    Biblioteca Central da UFLA

    Rossi, Guilherme Duarte Bicho-mineiro do cafeeiro: Anlise da digesto e inibio de tripsina por extratos de folhas de mamona / Guilherme Duarte Rossi. -- Lavras : UFLA, 2007.

    74 p. : il.

    Orientador: Custdio Donizete dos Santos. Dissertao (Mestrado) UFLA. Bibliografia.

    1. Caf. 2. Bicho-mineiro. 3. Inibio de tripsina. I. Universidade

    Federal de Lavras. II. Ttulo.

    CDD-633.739

  • AGRADECIMENTOS Agradeo ao professor Custdio Donizete dos Santos pela orientao e pela bela amizade cultivada durante vrios anos. Ao meu amigo Jos Renato de Abreu pela longa e bela caminhada na qual sempre estivemos juntos. Ao Departamento de Qumica e ao Laboratrio de Bioqumica da UFLA, em especial Xulita, por estar sempre disponvel e ser um belo exemplo de dedicao. Aos meus amigos da Repblica Playboy (todas as geraes), pela convivncia, diverso e aprendizado. Aos meus amigos de todas as outras repblicas nas quais eu morei ou freqentei, sempre sendo muito bem recebido. professora Celeste Maria Patto de Abreu por sempre me guiar ao caminho correto e por sua amizade. Ao meu amigo Gustavo Akira Habe, uma pessoa extremamente inspiradora. Aos demais professores, alunos de ps-graduao e funcionrios que colaboraram com a elaborao desta dissertao, entre eles: Maria das Graas Cardoso, Angelita Duarte Corra, Mrio Csar Guerreiro, Luciano Vilela Paiva, Geraldo Andrade Carvalho, Jair Campos de Moraes, Marasa, Miriam, Julinho, Anderson e Anderson. Aos meus pais e irmos. Ao CNpQ, pela concesso da bolsa de estudos durante o mestrado.

  • SUMRIO

    Pgina LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS......................................... i

    RESUMO GERAL.................................................................................................... ii

    GENERAL ABSTRACT........................................................................................... iii

    1 INTRODUO GERAL........................................................................................ 1

    2 REFERENCIAL TERICO................................................................................... 3

    2.1 Cafeicultura.......................................................................................................... 3

    2.2 Bicho-mineiro...................................................................................................... 3

    2.3 Controle do bicho-mineiro................................................................................... 6

    2.3.1 Controle biolgico............................................................................................ 6

    2.3.1.1 Predadores...................................................................................................... 6

    2.3.1.2 Parasitides.................................................................................................... 7

    2.3.1.3 Patgenos....................................................................................................... 8

    2.3.2 Controle qumico.............................................................................................. 8

    2.4 Manejo integrado de pragas (MIP)...................................................................... 10

    2.5 Digesto dos insetos............................................................................................ 10

    2.6 Organizao do intestino dos insetos................................................................... 12

    2.6.1 Intestino anterior............................................................................................... 13

    2.6.2 Intestino mdio................................................................................................. 14

    2.6.3 Intestino posterior ............................................................................................ 14

    2.7 Dietas dos insetos................................................................................................ 15

    2.8 Consequncias de uma dieta deficiente............................................................... 16

    2.9 Enzimas digestivas dos insetos............................................................................ 18

    2.9.1 Peptidases......................................................................................................... 18

    2.9.2 Glicosidases...................................................................................................... 20

    2.9.3 Esterases, lipases e fosfolipases........................................................................ 22

    2.9.4 Outras enzimas digestivas................................................................................. 22

    2.10 Inibio enzimtica............................................................................................ 23

    2.11 Purificao de molculas................................................................................... 23

  • 2.11.1 Purificao de protenas.................................................................................. 24

    2.11.2 Purificao de molculas no-proticas.......................................................... 25

    2.11.3 Cromatografia de adsoro............................................................................. 26

    3 OBJETIVOS........................................................................................................... 27

    4 RESULTADOS...................................................................................................... 27

    CAPTULO I: ENZIMAS DIGESTIVAS DO BICHO-MINEIRO DO

    CAFEEIRO................................................................................................................

    28

    CAPTULO II: INIBIO DA TRIPSINA DO BICHO-MINEIRO DO

    CAFEEIRO E PURIFICAO DO INIBIDOR PRESENTE EM EXTRATOS

    DE FOLHAS DE MAMONA...................................................................................

    50

    5 CONCLUSES GERAIS....................................................................................... 69

    6 PERSPECTIVAS.................................................................................................... 69

    7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................... 70

  • i

    LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS : Alfa : Beta : Micro BapNA: (D-L) Benzoil-arginina-para-nitroanilida CEPEA: Centro de Estudos Avanados em Economia Aplicada cm2: Centmetro quadrado g: Acelerao da gravidade ESALQ: Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz g: Grama HCl: cido clordrico ITU: Inhibited trypsin unit kg: Quilograma L: Litro LpNA: (L)Leucina-para-nitroanilida M/z: Massa/carga mA: Miliamper mg: Miligrama mL: Mililitro mm: Milmetro mmol: Milimol NaOH: Hidrxido de sdio nm: Nanmetros P.A.: Puro para anlise p-: Para pH: Potencial hidrogeninico psi: Libras por polegada quadrada (pound per square inch) rpm: Rotaes por minuto TRIS: Tri-hidroximetilaminometano U: Micromol de substrato hidrolisado por minuto UTI: Unidade de tripsina inibida UV/H2O2: Ultra-violeta/Perxido de hidrognio

  • ii

    RESUMO ROSSI, Guilherme Duarte. Bicho-mineiro do cafeeiro: Anlise da digesto e inibio de tripsina por extratos de folhas de mamona. 2007. 74 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.

    O caf uma cultura de grande importncia social e econmica para o Brasil e sua produo afetada por diversas pragas e doenas. Uma dessas pragas o bicho-mineiro do cafeeiro Leucoptera coffeella (Gurin-Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae), que pode provocar grandes perdas na produo. As formas de controle do bicho-mineiro do cafeeiro conhecidas e utilizadas atualmente apresentam diversos inconvenientes, o que motiva a procura por novas formas de controle desse inseto. Um possvel ponto de ataque s pragas visando ao seu controle o uso de agentes inibidores de enzimas digestivas participantes da digesto primria. Os testes de inibio da tripsina foram escolhidos pelo fato de essa enzima participar da digesto primria de protenas e seu mau funcionamento resultar na reduo de aminocidos disponveis para o inseto. Utilizaram-se extratos de folhas de mamona, pois estudos preliminares com Erinnyis ello (Linneaus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) mostraram a presena de um inibidor de tripsina em folhas de mamona. Objetivou-se com este trabalho estudar as enzimas digestivas do bicho-mineiro do cafeeiro e analisar a inibio de sua tripsina utilizando extratos de folhas de mamona. O experimento foi conduzido em Lavras-MG e analisaram-se as enzimas -glicosidase (13,7 + 3,4 U/g de inseto; pH timo = 6,0), amilase (2,2 + 0,11 U/g de inseto; pH timo = 10,0), aminopeptidase (6,8 + 0,86 U/g de inseto; pH timo = 8,3), -glicosidase (0,38 + 0,16 U/g de inseto; pH timo = 6,0), fosfatase cida (0,79 + 0,19 U/g de inseto; pH timo = 5,5), sacarase (6,7 + 0,78 U/g de inseto; pH timo = 6,5), trealase (2,2 + 0,43 U/g de inseto; pH timo = 6,0) e tripsina (0,70 + 0,2 U/g de inseto; pH timo = 9,7). Pela anlise dos pHs timos das enzimas, infere-se que o ambiente digestivo do bicho-mineiro do cafeeiro muito semelhante ao dos demais lepidpteros. Pelos testes de inibio da atividade de tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro, verificou-se uma inibio de aproximadamente 2,12 UTI/g de folhas frescas de mamona. Os procedimentos de purificao e os tratamentos de fervura e fervura mais adio de -mercaptoetanol no extrato de folhas de mamona mostraram que o inibidor uma molcula no-protica e termorresistente, que foi purificada por cromatografia de adsoro (slica gel 60) e analisado por espectrometria de massas. _________________ Comit Orientador: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Orientador), Dra. Maria das Graas Cardoso - UFLA e Dra. Angelita Duarte Corra - UFLA

  • iii

    ABSTRACT ROSSI, Guilherme Duarte. Coffee leaf miner: Digestion and trypsin inhibition using castor beam leaves extracts. 2007. 74 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Federal University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil. Coffee is a crop of great social and economic importance to Brazil and its production is affected by a number of pests and diseases. One of those pests is the coffee leaf miner, Leucoptera coffeella (Gurin-Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) which can cause great losses in production. The forms of controlling the coffee leaf miner known and utilized at present show several troubles, which motivates the search for new forms of control of this insect. A possible point of attack to the pests aiming at their control is the use of digestive enzyme-inhibiting agents which take part in the primary digestion. The tests of inhibiting trypsin were chosen by this enzyme taking part in the primary digestion of proteins and their poor functioning resulting into the reduction of aminoacids available to the insect. Castor bean leaf extracts were utilized, since previous studies on cassava hornworm - Erinnyis ello (Linneaus, 1758) (Lepidoptera: Sphingidae) showed the presence of a trypsin inhibitor in castor bean leaves. The objective of this work was to study the digestive enzymes of the coffee leaf miner and investigate the inhibition of its trypsin by utilizing castor bean leaf extracts. The experiment was conducted in Lavras-MG and the enzymes -glucosidase (13.7 + 3.4 U/g of insect; optimum pH = 6.0), amylase (2.2 + 0.11 U/g of insect; optimum pH = 10.0), aminopeptidase (6.8 + 0.86 U/g of insect; optimum pH = 8.3), -glucosidase (0.38 + 0.16 U/g of insect; optimum pH = 6.0), acidic phosphatase (0.79 + 0.19 U/g of insect; optimum pH = 5.5), saccharase (6.7 + 0.78 U/g of insect; optimum pH = 6.5), trehalase (2.2 + 0.43 U/g of insect; optimum pH = 6.0) and trypsin (0.70 + 0.2 U/g of insect; optimum pH = 9.7). The analysis of the optimum pHs of enzymes could suggest that the digestive environment of the coffee leaf miner is highly similar to the one of the other lepidopterans. The tests of inhibition of the coffee leaf miner trypsin activity indicated an inhibition of about 2.12 UTI/g of fresh castor bean leaves. The purification procedures and the treatments of boiling and boiling plus addition of -mercaptoethanol in the castor bean leaf extract showed that the inhibitor is a non-protein molecule and heat-resistant which was purified by adsorption chromatography (silica gel 60) and analyzed by mass spectrometry. _________________ Guidance Committee: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Adviser), Dr. Maria das Graas Cardoso - UFLA and Dr. Angelita Duarte Corra - UFLA

  • 1

    1 INTRODUO GERAL

    A cafeicultura uma atividade agrcola de grande importncia

    econmica para o Brasil. Porm, adversidades como pragas e doenas

    constantemente assolam o produtor rural, que, de alguma forma, deve recorrer a

    solues oferecidas por profissionais competentes. No caso da cafeicultura,

    observa-se a incidncia do bicho-mineiro do cafeeiro (Gurin-Mneville, 1842)

    (Lepidoptera: Lyonetiidae), praga-chave dessa cultura, que implica em perdas na

    produtividade e no aumento do custo de produo, para que seu controle seja

    realizado.

    Para que as perdas causadas pelo bicho-mineiro do cafeeiro sejam

    reduzidas, o produtor deve recorrer s formas de controle disponveis,

    utilizando-se de tcnicas de controle cultural, de controle biolgico e de controle

    qumico. Porm, entre as modalidades de controle, nem sempre se observa

    disponibilidade de recursos, como cultivares resistentes, eficincia do controle

    biolgico ou segurana no uso do controle qumico.

    Dessa forma, mtodos de controle alternativos que visem segurana

    ambiental e alta eficcia contra as pragas devem ser continuamente pesquisados,

    para que se possa desenvolver uma atividade agrcola economicamente vivel e

    ambientalmente segura.

    Uma forma de controle adotada visando ao controle de pragas consiste

    na incorporao de inibidores de enzimas digestivas participantes da digesto

    primria (despolimerases), entre os quais se destacam atualmente os inibidores

    de amilase e tripsina. Esses inibidores so ingeridos juntamente com o alimento

    e, quando em contato com as enzimas digestivas do inseto-praga, evitam que as

    enzimas em questo atuem corretamente na hidrlise do substrato (alimento

    ingerido). O alimento, dessa forma, no devidamente processado e torna-se

    indisponvel para o metabolismo do inseto.

  • 2

    Com o uso de inibidores de proteases, a reduo do nvel populacional

    da praga em campo pode ser observada mediante o atraso da realizao de seu

    ciclo de vida ou diretamente pela morte do inseto (Lee et al., 1999, Mcmanus,

    1999 e Xu et al., 1996).

    Diante do exposto, objetivou-se estudar a digesto do bicho-mineiro do

    cafeeiro e, posteriormente, analisar a inibio de sua tripsina utilizando-se

    extratos de folhas de mamona.

  • 3

    2 REFERENCIAL TERICO

    2.1 Cafeicultura

    No contexto do mundo globalizado, a cafeicultura moderna contribui

    com o Brasil na gerao de divisas, ocupando posio de destaque na agricultura

    brasileira (Alves, 1991). O caf cultivado praticamente em todo o territrio

    nacional, constituindo-se numa grande fonte de empregos diretos e indiretos.

    Segundo o Agrianual (2006), a produo anual de caf no Brasil foi de

    36.642.750 de sacas (60 kg) (mdia dos anos de 2003 a 2006). Considerando o

    preo da saca em torno de R$ 252,03 (mdia dos anos de 2003 a 2005), o caf

    gerou, em mdia, R$ 9.235.072.282,00/ano, com sua comercializao (indicador

    CEPEA/ESALQ).

    Evidenciada a importncia social e econmica dessa cultura para o

    Brasil, vale salientar que sua produo limitada por alguns problemas

    fitossanitrios, como a ferrugem-do-cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia

    vastatrix, a broca-do-caf Hypothenemus hampei (Ferrari, 1867) (Coleoptera:

    Scolytidae) e o bicho-mineiro do cafeeiro Leucoptera coffeella (Gurin-

    Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) (Fragoso, 2000).

