banca examinadora -...
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UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
LUCIANE RECHE DE MORAES GERASSI
NANOEMULSÃO CONTENDO OS FÁRMACOS MILTEFOSINA E TAMOXIFENO COM POSSÍVEL APLICAÇÃO PARA TRATAMENTO DA
LEISHMANIOSE
SÃO PAULO
2016
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MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
LUCIANE RECHE DE MORAES GERASSI
NANOEMULSÃO CONTENDO OS FÁRMACOS MILTEFOSINA E TAMOXIFENO COM POSSÍVEL APLICAÇÃO PARA TRATAMENTO DA
LEISHMANIOSE
Dissertação apresentada à
Universidade Anhanguera de São
Paulo, como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre em
Farmácia, na Área de Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos.
Orientadora: Profa. Dra. Susana
Nogueira Diniz.
Coorientadora: Profa. Dra. Claudete
Justina Valduga.
SÃO PAULO
2016
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BANCA EXAMINADORA
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Dedicatória
Dedico este trabalho ao meu esposo Renato Gerassi, aos meus mestres que sem
eles não chegaria até aqui. Principalmente a minha querida Profa. Dra. Claudete
Justina Valduga, aos meus colegas de laboratório, Maria Aparecida dos Santos e
Willian Rodrigues Ribeiro.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço ao nosso criador, pela oportunidade de concluir mais uma
importante etapa da minha vida. Depois ao meu esposo, Renato Gerassi,
companheiro em todos os momentos, sempre me deu forças.
Agradeço a todos os meus professores do mestrado, especialmente à minha amiga
e coorientadora Profa. Dra. Claudete Justina Valduga, por ter gentilmente cedido sua
ideia de pesquisa, pela paciência e horas de dedicação que para sempre ficará
guardado em meu coração.
Agradeço aos meus colegas de laboratório, a Ms. Maria Aparecida dos Santos que
ofereceu seu tempo com muita dedicação me auxiliando na realização dos
experimentos e ao Willian Rodrigues Ribeiro que foi presente nos momentos que
precisei.
Agradeço a minha orientadora Profa. Dra. Susana Nogueira Diniz, que quando tudo
parecia sem saída ela segurou em minhas mãos e me pôs diante de uma porta
aberta.
Minha eterna gratidão a todos.
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O Conhecimento Liberta o Homem. Autor desconhecido
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RESUMO
GERASSI, L. R. M. Nanoemulsão contendo os fármacos miltefosina e tamoxifeno com possível aplicação para tratamento da leishmaniose. 71p. Dissertação de mestrado – Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Anhanguera de São Paulo, 2016.
A nanotecnologia farmacêutica vem sendo ativamente estudada com propósito de direcionar e controlar a liberação de fármacos. Além de proteger o fármaco contra degradação e o possível direcionamento do princípio ativo ao sítio específico, os nanossistemas de liberação controlada de fármacos apresentam várias vantagens em relação aos sistemas convencionais, tais como: diminuição da dose terapêutica, maior intervalo de administração, melhora da aceitação terapêutica por parte do paciente, melhor absorção do ativo. Um dos principais problemas relacionados ao tratamento da leishmaniose é a toxicidade, os efeitos colaterais são muito acentuados e a utilização dos medicamentos é difícil, pois são injetáveis e na maioria das vezes é necessária a internação, dificultando aos pacientes a adesão ao tratamento. A proposta desta pesquisa é associar os fármacos leishmanicidas com diferentes mecanismos de ação, e melhorar a eficácia dos fármacos já existentes, com a expectativa de se obter resultados mais satisfatórios que as terapias convencionais. Foram veiculados em nanoemulsões lipídicas os ativos miltefosina com o tamoxifeno. Os resultados mostraram que a emulsão controle (Branco) apresenta uma aparência leitosa, já nas formulações com os fármacos há uma coloração branco-acinzentado quase transparente característica da nanoemulsão. Em relação à estabilidade, as emulsões não apresentaram alterações macroscópicas, se sustentaram estáveis, não ocorreu formação de precipitado, continuaram com aspecto claro e transparente, o pH se manteve durante o tempo analisado (pH= 4,6), comprovando que não houve oxidação dos componentes da fase oleosa. A medida do tamanho das partículas mostrou que todas as formulações apresentam características de tamanho nanométricos (< 100nm). O valor da polidispersidade ao longo do período analisado não houve alteração, se conservou próximo dos resultados iniciais em todas as formulações. Os resultados dos testes de estabilidade em fluídos gastrointestinais simulados foi estável e a avaliação in vitro do potencial hemolítico mostrou que o encapsulamento dos fármacos reduziu o potencial hemolítico da miltefosina. Neste estudo as nanoemulsões lipídicas contendo miltefosina e tamoxifeno apresentaram boa estabilidade, mostrando ser possível obter formulações estáveis com os diferentes fármacos associados e em temperatura variadas.
Palavras-chave: Nanotecnologia. Nanoemulsões lipídicas. Miltefosina. Tamoxifeno.
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ABSTRACT
GERASSI, L. R. M. Nanoemulsion containing the drug miltefosine and tamoxifen with possible application to treatment of leishmaniasis. 71p. Dissertação de mestrado – Mestrado Profissional em Farmácia, Universidade Anhanguera de São Paulo, 2016. Pharmaceutical nanotechnology has been actively studied with the purpose to direct and control the drugs release. In addition to protecting the drug against degradation and potential targeting the active ingredient to specific site, the controlled drug release of nano-systems has several advantages over conventional systems, such as: reduction of therapeutic dose, increase the range of time administration, improving therapeutic patient acceptance and absorption of the active. One of the main problem related to leishmaniasis treatment is drug toxicity, leading to several side effects to patients. Also, the difficulty of anti leishmanial drugs administration that requires patient hospitalization significantly decreases treatment adherence. The proposal of this study is to associate anti leishmanial drugs with different mechanisms of action, and improve the effectiveness of existing drugs, with the expectation of obtaining more satisfactory results than conventional therapies. Were formulated the drugs miltefosine and tamoxifen in nanolipid emulsion. The results showed that the control emulsion (white) has a milky appearance, however, the formulation containing the drugs has a white-gray, almost transparent, feature. Regarding stability, both formulations did not present macroscopic alterations, precipitation and maintained a clear and transparent aspect. Also the formulations pHs remained unaltered (pH = 4.6) during the time analyzed, suggesting that oxidation of the oily phase components did not occur. The measurement of the particle size showed that all formulations presented nanometric size (< 100nm). The value of the polidispersity did not change over the time analysed. The behavior of formulations in gastrointestinal fluids demonstrated stability without degradation and the in vitro evaluation of hemolytic activity showed that the drug encapsulation in nanoemulsions significantly reduced the hemolytic activity of miltefosine. In this study the lipid nanoemulsions containing miltefosine and tamoxifen showed satisfatory stability at different temperature, showing that it is possible to obtain stable formulations with the association of drugs with adverse action mechanism Keywords: Nanotechnology. Lipid Nanoemulsions. Miltefosine. Tamoxifen.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação de uma escala manométrica 17
Figura 2 - Representação esquemática de um lipossoma 20
Figura 3 - Representação de uma nanopartícula lipídica sólida 21
Figura 4 - Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas 23
Figura 5 - Representação de uma partícula de nanoemulsão 25
Figura 6 - Fêmea Flebotomíneo 27
Figura 7 - Ciclo Parasitário da Leishmaniose 28
Figura 8 - Criança com leishmaniose visceral 29
Figura 9 - Casos confirmados de leishmaniose visceral nas regiões Brasileira de
2000 a 2013 30
Figura 10 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil de 1990 a
2013 32
Figura 11 - Leishmaniose mucocutânea 33
Figura 12 - Leishmaniose Cutânea 34
Figura 13 - Leishmaniose difusa 34
Figura 14 - Estrutura química do Antimoniato de meglumina 36
Figura 15 - Estrutura química da Anfotericina B 37
Figura 16 - Estrutura química do Isotionato de pentamidina 38
Figura 17 - Estrutura química da molécula de miltefosina 40
Figura 18 - Estrutura química da molécula de tamoxifeno 41
Figura 19 - Fluxograma representando as etapas para preparo das
nanoemulsões 48
Figura 20 - Nanoemulsão com diferentes concentrações de miltefosina e
tamoxifeno em 20ml de formulação 52
Figura 21 - Representação gráfica do tamanho das partículas das emulsões no dia
do preparo das emulsões e após 15 dias sob refrigeração e em temperatura
ambiente 54
Figura 22 - Dimensionamento de partículas das nanoemulsão com diferentes
concentrações de fármacos e controle (sem fármaco) no fluido gástrico simulado
pepsina e fluido intestinal simulado pancreatina 57
Figura 23 - Quantificação de hemólise de eritrócitos do sangue humano em função
da concentração de Miltefosina 58
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01- Diferentes concentrações de miltefosina e tamoxifeno nas
nanoemulsões............................................................................................................52
Tabela 02 – Tamanho das partículas com diferentes concentrações de miltefosina e
tamoxifeno..................................................................................................................54
Tabela 03 – Média da polidispersidade com diferentes concentrações de fármacos
....................................................................................................................................55
Tabela 04 – Potencial Zeta com diferentes concentrações de miltefosina e
tamoxifeno..................................................................................................................56
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LISTA DE ABREVIATURAS HIV Vírus da imunodeficiência adquirida IM Intramuscular IV Intravenosa KHz Quilohertez Mt. Miltefosina mV Milivolts nm Nanômetro OMS Organização Mundial da Saúde PBS Tampão Fosfato Salino PSI Libra por polegada quadrada pH Potencial Hidrogeniônico RNA Ácido Desoxirribonucleico Rpm Rotação por Minuto Tm. Tamoxifeno USP United States Pharmacopeia UV-VIS Ultravioleta Visível W Watt
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO………...………………...….................................................... 14
2 REVISÃO DE LITERATURA...............…………......................................…. 17
2.1 NANOTECNOLOGIA............................................................................. 17
2.1.1 Lipossomas............................................................................... 19
2.1.2 Nanopartículas Lipídicas Sólidas.............................................. 21
2.1.3 Nanopartículas Poliméricas...................................................... 22
2.1.4 Nanocristais.............................................................................. 23
2.1.5 Nanoemulsões.......................................................................... 24
2.2 LEISHMANIOSE.....................................................................................
2.2.1 Leishmaniose Visceral................................................................
2.2.2 Leishmaniose Tegumentar Americana.......................................
2.2.3 Terapêutica da Leishmaniose....................................................
2.2.4 Alternativa para o tratamento da Leishmaniose.........................
2.2.4.1 Miltefosina.......................................................................
2.2.4.2 Tamoxifeno......................................................................
26
29
31
35
39
39
41
3 OBJETIVO............................................................................................. 44
3.1 Objetivos Específicos............................................................................. 44
4 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 45
4.1 Material................................................................................................... 45
4.2 Equipamento........................................................................................... 45
4.2.1 Homogeneizador de alta pressão............................................. 45
4.2.2 Processador ultrassônico.......................................................... 45
4.2.3 Espalhamento de luz dinâmico................................................. 46
4.2.4 Espectrofotômetro de UV-Visível.............................................. 46
13
4.2.5 Outros aparelhos....................................................................... 46
4.3 Preparação das nanoemulsões.............................................................. 47
4.4 Estabilidade das formulações................................................................. 49
4.4.1Tamanho de partícula, polidispersidade, potencial zeta e pH... 49
4.5 Estabilidade em Fluídos Gastrointestinais Simulado.............................
4.6 Teste de Hemólise in vitro......................................................................
49
50
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 51
6 CONCLUSÃO............................................................................................... 60
REFERÊNCIAS…………………………………………………….……….…… 61
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1 INTRODUÇÃO
A nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar que permite o
desenvolvimento de sistemas com tamanho na escala nanométrica. Nessa escala,
átomos e moléculas são manipulados para criação de nanoestruturas úteis para
distintas aplicações. A nanociência tem avançado rapidamente nos últimos anos, e
vem sendo aplicada nos mais variados setores industriais (TEIXEIRA et al., 2014).
