avaliação do desempenho da tci/tcvi/tcii chagas-flow ate … · 2019. 4. 16. · catalogação:...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO – UFOP
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a no sorodiagnóstico universal e genótipo-
específico de infecções experimentais simples e mistas pelo
Trypanosoma cruzi
AUTOR: GLAUCIA DINIZ ALESSIO
ORIENTADORA: PROFA. DR
A. MARTA DE LANA
CO-ORIENTADOR: DR. OLINDO ASSIS MARTINS-FILHO
OURO PRETO, MG, 2017
II
GLAUCIA DINIZ ALESSIO
Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a no sorodiagnóstico universal e genótipo-
específico de infecções experimentais simples e mistas pelo
Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do
Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do Título de
Doutor em Ciências Biológicas, área de
concentração Imunobiologia de
Protozoários.
Orientadora: Profa. Dra. Marta de Lana
Co-orientador: Dr. Olindo Assis
Martins-Filho
OURO PRETO, MG, 2017
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
A372a Alessio, Glaucia Diniz. Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a nosorodiagnóstico universal e genótipo-específico de infecções experimentais simplese mistas pelo Trypanosoma cruzi [manuscrito] / Glaucia Diniz Alessio. - 2017. xvii, 173f.: il.: color; Um artigo em anexo.
Orientador: Prof. Dr. Marta de Lana. Coorientador: Prof. Dr. Olindo Assis Martins-Filho.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Pró-Reitoria dePesquisa e Pós-Graduação. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Imunobiologia de Protozoários.
1. Trypanosoma cruzi. 2. Sorologia. 3. Citometria de fluxo. 4. Diagnósticouniversal. 5. Diagnóstico genótipo-específico. I. Lana, Marta de. II. Martins-Filho,Olindo Assis . III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 577.27:561.24
III
“O que chamamos de inspiração é a capacidade de reter e ampliar, com um toque
próprio único, um flash ou insight, uma coisinha de nada que atravessa o nosso
pensamento e pode fugir. Porém, boa parte dessa inspiração é fruto de nossa capacidade
de concentração, de disciplina, de esforço mental e até de teimosia. Precisamos não de
um dia bonito de céu azul, mas de uma boa dose de paciência para produzir alguma
coisa interessante, para organizar raciocínios, transformar barro em tijolos e tijolos em
casa.”
Freitas, 2002
IV
Dedico esse trabalho aos meus pais Carmen e Paulo, ao meu irmão Marcelo, a minha
cunhada Ana e ao meu sobrinho Joãzinho, por me incentivarem em todos os momentos,
pelo amor, carinho, amizade, paciência e força ao longo dessa caminhada. Vocês foram
fundamentais para que esse trabalho se concretizasse!
AGRADECIMENTOS
V
Agradeço imensamente a Deus por ter me dado força, sabedoria e iluminado os meus
caminhos para que eu conseguisse chegar até aqui. Hoje concretizo esse sonho devido
às bênçãos de Deus e da minha fiel protetora Santa Terezinha das Rosas! Só tenho a
agradecer por mais essa conquista!
Agradeço à minha orientadora Dra. Marta de Lana, por ter me acolhido desde a minha
iniciação científica. Obrigado por ter me introduzido nos caminhos da pesquisa e por
despertar em mim o amor pela ciência. Obrigado por todos os seus ensinamentos, pela
paciência e principalmente pela confiança!
Agradeço ao meu co-orientador Dr. Olindo Assis Martins-Filho por me aceitar como
sua aluna e por ter me recebido de portas abertas no laboratório. Obrigado por todos os
seus ensinamentos, que com certeza eu vou levar tanto para a minha vida pessoal quanto
para a profissional. Obrigado pela sua dedicação e persistência com o meu projeto, pelo
seu esforço diário em fazer com que tudo desse certo! Obrigado pela sua paciência, por
estar sempre disposto a me ouvir e por despertar em mim o meu senso crítico e amor
pela pesquisa. Acima de tudo obrigado pelo seu carinho! Você é um verdadeiro
exemplo de pessoa e profissional que eu quero levar pra sempre comigo!
Agradeço à Dra. Ándrea Teixeira de Carvalho por toda a colaboração e suporte
possibilitando a concretização desse projeto. Obrigado por todas as sugestões que
aprimoram o desenvolvimento desse trabalho.
Agradeço à Dra. Fernanda Fortes por todas as suas contribuições no meu projeto.
Obrigado por estar sempre disposta a me ajudar e acima de tudo pela sua amizade!
Agradeço ao Dr. Policarpo Ademar Sales Júnior por estar sempre disposto a me ajudar.
Obrigado pelo seu empenho e suporte possibilitando o desenvolvimento desse trabalho.
Agradeço à Dra. Denise Fonseca Côrtes pelo seu envolvimento e apoio na parte
experimental e nas análises da primeira etapa desse trabalho. Obrigado pela sua
preocupação com o meu projeto e pela sua amizade.
AGRADECIMENTOS
VI
Agradeço aos meus colaboradores Dr. Matheus de Souza Gomes, Dr. Laurence
Rodrigues do Amaral e Dr. Marcelo Antônio Pascoal Xavier por todo o suporte na parte
das análises desse projeto. Obrigado pelo envolvimento e comprometimento de vocês
permitindo que desenvolvêssemos um trabalho de alta qualidade.
Agradeço aos pesquisadores do Grupo Integrado de Pesquisas em Biomarcadores Dr.
Márcio Sobreira Silva Araújo e Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal pelos
ensinamentos, apoio, incentivo e amizade.
Agradeço aos membros da Plataforma de Citometria, Dra. Carol Campi Azevedo, Tiza,
Lorena e Bruna pelo auxílio e acompanhamento das leituras no citômetro e pelo suporte,
permitindo assim a realização desse trabalho.
Agradeço à Júcelia Amorim, um verdadeiro exemplo de pessoa, pelo seu carinho,
amizade, pela convivência e por estar sempre disposta a me ajudar nos momentos que
eu mais precisei.
Agradeço à Universidade Federal de Ouro Preto e ao Centro de Pesquisas René Rachou
por todo o suporte científico, tecnológico e financeiro que permitiram a realização desse
projeto.
Agradeço à CAPES pela concessão da minha bolsa.
Agradeço à todos os membros do Laboratório de Doença de Chagas e do Grupo
Integrado de Pesquisas em Biomarcadores pela convivência diária, pelo carinho,
amizade, força e incentivo.
Agradeço aos meus queridos amigos de Ouro Preto Levi, Jamille e Maykon, pela força
e incentivo que vocês sempre me deram, pelo apoio e por estarem sempre dispostos a
me ajudar. Agradeço imensamente por todos esses anos de amizade!
Agradeço mais do que nunca as minhas queridas amigas “divas quase doutoras”
Marcela, Chris, Paulinha, Taty, Jô, Amandinha, Sarinha e Raquel. Vocês são muito
AGRADECIMENTOS
VII
especiais e importantes na minha vida. Sem o apoio, a amizade e o carinho de vocês eu
não conseguiria chegar até aqui. Obrigado por tudo do fundo do meu coração!!!!
Agradeço a todos os meus amigos de BH, em especial Isabela, Socorro e Amanda, por
sempre estarem presentes em todos os momentos da minha vida, pela amizade de anos,
pelo carinho e incentivo de vocês, por estarem sempre dispostas a me ouvir e me ajudar.
Amo vocês e sou imensamente grata por ter pessoas tão especiais na minha vida!
Finalmente agradeço imensamente a minha família, mãe, pai, Marcelo, Ana e
Joãozinho!!! Vocês são a razão da minha vida!!! Eu nunca conseguiria chegar até aqui
sem o apoio incondicional de vocês. Por diversos momentos a caminhada foi árdua,
foram muitos momentos difíceis, mas graças a Deus conseguimos superar todos, e hoje
estamos firmes e fortes! Obrigado pelo amor, união, carinho e por todo o incentivo. Me
desculpe se por alguns momentos foi incompreensiva, pelo meu estresse, pela correria e
se não dei a atenção necessária à vocês. Muito obrigada por tudo!!!!!
RESUMO
VIII
O Segundo Consenso Taxonômico do Trypanosoma cruzi subdividiu a espécie em seis
grupos genéticos distintos (DTUs- “Discrete Typing Unity”), TcI a TcVI. Nesse
contexto, diversos estudos vêm associando a variabilidade genética do T. cruzi com as
características biológicas, epidemiológicas e clínicas da doença de Chagas (DCh).
Assim, torna-se cada vez mais importante correlacionar a diversidade genética do
parasito com o diagnóstico da DCh. Recentemente, foi padronizada a técnica de
pesquisa de anticorpos IgG anti-amastigotas (AMA), tripomastigotas (TRIPO) e
epimastigotas (EPI) do T. cruzi por citometria de fluxo (Chagas-Flow ATE), com
excelente desempenho no diagnóstico e na monitoração pós-terapêutica da DCh. Assim,
esse trabalho busca otimizar a Chagas-Flow ATE no diagnóstico universal e genótipo-
específico da infecção experimental simples e mista pelo T. cruzi, utilizando distintas
DTUs do parasito como antígeno. Foram avaliados pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a amostras de soros de camundongos não infectados e com infecções pelo T.
cruzi simples: Colombiana (COL)/TcI, CL/TcVI e Y/TcII e mistas: Colombiana/TcI +
CL/TcVI, CL/TcVI + Y/TcII e Colombiana/TcI + Y/TcII nas infecções recentes (IR) e
tardias (IT). Os dados demonstraram o excelente desempenho da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal da infecção experimental pelo T.
cruzi, com 100% de sensibilidade e especifidade. Essa metodologia apresentou ainda
um bom desempenho no diagnóstico genótipo-específico de infecções IR simples, com
uma acurácia de 69% para discriminar infecções por TcI (COL)/TcVI (CL)/TcII (Y) e
de 94% para diferenciar infecções por TcI (COL)/TcII (Y). Além do mais, essa técnica
demonstrou uma boa performance para distinguir infecções pelo T. cruzi nas IR e IT,
com uma acurácia de 81%. Os resultados evidenciaram ainda o bom desempenho dessa
metodologia para discriminar infecções simples e mistas na IR e na IT, com uma
acurácia de 85% e 84%, respectivamente. Além do mais, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a apresentou uma boa performance no diagnóstico genótipo-específico de
infecções experimentais simples e mistas pelo T. cruzi na IR, com uma acurácia de 72%
e 80%, respectivamente, e de infecções simples e mistas na IT, com uma acurácia de
69% e 76%, respectivamente. Em relação à análise dos algoritmos sequenciais, a
metodologia proposta demonstrou uma acurácia de 81% como um teste diagnóstico
complementar para a infecção experimental pelo T. cruzi. Os resultados indicam o
potencial da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico universal e
genótipo-específico da infecção experimental simples e mista pelo T. cruzi, na IR e na
IT. A padronização da metodologia Chagas-Flow ATE para o diagnóstico genótipo-
específico da DCh será de extrema importância para a proposta clínica, estudos
epidemiológicos, e de monitoração pós-terapêutica.
ABSTRACT
IX
The second Taxonomic Consensus of Trypanosoma cruzi subdivided the species in six
distinct genetic groups (DTUs- “Discrete Typing Unity”), TcI to TcVI. In this context,
several studies have been associating the genetic variability of T. cruzi with the
biological, epidemiological and clinical characteristics of Chagas disease (DCh). Thus,
it is becoming increasingly important to correlate the genetic diversity of the parasite
with the diagnosis of DCh. Recently, our group standardized the technique of screening
for IgG anti-amastigotes (AMA), trypomastigotes (TRIPO) and epimastigotes (EPI) of
T. cruzi by flow cytometry (Chagas-Flow ATE), with excellent performance in the
diagnostic and post-treatment monitoring of DCh. So, this work aimed to optimize
Chagas-Flow ATE for the universal and genotype-specific diagnosis of simple and
mixed experimental T. cruzi infection, using different DTUs of the parasite as antigen.
Serum samples from non-infected mice and infected mice with single infections of T.
cruzi: Colombiana/ TcI, CL/ TcVI and Y/ TcII and infected mice with mixed infections
of T. cruzi: Colombiana/TcI + CL/TcVI, CL/TcVI + Y/TcII and Colombiana/TcI +
Y/TcII, in the recent (RI) and late (LI) infections were evaluated by TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a. The data demonstrated an excellent performance of the
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for the universal diagnosis of T. cruzi
infection, with 100% sensibility and specificity. This methodology showed a good
performance for the genotype-specific diagnosis of single infections in the LI, with an
accuracy of 69% to discriminate TcI/TcVI/TcII infections and 94% to differentiate
TcI/TcII infections. Moreover, this technique demonstrated a good performance to
distinguish T. cruzi infection in RI and LI, with an accuracy of 81%. The results also
demonstrated the good performance of this methodology to discriminate between
simple and mixed infections in RI and LI with an accuracy of 85% and 84%,
respectively. Furthemore, TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a showed a good
performance for the genotype-specific diagnosis of single and mixed infections in the
RI with an accuracy of 72% and 80%, respectively, and single and mixed infections in
the LI with an accuracy of 69% and 76%, respectively. Regarding the analysis of the
sequential algorithms, the present methodology demonstrated an accuracy of 81% as a
complementary diagnostic test for the T. cruzi experimental infection. The results
indicated the potential of the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for the universal
and genotype-specific diagnosis of T. cruzi simple and mixed experimental infection in
RI and LI. The standardization of the Chagas-Flow ATE methodology for the genotype-
specific diagnosis of DCh will be extremely important for clinical purposes,
epidemiological studies and post-therapeutic monitoring applications.