    O foco deste estudo foi o bicho-mineiro do cafeeiro, considerando

    principalmente que, em pesquisas conduzidas na regio Sul de Minas Gerais

    demonstrou-se que o ataque dessa praga na poca de florao do cafeeiro pode

    causar reduo de mais de 50% na produo, devido ao desfolhamento (Moraes,

    1997).

    2.2 Bicho-mineiro do cafeeiro

    O bicho-mineiro do cafeeiro uma praga extica e sua primeira

    ocorrncia no Brasil foi constatada em 1851, provavelmente introduzido pelas

    mudas advindas das Antilhas e da Ilha Bourbon. As primeiras referncias de

  • 4

    bicho-mineiro do cafeeiro como praga no Brasil datam de 1860-61, poca da

    exploso populacional dessa praga nos cafezais do Rio de Janeiro, Minas Gerais

    e So Paulo (Mann, 1872; Fonseca, 1944 e Green, 1984 citados por Fragoso,

    2000).

    Desde 1970, o bicho-mineiro do cafeeiro apresenta-se por meio de

    ataques intensos e severos, constituindo-se at hoje como umas das pragas mais

    srias para a cultura do caf nas principais regies produtoras do pas (Speer,

    1949; Souza et al., 1981; Instituto Brasileiro do Caf, 1986; Souza et al., 1998

    citados por Fragoso, 2000). uma praga monfaga e, por isso, s ataca o

    cafeeiro (Souza et al., 1998).

    O adulto do bicho-mineiro do cafeeiro uma mariposa de 6,5 mm de

    envergadura, com as asas brancas que apresentam uma mancha escura em cada

    ponta. A micromariposa abriga-se durante o dia na superfcie abaxial das folhas

    do cafeeiro e, ao anoitecer, abandona o esconderijo, iniciando a oviposio. Os

    ovos so colocados na superfcie adaxial das folhas, numa mdia de sete a oito

    ovos/noite, em pontos isolados da mesma folha ou em diferentes folhas. So

    achatados, brancos, com cerca de 0,3 mm de comprimento, sendo a sua casca

    (crion) de aspecto transparente e permanece aderida folha. Uma fmea,

    durante sua vida, capaz de colocar mais de 50 ovos, com um perodo

    embrionrio que varia de 5 a 21 dias, dependendo das condies de temperatura

    e umidade (Moraes, 1997).

    Logo aps a ecloso, as lagartas penetram no interior da folha,

    permanecendo entre as duas epidermes e alimentando-se do parnquima foliar.

    As reas atacadas vo secando e aumentando de tamanho medida que as

    lagartas vo se desenvolvendo. A pelcula superior do tecido seco facilmente

    destacvel e essa injria conhecida como mina (Moraes, 1997).

  • 5

    Em alguns casos, pode-se encontrar mais de uma lagarta por mina. A

    presena de mais de uma lagarta em uma mesma leso deve-se coalescncia de

    leses (Souza et al., 1998).

    A durao da fase jovem oscila entre 9 e 40 dias. Quando as lagartas

    esto completamente desenvolvidas (com cerca de 6 mm de comprimento),

    abandonam a folha pela superfcie adaxial da mina, tecem um fio de seda e

    descem at as folhas prximas da saia do cafeeiro. Geralmente, na superfcie

    abaxial da folha, as lagartas tecem um casulo de colorao branca e com formato

    caracterstico de X, onde passam para a fase de pupa com durao de 5 a 26

    dias. Aps esse perodo, emergem as micromariposas na proporo de 1 macho:

    1 fmea, cuja longevidade mdia de 15 dias.

    O ciclo evolutivo varia de 19 a 87 dias, principalmente em funo de

    temperatura e, em condies normais, podem ocorrer 8 a 12 geraes/ano.

    Clima seco e/ou manipulao ambiental, que proporcionem condies

    microclimticas de baixa umidade relativa no cafezal, favorece a ocorrncia

    desse inseto-praga. J se constataram infestaes significativamente maiores

    desse inseto em plantas de caf cultivadas sob severo dficit hdrico, estando de

    acordo com a afirmao de que o bicho-mineiro do cafeeiro tem sua atuao

    favorecida pelo perodo seco. Dessa forma, a abertura de novas fronteiras em

    reas de cerrado para o cultivo do cafeeiro, a partir de meados de 1970,

    favoreceu a ocorrncia contnua desse inseto, mesmo durante a poca das chuvas

    (Moraes, 1997).

    O bicho-mineiro do cafeeiro afeta a produtividade e longevidade do

    cafeeiro, devido ao consumo do parnquima palidico, causando necrose foliar,

    reduo da rea fotossinttica e desfolhamento (Souza et al., 1998). Os sintomas

    so mais visveis na parte superior da planta, ocorrendo intenso desfolhamento

    quando a infestao grave. A desfolha acentuada prxima ao perodo de

    florao muito prejudicial produo, em razo do baixo vingamento de frutos

  • 6

    e do baixo rendimento (frutos grandes, porm, com maior volume de casca)

    (Moraes, 1997).

    2.3 Controle do bicho-mineiro do cafeeiro

    A seguir, so apresentadas algumas formas de controle do bicho-mineiro

    do cafeeiro. Todas as formas apresentadas possuem vantagens e desvantagens, o

    que justifica novos estudos que visem obteno de uma planta resistente

    praga ou outras formas de controle alternativas.

    2.3.1 Controle biolgico

    Aps a constatao cada vez maior da praga, muitos trabalhos de

    controle foram realizados, principalmente com produtos qumicos. Entretanto,

    durante a realizao desses trabalhos, observaes paralelas foram realizadas,

    verificando-se a ocorrncia de controle biolgico natural utilizando predadores,

    parasitides e patgenos (Reis & Souza, 1986).

    2.3.1.1 Predadores

    Entre os agentes que promovem o controle biolgico, os predadores

    podem ser considerados os mais eficientes, pois necessitam predar mais de um

    indivduo para sua sobrevivncia e tornam-se, assim, grandes inimigos naturais.

    Para o bicho-mineiro, j foram identificados diversos predadores, todos

    da ordem Hymenoptera e da famlia Vespidae - Brachygastra augusti

    (Epiponini) (Hymenoptera: Vespidae), Protonectarina sylveirae (Saussure)

    (Hymenoptera: Vespidae), Brachygastra lecheguana (Latreille, 1824)

    (Hymenoptera: Vespidae), Polybia scutellaris (Write, 1841) (Hymenoptera:

    Vespidae), Synoeca surinama cyanea (Linnaeus) (Hymenoptera: Vespidae) e

    Eumenes sp).

  • 7

    As vespas predadoras do bicho-mineiro predam tambm as lagartas de

    outros insetos e a poca de ocorrncia depende da abundncia de presas, sendo

    esse um dos motivos pelos quais no se recomenda o uso indiscriminado de

    defensivos, principalmente no vero, que a poca de maior atividade dos

    insetos. A preservao de ninhos de vespas em vegetao prxima aos cafezais

    muito importante para o sucesso do controle biolgico do bicho-mineiro (Reis &

    Souza, 1986).

    A eficincia dos predadores no controle do bicho-mineiro de cerca de

    69% (Souza, 1979; Souza et al., 1980 citados por Reis & Souza, 1986), e a

    constatao desse fato pode ser feita observando-se folhas minadas que, aps

    haver a predao, tm a epiderme superior e/ou inferior, correspondente rea

    da leso, totalmente dilacerada. Essas dilaceraes so realizadas pela vespa

    para retirar a lagarta que lhe serve de alimento.

    O controle por meio de predadores ainda obtido somente em condies

    naturais, porm j se conseguiu, por meio de trabalhos experimentais, transferir

    ninhos de vespas para locais prximos a cafezais com pleno sucesso, o que

    garante a instalao dessa modalidade mesmo em locais onde que no existem

    vespas em condies naturais (Reis & Souza, 1986).

    2.3.1.2 Parasitides

    Apesar de os parasitides serem timos aliados do homem no controle

    do bicho-mineiro, a eficincia deles bem menor que a dos predadores, tendo

    sido j constatado cerca de 16% a 30% de parasitismo sobre essa praga (Gallo et

    al., 2002).

    O bicho-mineiro parasitado na fase de lagarta, sendo que as fmeas dos

    parasitides detectam com suas antenas as lagartas dentro da leso para

    efetuarem a postura.

  • 8

    Os parasitides do bicho-mineiro do cafeeiro so microhimenpteros,

    pertencentes a vrias famlias que, devido ao seu diminuto tamanho, passam

    despercebidos pelos cafeicultores (Reis & Souza, 1986).

    Da mesma forma que os predadores, o controle feito utilizando

    parasitides em condies naturais tambm no isoladamente suficiente e

    devem-se utilizar outros recursos para efetuar o controle da praga,

    principalmente na poca de pico populacional.

    2.3.1.3 Patgenos

    Dos agentes de controle biolgico do bicho-mineiro, os patgenos ou

    microorganismos entomopatognicos so os menos conhecidos e menos

    empregados no controle do bicho-mineiro do cafeeiro. Sabe-se, entretanto, de

    sua existncia e do potencial que possuem para o controle da praga (Reis &

    Souza, 1986).

    Citados por Reis & Souza (1986), Robbs et al. (1976) relataram a

    presena de bactrias e fungos em lagartas mortas do bicho-mineiro do cafeeiro.

    As bactrias Erwinia herbicola e Pseudomonas aeruginosa so apontadas como

    os microrganismos mais eficientes no controle de lagartas do bicho-mineiro.

    2.3.2 Controle Qumico

    O nvel de controle do bicho-mineiro do cafeeiro para utilizao de

    inseticidas em pulverizao (carbamatos, fosforados e piretrides) varia de

    acordo com a poca de ocorrncia. Assim, em locais onde o ataque ocorrer no

    perodo seco (julho a agosto), o controle dever ser iniciado quando forem

    encontradas 40 folhas com lagartas vivas, num total de 100 folhas amostradas.

    Nas regies em que o ataque ocorrer no perodo chuvoso (dezembro, janeiro e

    fevereiro), esse nvel ser de 20% (Gallo et al., 2002).

  • 9

    No deve ser feita aplicao indiscriminada de inseticidas em

    pulverizao, pois podero ocorrer desequilbrios biolgicos devido

    eliminao de inimigos naturais, causando exploses populacionais da praga ou

    surtos indesejveis de lagartas que, normalmente, so controladas

    biologicamente por parasitides encontrados em abundncia nas lavouras.

    Quando se usam constantemente inseticidas em pulverizao, principalmente

    piretrides, alm de eliminar os parasitides, esse grupo de inseticidas pode

    causar desequilbrios populacionais em favor do caro vermelho. O controle

    qumico deve ser feito somente nos talhes ou parte dos talhes mais infestados,

    a fim de auxiliar na preservao dos inimigos naturais (Reis & Souza, 1986). As

    aplicaes devem ser repetidas a cada 5/6 meses e deve ser respeitado um

    perodo de carncia de 90 dias, evitando-se culturas intercalares (Gallo et al.,

    2002).

    O uso de granulados sistmicos feito de maneira preventiva e

    recomendado em regies cujo clima seja favorvel ao bicho-mineiro. Os

    inseticidas sistmicos granulados devem ser aplicados no perodo chuvoso (no

    incio ou final), pois esses dependem da umidade do solo para atuar (Gallo et al.,

    2002) e apresentam perodo residual de 110 a 160 dias, dependendo da natureza

    dos produtos recomendados (Souza et al., 1998). Esses inseticidas devem ser

    aplicados no solo com incorporao, evitando-se, assim, qualquer contaminao

    de guas pela eroso laminar, alm da morte de aves e de outros animais,

    inclusive o homem (Souza et al., 1998).

    O controle qumico a forma de controle do bicho-mineiro mais usada,

    porm, sua utilizao indiscriminada traz como conseqncias a seleo de

    pragas resistentes, desequilbrios ecolgicos e a contaminao do meio ambiente

    e do aplicador.

  • 10

    2.4 Manejo integrado de pragas (MIP)

    O manejo integrado de pragas, mais comumente chamado de MIP, uma

    tcnica que, por sua definio, compreende a utilizao dos mais variados

    mtodos de manejo, a fim de se controlar as pragas em agroecossistemas

    (Panizzi & Parra, 1991).

    Luckman & Metcalf (1982), citados por Panizzi & Parra (1991),

    destacaram que, para a implementao efetiva do MIP, necessrio que se

    entenda e se planeje a implantao e conduo da lavoura em questo, que se

    analise a questo custo/benefcio da implementao do MIP, que se conhea a

    tolerncia da cultura aos danos das pragas, que se determine a poca correta da

    utilizao dos inseticidas e, finalmente, que se eduquem as pessoas para

    entenderem e aceitarem o MIP. Esses autores referiram-se ainda a sete grandes

    categorias de mtodos de controle, com cerca de trinta tcnicas viveis de serem

    aplicadas em programas de MIP.

    Para a implantao de um programa de MIP, deve-se atentar para a

    necessidade da integrao das diferentes tcnicas disponveis ao usurio de

    forma harmnica e que rendam os melhores resultados tanto em nvel

    econmico como nos nveis ecolgico e social (Panizzi & Parra, 1991).

    2.5 Digesto dos insetos

    Os insetos, como todos os seres vivos heterotrficos, demandam energia

    para crescer e manter seu metabolismo mediante a oxidao (respirao celular)

    de molculas orgnicas. Tais molculas orgnicas so obtidas de diversas fontes

    de alimentos, o que classifica os insetos em fitfagos (alimentam-se de toda a

    planta ou de partes dela, tais como folhas, razes, flores, frutos, sementes, plen,

    etc), carnvoros (alimentam-se de animais inteiros ou parte deles, como sangue,

    plo ou penas) ou saprfagos, que se alimentam de material vegetal ou animal

    em decomposio ou esterco. Quanto ao nmero de fontes de alimentos, os

  • 11

    insetos so classificados em monfagos (cuja dieta restrita a apenas uma

    fonte), oligfagos (dieta restrita a fontes de uma mesma famlia) ou polfagos

    (dieta composta por fontes de alimento de vrias famlias) (Horn, 1978).

    Os insetos utilizam seu sistema digestivo para extrair nutrientes e outras

    substncias do alimento por eles consumido. A maior parte do alimento

    ingerida na forma de macromolculas e outras substncias complexas (como

    protenas, polissacardeos, gorduras, cidos nuclicos, etc.), as quais precisam

    ser quebradas por meio de reaes hidrolticas em molculas menores (como

    aminocidos, acares simples, etc.) antes de serem usadas pelas clulas do

    corpo para obteno de energia, crescimento ou reproduo. Esse processo de

    quebra denominado digesto (Meyer, 2006).

