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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
Avaliação Sistemática para o Dimensionamento de
Microbiorreatores como Ferramentas no Desenvolvimento
e Otimização de Bioprocessos
Raphael Carvalho Prado
Rio de Janeiro
2017
ii
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos
Raphael Carvalho Prado
Avaliação Sistemática para o Dimensionamento de Microbiorreatores como
Ferramentas no Desenvolvimento e Otimização de Bioprocessos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos, Escola de Química, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, para obtenção do grau de Mestre em
Ciências.
Orientador:
Prof. Elcio Ribeiro Borges, D.Sc.
Rio de Janeiro
2017
iii
F ICHA CATALOGRÁFICA
Prado, Raphael Carvalho.
Avaliação Sistemática para o Dimensionamento de Microbiorreatores
como Ferramentas no Desenvolvimento e Otimização de Bioprocessos/
Raphael Carvalho Prado. Rio de Janeiro:UFRJ/EQ, 2018.
Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Escola de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos, 2018.
Orientador: Elcio Ribeiro Borges, DSc.
1. Microbiorreatores 2. Extrapolação 3. Microfluídica 4. Dimensionamento
I. Ribeiro Borges., Elcio (Orientador) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Química. Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. III. Avaliação Sistemática para o Dimensionamento de Microbiorreatores como Ferramentas no Aprimoramento e Desenvolvimento de Bioprocessos.
iv
v
AGRADECIMENTOS
Ao longo da jornada que tomo por vida, a dádiva de conhecer pessoas singulares torna
valiosa e engrandecedora toda experiência vivida de forma sublime. É preciso reconhecer o
prestígio daqueles que nos cercam, pois nenhum homem jamais clamou vitória apenas pelo
caminhar dos próprios pés. Deixo aqui o meu sincero agradecimento àqueles que de alguma
forma acreditaram e apoiaram meus devaneios.
Primeiramente, agradeço a minha brilhante avó, Maria das Graças, aquela que considero
ser o maior exemplo de virtude. Assim como Virgílio orienta Dante Alighieri em sua Divina
Comédia, a Sra. Maria tem me conduzido pela vida, ensinando-me a importância e a razão de
cada passo, obstáculo, queda, aclive e conquista.
Em segundo lugar, gostaria de expressar gratidão à minha família e amigos, os quais
foram medulares na persistência e realização deste trabalho. Muitas das vezes, foram esses que
me ajudaram a seguir em frente sem olhar para trás.
Agradeço também ao meu orientador Dr. Elcio Borges, quem acreditou em minhas
ideias desde o início, conduzindo-me pelo árduo caminho dessa conquista.
À Dra. Sabrina Oliveira, quem me acompanhou pelo mundo da prospecção tecnológica
com simpatia e bom grado.
À professora Dra. Anita do Valle que apostou em minhas ideias e tornou-se fundamental
para o desenvolvimento dos microbiorreatores.
Ao professor Dr. Ricardo Michel, possuidor de uma mente brilhante e um espírito
humilde, sempre disposto a oferecer conhecimento e conselhos valiosos.
Ao Cidnei e demais amigos da oficina de mecânica do Instituto de Química da UFRJ,
sem os quais os microbiorreatores não teriam se tornado tão fascinantes como o são.
À professora Dra. Maria Antonieta, quem muito me concedeu ensinamentos valiosos.
Finalmente, ao Vinícius Nirello, aquele que esteve lá quando mais precisei, quem
estendeu a mão sem exigir nada em troca.
vi
It is impossible to live without failing at something, unless
you live so cautiously that you might as well not have
lived at all – in which case you have failed by default.
J. K. ROWLING
vii
RESUMO
PRADO, Raphael Carvalho. Avaliação Sistemática para o Dimensionamento de
Microbiorreatores como Ferramentas no Desenvolvimento e Otimização de Bioprocessos.
Orientador: Elcio Ribeiro Borges. Dissertação de Mestrado. Programa de Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Rio de Janeiro, 2018.
Microbiorreatores são dispositivos miniaturizados capazes de realizar testes de
screening de alto rendimento, de forma rápida e barata usando pequenas quantidades de
reagentes. Além disso, essas ferramentas são versáteis e podem permitir um melhor controle de
parâmetros quando comparados aos reatores de escalas convencionais. Dentro da engenharia e
desenvolvimento de bioprocessos industriais, os microbiorreatores consistem, portanto, em
ferramentas poderosas capazes de gerar dados prontamente precisos. Consequentemente, essa
tecnologia vem ganhando a atenção da comunidade científica nos últimos anos. Mediante esse
cenário, o presente trabalho descreve o estudo prospectivo sobre as oportunidades e tendências
dos microbiorreatores e sua tecnologia para o desenvolvimento de bioprocessos, bem como no
desenvolvimento de dois fotomicrobiorreatores especializados no cultivo de Spirulina maxima.
Em uma primeira instância, com o objetivo de desenhar uma imagem comparativa sobre tal
abordagem, o estudo acompanhou a evolução das publicações científicas obtidas a partir da
base de dados Scopus® e dos depósitos de patentes oriundos da base Orbit Intelligence®,
juntamente com a identificação das tendentes estratégias adotadas no desenvolvimento e na
aplicação da tecnologia dos microbiorreatores. Como resultados desta prospecção, foram
analisados 286 artigos científicos e 220 documentos de patentes, os quais descreveram uma
forte atuação do cenário internacional na pesquisa e desenvolvimento de microbiorreatores,
onde destacaram-se os Estados Unidos da América (73 artigos e 80 patentes), Japão (15 artigos
e 90 patentes), Alemanha (43 artigos e 6 patentes) e Grã-Bretanha (35 artigos e 5 patentes).
Entretanto, foi evidenciada a incipiente presença brasileira em artigos (1.4% dos documentos)
e ausência de pedidos de patentes por residentes brasileiros. Identificou-se ainda a
predominância do uso de poli(dimetilsiloxano) (PDMS; 33% dos documentos) e poli(metil-2-
metilpropenoato) (PMMA; 24% dos documentos) como principais materiais para a fabricação
de microbiorreatores. Embora tenha sido detectada uma quantidade relativamente pequena de
artigos, há um aumento progressivo no número de documentos, indicando a tendente adoção
dos microbiorreatores em estudos envolvendo respostas metabólicas e fisiológicas de células,
screening molecular e desenvolvimento e otimização de bioprocessos. Fatores como a
juventude da tecnologia e a multidisciplinariedade envolvida em tal abordagem ajudam a
viii
justificar a construção desse panorama. Em segunda instância, foram desenvolvidos
fotomicrobiorreatores de PMMA e policarbonato, sendo avaliados perante a
biocompatibilidade com células de S. maxima. Como resultado, as células foram capazes de
sobreviver e realizar atividade fotossintética por três dias de cultivo. Entretanto, foi detectado
um alto teor de evaporação a partir do meio de cultivo empregado, enfatizando a necessidade
de trabalhos futuros para o sucesso da aplicação dos dispositivos construídos. Sob a luz de tais
fatores, o presente trabalho representa um primeiro passo importante no campo da prospectiva
tecnológica de uma abordagem estratégica para o desenvolvimento de bioprocessos industriais
e muitas outras aplicações biotecnológicas.
Palavras-chave: microbiorreator, microfluídica, scale-down, bioprocesso, biotecnologia, prospecção
ix
ABSTRACT
PRADO, Raphael Carvalho. Systematic Evaluation for the Scaling-down of
Microbiorreactors as Tools for the Development and Optimization of Bioprocesses.
Orientador: Elcio Ribeiro Borges. Dissertação de Mestrado. Programa de Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Rio de Janeiro, 2018.
Microbioreactors are miniaturized devices able to provide high-throughput screening
tests in a fast and cheap manner by using small amounts of reagents. Furthermore, such tools
are versatile and may allow a better control of parameters when compared to conventional
bench-scale reactors. Within the engineering and development of industrial bioprocesses,
microbioreactors are thus powerful tools able to promptly generate precise data.
Consequentially, this technology has been gaining attention by the scientific community over
the past years. In such scenario, a prospective study was carried out concerning the
opportunities and trends of microbioreactors and their technology for the development of
bioprocesses, as well as the development of two photomicrobioreactors specialized in the
cultivation of Spirulina maxima. On a first instance, aiming the draw of a comparative picture
about such approach, the study monitored the evolution of scientific publications from the
database Scopus® and patent deposits obtained from the database Orbit Intelligence®, alongside
with the identification of trending strategies adopted on both development and application of
the microbioreactor technology. As a result of the prospection study, 286 scientific articles and
220 patent documents were analysed, describing the strong performance of the international
scenario in the research and development of microbioreactors, highlighting the United States
of America (73 articles and 80 patents), Japan (15 articles and 90 patents), Germany (43 articles
and 6 patents) e Great Britain (35 articles and 5 patents). However, it was evidenced the
incipient presence of Brazil in the publication of articles (1.4% of total documents) and absence
of patent applications by Brazilian residents. Furthermore, it was identified the predominance
of elastomers poly(dimethylsiloxane) (PDMS; 33% of total documents) and poly(methyl-2-
methylpropenoate) (PMMA; 24% of total documents) as the main materials for the fabrication
of microbioreactors. Even though a relatively small quantity of scientific publications was
realized through the research, there is a progressive increase on the number of such documents
indicating the trending adoption of microbioreactors on studies involving metabolic and
physiological responses of cells, molecular screening and development and optimization of
bioprocesses. Factors such as the youth of the microbioreactor technology and the
multidisciplinary involved in such approach may have contributed to the construction of such
x
panorama. In the second instance, photomicrobioreactors made of PMMA and polycarbonate
were developed and evaluated for the biocompatibility with S. maxima. As a result, the cells
were able to survive and carry out photosynthetic activity for three days of cultivation.
However, a high evaporation index was detected from the culture medium adopted,
emphasizing the need for future work to successfully implement the devices hereby developed.
Therefore, this work represents an important first step in the field of technological prospect of
a strategic approach for the development of industrial bioprocesses and many other
biotechnological applications.
Keywords: microbioreactor, microfluidic, scale-down, bioprocess, biotechnology, foresight
xi
SUMÁRIO
RESUMO vii
ABSTRACT ix
LISTA DE FIGURAS xiii
LISTA DE TABELAS xvi
LISTA DE QUADROS xvi
LISTA DE SIGLAS xvii
LISTA DE COMPOSTOS QUÍMICOS xix
LISTA DE LETRAS GREGAS xx
LISTA DE UNIDADES MEDIDAS xx
CAPÍTULO 1 APRESENTAÇÃO DO TEMA 21
1.1 INTRODUÇÃO 21
1.2 JUSTIFICATIVA 23
1.3 OBJETIVOS 24
1.3.1 Objetivos Específicos 24
1.4 ESTRUTURAÇÃO DO DOCUMENTO 25
CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 26
2.1 A ORIGEM DOS MICROBIORREATORES 26
2.2 MICROFLUÍDICA 30
2.2.1 Forças Físicas 31
2.2.2 Composição Material e Métodos de Microfabricação 33
2.2.3 Configurações Geométricas e suas Abordagens 39
2.3 MICROBIORREATORES APLICADOS AOS BIOPROCESSOS 46
2.3.1 Microbiorreatores de Micropoços e Microfluídicos 47
2.3.2 Particularidades dos Microbiorreatores 52
2.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS 60
CAPÍTULO 3 PROSPECÇÃO TECNOLÓGICA 62
CAPÍTULO 4 METODOLOGIA 66
4.1 FASE 1: PREPARATÓRIA 66
xii
4.2 FASE 2: PRÉ PROSPECTIVA 66
4.2.1 Estratégia de Busca 67
4.2.2 Análise Taxonômica de Artigos Científicos 70
CAPÍTULO 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 72
5.1 FASE 3: PROSPECTIVA 72
5.1.1 Base de Dados de Artigos Científicos - Scopus® 74
5.1.2 Análise Taxonômica de Artigos Científicos 81
5.1.3 Base de Dados de Patentes – Orbit Intelligence® 91
5.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS 105
CAPÍTULO 6 ESTUDO DE CASO 106
6.1 INTRODUÇÃO 106
6.2 METODOLOGIA 107
6.2.1 Design do Microbiorreator e Suporte para Cultivo 107
6.2.2 Análise de Biocompatibilidade à S. maxima 109
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 110
CAPÍTULO 7 CONCLUSÃO E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 116
7.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS 116
7.2 CONCLUSÕES 116
7.3 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 118
CAPÍTULO 8 REFERÊNCIAS 120
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Linha do tempo destacando os principais eventos que tecem a origem e o
surgimento dos microbiorreatores. Fonte: Elaboração própria. 29
Figura 2. Exemplo de um protocolo padrão de litografia suave para a fabricação de
micropoços, adotando PDMS como substrato. 38
Figura 3. Dispositivos microfluídicos baseados em microarranjos. 40
Figura 4. Dispositivos microfluídicos de gradiente de concentração. 42
Figura 5. Abordagens baseadas em microarranjos de células únicas. 44
Figura 6. Dispositivos microfluídicos droplet. 46
Figura 7. Microbiorreatores como ferramentas para análise de fermentações. 50
Figura 8. Desenho esquemático dos métodos ativos de mistura em microbiorreatores. 54
Figura 9. Fluxograma das principais estratégias para detecção e controle de parâmetros em
microbiorreatores. 59
Figura 10. Sequência de fases a serem adotadas para a execução, organização e conclusão da
prospecção tecnológica segundo Bahruth, Antunes e Bomtempo (2006). 64
Figura 11. Descrição da seção, classe e subclasse da CIP abordada na estratégia de
prospecção tecnológica de patentes. 68
Figura 12. Avaliação da pertinência dos documentos obtidos a partir da estratégia de busca
adotada referente ao tema de cada documento. 73
Figura 13. Evolução temporal das publicações científicas sobre a tecnologia dos
microbiorreatores, a partir da base de dados Scopus®. 74
Figura 14. Países de origem das publicações científicas obtidas a partir da base Scopus®. 75
Figura 15. Principais autores de artigos científicos obtidas a partir da base Scopus®. 76
Figura 16. Principais instituições filiadas aos artigos científicos obtidos a partir da base
Scopus®. 77
Figura 17. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que
disponibilizaram o detalhamento do microbiorreator em estudo. 81
Figura 18. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que realizaram
estudos comparativos entre os resultados obtidos utilizado microbiorreatores e reatores de
escalas convencionais. 82
xiv
Figura 19. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que apresentaram
aplicações práticas aos microbiorreatores desenvolvidos. 83
Figura 20. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que realizaram e
disponibilizaram o cálculo de parâmetros relevantes para o bioprocesso em questão. 84
Figura 21. Natureza (material ou modelo comercial) dos microbiorreatores abordados nos
artigos científicos obtidos a partir das buscas na base Scopus®. 85
Figura 22. Biocatalisadores abordados nos bioprocessos descritos nos artigos obtidos a partir
das buscas na base Scopus®. 86
Figura 23. Finalidades dos bioprocessos envolvidos nos artigos obtidos a partir das buscas na
base Scopus®. 87
Figura 24. Parâmetros detectados e controlados nos artigos obtidos a partir das buscas na
base Scopus®. 88
Figura 25. Análise da capacidade temporal de inserção dos microbiorretores no mercado, a
partir dos artigos obtidos a partir das buscas na base Scopus®. 90
Figura 26. Evolução do cenário patentário referente aos microbiorreatores e sua tecnologia, a
partir da base de dados Orbit Intelligence®. 91
Figura 27. Principais territórios geográficos depositantes de patentes referente aos
microbiorreatores e sua tecnologia, a partir da base de patentes Orbit Intelligence®. 92
Figura 28.Quantidade de documentos de patentes oriundos dos principais detentores ao longo
dos anos 1980 e 2015. 93
Figura 29. Correlação entre os principais países depositantes de patentes e o ano do depósito,
conforme os resultados obtidos a partir da base Orbit Intelligence®. 94
Figura 30. Principais instituições depositantes dos documentos de patente sobre os
microbiorreatores e sua tecnologia, obtidos a partir da base Orbit Intelligence®. 95
Figura 31. Frequência anual do depósito de patentes pelas principais empresas depositantes a
partir das buscas relizadas na base Orbit Intelligence®. 96
Figura 32. Mapa de correlação cruzada entre as instituições titulares de patentes sobre a
tecnologia dos microbiorreatores, obtido a partir de pesquisas na base Orbit Intelligence®. O
número de co-autorias é identificado a nas ligações entre as instituições, bem como na
espessura da ligação, a qual é proporcional ao número de co-autorias. 99
Figura 33. Principais Classificações Internacionais de Patentes (CIP) encontradas nos
documentos sobre a tecnologia dos microbiorreatores extraídos da base Orbit Intelligence®.
100
xv
Figura 34. Principais territórios geográficos onde foram depositadas as patentes referentes
aos microbiorreatores e sua tecnologia a partir da base Orbit Intelligence®. 102
Figura 35. Natureza das abordagens referentes aos microbiorreatores referentes aos
documentos obtidos a partir da base Orbit Intelligence®. 103
Figura 36. Alvos das reações químicas e bioquímicas para os quais foram destinados os
dispositivos das patentes obtidas a partir das buscas na base Orbit Intelligence®. 104
Figura 37. Ilustração CAD do microbiorreator projetado para o cultivo de S. maxima,
construído a partir do software SolidWorks®. 108
Figura 38. Ilustração CAD do suporte para microbiorreator construído a partir do software
SolidWorks®: (A) ilustração do display completo, incluindo a integração com um spartphone
para registro fotográfico e uma lâmpada como fonte luminosa; (B) ilustração do suporte
isolado; (C) visão superior do suporte. 109
Figura 39. Dispositivos e aparatos desenvolvidos: (A) microbiorreator feito a partir de
policarbonato ou PMMA; (B) suporte para o cultivo de células de S. maxima no
microbiorreator; (C) display do cultivo de S. maxima a partir dos microbiorreatores
desenvolvidos. 111
Figura 40. Cultura de S. maxima em microbiorreatores de policarbonato (à esqueda) e
PMMA (à direita) com um dia de cultivo. As câmaras de cultivo 1, 2 e 3 são indicadas na
figura por C1, C2 e C3, respectivamente. 112
Figura 41. Cultura de S. maxima em microbiorreatores de policarbonato (à esqueda) e
PMMA (à direita) com três dia de cultivo. As câmaras de cultivo 1, 2 e 3 são indicadas na
figura por C1, C2 e C3, respectivamente. 113
Figura 42. Micrografia das células de S. maxima cultivadas por três dias em
microbiorreatores de policarbonato (A) e PMMA (B), a partir da lente objetiva 40x. 115
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultados obtidos e avaliados a partir das buscas utilizando as bases Scopus® e
Orbit Intelligence®. 73
Tabela 2. Títulos, instituições, autores e ano de publicação dos artigos publicados somente
por instituições brasileiras, obtidos a partir da base Scopus®. 79
Tabela 3. Volume evaporado nos microbiorreatores de policarbonato e PMMA após um e três
dias de cultivo de S. maxima. 114
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Materiais adotados na fabricação de dispositivos microfluídicos e suas principais
características. 34
Quadro 2. Palavras-chave abordadas na estratégia de busca da prospecção tecnológica de
patentes. 68
Quadro 3. Descrição das subseções da CIP C12M adotadas na metodologia de prospecção
tecnológica de patentes. 69
Quadro 4. Estratégia de busca adotada para a busca de pedidos de patentes na base de dados
Orbit Intelligence®. 69
Quadro 5. Período de abrangência e de realização das buscas para cada base de dados
adotada. 70
Quadro 6. Taxonomias adotadas na análise taxonômica dos artigos científicos. 70
Quadro 7. Principais Classificações Internacionais de Patentes (CIP) encontradas nos
documentos sobre a tecnologia dos microbiorreatores a parti da base Orbit Intelligence®. 101
xvii
LISTA DE SIGLAS
C1 – Câmara 1
C2 – Câmara 2
C3 – Câmara 3
Ca – Número capilar
CAD – Desenho computacional (do Inglês computer aided design)
Caltech – California Institute of Technology
CE – Eletroforese capilar (do Inglês capilar electrophoresis)
CIP – Classificação Internacional de Patentes
DARPA – Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (do Inglês Defense Advanced
Research Projects Agency)
DNA – Ácido desoxirribonucleico (do Inglês deoxyribonucleic acid)
DO – Densidade óptica
DTU – Danmarks Tekniske Universitet
GPC – Cromatografia de fase gasosa (do Inglês gas-phase chromatography)
HPLC – Cromatografia líquida de alta precisão (do Inglês high precision liquid
chromatography)
hPSCs – Células tronco pluripotentes de humano (do Inglês human pluripotent stem cells)
ISFET – Transistores de efeito de campo sensíveis a íons (do Inglês ion-sensitive field-effect
transistor)
KLa – Coeficiente de transferência de oxigênio
LED – Diodos emissores de luz (do Inglês light emitting diode)
LOM – Fabricação de objetos laminados (do Inglês laminated object manufacturing)
MEMS – Sistemas microeletromecânicos (do Inglês microelectromechanic systems)
MIT – Massachusetts Institute of Technology
xviii
mRNA – Ácido ribonucleico mensageiro (do Inglês messenger ribonucleic acid)
OD – Oxigênio dissolvido
PCR – Reação de polymerase em cadeia (do Inglês polymerase chain reaction)
PCT – Tratado de Cooperação de Patentes (do Inglês Patent Cooperation Treaty)
PDMS – poli(dimetilsiloxano)
Pe – Número de Péclet
PMMA – poli(metil-2-metilpropenoato)
Re – Número de Reynolds
RTD – Resistência detectoras de temperatura (do Inglês resistance temperature detector)
UCL – University College London
UFJF – Universidade Federal de Juiz de Fora
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
USDOD – Departamento de Defesa dos Estados Unidos (do Ingês United States Department of
Defense)
USP – Universidade de São Paulo
UV – Ultravioleta
We – Número de Weber
WO – Escritório Internacional de Patentes (do Inglês World International Office)
μTAS – Sistemas de Análise Micro Total (do Inglês micro total analysis systems)
xix
LISTA DE COMPOSTOS QUÍMICOS
CaCl2 – Cloreto de cálcio
Co(NO3)2 – Nitrato de Cobalto
CO2 – Dióxido de carbono
CuSO4 – Sulfato de cobre
FeSO4 – Sulfato de Ferro
H+ - Hidrogênio molecular
H3BO3 – Ácido bórico
K2HPO4 – Fosfato dipotássico
K2SO4 – Sulfato de potássio
MgSO4 – Sulfato de magnésio
MnSO4 – Sulfato de manganês
Na2CO3 – Carbonato de sódio
Na2EDTA - Diidrato de etilenodiaminotetraacetato dissódico
Na2MoO4 – Molibdato de sódio
NaCl – Cloreto de sódio
NaHCO3 – Bicarbonato de sódio
NaNO3 – Nitrato de sódio
NH3 - Amônia
O2 - Oxigênio
OH- - Hidroxila
ZnSO4 – Sulfato de zinco
xx
LISTA DE LETRAS GREGAS
γ - Tensão interfacial entre duas fases
μ - Viscosidade do fluido
ρ - Densidade do fluido
LISTA DE UNIDADES MEDIDAS
µL - Microlitro
µmol m-2 s-1 – Micromol por metro quadrado por segundo
atm – Atmosfera
cm – Centrímetro
g L-1 – Grama por litro
g m-2 – Grama por metro quadrado
Kg/m3 – Quilograma por metro cúbico
m - Metro
m/s – Metro por segundo
mL - Mililitro
N/m – Newton por metro
oC – Grau Celsius
Pa.s – Pascal segundo
W – Watt
21
CAPÍTULO 1 APRESENTAÇÃO DO TEMA
1.1 INTRODUÇÃO
Durante os últimos anos, a miniaturização dos biorreatores tem sido altamente estudada
com uma perspectiva de novas e excelentes técnicas de alto rendimento para abordagens
bioquímicas (WHITESIDES, 2006). Frutos de pesquisas no campo da microfluídica, a ciência
que estuda e manipula pequenas quantidades de fluidos, os microbiorreatores compõem uma
tecnologia que oferece a possibilidade de se realizar bioprocessos sob a microescala. Ao
combinar dos princípios da microfluídica e da bioquímica, tal abordagem apresenta vantagens
em relação ao método tradicional que usa biorreatores de escala de bancada, uma vez que
permite realizar bioprocessos em condições dinâmicas e flexíveis (SZITA et al., 2005;
MICHELETTI; LYE, 2006; SCHÄPPER et al., 2009). Portanto, essa estratégia pode permitir
um alto rendimento de dados experimentais através de métodos baratos e precisos (SCHÄPPER
et al., 2009).
No contexto industrial, uma série de variáveis atua como gargalos para a melhoria de
muitos bioprocessos devido à sua alta complexidade e uma relativa baixa quantidade de
informações quanto à sua natureza (SCHMIDELL et al., 2001; MICHELETTI; LYE, 2006). Já
no âmbito acadêmico, muitos bioprocessos não são levados adiante uma vez que suas taxas
reacionais de transformação e rendimentos de produção não são viáveis para uma escala
industrial ou simplesmente por falta de conhecimento sobre variáveis específicas
(SCHMIDELL et al., 2001). Em ambos os casos, a aplicação da tecnologia dos
microbiorreatores tornaria possível um estudo completo de tais variáveis, oferecendo suficiente
compreensão de seu comportamento e, assim, superando tais gargalos e abrindo um novo
caminho para estudos futuros de aprimoramento, otimização e melhoramento de bioprocessos.
Os benefícios oferecidos pela aplicação dos microbiorreatores em bioprocessos devem
a três vantagens diferenciais principais que têm grande impacto na obtenção de dados
relevantes. O primeiro diferencial versa sobre a característica simples e mais óbvia dessa
tecnologia: a pequena quantidade de reagentes necessária para realizar experimentações. Cabe
ressaltar que a microfluídica é baseada na microescala, os volumes de meio de cultivo, inóculo
e outros reagentes adicionais aplicados em um microbiorreator são substancialmente pequenos,
influenciando diretamente no orçamento de ensaios para experimentações (WHITESIDES,
2006). O segundo diferencial consiste no tempo gasto para a obtenção de dados. Como o
22
volume de trabalho exigido por esta tecnologia transita na escala micro, menos moléculas são
submetidas a transformações biológicas e químicas, reduzindo o tempo gasto até o passo final
de um bioprocesso (MICHELETTI; LYE, 2006). Este é um ponto relevante a ser considerado
quando vários ensaios precisam ser realizados. Por exemplo, a otimização de bioprocessos pode
levar muito tempo ao executar ensaios em escala de bancada, enquanto cada variável relevante
é testada. A paralelização (scaling out) de tais ensaios é restrita pela disponibilidade de
instalações que limitam vários centros de pesquisa a uma execução singular dos experimentos.