Na área da saúde a nanomedicina que é a denominação dada à junção da
medicina e da nanotecnologia, vem sendo aplicada para melhorar tanto o
diagnóstico como o tratamento, isso permite que o paciente tenha um diagnóstico
precoce, preciso e com alta sensibilidade, e através da entrega de drogas, um
tratamento terapêutico de forma mais eficaz e pontual, minimizando os riscos para o
organismo do paciente (CANCINO; MARANGONI; ZUCOLOTTO, 2014).
A nanotecnologia farmacêutica é uma das áreas que vem apresentando
crescente evolução, está relacionada com o desenvolvimento, caracterização e
aplicação de novos sistemas de liberação de fármacos em escala nanométrica,
tendo em vista as vantagens que apresentam em relação à liberação convencional
(MELO et al., 2010).
Cerca de 40% das moléculas farmacologicamente ativas descobertas não
chegam ao mercado devido a problemas farmacológicos, relacionados
principalmente à biodisponibilidade e solubilidade reduzida. Por isso, um número
significante de nanocarreadores de fármacos foi desenvolvido pela indústria
farmacêutica, para contornar tais problemas e melhorar a efetividade de fármacos já
utilizados na terapêutica convencional (ARAÚJO; ANDRADE; ROLIM, 2014).
Os nanossistemas carreadores de drogas farmacêuticas levam a substância
ativa imobilizada, absorvida, ligada, dissolvida ou encapsulada na nanopartícula,
permitindo o controle preciso sobre a liberação da droga (MELO et al., 2010).
Dentre os inúmeros nanocarreadores de fármacos está a nanoemulsão, que
consiste em um sistema preparado a partir de água, óleo e tensoativo (BRUXEL et
al., 2012). As principais vantagens da nanoemulsão como veículo de distribuição de
drogas ficam na competência para dissolver grandes quantidades de fármacos de
baixa solubilidade, na capacidade de proteção do fármaco contra degradação
enzimática, e na biocompatibilidade de seus componentes (JAISWAL; DUDHE;
SHARMA, 2015). Nanoemulsões contendo partículas menores que 100nm
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apresentam melhor interação celular, proporcionam estabilidade e maior
transparência, dificultando a ocorrência de coalescência (separação das fases)
(ASSIS et al., 2012; MATTOS et al., 2015). Também tem o benefício de ser um
sistema termodinâmico estável (JAISWAL; DUDHE; SHARMA, 2015).
A leishmaniose é uma doença infecciosa não contagiosa, causada por
parasita do gênero Leishmania, protozoário pertencente à família
Trypanosomatídae, possui duas formas, a flagelada ou promastigota encontrada no
tubo digestivo do inseto (hospedeiro invertebrado) e a forma aflagelada ou
amastigota, encontrada no interior dos macrófagos nos mamíferos em geral
(hospedeiro vertebrado). Essa doença é transmitida pela picada do flebotomíneo,
mosquito (fêmea hematófago), popularmente conhecido como mosquito palha ou
birigui (NEVES, D., et al., 2011).
A leishmaniose é uma doença com ampla variedade de sintomas clínicos,
pois resulta de diferentes espécies de Leishmania. Podendo se manifestar na forma
visceral, cutânea, mucocutânea e difusa (WHO, 2010).
A forma visceral, também conhecida como calazar, ataca órgãos internos
(fígado, baço e medula óssea), é a forma mais grave da doença, caso não tratado é
fatal em até dois anos. Além disso, certa porcentagem dos casos pode evoluir para
uma disseminação de parasitas na pele (BRASIL, 2014).
Já a forma cutânea é a mais comum, provoca úlcera no rosto, nos braços e
pernas. Essas úlceras podem se curar espontaneamente, mas deixam cicatrizes
graves e permanentes. A forma mais desfiguradora é a mucocutânea, onde as
leismanias atingem nariz, boca e garganta, causando mutilações graves. A difusa é
uma forma clínica rara, porém grave, em que o individuo não consegue gerar uma
resposta imunológica adequada para a eliminação do parasita, formando lesões
nodulares ou em placas, cobrindo grandes extensões do corpo com grande
quantidade de leishmanias nas lesões (BRASIL, 2013).
Doenças consideradas negligenciadas pela organização mundial da saúde,
pois atingem áreas pobres, pessoas que não trazem retorno financeiro à indústria
farmacêutica. Prova disso é a falta de investimento para implementação de novos
medicamentos, mais seguros, eficazes, accessíveis e de utilização mais simples
(WHO, 2010).
O tratamento de primeira escolha para leishmaniose ainda é o antimonial
pentavalente (Sb5+), medicamento injetável, de uso prolongado, e com potencial
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toxicidade e efeitos colaterais muito altos, e em muitos países tornou-se ineficaz
devido ao parasita ter desenvolvido resistência. Em caso de não resposta com o
tratamento de primeira escolha ou recidiva, utiliza-se os medicamentos de segunda
escolha, como anfotericina B ou a pentamidina que são mais tóxicos e de difícil
utilização (GOODMAN; GILMAN, 2012).
Um dos principais problemas relacionados ao tratamento da leishmaniose é a
toxicidade, os efeitos colaterais são muito acentuados e a utilização destes
medicamentos é difícil, pois são injetáveis e na maioria das vezes é necessária a
internação, dificultando aos pacientes a adesão ao tratamento (RIBEIRO, 2014).
Como alternativa para o tratamento da leishmaniose em 2002 foi aprovado o
uso da miltefosina na Índia, com vantagem deste medicamento ser utilizado via oral,
facilitando a adesão do paciente ao tratamento. O problema deste fármaco é que ele
é teratogênico e sua eliminação é muito lenta, se mantem no organismo por um
período longo, possibilitando a alguns parasitas o desenvolvendo de resistência a
essa medicação (COSTA; LUCAS; SAMPAIO, 2008).
Dos medicamentos pesquisados com potencial atividade leishmanicida está o
tamoxifeno, que após ser reconhecido com potencial antiestrogênico foi incluído no
uso clínico contra o câncer de mama metastático e desde a década de 1970 vem
sendo utilizado (GOODMAN; GILMAN, 2012). O mecanismo de ação desse fármaco
ainda não está completamente elucidado, o que se sabe que além de antiestrógeno,
ele também inibi a acidificação de organelas intracelulares. Sabendo que a forma
amastigota da Leishmania necessita de pH próximo de 5,0, pesquisadores
resolveram testar o tamoxifeno como agente leishmanicida e constataram que foi
efetivo tanto in vitro como in vivo, nas formas cutâneas e visceral da doença
(MIGUEL, 2011).
Formular uma nanoemulsão com os fármacos tamoxifeno e miltefosina
combinado foi a proposta deste trabalho, para obtenção de um suposto tratamento
para leishmaniose com menor toxicidade e maior efetividade.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 NANOTECNOLOGIA
A Nanociência é o estudo em escala nanométrica, se apresenta em diversas
áreas do conhecimento humano, está relacionada à descoberta de algo novo,
permitindo assim a caracterização, identificação e descobertas de inovadores
materiais.
Em 1959, o ganhador do prêmio Nobel de física Richard Feynman deu início
às discussões em torno da manipulação de átomos e moléculas, algo invisível ao
olho humano (PASTRANA; AVILA, 2007; NATIONAL NANOTECHNOLOGY, 2015).
A primeira definição do termo nanotecnologia surgiu em 1974 na Tokyo
Science University, proposta pelo professor Norio Taniguchi para descrever as
tecnologias que permitiam a construção de materiais em nano escala (HERMES;
BASTOS, 2014).
A expressão nano surgiu a partir da palavra “nanus”, que do grego significa
anão (SANCHEZ et al., 2009). Dessa maneira, um nanômetro (nm) é definido como
a bilionésima (10-9) parte de um metro (FERNANDES; FILGUEIRAS, 2008). A
nanoescala vai de cerca de 100 nanômetros até aproximadamente 0,2 nanômetro.
Para efeito de comparação, uma fileira de dez átomos de hidrogênio tem um
nanômetro de comprimento e um único fio de cabelo tem 50 mil nanômetros de
diâmetro (FERNANDES; FILGUEIRAS, 2008). Como exemplo dessa dimensão
segue a escala nanométrica representativa (Figura 1).
Figura 1 - Representação diagramática de alguns exemplos de partículas representadas sobre uma escala nanométrica (1 nm = 0,000 000 001 m). Fonte: ANVISA (2014).
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A nanotecnologia vem sendo aplicada nas mais diversas áreas, como,
indústria têxtil, cosmético, automobilística, informática, alimento, meio ambiente,
entre outras. É um campo cientifico multidisciplinar que tem apresentado nos últimos
anos, um rápido avanço (ROSSI-BERGMANN, 2008). Esta revolucionária tecnologia
tem possibilidades imensas, pois, partículas na escala nanométrica apresentam
maior estabilidade térmica e resistência mecânica daquelas apresentadas em escala
maior (FERNANDES; FILGUEIRAS, 2008; ROSSI-BERGMANN, 2008).
A nanotecnologia farmacêutica vem sendo ativamente estudada com
propósito de direcionar e controlar a liberação de fármacos. É o campo das ciências
farmacêuticas envolvido no desenvolvimento, caracterização e aplicação de
sistemas terapêuticos em escala nanométrica ou micrométrica (PIMENTEL et al.,
2007).
O benefício na terapêutica de formulações nanotecnológicas tem sido descrito
em inúmeros trabalhos científicos, sendo a maior parte dos estudos focados ao
tratamento do câncer, doenças inflamatórias, cardiovasculares, neurológicas,
diabetes e ao combate do vírus da imunodeficiência adquirida (AIDS) (DIMER et al.,
2013). As doenças que lideram a utilização do sistema de liberação controlada de
fármaco, como alternativas para o tratamento são: o câncer em seguida o sistema
nervoso central (ROSSI-BERGMANN, 2008; DIMER et al., 2013).
As nanopartículas utilizadas como veículo de distribuição de drogas são
geralmente menores que 100nm (NATIONAL INSTITUTE, 2014). Consistem em
diferentes materiais biocompatíveis, tais como polímeros naturais ou sintéticos,
lipídios ou metais (SURI; FENNIRI; SINGH, 2007). São partículas poliméricas na
forma de reservatório (cápsula) ou matricial (matriz polimérica) nas quais os
fármacos podem ser integrados, quer na matriz da partícula ou ligado à superfície da
partícula (PIMENTEL et al., 2007). São absorvidas pelas células de forma mais
eficiente do que micropartículas, portanto podem ser utilizadas como sistemas de
transporte e entrega de droga eficaz (SURI; FENNIRI; SINGH, 2007; NATIONAL
INSTITUTE, 2014).