LISTA DE FIGURAS
X
Figura 1- Delineamento da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o
sorodiagnóstico da infecção pelo T. cruzi.......................................................................39
Figura 2- Perfil de reatividade geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção crônica pelo T. cruzi...............46
Figura 3- Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
universal da infecção experimental pelo T. cruzi............................................................49
Figura 4- Reatividade global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser
aplicado no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi....52
Figura 5- Estabelecimento dos pontos de corte e análise do desempenho da
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi.................................................................................55
Figura 6- Desempenho combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi em dois
protótipos populacionais..................................................................................................58
Figura 7- Análises discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi........................60
Figura 8- Critério para definição do diagnóstico universal e genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em
dois protótipos populacionais..........................................................................................62
Figura 9- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi nas
infecções recentes e tardias..............................................................................................67
Figura 10- Reatividade geral TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em infecções
simples e mistas com distintos genótipos do T. cruzi......................................................70
LISTA DE FIGURAS
XI
Figura 11- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação de infecções experimentais simples e mistas com distintos genótipos do
T. cruzi, nas infecções recentes e tardias.........................................................................75
Figura 12- Perfil de reatividade genótipo-específica da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a em infecções recentes, simples e mistas, com distintos genótipos do T.
cruzi.................................................................................................................................79
Figura 13- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções recentes, simples e mistas pelo T.
cruzi.................................................................................................................................85
Figura 14- Perfil de reatividade genótipo-específico da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a em infecções tardias, simples e mistas, com distintos genótipos do T.
cruzi.................................................................................................................................89
Figura 15- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções tardias, simples e mistas pelo T.
cruzi.................................................................................................................................95
Figura 16- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi utilizando algoritmos sequenciais
estabelecidos pela análise das árvores de decisão.........................................................100
LISTA DE ABREVIATURAS
XII
AI- amastigota TcI
AII- amastigota TcII
AVI- amastigota TcVI
AMA- amastigota
ATE- Amastigota, Tripomastigota e Epimastigota
AUC- área sob a curva
BZ- benzonidazol
CH- chagásicos
Chagas-Flow-ATE- pesquisa de anticorpos IgG1 anti-Amastigota, Tripomastigota e
Epimastigota por citometria de fluxo
COL- Colombiana
CPqRR- Centro de Pesquisas René Rachou
DCh- doença de Chagas
Dot-ELISA- immunobloting enzime-linked immunosorbent assay
DTUs- “Discrete Typing Unity”
DTU-blot- hibridização utilizando sondas DTU-específicas
EI- epimastigota TcI
EII- epimastigota TcII
EVI- epimastigota TcVI
ELISA- enzime-linked immunosorbent assay
EPI- epimastigota
FL-1- fluorescência 1
FL-2- fluorescência 2
FC- fase crônica
FC-AFEA- pesquisa de anticorpos IgG anti-formas epimastigotas fixadas
FC-AFPA-IgG- pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas fixadas de
Leishmania sp
FC-ALTA- pesquisa de anticorpos IgG anti-formas tripomastigotas vivas
FC-TRIPLEX Chagas/Leish IgG1- pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas
epimastigotas fixadas do T. cruzi e promastigotas fixadas da L. braziliensis e da L.
chagasi pela citometria de fluxo
FITC- isotiocianato de fluoresceína
FSC- tamanho
GPI- glicose-6-fosfato-isomerase
LISTA DE ABREVIATURAS
XIII
HAI- hemaglutinação indireta
HSP60- proteína de choque térmico 60
IFI- imunofluorescência indireta
IR- infecção recente
IT- infecção tardia
kDNA- ácido desoxirribonucleico do cinetoplasto
LI- “late infection”
LIT- “Liver Infusion Tryptose”
LMCo- lise mediada pelo complemento
LOOCV- leave-one-out-cross-validation
LSSP-PCR- reação em cadeia da polimerase primer específico único de baixa
adstringência
LSU-PCR- variabilidade na sequência do domínio divergente D7 do gene ribossômico
da subunidade 24Sα
LT- leishmaniose tegumentar
LV- leishmaniose visceral
MFF- Max FacsFix- solução fixadora para citometria
MLEE- eletroforese isoenzimática multilocus
MTq-PCR- PCR-Real Time utilizando sondas Taq-Man
NCH- não chagásicos
NF- nifurtimox
NI- não infectados
PBS- solução salina tamponada
PCR- reação em cadeia da polimerase
PCR-RLFP- tipagem do polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição do
DNA do cinetroplasto dos mincírculos por meio da reação em cadeia da polimerase
PPFP- percentual de parasitos fluorescentes positivos
qPCR- reação em cadeia da polimerase Real-Time
RAPD- DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
rDNA- ácido desoxirribonucleico ribossomal
RNA- ácido ribonucleico
RI- “recent infection”
ROC- receiver operating characteristic
SAPE- estreptoavidina-ficoeritrina
LISTA DE ABREVIATURAS
XIV
Se- sensibilidade
SFB- soro fetal bovino
SL-IL- espaçador intergênico do mini-exon
Sp- especificidade
SSC- granulosidade
T. cruzi- Trypanosoma cruzi
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a- pesquisa de anticorpos IgG2a anti-
Amastigota, Tripomastigota e Epimastigota, dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi,
por citometria de fluxo
TcI- T. cruzi I
TcII- T. cruzi II
TcIII- T. cruzi III
TcIV- T. cruzi IV
TcV- T. cruzi V
TcVI- T. cruzi VI
TI- tripomastigota TcI
TVI- tripomastigota TcVI
TII- tripomastigota TcII
TESA-blot- antígenos de tripomastigotas do T. cruzi excretados-secretados
TG-ROC- Two-Graph ROC curve
TSSA- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas
TSSApep-I- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas, peptídeo I
TSSApep-III- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas, peptídeo III
TSSApep-IV- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas, peptídeo IV
TSSApep-II/V/VI- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas,
peptídeos II/V/VI
TSSApep-V/VI- antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas, peptídeos
V/VI
UFOP- Universidade Federal de Ouro Preto
Z1- zimodema I
Z2- zimodema II
Z3/Z1- zimodema III/I
ZB- zimodema B
TRIPO- tripomastigota
SUMÁRIO
XV
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
1.1- Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi............................................2
1.2- Variabilidade genética do T. cruzi e sua correlação com os diferentes aspectos de
sua biologia e da doença de Chagas...........................................................................5
1.3- Infecções mistas do T. cruzi....................................................................................9
1.4- Diagnóstico da doença de Chagas na fase crônica................................................12
1.4.1- Testes parasitológicos.....................................................................................12
1.4.1.1- Xenodiagnóstico....................................................................................12
1.4.1.2- Hemocultura..........................................................................................13
1.4.2- Método molecular: reação em cadeia da polimerase (PCR)..........................13
1.4.3- Testes sorológicos..........................................................................................16
1.4.3.1-Diagnóstico sorológico genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi..22
1.5- Citometria de fluxo no diagnóstico da doença de Chagas....................................23
1.6- Metodologia Chagas-Flow ATE...........................................................................25
2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................27
3. OBJETIVOS..............................................................................................................29
3.1- Objetivo Geral.......................................................................................................30
3.2- Objetivos Específicos............................................................................................30
4. METODOLOGIA......................................................................................................32
4.1- Comitê de Ética.....................................................................................................33
4.2- Cepas do T. cruzi...................................................................................................33
4.3- Infecções experimentais com os genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi.............33
4.4- Preparação dos antígenos alvo AMA, TRIPO e EPI (ATE) dos genótipos TcI,
TcVI e TcII do T. cruzi....................................................................................................34
4.4.1- Cultivo e preparação das formas amastigotas e tripomastigotas do T. cruzi...34
4.4.2- Cultivo e preparação das formas epimastigotas do T. cruzi............................35
4.4.3- Marcação das formas AMA, TRIPO e EPI com isotiocianato de
fluoresceína......................................................................................................................36
SUMÁRIO
XVI
4.5- TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no sorodiagnóstico da infecção pelo T.
cruzi.................................................................................................................................37
4.6- Análises.................................................................................................................40
5. RESULTADOS..........................................................................................................43
5.1- Perfil de reatividade geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção crônica experimental pelo T.
cruzi.................................................................................................................................44
5.2- Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
universal da infecção experimental pelo T. cruzi............................................................47
5.3- Perfil de reatividade global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser
aplicado no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi....50
5.4- Estabelecimento dos pontos de corte e análise do desempenho TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental
pelo T. cruzi.....................................................................................................................53
5.5- Desempenho combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi em dois
distintos protótipos populacionais...................................................................................56
5.6- Definição de um critério de análise para ser utilizado no diagnóstico universal e
genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi por meio da técnica
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em dois distintos protótipos
populacionais...................................................................................................................61
5.7- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais recentes e tardias pelo T. cruzi...................64
5.8- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais simples e mistas com distintos genótipos do
T. cruzi nas infecções recentes e tardias..........................................................................68
5.9- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais tardias, simples e mistas
pelo T. cruzi.....................................................................................................................76
SUMÁRIO
XVII
5.10- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais tardias, simples e mistas
pelo T. cruzi.....................................................................................................................86
5.11- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi utilizando algoritmos sequenciais
estabelecidos pela análise das árvores de decisão...........................................................96
6. DISCUSSÃO............................................................................................................102
7. EVIDÊNCIAS..........................................................................................................124
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................127
9. PERSPECTIVAS.....................................................................................................129
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................131
11. ANEXO...................................................................................................................149
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
2
1.1 - Aspectos gerais da infecção pelo Trypanosoma cruzi
A doença de Chagas (DCh) causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi,
da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, foi descoberta em 1909 pelo
médico cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas, enquanto trabalhava
no controle de um surto de malária no município de Lassance, MG, durante a
construção da estrada de ferro Central do Brasil. Carlos Chagas descreveu o agente
etiológico da doença, o vetor, os reservatórios silvestres e domésticos, assim como
algumas alterações clínicas e sintomas no hospedeiro humano (CHAGAS, 1909; 1911).
Atualmente, cerca de 7 a 8 milhões de indivíduos estão infectados pelo T. cruzi no
mundo, principalmente na América Latina, onde a doença é endêmica, causando assim
sérias consequências para a saúde pública e a economia nacional (WHO, 2017). O T.
cruzi é um parasito amplamente disperso no continente americano, sendo localizado do
sul dos Estados Unidos até o sul da Argentina, compreendendo 22 países (ZINGALES
et al., 2012). No entanto, nos últimos anos, devido à migração de indivíduos infectados
pelo T. cruzi para países não endêmicos e a falta de controle dos bancos de sangue a
doença de Chagas tem sido disseminada para diversos países de outros continentes
(SCHMUNIS AND YADON, 2010; BENJAMIN et al., 2012; PEREZ-MOLINA et al.,
2012). Nos Estados Unidos têm sido registrados cerca de 300.000 casos, no Canadá
5.500, no Japão 3.000, na Austrália 1.500 casos e na Europa aproximadamente 80.000
indivíduos estão infectados pelo T. cruzi (SCHMUNIS AND YADON, 2010; WHO,
2010).
A transmissão da DCh ocorre principalmente através das fezes e urina dos
triatomíneos contaminadas com as formas tripomastigotas (TRIPO) metacíclicas do T.
cruzi (DIAS, 2000; SCHUMNIS, 2000). No entanto, a incidência de indivíduos
infectados por transmissão vetorial vem diminuindo devido ao sucesso do controle dos
vetores (SCHOFIELD AND DIAS, 1999). Uma vez que o parasito desenvolve uma
infecção de vida longa em humanos, esses indivíduos podem servir como reservatórios,
e assim o risco de transmissão congênita, transmissão por transfusão de sangue
contaminado e transplante de órgãos contaminados (SCHMUNIS AND YADON, 2010;
PEREZ-MOLINA et al., 2012) pode tornar-se um grande problema principalmente em
países não endêmicos (DIAS et al., 2002; COURA AND DIAS, 2009; WHO, 1997).
Além desses mecanismos de transmissão, muitos casos de transmissão da doença de
INTRODUÇÃO
3
Chagas continuam acontecendo por via oral, devido ao intenso extrativismo praticado
no Pará e em toda região da Bacia Amazônica (AGUILAR et al., 2007; VALENTE et
al., 2009).
A distribuição geográfica dos triatomíneos e hospedeiros vertebrados, associados
com a preferência do inseto por fontes sanguíneas, definem dois ciclos de transmissão
do T. cruzi: o ciclo silvestre, envolvendo diferentes espécies de triatomíneos e
mamíferos silvestres, e o ciclo doméstico ou peridoméstico, na qual animais que vivem
dentro das residências e humanos atuam como reservatórios (BUSCAGLIA AND DI
NOIA, 2003; COURA, 2007). Assim, o parasito alterna o seu ciclo de vida entre
vertebrados e insetos vetores, com diferentes estágios de desenvolvimento em cada
hospedeiro (TYLER et al., 2001).
O ciclo de vida do T. cruzi inicia-se quando o triatomíneo durante ou logo após o
repasto sanguíneo no hospedeiro vertebrado, elimina em suas fezes e urina as formas
tripomastigotas metacíclicas do parasito. Essas formas penetram em mucosas ou
ferimentos na pele e infectam células do sistema fagocítico mononuclear mais próximas
do local da picada. Tal penetração do T. cruzi no interior das células hospedeiras é
facilitada por glicoproteínas, proteínas como lectinas, presentes em ambos parasitos e
hospedeiros (YOSHIDA, 2006). O ácido siálico também participa dos processos de
interação do parasito com a célula hospedeira.