Por outro lado, vários microbiorreatores podem ser executados em paralelo (SZITA et al.,
2005), reduzindo as despesas de experimentação, pois são necessários menores espaços físicos
para instalações e, mais dados são produzidos em um menor intervalo de tempo. O terceiro
diferencial é uma consequência da tecnologia de microfabricação: há uma consistente redução
do manuseio humano em bioprocessos ao usar microbiorreatores, uma vez que existe a
possibilidade de automação tanto para as etapas upstream como para downstream ao aplicar de
tal tecnologia. Esta característica tem um efeito significativo na superioridade da resolução e
precisão de dados, permitindo uma melhor reprodutibilidade de condições abordadas e,
concomitantemente, a padronização do bioprocesso a ser conduzido (SZITA et al., 2005;
SCHÄPPER et al., 2010; HEGAB; ELMEKAWY; STAKENBORG, 2013). Portanto, espera-
se um menor erro experimental ao usar a tecnologia dos microbiorreatores, garantindo um maior
nível de confiabilidade dos resultados e das premissas definidas.
Tais vantagens exercem grande influência na elaboração de estratégias de pesquisa
sobre os mais diversos temas dos bioprocessos, uma vez que há uma redução substancial no
preço e no tempo de execução de experimentos, aliado ao aumento da precisão dos dados
resultantes (SZITA et al., 2005; MICHELETTI; LYE, 2006; SCHÄPPER et al., 2009; HEGAB;
ELMEKAWY; STAKENBORG, 2013). Os microbiorreatores podem, portanto, compreender
uma ótima alternativa para empresas e centros de pesquisa que precisam lidar com limitações
de suporte financeiro e instalações.
Devido à versatilidade de tais dispositivos, os microbiorreatores têm sido idealizados e
construídos a partir de diferentes naturezas, variando de tamanho, geometria, capacidade e
abordagens. Como consequência, o principal conceito de microbiorreator tem variado de acordo
com as pesquisas existentes, fazendo-se assim necessária a indicação e restrição de
características gerais dos dispositivos em grande parte dos estudos gerados sobre o tema
abordado. Conforme discutido adiante, no Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica, atualmente
existem duas abordagens relativas aos microbiorreatores: biorreatores de micropoços e
23
biorreatores microfluídicos. Com o objetivo de evitar um mal-entendido durante a leitura, o
presente trabalho considerar-se-á como fundamentação os microbiorreatores como dispositivos
de biorreatores microfluídicos, exceto quando especificados como biorreatores de micropoços,
tendo em vista a alta versatilidade e, portanto, maior aplicação da abordagem de biorreatores
microfluídicos.
1.2 JUSTIFICATIVA
A proposta contida no presente trabalho foi concebida a partir do estudo minucioso e
sistemático sobre bioprocessos e suas tecnologias. Mediante eventual visita à Universidade de
Londres (University College London - UCL), Inglaterra, tomou-se ciência da tecnologia dos
microbiorreatores, adotada pelo Departamento de Engenharia Bioquímica da universidade para
a engenharia de bioprocessos industriais, alimentando a hipótese de amadurecer o
conhecimento e intensificar as pesquisas no cenário nacional.
Devido às características promissoras da adoção dos microbiorreatores como
ferramentas para o estudo e engenharia de bioprocessos, o desejo da adaptação,
desenvolvimento e implementação desses instrumentos nos laboratórios nacionais corroboram
com as justificativas motivacionais para a execução dessa tecnologia de forma enriquecedora.
Entretanto, até o momento de execução dos trabalhos deste estudo, notou-se que são poucos os
trabalhos publicados envolvendo os microbiorreatores e suas tecnologias, de origem nacional.
Mediante tais circunstâncias, suscita-se a necessidade do estudo cardinal sobre a
tecnologia dos microbiorreatores, com o intuito de gerar e propagar o conhecimento sobre as
técnicas envolvidas. Adicionalmente, mediante um instrumento de estudo pouco explorado, é
preciso estabelecer um estudo norteador, capaz de identificar tendências e oportunidades a
serem exploradas, para minimizar a ocorrência de falhas nos processos futuros e alcançar
resultados proeminentes, que possam ser considerados viáveis para a consolidação desse
processo de redução de escala. Sob tal contexto, a Prospecção Tecnológica torna-se uma
ferramenta medular na construção de uma linha de pesquisa sólida referente ao uso de
microbiorreatores como ferramentas para o estudo e a engenharia de bioprocessos.
Sob a luz de tais necessidades, a análise prospectiva desenvolvida no presente trabalho
surge como fruto da necessidade de se desenvolver as bases norteadoras a serem exploradas
para o desenvolvimento de microbiorreatores aplicados aos bioprocessos, bem como na
24
identificação de oportunidades e tendências a serem seguidas. Sendo assim, algumas das
principais justificativas que erigiram os estudos presentes neste trabalho são descritas a seguir:
➢ Os microbiorreatores são ferramentas promissoras, capazes de gerar dados com maior
precisão e eficiência, com onerosidade e tempo total de processo reduzidos;
➢ O desenvolvimento dessa tecnologia tem se demonstrado bastante promissor e por
consequência, vem sendo adotada de forma recorrente por laboratórios de pesquisa com
destaque internacional, configurando-se uma ferramenta fundamental para os estudos
voltados para bioprocessos;
➢ A popularidade dos microbiorreatores e sua tecnologia ainda é muito baixa no território
nacional, devido aos escassos estudos existentes acerca dessa temática;
➢ A ausência de estudos prospectivos sobre a tecnologia dos microbiorreatores e seus
derivados, tanto no contexto nacional como internacional.
1.3 OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo sistemático de prospecção
tecnológica visando elucidar o estado da arte e as condições para o dimensionamento e
desenvolvimento de um modelo de microbiorreator para testes iniciais em laboratório de
bioprocessos. Adicionalmente, a partir da base de dados Orbit Intelligence® (Questel, Paris),
objetiva-se verificar a adoção de patentes como instrumentos de identificação prospectiva.
1.3.1 Objetivos Específicos
Dentre os objetivos específicos do presente trabalho, compreende-se:
➢ Elaborar um estudo inicial, capaz de nortear futuras pesquisas que adotem os
microbiorreatores e sua tecnologia como ferramenta para o desenvolvimento de
bioprocessos;
➢ Definir o escopo de taxonomias necessárias para a execução da metodologia de
pesquisa, dividida em três fases: pré-prospectiva (amadurecimento da temática),
prospectiva (metodologia de pesquisa) e pós-prospectiva (avaliação dos resultados);
25
➢ Reconhecer os principais aspectos científicos dos microbiorreatores que têm sido foco
de estudos e pesquisas;
➢ Elaborar um panorama geral das patentes no mundo relacionadas aos microbiorreatores
e sua tecnologia a partir da base de dados Orbit Intelligence®;
➢ Apontar a origem das pesquisas aplicadas e os principais mercados potencialmente
protegidos sob documentação de patentes sobre microbiorreatores e sua tecnologia;
➢ Mapear as principais instituições detentoras de pedidos de patentes sobre tal tecnologia;
➢ Revelar quais as principais aplicações dos microbiorreatores estão sendo exploradas;
➢ Aplicar o conhecimento adquirido no desenvolvimento de novos microbiorreatores.
1.4 ESTRUTURAÇÃO DO DOCUMENTO
Para a apresentação deste trabalho, foram elaborados oito capítulos fundamentais,
imbuídos de dividir de maneira sequencial, as principais etapas executadas. Nestes termos, o
Capítulo 2 apresenta uma consistente revisão bibliográfica, transitando entre o contexto
histórico, princípios fundamentais, características específicas e abordagens aplicadas aos
microbiorreatores. Adiante, no Capítulo 3, são explorados os conceitos e as ferramentas que
circundam a Prospecção Tecnológica. O Capítulo 4, por sua vez, descreve de forma detalhada
a metodologia adotada no presente estudo, seguido pelo Capítulo 5, o qual apresenta os
resultados das análises prospectivas. Finalmente, o Capítulo 6 apresentará um estudo de caso
no qual foram desenvolvidos fotomicrobiorreatores para a aplicação específica do crescimento
de microalgas. No Capítulo 7, são expostas as conclusões e sugestões provenientes do estudo.
Por final, o Capítulo 8 lista as referências a partir das quais foram extraídas as informações para
confecção do presente trabalho.
26
CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A tecnologia dos microbiorreatores é fruto do advento da microfabricação e da
microtecnologia, encontrando-se, portanto, ainda em sua juventude. É no intento de
compreender o surgimento dessa temática e também familiarizar o leitor com as estratégias
abordadas, que o presente capítulo discorrerá um breve histórico sobre o surgimento dos
microbiorreatores. Em sequência, apresentar-se-á uma visão geral sobre a microfabricação e os
principais materiais e métodos adotados para o estabelecimento de um dispositivo geral. Uma
vez que os microbiorreatores são apenas uma das múltiplas aplicações que a microfluídica é
capaz de fornecer, algumas das abordagens populares da microfluídica também ser-se-ão
apresentadas. Finalmente, a terceira parte do presente capítulo concentrar-se-á na
miniaturização de biorreatores e os principais recursos necessários para estabelecer uma
fermentação efetiva, através da transferência de calor e massa, monitoramento on-line de
parâmetros e integração de instrumentos e detectores.
2.1 A ORIGEM DOS MICROBIORREATORES
O surgimento dos microbiorreatores pode ser visto como um ponto oriundo da
associação de dois principais campos da ciência: a tecnologia microfluídica; e a biologia
molecular. No início da década de 1950, o desenvolvimento da fotolitografia deu origem à
microfabricação e à microtecnologia, permitindo a construção dos primeiros microdispositivos:
os microtransistores. Ademais, como uma consequência paralela aos estudos e avanços na
miniaturização de dispositivos, Richard Feynman apresentou a famosa palestra "There is Plenty
of Room at the Bottom" (FEYNMAN, 1960) em 29 de dezembro de 1959, na California Institute
of Technology (Caltech), durante um encontro da Sociedade Americana de Física (American
Physical Society). Feynman, consagrou-se então um notório visionário, responsável por
catalisar o desenvolvimento das micro e nanotecnologias alguns anos após a sua morte. Ainda
na década de 1950, o governo dos Estados Unidos da América financiou uma enorme
quantidade de recurso visando a redução do tamanho de calculadoras, em busca de tornar-se
possível o seu transporte em aeronaves espaciais junto aos astronautas durante suas missões
durante o programa Apollo. Tal investimento teve como corolário um aumento considerável no
conhecimento e na capacidade da microtecnologia, abrindo espaço para a emergência da
27
tecnologia de sistemas microelectromecânicos (MEMS). E assim, marcou-se o início da grande
revolução tecnológica dos dispositivos eletrônicos.
À medida que a microtecnologia obteve novas abordagens e aplicações ao passar dos
anos, ensaios químicos também começaram a ser miniaturizados. Em consequência, Terry,
Herman e Angell publicaram em dezembro de 1979 o primeiro dispositivo miniaturizado de
cromatografia em fase gasosa (GPC) (TERRY; HERMAN; ANGELL, 1979). Fabricado usando
fotolitografia e gravura química (chemical etching), o dispositivo foi composto à base de silício,
com uma magnitude de aproximadamente três ordens menores do que os dispositivos de
laboratório convencionais. Desde então, não bastou muito para que outros métodos analíticos
fossem também sofisticados, a exemplo da cromatografia líquida de alta performance (HPLC)
e da eletroforese capilar (CE), aumentando dramaticamente a capacidade das análises químicas
(WHITESIDES, 2006). O surgimento dessas técnicas permitiu a obtenção de dados de alta
precisão aliada a um alto nível de resolução, usando pequenas quantidades de amostras. Esse
conceito, portanto, compreendeu-se na primeira motivação para o desenvolvimento da
microfluídica. É então na década de 1980 que a microfluídica suscita-se, aliada desta vez, a uma
segunda motivação: a revolução da biologia molecular pelos fundamentos da genômica. Uma
vez capaz de fornecer as altas quantidades de resultados com elevada precisão demandados pela
genômica, a microfluídica foi rapidamente aplicada ao campo da biologia molecular
(WHITESIDES, 2006). Como consequência, os microchips foram então desenvolvidos com
base em polímeros, uma adaptação de técnicas de microfabricação que passou a ser chamada
de litografia suave (soft lithography).
No início da década de 1990, os cientistas começaram a explorar as possibilidades de
compartimentalização e integração de ensaios bioquímicos miniaturizados. A ideia principal
consistia em desenvolver dispositivos imbuídos de hospedar diferentes tipos de reações
bioquímicas separadamente ao mesmo tempo, de forma integrada através de microcanais,
retomando os mesmos passos de um experimento conduzido em um laboratório experimental,
em um pequeno chip. Ao passo em que os avanços na instrumentação dos dispositivos
possibilitassem as experimentações em escala micro, surgiu-se a tecnologia chamada Lab-on-
a-chip. Interessados na versatilidade dessa tecnologia, vários programas militares norte-
americanos forneceram financiamento para o desenvolvimento de dispositivos capazes de
combater armas biológicas e químicas. Tal fomento adveio particularmente da Agência de
Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA), do Departamento de Defesa dos Estados
Unidos da América (USDOD), vislumbrando uma sinalização consistente para o
28
desenvolvimento de dispositivos microfluídicos no ambiente acadêmico. Dessa forma, uma vez
que os microcanais estavam na mesma escala que as células, as análises que incluíam uma única
célula como objeto de estudo (single cell) tornaram-se possíveis, sendo celeremente elucidados.
Impulsionados pelas possibilidades da tecnologia, vários engenheiros e bioquímicos enfocaram
seus esforços na miniaturização integrada das técnicas de biologia molecular como a reação em
cadeia da polimerase (PCR), lise celular, extração de DNA e eletroforese, onde desde a coleta
da amostra até a análise final, todos os ensaios seriam realizados sequencialmente, em um
mesmo chip. Esses dispositivos ganharam popularidade devido ao seu grande potencial de
análise genômica, ganhando a denominação de microssistemas de análise total (μTAS)
(ELVEFLOW, 2017).
De forma análoga, os microbiorreatores finalmente emergiram como uma consequência
da aplicação da microfluídica nas ciências biológicas. No início dos anos 2000, algumas
pesquisas conjecturaram a ideia de aplicar a microfluídica em estudos de bioprocessos
industriais (KOSTOV et al., 2001; MAHARBIZ et al., 2004; ZANZOTTO et al., 2004; SZITA
et al., 2005; ZHANG et al., 2006). Para tanto, os microbiorreatores foram enfim desenvolvidos
e, cada um ao seu modo, avaliados a partir dos parâmetros de relevância industrial em que se
aplicavam, quais sejam: taxa específica de crescimento, oxigênio dissolvido (OD), temperatura
e níveis de pH. Embora a viabilidade da aplicação dos microbiorreatores nos estudos de
bioprocessos tenha sido comprovada de maneira inquestionável, as principais limitações que
impedem avanços significativos nessa abordagem dependem da instrumentação acoplada aos
dispositivos. A detecção e o controle de parâmetros sob a microescala dependem de
microferramentas, muitas das quais ainda estão em estágio inicial do seu desenvolvimento,
restringindo por consequência a capacidade de controle sensível de parâmetros específicos
(WHITESIDES, 2006; SCHÄPPER et al., 2009). Para uma melhor visualização cronológica
dos acontecimentos que tecem o advento dos microbiorreatores, a Figura 1 esquematiza uma
linha do tempo destacando os principais fatos ocorridos ao longo dos anos.
29
Figura 1. Linha do tempo destacando os principais eventos que tecem a origem e o surgimento dos
microbiorreatores. Fonte: Elaboração própria.
Embora a redução da escala de bioprocessos industriais pelo uso de microbiorreatores
tenha se provado uma estratégia atrativa e viável para análises experimentais, poucos são os
laboratórios e grupos de pesquisa familiarizados com essa tecnologia. Se os microbiorreatores
têm sido avaliados como promissores para análises experimentais, com tantas vantagens e
oportunidades aplicáveis, surge o questionamento sobre o motivo pelo qual microbiorreatores
ainda são impopulares entre os laboratórios de bioprocessos. De maneira análoga, George
Whitesides questiona essa mesma problemática em 2006, tendo no âmago do seu
questionamento a adoção da microfluídica como ferramenta para análises bioquímicas
(WHITESIDES, 2006). É lícito esperar, de acordo com Ho et al. (2015), que a abordagem que
agrega a microtecnologia como ferramenta bioanalítica ainda não tenha sido explorada
suficientemente para que se desenvolvesse uma aplicação suprema que pudesse transcender as
abordagens convencionais que são adotadas atualmente.
De forma aquiescente, Oliveira et al. (2016) realizaram uma rápida busca na base de
dados Scopus® (Elsevier B.V.) referente a abordagens microfluídicas na biotecnologia
industrial. Tal estudo apresenta as inúmeras oportunidades, ainda não exploradas pela ciência,
de se desenvolver pesquisa de cunho inovador, não apenas acerca da aplicação de
microbiorreatores nos bioprocessos, mas também pelas abordagens gerais da microfluídica na
30
biotecnologia industrial. Entretanto, apesar do seu célere crescimento nos últimos anos, a
microfluídica tem sido o assunto de revistas e jornais científicos, apontando a complexidade
desses fenômenos quando aplicados em outras ciências (OLIVEIRA et al., 2016). Essa
problemática denuncia não somente a oportunidade, mas também a necessidade de se
desenvolver tal tecnologia para que suas vantagens não sejam limitadas apenas a especialistas
e técnicos da microfluídica.
2.2 MICROFLUÍDICA
Como consequência do advento da microtecnologia, a microfluídica compreende-se na
ciência e também tecnologia que estuda e manipula fluidos em pequenos volumes através de
canais micrométricos (BRESLAUER; LEE; LEE, 2006; WHITESIDES, 2006; HO et al., 2015).
Nestes termos, os microbiorreatores têm sua origem como derivação da microfluídica,
constituindo uma de muitas abordagens que essa tecnologia pode fornecer.
Uma vez que se baseia na redução do volume de trabalho, a microfluídica consiste em
uma abordagem sensível, sendo suscetível aos mínimos distúrbios do sistema. Essa
sensibilidade proporciona assim um alto nível de resolução e precisão em relação à
confiabilidade e qualidade dos dados obtidos. Portanto, a microfluídica inicialmente tendeu a
técnicas analíticas, realizando experimentos através de uma abordagem rápida, barata, precisa
e sensível, atendendo às necessidades das análises experimentais (WHITESIDES, 2006).
Adicionalmente, é devido à essa alta resolução e sensibilidade que a microfluídica se torna
capaz de oferecer o controle consistente das moléculas no espaço e tempo (WHITESIDES,
2006; SZITA et al., 2010). Cabe ressaltar que uma consequência da redução do espaço
dimensional é o aumento da relação superfície/volume e fluxo laminar, o que reflete no aumento
do fenômeno de transferências de calor e de massa (SCHÄPPER et al., 2009; BJÖRNMALM;
YAN; CARUSO, 2014; SACKMANN; FULTON; BEEBE, 2014). Tais características
mostram-se positivas ou negativas, em que pesem as reações na microescala, que ocorrem de
forma célere e precisa, mas também podem ser interferidas por fenômenos menores que
normalmente não são um problema vital nas escalas convencionais (por exemplo, evaporação,
formação de bolhas e adsorção inespecífica pelas paredes dos protótipos) (MICHELETTI;
LYE, 2006; SCHÄPPER et al., 2009).
Consequentemente, os dispositivos microfluídicos normalmente apresentam recursos
adaptados às necessidades peculiares de suas aplicações. Desta forma, as possibilidades de se
31
controlar a dinâmica dos fluidos aplicada aos microssistemas têm se demonstrado medular nas
mais diversas abordagens da biologia, como por exemplo: na investigação de respostas
genéticas às mudanças ambientais (TAY et al., 2010; LI et al., 2016c; CHIANG et al., 2017);
nos diagnósticos moleculares (CHIN et al., 2011; HUO et al., 2015; PATOU et al., 2015; LI et
al., 2016a); no screening molecular (DEMELLO, 2006; DITTRICH; MANZ, 2006; YU et al.,
2014); na triagem microbiana (EL-ALI; SORGER; JENSEN, 2006; STOTT et al., 2010;
SJOSTROM et al., 2014; JACQUES et al., 2017; XIE et al., 2017); e na simulação de
microambientes celulares (CHANG; LEE; LIEPMANN, 2005; SUNG; SHULER, 2009;
HOUSHMAND et al., 2016). A microfluídica também é uma ótima estratégia para o estudo das
ciências ômicas: genômica e transcriptômica (WANG; BODOVITZ, 2010; SHALEK et al.,
2014; MACOSKO et al., 2015; KIM et al., 2016); proteômica (SANDERS; MANZ, 2000;
WANG; BODOVITZ, 2010; WANG; YANG, 2016); e metabolômica (WANG; BODOVITZ,
2010; DE RAAD; FISCHER; NORTHEN, 2016; MAISCH et al., 2016). De tal forma, a
microfluídica revolucionou os métodos de estudos de células únicas (single cell) e, portanto, na
compreensão do comportamento, heterogeneidade e propriedades celulares.
Em resposta a tal versatilidade, aquele que busca entender e manipular as aplicações da
microfluídica na biologia deve compreender uma variedade de conhecimentos
multidisciplinares que abordam e transitam também a física e a química. Assim, são vários os
conceitos de mecânica de fluidos, geometria, transferência de calor e massa, interações
químicas e comportamento biológico que constituem os pilares da abordagem microfluídica em
sistemas biológicos. Desta forma, os seguintes tópicos discutirão, portanto, os principais fatores
referentes às aplicações e fabricações de dispositivos microfluídicos, tais como as forças e
fenômenos físicos; composição material dos dispositivos; técnicas de fabricação; configurações
de geometria e suas abordagens.
2.2.1 Forças Físicas
No âmbito dos microssistemas, devido ao pequeno volume de trabalho aplicado, as
forças inerciais e gravitacionais tomam menos relevância, proporcionando espaço para o regime
das forças de convecção, interfaciais e viscosidade (FERNANDES; CARVALHO;
MARQUES, 2011; MARQUES; FERNANDES, 2011). Além disso, o grau de homogeneidade
é rapidamente alcançado pela simples difusão molecular, considerando, portanto, a consequente
predominância de um fluxo laminar (SCHÄPPER et al., 2009). De tal forma, são quatro os
32
principais números adimensionais que exploram tais forças físicas nos microssistemas: número
de Reynolds (Re); número capilar (Ca); número de Weber (We); e número de Péclet (Pe).
Dada a correlação entre forças inerciais e viscosidade, o número de Reynolds (Re)
expressa as limitações de um fluxo laminar a turbulento:
𝑅𝑒 =𝜌.𝑣.𝐿
𝜇 (Equação 1)
onde ρ representa a densidade do fluido (Kg/m3); v a velocidade do fluxo (m/s); L o
diâmetro hidráulico do microcanal (m); e μ a viscosidade do fluido (Pa.s). Dispositivos
microfluídicos em fluxo laminar geralmente funcionam com um Re de aproximadamente 10-1
(BEEBE; MENSING; WALKER, 2002; SQUIRES; QUAKE, 2005).
Já o número capilar (Ca) caracteriza a correlação entre viscosidade e forças interfaciais:
𝐶𝑎 =𝜇.𝑣
𝛾 (Equação 2)
onde μ representa a viscosidade do fluido (Pa.s); v a velocidade do fluxo (m/s); e γ a tensão
interfacial entre duas fases (N/m). Na microfluídica, Ca é frequentemente menor do que 1,
variando entre 101 e 10-3 e distinguindo os padrões de fluxos bifásicos. É importante destacar a
importância deste número para microdispositivos com base na geração de gotas (droplet), uma
vez que caracteriza o comportamento da capilaridade, fenômeno responsável pela geração de
gotas esféricas (BERTHIER; SILBERZAN, 2009; BAROUD; GALLAIRE; DANGLA, 2010).
Os microdispositivos especializados em droplet serão discutidos mais adiante no tópico 2.2.3.4
Dispositivos Droplet.
Com base em Re e Ca, o número de Weber (We) correlaciona as forças inerciais à tensão
interfacial:
𝑊𝑒 = 𝑅𝑒. 𝐶𝑎 =𝜌.𝑣2.𝐿
𝛾 (Equação 3)
onde ρ representa a densidade do fluido (Kg/m3); v a velocidade do fluido (m/s); L o
diâmetro hidráulico do microcanal (m); e γ a tensão interfacial entre duas fases (N/m). We é um
parâmetro interessante uma vez que as forças inerciais são menos relevantes em dispositivos
microfluídicos, mantendo a configuração da interface do fluido e formando gotículas em
intervalos regulares (BERTHIER; SILBERZAN, 2009; BASOVA; FORET, 2014). Portanto,
We é um outro número adimensional de importância substancial para microdispositivos droplet.
33
Finalmente, o número de Péclet (Pe) correlaciona a força de convecção ao fenômeno de
difusão. É usado para caracterizar o transporte de massas dentro dos microssistemas:
𝑃𝑒 =𝑣.𝐿
𝐷 (Equação 4)
onde v representa a velocidade do fluido (m/s); L o diâmetro hidráulico do microcanal
(m); e D o coeficiente difusivo. Em dispositivos microfluídicos, a velocidade do fluxo
geralmente é pequena, resultando em um pequeno número Pe, o que indica o domínio de um
processo de difusão por convecção sobre a mistura (LIVAK-DAHL; SINN; BURNS, 2011;
MARQUES; FERNANDES, 2011).
Outros valores adimensionais como Bond (Bo), Ohnesorge (Oh) e Damköler (Da)
também são aplicados em estudos microfluídicos, correlacionando as forças gravitacionais às
forças superficiais, viscosidade às forças inerciais, e distância de transporte ao tempo de reação,
respectivamente (MARQUES; FERNANDES, 2011).