Para obtenção de formulações nanotecnológicas, procura-se usar substâncias
que sejam biocompatíveis e inertes, minimizando possíveis problemas nas
aplicações em humanos, os materiais utilizados devem ser selecionados de acordo
com suas características de biodegradabilidade, biocompatibilidade, capacidade
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para funcionalização de superfície, conjugação, complexação e encapsulamento
(DIMER et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2012).
Além de proteger o fármaco contra degradação e o possível direcionamento
do princípio ativo ao sítio específico, os nanossistemas de liberação controlada de
fármacos apresentam várias vantagens em relação aos sistemas convencionais, tais
como: diminuição da dose terapêutica, maior intervalo de administração, melhora da
aceitação terapêutica por parte do paciente, melhor absorção do ativo, etc.
(MARTINHO; DAMGÉ; REIS, 2011; PIMENTEL et al., 2007; ROSSI-BERGMANN,
2008). São classificados em dois grupos: as nanopartículas lábeis (frágeis) que se
desintegram após sua aplicação, tais como lipossomas, micelas, nanoemulsões,
nanoparticula polimérica; e as nanopartículas insolúveis, que não se desintegram
após aplicação, como fulereno, nanopartículas de oxido metálico, nanotubo de
carbono, etc. (POLETTO; POHLMANN; GUTERRES, 2008).
A variedade de nanoestruturas para uso potencial na medicina é vasta, já
foram descritos vários sistemas de liberação de drogas, os principais aplicados na
terapêutica são: os lipossomas, as nanopartículas lipídicas sólidas, as
nanopartículas poliméricas e os nanocristais (ROSSI-BERGMANN, 2008; DIMER et
al., 2013). E também, as nanoemulsões lipídicas óleo em água, que têm sido
empregadas há mais de 40 anos como fonte de calorias e ácidos graxos essenciais
e, mais recentemente, como sistema de liberação de fármacos (BRUXEL et al,
2012).
2.1.1LIPOSSOMAS
Em 1960 os lipossomas foram descobertos pelo cientista inglês Alec
Bangham, durante um estudo para avaliar o comportamento, ou a influência dos
fosfolipídios e coagulação sanguínea (ROSSI-BERGMANN, 2008). No entanto,
somente 20 anos mais tarde as pesquisas em torno dessa estrutura foram
intensificadas (ANTUNES, 2004). Bastante versáteis, pois, suas propriedades físicas
e químicas podem ser alteradas de acordo com requisito farmacológico e também
amplamente utilizados como modelos de membranas celulares na biologia e
bioquímica (MOREIRA, 2013). Foram os primeiros nanossistemas utilizados na
saúde (ROSSI-BERGMANN, 2008).
20
Os lipossomas são vesículas esféricas, microscópicas formadas por uma
(unilamelar) ou mais (multilamelar) bicamadas de fosfolipídios concêntricas,
organizadas espontaneamente por meio aquoso (Figura 2) (BATISTA; CARBALHO;
MAGALHAES, 2007). São constituídos por compostos anfifílicos, possuem em sua
estrutura uma região polar (hidrofílica) capaz de interagir com a água e uma região
apolar (lipofílica), que tende a proteger-se do contato com a água (DIMER et al.,
2013).
Os fármacos hidrossolúveis ficam encapsulados no interior da cavidade
lipossomal enquanto que os fármacos lipossolúveis são incorporados na bicamada
lipídica (PIMENTEL et al., 2007).
Figura 2 – Representação esquemática de um lipossoma. Fonte: Adaptado de SOSNIK, 2010. .
São vários os lipídeos utilizados nas formulações de lipossomas, mas as
fosfatidilcolinas são as mais empregadas, pois apresentam grande estabilidade
frente à variação de pH ou à concentração de sal do meio. Os métodos de
preparação de lipossomas incluem hidratação de um filme lipídico seguido de
sonicação ou extrusão para redução do tamanho das vesículas (AKBARZADEH et
al, 2013; BATISTA; CARBALHO; MAGALHAES, 2007).
Os lipossomas apresentam vantagens como: aumento da eficácia terapêutica,
não são tóxicos, são flexíveis, biocompatíveis, biodegradáveis, reduzem a toxicidade
dos fármacos, etc. Mas, apresentam algumas desvantagens, como: baixa
21
solubilidade, meia vida curta, instabilidade física (agregação das vesículas,
extravasamento do fármaco encapsulado), instabilidade química (hidrólise lipídica,
oxidação lipídica) (AKBARZADEH et al, 2013).
Os lipossomas têm uma vasta aplicação, são utilizados tanto na área
farmacêutica, para tratamento do câncer, doenças parasitárias, infecciosas,
dermatológicas, diabetes, e no desenvolvimento de vacinas. Também são utilizados
na área dermocosmética, tanto para aumentar a incorporação de ativos nas células,
como para prolongar a liberação destes. São empregados em produtos para
desaceleração do processo de envelhecimento da pele, para potencializar os efeitos
hidrantes na pele e clareamento da pigmentação cutânea ( BATISTA; CARBALHO;
MAGALHAES, 2007; CHORILLI et al, 2004).
2.1.2 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS
Desenvolvidas em 1991 as nanopartículas lipídicas sólidas, com propósito de
um dispositivo alternativo para encapsulamento de fármacos em relação aos
sistemas coloidais tradicionais, com grande diferencial em relação à estabilidade
físico-química, propondo maior proteção contra degradação de fármacos lábeis,
podem ser usados em todas as vias de administração, devido seu tamanho
reduzidos e sua biocompatibilidade. Sistema muito parecido com nanoemulsão
diferindo apenas na natureza lipídica, pois o núcleo se apresenta oleoso – sólido
(Figura 3), a técnica de preparo é a homogeneização a alta pressão (UNER;
YENER, 2007; SOUTO et al, 2011).
Figura 3 – Representação de uma nanopartícula lipídica sólida.
Fonte: TAVEIRA, 2009.
Região Hidrofílica Lipídio em Estado Sólido Região Lipofílica
22
Tem a vantagem de produção da matriz a partir de lipídios biodegradáveis
não proporcionando toxicidade, capacidade de encapsular fármacos hidrofóbicos, e
característica oclusiva (MEYAGUSKU, 2014)
Como desvantagens, as nanopartículas lipídicas sólidas têm redução na
capacidade de sustentar a encapsulação do ativo, com possibilidade de formar
dispersões coloidais alternativas (micelas, lipossomas e misturas de micelas) e
exibem instabilidade física durante a estocagem (MEYAGUSKU, 2014; DAUDT,
2013).
2.1.3 NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
As nanopartículas poliméricas proporcionam elevada estabilidade, tanto no
organismo quanto no seu armazenamento. São elaboradas com polímeros que
podem ser naturais ou sintéticos. Dentre esses polímeros, os mais utilizados são os
naturais modificados, sendo eles os de albumina, colágeno, ácido hialurônico,
gelatina, quitosana e alginato. Tanto os polímeros naturais como os sintéticos são
biocompatíveis e biodegradáveis, reduzindo os impactos da formulação no
organismo. Classificados quanto ao tipo de estrutura, são divididos em
nanocápsulas e nanoesferas (Figura 4) (KUMARI; YADAV; YADAV, 2010;
VAUTHIER; BOUCHEMAL, 2009).
Nanocápsula (sistema polimérico do tipo reservatório), são sistemas coloidais
vesiculares de tamanho nanométrico, constituem os sistemas do tipo depósito onde
é possível identificar um invólucro polimérico disposto ao redor de um núcleo oleoso
ou oco, sendo que o fármaco pode estar dissolvido neste núcleo e/ou adsorvido ao
polímero (PIMENTEL et al., 2007; SCHAFFAZICK et al 2003).
As nanoesferas (sistema polimérico matricial) não possuem óleo em sua
composição, são formados por uma matriz polimérica, onde o fármaco pode ficar
retido ou adsorvido (PIMENTEL et al., 2007; SCHAFFAZICK et al 2003).
23
Figura 4 – Representação esquemática de nanoesferas e nanocápsulas. Fonte: Adaptado de SOSNIK, 2010.
As nanopartículas poliméricas têm como vantagem o fato de serem
biodegradáveis e não tóxicas, estáveis no sistema gastrointestinal, podem ser
administradas via oral, intravenosa ou tópica. Permitem liberação lenta e controlada,
além de um endereçamento mais efetivo aos locais de ação, possibilitando a
diminuição da dosagem administrada, tornando o tratamento mais eficaz
(GROTTKAU et al., 2013).
2.1.4 NANOCRISTAIS
A micronização dos pós das drogas não muito solúveis, não foi suficiente para
superar os problemas como baixa solubilidade e baixa permeabilidade. A opção foi
passar da escala micro para escala nano. Surgem então os nanocristais que
possibilitam alterar as propriedades de um medicamento tornando-os mais solúveis
e de fácil absorção (BARBOSA, 2014; DIMER et al., 2013; DURÁN et al., 2010).
Os nanocristais são considerados nanopartículas compostas somente pelo
fármaco estabilizado por agente tensoativo, isentos de outros componentes
(BARBOSA, 2014).
As principais técnicas para a obtenção de nanocristais são, top-down
(resume-se em moagem à alta energia ou homogeneização à alta pressão), técnica
24
mais utilizada e que teve um grande impacto no desenvolvimento de novos
fármacos, e o bottom-up (precipitação em solvente e posterior secagem). Pode-se
também utilizar as duas técnicas combinadas (BARBOSA, 2014; DIMER et al., 2013;
JUNGHANNS; RAINER, 2008).
Sua administração pode ser por via oral (suspensão água em óleo, cápsula
de gelatina ou em grânulos), tópico, ocular, intravenosa (por suspensão aquosa
estabilizada por tensoativo) e pulmonar (JUNGHANNS; RAINER, 2008).
A vantagem deste sistema está no aumento da área superficial, ampliando
simultaneamente a solubilidade do fármaco nanocristalino (DURÁN et al., 2010).
Permite trabalhar tanto com fármaco hidrossolúvel, assim como com
lipossolúveis, e com diversos solventes, desde água até solventes orgânicos, e
também com diferentes tensoativos (DURÁN et al., 2010).
Podem ser incorporados em nanoestruturas carreadoras de fármacos ou
transformados em conjugados fármacos-lipídio. É possível a produção em larga
escala para suprir a necessidade da indústria farmacêutica e cosmética por novas
tecnologias (BARBOSA, 2014; DIMER et al., 2013; DURÁN et al., 2010).
2.1.5 NANOEMULSÕES
Emulsão é definida como um sistema composto por dois líquidos imiscíveis.
Existem duas formas de emulsões, do tipo óleo em água (O/A), na qual gotículas de
óleo estão dispersas na água, e a do tipo água em óleo (A/O), na qual as gotículas
de água estão dispersas no óleo, se faz necessário para dispensar um líquido do
outro a aplicação de agitação (BERNARDI, 2011).
A nanoemulsão (Figura 5) é um tipo de emulsão, com tamanho reduzido das
partículas na escala nanométrica, que varia de 20nm a 200nm; esta redução no
tamanho deixa o sistema com aspecto transparente ou translúcido e altamente
estável (PEREIRA et al, 2016). O tamanho das partículas reduzidas aumenta a área
superficial, diminuindo os fenômenos de sedimentação, cremeação, floculação,
coalescência induzidos pelos efeitos gravitacionais (BERNARDI, 2011).