    A digesto entre os animais superiores ocorre usualmente em alguma

    cavidade do corpo sob a ao de enzimas secretadas (digesto luminal ou

    cavital) e/ou sob ao de enzimas ligadas membrana de clulas que recobrem a

    superfcie luminal do rgo onde se verifica a digesto (digesto em membrana).

    A digesto de polmeros, tais como polissacardeos e protenas, que

    correspondem a maior massa do alimento usualmente consumido pelos animais

    pode ser dividida em trs fases distintas: digesto primria, digesto

    intermediria e digesto final. A digesto primria consiste no ataque s ligaes

    internas dos polmeros por enzimas conhecidas como despolimerases (amilases e

    tripsinas por exemplo) normalmente secretadas, resultando em oligmeros. Na

    digesto intermediria, os oligmeros provenientes da digesto primria so

    hidrolisados at oligmeros de menor peso molecular pelas mesmas enzimas

    responsveis pela digesto primria e/ou por enzimas diferentes, geralmente

    tambm secretadas. Na digesto final, os oligmeros resultantes (mais

    freqentemente dmeros e trmeros) so hidrolisados at monmeros. Esse

    processo geralmente mediado por enzimas ligadas nas microvilosidases das

    clulas ou presas ao glicoclice, podendo agir tambm no lmen do intestino

  • 12

    mdio. Esse processo resulta em monmeros, que so prontamente disponveis

    para serem absorvidos e utilizados no metabolismo celular (Santos, 1985).

    As enzimas hidrolticas envolvidas na digesto primria e intermediria

    so usualmente secretadas por clulas presentes na parede do trato digestivo ou

    glndulas. A saliva em alguns animais tem a funo de apenas lubrificar o

    alimento, ao passo que em outros ela contm enzimas importantes na digesto

    (Santos, 1985).

    2.6 Organizao do intestino dos insetos

    Todos os insetos possuem um sistema digestivo complexo. Isso significa

    que o processamento do alimento ocorre por um tipo de tubo fechado, o canal

    alimentar, que atravessa o corpo do inseto longitudinalmente, a partir da boca at

    o nus. Os alimentos ingeridos normalmente atravessam o corpo em apenas uma

    direo (Meyer, 2006).

    FIGURA 1. Esquema do canal alimentar dos insetos (Meyer, 2006).

    Esse arranjo difere de um sistema incompleto de digesto (encontrado

    em certos invertebrados inferiores, como a hidra e a estrela-do-mar) em que se

    tem uma nica abertura que funciona como boca e nus e se liga a uma cavidade

    semelhante a uma bolsa. Muitos bilogos consideram o sistema digestivo

    completo como uma evoluo sobre o sistema digestivo incompleto, j que

    aquele apresenta a especializao funcional (Meyer, 2006).

  • 13

    A especializao funcional do sistema digestivo permite que diferentes

    partes desse sistema possam estar especialmente adaptadas para realizar vrias

    funes, como digesto do alimento, absoro de nutrientes e excreo. Na

    maioria dos insetos, o canal alimentar subdividido em trs regies funcionais:

    intestino anterior, intestino mdio e intestino posterior (Nation, 2002).

    2.6.1 Intestino anterior

    A boca de um inseto, localizada centralmente entre a base das peas

    bucais, uma vlvula muscular que indica a frente do pr-intestino. Na cavidade

    bucal, o alimento sugado da abertura bucal at a faringe mediante a contrao

    dos msculos cibariais. Esses msculos, localizados entre a cabea e a parede

    anterior da faringe, fazem a suco aumentando o volume da faringe. Esse

    mecanismo de suco chamado de bomba cibarial. Esse sistema mais

    desenvolvido em insetos com aparelho bucal picador/sugador.

    Da faringe, a comida passa pelo esfago atravs de peristaltismo

    (contrao muscular rtmica da parede do intestino). O esfago apenas um tubo

    que conecta a faringe ao papo, sendo esse um rgo de armazenamento de

    comida.

    A comida permanece no papo at que esta possa ser processada atravs

    das sees restantes do canal alimentar. No papo, alguma digesto pode ocorrer

    como resultado de enzimas salivares aderidas na cavidade bucal e/ou de outras

    enzimas regurgitadas do intestino mdio.

    Em alguns insetos, o papo se abre posteriormente em um proventrculo

    que contm dentculos que moem e pulverizam as partculas de comida. O

    proventrculo executa as mesmas funes da moela nas aves. A vlvula

    estomodeal, um msculo localizado logo atrs do proventrculo, regula o fluxo

    de comida do intestino anterior at o intestino mdio (Meyer, 2006).

  • 14

    2.6.2 Intestino mdio

    O intestino mdio inicia-se logo aps a vlvula estomodeal. Perto do seu

    final, projees no formato de dedos (normalmente de 2 a 10) divergem das

    paredes do intestino mdio. Essas estruturas, os cecos gstricos, proporcionam

    superfcie de contato extra para secreo de enzimas ou para a absoro de gua

    e outras substncias do canal alimentar. O restante do intestino mdio chamado

    de ventrculo local onde inicialmente ocorre a digesto enzimtica da comida e

    absoro de nutrientes. Clulas digestivas que revestem as paredes do ventrculo

    possuem projees microscpicas (microvilosidades) que aumentam a superfcie

    de contato para absoro de nutrientes (Meyer, 2006).

    No intestino mdio, ocorre a sntese das enzimas digestivas (Acevedo

    Jaramillo, 1997) e o local onde efetivamente ocorre a hidrlise das

    macromolculas.

    A parte posterior do intestino mdio marcada por outro msculo, a

    vlvula pilrica. Essa regula o fluxo de material do intestino mdio at o

    intestino posterior (Meyer, 2006).

    2.6.3 Intestino posterior

    Prximos vlvula pilrica esto presentes centenas de tbulos de

    Malpighi. Essas longas estruturas em formato de tbulos finos se estendem por

    quase toda cavidade abdominal e servem como rgos excretores, removendo

    resduos nitrogenados (principalmente ons amnio) da hemolinfa.

    O on amnio txico rapidamente convertido em uria e depois em

    cido rico mediante diversas reaes ocorridas nos tbulos de Malpighi. O

    cido rico (semi-slido) acumulado dentro de cada tbulo, que

    eventualmente esvaziado atravs do intestino posterior para eliminao do cido

    rico como parte do bolo fecal.

  • 15

    O resto do intestino posterior funciona em maior parte em homeostase,

    pela regulao da absoro de gua e sais. Em alguns insetos, o intestino

    posterior visivelmente subdividido em leo, colo e reto. A eficiente

    recuperao de gua facilitada por seis estruturas retais que esto incrustadas

    nas paredes do reto. Esses rgos removem mais de 90% da gua do bolo fecal

    antes que esse abandone o corpo atravs do nus (Meyer, 2006).

    2.7 Dietas dos insetos

    Estima-se que aproximadamente dois teros das espcies do mundo

    sejam insetos (Wigglesworth, 1974). Uma possvel explicao para essa

    hegemonia a grande capacidade de os insetos explorarem diversas fontes de

    alimento.

    A capacidade digestiva dos insetos depende das enzimas presentes no

    trato digestivo e como elas esto compartimentalizadas em seu intestino. Alm

    da capacidade de digerir materiais tratados, os insetos tm explorado diversas

    fontes de comida no disponveis para outros animais devido toxicidade dessas

    fontes. Algumas espcies fitfagas tm driblado os efeitos de inibidores de

    proteases e compostos secundrios das plantas, os quais se tornam txicos aps a

    ao enzimtica (Harbone, 1993 citado por Terra et al., 1996). Dessa maneira, os

    insetos tm se desenvolvido em nichos ecolgicos inexplorveis por outros seres

    vivos, constituindo um desafio sem igual para enzimologistas estudarem a

    fisiologia digestiva desses organismos, que possuem dieta extremamente

    diversificada (Terra et al., 1996).

    A dieta dos insetos define o grupo de enzimas de maior atividade na

    digesto. As baratas, por exemplo, possuem um grande nmero de enzimas

    digestivas capazes de digerir diferentes tipos de fontes de alimento. Insetos

    hematfagos, cuja dieta baseada em protenas, possuem poucas enzimas

    digestivas, sendo que as presentes so do tipo proteases. Quando um inseto se

  • 16

    alimenta apenas de nctar, como os adultos da ordem Lepidoptera, apenas a

    sacarase est presente; j as lagartas fitfagas dessa ordem possuem proteases,

    lipases, amilases, maltases e sacarases (Wigglesworth, 1974). Os cupins, que

    possuem um regime alimentar base de celulose, necessitam da presena de

    certos microrganismos simbiticos para que o processo digestivo se complete

    (Acevedo Jaramillo, 1997).

    A habilidade de os insetos utilizarem diferentes materiais como fonte de

    alimento inevitavelmente conduziu alguns deles a serem classificados como

    pragas em diferentes setores, tais como na produo agrcola de campo, no

    armazenamento de alimentos e na sade humana. Tal considerao mostra a

    necessidade do conhecimento da digesto dos insetos como um pr-requisito

    para o desenvolvimento de mtodos de controle (Terra et al., 1996), como por

    exemplo, a utilizao da inibio da digesto por meio de inibidores de enzimas

    digestivas importantes como ferramenta para controlar a infestao de insetos

    importantes na agricultura.

    2.8 Consequncias de uma dieta deficiente

    Apesar da grande diversidade da dieta entre os insetos, existem algumas

    necessidades bsicas para que esses cresam e se desenvolvam. Dessa maneira,

    todos os insetos necessitam de fontes de energia qumica, geralmente

    carboidratos, alm de protenas e lipdeos (Horn, 1978).

    Durante a digesto, as protenas so hidrolisadas, gerando os

    aminocidos, estruturas bsicas para o crescimento estrutural e sntese de

    enzimas.

    Os insetos podem sintetizar aminocidos, porm, os considerados

    essenciais devem ser ingeridos na dieta. Srivastava & Auclair (1974) citados por

    Horn (1978), demonstraram a importncia dos aminocidos na sobrevivncia e

    crescimento de pulges, conforme TABELA 1.

  • 17

    TABELA 1. Efeito dos aminocidos na sobrevivncia e crescimento de pulges (Acyrthosiphon pisum)

    % de aminocidos na dieta

    Ganho de peso aps 12 dias

    Taxa de sobrevivncia aps

    12 dias (%)

    Dias at o estdio adulto

    0 0,09 mg 3 Sem adultos 1 0,42 mg 56 12-15 2 0,83 mg 74 8-10 4 1,19 mg 62 10

    As quantidades e propores de vrios elementos da dieta de um inseto

    podem resultar em importantes conseqncias, alm dos efeitos bvios de

    deficincia ou excesso dos mesmos (insetos bem alimentados geralmente tm

    maior tamanho) (Horn, 1978).

    Por exemplo, a produo de ovos em parasitides das ordens Diptera e

    Himenoptera aumenta quando mais flores esto disponveis, para que os

    parasitides possam aumentar sua alimentao com nctar (carboidrato) e plen

    (protena) (Leius, 1967, citado por Horn, 1978). A adio de gelia real na

    rotina alimentar de larvas de abelhas implica na formao de uma taxa maior de

    rainhas reprodutivas frteis em relao a trabalhadores estreis. Citado por Horn

    (1978), Mitsuhashi & Koiama (1974) perceberam que pulges desenvolviam

    asas mais curtas quando cido flico (uma vitamina B) estava numa

    concentrao entre 0,5 e 0,7 mg/L de dieta. Em concentraes maiores, as asas

    cresciam totalmente.

    A necessidade de aminocidos para insetos adultos est longe de ser to

    bem conhecida como as necessidades para crescimento e metamorfose. Por

    exemplo, insetos machos adultos geralmente no requerem aminocidos, pois a

    espermatognese ocorre em estdios imaturos e os adultos podem ter reservas

  • 18

    suficientes armazenadas para suas necessidades metablicas e para sntese de

    protenas (Blum, 1985).

    2.9 Enzimas digestivas dos insetos

    Vrios estudos a respeito de diferentes enzimas digestivas presentes em

    insetos foram realizados e pode-se agrupar as principais enzimas envolvidas com

    o processo digestivo de acordo com sua funo em peptidases, glicosidases,

    lipases, fosfolipases, esterases e outras enzimas digestivas (Terra et al., 1996).

    2.9.1 Peptidases

    As peptidases so enzimas atuantes no processo digestivo dos insetos e

    tm a funo de hidrolisar ligaes peptdicas, promovendo a digesto de

    protenas. As principais enzimas com funo de hidrlise protica em insetos so

    divididas em tripsinas, quimotripsinas, cistena proteinases, cido asprtico

    proteinases, aminopeptidases, carboxipeptidades e dipeptidases (Terra et al.,

    1996). A classificao das peptidases se d de acordo com a posio de clivagem

    das protenas, das caractersticas do seu stio ativo e local onde essa enzima

    realiza a hidrlise (Rawlings & Barrett, 1999).

    As tripsinas so endopeptidases (Jany et al., 1978) com o aminocido

    serina em seu stio ativo que, preferencialmente, clivam ligaes peptdicas do

    lado da carboxila de L-aminocidos arginina ou lisina (Olsen et al., 2004).

    A atividade digestiva de tripsinas tem sido encontrada em quase todas as

    espcies de insetos, mas existem excees, como espcies da ordem Hemiptera e

    espcies pertencentes ordem Cucujiformia da ordem Coleoptera (Terra et al.,

    1996).

    Da mesma forma que as tripsinas, as quimotripsinas so endopeptidases

    (Broadway, 1989) com o grupo serina no stio ativo, mas diferem das tripsinas

    por clivar ligaes peptdicas do lado da carboxila de aminocidos aromticos

  • 19

    (fenilalanina, tirosina e triptofano) (Lehninger et al., 1995). Algumas

    propriedades das quimotripsinas dos insetos contrastam com as quimotripsinas

    dos vertebrados, como sua instabilidade em pHs cidos e sua forte inibio pelo

    inibidor encontrado na soja (Terra et al., 1996).

    As cistena proteinases so endopeptidases com um resduo de

    aminocido cistena envolvido na catlise em seu stio ativo (Merck & Co.,

    2006) e so enzimas comuns em espcies de colepteras (Murdok et al., 1997 e

    Campos, 1989, citados por Oliveira Neto et al., 2004).