As formas tripomastigotas penetram então nas células hospedeiras por mecanismos
que envolvem a interação com lisossomos, e formam o vacúolo parasitóforo
(ANDRADE AND ANDREWS, 2004). Uma vez dentro das células, as formas
tripomastigotas secretam a proteína Tc-Tox, estimuladas pelo baixo pH, levando a
destruição da membrana do vacúolo parasitóforo e liberação dos parasitos no
citoplasma. No citoplasma da célula hospedeira, as formas tripomastigotas se
transformam nas formas amastigotas (AMA), que se multiplicam por divisão binária
simples longitudinal. Após sucessivas divisões das formas amastigotas, elas se
diferenciam nas formas tripomastigotas, que com a ruptura da célula hospedeira caem
no espaço extracelular e disseminam-se pela corrente sanguínea, sendo capazes de
infectar novas células de outros tecidos e órgãos. Quando o triatomíneo alimenta-se do
sangue do hospedeiro vertebrado infectado, os tripomastigotas sanguíneos presentes na
corrente circulatória são transmitidos ao inseto vetor. As formas tripomastigotas
sanguíneas se transformam em formas esferomastigotas no estômago dos triatomíneos,
INTRODUÇÃO
4
que a seguir se transformam em formas epimastigotas (EPI) no intestino, onde se
multiplicam por divisão binária simples longitudinal. Na ampola retal do triatomíneo, as
formas epimastigotas se transformam em formas tripomastigotas metacíclicas que são
eliminadas junto com as fezes e urina do inseto durante ou logo após o repasto
sanguíneo no hospedeiro vertebrado. Essas formas penetram no local da picada do
vetor ou mucosas, fechando assim o ciclo biológico (BRENER, 1973; DIAS, 2000).
Clinicamente a DCh apresenta duas fases sucessivas: a aguda (FA) e a crônica (FC).
A fase aguda dura cerca de 1 a 4 meses e é assintomática ou caracterizada pela presença
de sinais e/ou sintomas inespecíficos tais como: febre, linfadenopatia,
hepatoesplenomegalia, miocardite, e outros (RASSI et al., 2010), podendo ainda ser
oligossintomática. Alguns pacientes apresentam, no entanto, os sinais de porta de
entrada característicos da fase aguda: o sinal de Romanã (ROMAÑA, 1935) e/ou
chagoma de inoculação (MAZZA & FREIRE, 1940). Na fase aguda, o T. cruzi é
encontrado com maior frequência na circulação (parasitemia patente), em relação à fase
crônica, e por isso o diagnóstico é realizado principalmente pela demonstração direta do
parasito no sangue, tais como por exame de sangue a fresco, além do esfregaço
sanguíneo ou gota espessa. Nessa fase, os níveis de anticorpos IgM estão elevados e
desaparecem ao longo da fase crônica. Os anticorpos IgG também estão presentes,
reduzindo mais tardiamente, porém permanecem ao longo da fase crônica em níveis
variáveis dependendo do paciente. Ambos os anticorpos podem ser detectados por
métodos de diagnóstico, denominados métodos sorológicos convencionais.
A fase crônica da DCh apresenta longa duração e é caracterizada pela escassez
de parasitos na circulação (parasitemia subpatente). Devido a este fato, o diagnóstico é
realizado principalmente por métodos sorológicos de pesquisa de anticorpos IgG anti-T.
cruzi (SÁNCHEZ et al., 2008). Na fase crônica, cerca de 70% dos indivíduos não
desenvolvem doença clínica aparente, caracterizando a forma clínica indeterminada da
doença de Chagas. Nessa forma clínica, o paciente apresenta exames sorológicos
positivos e parasitológicos positivos ou negativos, ausência de sintomas e/ou sinais
clínicos da doença, ou seja, eletrocardiograma convencional normal e coração, esôfago
e cólon radiologicamente normais (DIAS, 1995; RASSI et al., 2010). Após um longo
período assintomático, cerca de 30% dos pacientes desenvolvem a forma clínica
cardíaca, digestiva ou mista (PRATA, 1990; DIAS, 1995; RASSI et al., 2010).
INTRODUÇÃO
5
A forma cardíaca é caracterizada por alterações anátomo-histopatológicas e
funcionais do coração. Nessa forma, ocorrem complicações relacionadas à alterações no
ritmo cardíaco e na condução do impulso nervoso no coração causando alterações
eletrocardiográficas de maior ou menor gravidade (arritmias, extra-sístoles bloqueios,
acompanhadas ou não do quadro de insuficiência cardíaca congestiva) (COURA et al.,
2012; RASSI et al., 2013).
Já a forma digestiva é caracterizada por alterações anátomo-histopatológicas e
funcionais do esôfago e/ou cólon (megaesôfago e/ou megacólon). Na forma mista,
ocorre o acometimento tanto do coração quanto do esôfago e/ou cólon. Admite-se que a
cepa do parasito e características biológicas associadas com a sua genética, sejam os
maiores e mais importantes fatores envolvidos na gênese da patologia da DCh, e no
desenvolvimento de suas manifestações clínicas (DIAS et al., 2000).
Variações geográficas na prevalência das formas clínicas e morbidade da doença
de Chagas em diferentes países têm sido registradas (DIAS et al., 1992). No Brasil
predomina a forma indeterminada, seguida pela cardíaca, digestiva e mista. No Brasil
Central e no Chile predomina a forma digestiva, enquanto esta é praticamente
inexistente na Venezuela e na América Central (LUQUETTI et al., 1986; DIAS, 1992).
Embora os fatores que determinam essa heterogeneidade clínica da doença de Chagas
não estão completamente elucidados, sugere-se que o curso clínico distinto da infecção
pelo T. cruzi pode estar associado com a diversidade genética do parasito nas Américas
(ZINGALES et al., 2012). Os fatores ambientais, além do estado nutricional e
imunológico do hospedeiro também podem estar relacionados a essa variabilidade
clínica (MACEDO et al., 2004).
1.2-Variabilidade genética do T. cruzi e sua correlação com os diferentes aspectos
de sua biologia e da doença de Chagas
Com o objetivo de padronizar a nomenclatura dos grupos do T. cruzi e facilitar
assim a comunicação entre os pesquisadores visando o entendimento e sua correlação
com a biologia do parasito, com os aspectos eco-epidemiológicos e com a
patogenicidade de seus grupos genéticos e consequentemente com a evolução clínica da
doença de Chagas, foi realizado em 2009, na cidade de Búzios, Rio de Janeiro, o
Segundo Consenso Taxonômico do T. cruzi. Neste encontro, o T. cruzi foi subdividido
INTRODUÇÃO
6
em seis grupos genéticos distintos, ―Discrete Typing Unity‖ (DTUs), que são o conjunto
de cepas que são geneticamente mais relacionadas entre si do que qualquer outra cepa e
que são identificadas por marcadores genéticos, moleculares e imunológicos comuns
(TIBAYRENC, 1998), denominados: TcI (correspondente ao Z1 de MILES et al., 1981,
linhagem II de SOUTO et al., 1996, T. cruzi I de ANONYMOUS et al., 1999 e a DTU I
de BRISSE et al., 2000), TcII (correspondente ao Z2 de MILES et al., 1981, linhagem I
de SOUTO et al., 1996, T. cruzi II de ANONYMOUS et al., 1999 e a DTU IIb de
BRISSE et al., 2000), TcIII (correspondente ao Z3/Z1 de MILES et al., 1981; DTU IIc
de BRISSE et al., 2000 e T. cruzi III de FREITAS et al., 2006), TcIV (correspondente
ao Z3 de MILES et al., 1981 e DTU IIa de BRISSE et al., 2000), TcV (correspondente
ao Z2b de MILES et al., 1981, grupo 1/2 de SOUTO et al., 1996 e DTU IId de BRISSE
et al., 2000) e TcVI (correspondente ao ZB de ROMANHA, 1982, linhagem I de
SOUTO et al., 1996 e DTU IIe de BRISSE et al., 2000) (ZINGALES et al., 2009).
Diversos estudos vêm associando a genética do T. cruzi com as características
biológicas do parasito: infectividade, parasitemia, tropismo tecidual, mortalidade
durante a fase aguda da infecção em camundongos (ANDRADE, 1974; ANDRADE
AND MAGALHÃES, 1997; LAURENT et al., 1997; TOLEDO et al., 2002;
ANDRADE et al., 2010), susceptibilidade/resistência à drogas em modelos murinos
(ANDRADE, 1985; FILARDI AND BRENER, 1987; ANDRADE et al., 1992;
TOLEDO et al., 2003; TESTON et al., 2013; OLIVEIRA-SILVA et al., 2015) e
infectividade, replicação e diferenciação no vetor (LANA et al., 1998). A variabilidade
genética do T. cruzi também têm sido associada com as características epidemiológicas
(MILES et al., 2009; ZINGALES et al., 2012; TIBAYRENC AND AYALA, 2015) e
com as manifestações clínicas da doença de Chagas (LAGES-SILVA et al., 2006;
VIRREIRA et al., 2006; VALADARES et al., 2007), aspecto ainda bem controverso
entre diversos autores (VAGO et al., 2000; LAGES-SILVA et al., 2006; D´ÁVILLA et
al., 2009).
Trabalho prévios demonstraram que a DTU TcI apresentou maior capacidade de
multiplicação e sobrevivência em cultura celular e acelular do que a DTU TcII, quando
foram avaliados o comportamento biológico de clones (LAURENT et al., 1997;
REVOLLO et al., 1998; ANDRADE et al., 2010) e cepas do T. cruzi (ANDRADE
AND MAGALHÃES, 1997; RIMOLDI et al., 2012; NOGUEIRA-PAIVA et al., 2015),
embora tenham sido demonstrados resultados contraditórios com isolados do parasito de
INTRODUÇÃO
7
pacientes chagásicos crônicos (OLIVEIRA et al., 2017). Clones da TcI também
apresentaram maior capacidade de infectar e completar o seu ciclo de vida no vetor
(LANA et al., 1998). Além do mais, cepas da TcI apresentaram maior capacidade de
infectar animais de experimentação, desenvolvendo neles parasitemia mais elevada e
infecção mais severa (ANDRADE, 1985; ANDRADE AND MAGALHÃES, 1997). No
entanto, alguns trabalhos demonstraram que cepas (SALES-CAMPOS et al., 2015) e
isolados do T. cruzi de pacientes chagásicos crônicos do genótipo TcI desenvolveram
parasitemia subpatente em camundongos (OLIVEIRA et al., 2017).
Em infecções experimentais, camundongos infectados com clones pertencentes ao
genótipo 19 (T. cruzi I-TcI) tratados, foram parcialmente susceptíveis ao tratamento
com benzonidazol (BZ) e resistentes ao tratamento com itraconazol na FA e na FC. Já
clones do genótipo 20 (TcI), foram resistentes aos dois fármacos em ambas as fases da
infecção (TOLEDO et al., 2003). Clones pertencentes aos genótipos 19/20 (TcI) foram
menos sensíveis ao tratamento com BZ e nifurtimox (NF) in vitro (REVOLLO et al.,
1998). A cepa Colombiana (COL) (TcI), resistente ao BZ e NF em modelo murino,
ambas isoladas de humanos (FILARDI AND BRENER, 1987), mostraram resultados
similares quando estudadas no modelo cão (GUEDES et al., 2002).
A DTU TcI está relacionada tanto ao ciclo doméstico quanto ao silvestre da
infecção, sendo que os casos humanos são predominantes na América Central e em
países do norte da América Sul (ZINGALES et al., 2012; TIBAYRENC AND AYALA,
2015, MESSENGER et al., 2015). Além do mais, TcI é o principal agente da doença de
Chagas no norte da Amazônia (CARASCO et al., 2012). A maioria dos surtos de
infecção oral na região Amazônica foram devidos à TcI (COURA, 2006; VALENTE et
al., 2009) e também mais recentemente à TcIV (COURA et al., 2002; VALENTE et al.,
2009; MONTEIRO et al., 2012).
A DTU TcI está associada com a doença de Chagas menos grave clinicamente,
incluindo casos raros de cardiomiopatia chagásica, principalmente nos países da
América Central e na bacia Amazônica, e com menos frequência no Brasil central e no
Cone Sul (MILES et al., 2009; RAMÍREZ et al., 2010; CARRASCO et al., 2012;
ZINGALES et al., 2012; GUHL AND RAMÍREZ, 2013), e ainda associada à eventos
severos de meningoenceflite em hospedeiros imunocomprometidos.
Em contraste à DTU TcI, diversos trabalhos demonstraram que clones (LAURENT
et al., 1997; REVOLLO et al., 1998; ANDRADE et al., 2010) e cepas (ANDRADE
INTRODUÇÃO
8
AND MAGALHÃES, 1997; RIMOLDI et al., 2012; NOGUEIRA-PAIVA et al., 2015)
pertencentes à DTU TcII apresentaram menor capacidade de multiplicação em cultura
celular e acelular, clones da TcII demonstraram menor capacidade de infectar e
completar o seu ciclo de vida no vetor (LANA et al., 1998) e cepas da TcII revelaram
menor capacidade de infectar animais de experimentação (ANDRADE, 1985;
ANDRADE AND MAGALHÃES, 1997), embora algumas cepas como a VL-10 (TcII)
são altamente virulentas e produzem intensa reação inflamatória no modelo murino
(CALDAS et al., 2014) e em cães (CALDAS et al., 2013). Em infecções experimentais,
camundongos infectados com clones do genótipo 32 (equivalente a TcII) tratados, foram
susceptíveis ao tratamento com BZ em ambas as fases da infecção, ao itraconazol na
FC, e parcialmente susceptíveis ao itraconazol na FA (TOLEDO et al., 2003). A cepa Y
(parcialmente resistente ao BZ e NF), em modelo murino, ambas isoladas de humanos,
(FILARDI & BRENER, 1987) mostraram resultados similares quando estudadas no
modelo cão (GUEDES et al., 2002). Essa DTU está amplamente relacionada ao ciclo
doméstico da infecção, sendo predominante no sul da América Latina, especialmente na
região central, sul e sudeste do Brasil, onde as manifestações cardíacas, megacólon e
megaêsofago são quase exclusivamente ligadas à TcII (LAGES-SILVA et al., 2006;
ZINGALES et al., 2012; TIBAYRENC & AYALA, 2015).