25
Figura 5 - Representação de uma partícula de nanoemulsão. Fonte: Adaptado de SOSNIK, 2010.
Esses nanossistemas são produzidos à base de água, óleo, tensoativo e
adjuvantes (JAISWAL; DUDHE; SHARMA, 2015). Os tensoativos são responsáveis
por conferir estabilidade às nanoemulsões, esses compostos anfifílicos dispõem-se
entre as duas fases da emulsão (aquosa e oleosa), diminuindo a tensão interfacial e
estabilizando o sistema (BRUXEL et al., 2012). Diversos métodos são empregados
no preparo dessas formulações, dentre eles a homogeneização a alta pressão
(passagem de uma dispersão grosseira, através de um orifício, sob pressão elevada,
em turbulência intensa, diminuindo o tamanho das partículas), a microfluidição
(passagem da emulsão por uma série de microcanais), sonicação (aplicação do
ultrassom, produzindo ondas interfaciais instáveis rompendo as gotículas) (BRUXEL
et al., 2012; JAISWAL; DUDHE; SHARMA, 2015).
As nanoemulsões possuem aplicações práticas em muitas áreas, como
química, farmacêutica e cosmética (BERNARDI, 2011). Este sistema de liberação
controlada tem a capacidade de veiculação de fármacos hidrofílicos e lipofílicos no
mesmo sistema (BRUXEL et al., 2012). Promissora na ciência cosmética devido ao
grande poder de hidratação, alta espalhabilidade e promove a formação de uma
película protetora sobre a pele (PEREIRA et al, 2016).
Na área farmacêutica as nanoemulsões podem ser formuladas para entrega
de drogas através de várias vias, sendo bem tolerados para uso oral, pele, mucosa,
permite o direcionamento seletivo da droga, além da proteção do fármaco da
degradação e oxidação, mascara sabor desagradável de algumas drogas
(LOVELYN et al, 2011).
Região Hidrofílica Lipídio em Estado Líquido Região Lipofílica
26
Embora este sistema forneça muitas vantagens, também apresenta desafios,
pois, a produção da nanoemulsão é um tanto caro, e os equipamentos necessários
para sua produção exigem um alto custo de investimento financeiro.
2.2 LEISHMANIOSE
A Leishmaniose é uma das 17 doenças tropicais parasitárias crônicas
consideradas negligenciadas pela organização mundial da saúde (OMS), são
silenciosas, uma vez que pessoas afetadas ou em risco têm pouca voz política. São
doenças associadas à pobreza, oferecendo pouco estímulo à indústria farmacêutica
no investimento e desenvolvimento de novos e melhores produtos, pois é um
mercado desprovido de poder aquisitivo, ou seja, não oferece retorno ao investidor
(WHO, 2010).
Anteriormente considerada uma doença rural, a leishmaniose vem se
expandindo para áreas urbanas, está presente em 98 países, e a cada ano, 500 mil
pessoas desenvolvem a forma visceral e 1,5 milhão a forma tegumentar da doença
(WHO, 2010).
A leishmaniose é uma doença infecciosa não contagiosa, causada por cerca
de 20 distintas espécies de protozoários unicelular do gênero Leishmania,
pertencem à ordem Kenetoplastida e a família Trypanosomatidae (NEVES, D., et al.,
2011). São heteróxenos (Figura 7) (parasita que apresenta em seu ciclo biológico
dois hospedeiros distintos), encontrados nas formas flageladas ou promastigotas no
trato digestivo dos hospedeiros invertebrados (mosquitos fêmeas, hematófagos) e,
aflageladas ou amastigotas, intracelular obrigatório do sistema fagocítico
mononuclear dos hospedeiros vertebrados (abrangem grandes variedades de
mamíferos, incluindo o homem) (REY, 2008).
A Leishmaniose é uma complexa zoonose, transmitida por aproximadamente
30 espécies de diferentes flebotomíneos dos gêneros Phlebotomus na Europa,
África e Ásia, e Lutzomya nas Américas (Figura 6) (GOODMAN; GILMAN, 2012;
MIGUEL, 2011).
27
Figura 6 - Fêmea Flebotomíneo (Foto Ampliada) Fonte: What is leishmaniasis? 2015.
Os flebotomíneos, insetos conhecidos popularmente como mosquito palha,
tatuquira, birigui, entre outros, são responsáveis na transmissão da leishmaniose
(BRASIL, 2014). As fêmea dos flebotomíneos, pica o vertebrado para exercer o
repasto sanguíneo e juntamente com o sangue ingere macrófagos parasitados por
formas amastigotas (figura 7). Ao interior do tubo digestivo do inseto vetor, os
macrófagos se rompem, liberando as formas amastigotas, ocorre então o processo
de divisão binária e se transformam rapidamente em promastigotas metacíclicas,
forma flagelada (altamente infectante), morfologicamente e bioquimicamente
distintas das amastigotas. Posteriormente quando o inseto realizar um novo repasto
sanguíneo, os promastigotas metacíclicas serão introduzidos no hospedeiro
mamífero e dentro de quatro a oito horas são interiorizados pelos macrófagos
teciduais, envoltos pelo vacúolo fagocitário, e rapidamente as formas promastigotas
se transformam em amastigotas, já adaptados ao novo meio fisiológico e resistente
à ação destruidora dos lisossomos, multiplicam-se por divisão binária até esgotar a
resistência da membrana do macrófago, que se rompe liberando os amastigotas,
que novamente são fagocitados por outras células, tanto localmente quanto em
locais distantes (NEVES, D., et al., 2011; WHO, 2010; MIGUEL, 2011; BRASIL,
2013). Na figura 7 explica o ciclo parasitário da Leishmaniose.
28
Período Vetorial Período no Homem
Figura 7 – Ciclo Parasitário da Leishmaniose. Fonte: Adaptado – MONTALVO et al., 2012.
A variedade da espécie genética do parasita em combinação com a resposta
imune do hospedeiro, fornece muito para a diversidade do quadro clínico na
leishmaniose, podendo assim, se manifestar de quatro formas comuns: leishmaniose
cutânea, leishmaniose mucocutânea, leishmaniose cutânea difusa e leishmaniose
visceral (SINGH; SIVAKUMAR, 2004; NASCIMENTO, 2009).
29
2.2.1 LEISHMANISE VISCERAL
Desde 1999 o Brasil vem sofrendo um aumento acentuado no número de
casos da leishmaniose visceral (Figura 8). Conhecida popularmente como calazar,
barriga d’água. Se não tratada, ou não detectada, a leishmaniose visceral leva a
morte em dois anos, é a forma mais grave da doença, pois as leishmânias agridem
os órgãos internos, atacando o sistema fagocítico mononuclear do baço, fígado,
medula óssea e tecidos linfóides, ocasionando esplenomegalia (aumento do baço),
hepatomegalia (aumento do fígado) e alterações da medula óssea (NASCIMENTO,
2009; REY, 2008). Sua letalidade é alta principalmente em crianças desnutridas,
idosos e em indivíduos portadores da infecção pelo vírus da imunodeficiência
adquirida (HIV) é, portanto, uma das doenças mais importantes da atualidade
(BRASIL, 2014).
Figura 8 – Criança com leishmaniose visceral Fonte: SÃO PAULO, 2015.
O primeiro registro da doença no Brasil ocorreu em 1913, pelo professor
doutor Luís Migone, após necropsia de paciente da cidade de Boa Esperança do
30
estado do Mato Grosso (MIGONE, 1913). Desde então vem sendo descrita a
transmissão dessa doença em toda a América Latina, já foi relatada em pelo menos
12 países das Américas, sendo que 90% dos casos ocorrem no Brasil, em vários
municípios brasileiros, principalmente na região nordeste (BRASIL, 2014).
Como mostra o gráfico seguinte (Figura 9), verifica-se que a notificação de
casos da doença na região nordeste foi de 82,9% em 2000 para 59,1% em 2013,
uma redução de 28,7%, portanto comparada as outras regiões o nordeste ainda
continua registrando o maior número de casos, e a região sul menor número
(CEARÁ, 2014).
Figura 9. Casos confirmados de leishmaniose visceral nas regiões brasileira de 2000 a 2013.
Fonte: Organizado pela autora – CEARÁ, 2014.
As espécies causadoras da leishmaniose visceral são a Leishmaniose
(Leishmania) donavani na África Oriental, Índia e China, Leishmania (Leishmania)
infantum no Mediterrâneo, e outras regiões da África, Oriente Médio e China e no
continente Americano, é a Leishmania (Leishmania) chagassi (MIGUEL, 2011;
NASCIMENTO, 2009).
O período de incubação da leishmaniose visceral é de 2 a 4 meses, só uma
pequena parcela de indivíduos desenvolve sinais e sintomas, trata-se de uma
doença crônica e sistêmica (BRASIL, 2014).
O diagnóstico é feito com base em parâmetros clínicos e laboratoriais,
clinicamente pode ser feito com base em vários indicativos como, febre recorrente,
esplenomegalia e caquexia, é uma análise muito importante, mais pode ser
31
confundida com outras doenças tais como: malária, doenças de chagas,
toxoplasmose, febre tifoide, leucemia, esquistossomose entre outras (NEVES, D., et
al., 2011). No laboratorial é feito através de pesquisa do parasito, que pode ser
demonstrado em material obtido por punção aspirativa da medula óssea, fígado,
baço ou linfonodos, as punções são métodos invasivos e necessitam de um
especialista que muitas vezes não está disponível, tornando-se os métodos
imunológicos extremamente solicitados para afirmação do diagnóstico da
leishmaniose visceral (LOPES et al, 2014).
Os testes sorológicos diferem em sua sensibilidade e especificidade, estes
testes têm limitações como, reação cruzada com outras doenças, pode apresentar
resultado falso-negativo, ou permanecer positivo após o tratamento, não permitindo
avaliação do efeito terapêutico (NEVES, D., et al., 2011).
Existem vários métodos imunológicos para o diagnóstico de Leishmaniose
Visceral, sendo os mais utilizados no Brasil o (RIFI) reação de imunofluorescência
indireta – utilizado como antígeno a forma promastigotas fixado em lâmina,
apresenta baixa especificidade, exige na sua execução pessoal treinado, é uma
reação cara e não está adaptada para estudos epidemiológicos em larga escala e o
(ELISA) ensaio imunoenzimático – método de diagnóstico simples, permite analisar
grande número de indivíduos com um volume pequeno de amostra (GONTIJO;
MELO,2004).
2.2.2 LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
A leishmaniose tegumentar tem ampla distribuição mundial, e no Continente
Americano há registro de casos desde o extremo sul dos Estados Unidos até o norte
da Argentina, com exceção do Chile e Uruguai. No Brasil há maior prevalência da
doença, apresentando variedade de agentes de reservatórios e de vetores,
proporcionando diferentes padrões de transmissão. É estabelecido um problema de
saúde publica em 88 países, sendo essas disseminadas nas Américas, Europa,
África e Ásia, com registro anual de 1 a 1,5 milhão de casos. Sendo considerada
como uma das seis doenças infecciosas mais importantes, pois em casos não
32
tratados podem produzir cicatrizes e deformidade desfigurantes (BRASIL, 2013;
WHO, 2010; NEGRÃO; FERREIRA 2014).