2.2.2 Composição Material e Métodos de Microfabricação
Dispositivos microfluídicos são plataformas versáteis amplamente personalizadas,
podendo variar na sua composição material (Quadro 1) e na configuração da geometria. Cada
material possui suas propriedades individuais, requerendo diferentes estratégias para o processo
de microfabricação. Portanto, a composição material deve ser escolhida dependendo das
peculiaridades e exigências do processo ou técnica envolvida. Sob a luz de tais premissas, é de
extrema importância considerar qual é o propósito de um dispositivo a ser confeccionado ao
selecionar do material específico para sua fabricação, uma vez que diferentes atributos podem
limitar os resultados esperados. Exemplos de atributos importantes a serem considerados são:
a translucidez; permeabilidade ao gás; flexibilidade; resistência química; biocompatibilidade;
compatibilidade com solventes; e adsorção inespecífica (MCDONALD; WHITESIDES, 2002;
SCHÄPPER et al., 2009; QIN; XIA; WHITESIDES, 2010; WOLFE; QIN; WHITESIDES,
2010). Além disso, o nível de integração e instrumentação em um dispositivo é proporcional à
complexidade e especificidade do processo de microfabricação, estabelecendo uma relação de
custo/benefício entre a capacidade de detecção e controle de variáveis e a viabilidade da
microfabricação (SCHÄPPER et al., 2009). Entrementes, é importante destacar que mesmo
sendo o nível de integração proporcional à complexidade do processo de fabricação de um
protótipo, sua importância é significativa na eficiência e nas despesas do dispositivo, uma vez
34
que o maior e melhor controle de parâmetros diminui a dependência de aparelhos de
macroescala para realizar análises de dados (SCHÄPPER et al., 2009).
Quadro 1. Materiais adotados na fabricação de dispositivos microfluídicos e suas principais características.
Material Vantagens Desvantagens Referência
Cerâmica Apresenta boa resistência
química e térmica.
Como um material
opaco, apresenta pouca
visibilidade para o
interior do dispositivo,
limitando a observação e
detecção óptica.
(BELAVI; HODNIK;
SANTO, 2016)
(CZOK; GOLONKA,
2016)
(GROS et al., 2008)
(PETERSON et al.,
2005)
(VASUDEV et al., 2013)
Vidro
Apresenta boa resistência
química em geral, aliada à
facilidade de visualização
devido à sua translucidez.
É difícil de ser
trabalhado e não pode ser
aplicado a bases aquosas
fortes devido à sua
incompatibilidade. A
microfabricação é menos
flexível, dispendiosa e
requer instalações de
salas limpas.
(ZEIBI SHIREJINI;
MOHAMMADI, 2017)
(VLADISAVLJEVIĆ et
al., 2014)
(NABAVI et al., 2015)
(PETRUCCI et al., 2017)
(OTHMAN;
VLADISAVLJEVIĆ;
NAGY, 2015)
Papel
Apresenta um processo de
fabricação simples, barato,
não requer instrumentação
adicional e é de fácil
manuseio.
Sua aplicação é
fortemente limitada.
(CAO et al., 2017)
(JIANG; FAN, 2016)
(LAM et al., 2017)
(MARTINEZ et al.,
2010)
(MARTINEZ;
PHILLIPS;
WHITESIDES, 2008)
PDMS
Material relativamente barato
e muito flexível para
aplicações. Também possui
boa translucidez. Fácil de
trabalhar, com baixo tempo de
Incompatível com
determinados solventes,
deformando-se na
presença dos mesmos.
(DONG et al., 2017)
(CHIANG et al., 2017)
(VITTAYARUKSKUL;
LEE, 2017)
35
fabricação. É permeável aos
gases, não tóxico e tem um
baixo módulo de elasticidade,
facilitando a integração de
detectores e acessórios.
(SIA; WHITESIDES,
2003)
(MCDONALD;
WHITESIDES, 2002)
PMMA
Apresenta alta
compatibilidade biológica,
boa visibilidade para detecção
e facilidade de
microfabricação. Também é
impermeável aos gases.
Não suporta altas
temperaturas (acima de
100 oC).
(ASL; YAMINI; SEIDI,
2016)
(LI et al., 2016b)
(VAN ANH et al., 2016)
(ADAMS et al., 2008)
Silicone
Capaz de suportar altos níveis
de temperatura e pressão e
possui uma excelente
termocondutividade.
O processo de
microfabricação pode ser
oneroso e demorado.
Não é compatível com
bases aquosas fortes e
apresenta baixa
translucidez.
(CHANDRASEKARAN
et al., 2007)
(CHEN; SHIH; TAI,
2006)
(CADY; STELICK;
BATT, 2003)
Aço
Inoxidável
Uma boa opção para a
condutividade térmica,
suportando altos níveis de
temperatura e pressão. Por
outro lado.
É sensível à corrosão e,
como material opaco,
não há visibilidade para
o interior do dispositivo.
(KOBAYASHI et al.,
2008)
(TONG et al., 2001)
Teflon
De baixa popularidade, mas
apresenta uma grande
tolerância aos solventes e
produtos químicos em geral.
Também apresenta alta
biocompatibilidade e é
permeável aos gases.
Não oferece visibilidade
para o interior do
dispositivo.
(WALSH;
FEUERBORN; COOK,
2016)
(ZHENG et al., 2013)
(DE HAAS; FADAEI;
SINTON, 2012)
(REN et al., 2011)
Fonte: Elaboração própria
Os primeiros materiais adotados para a construção dos protótipos foram o silicone e o
vidro, considerados duas excelentes opções para microrreações e análises, uma vez que
apresentam excelente termocondutividade, eletroforese capilar rápida, tolerância ao solvente e
resistência mecânica adequada (MCDONALD; WHITESIDES, 2002; NGE; ROGERS;
WOOLLEY, 2013). No entanto, foram rapidamente substituídos por uma variedade de outras
36
opções, baseando-se principalmente nas inflexibilidades encontradas durante a condução do
processo de microfabricação ao adotar de tais materiais. O processo se tornava demorado e
caro, exigindo ainda, instalações de ambientes limpos (SCHÄPPER et al., 2009; NGE;
ROGERS; WOOLLEY, 2013). Além disso, o silicone e o vidro possuem baixa permeabilidade
aos gases, inviabilizando sua aplicação em reações gasosas prolongadas.
Ao passo do avanço das descobertas tecnológicas, polímeros elastômeros como o
poli(dimetilsiloxano) (PDMS) e o poli(metil-2-metilpropenoato) (PMMA) tornaram-se
progressivamente populares como substratos menos onerosos para a microfabricação (NGE;
ROGERS; WOOLLEY, 2013). O PDMS é um material versátil, não tóxico e econômico,
permitindo uma rápida construção de microdispositivos através da litografia suave
(MCDONALD; WHITESIDES, 2002). Apresenta um baixo módulo de elasticidade,
característica importante para a versatilidade deste material, permitindo a integração de aparatos
microfluídicos no âmbito do protótipo, como bombas pneumáticas, válvulas e misturadores
(QIN; XIA; WHITESIDES, 2010; NGE; ROGERS; WOOLLEY, 2013). O polímero apresenta
ainda, alta permeabilidade aos gases, característica importante para as biorreações que
envolvem o transporte e a troca de gases (SCHÄPPER et al., 2009). Em contrapartida, o PDMS
pode ser tornar incompatível com alguns solventes, deformando-se na presença de tais
componentes. Já o elastômero PMMA, por outro lado, apresenta baixa permeabilidade aos
gases, constituindo uma alternativa fácil para a micromecanização (sob baixos níveis de
temperatura, abaixo de 100°C) (NGE; ROGERS; WOOLLEY, 2013). É lícito considerar que,
sendo translúcidos, tanto o PDMS como o PMMA favorecem a observação e detecção óptica
através de aparelhos de emissão de luz.
Ao fabricar um dispositivo microfluídico, a técnica aplicada deverá depender do
material utilizado como substrato (composição do dispositivo futuro). Em geral, a fotolitografia
é a metodologia mais popular para a prototipagem, constituindo uma técnica rápida e precisa.
No entanto, este método é inevitavelmente caro, exigindo equipamentos específicos, instalações
de ambiente limpa e o desenvolvimento de fotomáscaras específicas, limitando a aplicação
apenas a polímeros fotossensíveis (QIN; XIA; WHITESIDES, 2010; WOLFE; QIN;
WHITESIDES, 2010). A técnica é também demorada, denegando o controle sobre a química
interfacial do substrato, os quais devem ser exclusivamente planos (QIN; XIA; WHITESIDES,
2010). De forma alternativa, a litografia suave, uma adaptação da litografia clássica para
substratos macios (polímeros, por exemplo), é uma abordagem interessante para uma
prototipagem rápida, contando com um grande número de técnicas de modelagem (ADDAE-
37
MENSAH et al., 2010). Ao contrário da fotolitografia, a litografia suave é uma técnica
consistentemente versátil, permitindo a aplicação de substratos macios, flexíveis, curvos ou
planos, sendo menos onerosa e de alta precisão nas micro e nanoescalas (XIA; WHITESIDES,
1998; QIN; XIA; WHITESIDES, 2010).
De acordo com o trabalho de Weibel, Diluzio e Whitesides (2007), um exemplo simples
e conciso do processo passo-a-passo da litografia suave para microfabricação, utilizando o
PDMS como substrato, pode ser esquematizado na Figura 2 (WEIBEL; DILUZIO;
WHITESIDES, 2007). Inicialmente, o design e a função do dispositivo devem ser idealizados
correspondendo às necessidades e especificações do processo envolvido. Após a idealização,
os desenhos técnicos são criados com a ajuda de ferramentas computacionais, como softwares
de desenho assistido por computador (CAD). Os desenhos são então utilizados para a
construção de uma máscara responsável pela modulação dos microcanais. Adiante, um
determinado polímero fotossensível, chamado de fotorresistente, é depositado em uma
superfície de silicone e recoberto pela máscara. Em sequência, o fotorresistente é exposto à luz
ultravioleta (UV) através da máscara, permitindo a polimerização das partes expostas do
polímero. Com o objetivo de remover o excesso que não reagiu com a luz UV, aplica-se um
solvente orgânico, resultando em uma peça do fotoresistente padronizada de acordo com o
formato da máscara, peça essa denominada peça mestre (master). A profundidade dos canais é
controlada pela quantidade do material (espessura) aplicada sobre o silicone, sendo
responsabilidade da máscara transferir as formas e informações laterais para a peça mestre.
Desta forma, o protótipo adquire todas as características inicialmente idealizadas, detalhadas
no dimensionamento. O substrato (neste caso o PDMS) é assim aplicado na peça mestre e
curado termicamente, resultando então em uma camada de PDMS com a respectiva estrutura
modelada na sua superfície.
38
Figura 2. Exemplo de um protocolo padrão de litografia suave para a fabricação de micropoços, adotando PDMS
como substrato. Uniformização do fotorresistente por revestimento em superfície de silicone (A e B). A máscara
é então colocada sobre o fotorresistente (C). O sistema é exposto à luz UV e o fotorresistente não polimerizada é
removido por um dado solvente, gerando o master (D). O substrato é aplicado sobre o master e curado
termicamente (E). A peça final é removida com as microestruturas gravadas em sua superfície (F). Fonte:
Adaptado de Weibel, Diluzio e Whitesides (2007).
Nos últimos anos, o advento e a popularização das técnicas de impressão em 3D têm
atraído a atenção dos pesquisadores pela sua capacidade de desenvolver estruturas complexas
de acurada resolução (TSENG et al., 2014; HO et al., 2015; AU et al., 2016; HE et al., 2016).
Técnicas populares como a estereolitografia e a fabricação de objetos laminados (LOM) podem
permitir a fabricação regular de múltiplos protótipos, exigindo menos tempo e menos contato
manual durante o processo (HO et al., 2015). Desta forma, aqueles com menos experiência na
prática de microfabricação podem ser capazes de fabricar dispositivos microfluídicos com
precisão e em um curto período de tempo.
39
Finalmente, o último passo do procedimento de microfabricação de dispositivos
microfluídicos consiste no processo de vedação, também chamado de selagem. Este passo é
responsável pela montagem de todas as partes e componentes do microdispositivo em uma
única peça final: o próprio consolidado; e deve ser responsável por inibir vazamentos de fluidos
internos durante as reações. O processo de vedação pode ser reversível ou irreversível e isso
dependerá do material que compõe o microdispositivo, bem como do material e método
utilizado para a vedação. Portanto, alguns materiais podem implicar processos de vedação mais
ou menos laboriosos, influenciando diretamente sobre a viabilidade e praticidade do
dispositivo.
2.2.3 Configurações Geométricas e suas Abordagens
A aplicação de sistemas microfluídicos na bioquímica aumentou consistentemente ao
longo dos anos, estimulando o desenvolvimento de diferentes abordagens e aplicações. De fato,
são inúmeras as possibilidades ao considerar-se a variedade de formas geométricas e as opções
de integração. O cientista disposto a ter sucesso no mundo da microfluídica terá de lidar não
apenas com um surpreendente nível de conhecimentos sobre física, química e a própria
microfluídica por si só, mas também com uma grande parcela de criatividade em relação às
possibilidades e aplicações desta tecnologia. Como os microbiorreatores, várias outras
abordagens microfluídicas têm gradualmente ganhado espaço no âmbito científico. Em
consideração a tais circunstâncias, apresentar-se-ão algumas das abordagens mais populares
baseadas na tecnologia microfluídica.
2.2.3.1 Microarranjos
Provavelmente a abordagem mais intuitiva da microfluídica, os microdispositivos
compostos por conjuntos de microcanais interceptados são úteis quando se pretende investigar
o comportamento e as interações entre células, proteínas e outras moléculas (WEIBEL;
WHITESIDES, 2006). Portanto, as aplicações são intensamente variáveis, que vão desde
ensaios de biologia molecular geral até o diagnóstico de pronto atendimento. Por exemplo, Gao
et al. (2017) desenvolveram um ensaio em tempo real capaz de detectar biomarcadores de
câncer de pulmão. O dispositivo foi construído com base em chips de PDMS, contendo duas
câmaras divididas para respostas analíticas rápidas. Um segundo exemplo é o avanço nas
40
técnicas de mapeamento do genoma descritas por Lam et al. (2012). Em seus estudos,
sequências motivo marcadas por fluorescência foram utilizadas para a construção de mapas
capazes de indicar distâncias físicas entre sequências genômicas. Outras estratégias de
aplicações dos microarranjos microfluídicos são a combinação de fluidos para estudo de reações
bioquímicas (ISMAGILOV et al., 2001), padronização da entrega de reagentes químicos
(DELAMARCHE et al., 1998), isolamento de mRNAs de uma única célula (MARCUS;
ANDERSON; QUAKE, 2006) e geração de energia a partir de células microbianas (YANG;
LEE; CHOI, 2017) conforme a Figura 3.
Figura 3. Dispositivos microfluídicos baseados em microarranjos: (A) sistema microfluídico com arranjos em
paralelo para o estudo da difusão de fluidos em reações bioquímicas; (B) desenho esquemático de uma rede de
canais microfluídicos para o transporte concomitante de reagentes inicialmente em câmaras macroscópicas
periféricas transportadas por microcanais até novas câmaras de concentração; (C) sistema microfluídico para a
geração de energia baseada no metabolismo celular, apresentando entradas (inlet) anólita e católita, juntamente
com as respectivas saídas (outlets). Fonte: Adaptado de Ismagilov et al. (2001); Delamarche et al. (1998); e
Yang, Lee e Choi (2017).
2.2.3.2 Gradientes de Concentração
Ao permitir a manipulação e controle de fluidos em regime de fluxo laminar, a
microfluídica possibilita a prototipagem de microdispositivos capazes de gerar gradientes de
concentração de moléculas específicas, sob precisão melhor que qualquer outra técnica,
conforme ilustrado na Figura 4 (WEIBEL; WHITESIDES, 2006). De tal forma, geradores de
41
gradiente são capazes simular microambientes biológicos complexos, permitindo o estudo das
respostas celulares às mais diversas condições in vivo. Essa abordagem pode ser dividia em dois
grupos distintos: geradores de gradiente baseados em difusão (KEENAN; HSU; FOLCH, 2006;
MOSADEGH et al., 2007; ATENCIA; COOKSEY; LOCASCIO, 2012) e geradores de
gradiente baseados em fluxo (JEON et al., 2000; COOKSEY; SIP; FOLCH, 2009; XU et al.,
2016). A principal diferença entre esses grupos baseia-se, fundamentalmente, no princípio
físico da formação de gradiente: enquanto gradientes baseados na difusão são formados por
difusão passiva sem a presença de um fluxo do fluido, gerando um gradiente linear; os
gradientes baseados em fluxo são formados pela difusão de duas ou mais correntes laminares
que fluem em sua interface, gerando um gradiente não linear (TOH et al., 2014). Ambas as
abordagens são capazes de investigar respostas biológicas, mas o fluxo contínuo presente em
geradores de gradiente baseados em fluxo pode interferir na comunicação celular, tendo em
vista que fatores moleculares podem acabar sendo arrastados (washout) (SAKA;
MACPHERSON; GIURANIUC, 2017). Microdispositivos geradores de gradiente foram
empregados em várias aplicações biológicas, incluindo estudos sobre quimiotaxia
(WOLFRAM; RUBLOFF; LUO, 2016), investigações sobre atividade farmacológica (PIHL et
al., 2005), diferenciação de células-tronco (CHUNG et al., 2005), microarranjos de culturas
celulares (HUNG et al., 2005) e biologia sistêmica de micro-organismos (BRESLAUER; LEE;
LEE, 2006; LEE et al., 2006).
Além dos gradientes moleculares, gradientes térmicos também podem ser gerados
usando microdispositivos. Baranek et al. (2010) desenvolveram um dispositivo para a
estimulação térmica de células embrionárias de Caenorhabditis elegans com base em
gradientes térmicos. Este protótipo levou à manipulação da taxa de divisão celular em culturas
in vitro. De forma análoga, Lucchetta et al. (2005) desenvolveram um dispositivo similar para
a avaliação de efeitos térmicos sobre o desenvolvimento embrionário de Drosophila
melanogaster.
A aplicação de dispositivos de gradiente de concentração é muito interessante no ponto
de vista dos bioprocessos, sendo eles uma possível ferramenta para a rápida investigação do
comportamento celular sob o regime de várias variáveis, como concentração de substratos e
solventes, temperatura e diferentes níveis de pH.
42
Figura 4. Dispositivos microfluídicos de gradiente de concentração: (A) ilustração esquemática da formação de
um gradiente de concentração gerado por difusão; (B) esquema de um microdispositivo baseado em gradiente de
concentração composto por duas entradas, um canal com fluido de menor ou nenhuma concentração (sink) e um
canal com fluido de maior ou concentração (source), juntamente com as regiões vermelhas onde os gradientes
não lineares são formados (gradiente region) devido às configurações assimétricas; (C) dispositivo microfluídico
de cultura de células combinando as abordagens de gradiente de concentração e microarranjo, constituído por
entradas e saídas de meio de cultivo (canais à esquerda e direita) e entrada e saída de células e reagentes (canais
superior e inferior); (D) registro colorimétrico do gradiente de concentração formado pelo dispositivo. Fonte:
Adaptado de Saka, Macpherson e Giuraniuc (2017); Mosadegh et al. (2007); e Hung et al. (2005).
2.2.3.3 Microarranjos de Células Únicas
Microdispositivos baseados em microarranjos de uma única célula (single-cell trapping
microarrays) são ferramentas microfluídicas capazes de capturar e isolar uma única célula
conforme ilustrado na Figura 5. O estudo do comportamento celular em placas ou poços de
cultura convencionais não é tão preciso como o uso nos microarranjos de células únicas, uma
43
vez que a precisão em tais estudos é inversamente proporcional à relação célula-volume de
cultivo. Por exemplo, a baixa homogeneidade pode causar a má interpretação de respostas
celulares em pontos específicos de uma cultura, onde encontram-se baixa disponibilidade de
nutrientes e alta concentração de resíduos metabólicos (DI CARLO; WU; LEE, 2006). Por
conseguinte, esta abordagem permite várias investigações face à biologia celular, tais como
respostas celulares à estímulos ambientais (ERIKSSON et al., 2007), screening de drogas
(WLODKOWIC et al., 2009), expressão gênica (TORIELLO et al., 2008), metabolismo celular
(MAGLICA; ÖZDEMIR; MCKINNEY, 2015) e farmacocinética (LUO et al., 2012).
Grünberger, Wiechert e Kohlheyer (2014) revisaram as aplicações dos
microdispositivos de células únicas no desenvolvimento de bioprocessos (Figura 5, painel A).
Tais protótipos são capazes de oferecer conhecimento sobre o crescimento e morfologia de
micro-organismos, caracterização da cepa e do processo, heterogeneidade populacional e
dinâmica ambiental. Consequentemente, estes dispositivos podem atuar como ferramentas
analíticas com o potencial de aumentar a compreensão do desempenho de micro-organismos
em condições industriais, com uma aplicação final nas otimizações voltadas para os
bioprocessos.
44
Figura 5. Abordagens baseadas em microarranjos de células únicas: (A) microscopia de células vivas
comparando os princípios dos cultivos múltiplo e único de células ); (B) matriz para a captura de células únicas:
(i) fotografia do dispositivo, indicando a direção do fluxo que contém célula e mídia até a distribuição através
das câmaras de aprisionamento (armadilhas). (ii) diagrama esquemático 3D do dispositivo, ilustrando o princípio
do mecanismo de aprisionamento celular. (iii) micrografia das câmaras de captura evidenciando as células
aprisionadas, onde, em alguns casos, encontram-se duas células aprisionadas e unidas. Fonte: Adaptado de
Grünberger, Wiechert e Kohlheyer (2014); e Di Carlo, We e Lee (2006).
45
2.2.3.4 Dispositivos Droplet
A microfluídica à base de gotas (Droplet Microfluidics), também referida como
microfluídica digital, é a abordagem capaz de gerar gotículas discretas dentro de fluxos
bifásicos com padrões distintos (Figura 6). Geralmente, um fluido hidrofóbico é adotado como
uma fase contínua e uma solução aquosa hidrofílica é usada para compor as gotículas (TEH et
al., 2008). A fase contínua, inicialmente separada em um primeiro microcanal, é submetida a
uma alta velocidade de fluxo, enquanto a fase aquosa, em um outro microcanal, possui uma
velocidade de fluxo muito menor. Quando ambos os microcanais são integrados, a fase aquosa
é dividida em pequenas gotas, caracterizando o fenômeno da formação de gotículas. Ao projetar
uma estratégia para a geração de microdispositivos baseados em gotículas, deve-se dar atenção
especial à composição material do dispositivo, geometria e composição do fluido. Tais aspectos
podem influenciar na formação de gotículas, na estabilidade da interface do fluido, no tamanho
das gotículas ou mesmo na provocação de coalescência (TEH et al., 2008; BAROUD;
GALLAIRE; DANGLA, 2010; BARET, 2012). Desta forma, os números adimensionais Ca e
We são amplamente aplicados nesta abordagem, uma vez que o comportamento de capilaridade
difere em fluidos de diferentes composições, alterando o padrão de formação de gotículas
(BERTHIER; SILBERZAN, 2009).
Em tal abordagem, a formação de gotículas pode isolar reagentes, transformando cada
gota em um pequeno reator singular. Os reagentes variam de células a substâncias químicas e,
possibilitando a emergência de diversas aplicações químicas, biológicas e bioquímicas (FAIR
et al., 2007; HUEBNER et al., 2008). Por exemplo, aplicações incluem o estudo de condições
para cristalização (ZHENG; ROACH; ISMAGILOV, 2003), pronto diagnósticos (SISTA et al.,
2008) e em estudos de biologia sistêmica e biologia sintética (SZITA et al., 2010).
46
Figura 6. Dispositivos microfluídicos droplet: (A) Desenho esquemático representando o princípio do processo
de formação de gotículas que transporta um fármaco hidrofóbico; (B) ilustração da formação de gotículas com
diferentes concentrações de NaCl à medida que seu respectivo fluxo diminui, resultando em cada gota um
microambiente diferente. Fonte: Adaptado de Busatto et al. (2017); e Zheng, Roach e Ismagliov (2003).
2.3 MICROBIORREATORES APLICADOS AOS BIOPROCESSOS
O desenvolvimento de bioprocessos industriais é de grande importância para o
surgimento de bioprodutos com aplicações inovadoras, sendo elas radicais ou incrementais.
Embora o comportamento das células em condições industriais tenha sido amplamente estudado
nas últimas décadas, a natureza dos sistemas biológicos é complexa e pode exigir
experimentação para a compreensão sobre as mais variadas condições aplicadas em um
bioprocesso (SCHMIDELL et al., 2001; MICHELETTI; LYE, 2006). Ao considerar ambas as
fases upstream e downstream, o nível de complexidade é consideravelmente maior, exigindo
estudos minuciosos em cada etapa de um bioprocesso. Além disso, sua otimização apresenta
um papel crucial na capacidade e viabilidade industrial, exigindo também uma quantidade
considerável de testes experimentais.
A experimentação de bioprocessos baseada na escala de bancada convencional é
onerosa e demanda muito tempo, forçando os pesquisadores a encontrarem reforço para seus
47
trabalhos em análises estatísticas que nem sempre são suportadas por um número adequado de
ensaios experimentais. Os microbiorreatores consistem, portanto, em uma solução viável que
permitem a triagem rápida de uma ampla gama de variáveis para o desenvolvimento ou
otimização de bioprocessos industriais. No entanto, os pesquisadores nem sempre usaram o
conceito de microbiorreatores com concordância. Com o objetivo de apresentar e esclarecer as
diferenças e peculiaridades de tais dispositivos, distinguir-se-á dois diferentes conceitos de
microbiorreatores: biorreatores de micropoços e biorreatores microfluídicos. Ainda, no intuito
de discutir a viabilidade de tal abordagem, apresentar-se-á algumas das particularidades ao
transitar sobre os bioprocessos na microescala, incluindo a transferência de calor e massa e
detecção e controle de parâmetros.