As DTUs TcIII e TcIV são predominantemente relacionadas ao ciclo silvestre da
infecção, sendo que a TcIII se distribui no Brasil e no sudoeste da América do Sul e a
TcIV no sul dos Estados Unidos e no norte da América do Sul (ZINGALES et al., 2012;
TIBAYRENC & AYALA, 2015). A TcIII não é comum em infecções crônicas, porém
já existem relatos da presença dessa DTU no ciclo peridoméstico da doença de Chagas e
infectando humanos (D´ÁVILLA et al., 2009; RAMÍREZ et al., 2010; MONJE-RUMI
et al., 2015). Uma característica importante da TcIV é que esse grupo genético é a
segunda maior causa da doença de Chagas na Venezuela (ZINGALES et al., 2012) e
tem sido associado à surtos de infecção oral na região Amazônica (COURA et al., 2002;
VALENTE et al., 2009; MONTEIRO et al., 2012).
Em contraste às DTUs TcIII e TcIV, as DTUs TcV e TcVI, também híbridas, são
predominantemente associadas ao ciclo doméstico da infecção. O genótipo TcV está
presente no sudoeste da América do Sul e o genótipo TcVI no centro e sudoeste da
América do Sul (ZINGALES et al., 2012; MONJE-RUMI et al., 2015; TIBAYRENC &
AYALA, 2015). A DTU TcV está envolvida em infecções humanas na região do Chaco
INTRODUÇÃO
9
e em países vizinhos, como Bolívia, Chile, norte da Argentina e Sul do Brasil. Além do
mais, a TcV está associado com o megacólon na Bolívia e com a transmissão congênita
na Argentina, Bolívia e sul do Brasil (VIRREIRA et al., 2006; VALADARES et al.,
2007). A TcVI está associado com a doença de Chagas aguda e crônica severa na região
Cone Sul (MILES et al., 2009; ZINGALES et al., 2012; MONJE-RUMI et al., 2015).
Evidências de trocas genéticas entre os parasitos têm contribuído para a estrutura da
população presente (STURM AND CAMPBELL, 2010). A heterozigose observada nas
DTUs TcV e TcVI sugerem que esses grupos genéticos são híbridos e derivados de TcII
e TcIII (STURM AND CAMPBELL, 2010). Dois modelos explicam a estrutura da
população existente que incluem os híbridos, o primeiro é o Modelo dos Três
Ancestrais: ao qual sugere a divisão do T. cruzi em três grupos ancestrais, TcI, TcII e
TcIII, sendo que eventos de trocas genéticas recentes entre TcII e TcIII deram origem à
TcV e TcVI (FREITAS et al., 2006). O segundo é o Modelo de Duas Hibridizações: em
que um evento de troca genética ancestral entre TcI e TcII, com perda da heterozigose
entre a progênie, produziram TcIII e TcIV, seguida por um segundo evento de
hibridização mais recente entre TcII e TcIII, resultando em TcV e TcVI
(WESTENBERGER et al., 2005).
1.3- Infecções mistas do T. cruzi
A existência de infecções mistas, muito observada em infecções naturais,
(BRENIÉRE et al., 1985; TIBAYRENC et al., 1985, SOLARI et al., 2001;
MANTILLA et al., 2010; MONJE-RUMI et al., 2015) têm sido estudada
experimentalmente em hospedeiros vertebrados e invertebrados (DEANE et al., 1984;
PINTO et al., 1998, 2000; LANA et al., 2000; BOSSENO et al., 2000; MARTINS et
al., 2006; 2007; ARAÚJO et al., 2007; LO PRESTI et al., 2014). Indivíduos que vivem
em áreas endêmicas são provavelmente submetidos a várias re-infecções que resultam
em diferentes populações do T. cruzi ao longo do curso da doença (BOSSENO et al.,
1996; BRENIÉRE et al., 1998; LEHANE et al., 2000). Assim, infecções mistas podem
ter consequências para a morbidade, a dinâmica de transmissão do parasito e a resposta
à quimioterapia (MARTINS et al., 2007).
As características resultantes das infecções mistas diferem daquelas observadas
nas infecções monoclonais correspondentes (MARTINS et al., 2006, 2007), e estes
INTRODUÇÃO
10
autores observaram que a interação entre os clones pode resultar em mudanças
significativas na relação parasito-hospedeiro. Nas infecções mistas, ocorre uma
interação entre as subpopulações das misturas e não apenas uma justaposição das suas
características, resultando assim em mudanças nas propriedades biológicas dos parasitos
em associação (DEANE et al., 1984; PINTO et al., 1998; DA SILVEIRA PINTO et al.,
2000; MARTINS et al., 2006, 2007; RAGONE et al., 2012). A interação entre as
populações naturais do T. cruzi leva à ocorrência predominante de parasitos com
propriedades mais adaptadas ao desenvolvimento nos hospedeiros (LAURIA-PIRES
AND TEIXEIRA, 1996) ou em condições de cultivo (LAURIA-PIRES et al., 1997).
Alguns trabalhos demonstraram que clones do T. cruzi com menor habilidade de se
desenvolverem em hospedeiros vertebrados e invertebrados em infecções monoclonais,
são capazes de se multiplicarem e permanecerem em infecções mistas (PINTO et al.,
1998; DA SILVEIRA et al., 2000; LANA et al., 2000; MARTINS et al., 2006).
Os trabalhos de MARTINS et al. (2007) demonstraram ainda a ocorrência de
mudanças no perfil de susceptibilidade ao benzonidazol nas infecções mistas quando
comparadas às respectivas monoinfecções, em camundongos infectados
experimentalmente. Assim, pode ser ainda mais difícil correlacionar a genética do T.
cruzi com a resposta ao tratamento, em infecções mistas. Nesse caso, o tratamento é
mais complexo do que nas monoinfecções devido à possibilidade de interação entre as
populações envolvidas, resultando por sua vez em novo padrão de
resistência/suceptibilidade às drogas. Os resultados contraditórios obtidos no tratamento
humano por diferentes autores, provavelmente são influenciados pelas infecções mistas
(BRENIÈRE et al., 1998).
O comportamento de infecções mistas foi também avaliado in vitro e no
triatomíneo vetor (PINTO et al., 1998; 2000; LANA e tal., 2000; ARAÚJO et al.,
2007). Os isolados da infecção mista apresentaram um tempo de multiplicação e uma
densidade populacional intermediária, em relação aos isolados das monoinfecções, além
do mais, a co-infecção resultou em um padrão de colonização diferente no trato
intestinal dos triatomíneos, quando comparado às monoinfecções (ARAÚJO et al.,
2007).
Alguns trabalhos demonstraram experimentalmente e em humanos, que
infecções mistas por diferentes DTUs do T. cruzi apresentaram distinto tropismo dentro
de um mesmo hospedeiro, sendo um fator determinante do curso clínico da doença de
INTRODUÇÃO
11
Chagas. Diferentes populações do parasito também foram encontradas na circulação e
nos tecidos dos hospedeiros, os quais podem variar ao longo da infecção, (MACEDO
AND PENA, 1998; VAGO et al., 2000; MANTILLA et al., 2010; LO PRESTI et al.,
2014; SALES-CAMPOS et al., 2014) o que levou a criação do termo ―modelo
histiotrópico clonal‖ para o T. cruzi (MACEDO AND PENA, 1998; MACEDO et al.,
2002). Este aspecto deve ser considerado quando amostras de parasitos são isolados de
pacientes portadores de infecções mistas ou policlonais por hemocultura e/ou
xenodiagnóstico. Além do mais, espera-se que as populações de parasitos com elevada
parasitemia serão mais facilmente isoladas do que aquelas de grupos genéticos ou DTUs
de baixa parasitemia e infectividade, para vetores, ou menor capacidade de se
desenvolverem no hospedeiro invertebrado (LANA et al., 1998, PINTO et al., 1998;
LANA et al., 2000).
SALES-CAMPOS et al. (2014) avaliaram o parasitismo sanguíneo e tecidual de
camundongos co-infectados com uma cepa TcII e duas cepas TcI durante as fases aguda
e crônica e durante a imunossupressão. Os autores observaram a prevalência de
populações sanguíneas do T. cruzi TcII durante as fases aguda, crônica e na
imunossupressão. Já nos tecidos, as populações foram distribuídas de acordo com a
cepa e a fase da infecção: na fase aguda houve uma predominância da cepa da DTU
TcII, em contraste, na fase crônica a cepa da TcI foi mais prevalentes do que a da TcII.
Na imunossupressão, houve uma exacerbação seletiva de populações do parasito,
previamente controladas pela resposta imune do hospedeiro. Nesse contexto, quando se
realiza a genotipagem das diferentes DTUs do T. cruzi é necessário considerar que os
parasitos que foram isolados do sangue, podem não representar o conjunto completo de
linhagens que infectam os indivíduos, devido ao distinto tropismo dos genótipos em um
mesmo hospedeiro nas infecções mistas. Consequentemente, as populações isoladas e
disponíveis para análise podem diferir daquelas que causam lesão tecidual (VAGO et
al., 2000; MACEDO et al., 2004; MANTILLA et al., 2010; LO PRESTI et al., 2014;
SALES-CAMPOS et al., 2014), consequência do modelo histiotrópico clonal proposto
por MACEDO et al. (2002).
Alguns métodos moleculares são capazes de genotipar o T. cruzi diretamente de
amostras biológicas, tais como pela PCR primer específico único de baixa adstringência
(LSSP-PCR) (VAGO et al., 2000; LAGES-SILVA et al., 2006), pela análise do
polimorfismo do rDNA (FREITAS et al., 2005; BURGOS et al., 2007) e pela análise do
INTRODUÇÃO
12
polimorfismo de microssatélites (BURGOS et al., 2008; VALADARES et al., 2008),
sendo estas abordagens importantes para o melhor entendimento da patogênese da
doença de Chagas.
1.4- Diagnóstico da doença de Chagas na fase crônica
1.4.1- Testes parasitológicos
A fase crônica da doença de Chagas é caracterizada pela baixa parasitemia
devido à persistente resposta imune do hospedeiro. Assim, o diagnóstico nessa fase
pode ser realizado por métodos parasitológicos indiretos ou moleculares, como descritos
a seguir.
1.4.1.1- Xenodiagnóstico
O xenodiagnóstico foi descrito inicialmente por BRUMPT em 1914 e
padronizado por CERISOLA em 1974 (SCHENONE et al., 1968; CERISOLA et al.,
1974). No xenodiagnóstico convencional são utilizados triatomíneos não infectados
para sugar diretamente o sangue do paciente. Já no xenodiagnóstico artificial o sangue
do paciente é coletado previamente e então oferecido aos triatomíneos por meio de um
dispositivo adequado. O xenodiagnóstico artificial é utilizado quando o paciente é
alérgico à picada e à saliva do triatomíneo, e em experimentos com inóculo
padronizado. Para a realização do xenodiagnóstico é recomendado que as espécies de
triatomíneos utilizadas tenham a mesma origem geográfica do paciente, levando em
consideração a adaptação parasito-hospedeiro adquirida a longo prazo.
A sensibilidade dessa técnica varia de 30 a 50%, dependendo da região, da
quantidade de insetos utilizados, do estágio da ninfa e da espécie do triatomíneo
(CERISOLA et al., 1974; BORGES AND COURA, 1987; PEREIRA et al., 1996;
MOREIRA AND PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, 1997; SCHENONE et al.,
2000). A sensibilidade da técnica pode ser aumentada por meio da inoculação do
conteúdo intestinal dos triatomíneos em animais de laboratório e posterior análise, e
ainda por meio da xenocultura destes insetos (BRONFEN AND ALVARENGA, 1991).
Devido à baixa sensibilidade da técnica, o xenodiagnóstico não deve ser utilizado como
INTRODUÇÃO
13
único método de diagnóstico da doença de Chagas, pois os resultados negativos podem
refletir períodos de parasitemia não detectável em pacientes crônicos (CANÇADO,
1985). Algumas desvantagens da utilização do xenodiagnóstico no diagnóstico da
doença de Chagas são: a baixa sensibilidade, o longo tempo necessário para a sua
realização, o alto custo operacional para manutenção das colônias, a dificuldade de
padronização dessa metodologia e a necessidade de manutenção em laboratório de
espécies de triatomíneos adequadas para a realização do exame (SCHENONE et al.,
1974; MOTT et al., 1980; BRONFEN AND ALVARENGA, 1991).