No Brasil essa doença apresenta distribuição em todas as regiões geográficas
(Figura 10), vem apresentando tendência de aumento do numero de casos desde a
década de 80, período em que foi implantado as atuações de vigilância e controle da
leishmaniose tegumentar Americana no país (BRASIL, 2013).
No total de notificações da doença em cada região brasileira nos anos de
1990 a 2014 (Figura 10), nota-se com menor ocorrência a região sul, em
contrapartida a norte seguida da nordeste detêm maior número de casos (PORTAL
DA SAÚDE, 2013).
Figura 10 – Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil de 1990 a 2014. Fonte: Organizado pela autora – PORTAL DA SAÚDE.
A Leishmaniose tegumentar americana, é uma doença infecciosa não
contagiosa, que acomete pele e mucosas, pode apresentar-se nas formas cutânea
localizada, cutânea disseminada, cutânea difusa e mucosa, com ou sem lesões na
pele, se inicia com pequenas pápulas eritematosas, aumentando lentamente de
tamanho, transformando-se em nódulos e posteriormente em lesões ulcerativas,
apresenta um período de incubação no ser humano entre duas semanas, meses e
33
até dois anos, e também pode aparentar casos assintomáticos (VELOZO et al.,
2006).
Nas Américas, são atualmente reconhecidas 11 espécies de Leishmania
causadoras da doença em humanos e oito espécies determinantes apenas em
animais (BRASIL, 2013).
No Brasil foram identificadas sete espécies, sendo seis do subgênero Viannia
e uma do subgênero Leishmania. As três principais espécies responsáveis pelas
maiores taxas de infecção são: Leishmania (Viannia) braziliensis, causa no humano
úlcera cutânea única ou múltipla, e pode atingir mucosas e nasofaringe causando a
leishmaniose mucocutanea (as mucosas mais acometidas são as do nariz, faringe,
laringe e boca); L.(V.) guyanensis, pode causar lesões ulceradas cutâneas única ou
múltiplas quando picado simultaneamente por vários flebótomo infectados e a
L.(Leishmania) amazonensis, gera ulceras cutâneas localizadas, e em alguns
indivíduos pode desenvolver a Leishmaniose Cutânea Difusa (forma rara e grave da
doença, se apresenta com lesões nodulares cobrindo grande extensões do corpo,
com grande quantidade de leishmania nas lesões) (BRASIL, 2013; MIGUEL, 2011).
As Figuras 11, 12 e 13 - mostram as três formas de lesões características da
leishmaniose tegumentar americana, sendo figura 11= leishmaniose mucocutânea,
(lesões com destruição do septo nasal e infiltração do lábio superior), figura 12 =
leishmaniose cutânea, (úlcera leishmaniótica), figura 13 = leishmaniose difusa,
(erupções nodulares não ulceradas distribuídas por todo o braço).
Figura 11 = leishmaniose mucocutânea.
Fonte: (RIVITTI, 2014)
34
Figura 12 = leishmaniose cutânea. Fonte: (SANTA CATARINA, 2015)
Figura 13 = leishmaniose difusa. Fonte: (NEVES, D., et al., 2011)
O diagnóstico da leishmaniose tegumentar Americana abrange aspectos
epidemiológicos, clínicos e laboratoriais e em alguns casos a associação desses
elementos são necessários para se chegar ao diagnóstico final (SAMPAIO, 2008).
35
O diagnóstico Clínico deve ser feito com base nas características da lesão
associadas à anamnese, onde os dados epidemiológicos são de grande importância.
Os diagnósticos laboratoriais incluem, exame de esfregaço em lamina,
histopatológico, cultura, inoculação do parasito em animais, reação de Montenegro e
sorologia (RIVITTI, 2014).
Segundo CAMPOS (2008), na prática, o diagnóstico utilizado para a
leishmaniose tegumentar americana baseia-se principalmente nas manifestações
clinicas apresentadas pelo paciente, nos fatores epidemiológico e no teste de
Montenegro, que é distribuído pelo ministério da saúde.
O teste intradérmico de Montenegro é realizado utilizando-se injeção
intradérmica de 0,1 a 0,3 ml de uma solução fenolada de leptosomas (forma
promastigotas), a leitura é feita após 48 a 72 horas medindo-se o diâmetro da
reação no local da injeção, sendo considerada positiva quando a pápula é maior do
que 5mm de diâmetro, a sensibilidade e a especificidade desse teste, estão
próximos de 100%. (NASCIMENTO, 2009; RIVITTI, 2014).
2.2.3 TERAPÊUTICA DA LEISHMANIOSE
Utilizados há mais de 80 anos, os antimoniais pentavalentes (Sb5+) (Figura
14), consistem no tratamento de primeira escolha. Eles apresentam efeitos
colaterais como: arritmias cardíacas, pancreatite, nefro e hepatotoxicidade, mialgia,
inapetência, cefaléia, febre, vômito, tontura e edema no local da administração e são
medicamentos que possuem uma eliminação rápida pela urina. Apresentam
dificuldades na administração, pois há necessidade de equipe especializada e
hospitalização do paciente, sendo sua administração via parenteral, tornando o
tratamento dificultoso (NASCIMENTO 2009; SALDANHA, 2000).
36
Figura 14 - Estrutura química do Antimoniato de meglumina (Glucantime®)
Fonte – (CARVALHO et al., 2015).
Os fármacos antimoniais são o estibogluconato de sódio (Pentaspam®),
utilizado para leishmaniose na Europa, África e Ásia, e o antimoniato de meglumina
(Glucantime®), usado nas Américas. São indicados para tratamentos de todas as
formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana, embora as formas
mucosas exijam maiores cuidados, podendo apresentar resposta mais lenta e maior
possibilidade de recidivas (BRASIL, 2013).
O N-Metil-Glucamina (Glucantime®), é apresentado em ampolas de 5ml, com
1,5g do sal (425mg de Sb5+ pentavalente); a administração é feita na dose de 15mg
de Sb5+ ∕ Kg ∕ dia, nas leishmanioses da forma cutânea, e de 20mg ∕ Kg ∕ dia, nas
formas cutâneo-mucosas e visceral. As aplicações são via intramuscular profunda
(IM) e intravenosa (IV) diluído em 10 ml de soro glicosado a 25%, sendo o total de
aplicações de 20 a 40 dias, uma vez ao dia, o tempo vai depender da forma clínica
da Leishmaniose apresentada (RIVITTI, 2014).
Apesar de ser um medicamento antigo o mecanismo de ação do antimônio
pentavalente, Sb5+ é largamente desconhecido, estudos recentes apoiam a antiga
hipótese de que o Sb5+ atua como pró-fármaco, que seria convertido em sua forma
mais tóxica dentro do organismo, o antimonial trivalente Sb3+, destruindo os
amastigotas no interior do fagolisossomos dos macrófagos (FRÉZARD; DEMICHELI;
RIBEIRO, 2009).
Não havendo resposta satisfatória com o tratamento pelos antimoniais
pentavalentes, as drogas de segunda escolha são a Anfotericina B e suas formas
37
(anfotericina-B-lipossomal e anfotericina-B-dispersão coloidal), e as pentamidinas
(sulfato de pentamidina e mesilato de pentamidina).
A anfotericina B (Figura 15) é um antibiótico usado como antifúngico
sistêmico, tem efeito leishmanicida, é efetiva no tratamento das leishmanioses
resistentes aos antimoniais (GOODMAN; GILMAN, 2012). As decorrências adversas
são febre, cefaléia, náuseas, vômitos, anorexia, tremores, calafrios, flebite, cianose,
hipotensão, hipopotassemia, hipomagnesemia, comprometimento da função renal e
distúrbios do comportamento. Está contraindicada a administração da anfotericina B
em cardiopatas, hepatopatas, nefropatas.(BRASIL, 2013).
Figura 15 -Estrutura química da Anfotericina B Fonte – (CARVALHO et al., 2015).
Anfotericina B é comercializada em ampolas contendo 50mg de desoxicolato
de sódico em pó liofilizado, sua aplicação é via endovenosa, diluído em soro
glicosado a 5%, em infusão lenta de 4-6 horas, a dose deve ser de 1mg ∕ Kg ∕ dia,
diariamente ou em dias alternados, não ultrapassando 50mg em cada aplicação.
Nas leishmanioses da forma cutânea aplicar até atingir as doses totais de 1 a 1,5g, e
para formas mucocutânea 2,5 a 3g, na forma visceral o máximo de 3g de dose total
(BRASIL, 2013; BRASIL 2014).
O mecanismo de ação da anfotericina é através da formação de complexos
com percursores do ergosterol na membrana plasmática parasitária, formando poros
na membrana, essa alteração interfere no balanço iônico da célula, induzindo a sua
destruição (NEUMANN; BAGINSKI; CZUB, 2010).
A anfotericina-B-lipossomal (AmBisome®) é uma preparação lisossômica de
vesículas unilamerares pequenas, preparadas a partir de formulações lipídicas.
(SUNDAR et al., 2010). Tem um custo muito elevado, limitando o uso em áreas
38
endêmicas, por esse motivo vem sendo indicada aos pacientes graves de
leishmaniose visceral, que desenvolveram insuficiência renal ou toxicidade cardíaca
durante o uso do Antimoniato de N-metil glucamina e de outras drogas de escolha,
sem melhora ou cura clínica (BRASIL, 2014; MURRAY, 2001). Porém, um estudo
feito na Índia para o tratamento da leishmaniose visceral, mostrou que o uso de uma
única dose aplicada de anfotericina-B-lipossomal na dose de 10mg ∕ Kg (pacientes
liberados 24 horas depois), foi equivalente à administração de 15 doses de 1mg ∕ Kg
de desoxicolato de anfotericina B, em dias alternados durante 29 dias de internação
hospitalar (SUNDAR et al., 2010).
O uso das pentamidinas (sulfato de pentamidina e mesilato de pentamidina)
(Figura 16) está reservado apenas para os casos em que ocorreu falha terapêutica
com antimoniais e anfotericina B. No Brasil é comercializado em ampolas contendo
300mg de sulfato de pentamidina com nome comercial de Pentacarinat®. A dose
recomendada é de 4mg ∕ Kg ∕ dia, via intramuscular profunda, de dois em dois dias
não ultrapassando a 2g. (BRASIL, 2013).
Figura 16 -Estrutura química do Isotionato de pentamidina - Pentacarinat®
Fonte – (CARVALHO et al., 2015).
As principais reações adversas relacionadas ao uso das pentamidinas são,
dor no local da aplicação, além de náuseas, vômitos, tonturas, adinamias, mialgias,
cefaleias, hipotensão, sincope, hipoglicemia e hiperglicemia transitória, por isso o
paciente tem que estar alimentado e permanecer em repouso 15 minutos antes e
depois da aplicação do medicamento (NEVES, L., et al., 2011).
Mecanismo de ação em Leishmania está relacionado ao acúmulo de droga da
pentamidina no interior da mitocôndria e a desintegração do cinetoplasto e o colapso
do potencial de membrana mitocondrial (GOODMAN; GILMAN, 2012).