    Outro tipo de endopeptidase so as cido asprtico proteinases, cuja

    catlise ocorre na hidrlise de ligaes peptdicas internas de protenas. Essas

    enzimas apresentam um resduo de cido asprtico em seu stio ativo, so ativas

    em pH cido e encontradas em insetos das ordens Coleoptera, Hemiptera e

    Diptera (Terra et al., 1996).

    As aminopeptidases so exopeptidases que atuam ligadas em membrana

    ou livres no lmen (Nation, 2002) e hidrolisam aminocidos da extremidade

    amino-terminal de cadeias polipeptdicas. As aminopeptidases encontradas em

    insetos possuem pH timo alcalino (Terra et al., 1996).

    As carboxipeptidases so exopeptidases que removem aminocidos da

    extremidade carboxila-terminal de cadeias polipeptdicas. Esse tipo de enzima

    foi diagnosticado em insetos das ordens Coleoptera, Diptera e Lepidoptera

    (Bown & Gatehouse, 2004).

    As dipeptidases hidrolisam aminocidos isolados a partir de pequenos

    peptdeos e so classificadas de acordo com sua especificidade por substrato.

    Essas enzimas foram encontradas em espcies das ordens Diptera, Himenoptera

    e outras (Del Lama & Ferreira, 2003).

  • 20

    2.9.2 Glicosidases

    As glicosidases so enzimas que clivam as ligaes glicosdicas

    formadas entre dois acares (Marana et al., 2001), a fim de reduzir o tamanho

    do alimento ingerido at molculas passveis de absoro pelo organismo. A

    hidrlise dos polmeros grandes de acares (amido e celulose) ingeridos na

    alimentao ocorre durante a digesto primria, atravs da ao de enzimas que

    atuam ao longo das cadeias -1,4 e -1,4 de glicose (Santos et al., 1983).

    As -amilases so altamente difundidas entre insetos de diversas ordens

    (Terra et al., 1996). J as enzimas atuantes nas cadeias -1,4 de glicose, como a

    celulase, por exemplo, so encontradas em insetos e podem ser de origem

    endgena ou de microrganismos simbiontes encontrados no intestino mdio

    (Watanabe et al., 1997).

    A xilanase mais comumente encontrada a endo--1,4-xilanase que atua

    nas cadeias de xilana (Brennan et al., 2004), secretada por microrganismos

    simbiontes presentes no intestino dos insetos e foi observada em Orthoptera,

    Plecoptera, Trichoptera e Isoptera (Vonk & Western, 1984 e Rouland et al.,

    1988b, citados por Terra et al., 1996).

    As quitinases so encontradas no intestino mdio de diversos insetos

    (Vonk & Western, 1984, citados por Terra et al., 1996) e essas hidrolisam a

    quitina, em suas ligaes -1,4 entre os monmeros de N-acetilglucosamina

    (Merzendorfer, 2006) em oligossacardeos solveis e insolveis de baixo peso

    molecular (Kramer & Muthukrishnan, 1997). Entre as quitinases, pode-se

    observar em insetos tambm a -N-acetilglucosaminidase, que libera N-

    acetilglucosamina da extremidade terminal no-redutora de oligossacardeos

    (Terra et al., 1996).

    A lisozima catalisa a hidrlise do glicosdeo -1,4, ligado entre o cido

    N-acetilmurmico e a N-acetilglucosamina do peptdeoglicano presente na

    parede celular de bactrias. As lisozimas esto espalhadas pela natureza como

  • 21

    parte de um sistema defensivo contra bactrias e foram encontradas em insetos,

    tanto no trato digestivo como na hemolinfa (Ursic Bedoya et al., 2005).

    As e glicosidases catalisam respectivamente a hidrlise de resduos

    de -1,4 glicose e -1,4 glicose da extremidade no redutora de dissacardeos ou

    oligossacardeos com variada eficincia. Maiores atividades de -glicosidases

    foram encontradas em Diptera (Terra et al., 1996), e -glicosidases tambm

    foram diagnosticadas em insetos (Santos & Terra, 1986).

    Pode-se observar uma complementaridade da ao das e

    glicosidases. Como, por exemplo, a hidrlise da sacarose catalisada por

    enzimas especficas para a ligao -glicosil ou pela ligao -frutosil. No

    intestino mdio dos insetos, geralmente ocorre a ao de -glicosidases,

    provavelmente devido ao fato de que a -frutosidase em insetos relativamente

    incomum, sendo observada em apenas um pequeno nmero de casos nos quais a

    caracterizao foi realizada (Santos & Terra, 1986). O papel fisiolgico da -

    frutosidase no intestino mdio de Eriniys. ello hidrolisar a sacarose das folhas

    (fase larval) ou a sacarose do nctar (fase de adulto). A sacarose que no

    eficientemente digerida pelas -glicosidases no intestino mdio de E. ello

    hidrolisada pelas -frutosidases (Terra et al., 1987).

    As trealases hidrolisam a trealose em duas molculas de glicose e uma

    das mais difundidas hidrolases de carboidratos entre os insetos (Terra et al.,

    1996). A trealase uma enzima ligada membrana encontrada no trato digestivo

    e no msculo relacionado com o vo de Locusta migratoria (Wegener et al.,

    2003). O consumo de trealose aumentado em at 10 vezes, quando o vo

    realizado (Van Der Horst et al., 1978, citados por Wegener et al., 2003),

    aumentando, dessa maneira, a atividade da trealase.

  • 22

    Outras enzimas que atuam sobre glicosdeos podem estar presentes em

    insetos de acordo com a fonte de alimentao e so classificadas observando-se

    seu mecanismo de reao e o substrato em que atuam.

    2.9.3 Esterases, lpases e fosfolipases

    As esterases so enzimas relacionadas com a hidrlise de ligaes do

    tipo ster e so amplamente encontradas no sistema digestivo de insetos na

    forma de lipases, fosfatases, entre outras.

    Os lipdeos ingeridos na dieta dos insetos na forma armazenada de leos

    e gorduras ou em membranas lipdicas precisam ser hidrolisados para liberao

    dos cidos graxos mediante hidrlise da ligao ster.

    As triacilglicerol lipases so enzimas primariamente envolvidas na

    mobilizao de lipdeos do corpo gorduroso dos insetos (Arrese & Wells, 1997)

    e preferencialmente hidrolisam as ligaes ster mais afastadas dos

    triacilgliceris e atuam apenas na interface gua-lipdeo (Terra et al., 1996).

    As fosfolipases A1 e A2 removem os cidos graxos anexados nas

    posies 1 e 2 dos fosfolipdeos (Uscian et al., 2005). A fosfolipase A j foi

    encontrada no intestino mdio de vrias espcies de lepidpteros (Sommerville

    & Pockett, 1976 e Turunen & Kastari, 1979, citados por Terra et al., 1996 e

    Uscian et al., 2005) e provavelmente muito comum entre os insetos.

    2.9.4 Outras enzimas digestivas

    Os grupos fosfato devem ser removidos dos compostos fosforilados para

    que sua absoro ocorra. Essas reaes so catalisadas por fosfatases no

    especficas, que so ativas em meio alcalino ou cido. As fosfatases alcalinas

    esto normalmente nas membranas das microvilosidades em espcies das ordens

    Diptera e Lepidoptera, mas podem tambm ocorrer nas membranas basolaterais

    do intestino mdio ou como enzimas secretadas (Terra et al., 1996). As

  • 23

    fosfatases cidas tambm se encontram presentes no processo digestivo de

    insetos e esto localizadas principalmente no citosol das clulas do intestino de

    insetos da ordem Lepidoptera (Santos & Terra, 1984 citados por Terra et al.,

    2005).

    2.10 Inibio enzimtica

    As enzimas promovem a catlise de praticamente todos os processos que

    ocorrem nas clulas e no surpreendente que os inibidores enzimticos estejam

    entre os mais importantes agentes farmacuticos conhecidos (Lehninger et al.,

    1995).

    Quando uma enzima no funciona corretamente em um organismo, esse

    fatalmente sofrer danos devido m funcionalidade do catalisador de reaes.

    Esse mau funcionamento pode ser atribudo a diversos fatores, sendo um destes

    a presena de inibidores enzimticos no sistema de reao. Os inibidores so

    classificados em irreversveis e reversveis. Entre os reversveis, outras

    classificaes so feitas de acordo com a maneira que interagem com a enzima

    ou substrato e so classificados em inibidores reversveis competitivos,

    incompetitivos ou acompetitivos (Lehninger et al., 1995 e Voet et al., 2000).

    2.11 Purificao de molculas

    Aps se diagnosticar a presena de uma molcula de interesse em uma

    mistura, de grande importncia purific-la e caracteriz-la, a fim de explorar

    suas propriedades.

    Durante o processo de purificao de uma molcula, experimentam-se

    vrios mtodos de separao e a eficincia de cada um avaliada pelo ensaio de

    uma propriedade que distinga a molcula de interesse (Stryer, 1996), como, por

    exemplo, a ao inibitria da molcula purificada sobre uma determinada

    enzima.

  • 24

    Na maioria dos casos, muitos mtodos diferentes de purificao

    precisam ser empregados em seqncia para se purificar completamente uma

    molcula (Lehninger et al., 1995).

    As molculas apresentam inmeras diferenas entre si, como, por

    exemplo, tamanho, forma, carga, hidrofobicidade, afinidade por outras

    molculas, entre outras. Todas essas propriedades podem ser exploradas para

    separar uma molcula de interesse das outras, permitindo que se possa estud-la

    individualmente (Alberts, 2002).

    Durante o processo de purificao, a escolha de um mtodo de certa

    forma emprica, e muitos protocolos so testados antes que seja determinado

    qual o mais efetivo. Esse jogo de tentativa e erro pode geralmente ser

    minimizado pelo uso de guias de procedimentos de purificao desenvolvidos

    para molculas similares (Lehninger et al., 1995), quando informaes a respeito

    da molcula de interesse esto disponveis.

    O censo comum diz que procedimentos baratos devem ser utilizados

    primeiro, quando o volume total da soluo do extrato bruto e o nmero de

    contaminantes maior. Alguns mtodos cromatogrficos so, em geral,

    impraticveis nos primeiros estgios de purificao, pelo fato de a quantidade do

    meio cromatogrfico necessrio aumentar de acordo com a amostra. medida

    que cada passo de purificao completado, o tamanho da amostra torna-se

    menor e podem ser aplicados mtodos cromatogrficos mais sofisticados e,

    tambm, mais caros (Lehninger et al., 1995).

    2.11.1 Purificao de protenas

    Antes de se proceder a purificao de uma protena, tcnicas massais de

    purificao, tambm conhecidas como tcnicas de pr-purificao, so adotadas.

    Tais tcnicas consistem em separar as protenas das demais molculas presentes

    em um composto.

  • 25

    Entre as formas de pr-purificao, uma muito utilizada baseia-se na

    precipitao das protenas mediante a adio de sulfato de amnio saturado a

    4C em uma soluo que contenha protenas. Este mtodo utiliza-se do princpio

    de salting-out, no qual a camada de solvatao das protenas retirada. Tal

    procedimento resulta na reduo da solubilidade e precipitao das protenas

    (Seidman & Mowery, 2006).

    Outro mtodo de precipitao de protenas consiste no uso de acetona a -

    20C. A presena desse solvente reduz a constante dieltrica da gua e as

    protenas em soluo precipitam (Wang, 2006).

    Ao se diagnosticar a presena da molcula de interesse na frao

    protica, tcnicas mais refinadas de separao de protenas devem ser utilizadas,

    tais como a filtrao molecular ou diferentes tipos de cromatografia disponveis,

    capazes de explorar as diferentes caractersticas das protenas para separ-las.

    2.11.2 Purificao de molculas no-proticas

    Da mesma forma que a purificao de protenas se utiliza de suas

    diferentes propriedades para separ-las, a purificao de molculas no-proticas

    tambm se utiliza deste artifcio.

    Porm, diferentemente das protenas, as molculas no-proticas

    apresentam, em geral, uma maior estabilidade em relao perda de funo da

    molcula devido desnaturao. Dessa forma, mtodos cromatogrficos que se

    utilizam de solventes inviveis para a separao de protenas podem ser

    explorados para separar esse grupo de molculas.

    Por definio, cromatografia um processo de separao no qual a

    amostra que contm uma mistura de compostos distribuda entre duas fases.

    Uma fase conhecida como estacionria, enquanto a outra conhecida como

    fase mvel e desloca-se atravs da fase estacionria. A fase estacionria pode ser

    um slido poroso, de superfcie composta por um material ativo na forma de

  • 26

    partculas minsculas ou por um fino filme de lquido colocado em um suporte

    slido. A fase mvel pode ser gasosa ou lquida. Se um gs utilizado, o

    processo conhecido como cromatografia gasosa e se um lquido utilizado,

    cromatografia lquida (Meyer, 2006).

    Vrios tipos de cromatografia so conhecidos, entre eles a cromatografia

    em papel, em camada delgada, de adsoro, de troca inica, de excluso, de

    bioafinidade, gasosa, lquida de alta eficincia, entre outros (Collins et al.,

    1997).

    Neste trabalho, explorou-se cromatografia de adsoro, cujos princpios

    so descritos no item 2.11.3.

    2.11.3 Cromatografia de adsoro

    A cromatografia de adsoro um mtodo de separao que se baseia na

    adsoro de diferentes compostos presentes em uma mistura a um adsorvente

    (ex.: slica ou alumina) em diferentes taxas. De acordo com a polaridade de

    determinada molcula, essa ter uma interao eletrosttica de Van der Waals

    com o adsorvente (Collins et al., 1997). Como as diferentes molculas

    demonstram foras de interao distintas com o adsorvente, as molculas so

    separadas de acordo com a passagem de solventes de diferentes polaridades pela

    coluna.

    Ao se aplicar uma amostra em uma coluna de cromatografia de adsoro,

    as molculas polares interagem mais fortemente com a slica em relao s

    molculas de carter mais apolar. Dessa maneira, realiza-se passagem de

    solventes de carter apolar e o processo de separao se inicia, pois as molculas

    com maior interao com o solvente migraro juntamente com esse, ao passo

    que as molculas cuja interao com a slica maior ficam adsorvidas. A fim de

    se continuar o processo de separao, deve-se aumentar gradativamente a

    polaridade dos solventes eludos na coluna, para que esses possam vencer a

  • 27

    competio pelas molculas adsorvidas na slica. A diferena na adsoro entre

    as molculas e a slica a base desse processo de separao (Scott, 2006).