1.4.1.2- Hemocultura
A hemocultura é utilizada desde a década de 50, com resultados inicialmente
inferiores ao xenodiagnóstico (PIFANO, 1954; CHIARI AND BRENER, 1966). Essa
técnica pode alcançar de 55 a 79% de positividade (CHIARI AND BRENER, 1966;
CHIARI et al., 1989; BRENER et al., 1993). Modificações implementadas como a
retirada do plasma, coleta de um volume maior de sangue (30 ml), processamento das
amostras a 4°C, maior número de tubos coletados e avaliação até 90 dias pós-cultura,
contribuíram para aumentar a sensibilidade dessa metodologia (CHIARI et al., 1989;
LUZ et al., 1994). A repetição da técnica e a realização do xenodiagnóstico em paralelo
contribuem para aumentar o percentual de resultados positivos (CASTRO et al., 2005).
A hemocultura não deve ser utilizada como único método de diagnóstico da doença de
Chagas, pois na fase crônica, os resultados negativos podem refletir períodos de baixa
parasitemia (BRENER, 1973; CANÇADO, 1985), de modo semelhante ao observado
no xenodiagnóstico. As vantagens da utilização da hemocultura são: a alta
especificidade e a possibilidade de isolamento e crescimento dos parasitos em meios de
cultura, permitindo assim a caracterização genética e bioquímica dos isolados, além da
preparação de diferentes antígenos. As desvantagens de se utilizar essa técnica são: a
baixa sensibilidade, a necessidade de coleta de um grande volume de sangue do paciente
e o longo tempo necessário para a sua realização e para obtenção dos resultados
(COURA AND CASTRO, 2002).
1.4.2- Método molecular: reação em cadeia da polimerase (PCR)
INTRODUÇÃO
14
A PCR é capaz detectar o kDNA (DNA do cinetoplasto), o DNA nuclear ou o
RNA do T. cruzi previamente extraído da amostra do paciente (BRITTO et al., 1995;
SOLARI et al., 2001; GALVÃO et al., 2003; ZULANTAY et al., 2004; BRITTO,
2009; MURCIA et al., 2010). Os principais alvos de amplificação desta técnica são as
regiões variáveis do kDNA dos minicírculos, podendo ser utilizadas amostras de
sangue, tecidos e fluidos, como também o conteúdo intestinal dos triatomíneos, sendo
capaz de detectar até 1 fentograma do DNA da amostra. Essa técnica, quando utilizada
no diagnóstico da doença de Chagas, se positiva, indica a presença da infecção pelo T.
cruzi, porém quando negativa nem sempre indica a ausência da infecção devido à
oscilação dos níveis de parasitemia em pacientes chagásicos crônicos, devendo ser
realizado outros testes sorológicos ou parasitológicos em paralelo (GALVÃO et al.,
2003). A sensibilidade da PCR pode variar de 45 a 86% no sangue de pacientes
chagásicos crônicos quando comparados aos testes sorológicos, hemocultura ou
xenodiagnóstico (JUNQUEIRA et al., 1996; BRITTO, 2009). No entanto, a
sensibilidade da PCR depende dos níveis parasitêmicos, do volume de sangue coletado,
dos iniciadores utilizados e das características genéticas de cepas do T. cruzi envolvidas
(CASTRO et al., 2002; MARTINS et al., 2008; MYAMOTO et al., 2008; MILES et al.,
2009; RAMIRÉZ et al., 2009; ZINGALES et al., 2012). Algumas desvantagens da
utilização da PCR são: a necessidade de operadores bem treinados para a realização da
técnica, os resultados discordantes entre os testes realizados com as mesmas amostras e
os resultados discordantes com os testes sorológicos e parasitológicos (BRITTO, 2009,
BRASIL et al., 2010), além do alto custo operacional. Devido à dificuldade de se
detectar os parasitos no sangue pela PCR em alguns indivíduos com baixa parasitemia,
uma alternativa é utilizar a técnica de concentração dos parasitos, empregando ligantes
específicos com grande afinidade e especificidade pelas formas tripomastigotas do T.
cruzi, como os aptâmeros de RNA. Esses aptâmeros são pequenas sequências de
nucleotídeos incorporadas em ―beads‖ paramagnéticas, que se ligam à superfície das
fromas tripomastigotas, capturando e concentrando os parasitos para serem analisados
pela PCR (NAGARKATTI et al., 2012).
A técnica de PCR Real-Time (qPCR) é capaz de amplificar sequências de DNA
satélite do genoma do T. cruzi (PIRON et al., 2007; DUFFY et al., 2009; MOREIRA et
al., 2013). Essa técnica foi descrita inicialmente por PIRON et al. (2007) e apresenta
como vantagens: a quantificação do DNA presente na amostra, possibilitando assim
INTRODUÇÃO
15
estimar os níveis de parasitemia de um paciente chagásico, além do mais essa técnica
apresenta alta sensibilidade. A qPCR apresenta um limite de detecção de 0,1 a 0,01
parasitos/ml e uma eficácia de 99%. Alguns trabalhos demonstraram que a qPCR
apresentou bons resultados na quantificação do T. cruzi, em amostras de sangue
periférico de pacientes infectados (PIRON et al., 2007; DUFFY et al., 2009, CALDAS
et al., 2012; DUFFY et al., 2013; MOREIRA et al., 2013). CALDAS et al. (2012)
observaram que a qPCR foi eficaz para estimar a parasitemia, com uma correlação
significativa entre a carga parasitária encontrada no sangue e no tecido cardíaco de
camundongos tratados e não tratados, durante as fases aguda e crônica da infecção pelo
T. cruzi. Essa metodologia tem sido utilizada na avaliação de infecções recentes por
transmissão oral ou transmissão congênita, no acompanhamento de pacientes
transplantados, na avaliação pós-terapêutica de pacientes chagásicos e para estimar a
parasitemia em indivíduos co-infectados com T. cruzi/HIV (DUFFY et al., 2009; DE
FREITAS et al., 2011; DUFFY et al., 2013; MOREIRA et al., 2013). A qPCR foi capaz
de detectar variações nas sequências de DNA satélite de diferentes grupos genéticos do
T. cruzi, de maneira que essa variabilidade deve ser levada em consideração na
estimativa da carga parasitária. Essa técnica apresentou uma diferente sensibilidade
entre as distintas DTUs do parasito: TcI < TcII < TcV e TcVI (DUFFY et al., 2009).
Os métodos moleculares têm sido utilizados no diagnóstico genótipo-específico
da doença de Chagas na identificação das seis DTUs do T. cruzi (ZINGALES et al.,
2012). No entanto, nenhum desses métodos quando utilizados individualmente permite
a completa resolução das DTUs, sendo necessária uma combinação de marcadores
genéticos sequenciais para confirmar o genótipo do T. cruzi (LEWIS et al., 2009;
D’ÁVILLA et al., 2009; ZINGALES et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2015),
principalmente quando se trata de infecções mistas, policlonais e híbridas.
Duas estratégias de genotipagem do parasito têm sido comumente utilizadas: a
primeira é o método de LEWIS et al. (2009), que tem como princípio à análise da
variabilidade na sequência do domínio divergente D7, do gene ribossômico da
subunidade 24Sα (24SαrRNA) (LSU-rDNA) (SOUTO et al., 1996) e duas tipagem do
polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição do DNA do cinetroplasto
(kDNA), dos mincírculos (RFLP), por meio da PCR (PCR-RLFP), da proteína de
choque térmico 60 (HSP60) e da glicose-6-fosfato-isomerase (GPI). A combinação
dessas três metodologias apresentou uma boa capacidade de tipagem da maioria das
INTRODUÇÃO
16
cepas, com um poder discriminatório adequado e boa reprodutibilidade (LEWIS et al.,
2009).
A segunda estratégia de genotipagem é baseada na análise do polimorfismo do
gene mitocondrial da citocromo oxidase subunidade II, pela RFLP-PCR (FREITAS et
al., 2006), do espaçador intergênico SL-IL do mini-exon (BURGOS et al., 2007) e na
LSU-rDNA (D´ÁVILLA et al., 2009). Esse critério apresenta também uma boa
reprodutibilidade, além de ser capaz de identificar possíveis infecções mistas de
diferentes genótipos do T. cruzi (ANDRADE et al., 2011).
No entanto, uma das desvantagens desses métodos consiste no fato que a maioria
deles não pode ser realizado diretamente em amostras biológicas e clínicas,
necessitando de um isolamento prévio do parasito por hemocultura e/ou
xenodiagnóstico, ambos com baixa sensibilidade na fase crônica. Além do mais, o
crescimento ―in vitro” dos parasitos isolados pode levar a uma seleção clonal (DEANE
et al., 1984; LAURIA-PIRES et al., 1997; BOSSENO et al., 2000; ORTIZ et al., 2015).
Outra desvantagem em relação à genotipagem do T. cruzi por métodos moleculares é
que os isolados do parasito do sangue podem não necessariamente representar o
conjunto completo de linhagens que infectam os indivíduos, tendo em vista que mais de
uma cepa pode estar confinada nos tecidos, consequência do modelo histiotrópico clonal
admitido para esse parasito (VAGO et al., 2000; D´AVILLA et al., 2009; BURGOS et
al., 2010; MACEDO et al., 2004; MANTILLA et al., 2010; LO PRESTI et al., 2014;
SALES-CAMPOS et al., 2014).
Apesar da existência de um grande número de métodos moleculares de
genotipagem das DTUs do parasito, pesquisas são necessárias a fim de otimizar a
sensibilidade e simplificar o procedimento experimental dessas metodologias para
serem utilizadas em laboratórios clínicos. Uma solução para esse problema seria
desenvolver uma sorologia genótipo-específica com peptídeos ou proteínas
recombinantes, que possam fornecer um perfil histórico/atual de todas as DTUs do T.
cruzi que infectam os indivíduos (BHATTACHARYYA et al., 2010; MENDES et al.,
2013; BHATTACHARYYA et al., 2014, 2105).
1.4.3- Testes sorológicos
INTRODUÇÃO
17
Devido à baixa parasitemia (subpatente) comum na fase crônica da doença de
Chagas e os elevados níveis de anticorpos IgG, o diagnóstico da infecção humana é
realizado principalmente pelos métodos sorológicos convencionais e não convencionais.
Os testes sorológicos convencionais, rotineiramente aplicados para a sorologia da
doença de Chagas em laboratórios clínicos, compreendem os métodos baseados na
detecção de anticorpos IgG anti-formas epimastigotas do T. cruzi por diferentes
técnicas, tais como: o ―enzime-linked immunosorbent assay‖ (ELISA), a
imunofluorescência indireta (IFI) e a hemaglutinação indireta (HAI).
Os métodos sorológicos não convencionais, comumente utilizados em laboratórios
de referência ou de pesquisa, incluem aqueles testes baseados na detecção de anticorpos
líticos pela técnica de lise mediada por complemento (LMCo) (KRETTLI AND
BRENER,1982), análogos a detecção dos anticorpos anti-tripomastigotas vivos pela
citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995; CORDEIRO et al., 2001;
MARTINS-FILHO et al., 2002; ALESSIO et al., 2014, LANA AND MARTINS-
FILHO, 2015). Por meio da citometria de fluxo, podem ainda ser detectados anticorpos
anti-formas epimastigotas fixadas (VITTELI-AVELAR et al., 2007; TEIXEIRA-
CARVALHO et al., 2015) e anti-formas amastigotas vivas (ALESSIO et al., 2014),
cujas metodologias foram descritas a seguir.
Para o diagnóstico da doença de Chagas na fase crônica, são utilizados como padrão
ouro os testes sorológicos convencionais: ELISA, HAI e IFI. Esses testes são baseados
na detecção de anticorpos circulantes, principalmente contra antígenos brutos das
formas epimastigotas do T. cruzi provenientes de diferentes processos de obtenção, ou
antígenos recombinantes (UMEZAWA et al., 1999; LUQUETTI AND RASSI, 2002;
UMEZAWA et al., 2004). Devido ao fato de nenhum teste sorológico apresentar
sensibilidade e especificidade ótima (100%), a Organização Mundial de Saúde e o
Ministério da Saúde no Brasil recomendam a utilização em paralelo de pelo menos dois
testes sorológicos de princípios distintos para confirmar a infecção pelo T. cruzi (MS,
1998; WHO, 2002). A fim de aumentar a sensibilidade e a especificidade dos testes,
várias estratégias são utilizadas, tais como: a utilização simultânea de mais de um teste
com diferentes antígenos e/ou mecanismos de reação, a utilização de bons controles
positivos e negativos, a repetição dos testes com as mesmas amostras, a repetição dos
testes com outras amostras do mesmo paciente, a utilização de bons reagentes e
antígenos, o treinamento contínuo dos operadores e a utilização de um bom controle de
INTRODUÇÃO
18
qualidade. Se não houver concordância entre dois métodos sorológicos, o diagnóstico
parasitológico (hemocultura e ou PCR) deve ser realizado como uma alternativa para o
diagnóstico da doença de Chagas.
A técnica de HAI foi descrita por CERISOLA et al. (1962) e otimizada por
CAMARGO et al. (1971) para o diagnóstico da doença de Chagas. Essa técnica
apresenta como vantagens a sua facilidade de execução, não necessitando de
equipamentos especializados, e a rapidez da leitura (1 a 2h), sendo um dos testes
sorológicos mais utilizados em laboratórios clínicos. A automatização desta técnica tem
favorecido a avaliação de um grande número de amostras de soros simultaneamente.
Apesar da alta especificidade da HAI, ela apresenta uma baixa sensibilidade (cerca de
20%), dependendo do fabricante. Além do mais, a leitura do teste depende de um
examinador bem treinado e podem ocorrer reações cruzadas que são comuns com outras
espécies da família Trypanosomatidae (GADELHA et al., 2003).