39
Dois estudos comparando o isotionato de pentamidina com antimoniato de
meglumina, para o tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana, um feito no
Brasil e outro na Colômbia, do Brasil fez uso de 3 doses e na Colômbia 4 doses de
pentamidina, sendo aplicado a cada dois dias ambos com dose de 4mg ∕ Kg ∕ dia. Os
autores concluíram que os dois medicamentos testados são de eficácia comparada
para o tratamento da Leishmaniose Tegumentar Americana. A desvantagem da
pentamidina com relação aos antimoniais é o custo, sendo a pentamidina duas
vezes o valor dos antimoniais, e as vantagens apresentadas foram menor tempo de
tratamento, e menor toxicidade (ROBLEDO et al., 2006; PAULA et al., 2003).
2.2.4 ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE
Há uma evidente necessidade de novas drogas com estruturas e mecanismos
de ação diferentes dos medicamentos em uso até hoje. Os fármacos empregados
atualmente para o tratamento da leishmaniose são muito tóxicos e os indicadores de
resistência são cada vez maiores (KAYSER; KINDERLEN; BERTELS, 2001).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, os tratamentos para esta doença
são antiquados, tóxicos e de difícil aplicação (WHO, 2010).
Dentre os fármacos estudados para tratamento da leishmaniose, destacam-se
os antineoplásicos miltefosina e tamoxifeno, (Figura 17 e 18).
2.2.4.1 MILTEFOSINA
A miltefosina (Figura 17) é um análogo da alquilfosfocolina, com substância
química denominada hexadecilfosfocolina, desenvolvido como agente anticâncer,
empregado para tratamento tópico de metástase cutânea de câncer de mama
(TANABE, 2011). Sua atividade antiprotozoário foi descoberta nos anos 1980, na
época em que estava sendo avaliada para quimioterapia antineoplásica. Em 2002 foi
aprovada na Índia como primeiro tratamento ativo por via oral para a leishmaniose
visceral (GOODMAN; GILMAN, 2012). No Brasil é a primeira droga oral a tratar com
40
sucesso as formas mucosas e cutâneas da leishmaniose tegumentar americana
(SILVA, 2011).
O P
O
O
O-
N+(CH3)3
Figura 17. Estrutura química da molécula de miltefosina Fonte – (RATH et al., 2003).
Em uma pesquisa clínica feita na universidade federal da Bahia com
pacientes portadores da leishmaniose cutânea causada por leishmaniose
brazilienses, levou a uma taxa de cura de 75%, superior as obtidas com a
administração de antimonial pentavalente (MACHADO et al., 2010). Logo em uma
outra pesquisa clínica aplicada para avaliar a eficácia terapêutica e a segurança da
miltefosina no tratamento de pacientes com leishmaniose mucocutânea, no período
de seis meses, obteve uma taxa de cura de 90% (SILVA, 2011).
A grande vantagem deste fármaco é a administração por via oral, sendo a
dose usual de 2,5 mg ∕ Kg de peso por dia durante 28 dias, e por não ser invasivo
favorece a adesão ao tratamento, não causando dor ao paciente, não sendo
necessária internação (SOTO; SOTO, 2006).
Esse medicamento é bem absorvido e amplamente distribuído, se mantem no
organismo cerca de 8 dias, teste feito em ratos mostrou que esta droga se acumula
em diversos órgãos, tais como rim, fígado, pulmão, baço e glândulas renais (MORE
et al., 2003). Sua eliminação é bem lenta, o que leva a discussão com a
possibilidade de resistência dos parasitas a medicação (SILVA, 2011).
A maior limitação da miltefosina é seu potencial teratogênico, impedindo o uso
em mulheres grávidas, e os principais efeitos colaterais, estão associados aos
distúrbios gastrintestinais (MIGUEL, 2011).
O mecanismo de ação da miltefosina é parcialmente conhecido, sabe-se que
tem interposição com a membrana plasmática parasitária, seu acesso para o interior
41
das células é feito por meio de transportadores de membranas, inibição da síntese
de fosfatidilcolina, RNA e apoptose (AZZOUZ et al., 2005).
2.2.4.2 TAMOXIFENO
Em 1966 foi sintetizado o tamoxifeno (Figura 18), com propósito de ser usado
como anticoncepcional oral, porém constatou-se que ele induz a ovulação
(KAYSER; KINDERLEN; BERTELS, 2001). Em 1971 foi introduzido para o
tratamento do câncer de mama, devido ao seu potencial antiestrogênico (OLIVEIRA,
2014).
Figura 18. Estrutura química da molécula de tamoxifeno Fonte – Adaptado (SEFERIN, 2005)
O mecanismo de ação se dá pela ligação do tamoxifeno os receptores de
estrógeno, bloqueando o crescimento de células tumorais (GOODMAN; GILMAN,
2012).
O tamoxifeno é um inibidor competitivo da ligação do estradiol ao receptor de
estrogênio, existem dois subtipos de receptores de estrogênio: o receptor α e β, que
apresentam distribuição tecidual diferente, explicando a resposta variável observada
ao tratamento com este medicamento, podendo afetar outros órgãos como o
endométrio uterino (aumentando significativamente o risco de desenvolver câncer de
útero), sistema de coagulação (risco de embolia pulmonar), e outras reações
adversas como: cefaléia, náusea, vômito, queda de cabelo, sangramentos e
42
irregularidade menstruais (GOODMAN; GILMAN, 2012; NASCIMENTO, 2009;
FACINA et al., 2003).
Além de seus efeitos antagonista de estrogênio sobre o câncer de mama,
também exerce efeito agonista estrogênico em tecidos não mamário
(MARTINKOVICH et al., 2014).
O mecanismo de ação do tamoxifeno na terapia e prevenção do câncer de
mama ainda não está inteiramente esclarecido. Diversos estudos demonstraram que
este fármaco apresenta uma série de efeito tanto in vitro como in vivo que não
podem ser explicados apenas por meio de sua interação com o receptor de
estrógeno (MIGUEL, 2011).
Independente da interação com receptor de estrógeno, o tamoxifeno também
age inibindo a acidificação de organelas intracelulares e também alterando a
membrana celular, impedindo a fluidez e consequentemente o funcionamento da
célula (CHEN; SCHINDLER; SIMON, 1999).
Partindo desse pressuposto, e sabendo que a forma amastigota de
Leishmania localiza-se obrigatoriamente no vacúolo dentro dos macrófagos do
hospedeiro vertebrado, e sendo este ambiente tipicamente ácido, pH ideal para
atividade metabólica dos amastigotas (CHEN; SCHINDLER; SIMON, 1999;
ANTOINE et al., 1998), Miguel e colaboradores testaram o tamoxifeno como agente
anti-Leishmania in vitro e in vivo. Já que, este fármaco evidenciou interferência nos
mecanismos intrínsecos de manutenção do pH, podendo gerar distúrbio na
multiplicação do parasita no interior do vacúolo. Por ser um medicamento que
apresenta segurança clínica muito bem estabelecida, fortaleceu o interesse dos
pesquisadores em determinar o potencial leishmanicida. Foi introduzido
intraperitoneal 20 mg ∕ Kg ∕ dia de citrato de tamoxifeno por duas semanas em
camundongos machos e fêmeas, concluindo que apesar do mecanismo de ação do
tamoxifeno não ter sido completamente esclarecido, os resultados mostraram que o
tamoxifeno é eficaz no tratamento da leishmaniose cutânea e visceral em modelo
animal (MIGUEL, 2011).
Em um estudo feito em ratos, na Universidade de Alexandria, os
pesquisadores obtiveram resultados positivos contra Leishmania major
(leishmaniose cutânea da Europa, África e Ásia), (EISSA; AMER; SAWY, 2011).
O tamoxifeno se mostrou eficaz no tratamento da leishmaniose in vivo e in
vitro, que se espera agora é a pesquisa clínica, em humano (COELHO et al., 2015).
43
A carência de novos tratamentos para leishmaniose é grande, necessita-se de
medicamentos com menos efeitos colaterais, mais baratos, com menor resistência.
Além disso, é importante desenvolver formulações de fácil administração com tempo
reduzido de tratamento não necessitando de internação do paciente, contribuindo
para adesão ao tratamento.
Notando essas suposições, surge a proposta desta pesquisa, em associar
fármacos leishmanicidas com diferentes mecanismos de ação, e melhorar a eficácia
dos fármacos já existentes, com a expectativa de se obter resultados mais
satisfatórios que as terapias convencionais. Foram veiculados em emulsões lipídicas
os ativos miltefosina com o tamoxifeno para uso via oral ou via parenteral.
44
3 OBJETIVO
Desenvolver uma emulsão composta dos fármacos miltefosina e tamoxifeno
para administração oral ou parenteral e avaliar sua estabilidade físico-química in
vitro.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Preparar emulsões lipídicas contendo miltefosina e tamoxifeno;
- Verificar as características físico-químicas das emulsões preparadas.
- Avaliar a estabilidade das formulações durante o armazenamento em diferentes
temperaturas.
- Analisar in vitro o potencial hemolítico e o comportamento em fluídos
gastrointestinais das emulsões.
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
Para realização deste projeto foram utilizados os seguintes reagentes:
pepsina A, pancreatina, colesterol, ácido oleico, glicerina, óleo de semente de
algodão, e Monooleato de Sorbitan Etoxilado 20 EO (Tween® 80), que foram
adquiridos da Sigma Chem. Co. (St. Louis, USA). A fosfatidilcolina foi obtida da
Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha). Os fármacos miltefosina – da empresa
Hangzhou Dayangchem Co., LTD. (China), e tamoxifeno – da farmácia de
manipulação (Farmad’oro, São Paulo, SP).
4.2 Equipamentos
Estes aparelhos pertencem ao Laboratório de Sínteses e Formulações da
Universidade Anhanguera de São Paulo.
4.2.1 Homogeneizador de alta pressão
O emulsificador Emulsiflex C05 da Avestin (Ottawa, ON, Canadá), foi utilizado
para preparar as formulações a alta pressão.
4.2.2 Processador ultrassônico
A emulsão foi obtida através da homogeneização em ultrassom, da marca
Sonics® (Sonics & Materials Inc, Newtown, CT, Estados Unidos).
46
4.2.3 Espalhamento de luz dinâmico
A medida do tamanho das partículas da emulsão, potencial Zeta e pH foi
realizada por espalhamento de luz dinâmico “Laser Light Scattering” (90 Plus, Brookhaven
Instruments Corporation, Holtsville, New York, USA).
4.2.4 Espectrofotômetro de UV- Visível
Para análises por espectrofotometria no UV-VIS utilizou-se o
espectrofotômetro modelo FENTO do Laboratório de Síntese de Compostos de
Coordenação da UNIAN.
4.2.5 Outros aparelhos
Chapa de agitação magnética Fisatom; agitadores tipo vórtex (Micronal, São
Paulo, Brasil); balança analítica Shimadzu; centrífuga de mesa Kindly Kc16 de alta
velocidade; centrifuga de mesa Centribio 80-2B para tubos falcon de baixa rotação;
fluxo laminar Veco, incubadora Shaker Tecnal TE 420 de bancada com
aquecimento.