    3 OBJETIVOS

    Objetivou-se com este trabalho analisar o pH timo e a atividade (U/g de

    inseto) das enzimas digestivas do bicho-mineiro do cafeeiro, avaliar o efeito in

    vitro do inibidor presente em folhas de mamona sobre a tripsina de bicho-

    mineiro do cafeeiro, avaliar a inibio desse inibidor sobre a tripsina bovina e

    purificar esse inibidor de tripsina.

    4 RESULTADOS

    Os resultados obtidos foram divididos em dois captulos. No captulo 1,

    esto apresentados os resultados da anlise das enzimas digestivas do bicho-

    mineiro do cafeeiro. No captulo 2, os resultados de inibio de tripsina e

    purificao deste inibidor so descritos.

  • 28

    CAPTULO I

    ENZIMAS DIGESTIVAS DO BICHO-MINEIRO DO CAFEEIRO

  • 29

    RESUMO

    ROSSI, Guilherme Duarte. Enzimas digestivas do bicho-mineiro do cafeeiro. 2007. 28-49 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. As enzimas digestivas so os catalisadores das reaes de hidrlise que ocorrem durante o processo digestivo. Os insetos so munidos de diferentes enzimas digestivas, as quais se diferenciam de acordo com suas dietas. Neste trabalho, objetivou-se verificar as atividades de algumas enzimas digestivas do bicho-mineiro do cafeeiro como pr-requisito para posterior anlise da inibio de enzimas participantes da digesto. As lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro -Leucoptera coffeella (Gurin-Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) - foram coletadas em campo e em casa-de-vegetao. O extrato enzimtico utilizado na determinao das atividades foi obtido pela macerao das lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro utilizando o homogeneizador do tipo Potter-Elvehjem e gua gelada como meio de extrao. Determinou-se a atividade de algumas enzimas incubando o extrato enzimtico do bicho-mineiro do cafeeiro com substratos especficos. O experimento foi conduzido em Lavras-MG e analisaram-se as atividades no pH timo especfico de cada enzima. As atividades das enzimas (U/g de lagarta) com seus respectivos pHs timos foram: -glicosidase (13,67 + 3,43 U/g de inseto; pH timo = 6,0), amilase (2,21 + 0,12 U/g de inseto; pH timo = 10,5), aminopeptidase (6,81 + 0,86 U/g de inseto; pH timo = 8,3), -glicosidase (0,38 + 0,16 U/g de inseto; pH timo = 6,0), fosfatase cida (0,79 + 0,19 U/g de inseto; pH timo = 5,5), sacarase (6,76 + 0,78 U/g de inseto; pH timo = 6,5), trealase (2,21 + 0,44 U/g de inseto; pH timo = 6,0) e tripsina (0,70 + 0,2 U/g de inseto; pH timo = 9,7). Pela comparao dos pHs timos encontrados em bicho-mineiro do cafeeiro, infere-se que o ambiente intestinal desse inseto se assemelha com o dos demais lepidpteros encontrados na literatura. _________________ Comit Orientador: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Orientador), - Dra. Maria das Graas Cardoso - UFLA e Dra. Angelita Duarte Corra UFLA

  • 30

    ABSTRACT ROSSI, Guilherme Duarte. Coffee leaf miner`s difegestive enzymes. 2007. 28-49 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Federal University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil. Digestive enzymes are the catalysts of the hydrolysis reactions occurring during the digestive process. Insects are fitted with different digestive enzymes, which differ from one another according to their diets. In this work, it was intended to verify the activities of some digestive enzymes of the coffee leaf miner as a pre-requisite for later analysis of the inhibition of enzymes participating in digestion. The leaf miner caterpillar -Leucoptera coffeella (Gurin-Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) were collected in fields and in greenhouse. The enzyme extract utilized in determining the activities was obtained from the grinding of the leaf miner caterpillars by utilizing the Potter-Elvehjem type homogenizer and icy water as a means of extraction. The activity of some enzymes incubating the enzyme extract of the coffee leaf miner with particular substrates was determined. The experiment was conducted in Lavras-MG and the activities in the optimum pH specific to each enzyme were investigated. The activities of the enzymes (U/g of caterpillar) with their respective optimum pHs were: -glucosidase (13.67 + 3.43 U/g of insect; optimum pH = 6.0), amylase (2.21 + 0.12 U/g of insect; optimum pH = 10.5), aminopeptidase (6.81 + 0.86 U/g of insect; optimum pH = 8.3), -glucosidase (0.38 + 0.16 U/g of insect; optimum pH = 6.0), acidic phosphatase (0.79 + 0.19 U/g of insect; optimum pH = 5.5), saccharase (6.76 + 0.78 U/g of insect; optimum pH = 6.5), trehalase (2.21 + 0.44 U/g of insect; optimum pH = 6.0) and trypsin (0.70 + 0.2 U/g of insect; optimum pH = 9.7). The comparison of the optimum pHs found in coffee leaf miner indicated that the intestinal environment of this insect is similar to the one of the other lepidopterans found in the literature. _________________ Guidance Committee: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Major Professor), Dr. Maria das Graas Cardoso - UFLA and Dr. Angelita Duarte Corra - UFLA

  • 31

    1 INTRODUO

    O processo digestivo dos insetos, bem como dos demais seres vivos

    heterotrficos, tem a funo de hidrolisar o alimento consumido na forma de

    macromolculas complexas e transform-lo em molculas mais simples, capazes

    de serem absorvidas pelo organismo (Meyer, 2006).

    Nos insetos, esse processo de hidrlise ocorre principalmente no

    intestino mdio, local onde as enzimas digestivas so secretadas (Acevedo

    Jaramillo, 1997).

    A digesto divida em trs etapas: primria, intermediria e final. Na

    digesto primria, o alimento sofre a ao de despolimerases, que reduzem o

    tamanho do alimento ingerido at tamanhos capazes de atravessar os poros da

    membrana peritrfica. A partir desse momento, os fragmentos menores de

    alimento so digeridos no espao ectoperitrfico pela ao das enzimas

    responsveis pela digesto intermediria e final (Santos, 1985).

    Nos lepidpteros, o contedo intestinal, localizado no espao

    endoperitrfico, apresenta pH alcalino, ao passo que o espao ectoperitrfico

    apresenta pH mais prximo da neutralidade (Nation, 2002).

    Objetivou-se com este trabalho analisar o pH timo e as atividades das

    enzimas digestivas -glicosidase, amilase, aminopeptidase, -glicosidase,

    fosfatase, sacarase, trealase e tripsina, a fim de se comparar as caractersticas das

    enzimas digestivas do bicho-mineiro do cafeeiro - Leucoptera coffeella (Gurin-

    Mneville, 1842) (Lepidoptera: Lyonetiidae) - com as caractersticas de outros

    lepidpteros.

  • 32

    2 MATERIAL E MTODOS

    2.1 Coleta e retirada das lagartas das minas

    As lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro foram coletadas em folhas

    infestadas de um cafezal e de uma casa-de-vegetao no campus da

    Universidade Federal de Lavras-MG (UFLA), acondicionadas em sacos de papel

    e transportadas at o Laboratrio de Bioqumica da UFLA, onde foram retiradas

    das minas com o auxlio de um estilete e uma pina. Depois de retiradas das

    minas, 12 lagartas foram colocadas em Eppendorfs, pesadas e armazenadas a -

    20C, at sua utilizao nos ensaios enzimticos. Cada conjunto de 12 lagartas

    constituiu uma repetio.

    2.2 Extrao enzimtica

    Em razo do tamanho diminuto das lagartas do bicho-mineiro do

    cafeeiro, a retirada do intestino mdio foi impossibilitada. Desse modo, a

    soluo encontrada foi homogeneizar a lagarta inteira. Aps experincias

    realizadas, determinou-se o nmero de 12 lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro

    para cada mL de meio extrator (gua 4C). Cada conjunto de 12 lagartas foi

    pesado e previamente macerado em um Eppendorf com o auxlio de um basto

    de vidro devidamente torneado para esmagar eficientemente as lagartas,

    juntamente com 0,1 mL de gua destilada a 4C para facilitar a macerao. Aps

    a pr-macerao, transferiu-se essa soluo para um homogeneizador do tipo

    Potter-Elvehjem, onde se realizou a macerao em um volume de soluo igual

    a 1 mL.

    Aps macerao final, filtrou-se a soluo obtida com uma tela de nylon

    com poros de 100 m de dimetro e completou-se o volume final para 1 mL.

    Esse homogeneizado foi utilizado na determinao das atividades enzimticas.

    Cada conjunto de 12 lagartas constituiu uma repetio.

  • 33

    2.3 Determinao dos pHs timos das enzimas analisadas

    A determinao dos pHs timos das enzimas foi realizada de acordo

    com o monitoramento da hidrlise de substratos especficos incubados com o

    extrato enzimtico obtido conforme o item 2.2 em diferentes pHs. Ensaios-

    controle sem enzima e sem substrato foram realizados, a fim de se evitar a

    quantificao de atividade por hidrlise do substrato na presena do tampo e

    por formao de cor a partir do extrato enzimtico.

    2.3.1 pH timo da -glicosidase

    Utilizou-se o tampo citrato-fosfato 0,1 mol.L1 nos seguintes pHs: 3,0;

    3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0. Incubaram-se 100 L do extrato enzimtico

    obtido no item 2.2 juntamente com 100 L do substrato p-nitrofenil--D-

    glicopiranosdeo 10 mmol.L1 (preparado em gua) por 2 horas a 30C (Santos,

    1985). A reao foi interrompida com 1,0 mL de NaOH 0,05 mol.L1 e realizou-

    se a leitura em espectrofotmetro ajustado no comprimento de onda igual a 400

    nm. Uma curva-padro de p-nitrofenol foi utilizada como referncia para os

    clculos de atividade.

    2.3.2 pH timo da amilase

    Utilizaram-se os tampes fosfato 0,1 mol.L1 nos seguintes pHs : 7,0;

    7,5 e 8,3 e o tampo glicina/NaOH 0,1 mol.L1, nos pHs 8,3; 9,0; 9,5; 10,0;

    10,5 e 11,0. Incubaram-se 100 L do extrato enzimtico com o substrato amido

    1% (preparado em gua) e deixou-se reagir por 8 horas a 30C. De acordo com

    metodologia proposta por Noelting & Bernfeld (1948), a reao foi interrompida

    com 200 L do reagente DNS, com posterior ebulio por 5 minutos,

    resfriamento e adio de 1,6 mL de gua. Os acares redutores formados a pela

    hidrlise do amido foram quantificados mediante observaes em

  • 34

    espectrofotmetro a 550 nm. Uma curva-padro de glicose foi utilizada com

    referncia para os clculos de atividade.

    2.3.3 pH timo da aminopeptidase

    Utilizaram-se os tampes fosfato 0,1 mol.L1 nos pHs 7,0; 7,5 e 8,3 e o

    tampo glicina/NaOH 0,1 mol.L1 nos pHs 8,3; 9,0; 9,5; 10,0 e 10,5.

    Incubaram-se 100 L do extrato enzimtico juntamente com 1000 L do

    substrato LpNA 1 mmol.L1por 30 minutos a 30C. A reao foi interrompida

    com a adio de 200 L de cido actico 30%. O monitoramento da hidrlise do

    substrato foi realizado com espectrofotmetro a 410 nm. Os clculos de

    velocidade de catlise da enzima foram baseados no coeficiente de extino

    molar da p-nitroanilida, de acordo com Erlanger et al. (1961).

    2.3.4 pH timo da -glicosidase

    Utilizou-se o mesmo procedimento do item 2.3.1, porm, o substrato

    utilizado foi p-nitrofenil--D-glicopiranosdeo 10 mmol.L1.

    2.3.5 pH timo da fosfatase

    Utilizou-se o mesmo procedimento do item 2.3.1, porm, o substrato

    utilizado foi p-nitrofenilfosfato 20 mmol.L1. Os tampes utilizados foram

    citrato 0,1 mol.L1 (pH = 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 e 5,5), TRIS/maleato 0,1 mol.L1

    (pH = 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 e 8,3) e glicina/NaOH 0,1 mol.L1 (pH = 8,3;

    9,0; 95; 10,0; 10,5 e 11,0) e deixando-se 100 L do extrato enzimtico reagir

    com 100 L do substrato por 4 horas a 30C.

    2.3.6 pH timo da sacarase

    Utilizou-se o mesmo procedimento do item 2.3.2, porm, o substrato

    utilizado foi a sacarose 20 mmol.L1 e os tampes utilizados foram

  • 35

    citrato/fosfato 0,1 mol.L1 (pH = 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0) e fosfato 0,1 mol.L1

    (pH = 7,0 e 7,5). Incubaram-se 100 L do extrato enzimtico com 100 L do

    substrato por 6 horas a 30C.

    2.3.7 pH timo da trealase

    Utilizou-se o mesmo procedimento do item 2.3.2, porm, o substrato

    utilizado foi a trealose 20 mmol.L1 e os tampes utilizados foram citrato/fosfato

    0,1 mol.L1 (pH = 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0) e fosfato 0,1 mol.L1 (pH =

    7,0 e 7,5). Incubaram-se 100 L do extrato enzimtico com 100 L do substrato

    por 8 horas a 30C.

    2.3.8 pH timo da tripsina

    Utilizou-se o mesmo procedimento do item 2.3.3, porm o substrato

    utilizado foi o BapNA 0,87 mmol.L1 e os tampes utilizados foram TRIS/HCl

    0,1 mol.L1 (pH = 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 e 9,0) e glicina/NaOH 01 mol.L1 (pH = 9,0;

    10,0; 10,5). Incubou-se 200 L do extrato enzimtico com 1 mL do substrato

    por 1 hora a 30C.

    2.5 Eletroforese do extrato enzimtico do bicho-mineiro do cafeeiro

    Preparou-se um gel para eletroforese em cilindro a 7,5% segundo Davis

    (1964) e Ornstein (1964). A eletroforese foi realizada em corrente constante de

    2,5 mA por gel e variao da voltagem livre. Aplicou-se uma alquota de 0,2 mL

    de extrato enzimtico sobre o gel e, aps a corrida, fracionou-se o gel em

    pedaos de 2 mm com o auxlio de lminas de ao. Deixaram-se as fraes

    eluindo em 200 L de gua e realizou-se a recuperao da atividade de tripsina

    de acordo com o item 2.6.