O teste de IFI foi introduzido por CAMARGO et al. (1966) para o diagnóstico da
doença de Chagas. Esse teste apresenta uma elevada sensibilidade e especificidade,
quando realizado por um operador bem treinado. Conjugados específicos podem ser
utilizados na IFI. As desvantagens desta técnica são: a leitura depende de um
microscópio de imunofluorescência, a condição dos antígenos e reagentes podendo
interferir nos resultados e a necessidade de um observador bem treinado, podendo levar
a erros na interpretação dos resultados.
A técnica de ELISA, para o diagnóstico da doença de Chagas, foi padronizada por
VOLLER (1975). Essa técnica apresenta uma alta sensibilidade e especificidade, além
de uma leitura passível de automação (FERREIRA AND ÁVILA, 2001). OELEMAN et
al. (1998) avaliaram diferentes ―kits” de ELISA e encontraram uma especificidade de
93,3 a 100% e uma sensibilidade de 97,7 a 100%. Apesar da alta especificidade da
técnica de ELISA, essa metodologia ainda apresenta uma elevada reatividade cruzada
com outras espécies da família Trypanosomatidae (VEXENAT et al., 1996;
GADELHA et al., 2003; AMATO-NETO et al., 2005). VEXENAT et al. (1996),
observaram pela técnica de ELISA a presença de determinantes antigênicos comuns
entre o T. cruzi, L. chagasi e L. braziliensis. Diferentes “kits” de ELISA apresentaram
uma especificidade de 82,84 a 100% quando amostras de pacientes com leishmanioses
foram incluídas e de 95,5 a 100% quando essas mesmas amostras foram excluídas do
estudo. A sensibilidade foi de 100% quando amostras de doadores brasileiros foram
INTRODUÇÃO
19
testadas e de 75 a 100% quando soros provenientes do Panamá foram avaliados
(CABALLERO et al., 2007).
Os testes sorológicos convencionais apresentam uma alta sensibilidade e
especificidade, e ainda como vantagens o baixo custo e a fácil utilização (CANÇADO,
1999; GOMES et al., 2009). No entanto, os antígenos comumente utilizados nesses
testes podem apresentar uma baixa especificidade devido à reatividade cruzada com
antígenos de infecções parasitárias relacionadas, tais como a leishmaniose (VEXENAT
et al., 1996; GADELHA et al., 2003; AMATO-NETO et al., 2005). A utilização de
antígenos brutos do T. cruzi tem sido substituída por extratos proteícos ou peptídeos
recombinantes isolados do parasito, a fim de aumentar a especificidade dos testes
sorológicos (CARVALHO et al., 1993; PERALTA et al., 1994; FLÓRES-CHÁVEZ et
al., 2010). FLORES-CHÁVEZ et al. (2010), avaliaram a sensibilidade e a
especificidade dos testes sorológicos convencionais e não convencionais para a doença
de Chagas, e observaram que os testes sorológicos não convencionais que utilizam
antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos apresentaram menor percentual de
reatividade cruzada com o soro de pacientes com leishmaniose visceral (LV). Da
mesma forma, CARVALHO et al. (1993), avaliaram a sensibilidade e a especificidade
da IFI, HAI, ELISA para a doença de Chagas e observaram que a ELISA utilizando
antígenos recombinantes não demonstrou nenhuma reatividade cruzada com soros de
pacientes com outras doenças infecto-parasitárias. UMEZAWA et al. (2004), também
demostraram que os antígenos recombinantes são mais específicos para a detecção dos
anticorpos anti-T. cruzi do que o antígeno de EPI bruto, uma vez que a especificidade
para o antígeno de EPI foi de 84%, e para os antígenos recombinantes variou de 96,2 a
99,6%.
Testes utilizando antígenos de tripomastigotas do T. cruzi excretados-secretados
(TESA-blot), têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da DCh (UMEZAWA et al.,
1996). Esses testes apresentaram uma alta sensibilidade, uma vez que todos os soros dos
pacientes chagásicos (CH), tanto na fase aguda quanto na fase crônica, foram reativos, e
uma alta especificidade, uma vez que nenhuma reação cruzada foi observada. Em
contraste, as técnicas de ELISA e de IFI utilizando antígeno de EPI bruto apresentaram
uma especificidade de 90% devido à reatividade cruzada com o soro de pacientes com
leishmaniose (UMEZAWA et al., 1996).
INTRODUÇÃO
20
Outros testes vêm sendo padronizados utilizando antígenos do T. cruzi excretados-
secretados na urina de indivíduos com doença de Chagas. O teste de Chunap (teste de
nanopartícula na urina Chagas) vem sendo utilizado para monitorar pacientes co-
infectados com T. cruzi/HIV, sendo uma ferramenta não invasiva, em que a
determinação dos antígenos na urina se correlaciona com os níveis de parasitemia,
tornando-se útil para a detecção antecipada da reativação da doença de Chagas e
tratamento precoce desses indivíduos (CASTRO-SESQUEN et al., 2016).
Os testes rápidos que utilizam antígenos recombinantes também têm sido
desenvolvidos para aumentar a especificidade dos testes para o diagnóstico da doença
de Chagas. Esses testes apresentam como vantagens: rápido processamento,
armazenamento em temperatura ambiente, não necessitam de reagentes e equipamentos
especializados e de técnicos bem treinados para executá-los, alta sensibilidade (96-
100%), alta especificidade (95-99%) e capacidade de fornecer resultados imediatos.
Esses testes são importantes para a realização de inquéritos sorológicos e como métodos
diagnósticos em áreas onde os indivíduos têm acesso limitado aos serviços de saúde,
possibilitando assim o diagnóstico e o tratamento precoce da doença (LUQUETTI et al.,
2003; CHAPPUIS et al., 2010). No entanto, a sensibilidade dos testes rápidos pode
variar de acordo com a localização geográfica das amostras testadas (CHIPPAUX et al.,
2009; VERANI et al., 2009), o que pode ser consequência de sua diversidade genética,
que influencia nos níveis de produção de imunoglobulinas e de seus respectivos isotipos
(SANTOS et al., 2009). Com essa mesma proposta, testes como o de Dot-ELISA,
também são sensíveis para o diagnóstico da doença de Chagas, sendo de fácil utilização
e interpretação dos resultados, além de apresentarem uma boa estabilidade do antígeno
nas membranas sensibilizadas, tendo grande utilidade em áreas onde os indivíduos não
tenham acesso a laboratórios especializados (CERVANDES-LANDÍN et al., 2013).
As formas amastigotas também podem ser utilizadas como fontes antigênicas em
testes sorológicos convencionais (PRIMAVERA et al., 1990; MATSUMOTO et al.,
1993). MATSUMOTO et al. (1993) avaliaram a reatividade dos anticorpos IgG, IgM e
IgA contra antígenos de amastigotas e epimastigotas no diagnóstico da doença de
Chagas pela IFI. Os autores observaram uma maior reatividade de IgG com as formas
amastigotas do que com as epimastigotas, além de uma menor reatividade cruzada dos
soros dos pacientes com leishmaniose visceral com as formas AMA.
INTRODUÇÃO
21
Os antígenos comumente utilizados nos testes sorológicos para a DCh também
podem apresentar sensibilidade variável devido à diversidade genética do T. cruzi
(UMEZAWA et al., 1999; VERANI et al., 2009; REIS-CUNHA et al., 2014). Estudos
prévios demonstraram que os soros dos pacientes de distintas áreas geográficas,
infectados com diferentes genótipos do T. cruzi, podem apresentar uma reatividade
sorológica variável no diagnóstico da doença de Chagas, quando são empregados
distintas metodologias e antígenos do parasito (UMEZAWA et al., 1999; UMEZAWA
et al., 2004; VERANI et al., 2009; ZINGALES et al., 2012). VERANI et al. (2009) ao
avaliar o desempenho de dois testes sorológicos, utilizando amostras de soros de
pacientes de diferentes áreas geográficas (Bolívia e Peru), demonstraram uma
sensibilidade variável de 26.6% a 87,5%. Outro estudo utilizou a técnica de ELISA com
seis antígenos recombinantes do T. cruzi e avaliou a reatividade dos soros de amostras
da Argentina, Brasil, Chile, Colombia, El Salvador, Guatemala, Honduras e Venezuela,
sendo encontrado como resultado variações na reatividade dos soros de 79-100% com
os antígenos individuais por região geográfica (UMEZAWA et al., 1999). Menores
valores de absorbância de amostras de soros do Panamá comparado com amostras da
Bolívia, Brasil e Honduras também foram observados com alguns antígenos
recombinantes do parasito (UMEZAWA et al., 2004). Esses trabalhos demonstraram
que características intrínsecas de cepas regionais do parasito podem influenciar na
sensibilidade dos testes sorológicos para a doença de Chagas. Assim, considerando a
variabilidade genética do T. cruzi, é importante ressaltar que os antígenos para o
diagnóstico da DCh sejam expressos em isolados do parasito de diferentes DTUs
(REIS-CUNHA et al., 2014). Os genótipos do T. cruzi podem influenciar no padrão da
resposta de anticorpos em modelos experimentais. SANTOS et al. (2009),
correlacionaram à diversidade genética do parasito com o padrão de resposta imune
humoral em camundongos infectados por distintos genótipos do parasito. Esses autores
demonstraram que os soros dos camundongos infectados com cepas da linhagem T.
cruzi I (clones dos genótipos 19 e 20- TcI) induziram a produção de maiores níveis de
anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b durante a fase aguda da doença de Chagas, do que
os soros dos animais infectados com cepas das linhagens T. cruzi II (clone do genótipo
32-TcII) e T. cruzi (clone do genótipo 39-híbrido). Os genótipos T. cruzi II (clone do
genótipo 32-TcII) e T. cruzi (clone do genótipo 39-híbrido) induziram níveis similares
de IgG, IgG1 e IgG2b. Na fase crônica, a linhagem T. cruzi I (clones dos genótipos 19 e
INTRODUÇÃO
22
20- TcI) induziram maiores níveis de IgG1, IgG2a e IgG2b do que parasitos dos grupos
genéticos T. cruzi II (clone do genótipo 32-TcII) e T. cruzi (clone do genótipo 39-
híbrido). Apenas os níveis de IgG foram similares no soro de camundongos infectados
com T. cruzi I (clones dos genótipos 19 e 20- TcI) e T. cruzi II (clone do genótipo 32-
TcII). Estudos prévios com clones do T. cruzi, demonstraram que a linhagem T. cruzi I
(TcI) apresentou maiores níveis de parasitos no sangue do que a linhagem T. cruzi II
(TcII) (TOLEDO et al., 2002). Esse fato pode estar associado à propriedade de cepas
largas serem mais resistentes à lise mediada pelo complemento, induzindo assim uma
maior resposta imunológica do hospedeiro e consequentemente maiores níveis de
anticorpos IgG. A síntese de anticorpos líticos também pode variar de acordo com a
cepa do T. cruzi que é utilizada como antígeno alvo nos testes de lise mediada pelo
complemento. Assim, características antigênicas genótipo-específicas do parasito
podem estar envolvidas na indução dos anticorpos líticos (KRETTLI et al., 1979;
WALLACE et al., 1995; ZULANTAY et al., 1998).
1.4.3.1- Diagnóstico sorológico genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi
Na tentativa de realizar um diagnóstico genótipo-específico mais simples,
sensível e específico, que possa ser utilizado em laboratórios clínicos, alguns trabalhos
vêm desenvolvendo métodos sorológicos com habilidade para o reconhecimento
genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi (DI NOIA et al., 2002;
BHATTACHARYYA et al., 2010; MENDES et al., 2013; BHATTACHARYYA et al.,
2014, 2105). DI NOIA et al. (2002), demonstraram dois antígenos do T. cruzi,
denominados antígeno pequeno de superfície das formas tripomastigotas (TSSA). Duas
proteínas de TSSA parecem estar correlacionadas com as duas maiores linhagens do
parasito T. cruzi I (TcI) e T. cruzi II (TcII). Esses estudos foram posteriormente
aprimorados por BHATTACHARYYA et al., 2010, 2014 e 2015.
BHATTACHARYYA et al. (2010) demonstaram que TSSA é um marcador capaz de
distinguir a infecção experimental de hospedeiros infectados por TcII, TcV e TcVI da
infecção por TcI, TcIII e TcIV. O peptídeo específico para TcII-VI (denominado
inicialmente como TSSA II) foi capaz de identificar apenas infecções por TcII, TcV e
TcVI, já o peptídeo descrito como específico para infecções por TcI (TSSA I),
compartilha algumas características com TcIII e TcIV. Com essa mesma proposta,
INTRODUÇÃO
23
BHATTACHARYYA et al. (2014) avaliaram por ELISA a reatividade de soros de
camundongos infectados com diferentes genótipos do T. cruzi e amostras de soros
humanas provenientes de diferentes regiões geográficas da América Latina, com o
antígeno TSSA. Os autores demonstraram que os soros dos camundongos infectados
por TcII, TcV e TcVI reconheceram especificamente o antígeno TSSApep-II/V/VI e os
soros dos infectados por TcIII e TcIV reagiram com seus respectivos peptídeos TSSA.
Já em relação às amostras de soros humanas, houve um grande reconhecimento dos
soros de pacientes dos países do Cone Sul pelos antígenos TSSApep-II/V/VI e
TSSApep-V/VI, porém as amostras de soros provenientes de países localizados na
região Norte da Amazônia não reconheceram especificamente o antígeno TcI, ou seja
TSSApep-I. Diante dos resultados encontrados, os autores propuseram que TSSA pode
ser um marcador sorológico para identificar a linhagem do T. cruzi em infecções
humanas e experimentais (BHATTACHARYYA et al., 2010, 2014 e 2015).