2.3.1 Microbiorreatores de Micropoços e Microfluídicos
Microbiorreatores podem ser classificados em duas abordagens distintas: biorreatores
de micropoços e biorreatores microfluídicos (MICHELETTI; LYE, 2006). A primeira
abordagem consiste na adoção de micropoços paralelos como plataformas para biorreações,
tipicamente em placas contendo 24 ou 96 poços com volume de trabalho total variando de
microlitros a mililitros, onde cada poço imita um único biorreator. Neste caso, as placas são
acopladas a um sistema capaz de detectar e controlar parâmetros. Esse sistema também é
responsável pela tradução de sinais de detecção em dados computacionais utilizados para
análises de resultados. Blesken et al. (2016) recentemente desenvolveram uma plataforma com
placas de 48 poços (capacidade volumétrica de 800 a 1500 μL) com um chip microfluídico
integrado capaz de fornecer dados on-line sobre a medição dos níveis de biomassa,
fluorescência, pH e oxigênio dissolvido. Além do método de detecção não-invasivo, o sistema
também permite a alimentação automática e o controle do pH durante o processo fermentativo.
Isso é possível ao utilizar-se de dois conjuntos de poços como reservatórios de meios de cultivo
e soluções para o controle do pH. Mesmo que tal regulação do pH seja uma abordagem prática,
o volume reacional pode ainda sofrer uma diferenciação no volume total, exigindo atenção
especial durante o processo em si e na análise de dados, uma vez que o volume de trabalho se
encontra na microescala e, portanto, está sujeito aos mínimos distúrbios e alterações no sistema.
Outro sistema de microplacas de relevância é o micro-Matrix (Applikon, Delft, Holanda),
disponível comercialmente, que consiste em uma plataforma de 24 poços capaz de medir e
48
controlar o pH, temperatura e densidade óptica, além de fornecer um mecanismo de alimentação
automatizado (APPLIKON, 2017).
Os sistemas de microplacas também podem ser equipados com agitadores individuais
para melhorar os valores do coeficiente de transferência de oxigênio (KLa) (MICHELETTI;
LYE, 2006). Puskeiler, Kaufmann e Weuster-Botz (2005) desenvolveram um sistema de placas
de 48 poços com agitadores incorporados, flutuando livremente ou suportados por uma haste
atingindo valores de KLa >0.4 s-1. Sistemas de microplacas com agitadores automáticos também
são comercialmente disponíveis. Um exemplo relevante é o bioREACTOR 48 (2mag, Munique,
Alemanha) com 48 poços de capacidade volumétrica de 8 a 15 mL. Capaz de alcançar valores
de KLa de >0.4 s-1, o sistema é automatizado, oferecendo a detecção da temperatura, pH e
oxigênio dissolvido por métodos não invasivos.
Por outro lado, os biorreatores microfluídicos geralmente são dispositivos projetados
simulando um biorreator de escala convencional. Sua configuração geral apresenta uma câmara
de fermentação integrada a sensores e controladores. De tal forma, os biorreatores
microfluídicos compreendem numa abordagem eficaz e versátil, sendo passível de aplicação na
triagem de variáveis e condições para o desenvolvimento e otimização de bioprocessos. Por
exemplo, Zanzotto et al. (2004) descreveram um microbiorreator com aeração integrada e
medição on-line da densidade óptica (DO), oxigênio dissolvido (OD) e pH com base em
métodos ópticos não invasivos. O dispositivo foi testado com uma fermentação de Escherichia
coli e os resultados foram comparados e comprovados com uma versão em escala de bancada.
Apesar de a maioria dos biorreatores microfluídicos serem projetados para um único tipo
específico de biorreação, Au, Shih e Wheeler (2011) desenvolveram um dispositivo capaz de
cultivar e analisar de maneira automatizada, a DO de bactérias, algas e leveduras, chamando-o
assim de microbiorreator BAY (Bacteria Algae Yeast microbiorreactor). Tal dispositivo foi
capaz de atender as singularidades de cada um desses micro-organismos simultaneamente,
cultivando células em gotículas distintas sem a necessidade de usar válvulas, bombas ou
misturadores. A viabilidade do microbiorreator também foi avaliada e comprovada ao comparar
dos resultados com sistemas de escala de bancada (AU; SHIH; WHEELER, 2011).
Recentemente, Johnson-Chavarria et al. (2014) desenvolveram um microbiorreator de
célula única capaz de estabelecer um ambiente quimiostático, continuamente fornecendo
nutrientes e removendo os metabólitos produzidos. Esse dispositivo, além de possibilitar o
estudo de fermentações contínuas na microescala, torna-se útil no estudo do comportamento
49
celular mediante as alterações do meio de cultivo. O microbiorreator foi integrado com
reguladores de pressão e bombas de seringas controlados por computador, para o controle de
pressão e entrega de mídia, juntamente com um aquecedor de placa térmica para regulação da
temperatura (Figura 7, painel A). Os testes experimentais para a avaliação do desempenho do
dispositivo incluíram a observação da dinâmica celular mediante a troca da composição do meio
de cultivo por células de E. coli, usando um microscópio invertido equipado para o
fornecimento de imagens de fase de contraste e fluorescência. Novas perspectivas para esse
dispositivo devem retomar à paralelização, tendo em vista melhorar o rendimento de resultados
fornecidos. Um maior nível de integração também mostra-se interessante em relação às outras
variáveis, como o pH e a concentração de OD.
50
Figura 7. Microbiorreatores como ferramentas para análise de fermentações: (A) microbiorreator para cultura de
células únicas, integrado com reguladores de pressão, placa térmica e microscópio invertido; (B) ilustração
esquemática de um microbiorreator capaz de cultivar células de mamíferos em microcápsulas de forma contínua.
(i) dimensões detalhadas de cada peça que compõe o microbiorreator. (ii) ilustração destacando a membrana
porosa entre as duas peças de PMMA. (iii) esquema ilustrando o princípio do microbiorreator. Fonte: Adaptado
de Johnson-Chavarria et al. (2014); e Abeille et al. (2014).
Nessa mesma vertente, Abeille et al. (2014) desenvolveram um microbiorreator com
base na cultura contínua de células de mamíferos em microcápsulas. O dispositivo foi feito a
51
partir de PDMS e composto de dois canais em diferentes níveis, montados em um formato
serpentina (Figura 7, painel B). Uma membrana porosa foi então integrada entre cada canal,
confinando as células no canal superior. O meio de cultivo fresco é fornecido por um sistema
de bomba de seringa, fluindo através do canal inferior e difundindo-se para o superior através
dos poros da membrana. Assim, bioprocessos de longo prazo são facilmente executados em tal
dispositivo, auxiliando o desenvolvimento e estudos da cultura de células de mamíferos em
processos contínuos. O dispositivo também foi integrado com um sensor térmico e o controle
de temperatura foi atingido ao colocar do dispositivo em um sistema de aquecimento externo.
Quanto à experimentação, células de Drosophila S2 foram monitoradas por um microscópio
confocal de varredura a laser (ABEILLE et al., 2014). Algumas das limitações deste dispositivo
consistem na capacidade de controle do sistema, uma vez que a temperatura e o fluxo de meio
de cultivo são as únicas variáveis manipuladas.
Diferentemente das tendências atuais no mundo dos microbiorreatores, Krull e Peterat
(2016) realizaram um interessante trabalho que não se concentrou no processo de
desenvolvimento dos microbiorreatores, mas sim na viabilidade e nos perfis cinéticos das
reações realizadas dentro de um microbiorreator para a fermentação contínua, submersa e
aeróbia. Para tanto, células de Saccharomyces cerevisiae foram analisadas perante o seu cultivo
quimiostático e os modelos cinéticos foram determinados a partir dos dados experimentais da
concentração estacionária de substrato, células crescidas e etanol produzido. Métodos lineares
como os de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee e Hanes Woolf foram aplicados para a
determinação da taxa específica máxima de crescimento específico (μmax) e da constante de
saturação (KS) do modelo de Monod. Os coeficientes de rendimento YX/S, YP/S e YP/X foram
determinados com base no modelo de Luedeking-Piret. Finalmente, o modelo cinético do
metabolismo foi construído com base em dois intervalos de validade considerando o efeito
Crabtree: (i) μ = D < Dcrab, onde o metabolismo é puramente considerado oxidativo,
convertendo o substrato em biomassa ou aplicado na manutenção endógena do biossistema; e
(ii) μ = D > Dcrab, onde considera-se que o metabolismo oxi-redutor está sob o efeito Crabtree,
levando em consideração a conversão do substrato em etanol e correlacionando-o com a
atividade metabólica das células. Os resultados obtidos foram comparados aos dados da escala
de bancada (em torno de 50 mil vezes maior que na microescala), onde ambas as constantes
cinéticas eram de mesma ordem, provando a viabilidade e aplicabilidade do microdispositivo
como ferramenta para estudos de bioprocessos.
52
2.3.2 Particularidades dos Microbiorreatores
As variáveis clássicas que mais afetam os bioprocessos geralmente consistem na cepa
cultivada, composição do meio de cultivo e condições físico-químicas, como o nível de OD,
temperatura e nível de pH. Dessa forma, os microbiorreatores devem ser integrados ou, pelo
menos, acoplados a uma plataforma capaz de detectar e medir tais parâmetros. Entretanto, o
microbiorreator com o maior número de integrações acaba tornando-se vulnerável a
complicações na sua construção e desempenho, tendo em vista o desenho do reator, a
composição do material e as mais variadas características do próprio bioprocesso (por exemplo,
o módulo de operação e o requisito de aeração). Além disso, devido ao pequeno volume de
trabalho, aspectos como a transferência de calor e massa, bem como os métodos de detecção e
controle de variáveis podem se comportar de forma diferente. Nesse sentido, é importante
salientar que a escalabilidade de fatores bióticos e abióticos muitas vezes não se comportam de
forma linear, sendo necessário o seu estudo específico a partir de cada bioprocesso, uma vez
que a integração e consequente interação entre fatores tornam suas respostas singulares.
2.3.2.1 Transferência de Massa e Calor
O estudo do fenômeno de transferência de calor e massa nos bioprocessos é substancial
para permitir o encontro de todos os reagentes a serem transformados (meio de cultura, células
e cofatores) nas mesmas condições (temperatura, pH e concentração dos reagentes). Por
conseguinte, é necessário um método de mistura capaz de garantir uma distribuição adequada
de reagentes e padronizar os parâmetros sobre o caldo fermentativo, o qual desempenha um
papel primordial no resultado final e na precisão dos dados obtidos (SCHÄPPER et al., 2009).
Devido ao pequeno número de Re aplicado (Re > 1.0), a condição laminar é predominante sobre
a turbulência dentro dos microbiorreatores, dificultando a obtenção de um grau de mistura ideal
à medida que o volume de trabalho diminui (PURCELL, 1977). Além disso, diferentes micro-
organismos podem apresentar diferentes níveis de sensibilidade aos movimentos mecânicos,
caracterizando a mistura ideal como uma relação de custo/benefício entre homogeneidade e
cisalhamento celular (SCHÄPPER et al., 2009).
Os métodos de mistura em microbiorreatores podem ser divididos em ativos e passivos.
Os métodos ativos geralmente adotam agitadores flutuantes ou pequenos impelidores inseridos
no escopo do microbiorreator conforme ilustrado na Figura 8 (PUSKEILER; KAUFMANN;
WEUSTER-BOTZ, 2005; TAN et al., 2015). Essa estratégia requer um cuidado extra no projeto
53
de dimensionamento do biorreator, uma vez que o surgimento de zonas mortas pode dificultar
e reduzir o perfil de mistura na câmara de fermentação. Zhang et al. (2006) construíram um
microbiorreator com bons perfis de mistura ao utilizar de uma barra de agitação magnética em
velocidade de agitação a 800 rpm. Esse dispositivo é capaz de alcançar valores de KLa de até
75 h-1. No entanto, os métodos ativos requerem a montagem de peças móveis dentro do
dispositivo, podendo compreender numa complicação capaz de inviabilizar a fabricação do
dispositivo (SCHÄPPER et al., 2009). Tal problemática foi recentemente estudada por Kirk et
al. (2016), os quais desenvolveram um microbiorreator capaz de promover a mistura ativa, cujo
mecanismo se baseia na presença de uma única seringa que provoca uma espécie de jato
oscilante ao recircular o meio de cultura dentro e fora da câmara fermentativa. Os valores de
KLa neste dispositivo atingiram cerca de 170 h-1.
54
Figura 8. Desenho esquemático dos métodos ativos de mistura em microbiorreatores: (A) uso de impelidor
magnético disperso no meio líquido; (B) uso de impelidor suportado por uma haste a ser inserida no interior da
câmara reacional. Fonte: Adaptado de Micheletti e Lye (2006).
Já a mistura passiva, pode ser alcançada por difusão molecular e advecção caótica ao
submeter o caldo fermentativo a um fluxo que será perturbado por bifurcações e convergências,
bem como pela colisão com obstáculos dispostos por todo o caminho percorrido pelo fluxo
(SCHÄPPER et al., 2009).
Outro parâmetro de alta relevância neste tópico é a taxa de aeração introduzida no
sistema, uma vez que pode ser considerado um gargalo de acordo com a escala em que o
bioprocesso é desenvolvido. Sabe-se que as fermentações aeróbicas consistem em uma grande
parcela de bioprocessos industriais e requerem um nível adequado de oxigênio disponível para
que a respiração celular seja conduzida satisfatoriamente (SCHMIDELL et al., 2001). O
material utilizado para a construção de microbiorreatores pode influenciar na capacidade de
55
aeração dentro da câmara fermentativa. O PDMS, como discutido anteriormente, é permeável
aos gases e pode ser usado para a construção de finas membranas capazes de promover a difusão
de oxigênio e outros gases produzidos ao longo do processo de fermentação, sem que a pureza
do meio de cultivo seja comprometida com agentes contaminantes (ZANZOTTO et al., 2004;
SZITA et al., 2005; LEE et al., 2006; ZHANG et al., 2006; SCHÄPPER et al., 2009). Além da
finalidade usual de garantir uma aeração adequada ao sistema, Schäpper et al. (2010) utilizaram
membranas de PDMS também para a aplicação de gases CO2 e NH3 com o objetivo de controlar
os níveis de pH. No entanto, as membranas de PDMS não são seletivas aos gases, permitindo
também a difusão do vapor de água a partir da câmara fermentativa, alterado o volume reacional
do sistema (BERTHIER et al., 2008; SCHÄPPER et al., 2009). Soluções para tal problemática
compreendem na redução da evaporação a partir da introdução de todo o dispositivo dentro de
uma câmara umidificada ou ao acoplar de um reservatório de água acima do nível da câmara
reacional do microbiorreator, permitindo o reabastecimento passivo de água (SZITA et al.,
2005; SCHÄPPER et al., 2009).
Sob a luz de tais circunstâncias, a disponibilidade de oxigênio no caldo fermentativo
pode ser aprimorada combinando estratégias envolvendo mistura e aeração. Nesse sentido, Kirk
e Szita (2013) estudaram o fenômeno da transferência de oxigênio e valores de KLa sob
biorreatores miniaturizados. Como a maioria dos sistemas em escala miniaturizada têm exibido
valores de KLa análogos, os mesmos podem ser considerados ferramentas úteis para o
desenvolvimento de bioprocessos, com a vantagem adicional de oferecer uma maior integração
com detectores on-line e ferramentas de controle, sendo, portanto, capazes de acelerar a
aquisição de dados e reduzir o custo de experimentações.
2.3.2.2 Métodos de Detecção e Controle
Os sistemas biológicos são extremamente complexos, sendo governados pelas
interações entre condições ambientais e respostas genéticas. O estudo e o desenvolvimento de
bioprocessos sofisticados requerem a capacidade de analisar tais interações (SZITA et al.,
2010). Dentro desse contexto, a detecção e o controle de condições e parâmetros significativos
são cruciais para a realização de experimentos de bioprocessos (SCHÄPPER et al., 2009).
É importante salientar que a microtecnologia é uma abordagem muito sensível e a menor
alteração no volume reacional é capaz de interferir nos resultados finais. Desta forma, existe
uma necessidade de se aplicar métodos não-invasivos que prescindam a coleta de amostras dos
56
microbiorreatores. Um bom exemplo de tais métodos é a implementação de detectores ópticos
(diodos ópticos), os quais geralmente são capazes de cobrir um grande número de variáveis em
um grande espectro de detecção (NGE; ROGERS; WOOLLEY, 2013).
Schäpper et al. (2009) revisaram as estratégias e os instrumentos mais comuns para a
detecção e controle de parâmetros em microbiorreatores, os quais serão brevemente explorados
a seguir, quais sejam :temperatura; pH; DO; e OD.
A temperatura é uma variável relativamente fácil de se medir e geralmente é detectada
por resistências detectoras de temperatura (RTDs) ou termopares (SCHÄPPER et al., 2009). As
RTDs são ferramentas capazes de medir a temperatura através da sua variação de resistência.
Por outro lado, os termopares são sensores compostos por dois metais diferentes soldados em
uma extremidade formando uma junção, onde é gerada uma carga devido à variação da
temperatura. Embora os termopares sejam muito pequenos (menos de 1,6 mm) e têm uma
resposta rápida às variações, as RTDs são mais precisas e permanecem estáveis por períodos
muito mais longos. Além disso, as RTDs são pouco onerosas e podem ser facilmente integradas
dentro da estrutura de um microbiorreator (SCHÄPPER et al., 2009). Controlar a temperatura,
por outro lado, pode ser complicado devido à sensibilidade da microescala. Como as proporções
da relação área superficial/volume de trabalho são maiores em tais circunstâncias, o calor é
trocado rapidamente entre os microbiorreatores e o ambiente (SCHÄPPER et al., 2009). Além
disso, a homogeneidade da temperatura por todo o microdispositivo deve ser questionada
quando materiais de baixa condutividade térmica, como PMMA e PDMS são adotados. Uma
solução simples em relação ao controle de temperatura consiste no posicionamento dos
microdispositivos em incubadoras ou aquecedores (SCHÄPPER et al., 2009). Embora tais
abordagens permitissem a paralelização de vários dispositivos no mesmo local com a mesma
temperatura condicionada, experimentos com o objetivo de estudar os efeitos de diferentes
temperaturas seriam menos práticos. Uma alternativa viável e barata capaz de contornar tais
desvantagens seria a implementação de microaquecedores dentro da câmara fermentativa
(SCHÄPPER et al., 2009).
Detectar e controlar o pH pode ser uma tarefa desafiadora, uma vez que os métodos
convencionais dependem de sondas volumosas e adições químicas, interferindo diretamente no
volume de trabalho total. Dentro da microescala, o pH é geralmente medido através de chips de
transistores de efeito de campo sensíveis a íons (ISFET) e diodos ópticos. Os detectores ISFET
dependem das mudanças pontuais dentro de um transistor com base na variação das
57
concentrações de íons (por exemplo, H+ e OH-) (BERGVELD, 2003; LEE; KYU KIM; KIM,
2009), enquanto que os diodos ópticos medem o pH através do tempo ou intensidade de sinais
fluorescentes. Embora os detectores ISFET sejam capazes de trabalhar com maior precisão e
menor tempo de resposta em uma ampla faixa de pH, diodos ópticos tendem a ser a opção
favorita para a detecção do pH nos microbiorreatores devido à sua facilidade de integração e
natureza não-invasiva (SCHÄPPER et al., 2009). Além disso, ao contrário dos diodos ópticos,
os detectores ISFET requerem um eletrodo referência, tornando o design dos microbiorreatores
mais complexo, e exigindo ainda que sejam reutilizáveis devido ao seu custo (SCHÄPPER et
al., 2009). Para o controle do pH, o pequeno volume da microescala torna-se a maior
problemática a ser resolvida devido às alterações do volume reacional com soluções de controle
de pH. Alternativas simples consistem na utilização de tampões na composição do meio de
cultivo ou na injeção direta de soluções químicas muito concentradas, no intuito de reduzir ao
máximo o volume alterado (SCHÄPPER et al., 2009). Ambas as abordagens são muito
limitadas: os tampões geralmente funcionam em um intervalo de pH específico e são limitados
a um certo número de íons; e a injeção de soluções químicas interfere diretamente no volume
reacional, um problema crítico perante a microescala. Uma solução promissora consiste na
aplicação de gases ácidos ou básicos para o controle do pH (ISETT et al., 2007). No entanto,
tal estratégia pode induzir o surgimento de bolhas à medida que o gás se difunde pela fase
aquosa, um cenário indesejado para os microbiorreatores (SCHÄPPER et al., 2009).
A concentração celular, ou densidade celular, pode ser facilmente monitorada pelo
método tradicional adotado nas escalas convencionais ao mensurar a DO do líquido
fermentativo, conforme ditado pela lei de Lambert-Beer. A técnica de espectrofotometria é
aplicada na microescala através de sondas óticas, utilizando diodos emissores de luz (LED)
como fonte de luz, e fotodetectores como instrumentos de detecção. Em tais circunstâncias, faz-
se necessária rigorosa atenção acerca do posicionamento correto do emissor e coletor de luz
perante a estrutura do dispositivo (SCHÄPPER et al., 2009). Como os microbriorreatores
tendem a ser projetados como uma estrutura achatada, o posicionamento vertical dos detectores
implica na transmissão da luz para dentro da câmara de cultivo em um caminho de curto
comprimento, uma boa opção para o monitoramento preciso de densidades celulares mais
elevadas. Por outro lado, o posicionamento dos emissores sobre um quadro de leitura horizontal
resultaria numa iluminação de menor intensidade no ponto de detecção, favorecendo a precisão
de resultados para densidades celulares inferiores (SCHÄPPER et al., 2009). Portanto, ao
mudar a posição do sistema de detecção celular em microbiorreatores descartáveis, tornam-se
58
necessárias novas calibrações a cada ensaio realizado. Outras características importantes
incluem o alinhamento das fibras para evitar a perda de luz transmitida, a ausência de agentes
interferentes entre o emissor e o detector (por exemplo, sólidos, coloides ou bolhas,
responsáveis por dispersar luz) e a interferência da luz externa ao sistema (SCHÄPPER et al.,
2009).
A detecção e o controle dos níveis de OD são cruciais para processos aerados. Essa
variável é facilmente detectada pelos detectores ópticos, ao utilizarem a saturação fluorescente
do oxigênio para medir sua concentração no meio fermentativo (SCHÄPPER et al., 2009). Este
método de detecção não é invasivo e nem oneroso, sendo de fácil implementação na estrutura
do microbiorreator. Adicionalmente, os sensores ópticos de OD aumentam a sua sensibilidade
com a queda na concentração de oxigênio, ajustando perfeitamente às características dos
processos de fermentação e à microtecnologia (SCHÄPPER et al., 2009). Entretanto, o controle
de OD sobre o meio fermentativo em microbiorreatores torna-se bastante limitado, uma vez que
o fornecimento direto de oxigênio por borbulhamento pode interferir nos sistemas de detecção
óptica. Para contornar tal problemática, a difusão de oxigênio pode ser realizada por membranas
permeáveis aos gases, permitindo a difusão de O2 externo ou ainda, de sistemas de aeração ou
câmaras de introdução de gás instalados no topo da câmara de fermentação, o que aumentaria
consideravelmente a taxa de difusão da fase gasosa para a fase aquosa (SCHÄPPER et al.,
2009). Ainda, aumentar a concentração de O2 na fase gasosa do sistema e, quando possível,
aplicar um sistema de mistura capaz de proporcionar bons níveis de homogeneidade, podem
aumentar significativamente os níveis de OD no meio fermentativo (SCHÄPPER et al., 2009).
Com o intuito de organizar e fornecer uma melhor visualização acerca das estratégias
para detecção e controle de parâmetros em microbiorreatores, a Figura 9 apresenta um
fluxograma contendo tais questões salientadas.
59
Figura 9. Fluxograma das principais estratégias para detecção e controle de parâmetros em microbiorreatores. Fonte: Elaboração própria.
60
2.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Durante os últimos anos, os microbiorreatores têm sido desenvolvidos e aplicados com
sucesso nos bioprocessos. Vários trabalhos vêm comprovando a viabilidade acerca da aplicação
dessa tecnologia com o objetivo de se estudar o comportamento cinético de uma forma geral
em bioprocessos. Consequentemente, a aceitação e adoção dos microbiorreatores e demais
técnicas no âmbito da microescala têm crescido consideravelmente no campo dos processos
biotecnológicos.
Na sociedade atual, onde a bioeconomia cresce de forma consistente, juntamente com a
gradual migração dos processos químicos para a rota biotecnológica, o desenvolvimento e a
otimização de bioprocessos torna-se crucial para o estabelecimento de uma indústria sólida e
capaz de superar gargalos e desvantagens recorrentes. É nesse contexto que os
microbiorreatores tornam-se uma estratégia interessante para a triagem de parâmetros. Quando
desenvolvidos corretamente, eles são capazes de fornecer uma enorme quantidade de dados
precisos durante um pequeno período de tempo, de forma viável e reduzindo os custos das
experimentações.
Embora essa tecnologia seja atraente e pareça contornar problemas atuais, como o alto
custo das experimentações e a baixa precisão de dados, o desenvolvimento de um centro
equipado com as instalações adequadas para a construção de microbiorreatores requer um
orçamento oneroso. Ainda, a popularidade dos microbiorreatores e demais técnicas da
microescala nos bioprocessos ainda permanecem em baixa popularidade. Tal circunstância
pode ser explicada pela natural apreensão dos cientistas àquilo que lhes parece novo e
desconhecido, aliado ao relativo baixo número de trabalhos publicados sobre as contribuições
da tecnologia da microescala à biotecnologia industrial. As atuais limitações da adoção dos
microbiorreatores como ferramentas para estudos de processos biotecnológicos se resumem aos
métodos de detecção e controle de variáveis mais específicas. A maioria das aplicações
geralmente se limita à detecção e controle de temperatura, densidade celular, pH e concentração
de gases. Desta forma, bioprocessos mais complexos devem enfrentar muitas barreiras ao serem
conduzidos por essa tecnologia, dada a necessidade de sensores viáveis, de elevada
versatilidade e sofisticação. Além disso, a escalabilidade dos bioprocessos ainda é motivo de
desvantagens, a pequena natureza da microescala é diferente da escala de bancada convencional
e não deve ser comparada diretamente, dificultando as análises comparativas entra ambas.