  • 36

    2.6 Atividade de enzimas digestivas

    As atividades das diferentes enzimas digestivas foram quantificadas de

    acordo com a TABELA 2, incubando-se o extrato enzimtico obtido no item 2.2

    por pelo menos 4 diferentes perodos de tempo com 3 repeties para cada

    enzima analisada. Branco de substrato (sem enzima) e branco de enzima (sem

    substrato) foram determinados da mesma maneira que os tubos experimentados.

    TABELA 2 Condies-padres e mtodos de determinao de atividade das enzimas.

    Enzima EC4 Substrato Concentrao final

    pH Determinao realizada

    -glicosidase 3.2.1.20 p-nitrofenil--D-glicopiranosdeo

    10 mM 6,0 p-nitrofenol2

    Amilase 3.2.1.1 Amido 0,5% 10,5 Acares redutores1

    Aminopeptidase 3.4.11.1 LpNA 1 mM 8,3 p-nitroanilida3 -glicosidase 3.2.1.21 p-nitrofenil--D-

    glicopiranosdeo 10 mM 6,0 p-nitrofenol2

    Fosfatase cida 3.1.3.2 p-nitrofenilfosfato 10 mM 5,5 p-nitrofenol2 Sacarase 3.2.1.48 Sacarose 10 mM 6,5 Acares

    redutores 1 Trealase 3.2.1.28 Trealose 10 mM 6,0 Acares

    redutores 1 Tripsina 3.4.21.4 BapNA 0,87 mM 9,7 p-nitroanilida3

    Os ensaios foram realizados a 30C, nos pHs timos determinados. Os tampes utilizados foram: citrato (pH = 5,5), citrato-fosfato (pH = 6,0 e 6,5), e glicina-NaOH (pH = 8,3; 9,7 e 10,5). 1 Noelting & Bernfeld, 1948. 2 Santos, 1985 3 Erlanger et al, 1961. 4 Moss, 2006.

  • 37

    3 RESULTADOS E DISCUSSO

    3.1 pHs timos

    A -glicosidase do bicho-mineiro do cafeeiro apresentou um valor de pH

    timo igual a 6,0 (FIGURA 2), justamente o mesmo encontrado por Pratviel-

    Sosa et al. (1986), citados por Terra et al. (1996), que analisaram essa mesma

    enzima estudando Thaumetopoea pityocampa (Denis & Schiffermller, 1775),

    (Lepidoptera: Thaumetopoeidae).

    FIGURA 2. pH timo da -glicosidase do bicho-mineiro do cafeeiro

    J o pH timo da amilase encontrado no bicho-mineiro do cafeeiro foi

    igual a 10,5 (FIGURA 3). Esse valor parecido com os encontrados por

    Nagaraju et al., 1995, que analisaram Antheraea mylitta (Drury, 1773)

    (Lepidoptera: Saturniidae) e encontraram o valor de pH timo da amilase igual a

    9,5.

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    2 3 4 5 6 7 8

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 38

    FIGURA 3. pH timo da amilase do bicho-mineiro do cafeeiro

    Ao analisar a aminopeptidase do bicho-mineiro do cafeeiro, determinou-se um

    valor de pH timo igual a de 8,3 (FIGURA 4). Esse valor semelhante ao

    encontrado por Lee et al. (1995), que encontraram uma faixa de pH timo de 7,5

    a 8,5 para a leucina, cistena e dipeptidil IV aminopeptidases estudando

    Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae).

    FIGURA 4. pH timo da aminopeptidase do bicho-mineiro do cafeeiro

    A anlise do pH timo da -glicosidase do bicho-mineiro do cafeeiro

    demonstrou que a maior atividade desta enzima foi em pH igual a 6,0 (FIGURA

    5). Resultados obtidos por Franzl et al. (1989), estudando Zygaena trifolii

    0

    50

    100

    150

    6 7 8 9 10 11 12

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

    0

    50

    100

    150

    6 7 8 9 10 11

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 39

    (Esper, 1783) (Lepidoptera: Zygaenidae) (faixa de pH timo encontrada entre

    3,5 e 6,5) e por Santos & Terra (1986), analisando Erinnyis ello (Linnaes, 1758)

    (Lepidoptera: Sphingidae) (pH timo igual a 6,0), assemelham-se muito com o

    resultado obtido para o bicho-mineiro do cafeeiro.

    FIGURA 5. pH timo da -glicosidase do bicho-mineiro do cafeeiro

    Utilizando o substrato p-nitro-fenilfosfato, Srinivas et al. (2006)

    determinaram que o pH timo da fosfatase alcalina de Helicoverpa armigera

    (Hbner) (Lepidoptera: Noctuidae) igual a 10,5. Na FIGURA 6, pode-se

    observar a presena de duas enzimas responsveis pela retirada de grupos

    fosfato das molculas, sendo uma ativa em pH cido (5,5) e outra em pH

    alcalino (9,5). Esse resultado condiz com outras experincias realizadas

    utilizando-se outros lepidpteros, que por meio das quais detectaram-se a

    atividade de fosfatases cidas e alcalinas (Santos & Terra, 1984 e Terra et al.,

    1990 citados por Terra, 2005).

    0

    50

    100

    150

    2 3 4 5 6 7 8

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 40

    FIGURA 6. pH timo da fosfatase do bicho-mineiro do cafeeiro

    Agarwal (1987), estudando a sacarase de Sesamia inferens (Walker)

    (Lepidoptera: Noctuidae), determinou que o pH timo dessa enzima igual a

    6,2. Observou-se atividade tima da sacarase do bicho-mineiro do cafeeiro em

    pH igual a 6,5 (FIGURA 7).

    FIGURA 7. pH timo da sacarase do bicho-mineiro do cafeeiro

    Sumida et al. (1977), determinaram que o pH timo da trealase solvel

    no lmen de Bombix mori (Linneaus, 1758) (Lepidoptera: Bombycidae) igual a

    5,0, ao passo que o pH timo da trealase ligada membrana desse mesmo inseto

    0

    50

    100

    150

    4 5 6 7 8

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

    0

    50

    100

    150

    0 2 4 6 8 10 12

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 41

    6,0. No caso da anlise da trelase do bicho-mineiro do cafeeiro, observou-se

    um valor de pH timo igual a 6,0.

    FIGURA 8. pH timo da trealase do bicho-mineiro do cafeeiro

    A tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro indicou maior atividade em pH

    9,7 (FIGURA 9). Esse resultado condizente com o esperado, pois, de acordo

    com Santos et al. (1983), a digesto primria de protenas ocorre no lmen do

    intestino mdio, local onde o pH alcalino. Milne & Kaplan (1993), citados por

    Terra (1996), estudando Choristoneura fumiferana (Clemens) (Lepidoptera:

    Tortricidae), encontraram o valor de 9,5 para o pH timo da tripsina desse

    inseto.

    0

    50

    100

    150

    3 4 5 6 7 8

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 42

    FIGURA 9. pH timo da tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro

    O contedo intestinal de lagatas E. ello, de acordo com Santos et al.

    (1983), apresenta pH alcalino prximo de 9,0. Considerando a anlise dos

    resultados de pH timo das enzimas das lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro,

    infere-se que, da mesma forma que E. ello, o contedo intestinal desse inseto

    tambm seja alcalino, pois as enzimas do tipo despolimerases relacionadas com

    a digesto primria (tripsina e amilase) apresentaram um pH timo alcalino. As

    despolimerases so secretadas no lmen, a fim de iniciar a digesto, reduzindo o

    tamanho das molculas ingeridas na alimentao.

    As enzimas responsveis pela finalizao do processo de hidrlise, alm

    de poderem estar solveis no lmen, localizam-se presas ao glicoclice e ligadas

    s membranas das microvilosidases, locais onde o pH mais cido que no

    lmen do intestino mdio (Nation, 2002).

    Os valores de pH timo das enzimas analisadas responsveis pelo

    processo de digesto intermediria e final de carboidratos ( e glicosidases,

    sacarase, trealase) no bicho-mineiro do cafeeiro esto prximos da neutralidade

    ou levemente cidos. Santos (1985) ressalta que o pH da regio mais prxima ao

    tecido epitelial menos alcalino que o contedo endoperitrfico.

    020406080

    100120

    5 6 7 8 9 10 11 12

    pH

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 43

    Nakonieczny et al. (2006) relatam valores superiores de atividade das

    enzimas envolvidas na digesto intermediria e final (maltase, celobiase,

    trealase, sacarase e -glicosidase) no tecido epitelial do intestino mdio (local

    com pH menos alcalino) de Parnassius apollo (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera:

    Papilionidae) em relao ao contedo do intestino mdio (local mais alcalino).

    J no contedo do intestino mdio, esses autores encontraram maior atividade de

    amilase (envolvida na digesto primria) em relao atividade dessa enzima,

    determinada no tecido epitelial do intestino mdio.

    Dessa forma, analisando os valores de pH timo das enzimas digestivas

    avaliadas no bicho-mineiro do cafeeiro, pode-se sugerir que seu processo

    digestivo seja organizado de forma semelhante ao dos demais lepidpteros

    comparados; o alimento ingerido, passa pelo processo de digesto primria em

    um ambiente fortemente alcalino, pela ao de despolimerases (amilase e

    tripsina) e, em seguida, o alimento sofre os processos de digesto intermediria e

    final em ambientes menos alcalinos por ao de outras hidrolases ( e

    glicosidases, sacarase e trealase, por exemplo)

    3.2 Eletroforese do extrato enzimtico do bicho-mineiro do cafeeiro e

    revelao da atividade de tripsina

    Diferentemente da curva de pH timo, a revelao da atividade de

    tripsina das fraes obtidas a partir da eletroforese do extrato enzimtico do

    bicho-mineiro do cafeeiro indicou a presena de pelo menos duas enzimas do

    tipo tripsina atuantes sobre o substrato BapNA em pH= 9,7 (FIGURA 10).

    Paulillo et al. (2000) demonstraram um perfil eletrofortico semelhante para

    Spodoptera frugiperda (Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), com dois picos

    de atividades para enzima do tipo tripsina. Possivelmente, a curva de pH timo

    de tripsina (FIGURA 9) indicou a presena de apenas uma enzima, pelo fato de

    que as diferentes enzimas observadas em gel de eletroforese apresentem valores

  • 44

    de pH timo muito prximos ou at mesmo semelhantes, inferindo-se que as

    enzimas reveladas estejam relacionadas com a digesto de protenas no lmen

    do intestino mdio, local onde o pH alcalino. Estudos mais refinados precisam

    ser realizados para que se possa afirmar tal hiptese.

    FIGURA 10. Recuperao da atividade de tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro nas

    fraes de gel de poliacrilamida.

    3.3 Atividade das enzimas analisadas

    As enzimas do bicho-mineiro do cafeeiro foram analisadas em seus

    respectivos pHs timos e apresentaram atividades expressas em U (Mol de

    substrato hidrolisado ou produto formado/minuto), conforme TABELA 3.

    -50

    0

    50

    100

    150

    0 5 10 15 20 25 30 35 40

    Frao (2mm)

    % d

    e at

    ivid

    ade

  • 45

    TABELA 3. Atividade e atividade especfica das enzimas analisadas.

    Enzima EC (Moss, 2006) Atividade (U/g de inseto) -glicosidase 3.2.1.20 13,67 + 3,43 Amilase 3.2.1.1 2,21 + 0,12 Aminopeptidase 3.4.11.1 6,81 + 0,86 -glicosidase 3.2.1.21 0,38 + 0,16 Fosfatase cida 3.1.3.2 0,79 + 0,19 Sacarase 3.2.1.48 6,76 + 0,78 Trealase 3.2.1.28 2,21 + 0,44 Tripsina 3.4.21.4 0,70 + 0,099

    Pode-se observar, pela comparao dos resultados de atividade (U/g de

    inseto) obtidos para o bicho-mineiro do cafeeiro (TABELA 3) com os resultados

    obtidos por Santos et al. (1983), cujo alvo de estudo foi o lepidptero E. ello,

    que as atividades de todas as enzimas comparadas apresentaram valores

    superiores no bicho-mineiro do cafeeiro, com exceo da amilase, cujo valor de

    atividade maior em E. ello. As atividades obtidas por Santos et al. (1983)

    foram: -glicosidase (0,95 U/g de inseto), amilase (5,76 U/g de inseto),

    aminopeptidase (1,79 U/g de inseto), -glicosidase (0,25 U/g de inseto), trealase

    (0,33 U/g de inseto) e tripsina (0,0606 U/g de inseto). A converso da atividade

    de U/animal disponvel em Santos et al. (1983) para U/g de inseto pode ser feita

    de acordo com o trabalho de Terra et al. (1982), no qual est demonstrado que o

    peso mdio das lagartas utilizadas nos ensaios foi de 5 gramas. As diferenas nas

    atividades podem estar relacionadas com o teor de nutrientes da fonte de

    alimento ou em razo das necessidades fisiolgicas das lagartas.

  • 46

    4 CONCLUSES

    Pela anlise dos resultados de pH timo das enzimas das lagartas do

    bicho-mineiro do cafeeiro, sugere-se que, da mesma forma que a maioria dos

    lepidpteros, o contedo intestinal desse inseto tambm alcalino, pois as

    enzimas do tipo despolimerases analisadas relacionadas com a digesto primria

    (tripsina e amilase) apresentaram um pH timo alcalino.

    Os valores de pH timo das enzimas analisadas responsveis pelo

    processo de digesto intermediria e final de carboidratos ( e glicosidases,

    sacarase, trealase) no bicho-mineiro do cafeeiro so prximos da neutralidade ou

    levemente cidos.

    A atividade de tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro foi 11,55 vezes

    maior que a atividade de tripsina em E. ello. Com base nessa informao,

    verifica-se que o bicho-mineiro do cafeeiro apresenta uma grande necessidade

    da atuao de enzimas do tipo tripsina em seu processo digestivo.