47
4.3 Preparação das nanoemulsões
Para comparação da estabilidade físico-química, foram preparadas várias
formulações com diferentes concentrações dos fármacos miltefosina e tamoxifeno, e
uma não contendo os ativos, para servir como controle, utilizando as composições
subsequentes:
- Colesterol....................................................................................................10mg
- Glicerina....................................................................................................200mg
- Óleo de semente de algodão....................................................................200mg
- Ácido oléico...............................................................................................200mg
- Fosfatidilcolina...........................................................................................400mg
- Tween 80 (tensoativo hidrofílico)...............................................................200mg
- Miltefosina 1ª (300mg), 2ª (200mg), 3ª (266mg), 4ª (225mg), 5ª (150mg), 6ª (200mg)
-Tamoxifeno 1ª (100mg), 2ª (200mg), 3ª (133mg), 4ª (75mg), 5ª (150mg), 6ª (100mg)
- Água destilada qsp......................................................................................20ml
Foram pesados em um becker, o colesterol, a glicerina, o óleo de semente de
algodão, ácido oleico, o Tween 80 e os fármacos miltefosina e tamoxifeno, assim
sucessivamente para cada formulação contendo diferentes concentrações dos
fármacos.
Em um segundo becker, foram pesados a fosfatidilcolina, e em seguida
adicionados 15ml de água destilada. As solubilizações de ambas foram feitas com
auxílio do agitador magnético a 60°C. Após a solubilização da fosfatidilcolina o
conteúdo do segundo becker foi adicionado ao primeiro e o volume foi completado
para 20ml. A mistura foi pré-homogeneizada em agitador magnético e
posteriormente emulsificada no homogeneizador de alta pressão, mantendo a
pressão entre 100 a 150 Psi, durante 50 minutos. Em seguida deixada no ultrassom
a uma frequência de 20 kHz e potência de 130 W, sendo acompanhado o tamanho
das partículas entre 10 e 40 minutos de emulsificação, por espalhamento de luz
48
dinâmica. Durante todo o processo de emulsificação foi monitorada a temperatura de
modo que estivesse sempre entre 50 a 60 °C.
Após o processo de emulsificação, o conteúdo do becker foi transferido para
um tubo falcon e centrifugado durante 30 minutos a 2.400 rpm. Foram retirados 2ml
do conteúdo total para armazenamento à temperatura ambiente, e o restante sob-
refrigeração, a 4ºC.
Para melhor entendimento segue o fluxograma contendo as etapas da
metodologia aplicada para preparação das nanoemulsões, (Figura 19).
Figura 19 – Fluxograma representando as etapas para preparo das nanoemulsões.
49
4.4 Estabilidade das formulações
A caracterização físico-química das formulações foi feita através das análises
seguintes: pH, tamanho das partículas, polidispersidade, potencial zeta e
características organolépticas.
4.4.1 Tamanho de partícula, polidispersidade, potencial zeta e pH
Para análises do diâmetro das partículas e polidispersidade, adicionaram-se
em uma cubeta de acrílico 50 L de amostra de emulsão e 3ml água destilada,
foram avaliados por espalhamento de luz dinâmica (“Dynamic Light Scattering –
DLS”). Para análise do potencial zeta foram utilizados 2 ml da solução anterior e
caracterizados por análise de fase de espalhamento de luz (“phase analysis light
scattering – PALS”).
A leitura do pH foi realizada diretamente no tubo falcon através de medidas
em pHmetro.
4.5 Estabilidade em fluídos gastrointestinais simulados
Suspensões de nanopartículas na concentração final de 1% (m/v) foram
incubadas a 37 oC em meio gástrico simulado (USP XXIV, pH 1,2, pepsina 0,32%
m/v) e em meio intestinal simulado (USP XXIV, pH 7,5, pancreatina 1% m/v). Foram
coletadas amostras nos tempos 0, 1, 2, 3 e 4 h e depois de centrifugadas,
analisadas no equipamento de Light Scattering.
50
4.6 Teste de hemólise in vitro
Para avaliar o potencial hemolítico das emulsões utilizou-se como controle
positivo o Triton 1% (p/v) em água, considerado 100% hemolítico e como controle
negativo o tampão fosfato salino (PBS), pH = 7,4, não hemolítico. Os eritrócitos
foram separados por centrifugação (2.400 rpm/10min.), lavados com PBS e
novamente centrifugados, esse processo foi repetido por três vezes.
Foi avaliada a capacidade hemolítica da emulsão contendo 200mg de cada
um dos fármacos (miltefosina e tamoxifeno) por 20 ml de emulsão, da miltefosina em
solução de PBS e do controle (emulsão sem substância ativa). Foram preparadas
soluções com as substâncias mencionadas acima, na concentração de 51,5 mM
com PBS e com triton. Em tubos cônicos de 1,5 ml foram adicionados 0,5 mL da
suspensão de eritrócitos e 0,5 ml das soluções referidas, volume equivalente à
concentração de miltefosina de 700; 350; 175; 87,5 e 43,75mM. Como controle
negativo, foram misturados 0,5 ml de solução de eritrócitos com 0,5 ml de PBS e,
como controle positivo, 0,5 ml de solução de eritrócitos com 0,5 ml de Triton®.
Incubou-se no shaker a mistura por 1h a 37ºC, com leve agitação. Os tubos foram
centrifugados a 2.400 rpm/10min, o sobrenadante foi retirado e diluído 1:10 em água
destilada, para leitura no espectrofotômetro em comprimento de onda de 540 nm.
Todos os testes foram feitos em triplicata e a porcentagem de hemólise foi calculada
a partir das absorbâncias medidas, de acordo com:
100(%) xAA
AAHemólise
negativocontrolepositivocontrole
negativocontroleamostra
51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As nanoemulsões são formadas a partir de sistemas como água/óleo e
tensoativos. Para chegar a uma formulação base ideal para a incorporação do
fármaco miltefosina, Bitencourt (2011), fez inúmeros ajustes dos componentes até
alcançar a estabilidade físico-química satisfatória que foram: índice de acidez,
tamanho de partícula, potencial zeta e polidispersidade. A fase oleosa desta
formulação foi: colesterol 0,1%, glicerina 1%, óleo de semente de algodão 1%, ácido
oleico 1%. Fase aquosa: fosfatidilcolina 2%, Tween 80® 1%, e água destilada em
quantidade suficiente para 10ml. Essa composição foi utilizada neste trabalho, com a
finalidade de combinar os fármacos miltefosina e tamoxifeno, em diferentes
proporções, a fim de obter uma formulação com potente efeito leishmanicida e com
baixa toxicidade.
O tamoxifeno apresenta baixa solubilidade em água, comprometendo a
absorção por via oral e a biodisponibilidade deste fármaco. Para tentar melhorar
essas propriedades, o tamoxifeno é comercializado na forma de sal, o citrato de
tamoxifeno, mesmo assim observa-se baixa biodisponibilidade (MOREIRA et al,
2014). Como estratégia de sobrepor estas barreiras, foi proposto neste trabalho
veiculá-lo em nanopartículas lipídicas, não sendo necessário o citrato. Para o
desenvolvimento desse projeto, utilizou-se o tamoxifeno na forma neutra. Assim, o
fármaco que se encontrava na forma de sal – citrato de tamoxifeno, foi dissolvido em
água e o pH foi elevado para 7, precipitando o tamoxifeno, que foi filtrado e seco.
Para obter uma formulação com características físico-químicas consideradas
ideais, foram preparadas 7 formulações (Tabela 01), sendo 1 controle, sem ativo
(Branco), e 6 com as seguintes proporções de miltefosina versus tamoxifeno (3:1-
300:100mg); (1:1 - 200:200mg); (2:1 - 266:133); (3:1 - 225:75mg); (1:1 - 150:150mg)
e (2:1 - 200:100mg) para 20 ml de volume total de formulação.
52
Tabela 01- Diferentes concentrações de miltefosina e tamoxifeno em 20 ml de emulsão.
Durante o preparo das formulações, foi analisado o tamanho das partículas de
emulsão, a fim de estipular o tempo de homogeneização a alta pressão. Sendo que,
foi estipulado 50 minutos sob alta pressão de 100 a 150 Psi, e em seguida no
ultrassom, entre 10 e 40 minutos.
Após preparo, as formulações foram submetidas à centrifugação por 30
minutos a 2.400 rpm. Ao final, nenhuma das formulações apresentava precipitado,
indicando que os fármacos foram incorporados 100%, não sendo necessário fazer a
quantificação dos mesmos na forma livre. O aspecto macroscópico das formulações
é característico de suspensões de nanopartículas, de coloração branco-acinzentado
(Figura 20).
Figura 20 – Nanoemulsão com diferentes concentrações de miltefosina (Mt.) e tamoxifeno (Tm.) em 20ml de formulação: (1) – 0mg; (2) – 300mg Mt. c/ 100mg Tm.; (3) – 200mg Mt. c/ 200mg Tm.; (4) – 266mg Mt. c/ 133mg Tm.; (5) – 225mg Mt. c/ 75mg Tm.; (6) - 150mg Mt. c/ 150mg Tm.; (7) - 200mg Mt. c/100mg Tm.
Formulação Milteosina (mg) Tamoxifeno (mg)
1 0 0
2 300 100
3 200 200
4 266 133
5 225 75
6 150 150
7 200 100
53
A formulação 1, controle (Branco), apresenta aparência leitosa, com tamanho
de partícula maior. Já, as formulações com os fármacos são mais transparentes,
com tamanho de partícula menor, isso porque a miltefosina apresenta estrutura
química semelhante ao surfactante fosfatidilcolina. Dessa forma, a miltefosina age
como co-surfactante na formulação. Este fato demonstra que, além de suas
propriedades farmacológicas a miltefosina é capaz de aumentar a estabilidade das
formulações (BITENCOURT, 2011).
A fim de avaliar a estabilidade das formulações, foi retirada uma alíquota e
mantida em temperatura ambiente e a outra parte armazenada sob refrigeração por
um período de 15 dias, para verificar alterações físico-químicas. Durante o período
de observação as emulsões não apresentaram alterações macroscópicas, se
sustentaram estáveis, não ocorreu formação de precipitado, continuaram com
aspecto claro e transparente.
O pH das emulsões se manteve durante o tempo analisado, em uma média
de 4,6. As formulações apresentaram pH levemente ácido, que se manteve durante
o período de armazenamento, indicando que não ocorreu oxidação da fase oleosa,
sendo assim não formou hidrólise de triglicerídeos, consequentemente não liberou
ácidos graxos livres que seriam os responsáveis por levar a uma redução do pH na
formulação (PEREIRA et al, 2016).
A medida do tamanho das partículas foi feita por espalhamento de luz (laser),
mostrou que todas as formulações apresentam tamanho nanométrico.
A Tabela 02 mostra o tamanho das partículas (nm). Sendo a primeira leitura
(1) - ao término do preparo das formulações, ou seja, no dia em que foram
preparadas; a leitura (2) - feita após 15 dias armazenadas sob refrigeração a 4ºC e a
leitura (3) – realizada também após 15 dias, sendo as emulsões mantidas em
temperatura ambiente.
54
Tabela 02 – Tamanho das partículas (nm) com diferentes concentrações de miltefosina e tamoxifeno.
Ao observar a tabela 02, fica claro que a miltefosina atuou como co-
surfactante, reduzindo o tamanho das partículas das emulsões. O controle
(substância sem ativo), teve resultado maior que 100 nm, e as formulações contendo
a miltefosina resultaram em partículas menores que 100nm.