61
É perante esse cenário que, embora os estudos sinalizem para um grande potencial, há
muitas lacunas a serem vencidas e aspectos a serem explorados dentro do universo da
microescala voltada para os bioprocessos e biotecnologia industrial. Portanto, há muito a ser
explorado dentro do mundo da microescala dos bioprocessos e da biotecnologia industrial. Essa
abordagem apresenta um grande potencial e ainda encontra-se em sua infância. Portanto, há
muito a ser descoberto e desenvolvido, o que torna a tecnologia do microbiorreator um campo
de estudo emocionante, dotando o presente trabalho de caráter relativamente inovador e de
fundamental importância no cenário nacional. Não obstante, devido à sua natureza multi, inter
e transdisciplinar, a ciência dos microbiorreatores exige o trabalho colaborativo entre as mais
diferentes ciências para que se desenvolvam ferramentas viáveis, intuitivas e talvez até mesmo
revolucionárias, capazes de reduzir custos e o tempo gasto durante a engenharia de bioprocessos
industriais.
Diante do exposto, o presente trabalho foi concebido com o intuito de elucidar de forma
sistemática o campo dos microbiorreatores, mediante ferramentas prospectivas de pesquisa,
tendo em vista a necessidade de se fazer uma varredura dessa importante temática, em que
pesem suas possibilidades, aplicações e elevado potencial tecnológico. Somado à escassez de
estudos no cenário nacional, provê-se uma preciosa oportunidade para que trabalhos futuros
sejam desenvolvidos com maior embasamento. O momento nunca foi tão promissor.
62
CAPÍTULO 3 PROSPECÇÃO TECNOLÓGICA
Como hábito desde os prolegômenos da evolução do ser humano e suas sociedades,
preocupar-se com o futuro erigiu-se como um instinto natural não apenas para a perpetuação da
espécie, mas também de bens, costumes e ideias. No passado, exprimir condições futuras
compunha-se de profecias, previsões, ensaios e livros que suscitavam o olhar crítico para o
futuro, no intuito de melhorar o estado presente em busca do desenvolvimento (OLIVEIRA,
2014).
Apesar de sua prática milenar, a visão de futuro permaneceu-se tendenciosa e
determinística até o final da II Guerra Mundial. Até então, o estudo do futuro baseava-se em
um enfoque unidirecional, fundamentado em comportamentos históricos. Chamado de previsão
clássica, tal abordagem torna-se falha ao negligenciar ambientes dinâmicos, onde rupturas
políticas, econômicas e sociais surgem frequentemente. Este cenário marcou o período pós-
guerra, durante a década de 1950, no qual as novas inter-relações e interferências entre os
autores passou a fazer parte do conceito de futuro. De forma não determinada, portanto, a visão
de futuro passou a ser construída a partir de ações presentes protagonizadas pelos seus autores
e suas ações e interações (OLIVEIRA, 2014).
Hodiernamente, prospectar o futuro deixou de ser apenas uma prática adicional para se
tornar um estudo medular no desenvolvimento de empresas, sociedades e economias (PORTER
et al., 2004). A análise de tecnologias emergentes confere uma grande vantagem competitiva,
sendo capaz de detectar ameaças, tendências e oportunidades (COELHO apud OLIVEIRA,
2014). De tal forma, seu exercício tornou-se fundamental para o direcionamento de estratégias
e decisões a serem executadas por governos, no intuito de fortalecer suas economias; e
instituições e empresas, a fim de sucederem no processo de desenvolvimento de pesquisa e
inovação.
Sob tais circunstâncias, os estudos de futuro, comumente chamados de Estudos de
Prospecção Tecnológica, sob denominação internacional de foresight, forecast, future studies
ou future assessments, tornaram-se capazes de fornecer as principais tendências do estado da
arte de uma tecnologia, produto ou setor. De tal forma, são capazes de identificar tecnologias
promissoras e úteis, assim como no estabelecimento de parcerias entre setores e instituições
endereçadas.
63
Devido ao olhar abrangente da Prospecção Tecnológica, seus estudos devem ser de
natureza multi e interdisciplinar, apoiando-se no tripé informação, tecnologia e participação da
sociedade. Ademais, é crucial que se envolva mais de uma estratégia, método ou técnica, de
cunho quantitativo e também qualitativo, a fim de compensar deficiências e restrições de cada
uma das estratégias adotadas (OLIVEIRA, 2014).
De acordo com Porter et al. (2004), os métodos e estratégias de prospecção podem ser
agrupadas e classificadas nas seguintes famílias: Análise de Tendências, Cenários, Criatividade,
Métodos Descritivos e Matrizes, Métodos Estatísticos, Modelagem e Simulação,
Monitoramento e Sistemas de Inteligência, Opinião de Especialistas, e Sistemas de Avaliação
e Decisão. Dentre tais, o Monitoramento e Sistemas de Inteligência é a técnica mais básico
dentre das famílias, constituindo-se da observação e checagem de fontes básicas de informações
de significância para dada finalidade. Desta forma, torna-se fundamental para qualquer
atividade de prospecção. Dentre as fontes de informação utilizadas, encontram-se aquelas de
natureza técnica: artigos científicos, patentes, catálogos, anais, revistas, jornais, entre outros.
Não obstante, fontes de informações não literárias, como opinião de especialistas, são
comumente adotadas em tal estratégia (OLIVEIRA, 2014).
No que tange ao monitoramento de informações científico-tecnológicas, artigos
científicos e depósitos de patentes constituem dois principais instrumentos de estudos. Os
artigos científicos são publicados em periódicos de natureza científica com o intuito de
preservar e divulgar conhecimento científico, assim como estabelecer comunicações entre
autores e grupos de cientistas (MUELLER apud OLIVEIRA, 2014). As patentes, por sua vez,
são documentos titulares outorgados pelo Estado, de propriedade temporária sobre dada
invenção, fruto de uma pesquisa e/ou desenvolvimento tecnológico, no qual seus autores são
forçados a revelar de forma detalhada o conteúdo técnico de tal inovação (INPI, 2017). Desta
forma, mediante os estudos prospectivos, artigos científicos podem ser interpretados como
indicadores de natureza científica, enquanto que patentes podem indicar tendências de natureza
tecnológica.
Consequentemente, a adoção de artigos científicos e patentes como principais fontes de
informação prospectiva tem se mostrado uma ferramenta consistente para a análise de
tendências e estabelecimento de estratégias e decisões. A quantidade e o detalhamento de
informações contido em sua estrutura proporcionam a identificação de novos mercados e
tecnologias, previsão de novas tendências, mapeamento e evolução de tecnologias já
64
consolidadas, definição de oportunidades tecnológicas, dentre várias outras possibilidades
(OLIVEIRA, 2014).
Em tal contexto, a plataforma Scopus® (Elsevier, Amsterdã) denota-se como uma
potente base de dados para a busca de artigos científicos, tendo em vista sua coleção de
documentos científicos que extrapola a marca de 38 milhões de arquivos, os quais são
adicionados diariamente. Além dos documentos, a base oferece ainda uma gama de ferramentas
analíticas de fácil manipulação (ELSEVIER, 2017).
Já no âmbito patentário, a plataforma Orbit Intelligence® (Questel, Paris) compreende-
se em uma forte fonte de documentos de patentes diariamente catalogados. Seu diferencial
consiste na capacidade de executar estratégias de busca simples ou altamente avançadas, bem
como em analisar e monitorar os resultados a partir de uma poderosa ferramenta analítica. Sua
interface é bastante simplificada e indutiva, facilitando a execução de estudos prospecção
tecnológica (QUESTEL, 2017).
Dentre as várias estratégias de Prospecção Tecnológica descritas na literatura, destaca-
se aquela descrita por Bahruth, Antunes e Bomtempo (2006), a qual é dividida em quatro
diferentes fases, considerando a execução, organização e conclusão dos estudos prospectivos
conforme demonstrado na Figura 10.
Figura 10. Sequência de fases a serem adotadas para a execução, organização e conclusão da prospecção
tecnológica segundo Bahruth, Antunes e Bomtempo (2006).
Em suma, dada a ocasião em que se deseja estudar tecnologias e/ou abordagens que se
encontram em sua fase inicial, o monitoramento de patentes torna-se interessante para a melhor
65
compreensão e análise de tal contexto. Diante de tais circunstâncias, a Prospecção Tecnológica
apresenta-se como um poderoso norteador, capaz de indicar quais os passos a serem seguidos;
quais as decisões a serem tomadas; quais as oportunidades a serem exploradas, rumo ao
desenvolvimento de tecnologias de sucesso científico e mercadológico.
66
CAPÍTULO 4 METODOLOGIA
Considerando as várias estratégias de Prospecção Tecnológica descritas na literatura, o
Monitoramento e Sistemas de Inteligência foi adotado como principal estratégia para a
realização do presente trabalho. Ainda, a metodologia aplicada para tal foi realizada com base
no método prospectivo realizado por (OLIVEIRA, 2014) e descrito por Bahruth, Antunes e
Bomtempo (2006), conforme a Figura 10 do Capítulo 3.
De tal forma, no Capítulo 4 apresentar-se-ão as Fases 1 e 2 da metodologia discutida,
seguido pelo Capítulo 6 que versar-se-á sobre as Fases 3 e 4. Adiante, descrever-se-á a
metodologia abordada para a elaboração do Capítulo 6 – Estudo de Caso do presente trabalho.
4.1 FASE 1: PREPARATÓRIA
A Fase 1 Preparatória consistiu-se no detalhamento da metodologia de prospecção
tecnológica e das fontes de informação empregadas para a realização do presente trabalho.
O estudo sobre microbiorreatores e sua aplicação no desenvolvimento de bioprocessos
iniciou-se a partir do processo de incorporação de informações relevantes, com o intuito final
de se formar uma visão técnica sobre o tema. Para tal, foi executada uma extensa revisão
bibliográfica referente aos microbiorreatores, metodologias de microfabricação e suas
aplicações nos mais diversos campos da ciência. Adicionalmente, foi realizado um estudo
prévio de busca de patentes, a fim de definir estratégias de busca a serem adotadas nas fases
seguintes. Após o levantamento de dados, a estrutura da metodologia de prospecção tecnológica
foi elaborada. De tal forma, as principais fontes de informação adotadas no presente estudo
foram artigos científicos e documentos de patentes.
4.2 FASE 2: PRÉ PROSPECTIVA
A Fase 2 Pré Prospectiva consistiu-se no delineamento da prospecção da inovação bem
como na análise da curva de crescimento da tecnologia. Para tanto, foram determinados os
seguintes critérios:
• Seleção da base de dados a ser adotada para a Prospecção da Inovação;
• Limitação do período de busca;
67
• Descrição da estratégia de busca a ser aplicada;
• Elaboração da curva de crescimento da tecnologia utilizando artigos científicos e
documentos de patentes;
• Construção do panorama dos pedidos de patentes no mundo;
• Determinação dos países de origem da tecnologia e dos principais mercados
potencialmente protegidos para documentos de patentes;
• Mapeamento das principais instituições detentoras de artigos científicos e pedidos de
patentes;
• Identificação de residentes brasileiros como autores de artigos científicos e/ou
inventores de patentes;
• Reconhecimento dos principais aspectos específicos que têm sido temas de artigos
científicos e patentes;
• Monitoramento da atuação comercial dos principais players na fabricação de
microbiorreatores;
No presente estudo, a base de dados abordada para a prospecção tecnológica de artigos
científicos foi o Scopus® (Elsevier, Amsterdã). No que se dizer respeito aos documentos de
patentes, a base de dados adotada foi o Orbit Intelligence® (Questel, Paris).
4.2.1 Estratégia de Busca
Com o propósito de se estabelecer uma análise do cenário científico que contempla a
tecnologia dos microbiorreatores, as buscas por artigos científicos deram-se em uma primeira
instância. Tal busca teve como objetivo inicial a análise do cenário científico enfocado apenas
na tecnologia de biorreatores microfluídicos especializados em bioprocessos industriais e não
industriais. Para tanto, foi dada prioridade para os termos “microbioreactor” e
“microfermentor” nos campos título do artigo, resumo e palavras-chave, como estratégia de
busca para a base de dados Scopus®.
Para a prospecção de patentes, no intuito de abranger e recuperar o maior número
possível de documentos pertinentes ao propósito do presente estudo, adotou-se como estratégia
de busca o uso de palavras-chave sinônimas ao termo “microbioreactor”, no campo título e
68
resumo dos pedidos de patentes. Ainda, algumas palavras-chave foram truncadas ao utilizar de
um caractere auxiliar (+), o qual é responsável por indicar variações menores no termo de busca
na pesquisa (como por exemplo, plurais), a fim de se englobar um maior número de resultados
pertinentes. O Quadro 2 apresenta todas as palavras-chave utilizadas na estratégia de busca
utilizando a base de dados Orbit Intelligence®.
Quadro 2. Palavras-chave abordadas na estratégia de busca da prospecção tecnológica de patentes.
Palavras-chave
microbioreactor+ microfermentor+ “miniaturized bioreactor+”
“microfluidic bioreactor+” microreactor+ microplate+
Ainda, além da adoção das palavras-chave sinônimas do termo “microbioreactor”, foi
abordada a Classificação Internacional de Patentes (CIP) pertinente ao assunto estudado. De tal
modo, a classe/subclasse C12M entende-se como a que melhor classifica os microbiorreatores,
referindo-se a aparelhos para enzimologia ou microbiologia (Figura 11) (INPI, 2017).
Figura 11. Descrição da seção, classe e subclasse da CIP abordada na estratégia de prospecção tecnológica de
patentes.
69
Dentro do grupo C12M, foram adotadas as subseções C12M 1/00 e C12M 3/00,
conforme indicado no Quadro 3.
Quadro 3. Descrição das subseções da CIP C12M adotadas na metodologia de prospecção tecnológica de
patentes.
Subseção Descrição
C12M 1/00 ➢ Aparelhos em que são produzidos ou isolados micro-organismos ou enzimas;
➢ Aparelhos em que são investigadas características de micro-organismos ou
enzimas;
➢ Aparelhos especialmente adaptados para empregar micro-organismos ou enzimas
como reagentes ou biocatalisadores;
➢ Aparelhos para uso em escala tanto industrial como laboratorial.
C12M 3/00 ➢ Aparelhos para cultura de tecidos, células de animais ou plantas, ou de vírus.
De forma geral, a estratégia de busca final consistiu na adoção de seis palavras-chave
sinônimas, restringidas por duas CIP pertinentes ao tema dos microbiorreatores, conforme
demonstrada no Quadro 4.
Quadro 4. Estratégia de busca adotada para a busca de pedidos de patentes na base de dados Orbit Intelligence®.
Palavras-chave/ CIP
C12M 1/00 microbioreactor+ microfermentor+ “miniaturized bioreactor+”
C12M 3/00 “microfluidic bioreactor+” microreactor+ microplate+
Todas as buscas de artigos científicos e documentos de patentes envolvidas no presente
trabalho foram realizadas no período que contempla o primeiro e segundo semestre de 2017. O
período de abrangência das buscas em cada uma das bases de dados é indicado no Quadro 51.
1 A disponibilidade de documentos em cada base de dados é diferente, resultando na divergência da datação e
abrangência temporal dos documentos.
70
Quadro 5. Período de abrangência e de realização das buscas para cada base de dados adotada.
Base de Dados Abrangência da Busca Período de Realização
Scopus® 1981 - 2017 Junho 2017
Orbit Intelligence® 1976 - 2017 Novembro 2017
4.2.2 Análise Taxonômica de Artigos Científicos
Com o objetivo de realizar um estudo refinado perante o atual contexto técnico dos
microbiorreatores e sua tecnologia, os artigos científicos provenientes das buscas na base de
dados Scopus® foram avaliados quanto à sua relevância, disponibilidade de informações no
escopo do texto e disponibilidade de acesso ao documento. Para tal análise, o período temporal
abrangeu apenas os últimos 5 anos (2012-2017). Consequentemente, foram identificadas as
principais tendências abordadas nos estudos, fornecendo, portanto, base para a criação de
taxonomias para a classificação dos mesmos.
As taxonomias abordadas foram subdivididas em duas classes: macro (objetiva) e micro
(subjetiva). De tal forma, as respectivas definições de cada taxonomia são descritas no Quadro
6.
Quadro 6. Taxonomias adotadas na análise taxonômica dos artigos científicos.
Classe Taxonomia Descrição
Macro
Detalhamento do Dispositivo? Se o artigo apresenta o detalhamento do
dispositivo, seja este em desenho ou
descrição
Comparação com Escalas
Superiores?
Se o artigo apresenta estudos comparando
os resultados obtidos a partir dos
microbiorreatores com resultados análogos
às escalas convencionais
Aplicação do Microbiorreator? Se o artigo, além de desenvolver o
microbiorreator, envolve estudos com sua
aplicação
71
Cálculo de Parâmetros? Se o artigo apesenta cálculo de parâmetros
de relevância para o dispositivo e/ou
aplicação
Micro
Fabricante/Composição do
Dispositivo
Qual a composição material do
microbiorreator ou qual o seu fabricante
Organismo Abordado Qual o organismo biológico foi adotado no
bioprocesso
Finalidade do Bioprocesso Qual a finalidade do bioprocesso
Parâmetros Controlados Quais os parâmetros foram controlados
durante o bioprocesso
Análise Temporal Análise subjetiva quanto ao tempo de
incorporação do microbiorreator como
potencial de mercado
72
CAPÍTULO 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pautando-se na lógica da metodologia de prospecção adotada no presente trabalho, o
Capítulo 4 apresentou os passos imbuídos nas Fases 1 (Preparatória) e 2 (Pré-Prospectiva), nas
quais a metodologia de prospecção tecnológica foi explanada e detalhada, definindo ainda a
fonte de informações a ser adotada. Por conseguinte, o presente capítulo tratar-se-á dos
resultados obtidos, integrando as Fases 3 e 4, as quais consistem nas etapas de Prospectiva e
Pós-prospectiva, respectivamente.
5.1 FASE 3: PROSPECTIVA
Assim como descrito por Bahruth, Antunes e Bomtempo (2006), a Fase 3 consiste na
coleta, tratamento e análise dos dados obtidos a partir da estratégia metodológica definida,
suscitando a prospecção da inovação e a análise da curva de crescimento da tecnologia dos
microbiorreatores.
A estratégia de busca realizada na base de dados Scopus® proveu 286 resultados que
abordam a construção e/ou aplicação de microbiorreatores para os mais variados fins. Os
documentos foram organizados e avaliados estatisticamente com o auxílio das ferramentas de
análise de dados da base Scopus®. Em sequência, a partir da análise subjetiva perante a
relevância, disponibilidade de informações no escopo do texto e disponibilidade de acesso dos
286 resultados, foram selecionados 64 artigos científicos para a análise taxonômica.
Para a estratégia de busca realizada na base de dados Orbit Intelligence®, foram obtidos
229 resultados, dos quais todos apresentavam resumo e demais informações relevantes para sua
análise, sem nenhuma sobreposição de número de prioridade, considerando-se assim, portanto,
a ausência de replicatas. Os documentos foram organizados e submetidos ao processo de
validação, no qual foi avaliada a pertinência subjetiva dos documentos perante o tema e foco
do assunto referente aos microbiorreatores e sua tecnologia.
O processo de validação resultou na exclusão de 8 documentos de patentes que não
abrangiam o tema abordado, conferindo uma pertinência de 97% dos resultados (220
documentos) obtidos pela estratégia de busca adotada, conforme mostrado na Figura 12. Dentre
os documentos excluídos, o tema abordado tratava-se de métodos e aparatos de centrifugação;
termocicladores; métodos de limpeza de dispositivos laboratoriais; sistema de emulsão
73
macromolecular; desenvolvimento de meio de cultura; e automação de análises de ácidos
nucleicos em escala macromolecular.
Figura 12. Avaliação da pertinência dos documentos obtidos a partir da estratégia de busca adotada referente ao
tema de cada documento.
De forma resumida, a Tabela 1 apresenta os resultados obtidos a partir das duas
estratégias de buscas utilizando as bases de dados Scopus® e Orbit Intelligence®.
Tabela 1. Resultados obtidos e avaliados a partir das buscas utilizando as bases Scopus® e Orbit Intelligence®.
Base de Dados Resultados Obtidos Resultados Avaliados
Scopus® 286 artigos 64 artigos
Orbit Intelligence® 229 patentes 220 patentes
5.2 FASE 4: PÓS-PROSPECTIVA
De maneira lógica, a etapa pós-prospectiva consiste na comunicação dos resultados
obtidos, implementando as ações de monitoramento para a prospecção da inovação e do ciclo
de vida da tecnologia dos microbiorreatores.
97%
3%
Pertinentes
Não Pertinentes
74
5.1.1 Base de Dados de Artigos Científicos - Scopus®
Perante a análise de primeira instância dos artigos científicos, as 286 publicações
oriundas das buscas na base de dados Scopus® foram analisadas com o auxílio das ferramentas
estatísticas da própria plataforma. De tal forma, com o intuito de se estabelecer um panorama
referente à evolução temporal da tecnologia dos microbiorreatores, a Figura 13 apresenta a
relação de artigos publicados por ano no período entre 1981 e 2017.
Figura 13. Evolução temporal das publicações científicas sobre a tecnologia dos microbiorreatores, a partir da
base de dados Scopus®.
Por meio da Figura 13, percebe-se um consistente crescimento no número de
publicações anuais relacionadas à tecnologia dos microbiorreatores a partir de 2005.
Interessantemente, Whitesides (2006) e Oliveira et al. (2016) descrevem em seus textos a
emergência da aplicação da microfluídica e sua tecnologia em bioprocessos na década de 2000.
De fato, o número de publicações sobre microbiorreatores anteriores a essa data são quase
inexistentes. A tecnologia microfluídica, suscitada ao final da década de 1970, nasceu
entremeio os processos de natureza química, sendo rapidamente aplicada aos processos
bioquímicos da implume biologia molecular, durante a década de 1980. Deveras, a aplicação
dos bioprocessos em pequena escala ainda não era um tema de alta relevância científica,
refletindo no número de artigos científicos gerados a partir do tema. Possivelmente, as
limitações tecnológicas da época tenham contribuído para esse cenário.
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 02
0 0 1 1 1 0 0 1 2 3 3
6
14
20
12
15
24
19
25 25
21
27
19
26
17
0
5
10
15
20
25
30
1981 1983 1985 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 2009 2011 2013 2015 2017
No
de
Do
cum
ento
s
Ano
75
Entretanto, após sua emergência, o estudo dos microbiorreatores manteve-se consistente
através dos anos, provendo avanço nas técnicas, metodologias e aplicações agregadas à
tecnologia.
Em relação à distribuição geográfica dos artigos científicos, a Figura 14 apresenta os
principais países de origem do primeiro autor dos documentos avaliados. Entre eles, encontra-
se em primeiro lugar os EUA com um total de 73 artigos. O segundo país com maior número
de publicações científicas é a Alemanha, com 43 artigos, seguido pela Grã-Bretanha, com 35
artigos. Os demais países desse ranking são: Dinamarca, Austrália, China, Japão, Taiwan,
Malásia, França, Itália e Holanda. O Brasil encontra-se em 15º lugar, com um total de 6 artigos
(dado não demonstrado).
Figura 14. Países de origem das publicações científicas obtidas a partir da base Scopus®.
A partir da Figura 14, percebe-se que a origem da tecnologia dos microbiorreatores se
concentra majoritariamente nos EUA. Analogamente, a tecnologia microfluídica surgiu a partir
das necessidades que o programa Apollo demandava (ELVEFLOW, 2017). Desta forma, torna-
se claro o motivo pelo qual a concentração dos estudos sejam oriundos dos EUA, uma vez que
o país investiu uma grande quantidade de recursos e criou uma variedade de programas que
incentivaram o surgimento e desenvolvimento dos microbiorreatores.
73
43
35
19
17
16
15
13
11
8
8
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80
EUA
Alemanha
Grã-Bretanha
Dinamarca
Austrália
China
Japão
Taiwan
Malásia
França
Itália
Holanda
No de Documentos
Paí
s
76
A Alemanha por sua vez, em segundo lugar no ranking, possui uma série de empresas
voltadas para o desenvolvimento de tecnologias referentes aos microbiorreatores. Em destaque,
encontra-se a empresa mp2-labs, que é especializada no desenvolvimento e melhoramento de
microbiorreatores e aparatos para sua utilização. Como por exemplo, o BioLector© é um dos
principais produtos comercializados pela empresa alemã, sendo este capaz de controlar e
detectar uma série de parâmetros de alto interesse como taxa de alimentação e oxigênio
dissolvido, pH, temperatura e agitação (M2P LABS, 2017).
A Grã-Bretanha, por sua vez, possui um grande centro de pesquisas envolvendo
microbiorreatores, situado no Departamento de Engenharia Bioquímica da UCL. É também
neste centro de pesquisas que se encontra o autor com maior número de artigos publicados,
Szita, N., conforme mostrado na Figura 15. Como uma de suas primeiras contribuições para o
desenvolvimento de microbiorreatores, o trabalho intitulado “Development of a multiplexed
microbioreactor system for high-throughput bioprocessing” (SZITA et al., 2005) refere-se
ao desenvolvimento de um sistema de microbiorreatores dispostos em série para o cultivo de E.
coli. Entretanto, a grande contribuição desse trabalho não se encontra no desenvolvimento do
dispositivo em questão, mas sim no seu pioneirismo quanto à paralelização de várias cópias do
mesmo microbiorreator, resultando em um alto rendimento de dados.
Figura 15. Principais autores de artigos científicos obtidas a partir da base Scopus®.
17
15
13
12
11
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Szita, N.
Wu, M.H.
Sinskey, A.J.
Bocazzi, P.
Gernaey, K.V.
No de Documentos
Au
tor
77
Com o segundo maior número de publicações científicas, o autor Wu, M.H., de acordo
com a plataforma Scopus®, é filiado à Chang Gung University (Taiwan). Em terceiro e quarto
lugar, encontram-se os autores Sisnkey, A.J. e Bocazzi, P., ambos filiados ao Massachusetts
Institute of Technology (MIT)(EUA). Finalmente, o quinto autor com maior número de artigos
é Gernaey, K.V., filiado à Danmarks Tekniske Universitet (Dinamarca). De maneira
complementar, a Figura 16 apresenta as instituições de maior relevância perante às buscas
realizadas na base Scopus®.
Figura 16. Principais instituições filiadas aos artigos científicos obtidos a partir da base Scopus®.