MENDES et al. (2013) também desenvolveram uma sorologia para genotipagem
do T. cruzi. Os autores utilizaram epitopos conservados e polimórficos de células B para
identificar antígenos alvo do T. cruzi no sorodiagnóstico e sorotipagem de pacientes
com doença de Chagas, por meio da técnica de ELISA. Quatro epitopos conservados
apresentaram alta sensbilidade, especificidade e acurácia na identificação do T. cruzi em
pacientes infectados por diferentes cepas do parasito, podendo ser utilizado no
diagnóstico universal da doença de Chagas. Além disso, três epitopos polimórficos
foram capazes de distinguir infecções por TcI e TcII, porém os soros dos animais
infectados por TcVI apresentaram reatividade-cruzada com esses peptídeos. Esse
trabalho demonstrou o potencial desses antígenos para o diagnóstico genótipo-
específico da infecção pelo T. cruzi.
Uma vez que à resposta ao tratamento da doença de Chagas varia de acordo com
o grupo genético do T. cruzi, em que hospedeiros infectados com TcI apresentaram
resistência total ou parcial, infectados com TcV ou TcVI resistência parcial e infectados
com TcII susceptibilidade total ou parcial ao tratamento com benzonidazol
(ANDRADE, 1974; ANDRADE & MAGALHÃES, 1997; TOLEDO et al., 2003), o
desenvolvimento de testes sorológicos para o diagnóstico genótipo-específico é de
extrema importância na monitoração pós-terapêutica de pacientes chagásicos tratados.
1.5- Citometria de fluxo no diagnóstico da doença de Chagas
INTRODUÇÃO
24
Uma ferramenta que vem sendo cada vez mais utilizada no diagnóstico da
doença de Chagas é a citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995; CORDEIRO
et al., 2001; MARTINS-FILHO et al., 2002; VITELLI-AVELAR et al., 2007; MATOS
et al., 2011). As vantagens de se utilizar a citometria de fluxo no diagnóstico da doença
de Chagas são: possibilidade de análise multiparamétrica em plataforma única, boa
reprodutibilidade, isenta de variabilidades metodológicas inerentes ao analista, com
sensibilidade superior aos diferentes protocolos de detecção e revelação convencionais.
Além disso, é uma técnica bem estabelecida, em que os parâmetros podem ser medidos,
armazenados e analisados em programas de computador simultaneamente ao citômetro
de fluxo (CORDEIRO et al., 2001).
As técnicas que utilizam como ferramenta a citometria de fluxo: pesquisa de
anticorpos IgG anti-formas tripomastigotas vivas (FC-ALTA) e pesquisa de anticorpos
IgG anti-formas epimastigotas fixadas (FC-AFEA), empregam como antígeno as formas
tripomastigotas vivas e epimastigotas fixadas do T. cruzi, respectivamente. Ambas as
metodologias apresentaram um bom desempenho no diagnóstico da doença de Chagas,
sendo capaz de discriminar as amostras de soros dos chagásicos e não chagásicos
(NCH) ou não infectados (NI), com altos valores de sensibilidade e especificidade,
ainda que um pequeno percentual de resultados falso-positivos foi observado
(MARTINS-FILHO et al., 1995; CORDEIRO et al., 2001; MARTINS-FILHO et al.,
2002; VITELLI-AVELAR et al., 2007).
Outra metodologia que utiliza como ferramenta a citometria de fluxo é a
pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas fixadas de Leishmania sp (FC-
AFPA-IgG), aplicada ao diagnóstico sorológico da Leishmaniose Tegumentar (LT) e da
Leishmaniose Visceral (LV). Essa nova metodologia empregou primeiramente como
fonte antigênica as formas promastigotas fixadas da Leishmania amazonensis, e
apresentou sensibilidade de 99% e especificidade de 61% no diagnóstico sorológico da
LT. No entanto, esse novo teste apresentou elevada reatividade cruzada com amostras
de soros de pacientes com doença de Chagas e LV (PISSINATI et al., 2008).
Posteriormente, foi avaliado o desempenho da FC-AFPA-IgG, empregando como fonte
antigênica formas promastigotas fixadas da Leishmania chagasi, que apresentou
sensibilidade e especificidade de 100% no diagnóstico sorológico da LV (GARCIA et
al., 2009). Visando solucionar os desafios de especificidade observados na FC-AFEA-
INTRODUÇÃO
25
IgG e na FC-AFPA-IgG para o diagnóstico diferencial da doença de Chagas e das
leishmanioses tegumentar e visceral, foi desenvolvida a metodologia de FC-TRIPLEX
Chagas/Leish IgG1, pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas epimastigotas fixadas do
T. cruzi e promastigotas fixadas da L. braziliensis e da L. chagasi pela citometria de
fluxo, como um método que emprega formas epimastigotas fixadas do T. cruzi e
promastigotas fixadas de L. braziliensis e de L. chagasi como antígeno. Essa nova
metodologia apresenta um sistema de revelação mais específico (anti-IgG1) e sensível
(conjugação biotina/avidina/ficoeritrina). A FC-TRIPLEX Chagas/Leish IgG1
apresentou uma acurácia global de 95%, sendo capaz de discriminar 76 das 80 amostras
analisadas, com índices de sensibilidade de 100% para LV e 95% para DCh e LT,
demonstrando assim ser um método eficaz para o diagnóstico diferencial da DCh, LV e
LT (TEIXEIRA-CARVALHO et al., 2015).
1.6-Metodologia Chagas-Flow ATE
Na busca de uma metodologia mais sensível, específica e prática, que possa ser
utilizada no diagnóstico e na monitoração pós-terapêutica da doença de Chagas, foi
padronizada a técnica de pesquisa de anticorpos IgG1 anti-Amastigota, Tripomastigota
e Epimastigota por citometria de fluxo (Chagas-Flow ATE) (ALESSIO et al., 2014),
depósito do pedido de patente DIRPA-PQ006). Essa técnica é baseada na pesquisa de
anticorpos IgG1 anti-formas evolutivas do T. cruzi (amastigota viva, tripomastigota viva
e epimastigota fixada) por citometria de fluxo. A nova metodologia emprega um
modelo de segregação fluorescente diferencial, por meio da marcação dos parasitos com
isotiocianato de fluoresceína (FITC) e um sistema de revelação fluorescente
complementar, por meio da utilização do anticorpo biotinilado conjugado com o
fluorocromo estreptoavidina-ficoeritrina (SAPE). A Chagas-Flow ATE apresentou um
excelente desempenho, uma vez que foi capaz de segregar amostras de soros de
pacientes chagásicos (CH) e não chagásicos, com índices de sensibilidade e
especificidade de 100%, nas diluições e pontos de corte padronizados (ALESSIO et al.,
2014). Quando avaliada a sua aplicabilidade no diagnóstico da DCh, essa metodologia
também apresentou um bom desempenho principalmente com as formas amastigotas e
tripomastigotas, uma vez que 100% das amostras dos CH foram positivas e 94% das
amostras dos NCH negativas com essas formas. Dentre as amostras dos NCH que
INTRODUÇÃO
26
apresentaram resultados falso-positivos, uma foi de um paciente com LV e duas de
pacientes com LT (ALESSIO et al., 2014). Na monitoração pós-terapêutica da DCh, a
Chagas-Flow ATE também apresentou um excelente desempenho, principalmente com
as formas amastigotas, uma vez que 100% das amostras dos não tratados e tratados não
curados foram positivas e 100% das amostras dos tratados curados foram negativas com
essas formas (ALESSIO et al., 2014).
Assim, diante desse contexto e buscando otimizar a Chagas-Flow ATE para o
diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi, em modelo
murino, infectado com uma única linhagem do parasito ou mista, esse trabalho visa
desenvolver a técnica Chagas-Flow ATE modificada, utilizando como antígenos
distintos genótipos do parasito das DTUS TcI, TcII e TcVI.
JUSTIFICATIVA
27
2. JUSTIFICATIVA
JUSTIFICATIVA
28
A variabilidade genética do T. cruzi se correlaciona com as características
biológicas, epidemiológicas e clínicas da doença de Chagas. Além do mais, o parasito é
capaz de induzir a formação de anticorpos específicos relacionados com o seu genótipo,
influenciando assim na sensibilidade das técnicas sorológicas. Devido a esse fato é
importante considerar os grupos genéticos do T. cruzi no desenvolvimento de novos
testes de diagnóstico para a doença de Chagas. Tendo em vista ainda, os bons resultados
obtidos com a técnica de Chagas-Flow ATE, o presente trabalho se justifica na
otimização dessa técnica para o diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção
experimental pelo T. cruzi, por uma única linhagem do parasito ou na infecção mista,
utilizando como antígenos diferentes grupos genéticos ou DTUs do T. cruzi.
OBJETIVOS
29
3. OBJETIVOS
OBJETIVOS
30
3.1- Objetivo Geral
Consolidar o desenvolvimento da técnica Chagas-Flow ATE no diagnóstico
universal e genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando como
antígenos diferentes grupos genéticos do parasito.
3.2- Objetivos Específicos
3.2.1- Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras de
soros de camundongos com infecções tardias simples por TcI (cepa Colombiana),
TcVI (cepa CL) e TcII (cepa Y) e amostras de soros de camundongos não infectados;
3.2.2- Avaliar o desempenho e definir um critério de análise para a técnica
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras de soros de camundongos na
com infecções tardias simples por TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y;
3.2.3- Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais recentes e tardias pelo T. cruzi;
3.2.4- Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais simples e mistas, com distintos genótipos
do T. cruzi nas infecções recentes e tardias;
3.2.5- Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental recente pelo T. cruzi,
utilizando amostras de soros de camundongos com infecções simples por
TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y e mistas por TcI/Colombiana + TcVI/CL, TcVI/CL
+ TcII/Y e TcII/Y + TcI/Colombiana.
3.2.6- Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental tardia pelo T. cruzi,
utilizando amostras de soros de camundongos com infecções simples por
OBJETIVOS
31
TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y e mistas por TcI/Colombiana + TcVI/CL, TcVI/CL
+ TcII/Y e TcII/Y + TcI/Colombiana.
3.2.7- Avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando algoritmos sequenciais
estabelecidos pela análise das árvores de decisão.
METODOLOGIA
32
4. METODOLOGIA
METODOLOGIA
33
4.1- Comitê de Ética
Neste trabalho, todos os animais utilizados foram mantidos no Centro de Ciência
Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Ouro Preto, MG, Brasil, de
acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal para a conduta ética no uso de animais para a pesquisa. Esse
projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Federal de Ouro Preto, MG, Brasil, protocolo nº 2013/48, ofício nº. 174/2013, de 6 de
dezembro de 2013, para as infecções experimentais e coleta de sangue por punção do
plexo ocular nos camundongos.
4.2- Cepas do Trypanosoma cruzi
As cepas padrão do T. cruzi, Colombiana-COL (TcI) (FEDERECI et al., 1964),
CL (TcVI) (BRENER and CHIARI, 1963) e Y (TcII) (PEREIRA DA SILVA AND
NUSSENZWEIG, 1953) foram utilizadas nesse estudo para a padronização da
metodologia TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no sorodiagnóstico da infecção
experimental pelo T. cruzi. Essas cepas representam os três maiores genótipos do
parasito envolvidos no ciclo doméstico da doença de Chagas no Brasil (ZINGALES et
al., 2012). Todos os isolados foram obtidos do criobanco do Grupo de Genômica
Funcional e Proteômica de Leishmania spp e Trypanosoma cruzi, do Centro de
Pesquisas René Rachou (CPqRR-Fiocruz/MG) e tipados por técnicas de biologia
molecular previamente. As cepas foram mantidas por passagens consecutivas em
camundongos Swiss fêmeas. As amostras de sangue obtidas desses camundongos
infectados foram utilizadas para as infecções experimentais e preparação dos antígenos
(amastigota-AMA, tripomastigota-TRIPO e epimastigota-EPI).
4.3- Infecções experimentais com os genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi
Camundongos Swiss fêmeas (n=155, de 28 a 30 dias), obtidos do Centro de
Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG, Brasil, foram
mantidos em temperatura controlada e com acesso à água e alimentação ad libitum. Para
as infecções simples (n=70) os animais foram subdivididos em três grupos: infectados
METODOLOGIA
34
com a cepa Colombiana/TcI (n=20), infectados com a cepa CL/TcVI (n=20) e
infectados com a cepa Y/TcII (n=20). Foram avaliados em paralelo, 10 camundongos
não infectados (NI) como grupo controle. A infecção foi realizada via intraperitoneal
com um inóculo de 50 tripomastigotas sanguíneos do T. cruzi de cada cepa por animal.
Para as infecções mistas (n=85) foram utilizados três grupos de 25 camundongos
cada. Os animais foram inoculados via intraperitoneal com um inóculo de 25
tripomastigotas sanguíneos de cada cepa do T. cruzi por animal. O primeiro grupo foi
infectado com as cepas Colombiana/TcI e CL/TcVI (n=25), o segundo com as cepas
CL/TcVI (=25) e Y/TcII e o terceiro com a cepas Colombiana/TcI e Y/TcII (n=25).
Foram avaliados também 10 camundongos não infectados como grupo controle.