  • 47

    5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

    ACEVEDO JARAMILLO, E. Aspectos basicos sobre morfologia y fisiologia de insectos. Manizales, Caldas: Universidad de Caldas, 1997. 293 p. AGARWAL, A. K. Effect of various factors on the activities of sucrase from the larvae of Sesamia inferens. Entomologia Experimentalis et Aplicatta, Dodrecht, v. 20, n. 1, p. 19-30, 1987. DAVIS, B. J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Annals of the New York Academy of Sciences, New York, v. 121, p. 404427, 1964. ERLANGER, B. F.; COHEN, W.; KOKOWSKY, N. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives Biochemistry and Biophyscs, San Diego, v. 95, n. 2, p. 271-278, 1961. FRANZL, S.; ACKERMANN, I.; NAHRSTEDT, A. Purification and characterization of a -glucosidase (linamarase) from the haemolymph of Zygaena trifolii Esper, 1783 (Insecta, Lepidoptera). Experientia, Basel, v. 45, n. 8, 1989. Lee, M. J.; ANSTEE, J. H. Characterization of midgut exopeptidase activity from larval Spodoptera littoralis. Insect biochemistry and Molecular Biology, Oxford, v. 25, n. 1, p. 63-71, Jan. 1995. MEYER, J. R. ENT 425 Home Page. Disponvel em: . Acesso em: 09 nov. 2006. MOSS, G. P. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Disponvel em: . Acesso em: 16 nov. 2006. NAGARAJU, J.; ABRAHAM, E. G. Purification and characterization of a digestive amylase from the tasar silkworm Antheraea mylitta (Lepidoptera: Saturniidae). Comparativa Biochemistry and Physiology B-Biochemistry Molecular Biology, Oxfford, v. 110, n. 1, p. 201-209, Jan. 1995. NAKONIECZNY, M.; MICHALCZYK, K.; KEDZIORSKI, A. Midgut glycosidases activities in monophagous larvae of Apollo butterfly, Parnassius

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  • 49

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  • 50

    CAPTULO II

    INIBIO DA TRIPSINA DE BICHO-MINEIRO DO CAFEEIRO E

    PURIFICAO DO INIBIDOR PRESENTE EM EXTRATOS DE FOLHAS

    DE MAMONA

  • 51

    RESUMO

    ROSSI, Guilherme Duarte. Inibio da tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro e purificao do inibidor presente em extratos de folhas de mamona. 2007. 50-68 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. Inibidores de tripsina representam uma estratgia de controle de insetos e, por isso, a identificao e caracterizao desses inibidores so etapas muito importantes para que novas formas de controle de pragas sejam desenvolvidas. Os inibidores de tripsina atuam na digesto primria de protenas e comprometem o processo digestivo por completo, reduzindo a disponibilidade de aminocidos ao inseto. A incorporao de inibidores de tripsina na dieta de insetos-praga uma forma de controle cuja eficcia foi verificada por diferentes autores. A fim de se observar a eficincia de extratos de folhas de mamona na inibio de enzimas do tipo tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro, conduziu-se em Lavras-MG um experimento com a finalidade de observar o fenmeno de inibio in vitro e iniciou-se um processo de purificao dessa molcula mediante precipitaes com sulfato de amnio e acetona, e em seguida, por meio de cromatografia de adsoro com posterior anlise em espectrmetro de massas. Pelos resultados obtidos, verificou-se presena de um inibidor de tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro nos extratos de folhas de mamona capaz de inibir 2,12 UTI/g de folhas frescas de mamona por grama de inseto, o que representa, aproximadamente 40% de inibio. Em testes realizados com tripsina bovina observou-se que o inibidor presente no extrato de folhas de mamona no apresenta poder de inibio sobre essa enzima. Os procedimentos de purificao e os tratamentos de fervura e fervura mais adio de -mercaptoetanol no extrato de folhas de mamona mostraram que o inibidor trata-se de uma molcula no-protica e termorresistente. _________________ Comit Orientador: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Orientador), - Dra. Maria das Graas Cardoso - UFLA e Dra. Angelita Duarte Corra - UFLA

  • 52

    ABSTRACT

    ROSSI, Guilherme Duarte. Coffee leaf miner trypsin inhibition and castor bean leaf extract inhibitor purification. 2007. 50-68 p. Dissertao (Mestrado em Agroqumica e Agrobioqumica) Federal University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.

    Trypsin inhibitors stand for a strategy of insect control and, therefore, the identification and characterization of these inhibitors are very important steps for new forms of pest control to be developed. Trypsin inhibitors act in the primary digestion of proteins and endanger the digestive process wholly, reducing the availability of aminoacids to the insect. The incorporation of trypsin inhibitors in the diet of pest insects is a control form whose efficacy was verified by different authors. In order to observe the efficiency of castor bean leaf extracts in inhibiting trypsin type enzymes of the coffee leaf miner, in Lavras-MG, an experiment was conducted with the purpose of observing an in vitro inhibition phenomenon and a purification process of this molecule through precipitations with ammonium sulfate and acetone was started, and next, through adsorption chromatography with later analysis in mass spectrometer. The reached results indicated the presence of a trypsin inhibitor of the coffee leaf miner in the castor bean leaf extracts, capable of inhibiting 2.12 UTI/g of fresh leaves per gram pf insect, which stands for about 40% of inhibition. Tests performed with bovine trypsin indicated that the inhibitor present in the castor bean leaf extract presents no inhibiting power on this enzyme. The purification procedures and the treatments of boiling and boiling plus addition of -mercaptoethanol in the castor bean leaf extract showed that the inhibitor is a non-protein and heat-resistant molecule. _________________ Guidance Committee: Dr. Custdio Donizete dos Santos - UFLA (Adviser), Dr. Maria das Graas Cardoso - UFLA and Dr. Angelita Duarte Corra - UFLA

  • 53

    1 INTRODUO

    A presena de metablitos secundrios com a funo de defesa em

    plantas um evento muito conhecido na natureza (Duke, 2007 e

    Hammerschmidt, 1999). Dessa forma, interessante detectar, isolar e

    caracterizar essas molculas de defesa presentes naturalmente nas plantas e

    utiliz-las no controle de pragas ou doenas que afetam a produo agrcola.

    Apesar de diversas molculas oriundas de plantas terem sido caracterizadas, o

    modo de ao de poucas conhecido (Lehane & Billingsley, 1996)

    Uma classe muito conhecida de compostos secundrios presentes em

    plantas so os inibidores de tripsina, uma serina protease relacionada com a

    digesto primria de protenas. Esses inibidores apresentam a propriedade de

    inibir enzimas relacionadas com a digesto protica e impedem que o organismo

    que os ingere tenha seu desenvolvimento adequado, podendo at mesmo

    interromper o ciclo de vida da espcie em questo (Lee et al., 1999, Mcmanus,

    1999 e Xu et al., 1996).

    Existem diversos tipos de inibidores de tripsina de natureza protica e

    esses so classificados de acordo com suas caractersticas em pelo menos 7

    famlias (Lehane & Billingsley, 1996). Mas existem tambm inibidores de

    tripsina de natureza no-protica, como o 4-(2-aminoetil) benzenosulfonil

    fluoreto hidrocloreto (Megyery et al., 2006) e o fenilmetilsulfonil fluoreto

    (Gomez-Cabronero et al., 2006).

    Objetivou-se com este trabalho confirmar a presena de um inibidor de

    tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro em extratos de folhas de mamona, verificar

    sua ao sobre a tripsina bovina e purificar esse inibidor de tripsina.

  • 54

    2 MATERIAL E MTODOS

    2.1 Preparo dos extratos de folhas de mamona (Ricinus communis)

    Para o preparo do extrato com inibidor, utilizaram-se folhas de mamona

    de uma espcie de ocorrncia espontnea no cmpus da UFLA denominada

    mamoninha de caule vermelho. Em testes nos quais se utilizaram outras

    cultivares, verificou-se que a mamoninha de caule vermelho foi a nica a

    apresentar inibio para a tripsina de lepidpteros (bicho-mineiro do cafeeiro, S.

    frugiperda e E. ello) e no inibir a tripsina bovina. Essa propriedade se faz muito

    importante e til para a incorporao desse inibidor em plantas de interesse

    comercial por meio do melhoramento de plantas.

    Foram coletadas folhas de tamanho e aspectos visuais

    padronizados, evitando-se folhas que apresentassem sinais de leses por

    pragas, doenas ou qualquer outro tipo de injria. Aps serem destacadas

    da planta, as folhas foram colocadas em uma caixa de isopor a 4C e

    transportadas at o Laboratrio de Bioqumica da UFLA, onde retiraram-

    se os pecolos e nervuras principais, cortando-as em pedaos de

    aproximadamente 1 cm2. Em seguida, macerou-se o material cortado

    utilizando-se um almofariz e um pistilo resfriados a 4C.

    Aps obter uma massa homognea, adicionou-se o meio de

    extrao (gua) resfriado a 4C, numa proporo definida em 1:3 (peso de

    folhas/volume de meio de extrao) e colocou-se para extrao do

    inibidor em um agitador orbital a 4C sob agitao de 150 rpm por 30

    minutos. Decorrido esse tempo, a amostra foi levada centrfuga por 10

    minutos, 4C e 10.000 x g. Aps a centrifugao, descartou-se o

    sedimento e armazenou-se o sobrenadante, que foi utilizado nos ensaios

    de inibio.

  • 55

    2.2 Ensaio de inibio da atividade da tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro

    A atividade do inibidor de tripsina foi determinada a pela comparao

    entre um ensaio cintico (com pelo menos 4 perodos de tempo) da atividade de

    tripsina (Erlanger et al., 1961) do bicho-mineiro na presena e ausncia do

    inibidor. Ensaios-controle, como o branco de substrato (atividade na ausncia de

    enzima e inibidor), branco de enzima (atividade na ausncia de substrato e

    inibidor), branco de inibidor (atividade na ausncia de substrato e enzima) e a

    atividade de tripsina no extrato de mamona foram realizados da mesma maneira

    que os tubos experimentais. Os resultados foram expressos em unidades de

    tripsina inibida (UTI), que consiste no desaparecimento da absoro de luz

    correspondente a 1 mol.L1 de p-nitroanilida (produto formado durante a

    atividade da tripsina sobre o substrato BapNA) durante 1 minuto de reao em 1

    g de folha de mamona fresca.

    A fim de se verificar a desnaturao do inibidor de tripsina presente nas

    folhas de mamona, foram realizados ensaios da tripsina de bicho-mineiro na

    presena de um extrato de folhas de mamona fervido durante cinco minutos,

    para verificar sua estabilidade quando submetido ao calor.

    Como os inibidores de tripsina proticos podem ser termorresistentes,

    outro tratamento foi realizado no extrato de folhas de mamona. Esse tratamento

    consistiu em adicionar beta mercaptoetanol 0,2% em soluo e posterior fervura

    por 5 minutos. Esse tratamento foi realizado para verificar a desnaturao do

    inibidor de tripsina devido ao rompimento de pontes dissulfeto que poderiam

    conferir resistncia trmica ao inibidor.

    2.3 Ensaio de inibio da atividade da tripsina bovina

    Testes com tripsina bovina purificada do fabricante MERCK (4

    mg/200mL HCl 0,001 N) foram realizados da mesma forma que o ensaio

    descrito no item 2.2, mas em pH=7,0.

  • 56

    Esses testes foram realizados para se verificar a ao do inibidor de

    tripsina encontrado nas folhas de mamona sobre a tripsina de mamferos.

    2.4 Extrao de enzimas digestivas de Spodoptera frugiperda

    Como as lagartas do bicho-mineiro do cafeeiro eram de difcil obteno,

    utilizaram-se lagartas de S. frugiperda, a fim de se testar a ao inibitria do

    extrato de folhas de mamona sobre sua tripsina.

    As lagartas foram coletadas em campo e colocadas sob gelo picado at

    ficarem imveis (aproximadamente 10 minutos). Cortaram-se a cabea e o nus

    de cada lagarta e, com o auxlio de pinas, estiletes e tesouras, retiraram-se seus

    tegumentos, deixando apenas seus intestinos. Separou-se o intestino mdio,

    descartando-se os intestinos anterior e posterior.

    O intestino mdio foi macerado em homogeneizador do tipo Potter na

    proporo de 1 intestino mdio de S. frugiperda para 4 mL de gua a 4C. Aps

    macerao, filtrou-se o homogeneizado em tela de nylon de 100 m. Essa

    soluo constituiu o extrato enzimtico de S. frugiperda, utilizado como modelo

    nos ensaios de inibio de tripsina.

    2.5 Purificao do inibidor

    A purificao iniciou-se com procedimentos mais simples e massais,

    como precipitao por sulfato de amnio e por acetona, pois acreditava-se que o

    inibidor em questo era de natureza protica, fato mais comum entre os

    inibidores de tripsina encontrados em plantas. Aps verificar que o inibidor no

    era de natureza protica, adotou-se um mtodo de cromatografia de adsoro.

  • 57

    2.5.1 Precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com

    sulfato de amnio

    Utilizou-se sulfato de amnio saturado (soluo 100%) a 4C na

    proporo de 80% em soluo em relao ao volume de extrato de mamona

    utilizado. Aps precipitao, centrifugaram-se as solues de extrato de mamona

    mais sulfato de amnio a 10.000 x g, por 10 minutos e a 4C. Descartou-se, em

    seguida, o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em um volume de gua a

    4C, igual ao volume inicial de extrato de folhas de mamona inicialmente

    colocado na soluo com sulfato de amnio.

    2.5.2 Precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com

    acetona

    A precipitao com acetona procedeu-se da mesma maneira que a

    precipitao com sulfato de amnio (item 2.5.1), porm, utilizando-se acetona a

    20C e variando a proporo dessa de 10% a 80% em soluo. O sedimento foi

    ressuspenso no mesmo volume de extrato e o sobrenadante foi evaporado em

    banho-maria a 37C e ressuspenso em gua no volume inicial de extrato de

    folhas de mamona colocado na soluo com acetona a 20C, a fim de verificar

    a presena do inibidor nesta frao.

    2.5.3 Liofilizao das folhas de mamona

    Para o preparo da amostra colocada na coluna de cromatografia de

    adsoro, as folhas de mamona foram liofilizadas em Liofilizador Labconco

    Freeze Dry System/Freezone 4,5 at massa constante.

    Aps a liofilizao, as folhas foram modas utilizando almofariz e

    pistilo. O p de folhas de mamona obtido aps macerao foi armazenado em

    recipiente de vidro hermeticamente fechado e protegido da luz sob temperatura

  • 58

    ambiente, at as anlises. O processo de liofilizao indicou uma umidade mdia

    de 70% nas folhas de mamona.

    2.5.4 Montagem de uma coluna de cromatografia de adsoro

    Utilizou-se uma coluna de vidro de 50 cm de comprimento e 2,5 cm de

    dimetro. A slica utilizada foi Kieselgel 60 (0,040 0,063 mm; 230-400 mesh)

    do fabricante Merck.