Ao mesclar as informações das Figuras 14, 15 e 16, percebe-se a correlação entre os
principais autores, suas filiações e o país de origem dos artigos publicados. Desta forma, dar-
se-á destaque às seis instituições de principal contribuição para a tecnologia dos
microbiorreatores.
Localizado em Cambridge, Massachusetts (EUA), o Instituto de Tecnologia de
Massachusetts (MIT) compreende em uma universidade privada de especialidade em ciências
aplicadas e engenharia. O MIT detém algumas das primeiras publicações envolvendo os
microbiorreatores, sendo a principal instituição referente ao tema abordado. Dentre as
publicações, o principal departamento envolvido é o Departamento de Biologia, e seus artigos
23
18
13
12
11
11
0 5 10 15 20 25
Massachusetts Institute of Technology
Danmarks Tekniske Universitet
UCL
University of Queensland
Technische Universitat Braunschweig
Chang Gun University
No de Documentos
Inst
itu
ição
78
transitam desde a pura criação e controle de microbiorreatores, aparatos e detectores, até
aplicações complexas como biologia sintética e cultura de tecidos e órgãos.
A Universidade Técnica da Dinamarca (Danmarks Tekniske Universitet - DTU), situada
em Lyngby (Dinamarca), é uma das instituições líderes em engenharia da Europa. Em
colaboração com os trabalhos desenvolvidos no MIT, a DTU também detém algumas das
primeiras publicações envolvendo microbiorreatores. Dentro da universidade, o principal
departamento envolvido no tema é o Departamento de Engenharia Química e Bioquímica e seus
artigos publicados são focados na construção e aprimoramento de microbiorreatores. Das 18
publicações detidas pela instituição, apenas três são de aplicações específicas.
A UCL, situada em Londres (Inglaterra), é uma universidade que abrange as mais
diversas áreas de estudos, não se limitando às ciências aplicadas e engenharias. Sua
contribuição aos microbiorreatores é mais recente, iniciando-se apenas em 2008, oscilando
entre artigos especializados no desenvolvimento de microbiorreatores e suas tecnologias e
aplicações específicas como culturas de tecidos. Apesar da sua introdução ao tema de forma
mais tardia, a UCL é a única instituição, dentre aquelas aqui discutidas, que apresenta uma
disciplina especializada na abordagem microfluídica em bioprocessos (UCL, 2017).
A University of Queensland, situada em Brisbane, Queensland (Austrália), também é
uma universidade que abrange diferentes áreas de estudos. Os seus primeiros artigos sobre
microbiorreatores deram-se em 2009, tendo uma forte contribuição nos últimos anos. Nos
últimos anos, entretanto, o tema de publicação concentra-se em aplicações mais específicas,
com um grande foco no cultivo de células tronco e técnicas de diferenciação celular. Por
exemplo, o artigo intitulado “Full factorial screening of human embryonic stem cell
maintenance with multiplexed microbioreactor arrays” (TITMARSH et al., 2013),
publicado no periódico Biotechnology Journal, versa sobre o estudo da diferenciação celular de
células tronco pluripotentes de humano (hPSCs) a partir de condições ambientais aplicadas em
um microbiorreator desenvolvido anteriormente pelos mesmos autores. Mais especificamente,
foram cultivadas células hPSCs na presença ou ausência de ácido retinóico em combinação com
diferentes níveis de fatores parácrinos. Como resultado, notou-se a influência negativa na
pluripotência das células a partir do aumento da concentração dos fatores parácrinos. Além
disso, o trabalho conclui que a aplicação do microbiorreator em questão configura-se como uma
ferramenta promissora no controle de microambientes celulares.
79
A Universidade de Tecnologia de Braunschweig (Technische Universitat
Braunschweig) situa-se em Braunschweig, Land Niedersachsen (Alemanha) e é uma
universidade técnica, especializada em ciências aplicadas e engenharias. Os primeiros artigos
publicados por essa universidade se deram a partir de 2010 e inicialmente focaram na
construção dos dispositivos.
Finalmente, a Chang Gung University é uma universidade tailandesa, localizada no
Distrito Guishan, Taoyuan. Sua contribuição nas publicações sobre microbiorreatores
consistem em artigos especializados em culturas de células de mamífero e aplicações médicas.
Em relação aos 6 artigos científicos publicados por autores filiados a instituições
brasileiras, apenas 4 foram publicados somente por instituições do Brasil, o equivalente a 1,4%
do total de artigos obtidos. De tal forma, a Tabela 2 apresenta os dados específicos dos
referentes quatro artigos científicos.
Tabela 2. Títulos, instituições, autores e ano de publicação dos artigos publicados somente por instituições
brasileiras, obtidos a partir da base Scopus®.
Título Instituição Autores Ano
Microfluidic tools toward industrial
biotechnology
Universidade Estadual de
Campinas
Universidade Federal de
São Carlos
Oliveira, A.F.
Pessoa, A.C.S.N.
Bastos, R.G.
de la Torre, L.G.
2016
Cultivation of yeast in diffusion-
based microfluidic device
Universidade Estadual de
Campinas
Oliveira, A.F.
Pelegati, V.B.
Carvalho, H.F.
Cesar, C.L.
Bastos, R.G.
de la Torre, L.G.
2016
Use of poly(methyl
methacrylate)/polyethyleneimine
flow microreactors for enzyme
immobilization
Universidade Federal de
Juiz de Fora
Universidade de São
Paulo
Cerqueira, M.R.F.
Santos, M.S.F.
Matos, R.C.
Gutz, I.G.R.
Angnes, L.
2015
Evaluation of pre-induction
temperature, cell growth at
induction and IPTG concentration
on the expression of a leptospiral
protein in E. coli using shaking
flasks and microbioreactor
Fiocruz
Larentis, A.L.
Nicolau, J.F.M.Q.
Esteves, G.D.S.
Vareschini, D.T.
De Almeida, F.V.R.
Dos Reis, M.G.
Galler, R.
Medeiros, M.A.
2014
80
Conforme a Tabela 2, os dois artigos mais recentes são oriundos da Universidade
Estadual de Capinas (UNICAMP). O mais recente, intitulado “Microfluidic tools toward
industrial biotechnology”, publicado no periódico Biotechnology Progress, trata-se de um artigo
de revisão referente às tecnologias da microfluídica e suas contribuições para o
desenvolvimento de bioprocessos industriais. Nele são descritas e exemplificadas as principais
abordagens microfluídicas adotadas para o desenvolvimento de processos bioquímicos, bem
como na teoria por detrás das técnicas. Dentre tais abordagens, encontram-se os
microbiorreatores. Nessa publicação, o objetivo geral consistiu em destacar os pontos fortes das
técnicas microfluídicas para chamar a atenção da comunidade científica às oportunidades que
as estratégias possam oferecer. Já o segundo artigo científico, consiste no desenvolvimento de
um dispositivo baseado em gradiente de concentração para o cultivo de células de S. cerevisiae.
Apesar dos resultados serem promissores, sendo capaz de reproduzir o modelo de Monod no
cultivo da cepa, o dispositivo criado no referente trabalho é bastante simples, excluindo-se de
sensores integrados para controle e detecção de parâmetros. A técnica utilizada para o controle
das células consiste em um aparato de raios infravermelhos para a produção de imagens e
respectiva visualização das células.
O artigo publicado pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) em conjunto à
Universidade de São Paulo (USP) refere-se ao desenvolvimento de um microbiorreator
enzimático feito a partir de PMMA puro, especializado na imobilização de enzimas para reações
catalíticas de diversas naturezas. Foi demonstrada a capacidade de se imobilizar mais de um
tipo de enzimas utilizando glutaraldeído como sistema de fixação enzimática. Dentre as
enzimas testadas, encontram-se a glicose oxidase, ascorbato oxidase, catalase, glutamato
desidrogenase e o complexo glicose oxidase-peroxidase de rábano silvestre. O trabalho
apresenta, além dos dados referentes à cinética enzimática, todo o detalhamento ilustrado do
microbiorreator em questão.
Finalmente, o trabalho publicado pela Fiocruz consistiu na avaliação da expressão
heteróloga de uma proteína similar à imunoglobulina de Leptospira (Lig) em células de E. coli
BL21 adotando o método convencional em escala de bancada e um método de menor escala.
Embora o artigo reivindique o termo microbiorreator, as culturas realizadas no mesmo
consistiam em volumes de 70mL, contrariando a definição de microescala adotada no presente
trabalho de dissertação. Uma vez que os volumes atingem a grandeza mililitro, a escala do
81
mesmo denota-se miliescala. Portanto, questiona-se a adoção do termo microbiorreator como
apropriado para a abordagem utilizada.
5.1.2 Análise Taxonômica de Artigos Científicos
Com o intuito de se estudar em detalhes o contexto técnico dos 286 artigos científicos
obtidos pelas buscas na base de dados Scopus®, foram selecionadas 62 publicações para a
análise taxonômica de acordo com a sua relevância, disponibilidade de informações no escopo
do texto e disponibilidade de acesso ao documento.
Para a análise Macro, foram questionadas, de maneira objetiva, a presença de quatro
quesitos no escopo dos artigos. A primeira questão refere-se à disponibilidade do detalhamento,
ilustrativo ou descritivo, do dispositivo em questão. Como resultado, 40 documentos (65%)
apresentaram o detalhamento, e 22 (35%) não apresentavam o detalhamento (Figura 17).
Figura 17. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que disponibilizaram o detalhamento
do microbiorreator em estudo.
Entre os 40 artigos do grupo positivo, o detalhamento dos microbiorreatores geralmente
aparece na seção de metodologia, onde são descritas as estratégias de microfabricação,
materiais utilizados, princípios do microbiorreator e ilustrações CAD. Portanto, o
desenvolvimento do dispositivo comporta-se como parte metodológica do trabalho, imbuindo
65%
35%
✓
✗
82
como resultados os dados de desempenho e aplicações. Dentre os 22 artigos que não
apresentaram o detalhamento do dispositivo, percebeu-se que a porção majoritária de tais
estudos adotava microbiorreatores comercialmente disponibilizados ou desenvolvidos em
trabalhos predecessores. Nesse caso, o foco dos trabalhos incumbia apenas em aplicações
específicas, como screening celular, otimização de bioprocessos e análise de expressão
heteróloga de proteínas.
Ao questionar a presença de estudos comparativos entre o desempenho de
microbiorreatores e reatores de escalas convencionais, apenas 21 artigos (34%) apresentaram-
na (Figura 18). Para essa taxonomia em específico, não foi observado nenhum padrão
correlativo. Todavia, é importante ressaltar aqui que comparar os dados obtidos em microescala
com aqueles análogos em escalas convencionais torna-se o maior critério de relevância para
que se prove a viabilidade do método abordado. Quando o contexto encontra-se em um cenário
ainda juvenil, tal premissa faz-se ainda mais necessária para garantir a confiabilidade do estudo
em questão.
Figura 18. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que realizaram estudos comparativos
entre os resultados obtidos utilizado microbiorreatores e reatores de escalas convencionais.
Para a questão envolvendo a aplicação dos microbiorreatores, 46 documentos (74%)
envolviam aplicações de contexto específico contra 16 documentos (26%) que não o fizeram,
conforme ilustrado na Figura 19.
34%
66%
✓
✗
83
Figura 19. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que apresentaram aplicações práticas
aos microbiorreatores desenvolvidos.
Dentre os documentos que não apresentaram aplicações, todos basearam-se apenas no
desenvolvimento do dispositivo e/ou aparatos auxiliares para seu funcionamento. Nesse caso,
quatro dos 16 documentos não realizaram experimentos de bioprocesso algum, baseando-se em
parâmetros inorgânicos. Entre eles, dois artigos propuseram o desenvolvimento de métodos de
agitação e mistura, um sobre a capacidade de dispersão de oxigênio no dispositivo e um que
apresentou um protocolo de fabricação de microbiorreatores cilíndricos.
Finalmente, ao questionar a presença dos cálculos de parâmetros, 44 documentos (71%)
fizeram-no contra 18 (29%) que não o fizeram (Figura 20).
74%
26%
✓
✗
84
Figura 20. Relação de artigos científicos obtidos a partir da base Scopus® que realizaram e disponibilizaram o
cálculo de parâmetros relevantes para o bioprocesso em questão.
Embora 18 artigos não tenham apresentado os cálculos de parâmetros, todos
controlaram e avaliaram, de certa forma, as variáveis de maior relevância para o bioprocesso
em questão. À exceção de um documento que buscou o desenvolvimento de um dispositivo
capaz de promover a homogeneização de células de forma programada, os demais 17 artigos
envolveram aplicações específicas aos microbiorreatores, nos quais, parâmetros como taxa
específica de crescimento e DO foram calculadas de maneira implícita. Mediante tais
circunstâncias, é importante ressaltar que a expressão detalhada dos cálculos de parâmetros é
uma premissa de alta relevância para que se possa compreender e avaliar a viabilidade dos
princípios adotados nos dispositivos desenvolvidos.
Na análise Micro, foram avaliadas cinco taxonomias referentes à composição ou origem
do dispositivo empregado, biocatalizador aplicado, finalidade do bioprocesso, parâmetros
controlados e capacidade de inserção no mercado como um produto comerciável. Na primeira
taxonomia, referente à composição ou origem dos microbiorreatores, percebeu-se uma alta
variedade de materiais constituintes dos dispositivos, bem como na recorrência de 5
microbiorreatores comercialmente disponíveis (Figura 21).
71%
29%
✓
✗
85
Figura 21. Natureza (material ou modelo comercial) dos microbiorreatores abordados nos artigos científicos
obtidos a partir das buscas na base Scopus®.
A partir da Figura 21, nota-se a alta recorrência do uso de PDMS como material de
fabricação dos microbiorreatores (26 artigos; 33%), seguido por PMMA (19 artigos; 24%). De
fato, assim como descrito por Nge, Rogers e Woolley (2013), durante as últimas décadas, o
PDMS tornou-se o polímero preferido para aplicações na microescala devido ao seu custo,
facilidade de manuseio, capacidade elástica e biocompatibilidade. Adicionalmente, o PMMA
também é um polímero pouco oneroso, biocompatível e de fácil manuseio. Torna-se portanto,
clara a razão pela qual tais polímeros tenham se mostrado tão recorrentes nos trabalhos
analisados.
Ainda, em um segundo patamar, nota-se a alta recorrência de microbiorreatores
comerciais. Dentre eles, encontram-se o Flower-Plates®, ocorrente em seis artigos (8%) e o
BioLector microbioreactor®, ocorrente em cinco artigos (6%) ambos comercializados pela
empresa m2p labs. Localizada na Alemanha, a m2p labs foi fundada em 2005 como uma start-
33%
24%
8%
6%
4%
4%
4%
2%
2%
2%2%
8%
PDMS
PMMA
Flower-Plates® (m2plabs, Germany)
BioLector microbioreactor®(m2plabs, Germany)
Microplacas
Policarbonato
Vidro
ambr®15 cell culture (SartoriusStedim Biotech, UK)
Mármore
μ-24 Bioreactor® (Pall, USA)
TissueFlexs (Zyoxel Ltd, UK)
Outros
86
up na RWTH Aachen University (Aachen, Alemanha), baseando seu foco na fabricação de
microbiorreatores (M2P LABS, 2017). Em 2007, a empresa lançou o BioLector
microbioreactor® e em 2008, o Flower-Plates®, produtos os quais passaram por otimizações ao
longo dos anos e atingindo uma grande parcela dos laboratórios de pesquisa envolvendo
microbiorreatores.
Ainda na Figura 21, a categoria ‘Outros’ inclui as variáveis que ocorreram apenas uma
vez. São elas: polímero de ciclo olefina; poliestireno; politereftalato de etileno;
politetrafluoroetileno; poliéster; e o dispositivo comercial CellMax 430-010® (Spectrum,
EUA). De tal forma, a diversa ocorrência de materiais e dispositivos comerciais abordados
evidencia a alta versatilidade da tecnologia dos microbiorreatores, abrindo margem a uma
surpreendente gama de possibilidades a serem exploradas.
Com o intuito de se estudar as tendências quanto aos organismos ou moléculas-alvo
abordados nos artigos, os documentos foram classificados de acordo com seu biocatalisador,
conforme apresentado na Figura 22.
Figura 22. Biocatalisadores abordados nos bioprocessos descritos nos artigos obtidos a partir das buscas na base
Scopus®.
43%
22%
16%
6%
1%1%
11%
Célula de Mamífero
Bactéria
Levedura
Enzima
Alga
Drosophila
Sem Identificação
87
Dentre os resultados da Figura 22, nota-se uma alta parcela de documentos envolvendo
células de mamíferos, com 27 ocorrências (43%). Nesse grupo, uma porção majoritária estuda
a diferenciação celular de células tronco pluripotentes. Assim como descrito por Oliveira et al.
(2016), a predominância dos estudos envolvendo dispositivos microfluídicos, e neles os
microbiorreatores, é dos estudos biomédicos, envolvendo estudos oncogênicos e
carcinogênicos, diferenciação e desdiferenciação celular, screening de drogas e
desenvolvimento de diagnósticos de pronto atendimento.
Nos grupos Bactéria (14 artigos; 22%) e Levedura (10 artigos; 16%), grande parte dos
documentos utilizam a capacidade de crescimento de micro-organismos modelo, como E. coli
e S. cerevisiae, para avaliar o desempenho dos dispositivos. Adicionalmente, uma parcela
menor estuda a capacidade de produção de proteínas heterólogas. Já no grupo Sem Identificação
(seis artigos; 11%), todos os documentos tratavam-se de estudos sobre parâmetros intrínsecos
ao microbiorreator em questão, como grau de mistura e aeração. De forma correlativa, nenhum
dos seis artigos apresentou aplicações específicas, sendo todos classificados como negativos na
taxonomia de Aplicações de Bioprocessos ilustrada pela Figura 19.
Para a análise quanto à finalidade do bioprocesso envolvido (Figura 23), 40 estudavam
o cultivo celular, 36 analisavam o metabolismo e fisiologia dos organismos e 5 realizavam
ensaios de screening celular.
Figura 23. Finalidades dos bioprocessos envolvidos nos artigos obtidos a partir das buscas na base Scopus®.
40
36
5 6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cultivo Análise Metabólica ouFisiológica
Screening Não Aplica-se
No
de
Do
cum
ento
s
Finalidade do Bioprocesso
88
Conforme demonstrado na Figura 23, é natural que os trabalhos enfoquem o cultivo
celular, uma vez que o alicerce dos bioprocessos é o organismo vivo, como era lícito de se
esperar, uma vez que sem o mesmo, não há catálise enzimática, e, portanto, não há bioprocesso
desenvolvido (SCHMIDELL et al., 2001). Por esse mesmo motivo, os seis artigos do grupo
‘Não Aplica-se’ são os mesmos artigos que não se utilizaram de qualquer biocatalisador em
seus estudos, conforme mostrado na Figura 22.
Para a análise quanto à detecção e controle de parâmetros (Figura 24), observou-se a
prevalência de trabalhos que envolvem a variável temperatura, com 43 artigos; seguido pela
análise de densidade celular por DO, com 24 artigos; e agitação, com 21 artigos.
Figura 24. Parâmetros detectados e controlados nos artigos obtidos a partir das buscas na base Scopus®.
Assim como demonstrado na Figura 24, a análise de temperatura destaca-se devido a
facilidade de se detectar tal parâmetro na microescala. Conforme descrito por Schäpper et al.
(2009), o uso de RTDs e termopares para avaliação da temperatura no interior dos
microbiorreatores é simples e se adequa perfeitamente às necessidades dos pequenos sistemas.
43
2421
17 1614
9
5 52 2 1 1 1 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
No
de
Do
cum
ento
s
Parâmetro
89
A análise da DO também é de relativa facilidade, uma vez que é necessária apenas a emissão
de luz em uma ponta do dispositivo e a detecção da luz incidente no ponto oposto. Essa análise
pode ser facilmente realizada a partir da integração de pequenas fibras e sensores óticos no
corpo do microbiorreator. Para a agitação, existem vários métodos relacionados ao parâmetro,
como a promoção de movimento caótico por microbombas e uso de partículas magnéticas
dispersas no meio fermentativo ou agitadores magnéticos.
Ainda na Figura 24, diferente daqueles mais recorrentes, os demais parâmetros (à
exceção do pH) são relacionados a características intrínsecas ao bioprocesso em questão, como
por exemplo, o fornecimento e dispersão de suprimento de oxigênio em bioprocessos aerados
e a velocidade da alimentação em processos contínuos ou bateladas alimentadas. Portanto, tais
recorrências apresentam-se menor, quando comparadas com os parâmetros de temperatura, DO
e agitação. O controle do pH, apesar de ser uma característica de elevada importância para os
bioprocessos, de uma maneira geral, apresentam uma baixa recorrência devido à sua dificuldade
de detecção e controle na microescala. Assim como descrito por Schäpper et al. (2009), os
métodos convencionais para sua detecção dependem de sondas volumosas, e o seu controle
depende da adição de químicos, interferindo diretamente no volume de trabalho, atrapalhando
por consequência, a sensibilidade e confiabilidade dos dados gerados.
Finalmente, a análise subjetiva sobre a capacidade de inserção do microbiorreator em
cada trabalho foi realizada com base nas taxonomias anteriores, e é ilustrada na Figura 25. Para
tanto, o critério utilizado levou em consideração a quantidade e qualidade de informações
providas nos trabalhos que fossem pertinente ao que tange a transição da ciência realizada para
um produto comercialmente disponível no mercado. Portanto, os documentos foram
classificados quanto ao tempo de implementação da ciência desenvolvida em seu contexto no
mercado comercial: curto prazo, para aqueles trabalhos que possuem uma forte capacidade de
colimar em uma tecnologia comerciável; médio prazo, para os trabalhos que apresentam de
alguma forma alguma limitação para que se tornasse um produto; e longo prazo, para aqueles
que ainda requerem aprimoramentos e trabalhos futuros para que se tornem um potencial de
mercado.
90
Figura 25. Análise da capacidade temporal de inserção dos microbiorretores no mercado, a partir dos artigos
obtidos a partir das buscas na base Scopus®.
Como exposto na Figura 25, uma parcela significativa dos trabalhos apresenta
microbiorreatores bem elucidados, com características bem definidos a partir de ilustrações e
descrições detalhadas, conforme apontado na Figura 17; princípios bem estabelecidos a partir
das aplicações (Figura 19); cálculos estabelecidos e descritos (Figura 20); e quantidade de
parâmetros relevantes ao bioprocesso que foram detectados e/ou controlados (Figura 24). Por
exemplo, o trabalho de Abeille et al. (2014), intitulado “Continuous microcarrier-based cell
culture in a benchtop microfluidic bioreactor”, versa sobre o desenvolvimento de um
microbiorreator para o cultivo contínuo de células de Drosophila sp. Além de construir um
dispositivo para uma aplicação específica, são apresentados todos os detalhamentos do
dispositivo, os cálculos dos parâmetros relevantes e a comparação dos resultados com dados
obtidos em escalas convencionais. Nesse sentido, o microbiorreator desenvolvido foi
extensivamente estudado e seus resultados mostram-se promissores, sendo de fácil
implementação no mercado como uma ferramenta para ensaios similares.
De forma contrária, questiona-se a capacidade de inserção no mercado os trabalhos com
baixo teor de informações ou que apontaram falhas e necessidades de otimização. Sobretudo,
questiona-se aqueles que além de não realizar análises comparativas entre escalas (Figura 18)
não agregaram detalhes sobre os dispositivos em questão.
48%
39%
13%
Curto prazo
Médio prazo
Longo prazo
91
5.1.3 Base de Dados de Patentes – Orbit Intelligence®
Com o objetivo de estudar o grau de inovação dos microbiorreatores e sua transição do
ambiente de pesquisas para o comercial, foram realizadas análises quantitativas e qualitativas
dos documentos extraídos da base de dados Orbit Intelligence®. Para tanto, foram avaliados
220 documentos de patentes relacionados ao tema abordado.
Sob a luz de tais objetivos, as primeiras análises realizadas contemplaram a evolução da
inovação a partir dos 220 documentos, os quais foram depositados entre os anos 1997 e 2017,
de acordo com a base de patentes Orbit Intelligence® (Figura 26).
Figura 26. Evolução do cenário patentário referente aos microbiorreatores e sua tecnologia, a partir da base de
dados Orbit Intelligence®.
Conforme ilustrado na Figura 26, destaca-se o crescimento no número total de depósitos
de patentes relacionados aos microbiorreatores e sua tecnologia a partir de 2002, permanecendo
estável ao longo dos anos. De maneira similar ao resultado ilustrado pela Figura 13, tal
panorama identifica-se com os trabalhos descritos por Whitesides (2006) e Oliveira et al. (2016)
que versam sobre a emergência da aplicação da microfluídica em bioprocessos nos anos 2000.
Entretanto, a análise temporal de patentes denota um crescimento no número de documentos
levemente precoce ao cenário da Figura 13. Tal perspectiva pode ser explicada conforme os
46 7
11 10
2528
31
39 38
51
40
32 33
38
32
26 2629
2522
0
10
20
30
40
50
60
199719981999200020012002200320042005200620072008200920102011201220132014201520162017
No
de
Do
cum
ento
s
Ano
92
trabalhos escritos por Oliveira (2014) e Mueller (1994), os quais se atentam às vantagens da
adoção de patentes como indicadores de tendências e novidades tecnológicas, sendo portanto,
publicadas de forma precedente aos artigos científicos.
Para a análise da provável origem da tecnologia utiliza-se o país de origem do pedido
de prioridade, ou seja, a origem do primeiro depósito de patente. Para as buscas sobre
microbiorreatores, foram analisadas as origens dos pedidos de prioridade dos 220 documentos
selecionados, conforme ilustrado pela Figura 27.
Figura 27. Principais territórios geográficos depositantes de patentes referente aos microbiorreatores e sua
tecnologia, a partir da base de patentes Orbit Intelligence®.
A partir da Figura 27, torna-se clara a concentração da tecnologia dos microbiorreatores
pelo Japão e os EUA. De fato, a tecnologia dos microbiorreatores tem como berço os EUA,
sendo fruto de anos de pesquisas envolvendo a miniaturização de dispositivos (ELVEFLOW,
2017). O Japão, por sua vez, equipara-se à quantidade de documentos dado à sua cultura
claramente ligada à alta produção de patentes conforme a ferramenta estatística da Organização
Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI), ilustrado na Figura 28.