Para melhor visualização do tamanho das partículas presentes nas emulsões
segue o gráfico (Figura 21).
Figura 21 – Representação gráfica do tamanho das partículas das emulsões no dia do preparo
das emulsões e após 15 dias sob refrigeração e em temperatura ambiente.
Durante o período de armazenamento as formulações não sofreram
alterações de tamanho, se conservaram estáveis, exceto a formulação controle que
já no início apresentava tamanho maior que 100 nm. Vários fatores podem
Controle Miltefosina (mg) X Tamoxifeno (mg)
Leitura 0 300 X 100 200 X 200 266 X 133 225 X 75 150 X 150 200 X100
1 227,68 89,34 98,19 85,57 76,81 60,32 83,05 DP 2,41 1,38 2,35 1,31 0,69 0,58 0,44 2 236,1 86,14 98,84 93,47 77,98 65,35 84,84
DP 3,90 0,59 1,56 2,04 0,66 3,01 1,13 3 791,39 135,82 88,6 88,84 76,46 69,44 81,23
DP 23,00 1,82 1,18 1,19 1,21 4,79 0,50
DP = Desvio Padrão. Obs. Leitura 1 – no dia do prep. 2 – 15 dias após a 4 ºC , 3 – 15 dias temp. amb.
X = Versus
55
influenciar na estabilidade das emulsões, entre eles o tamanho, partículas grandes
tendem a sofrer mais a força gravitacional. Além disso, agitação e variações de
temperatura também promovem a instabilidade das partículas de emulsão. A
emulsão controle apresentou menor estabilidade que as demais em temperatura
ambiente, seguida da 300mg de miltefosina com 100mg de tamoxifeno. O tamanho
das partículas de emulsão é um parâmetro muito importante, quanto menor, maior a
estabilidade do sistema (BRUXEL et al, 2012). Além disso, partículas menores
possuem maior interação com a membrana celular, facilitando o efeito farmacológico
(JAISWAL; DUDHE; SHARMA, 2015).
A polidispersidade é uma propriedade muito importante para a estabilidade
das nanopartículas. Ela indica a variabilidade de tamanho das partículas suspensas
na formulação, quanto menor o valor da polidispersidade, mais estável a formulação,
evitando a formação de agregados e a coalescência (MEYAGUSKU 2014).
Tabela 03 – Média da polidispersidade com diferentes concentrações de fármacos em 20ml
Polidispersidade
Leitura Miltefosina (mg) X Tamoxifeno (mg)
Controle 300 X 100 200 X 200 266 X 133 225 X 75 150 X 150 200 X 100
1 0,25 0,34 0,35 0,34 0,29 0,29 0,34
DP 0,01 0,01 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01
2 0,27 0,34 0,35 0,35 0,31 0,32 0,34
DP 0,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01
3 0,27 0,35 0,35 0,36 0,32 0,31 0,35
DP 0,03 0,00 0,00 0,01 0,01 0,01 0,00
DP = Desvio Padrão. Obs. Leitura 1 – no dia do prep. 2 – 15 dias após a 4 ºC, 3 – 15 dias temp. amb.
X = Versus
O valor da polidispersidade da nanoemulsão controle foi relativamente menor
comparada as formulações contendo os fármacos (Tabela 03), porém ao longo do
período analisado não houve alteração, se conservou próximo dos resultados
iniciais, pois o aumento do valor pode indicar variação nas propriedades físico-
químicas das partículas das emulsões, sugerindo coalescência entre as partículas,
que pode levar à perda de alguns dos componentes.
Embora a dispersão entre as partículas presentes na formulação controle seja
menor, as nanoemulsões contendo fármacos possuem tamanho de partículas
menores e com maior estabilidade (Figura 21).
56
O potencial zeta apresenta a carga total de uma partícula, que indica o grau
de repulsão entre as partículas, quanto mais alto o valor, tanto negativo quanto
positivo, maior a estabilidade da formulação, pois a repulsão elétrica impede a
formação de agregados de partículas (DAS, 2011). Por isso, o ideal é que o valor do
potencial zeta seja superior a 30 mV ou inferior a - 30 mV, conferindo estabilidade ao
sistema.
Na tabela 04 estão representados os valores de potencial zeta das partículas
com relação à concentração de fármacos nas emulsões. Os valores encontrados
para as emulsões na leitura 1 (no dia preparo) foram maiores que -30 mV, o que não
indica necessariamente princípio de instabilidade pois existem carregamentos de
fármacos diferentes nas partículas que podem afetar a carga superficial, alterando o
valor do potencial zeta (CASTANHEIRA, 2012). Na leitura 2, realizada após 15 dias
armazenadas sob refrigeração a 4ºC o valor apresentado foi de aproximadamente ±
30 mV, exceto a formulação com 150mg de miltefosina e 150mg de tamoxifeno que
ficou em -46,31mV (aparenta boa estabilidade). Esta mesma formulação, na leitura 3
acompanhada da emulsão com 300mg de miltefosina e 100mg de tamoxifeno,
apresentaram maior constância, mostrando ser possível obter boa estabilidade na
nanoemulsão com diferentes fármacos associados e em temperaturas variadas.
Este fato de alterar a carga após armazenamento pode ser por estabilização
termodinâmica do sistema, com uma melhor organização das cargas superficiais
(JAISWAL; DUDHE; SHARMA, 2015).
Tabela 04 – Potencial Zeta (mV) com diferentes concentrações de miltefosina e tamoxifeno.
Potencial Zeta (mV)
Controle Miltefosina (mg) X Tamoxifeno (mg)
Leitura 0 300 X100 200 X 200 266 X 133 225 X 75 150 X 150 200 X100
1 -26,79 -29,94 -22,54 -22,14 -16,27 -17,09 -16,32
DP 1,03 0,36 7,74 6,9 6,5 4,13 4,56
2 30,12 -31,94 -30,21 32,15 31,36 -46,31 -29,54
DP 1,3 2,15 1,15 1,4 2,78 3,01 3,12
3 15,01 -39,04 -4 7,51 17,92 31,56 17,94
DP 1,73 1,41 11,77 7,76 4,49 4,92 3,96
DP = Desvio Padrão. X = Versus. Obs. Leitura 1 – no dia do prep., 2 – 15 dias após a 4 ºC ,
3 – 15 dias temp. amb.
57
Valores altos de potencial zeta contribuem para a estabilidade das
nanoemulsões, todavia existem outros parâmetros como tamanho das partículas,
polidispersidade, temperatura, pH do meio e estabilidade química dos componentes,
que também contribuem com a estabilidade das mesmas.
A estabilidade em fluídos gastrointestinais simulados foi avaliada com todas
as nanoemulsões contendo fármacos em diferentes concentrações e na emulsão
controle (não contém fármaco). Neste teste as nanopartículas podem sofrer
degradação e liberar os fármacos, que na forma livre poderão sofrer agregação, ou
outros fenômenos de instabilidade, como alteração no tamanho das partículas por
coalescência (aumento) ou contração das partículas pela ação enzimática
(FATOUROS; MULLERTZ, 2007).
O gráfico a seguir (Figura 22) mostra o tamanho das partículas das
nanoemulsões após passar pela avaliação em fluido gástrico simulado, pepsina e,
intestinal simulado, pancreatina. Como referencial, foi utilizado o tamanho das
partículas sem influencia dos fluidos gastrointestinais simulado. As formulações
foram submetidas ao teste após quinze dias mantidas sob-refrigeração.
Figura 22 – Dimensionamento de partículas das nanoemulsões contendo diferentes concentrações
de fármacos e do controle (sem fármaco), e dos mesmos em fluido gástrico simulado - pepsina (pH
1.2) e fluido intestinal simulado pancreatina (pH 7.5), branco (contém só pepsina e a pancreatina).
Dados são expressos em média ± D.P.
58
Todas as nanoemulsões em contato com a pepsina sofreram redução de
tamanho das partículas, devido à contração das mesmas pela ação enzimática. Já,
as nanoemulsões em contato com pancreatina sofreram aumento de tamanho,
sugerindo agregação de enzima pancreática nas partículas lipídicas, exceto na
formulação contendo 150mg de cada fármaco onde ocorreu um aumento de 9,22
vezes o seu tamanho, indicando possível coalescência, ou maior agregação de
enzima à superfície das partículas. Essa ampliação no tamanho promoveu aumento
da polidispersidade, que foi de 0,38 ± 0,01, maior resultado entre as formulações,
que ficaram entre 0,25 (controle) e 0,36 a 0,37 (emulsões com fármacos).
As formulações analisadas não apresentaram formação de agregados, e
mesmo sem adição de antioxidantes e conservantes os resultados foram
promissores em ambas as situações.
A figura 23 mostra o resultado do potencial hemolítico da nanoemulsão
contendo 200mg de miltefosina com 200mg de tamoxifeno (escolhida por conter
maior concentração de ambos os fármacos), comparada com a miltefosina na forma
livre (não encapsulada) e a nanoemulsão controle (não contendo fármaco).
Figura 23 – Quantificação de hemólise (%) de eritrócitos do sangue humano em função da concentração de Miltefosina - () Miltefosina na forma livre - () nanopartículas lipídicas com 200mg de cada fármaco - () formulação controle (sem fármaco). Dados são expressos em média ± D.P.
59
Observa-se que o encapsulamento dos fármacos reduziu o potencial
hemolítico, quando comparado com a miltefosina na forma livre (não encapsulada
em emulsão lipídica). Isso ocorre em todas as concentrações a partir de 22 µM. Em
350 µM tanto a formulação controle (32,30%) quanto à miltefosina na forma livre
(78,74%), ocasionaram mais hemólise do que a formulação contendo os fármacos
(10,50%). Seguida da concentração de 700 µM, a miltefosina na forma livre
ocasionou quase 100% de hemólise enquanto que o fármaco encapsulado foi de
11,55%. Segundo DAS, ZHUKOVA e colaboradores (2010), o encapsulamento da
miltefosina em nanosistemas carreadores de drogas reduz o potencial hemolítico do
fármaco.
Os resultados obtidos mostram que a nanoemulsão pode ser altamente
promissora para administração dos fármacos estudados.
60
6 CONCLUSÃO
O propósito de desenvolver uma nanoemulsão com os fármacos miltefosina e
tamoxifeno combinado foi alcançado.
Durante o período de testes da caracterização físico-química, as formulações
se apresentaram estáveis, e os fármacos totalmente incorporados às nanopartículas.
Dentre as formulações analisadas, a que apresentou propriedades físico-
químicas mais apropriadas foi a emulsão com 150mg de miltefosina e 150mg de
tamoxifeno, seu tamanho foi de 65,35 nm, isso irá permitir maior interação celular e
consequentemente melhor ação farmacológica.
O resultado dos testes de estabilidade em fluídos gastrointestinais simulados
mostrou que a nanoemulsão foi estável. E no teste de hemólise in vitro o
encapsulamento dos fármacos em nanoemulsão reduziu o potencial hemolítico da
miltefosina.
Partindo destes resultados a nanoemulsão contendo os fármacos miltefosina
e tamoxifeno representa uma alternativa promissora a ser explorada no tratamento
da leishmaniose. E como perspectiva futura, pesquisa com a formulação alcançada
avaliando a atividade leishmanicida in vitro e in vivo.
61
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