    A coluna foi preenchida com uma mistura pastosa composta por slica e

    clorofrmio P.A. Essa pasta foi colocada na coluna tomando-se o cuidado para

    no formar bolhas. Acima da slica, adicionou-se terra diatomcea e, finalmente,

    acoplou-se uma bomba de presso ao topo dessa coluna.

    A amostra aplicada na coluna foi preparada adicionando-se 5 mL de

    metanol P.A. a 1 g de folhas de mamona liofilizadas, deixando a extrao do

    inibidor ocorrer por 30 minutos em um agitador orbital a 150 rpm. Filtrou-se

    essa soluo em papel de filtro e aplicou-se 1 mL desse extrato metanlico na

    coluna.

    A srie eluotrpica utilizada foi a seguinte: hexano, diclorometano,

    acetato de etila, etanol e metanol.

    As fraes coletadas tinham um volume aproximado de 100 mL e a troca

    de solventes ocorreu pela observao de manchas na coluna. Coletaram-se as

    diferentes manchas formadas de acordo com a eluio dos diferentes solventes

    em recipientes distintos.

    2.5.4 Rotoevaporao das fraes

    Observou-se que o volume das fraes obtidas na cromatografia era

    muito grande e possivelmente o inibidor estaria muito diludo, inviabilizando

    sua deteco. Dessa maneira, rotoevaparam-se as fraes obtidas at que o

  • 59

    solvente da frao em questo fosse totalmente evaporado. Ressuspendeu-se o

    remanescente com 5 mL do solvente em questo, a fim de concentrar a frao.

    Utilizaram-se as seguintes temperaturas de ebulio: hexano = 69C;

    diclorometano = 40C; acetato de etila = 77C; etanol = 78C; metanol = 65C.

    2.5.5 Teste de inibio das fraes obtidas na cromatografia de adsoro

    As fraes obtidas em solventes apolares (hexano, diclorometano e

    acetato de etila) foram particionadas em gua (5 mL) e utilizou-se a fase aquosa

    nos ensaios de inibio, pois, por experincias anteriores (dados no

    publicados), verificou-se que o inibidor apresenta grande afinidade por gua e

    outros solventes polares. J as fraes ressuspensas em etanol e metanol foram

    utilizadas diretamente nos ensaio de inibio, realizando ensaios-controle na

    presena de metanol e etanol.

    2.5.6 Espectrometria de massas das fraes obtidas na cromatografia de

    adsoro

    A fim de se identificar qual molcula era responsvel pela inibio da

    tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro, realizou-se a espectrometria de massas de

    fraes que no inibiam a tripsina e de fraes que inibiam a tripsina.

    A espectrometria de massas foi realizada pelos processos Foto-Fenton e

    UV/H2O2 e foram analisados por LC/MS Trap (Agilent-1100). As amostras

    foram ionizadas com tampo formato de amnio pH 5,5 e inseridas no aparelho

    por infuso a um fluxo de 5 L/min, com controle de carga no quadropolo (ICC)

    ajustado para 30000. A temperatura do gs de secagem (N2) foi de 325C e fluxo

    de 4 L min-1, com potencial de extrao de ons de -3500 V.

    Esperava-se, com essa comparao, indicar a molcula responsvel pela

    inibio mediante observao da presena da mesma molcula nas fraes que

    inibiam a tripsina e sua ausncia nas fraes que no inibiam.

  • 60

    3 RESULTADOS E DISCUSSO

    3.1 Anlise da inibio da tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro, de S.

    frugiperda e bovina por extratos de folhas de mamona

    Utilizando o extrato de folhas de mamona, pde-se observar a eficincia

    desse para inibir a tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro (FIGURA 11). O

    inibidor presente no extrato de folhas de mamona foi capaz de inibir a atividade

    da tripsina do bicho-mineiro do cafeeiro, em mdia, 2,12 UTI/g de folhas frescas

    de mamona. Em termos percentuais, essa inibio representa aproximadamente

    42% (FIGURA 12).

    FIGURA 11. mU de tripsina por grama de inseto de bicho-mineiro na ausncia e presena de extrato de folhas de mamona.

    Mdia e desvios-padro obtidos com trs repeties.

    0

    100

    200

    300

    400

    500

    600

    1

    mU

    /g d

    e in

    seto

    Sem inibidor Com inibidor

  • 61

    Os tratamentos que consistiam em ferver o extrato de folhas de mamona

    na presena e ausncia de beta-mercaptoetanol 0,2%, a fim de se desnaturar o

    inibidor indicaram que a inibio se manteve mesmo aps os tratamentos.

    Com tais resultados,verifica-se que o inibidor de tripsina presente nas

    folhas de mamona seja uma molcula no-protica, pois o tratamento com beta-

    mercaptoetanol 0,2% suficiente para desnaturar todas as protenas do extrato,

    mesmo as termoresistentes. Caso o inibidor fosse protico, esse se desnaturaria e

    perderia sua funo, no sendo possvel observar a inibio nos extratos fervidos

    e fervidos com adio de beta-mercaptoetanol 0,2%.

    O mesmo comportamento de inibio de tripsina pode ser observado

    para o lepidptero S. frugiperda, cuja tripsina foi inibida em 414,01 + 135,11

    UTI/g de folha de mamona.

    Esse valor representa aproximadamente 40% da tripsina de S. frugiperda

    inibida e muito semelhante ao valor obtido para o bicho-mineiro do cafeeiro

    (FIGURA 12). A lagarta S. frugiperda foi utilizada como inseto-modelo para

    recuperao da atividade de tripsina nas fraes obtidas na cromatografia de

    adsoro.

    J o teste de inibio de tripsina realizado com tripsina bovina na

    presena do extrato de folhas de mamona indicou que esse no apresenta

    propriedade inibitria sobre essa enzima, pois sua atividade foi recuperada em

    100% nos ensaios de inibio (FIGURA 12).

  • 62

    FIGURA 12. Porcentagem de atividade de tripsina recuperada nos ensaios de tripsina bovina, bicho-mineiro do cafeeiro e S. frugiperda na presena de extratos de folhas de mamona.

    Mdias e desvios padro obtidos com trs repeties.

    3.2 Precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com sulfato

    de amnio

    Aps a precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com

    sulfato de amnio saturado na proporo de 80% em soluo, verificou-se que a

    recuperao da atividade de tripsina de bicho-mineiro na presena do sedimento

    ressuspenso em gua foi de 90%. Desse modo, pode-se concluir que o inibidor

    no est acompanhando as protenas que sedimentam na presena do sulfato de

    amnio na proporo de 80% em soluo.

    3.3 Precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com acetona

    A precipitao das protenas do extrato de folhas de mamona com

    acetona a -20C, variando a proporo de acetona de 10% a 80% em soluo,

    indicou que o inibidor no apresenta as mesmas caractersticas das protenas

    com relao precipitao.

    020406080

    100120

    1% d

    e at

    ivid

    ade

    recu

    pera

    da

    Bovina Bicho-mineiro S. frugiperda

  • 63

    Nas faixas de precipitao nas quais se esperava menor quantidade de

    protenas (sedimento de 10, 20, 30, 40 e 50% de acetona 20C em soluo),

    verificou-se maior inibio (FIGURA 13), ao passo que nas faixas de

    precipitao onde se esperava maior quantidade de protenas (sedimento de 60,

    70, 80%) verificou-se uma menor inibio da tripsina. A anlise de inibio no

    sobrenadante mostrou que, conforme se aumenta a proporo de acetona 20C

    em soluo, maior a capacidade deste solvente solubilizar o inibidor (FIGURA

    13).

    FIGURA 13. Atividade da tripsina de S. frugiperda (mU/inseto) no sedimento e no sobrenadante do extrato de folhas de mamona fracionado em diferentes propores de acetona 20C e no controle (extrato de folhas de mamona no fracionado). Mdias obtidas com trs repeties.

    3.4 Anlise da inibio das fraes obtidas na cromatografia de adsoro

    Ao se realizar o teste de inibio de tripsina na presena das fraes

    provenientes dos solventes apolares hexano (fraes 1, 2, 3 e 4) e diclorometano

    (fraes de 5, 6, 7, 8 e 9), no se observou a propriedade de inibio de tripsina

    0

    50

    100

    150

    200

    250

    300

    0 20 40 60 80 100

    % de acetona em soluo

    mU

    /inse

    to

    Sobrenadante Sedimento Controle

  • 64

    de S. frugiperda (enzima-modelo de mesmo comportamento da tripsina do

    bicho-mineiro do cafeeiro, conforme FIGURA 12). Porm, ao se realizar o teste

    de inibio da tripsina com as fraes cujo eluente utilizado foi o acetato de

    etila, pde-se diagnosticar a propriedade de inibio nas fraes 10, 11 e 12,

    mas, na frao 13 do mesmo eluente, no se pde observar o mesmo

    comportamento. A partir da frao 14 (eluio com etanol), outro pico de

    inibio de tripsina foi diagnosticado, sugerindo que podem existir duas

    molculas diferentes envolvidas no processo de inibio (FIGURA 14).

    Para verificar a estabilidade da molcula de inibidor de tripsina presente

    nas fraes, realizou-se um teste de inibio de tripsina aps 7 dias em relao

    ao primeiro teste. Como pode ser observado na FIGURA 14, o mesmo perfil de

    inibio de tripsina foi verificado aps decorrido o tempo de avaliao. No se

    testou a inibio de tripsina aps 7 dias utilizando-se as fraes anteriores

    dcima, pois pde-se verificar que o inibidor de tripsina presente em extratos de

    folhas de mamona no tem afinidade por solvente apolares. Esse fato pode ser

    sustentado pelos dados no publicados (testes com extrao do inibidor em gua,

    etanol e metanol e partio com ter), que mostram que o inibidor de tripsina em

    questo apresenta grande afinidade por solventes polares em detrimento de

    solventes apolares.

  • 65

    FIGURA 14. UTI (S. frugiperda) por grama de folha de mamona na presena das fraes imediatamente aps obteno e aps 7 dias. 3.5 Espectrometria de massas das fraes obtidas

    Na tentativa de se obter o peso molecular da substncia responsvel pela

    inibio da tripsina dos insetos utilizados, uma espectrometria de massas das

    fraes obtidas na cromatografia de adsoro foi realizada. Comparaes

    realizadas entre as fraes que apresentavam o poder de inibio de tripsina

    (fraes 10, 11, 12, 14 e 15) com a frao que no apresentava o poder de

    inibio (frao nmero 13) no puderam sugerir o peso da molcula

    responsvel pela inibio de tripsina presente no extrato de folhas mamona.

    -15

    -5

    5

    15

    25

    35

    45

    0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

    Fraes

    UT

    I/g

    de f

    olha

    fre

    sca

    de m

    amon

    a

    0 dias Aps 7 dias

  • 66

    4 CONCLUSES

    O inibidor de tripsina presente no extrato de folhas de mamona

    apresentou propriedades de inibio de tripsina de lepidpteros (bicho-mineiro

    do cafeeiro e S. frugiperda), mas no foi capaz de inibir a tripsina bovina.

    O inibidor de tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro encontrado nas

    folhas de mamona uma molcula no-protica e termorresistente.

    Os processos de purificao e deteco de massa molecular

    adotados no puderam sugerir o peso da molcula responsvel pela

    inibio de tripsina.

    Mtodos cromatogrficos com melhor poder de separao precisam ser

    realizados para, posteriormente, efetuar outros processos de identificao da

    molcula em questo.

  • 67

    5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

    DUKE, S. O. Natural pesticides from plants. Disponvel em: . Acesso em: 23 jan. 2007. ERLANGER, B. F.; COHEN, W.; KOKOWSKY, N. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives Biochemistry and Biophyscs, San Diego, v. 95, n. 2, p. 271-278, 1961. GOMEZ-CABRONERO, J. et al. Actions of protease inhibitor phenylmethylsulfonil fluoride on neutrophil granule enzyme secretion and superoxide production induced by fMet-Leu-Phe and phorbol 12-myristate-13-acetate. Disponvel em: . Acesso em: 27 nov. 2006. HAMMERSCHMIDT, R. Phytoalexins: What HaveWe Learned After 60 Years? Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 37, p. 285306, 1999. LEE, S. I.; LEE, S. H.; KOO, J. C.; CHUN, H. J.; LIM, C. O.; MUN, J. A.; SONG, Y. H.; CHO, M. J. Soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) confers resistance to the brown planthopper (Nilaparvata lugens Staal) in transgenic rice. Molecular Breeding, Dordrecht, v. 8, n. 1, p.1-9, 1999. LEHANE, M. J.; BILLINGSLEY, P. F. (Ed.). Biology of the insect midgut. London: Chapman and Hall, 1996. 486 p. MCMANUS, M. T.; BURGESS, E. P. J.; PHILIP, B.; WATSON, L. M.; LAING, W. A.; VOISEY, C. R.; WHITE, D. W. R. Expression of the soybean (Kunitz) trypsin inhibitor in transgenic tobacco: effects on larval development of Spodoptera litura. Transgenic Research, Dordrecht, v. 8, n. 5, p. 383-395, Oct. 1999. MEGYERY, P et al. 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride attenuates tumor necrosis-factor--induced blood brain barrier oppening. Disponvel em: . Acesso em: 27 nov. 2006. XU, D. P.; XUE, Q. Z.; McELROY, D.; MAWAL, Y.; HILDER, V. ; WA, T. Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene, CpTi, transgenic rice

  • 68

    plants confers resistance to two major rice insects pests. Molecular Breeding, Dordrecht, v. 2, n. 2, p. 167-173, 1996.

  • 69

    5 CONCLUSES GERAIS

    No presente estudo, pde-se inferir que o ambiente digestivo do bicho-

    mineiro do cafeeiro semelhante ao dos demais lepidpteros, j que os valores

    de pH timos encontrados so muito parecidos com os valores encontrados para

    outros lepidpteros.

    Observou-se a inibio da tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro em

    aproximadamente 42% por um inibidor no-protico e termorresistente.

    6 PERSPECTIVAS

    A utilizao desse inibidor de tripsina de bicho-mineiro do cafeeiro em

    folhas de mamona pode futuramente se consolidar em uma opo para que se

    realize o controle dessa praga mediante a incorporao desse inibidor numa

    planta de caf utilizando tcnicas de alterao molecular de plantas.

    Dessa forma, o isolamento e a caracterizao desse inibidor de tripsina

    so necessrios para que os estudos sobre essa possibilidade avancem.

  • 70

    7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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