90
80
116 5 5 5 4 3 3 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
No
de
Do
cum
ento
s
Território
93
Figura 28.Quantidade de documentos de patentes oriundos dos principais detentores ao longo dos anos 1980 e
2015. Fonte: WIPO (2017).
De forma contrária ao cenário internacional, não foi encontrada nenhuma patente de
origem brasileira. Tal resultado pode ser justificado de acordo com o trabalho de Müller e
Carminatti (2003), o qual afirma a cultura brasileira ser fortemente ligada à produção de artigos
científicos em detrimento de patentes, como resultado decorrente da ignorância da comunidade
científica em relação à propriedade industrial.
No que tange a análise do número de patentes depositadas por território por ano, a Figura
29 denota a correlação entre os principais países depositantes de patentes sobre a tecnologia
dos microbiorreatores e o ano em que foi feito o depósito.
94
Figura 29. Correlação entre os principais países depositantes de patentes e o ano do depósito, conforme os resultados obtidos a partir da base Orbit Intelligence®.
95
Conforme mostrado na Figura 29, percebe-se um padrão no número de patentes entre
os principais países depositantes. Rapidamente se inserindo no cenário patentário referente aos
microbiorreatores, o Japão manteve um índice superior de depósitos ao longo dos primeiros
anos da análise. Entretanto, a partir de 2009, os EUA passaram a prevalecer na quantidade de
inovação protegida por documentos de patentes.
Ainda sobre a origem dos documentos de patentes, a Figura 30 apresenta as principais
instituições detentoras de patentes referentes aos microbiorreatores.
Figura 30. Principais instituições depositantes dos documentos de patente sobre os microbiorreatores e sua
tecnologia, obtidos a partir da base Orbit Intelligence®.
Conforme a Figura 30, destacam-se como principais instituições inovadoras no campo
dos microbiorreatores as empresas Konica Minolta Medical & Graphic, Corning, Life
Technologies, BioProcessors e Olympus Optical. Percebe-se ainda, que a detenção dos
documentos de patentes é bastante dispersa, uma vez que somando o valor de patentes detidas
pelas principais instituições, obtém-se apenas 19% dos documentos da presente análise.
Adicionalmente, foi apontada a frequência anual de publicações de tais empresas,
conforme demonstrado na Figura 31.
15
8 8
6
5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
KONICA MINOLTAMEDICAL & GRAPHIC
CORNING LIFE TECHNOLOGIES BIOPROCESSORS OLYMPUS OPTICAL
No
de
Do
cum
ento
s
Aplicante
96
Figura 31. Frequência anual do depósito de patentes pelas principais empresas depositantes a partir das buscas relizadas na base Orbit Intelligence®.
97
Assim como indicado na Figura 31, apesar de deter o maior número de depósitos, a
empresa japonesa Konica Minolta Medical & Graphic inseriu-se no referente contexto
patentário apenas no ano de 2004. Localizada em Osaka, a Konica Minolta, é uma multinacional
fundada em 2003 a partir da fusão das empresas Konica e Minolta. Sua especialidade
compreende na fabricação de equipamentos das mais variadas naturezas, como imagens
médicas, câmeras fotográficas, instrumentos ópticos e para diagnósticos (KONICA
MINOLTA, 2017). Na análise de patentes, os documentos detidos por tal empresa enfocam
dispositivos voltados para testes e análises genômicas, como microbiorreatores para PCR e
sequenciamento gênico.
Com 8 documentos, a Corning Incorporated é uma empresa estadunidense, localizada
na cidade de Corning (New York). Fundada em 1851 sob o nome Corning Glass Works, a
instituição foi responsável por instituir um dos primeiros laboratórios para pesquisas industriais.
Atualmente, a Corning é especialista no desenvolvimento de materiais e produtos voltados para
a ciência, como por exemplo, vidros temperados, fibras óticas e cerâmicas (CORNING
INCORPORATED, 2017). De tal forma, os documentos detidos pela empresa são de natureza
variada, transitando entre biorreatores microfluídicos, microplacas e sensores ópticos.
Também detendo 8 documentos, a Life Technologies Corporation foi uma empresa
estadunidense fundada em 2008 na Carlsbad (California) especializada em biotecnologia
industrial. Em 2014, entretanto, a empresa foi comprada pela ThermoFisher Scientific, uma
multinacional estadunidense, especializada no desenvolvimento de materiais laboratoriais
(THERMOFISHER SCIENTIFIC, 2017). Dentre os documentos detidos pela Life
Technologies, encontram-se apenas patentes referentes a microplacas, além de filtros e suportes
para as mesmas.
A BioProcessors Corporation foi uma corporação estadunidense fundada em 2000 na
cidade de Woburn (Massachusetts). Sua especialidade baseava-se em microbioreatores
especializados em fermentações (microfermentadores). De tal forma, as 6 patentes detidas pela
corporação são referentes a microfermentadores e aparatos para o controle de parâmetros para
seus dispositivos. Em 2009, a empresa foi comprada pela Seashore Bioscience Incorporated,
outra empresa estadunidense, especializada na manufatura de dispositivos para a otimização da
produção de biofármacos (BLOOMBERG, 2017).
Finalmente, com 5 patentes em sua posse, a Olympus Optical é uma empresa subsidiária
da corporação japonesa Olympus. Situada em Shinjuku (Tokyo), a Olympus Optical é
98
especialista na fabricação de lentes e equipamentos ópticos, como microscópios e câmeras
digitais (OLYMPUS, 2017). Interessantemente, os documentos da Olympus Optical estão entre
os mais velhos dos documentos analisados, datados do ano 1988, e reivindicam aparatos
responsáveis pela alimentação de micropoços em microplacas, e manipulação de reagentes de
estado sólido, também em microplacas.
A partir da ferramenta de análises da base de patentes Orbit Intelligence®, foram
avaliadas as parcerias entre todas as instituições detentoras das patentes estudadas no presente
trabalho. A Figura 32 ilustra tal interação através das co-autorias, construída a partir da
ferramenta de análise de correlação cruzada (Cross-Correlation), entre 22 instituições titulares
de patentes.
99
Figura 32. Mapa de correlação cruzada entre as instituições titulares de patentes sobre a tecnologia dos
microbiorreatores, obtido a partir de pesquisas na base Orbit Intelligence®. O número de co-autorias é
identificado a nas ligações entre as instituições, bem como na espessura da ligação, a qual é proporcional ao
número de co-autorias.
Conforme a Figura 32, dentre as respectivas 22 instituições detentoras de patentes, é
possível denotar apenas uma correlação de maior intensidade (3 trabalhos em co-autoria), sendo
tal referente aos trabalhos da Waseda University junto à Shimadzu (Cluster 1 da Figura 32).
A Waseda University é autora de 4 patentes, dos quais, 3 estão em co-autoria com a
Shimadzu, que detém apenas as 3 mesmas patentes, as quais referem-se a biorreatores
microfluídicos específicos para a análise de movimentação celular em diferentes condições
ambientais; otimização de métodos de mistura para a homogeneidade de biorreações; e
seletividade de biocatalisadores específicos.
100
Dentre as correlações de menor intensidade, destacam-se os clusters 2, 3 e 4 da Figura
32. No cluster 2, destaca-se a correlação entre a CEA - Commissariat à l’énergie atomique et
aux énergies alternatives e a Serono Genetics Institute. Em tal cluster, os dois artigos são
referentes ao desenvolvimento de um biorreator microfluídico especializado em bioprocessos
contínuos. Já no cluster 3, apresenta a coautoria de dois trabalhos entre empresas subsidiárias
da Panasonic (Panasonic Healthcare Holdings), os quais se referem ao desenvolvimento de
aparatos especializados na incubação de microplacas. Finalmente, o cluster 4 denota a relação
de coautoria entre a Kyowa Hakko Kogyo e Panasonic, trabalho referente ao desenvolvimento
de um sistema especializado no transporte contínuo de amostras líquidas de uma câmara a outra
(na microescala).
Uma outra análise de importância para o estudo de patentes é a identificação das
principais Classificações Internacionais de Patentes (CIP) relacionadas aos documentos
estudados (Figura 33).
Figura 33. Principais Classificações Internacionais de Patentes (CIP) encontradas nos documentos sobre a
tecnologia dos microbiorreatores extraídos da base Orbit Intelligence®.
Conforme ilustrado na Figura 33, as principais CIPs encontradas foram a C12M,
presente em 77 documentos, G01N em 53 documentos, e B01L em 24 documentos. A descrição
de cada uma dessas classificações é detalhada no Quadro 7.
77
53
24
12 127
3 2 2 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C12M G01N B01L C12N C12Q B01J B01F B01D B03C C12P
No
de
Do
cum
ento
s
CIP
101
Quadro 7. Principais Classificações Internacionais de Patentes (CIP) encontradas nos documentos sobre a
tecnologia dos microbiorreatores a parti da base Orbit Intelligence®.
CIP Descrição
C12M Aparelhos para enzimologia ou microbiologia
G01N Investigação ou análise dos materiais pela determinação de suas propriedades químicas ou
físicas
B01L Aparelhos de laboratório de química ou de física para uso geral
(Fonte: INPI, 2017)
A classificação C12M refere-se a aparelhos especializados em técnicas de
microbiologia ou enzimologia, e por tal motivo, as subclassificações C12M 1/00 e C12M 3/00
foram empregadas na estratégia de busca deste trabalho, tendo em vista o desejável foco em
reatores miniaturizados para biorreações. De tal forma, torna-se natural e esperado que tal CIP
seja a mais encontrada nos documentos analisados.
Já a classificação G01N denota o estudo de materiais e suas propriedades químicas ou
físicas. De maneira inesperada, a alta aparência dessa classificação muito se correlaciona aos
microbiorreatores dada a grande versatilidade de sua tecnologia capaz de adotar uma gama de
materiais diferentes, conforme discutido no Capítulo 2 - Revisão Bibliográfica e sumarizado no
Quadro 1.
Finalmente, a classificação B01L, referente a aparelhos para laboratórios de química ou
de física, aparece em 24 documentos. Tal resultado justifica-se pela capacidade das suas
respectivas invenções serem também capazes de realizar reações puramente químicas, sendo
naturalmente recorrente em uma menor quantidade de documentos, visto que o foco das buscas
foi em dispositivos voltados para reações de natureza biológica e/ou bioquímica.
Em sequência, foram analisados os principais mercados dos 220 depósitos de patente
resultantes das buscas deste trabalho, conforme ilustrado pela Figura 34.
102
Figura 34. Principais territórios geográficos onde foram depositadas as patentes referentes aos microbiorreatores
e sua tecnologia a partir da base Orbit Intelligence®.
De tal forma, os principais mercados em que a tecnologia dos microbiorreatores foi
protegida denotam-se no Japão, com 133 depósitos (23%); EUA, com 118 depósitos (21%);
Escritório Internacional de Patentes (WO)1, com 79 depósitos (14%); União Europeia, com 72
depósitos (12%); e China, com 39 depósitos (7%) (Figura 34). Estender a proteção da
propriedade intelectual em diferentes países compreende na garantia da exclusividade dos
direitos de comercialização da patente nos referentes territórios (OLIVEIRA, 2014). Sendo
assim, é esperado que os países em que foram depositados os maiores números de patentes
sejam aqueles detentores da tecnologia, que no caso, consistem no Japão e EUA, conforme o
resultado ilustrado na Figura 27.
1 As patentes WO são aquelas depositadas no Patent Cooperation Treaty (PCT), tratado internacional responsável
por oficializar o sistema de depósito de patentes. Tal sistema permite a obteção de patentes em diversos territórios
a partir de um único pedido. Todavia, as patentes WO não são de abrangência mundial, comportam-se apenas
como uma espécie de intermediário que facilita o processo de patenteamento em países que são contratantes do
PCT (CNPEM, 2017).
23%
21%
14%
12%
7%
4%
4%
3%
2%2%
8%
Japão
EUA
WO
Escritório de Patentes Europeu
China
Austrália
Canada
Alemanha
Áustria
Coréia do Sul
Outros
103
Ainda referente à Figura 34, os resultados das análises de patentes apontaram um único
documento depositado no Brasil. Com o título “Sample processing device positioning
apparatus and methods” (US20060029524) (CARTER; KOKAISEL; WOOD, 2006), o
documento tem como origem os EUA, sendo patenteado no Brasil através do sistema Patent
Cooperation Treaty (PCT). A patente refere-se a um sistema de alinhamento do campo focal
de sensores para o processamento de amostras em poços de microplacas. De certa forma, pode-
se justificar o baixo interesse estrangeiro no cenário patentário brasileiro pelo fato do Brasil ser
um país de baixa competitividade no campo tecnológico dos microbiorreatores, sendo ainda,
um grande importador de produtos de alto valor agregado (OLIVEIRA, 2014).
É com base nessa baixa proteção à tecnologia dos sistemas miniaturizados para
biorreações que se destaca a grande oportunidade a ser explorada pelas universidades e centros
de pesquisas nacionais, envolvidos no estudo de bioprocessos.
Finalmente, no intuito de estabelecer as tendências do cenário patentário, os 220
documentos de patentes foram avaliados de forma objetiva quanto à abordagem dos sistemas
desenvolvidos, conforme ilustrado pelas Figuras 35.
Figura 35. Natureza das abordagens referentes aos microbiorreatores referentes aos documentos obtidos a partir
da base Orbit Intelligence®.
Ao analisar da Figura 35 é possível perceber uma forte tendência no desenvolvimento
de biorreatores microfluídicos (105 documentos; 48%) e microplacas (100 documentos; 45%).
48%
45%
6% 1%
Biorreator Microfluídico
Microplaca
Acessórios de Integração
Droplet
104
Tais abordagens distinguem-se claramente pela sua natureza arquitetônica. Os biorreatores
microfluídicos são aqueles dispositivos que usufruem de microcanais como vasos reacionais,
sendo, portanto, flexíveis e versáteis quanto à sua forma e capacidade de integração. Do outro
lado, as microplacas configuram-se em microbiorreatores menos versáteis, presos à
conformação de micropoços paralelos, e, portanto, fortemente ligados à paralelização de
experimentos.
Em sequência à análise de tendências, foram avaliados os alvos reacionais mais
recorrentes entre os documentos de patentes obtidos (Figura 36).
Figura 36. Alvos das reações químicas e bioquímicas para os quais foram destinados os dispositivos das patentes
obtidas a partir das buscas na base Orbit Intelligence®.
Conforme a Figura 36 denota, a grande maioria das inovações é voltada para biorreações
realizadas por células. Em sequência, encontram-se os dispositivos especializados em reações
para ácidos nucleicos, biomoléculas, químicos e tecidos. Adicionalmente, 40 documentos não
especificaram qual o alvo reacional de suas inovações. Nesse caso, as patentes enfocam a
descrição do dispositivo em questão, deixando de modo genérico qual a finalidade do processo
envolvido. De fato, é lícito esperar que a grande maioria das patentes envolvam células como
catalisador reacional, uma vez que o foco das buscas desses documentos foram os
120
38
2518
2
40
0
20
40
60
80
100
120
140
Células Ácidos Nucléicos Biomoléculas Químicos Tecidos Não Aplica-se
No
de
Do
cum
ento
s
Alvo
105
microbiorreatores. Para as patentes envolvendo ácidos nucleicos, sua grande maioria é referente
a dispositivos capazes de realizar sequenciamento gênico e/ou PCR.
5.2 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nos últimos anos, os microbiorreatores têm se tornado cada vez mais parte dos
laboratórios de pesquisa, suscitando trabalhos de alta relevância para o desenvolvimento
tecnologias inovadoras e descobertas biotecnológicas. Sendo assim, diversas instituições de
pesquisa, bem como as grandes empresas de tecnologia e ciência, têm contribuído de forma
substancial para o desenvolvimento de uma tecnologia promissora e de caráter altamente
inovador.
Entretanto, o Brasil mostrou-se incipiente na adoção e desenvolvimento dos
microbiorreatores. A quantidade de artigos científicos brasileiros relativamente baixa, aliada à
existência de apenas uma patente encontrada em território nacional, denunciam uma valiosa
área a ser fortemente explorada, bem como na possibilidade de patenteamento de inúmeras
invenções ainda não protegidas em território nacional.
Além disso, embora os microbiorreatores estejam sendo estudados de forma consistente
no âmbito internacional, há muito a se fazer para que essa tecnologia se torne consolidada.
Sendo assim, destaca-se a oportunidade a ser explorada como forma de inserção em tal contexto
científico.
106
CAPÍTULO 6 ESTUDO DE CASO
Com o intuito de melhor compreender a tecnologia dos microbiorreatores, bem como
aplicar o conhecimento teórico assimilado ao longo dos estudos realizados no presente trabalho,
construiu-se dois protótipos de microbiorreatores, os quais foram posteriormente aplicados a
ensaios preliminares para avaliação de sua biocompatibilidade. De tal forma, o presente capítulo
descreve a idealização, dimensionamento e aplicação de dois fotomicrobiorreatores para o
cultivo de Spirulina maxima.
6.1 INTRODUÇÃO
Ao longo da realização dos estudos prospectivos referentes aos microbiorreatores e sua
tecnologia, sentiu-se a necessidade de aplicar o conhecimento adquirido a partir da fabricação
de novos protótipos. Para tanto, foram identificados laboratórios e instituições nacionais que
pudessem oferecer instalações e aplicações práticas que se encaixassem com o contexto dos
microbiorreatores.
Inicialmente, tomou-se ciência do Laboratório de Nano e Microfluídica e de
Microssistemas (LabMEMS), vinculado ao Programa de Engenharia Mecânica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Sob o apoio da professora Dra. Carolina Palma Naveira
Cotta, diversos dispositivos microfluídicos foram pessoalmente apresentados, bem como no
laboratório e suas instalações. A partir desse contato, réplicas de dispositivos já descritos na
literatura foram reconstruídas, com o intuito de estudar e entender as etapas do processo de
microfabricação e suas peculiaridades. Entretanto, a necessidade de se manipular diferentes
materiais como vidro, inviabilizaram o prosseguimento dos estudos no LabMEMS.
Em uma segunda instância, o tema dos microbiorreatores foi apresentado à professora
Dra. Anita Ferreira do Valle (Departamento de Bioquímica do Instituto de Química – UFRJ),
quem idealizou a aplicação dos microdispositivos ao cultivo de microalgas: um
fotomicrobiorreator. De tal forma, uma breve análise da literatura foi realizada acerca do cultivo
de microalgas em microssistemas, evidenciando por consequência o trabalho de Perin et al.
(2016), o qual descreve um fotomicrobiorreator especializado no cultivo da alga
Nannochloropsis gaditana a partir de micropoços interligados por canais microfluídicos.
Entretanto, ainda questionava-se as condições e possibilidades de se desenvolver um
dispositivo mediante as instalações e equipamentos disponíveis.
107
Para superar as limitações encontradas, foi realizada uma reunião às 10 h do dia 23 de
Agosto de 2017, no Instituto de Química da UFRJ, na qual estiveram comparecidos o autor do
presente trabalho, Raphael C. Prado, a professora Dra. Anita F. do Valle, o professor Dr.
Ricardo C. Michel (Departamento de Química Analítica do Instituto de Química – UFRJ), o
técnico em Mecânica Cidnei V. de Souza (Oficina Mecânica do Instituto de Química – UFRJ),
e o graduando em Engenharia Eletrônica Renan Vieira. A partir de então, foi elucidada a
estrutura inicial de um fotomicrobiorreator baseado em micropoços, contendo três câmaras de
cultivo de capacidade volumétrica igual a 500 µL para cada câmara. Os materiais de
constituição do dispositivo a serem testados foram estabelecidos: o PMMA e o policarbonato;
e o bioprocesso a ser aplicado foi definido como a produção de células de S. maxima.
O gênero Spirulina denota cianobactérias, ou seja, seres procariotos, unicelulares e
fotoautotróficos. Seu metabolismo e capacidade de crescimento já são elucidadas pela literatura
científica, tornando seu cultivo relativamente de fácil execução. Consequentemente, sua
produção tem alto potencial de mercado como suplemento alimentar (BARROCAL et al.,
2010). De tal forma, a cultura de S. maxima torna-se uma oportunidade interessante para a
aplicação e execução da tecnologia dos microbiorreatores.
Sob a intenção de investigar a possibilidade de se construir os dispositivos de PMMA e
de policarbonato e a viabilidade de aplica-los ao cultivo de cianobactérias, o objetivo desse
estudo de caso foi avaliar a viabilidade do crescimento celular de S. maxima para utilização dos
fotomicrobiorreatores como ferramentas úteis para a execução de estudos experimentais de
bioprocessos.
Nesse contexto, os fotomicrobiorreatores foram fabricados pela Oficina Mecânica do
Instituto de Química, e os testes iniciais do cultivo de S. maxima em microescala foram
realizados no Laboratório de Estudos Aplicados em Fotossíntese (CMLEAF) localizado no
Instituto de Química da UFRJ.
6.2 METODOLOGIA
6.2.1 Design do Microbiorreator e Suporte para Cultivo
Os fotomicrobiorreatores a serem confeccionados foram fabricados pela Oficina
Mecânica do Instituto de Química, sob liderança do técnico Mecânico Cidnei de Souza. O
desenho técnico do dispositivo foi concebido utilizando o software SolidWorks® (Dassault
108
Systèmes S.A., França), com base no dispositivo desenvolvido por Perin et al. (2016). Cada
dipositivo contém três camaras de cultivo em paralelo, com volume de capacidade total de 500
µL em cada câmara. Como material principal de constituição do fotomicrobiorreator, foram
adotados dois materiais distintos, resultando portanto, em dois fotomicrobiorreatores diferentes.
Para ambos os casos, a superfície inferior dos dispositivos foi construída a partir de vidro,
seguida por uma manta de silicone para integrar o vidro ao PMMA ou policarbonato sem que
ocorressem vazamentos. Adicionalmente, as três camadas a formarem o fotomicrobiorreator
(vidro, silicone e PMMA ou policarbonato) foram integradas a partir de dois suportes de acrílico
flaqueando as extremidades do dispositivo sob o auxílio de parafusos. Como superfície
superior, foi adotada uma membrana de parafina plástica (Parafilm M®, Bemis Company,
EUA). Para melhor compreensão da estrutura gerada, o dispositivo é ilustrado na Figura 37.
Figura 37. Ilustração CAD do microbiorreator projetado para o cultivo de S. maxima, construído a partir do
software SolidWorks®.
Para estabelecer o cultivo apropriado de S. maxima, foi desenvolvido, tamém pela
Oficina Mecânica do Instituto de Química, sob liderança do técnico Mecânico Cidnei de Souza,
um suporte para ambos os fotomicrobiorreatores de PMMA e policarbonato, no qual as câmaras
de cultivo são dispostas ligeiramente acima de uma fonte de luz, dada necessidade de incidência
luminosa para a realização da fotossíntese. Além disso, o sistema compõe ainda um suporte
superior para o posicionamento de smartphones ou microcâmeras para o registro fotográfico do
sistema em reação. O suporte é ilustrado na Figura 38.
109
Figura 38. Ilustração CAD do suporte para microbiorreator construído a partir do software SolidWorks®: (A)
ilustração do display completo, incluindo a integração com um spartphone para registro fotográfico e uma
lâmpada como fonte luminosa; (B) ilustração do suporte isolado; (C) visão superior do suporte.
6.2.2 Análise de Biocompatibilidade à S. maxima
Para o cultivo realizado, foram utilizadas células de S. maxima (código LEAF046)
oriundas do CMLEAF do Instituto de Química da UFRJ, originalmente obtidas a partir da
Universidade Federal de São Carlos.
As células de S. maxima utilizadas no presente trabalho foram previamente cultivadas
em um tanque de cultivo de 50 L, em meio estéril, conforme descrito por Aiba, Ogawa e
Schlösser (2005).
O meio de cultivo constiu-se de NaHCO3 (13,6 g L-1), Na2CO3 (4,03 g L-1), K2HPO4
(0,5 g L-1), NaNO3 (2,5 g L-1), K2SO4 (1,0 g L-1), NaCl (1,0 g L-1), MgSO4 (0,2 g L-1), CaCl2
(0,04 g L-1), FeSO4 (0,01 g L-1), Na2EDTA (0,08 g L-1), solução de metais (1 mL) e solução de
vitaminas (1 mL) em água destilada. A solução de metais constotui-se de Na2EDTA (0,8 g L-
1), FeSO4 (0,7 g L-1), ZnSO4 (1,0 g L-1) (1 mL), MnSO4 (2,0 g L-1) (1 mL), H3BO3 (10,0 g L-1)
(1 mL), Co(NO3)2 (1,0 g L-1) (1 mL), Na2MoO4 (1,0 g L-1) (1 mL) e CuSO4 (0,005 g L-1) (1
mL) em água destilada. A composição da solução de vitaminas compreende em
cianocobalamina ( 0,005 g L-1) dissolvida em água destilada.
110
Nos fotomicrobiorreatores, as células foram cultivadas no mesmo meio de cultivo
supracitado, com um volume total de 400 µL, por três dias a 30oC, sob a incidência de fótons
de 35 µmol m-2 s-1 emitidos por uma fonte de luz fluorescente (lâmpada fluorescente de luz
branca 20W) posicionada a aproximadamente 5 cm de distância das câmaras de cultivo, por um
fotoperíodo ativo de 12 horas.
A biocompatibilidade das células foi verificada por microscopia de luz e a partir da
observação visual da coloração esverdeada da cultura, a qual indica a presença de clorofila no
sistema em cultivo e, portanto, o metabolismo fotossintético ativo dos micro-organismos.
Adicionalmente, o volume útil em cada câmara de cultivo foi medido, a partir de
micropipetadores, ao final de cada período de cultivo para verificação da taxa de evaporação.
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com o objetivo de aplicar os conhecimentos adquiridos ao longo da realização do
presente trabalho, foram construídos dois microbiorreatores de diferentes composições, bem
como em um suporte para cultivo, voltados para a produção de células de S. maxima (Figura
39). A configuração física dos dispositivos foi baseada no trabalho de Perin et al. (2016), o qual
descreve o desenvolvimento de um fotomicrobiorreator especializado no cultivo de
Nannochloropsis gaditana.
111
Figura 39. Dispositivos e aparatos desenvolvidos: (A) microbiorreator feito a partir de policarbonato ou PMMA;
(B) suporte para o cultivo de células de S. maxima no microbiorreator; (C) display do cultivo de S. maxima a
partir dos microbiorreatores desenvolvidos.
112
O gênero Spirulina denota cianobactérias muito populares no âmbito de cultivo de
microalgas. Devido a sua alta capacidade fotoautotrófica, as cepas de Spirulina normalmente
apresentam altos índices de produtividade, sendo ainda de fácil cultivo. Sendo assim, encontra-
se em tal gênero a oportunidade de se estudar o desenvolvimento prático de microbiorreatores.
Foram adotados como principal constituinte do corpo dos microbiorreatores, PMMA e
policarbonato. A escolha de tais materiais justifica-se pela sua facilidade de manipulação e
baixa onerosidade. Consequentemente, a primeira análise relativa aos dispositivos
compreendeu-se na observação da compatibilidade e capacidade das células de S. maxima
sobreviverem no ambiente interno dos dispositivos. De tal forma, verificou-se a partir da Figura
40 um período de aproximadamente um dia de cultivo das a cultura de células de S. máxima.
Figura 40. Cultura de S. maxima em microbiorreatores de policarbonato (à esqueda) e PMMA (à direita) com um
dia de cultivo. As câmaras de cultivo 1, 2 e 3 são indicadas na figura por C1, C2 e C3, respectivamente.
113
Percebe-se, a partir da Figura 40, a coloração verde da cultura celular, característica
intrínseca ao metabolismo fotossintético ativo de S. maxima. Entretanto, percebeu-se uma
queda no volume líquido disposto nas três câmaras de cultivo decorrente da evaporação de água.
O volume original consistia em 400 µL em cada uma das câmaras, e, após um dia de cultivo, o
volume total resultante no dispositivo de policarbonato foi de 350 µL na câmara 1 (C1), 300
µL na câmara 2 (C2), e 350 µL na câmara 3 (C3). Para o dispositivo de PMMA, o volume
observado foi de 300 µL na C1, 100 µL na C2, e 300 µL na C3. O volume evaporado foi então
reabastecido com água destilada e as culturas permaneceram em cultivo por mais dois dias
(Figura 41).
Figura 41. Cultura de S. maxima em microbiorreatores de policarbonato (à esqueda) e PMMA (à direita) com
três dia de cultivo. As câmaras de cultivo 1, 2 e 3 são indicadas na figura por C1, C2 e C3, respectivamente.
114
Conforme ilustrado na Figura 41, a cultura celular permaneceu verde (à exceção da
câmara de cultivo central para o microbiorreator de PMMA) indicando a atividade metabólica
das células e, portanto, sua tolerância aos microbiorreatores por pelo menos três dias de cultivo.
Contudo, mais uma vez, foi observada uma queda no volume das culturas. O volume total no
dispositivo de policarbonato, após dois dias consecutivos de cultivo, foi de 200 µL na câmara
1 (C1), 100 µL na câmara 2 (C2), e 200 µL na câmara 3 (C3). Para o dispositivo de PMMA, o
volume observado foi de 200 µL na C1, 400 µL na C2, e 200 µL na C3. Resumidamente, a
Tabela 3 sumariza os volumes de água evaporada em cada um dos dias de cultivo utilizando os
microbiorreatores de policarbonato e PMMA.
Tabela 3. Volume evaporado nos microbiorreatores de policarbonato e PMMA após um e três dias de cultivo de
S. maxima.
Microbiorreator Dia Câmara Volume Evaporado (%)
Policarbonato
1
C1 12.5
C2 25
C3 12.5
3
C1 50
C2 75
C3 50
PMMA
1
C1 25
C2 75
C3 25
3
C1 50
C2 100
C3 50
De fato, de acordo com Schäpper et al. (2009), o problema de evaporação em
microbiorreatores é uma problemática recorrente e exclusiva das reações em microescala dado
o pequeno volume de trabalho total. Adicionalmente, a membrana superior de parafina plástica
utilizada para fechar o sistema de biorreação, segundo o fabricante Bemis Company (EUA), é
permeável ao vapor de água (1 g m-2 em 38 oC e 1 atm) (BEMIS COMPANY, 2017). Uma
solução para a evaporação, assim como discutido no Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica,
115
consiste no reabastecimento de água destilada a partir de um reservatório posicionado acima do
nível de cultivo, de forma que o volume reabastecido seja proporcional ao volume evaporado
(SCHÄPPER et al., 2009).
Após os três dias de cultivo, as células foram observadas por microscopia de campo
claro. Os resultados são ilustrados na Figura 42.
Figura 42. Micrografia das células de S. maxima cultivadas por três dias em microbiorreatores de policarbonato
(A) e PMMA (B), a partir da lente objetiva 40x.
A partir da Figura 42, pode-se perceber a integridade da célula, a partir dos agregados
lineares formando filamentos, validando a biocompatibilidade das células de S. maxima com
ambos os microbiorreatores construídos.
Com o objetivo de realizar ensaios preliminares envolvendo microbiorreatores, a
construção do presente dispositivo mostrou-se factível e promissora para o cultivo de S.
maxima.
De forma conclusiva, embora diversas são as barreiras a serem vencidas para a
implementação dessa invenção como ferramenta eficiente para a condução de bioprocessos, o
presente estudo representa um marco inicial para o desenvolvimento de trabalhos de maior
complexidade e sofisticação.
116
CAPÍTULO 7 CONCLUSÃO E SUGESTÕES PARA
TRABALHOS FUTUROS
7.1 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir das conclusões obtidas no presente trabalho de dissertação, nota-se a crescente
inserção da comunidade científica internacional no contexto dos microbiorreatores. Tais
dispositivos têm sido desenvolvidos e sucessivamente aplicados em bioprocessos.
Adicionalmente, a viabilidade de tal estratégia tem se confirmado de forma bela através de
estudos comparativos entre escalas micro e convencionais e cálculos de parâmetros bem
estabelecidos. Como consequência, a aprovação e incorporação dos microbiorreatores como
ferramentas estratégicas no desenvolvimento de têm crescido consideravelmente no campo dos
processos biotecnológicos.
Ainda, imersos em uma sociedade onde a bioeconomia cresce de forma consistente,
juntamente com a gradual migração dos processos químicos para a os processos
biotecnológicos, procura-se de forma substancial o desenvolvimento e a otimização de
bioprocessos para que se possa estabelecer uma indústria sólida eficiente. Em tal contexto, os
microbiorreatores tornam-se uma estratégia interessante para os estudos de condições e
parâmetros relevantes no desenvolvimento de estratégias altamente qualificadas para a
substituição dos métodos convencionais.
Sendo assim, conclui-se que o mundo da microescala dos bioprocessos e da
biotecnologia industrial está repleto de oportunidades a serem ainda a serem exploradas.
Conclusivamente, sob a luz de tais fatores, este trabalho representa um primeiro passo
importante no campo da prospectiva tecnológica dos microbiorreatores e sua tecnologia, como
uma abordagem estratégica para o desenvolvimento de bioprocessos industriais, dentre outras
aplicações biotecnológicas.
7.2 CONCLUSÕES
A presente dissertação objetivou realizar a prospecção tecnológica da tecnologia dos
microbiorreatores, adotando indicadores científicos e tecnológicos; bem como aplicar o
conhecimento teórico obtido a partir dos estudos no desenvolvimento de microbiorreatores. De
117
tal forma, serão apresentadas a seguir as principais conclusões obtidas a partir de cada etapa do
trabalho realizado.
No que se diz respeito à evolução anual de documentos de artigos científicos e depósitos
de patentes que versam sobre a tecnologia dos microbiorreatores, percebeu-se um súbito
crescimento no número de artigos científicos e documentos de patentes a partir do milênio 2000.
Em termos de artigos científicos oriundos de instituições brasileiras, a quantidade de
documentos encontrados foi substancialmente inferior quando comparado ao cenário
internacional, compreendendo em apenas 4 artigos, o equivalente a 1,4% do total de artigos
obtidos. Para as patentes, não foi encontrada nenhuma solicitação de patente proveniente de
residentes brasileiros
No que tange à origem das pesquisas sobre os microbiorreatores e sua tecnologia, notou-
se a forte influência dos EUA, Alemanha e Grã-Bretanha em relação aos artigos científicos.
Dentre tais países, destacaram-se as universidades MIT, DTU e UCL, respectivamente. Em
termos de depósitos de patentes, destacaram-se o Japão e os EUA com uma quantidade massiva
de documentos em relação aos outros países, detendo mais de 75% dos depósitos. Dentre tais
países, destacam-se as instituições Konica Minolta Medical & Graphic, Corning, Life
Technologies, BioProcessors e Olympus Optical.
Os principais mercados onde a tecnologia dos microbiorreatores foi protegida consistem
no Japão (com 133 depósitos), EUA (com 118 depósitos), União Europeia (com 72 depósitos)
e China (com 39 depósitos). No Brasil, apenas um depósito foi encontrado, sendo esse
patenteado no país através do sistema PCT. Um aspecto de suma relevância a ser destacado
aqui se refere à grade oportunidade aos centros de pesquisa nacionais que trabalham com o
estudo e desenvolvimento de bioprocessos, uma vez que se torna possível copiar e comercializar
as mais diversas tecnologias patenteadas em outros países, sem que haja a necessidade do
pagamento de royalties.
Ainda, dentre os artigos científicos, percebeu-se que grande parte dos dispositivos
estudados apresentam uma alta capacidade de inserção no mercado em curto um curto prazo de
tempo (30 documentos). Dentre esses dispositivos, destacam-se aqueles que são apresentados
com um alto teor de detalhamento visual e descritivo; comparados com dispositivos de escalas
convencionais; aplicados a abordagens específicas; e que apresentam o cálculo de parâmetros
relevantes para o bioprocesso em questão.
118
No tocante aos materiais de maior abordagem como constituição principal dos
microbiorreatores, destacam-se os elastômeros PDMS e PMMA, presentes em 26 e 19
documentos, respectivamente. Ainda, destacam-se dois microbiorreatores comercialmente
disponíveis: Flower-Plates® (6 ocorrências) e BioLector microbioreactor® (5 ocorrências),
ambos fabricados pela m2p labs, empresa alemã especializada no desenvolvimento de
microbiorreatores.
Quanto aos principais biocatalisadores abordados nos artigos científicos, destacam-se
de forma consistente as células de mamíferos (27 documentos), majoritariamente relacionadas
a estudos de diferenciação celular a partir de células tronco pluripotentes. Em sequência,
destacaram-se as mais diversas células de bactérias (14 documentos) e leveduras (10
documentos). No que cerne a finalidade dos bioprocessos em que tais células são aplicadas,
destaca-se de forma majoritária a cultura celular (40 documentos) e sua análise metabólica e/ou
fisiológica (36 documentos).
Quanto aos parâmetros monitorados e controlados nos microbiorreatores, percebe-se
um destaque majoritário para a temperatura (43 documentos), seguindo-se da densidade óptica
(24 documentos) e agitação (21 documentos).
Adicionalmente, ao analisar os documentos de patentes, destacou-se a recorrência
equilibrada entre dispositivos baseados em biorreatores microfluídicos (105 patentes) e
microplacas (100 patentes). Em tais documentos, ainda, destaca-se de forma majoritária o
desenvolvimento de microdispositivos baseados em células como biocatalisadores.
Finalmente, o estudo de caso apontou o desenvolvimento de dois fotomicrobiorreatores
de diferentes composições (policarbonato e PMMA), bem como no desenvolvimento de um
suporte para tais, especializados no cultivo de microalgas. Os dispositivos demonstraram-se
biocompatíveis com as células de S. maxima, as quais apresentaram atividade fotossintética e
integridade celular pelos três dias em que foram cultivadas.
7.3 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, no intuito de se explorar uma
tecnologia altamente promissora, sugerem-se os seguintes estudos:
119
➢ Desenvolver uma plataforma capaz de monitorar o cultivo de células de S. maxima
de forma automatizada, a partir da integração de sensores ópticos ao
fotomicrobiorreator para análise de DO;
➢ Integrar um sistema de agitação a partir de microimpelidores magnéticos imersos no
meio fermentativo para o cultivo de S. máxima;
➢ Estudar o comportamento da taxa de evaporação no fotomicrobiorreator
desenvolvido, a partir da integração de uma fina membrana de PDMS como
substituição à membrana de parafina plástica;
➢ Explorar a aplicação dos microbiorreatores em diferentes bioprocessos, a partir do
desenvolvimento de dispositivos de distintas configurações e geometrias.
120
CAPÍTULO 8 REFERÊNCIAS
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151
ANEXO C
Patentes Analisadas
152
EP3239285 Device for determining and monitoring the physiological states of microbial
cultures in each micro-bioreactor of a microtitration plate
RWTH AACHEN
NL2016281 Means and methods for spheroid cell culturing and analysis
PERKINELMER
CN106978384 Porous microcryogel cell three-dimensional culture carrier, and preparation
method and preparation system thereof
MICROBIOTECH TSINGHUA UNIVERSITY
EP3190172 Interconnections of multiple perfused engineered tissue constructs and
microbioreactors, multi-microformulators and applications of the same
VANDERBILT UNIVERSITY
WO9932654 Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates
HITACHI CHEMICAL
WO200600115 Device and method for disposing pipette tips or dispenser tips in a system used
for manipulating liquid samples
TECAN TRADING TECON TRADING
WO2017104610 Porous film, method for manufacturing porous film, microlens array,
microreactor, and bio-device
JAPAN SCIENCE & TECHNOLOGY AGENCY
WO201762629 Microfluidic tissue development systems
UNIVERSITY OF PITTSBURGH
US20170081625 Interconnections of multiple perfused engineered tissue constructs and
microbioreactors, multi-microformulators and applications of the same
VANDERBILT UNIVERSITY
CN205953998U Modular defoaming paddle and use combination formula defoaming paddle's
miniature bioreactor
EAST CHINA UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY SHANGHAI
GUOQIANG BIOENGINEERING EQUIPMENT
KR20170003177 Polygons microplate preparation mehthod thereof and culture method of cell
aggregation using the same
MICROFIT
US20160369222 Microplate-based apparatus for measuring cell metabolism
DK INNOTECH
WO2016180836 Well inserts with brittle membranes
CSEM - CENTRE SUISSE D ELECTRONIQUE ET DE MICROTECHNIQUE
153
WO2007123100 Filter-carrying micro plate
DAI NIPPON PRINTING
US20050272144 Microreactor enhancing efficiency of liquid mixing and reaction
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
US20080187949 Multiplexed assays of cell migration
MILLIPORE
US20160137974 Microplates for magnetic 3d culture
NANO3D BIOSCIENCES
WO201644537 Microfluidic system and method for perfusion bioreactor cell retention
MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY MIT NATIONAL
UNIVERSITY OF SINGAPORE NATIONAL UNIVERSITY OF
SINGAPORE
US20160017272 Method and Apparatus for Pipette Tip Columns
GJERDE DOUGLAS T
WO201611075 Ultrasound system for shearing cellular material
UNIVERSITY OF WASHINGTON
US20150004686 Automatic continuous perfusion cell culture microplate consumables
CORNING
US20070248976 Inverted orientation for a microplate
LIFE TECHNOLOGIES
CA2933950 Microfluidic bioreactor with modular design for synthesizing cell metabolites,
method for using same, and use thereof
KARLSRUHER INSTITUTE FÜR TECHNOLOGIE
DE202014105173 Microplate reader with incubation device
TECAN TRADING
CN104480010 Biological reaction device and application thereof
TSINGHUA UNIVERSITY
WO201527186 A modular, microfluidic, mechanically active bioreactor for 3d, multi-tissue,
tissue culture
UNIVERSITY OF PITTSBURGH
WO201516471 Micro cell culturing device
UNIST UNIST ACADEMY INDUSTRY RESEARCH
US20050026134 Systems and methods for control of pH and other reactor environment
conditions
BIOPROCESSORS
154
CN204039380U High-efficiency magnetic separation device convenient for pipetting
BEAVER NANO TECHNOLOGY SUZHOU
TWI464400 Bio-sensing device
WISTRON
US20140322701 Miniaturized, automated in-vitro tissue bioreactor
LAWRENCE LIVERMORE NATIONAL SECURITY
US20140234954 Methods and apparatus for independent control of product and reactant
concentrations
PHARYX
GB201400836 Microplate content agitation apparatus and method
TTP LABTECH
GB201322082 Foldable microplate
GE HEALTHCARE BIO SCIENCES
CN203569110U Composite structure for 384-hole microplate
VANGUARD
CN203569108U Microplate structure with bottom penetrated 384 holes
NEST BIOTECHNOLOGY
CN103396986 Animal cell perfusion culture method, and special device and application
thereof
NCPC GENETECH BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT
WO2013191173 Sample dispensing apparatus, crystallization method for protein, and microplate
formation sheet
RIKAGAKU KENKYUSHO RIKEN
WO2013175218 Clamp for fast pcr heating
BJS BJS IP
WO2013116449 Automatic continuous perfusion cell culture microplate consumables
CORNING
US20130196276 Apparatus and methods to operate a microreactor
PHARYX
KR20140080899 Microplates for cell culture and cell culture container comprising the same
KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC
COOPERATION FOUNDATION
RU2012149565 Method of estimating cell viability in microbioreactor by means of optical light
guide
OOO NT TS BIOKLINIKUM OOO NTTS BIOKLINIKUM
155
CN103665098 Dual phase column membrane protein micro-reactor and use thereof
DALIAN INSTITUTE OF CHEMICAL PHYSICS
US20140045253 Multi-compartment device for cell cloning and method of performing the same
ZOU QIAN
CA2832759 Thermal cycler with vapor chamber for rapid temperature changes
BIO RAD
WO2012139125 System and methods for making and processing emulsions
LIFE TECHNOLOGIES
JP2012152734 Assembly/dispersion apparatus of magnetic particle in liquid
TAMAGAWA SEIKI
JP2012147785 Apparatus for collecting/dispersing magnetic particle in liquid
TAMAGAWA SEIKI
CA2821580 Methods and systems for fast pcr heating
BEE JAY S IPD BJS IP
EP2548943 Clamping insert for cell culture
CSEM - CENTRE SUISSE D ELECTRONIQUE ET DE MICROTECHNIQUE
JP2012231764 Apparatus and method for sorting and acquiring cell aggregate
KYOKKO DENKI
US20120276541 Microplates, reaction modules and detection systems
SUZHOU GENEISYS BIOMEDICAL INSTR SUZHOU JINYI
BIOMEDICAL INSTR
US20120231976 Microfluidic chip for high-throughput perfusion-based three-dimensional cell
culture
CHANG GUNG UNIVERSITY
WO2010138960 Methods and systems for single-molecule rna expression profiling
HARVARD COLLEGE
WO2010126992 Microreactors with connectors sealed thereon; their manufacturing
CORNING
JP2011189270 Microplate and separation method
SUMITOMO BAKELITE
US20110111489 Sensor adapter, method for the manufacture thereof, method for the use of a
sensor in this sensor adapter and bioreactor with this sensor adapter
EPPENDORF
WO201048441 Culture systems
156
REGENEMED
WO201040831 Genetic analysis in microwells
PICO VITRO PICOVITRO
US20110082563 Microscale multiple-fluid-stream bioreactor for cell culture
CHARLES STARK DRAPER LABORATORY CHARLES STARK
LABORATORY DOREIPA
WO201130018 Microplate
PIERRE FABRE MEDICAMENT
WO201014885 Microplates with ultra-thin walls by two-stage forming
BIO RAD
CN201473546U Microreactor
HANGZHOU AMPROTEIN BIOLOG ENGINEERING
GB200911331 Vibrating microplate biosensing for characterising properties of behaviour of
biological cells
ASTON UNIVERSITY
JP2011004608 Microreactor for evaluating cell movement
KYOTO UNIVERSITY SHIMADZU WASEDA UNIVERSITY
IT2008TO1000 Microreactor with vent channels for removing air from a reaction chamber
STMICROELECTRONICS
JP2010088317 Chip for biological sample determination, kit for biological sample
determination and method for biological sample determination
SEIKO EPSON
JP2010066195 Biological sample reaction chip, centrifugal apparatus for filling biological
sample reaction chip with reaction liquid, and method for filling biological
sample reaction chip with reaction liquid
SEIKO EPSON
JP2010041973 Microreactor carrying enzyme-silica-based nanoporous material composite and
method for producing the same
NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE &
TECHNOLOGY
TW200951437 Bioreactor
CHUNG YUAN CHRISTIAN UNIVERSITY
WO2009121868 Microbioreactor and microtiter plate comprising a plurality of microbioreactors
TECHNISCHE UNIVERSITÄT ILMENAU
US20080255062 Axon regeneration from adult sensory neurons
UNIVERSITY OF MANITOBA
157
DE102008008256 Microreactor
M2P LABS PEE EM 2 RABBS
US20100184020 Chip-based sequencing nucleic acids
LAWRENCE LIVERMORE NATIONAL SECURITY
JP2009150754 Chip, apparatus and method for biological sample reaction
SEIKO EPSON
US20090148912 Biological sample reaction chip, biological sample reaction apparatus, and
biological sample reaction method
SEIKO EPSON
WO200828241 Microbioreactor
UNIVERSITY OF QUEENSLAND
JP2008271876 Microreactor, multi-step enzymic reaction method using the same, and method
for continuous synthesis of sugar chain
MITSUBISHI CHEMICAL
AU2007201793 Microfermentor device and cell based screening method
BIOPROCESSORS
WO200816411 Improved disposable bioreactor vessel port
FINESSE SOLUTIONS
FI200705191 Device and method for use in analysis
BIOINNOVATIONS BIOINNOVATONS
JP2008221192 Microreactor and microfluid reaction apparatus
CANON
US20070172395 Thermally conductive microplate
LIFE TECHNOLOGIES
KR100824357 Miniaturized bioreactor
BIOTRON
US20080153135 Methods and apparatus for conducting amplification reactions on high density
hydrophilic patterned microplates
LIFE TECHNOLOGIES
WO200755165 Method of separating nucleic acid, microreactor for testing nucleic acid and
nucleic acid test system
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
WO200758077 Gene test method, microreactor for gene test and gene test system
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
WO200853598 Method for producing a biomolecule assay chip
158
JANUSYS JAPAN SCIENCE & TECHNOLOGY AGENCY SAITAMA
SMALL ENTPR PROMOTION SAITAMAKEN CHUSHO KIGYO SHINKO
WO200752471 Microreactor and method of liquid feeding making use of the same
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
WO200826670 Microplate divider and microplate dividing method
UNIVERSAL BIO RESEARCH
US20070037195 Apparatus and method for digital magnetic beads analysis
APPLIED BIOCODE MAXWELL SENSORS
WO200808149 Cell analysis apparatus and method
SEAHORSE BIOSCIENCE
WO200800238 Microreactor array, device comprising a microreactor array, and method for
using a microreactor array
M2P LABS
WO2006138743 Fluid transfer device
BIOPROCESSORS
EP1864716 Closure for milliliter scale bioreactor
PALL FORTEBIO PALL MICROREACTOR TECHNOLOGIES
US20070280855 Modular and reconfigurable multi-stage microreactor cartridge apparatus
ADVION ADVION BIOSCIENCES MATTEO JOSEPH C
NANOTECHNOLOGY LIABILITY NANOTEK
WO2007129413 Microplate mounting stand, and analyte testing/observing apparatus equipped
therewith
EFFECTOR CELL INSTITUTE HIRATA
JP2007289032 Microreactor and integrated microanalytical system using the same
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
JP2007292506 Microreactor and micro-integrated analysis system using the same
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
JP2007237021 Microreactor
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
CN1982431 Fast protease microreactor and its production
DALIAN INSTITUTE OF CHEMICAL PHYSICS
JP2007159439 Microreactor having high-density reaction space array formed by porous silicon
QUANTUM 14
US20070122854 Method for diagnosing colon cancer
RNL BIO
159
JP2007135504 Microreactor used for nucleic acid inspection and holding beads at
amplification site
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
JP2007117830 Ultarsonic micro plate agitation and defoaming apparatus
HONDA ELECTRONICS
US20060088451 Micro-reactor for biological substance inspection and biological substance
inspection device
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
US20060088929 Microreactor for genetic test
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
JP2007113922 Microreactor
SHIMADZU WASEDA UNIVERSITY
EP1647329 Microplate with dialysis membrane
BECTON DICKINSON CORNING
JP2007097510 Microreactor
SHIMADZU WASEDA UNIVERSITY
US20060199260 Microbioreactor for continuous cell culture
MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY MIT
WO200637022 Microbioreactor for continuous cell culture
MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY MIT
JP2007083191 Microreacter
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
GB200518623 Data capture system for microtiter plates
POLYLOGIC
JP2007071555 Substrate having protein immobilized thereon and microreactor using it
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
JP2007068413 Microreactor for genetic testing
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
US20050282224 Method for carrying out a biochemical protocol in continuous flow in a
microreactor
CEA - COMMISSARIAT A L ENERGIE ATOMIQUE ET AUX ENERGIES
ALTERNATIVES SERONO GENETICS INSTITUTE
WO2005118867 Microfabricated integrated dna analysis system
UNIVERSITY OF CALIFORNIA UNIVERSITY OF CALIFORNIA
BERKELEY
160
US20050250200 Micro-reactor for testing, genetic testing apparatus, and genetic testing method
KONICA MINOLTA KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
US20060229818 Method for eliminating crosstalk between waveguide grating-based biosensors
located in a microplate and the resulting microplate
CORNING
US20050244932 Inverted orientation for a microplate
LIFE TECHNOLOGIES
WO200573410 Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
454 454 LIFE SCIENCES
US20060139641 Optical reader system and method for monitoring and correcting lateral and
angular misalignments of label independent biosensors
CORNING CYBERDYNE INNOVATIONS
EP1652912 Micro-reactor, biological material inspection device, and microanalysis system
KONICA MINOLTA MEDICAL & GRAPHIC
CN1766645 Micro channel structure and method of manufacturing the same
DAINIPPON SCREEN MANUFACTURING
WO200529041 High density plate filler
LIFE TECHNOLOGIES
US20060029524 Sample processing device positioning apparatus and methods
3M 3M INNOVATIVE PROPERTIES
JP2006034256 Storing apparatus
SANYO ELECTRIC
WO2004113918 Sample arraying/assembling device, its method, and apparatus using sample
assembly
UNIVERSAL BIO RESEARCH
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