As infecções foram confirmadas em todos os camundongos infectados pelo T.
cruzi pela positividade do exame de sangue a fresco, realizado no 7°, 10°ou 15° dia pós-
infecção. O sangue de cada animal foi coletado por punção do plexo ocular, e após o
processamento dessas amostras, foram obtidos os soros para serem testados no
sorodiagnóstico da infecção pelo T. cruzi, pela técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a. O sangue foi coletado dos controles não infectados e dos camundongos
infectados pelo T. cruzi 30 dias (infecção recente- IR) e 90 e 180 dias (infecção tardia-
IT) pós-infecção. As amostras de soro foram inativadas a 56°C por 30 min e estocadas a
-20°C até serem utilizadas nos experimentos. Considerando à mortalidade dos animais
durante o estudo, o número final de amostras de soros dos camundongos por grupo nas
infecções simples foi: Colombiana/TcI- IR n=16, IT n=29; CL/TcVI- IR n=15, IT n=29;
Y/TcII- IR n=19, IT n=35 e NI- n=10.
Já nas infecções mistas o número final de amostras de soros dos camundongos
por grupo foi: Colombiana/TcI + CL/TcVI- IR n=16, IT n=28; CL/TcVI + Y/TcII- IR
n=24, IT n=43; Colombiana/TcI + Y/TcII- IR n=20, IT n=36 e NI- n=10.
4.4- Preparação dos antígenos alvo AMA, TRIPO e EPI (ATE) dos genótipos TcI,
TcVI e TcII do T. cruzi
4.4.1- Cultivo e preparação das formas amastigotas e tripomastigotas do T. cruzi
Para o cultivo das formas amastigotas e tripomastigotas das cepas
Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcVII foram utilizadas células da linhagem NTCT
clone 929 (L929) (ATCC CCL 1), de tecido conectivo de camundongo, mantidas em
METODOLOGIA
35
RPMI 1640, com vermelho de fenol, suplementado com 10% de SFB e 2mM de
glutamina. As células foram infectadas com as formas tripomastigotas de cada uma das
cepas na proporção de 20 tripomastigotas/célula. As garrafas foram mantidas em estufa
a 37ºC, 5% gás carbônico, 95% de umidade por 24 horas. Após este período, as
monocamadas foram lavadas e mantidas em meio RPMI suplementado a 33ºC, 5% CO2,
95% de umidade (BERTELLI et al., 1977). O meio foi trocado diariamente, e de 4-6
dias e de 8-15 dias pós-inoculação os tripomastigotas e amastigotas foram coletados,
respectivamente, de cada uma das suas garrafas de cultura de células.
As formas TRIPO e AMA foram coletadas da garrafa de cultura de células e
transferidas para tubos falcon de 50 ml. A suspensão de parasitos foi centrifugada a 400
rpm, 10 min, 25°C para a remoção das células remanescentes. O sobrenadante foi
transferido para outro tubo e o ―pellet‖ foi descartado. Para lavar os parasitos foi
adicionado à suspensão de TRIPO e AMA PBS 10% SFB. A suspensão de parasitos foi
centrifugada a 2.200 rpm, 10 min, 4°C. O sobrenadante foi descartado e 1 ml de ―pellet‖
foi ressuspendido. As formas AMA e TRIPO foram contadas em câmara de Neubauer e
a concentração dos parasitos ajustada para 1x107
parasitos/ml.
4.4.2- Cultivo e preparação das formas epimastigotas do T. cruzi
As formas epimastigotas das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII foram
obtidas na fase-log de crescimento em cultura axênica com o meio ―Liver Infusion
Tryptose‖ (LIT) (CAMARGO, 1964). Para iniciar o cultivo das formas epimastigotas,
foi realizado um inóculo de 1x107 parasitos/ml em uma garrafa de cultura de células
contendo 3 ml de LIT. As culturas foram diariamente homogeneizadas para oferecer
uma maior aeração e observadas em microscópio óptico para verificar a ausência de
contaminação. A cada sete dias, as culturas foram repicadas por passagens sucessivas
em meio LIT. Este procedimento foi repetido para manutenção das culturas em fase de
crescimento exponencial e para evitar a diferenciação das formas epimastigotas em
tripomastigotas metacíclicas. As culturas foram mantidas em estufa B.O.D a
temperatura de 28 1ºC.
Os parasitos coletados na fase-log de crescimento foram transferidos para tubos
estéreis de 50 ml e homogeneizados em vórtex a baixa velocidade para desfazer os
grumos celulares. A suspensão de parasitos foi centrifugada a 200 rpm, 10 min, 18°C,
METODOLOGIA
36
para remoção de partículas e grumos de parasitos do sedimento. Os tubos foram
mantidos em estufa B.O.D 28 1ºC, 10 mim, para que as formas epimastigotas se
deslocassem do sedimento para o sobrenadante. O sobrenadante foi transferido para
outro tubo de 50 ml e o sedimento desprezado. Os parasitos foram então lavados duas
vezes com PBS com 3% de SBF por centrifugação a 2.200 rpm, 10 min, 18°C. O
―pellet‖ foi homogeneizado, ressuspendido em igual volume com PBS e solução
fixadora para citometria (Max FacsFix- MFF) e mantido por 12h a 4°C. No dia
seguinte, os parasitos foram centrifugados a 2.200 rpm, 10 min, 18°C e ressuspendidos
em PBS. A suspensão de parasitos foi quantificada e ajustada para 1x107 parasitos/ml
em câmara de Neubauer e monitoradas em citômetro de fluxo, para verificar a qualidade
da população. As formas epimastigotas fixadas foram mantidas a 4°C.
4.4.3- Marcação das formas AMA, TRIPO e EPI com isotiocianato de fluoresceína
As formas amastigotas e tripomastigotas vivas e epimastigotas fixadas foram
marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) como descrito por ALESSIO et al.
(2014). Na técnica Chagas-Flow ATE as formas amastigotas e tripomastigotas são
utilizadas vivas, pois devido ao fato de estarem presentes no hospedeiro vertebrado, elas
apresentam particularidades antigênicas, que são reconhecidas por anticorpos
específicos nessa metodologia, com alta especificidade. O processo de fixação leva a
mudanças conformacionais nos antígenos de membrana das formas tripomastigotas e o
reconhecimento por imunoglobulinas inespecíficas (CORDEIRO et al., 2001). Além do
mais, uma vantagem de se utilizar as formas amastigotas e tripomastigotas vivas como
antígenos na Chagas-Flow ATE é que apenas os epitopos do lado de fora da membrana
estão disponíveis para a ligação dos anticorpos. Essa propriedade dos parasitos vivos,
evita à ligação dos anticorpos a componentes intracelulares amplamente distribuídos em
outros tripanossomatídeos, o que leva a reatividade cruzada. As formas epimastigotas
por estarem presentes nos hospedeiros invertebrados compartilham antígenos com as
formas amastigotas e tripomastigotas, e devido a esse fato são fixadas para serem
utilizadas na Chagas-Flow ATE. Trabalhos prévios demonstraram que as formas
epimastigotas quando fixadas com MFF apresentam uma estabilidade antigênica de até
um ano quando mantidas a 4°C (TEIXEIRA-CARVALHO et al., 2015).
METODOLOGIA
37
A mistura de AMA + TRIPO e a suspensão de EPI (1x107 parasitos/ml) foram
marcadas com FITC (100g/mL para cepa Colombiana/TcI e 200g/mL para as cepas
CL/TcVI e Y/TcII) por 30 min à 37°C. Após as marcações, a mistura AMA + TRIPO
foi incubada à 37°C por 60 min, para ocorrer o fenômeno de marcação diferencial
(ALESSIO et al., 2014). A suspensão de EPI foi armazenada a 4°C por 24h antes da
realização dos experimentos, pois já foi demonstrado que a mesma não reage com o
soro teste antes desse período de incubação (ALESSIO et al., 2014).
As preparações de parasitos marcadas com FITC foram misturadas de modo que
obtivéssemos uma proporção equivalente de AMA (33%), TRIPO (33%) e EPI (33%)
para serem testadas na Plataforma de Parasitos-ATE, monitoradas por meio da leitura
no citômetro de fluxo. A técnica de marcação com FITC resultou em um fenômeno de
marcação diferencial, previamente descrito por ALESSIO et al. (2014), possibilitando
assim segregar as formas AMA, TRIPO e EPI em grupos distintos, como observado em
gráficos de distribuição pontual da citometria de fluxo de FITC (Fluorescência 1-FL1)
por FSC (Tamanho) (Figura 1).
4.5- TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no sorodiagnóstico da infecção pelo
T. cruzi
Um delineamento da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser
utilizado no sorodiagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi foi demonstrado na
Figura 1. O método compreende duas etapas: i) Procedimento experimental (Figura
1A) e ii) Análise da reatividade de IgG2a anti-T. cruzi genótipo-específica (Figura 1B).
Procedimento Experimental:
A sorologia TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a foi realizada como descrito
previamente por ALESSIO et al. (2014), com algumas modificações. As amostras de
soros foram descongeladas, filtradas com filtro para seringa de 0,22m e foi relizada
uma diluição seriada (1:500 a 1:64000) com PBS 10% SFB, em placas de 96 poços com
fundo em ―U‖. Um volume final de 50L das amostras de soros pré-diluídas foi
incubado com 50L da mistura ATE dos parasitos fluorescentes (Amastigota,
Tripomastigota e Epimastigota), nas plataformas TcI, TcVI e TcII genótipo-específica,
em experimentos paralelos, por 30 min à 37°C em estufa com 5% de CO2. Após a
METODOLOGIA
38
incubação, os parasitos foram lavados duas vezes com PBS 10% SFB e o sobrenadante
descartado. O ―pellet” da mistura de parasitos foi re-suspendido e incubado com 50L
do anticorpo anti-IgG2a de camundongo biotinilado (diluído 1:3000 em PBS 10%
SFB), junto com 20L do reagente secundário (estreptoavidina conjugada com a
ficoeritrina-SAPE, diluída 1:800 em PBS 10% SFB), por 30 min à 37°C em estufa com
5% de CO2. A imunoglobulina IgG2a de camundongo é análoga ao IgG1 humano.
Trabalhos prévios demonstraram IgG1 como uma imunoglobulina mais específica para
ser utilizada no diagnóstico da doença de Chagas (CORDEIRO et al., 2001).
Os parasitos foram lavados novamente com PBS 10% SFB, fixados com 200L
de solução fixadora para a citometria- MFF (10g/L de paraformoldeído, 10,2g/L de
cacodilato de sódio e 6,65g/L de cloreto de sódio, PH 7,2) e armazenados à 4°C ao
abrigo da luz. Em todos os experimentos foi utilizado um controle interno da reação
(controle do conjugado- anti-IgG2a de camundongo biotinilado + SAPE), a fim de
monitorar ligações inespecíficas, na qual a mistura de parasitos-ATE foi incubada na
ausência de soro do camundongo, mas na presença do anticorpo secundário (Figura
1A).
As amostras foram lidas no citômetro de fluxo FACScan (Beckton Dickinson,
USA). Um total de 10.000 eventos foram adquiridos no citômetro de fluxo para cada
uma das diluições do soro testadas. A aquisição dos dados no citômetro foi realizada em
escala logarítmica com os ajustes apropriados (FSC=E00, SSC=427, FL1=620 e
FL2=500). Os dados foram armazenados para as futuras análises.
Análise da reatividade de IgG2a anti-T. cruzi genótipo-específica:
Os dados foram analisados por meio do software FlowJo na versão 10.1
(TreeStar, San Diego, CA, USA). A análise da reatividade de IgG2a anti-T. cruzi
genótipo-específica foi realizada para cada uma das plataformas da mistura de parasitos
ATE com os genótipos TcI (cepa Colombiana), TcVI (cepa CL) e TcII (cepa Y). Foram
utilizadas estratégias adequadas para selecionar os antígenos (amastigota, tripomastigota
e epimastigota) em cada plataforma TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a, levando
em consideração o fenômeno de marcação diferenciação com FITC de AMA, TRIPO e
EPI. Após a seleção dos antígenos, gráficos de histograma foram construídos para
quantificar a reatividade de IgG2a anti-T. cruzi genótipo-específica, por meio de um
limiar de positividade (percentual de parasitos fluorescentes positive-PPFP<2%),
METODOLOGIA
39
estabelecido no controle interno da reação (controle do conjugado). Os resultados foram
expressos como percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) para cada
diluição das amostras de soros testadas (Figura 1B).
TR
IPO
EP
I
AM
A
TcI(
cep
aC
olo
mbia
na
))T
cII
(cep
aY
)T
cV
I(cep
aC
L)
Pla
tafo
rma-A
TE
do
T. cru
ziG
enó
tip
o-E
sp
ecíf
ica
α-IgG2a -Biotinilado junto com SAPE
Mistura de parasitos ATE marcada com FITC
30min, 37ºC, Incubadora Humidificada com 5% CO2
Fixação com MFF
Procedimento Experimental
Controle Interno Amostras Teste
# de
Par
asit
os
AM
ATR
IPO
EPI
FL2/α-IgG2a-
Biotinilado/SAPE
PPFP=97%
PPFP<2%
PPFP<2%
PPFP<2%
PPFP=85%
PPFP=80%
PPFP=98%
TR
iPO
EP
I
AM
A
TR
IPO
AM
A
EP
I
FL1/Diferencial Marcação FITC
Siz
e-F
SC
Amostras de Soros Inativadas/Filtradas/ Pré-diluídas (1:5001:64.000)
Análises genótipo-específica da reatividade anti-T. cruzi IgG2a
Delineamento da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o sorodiagnóstico da Infecção pelo T. cruzi
TcI(
cep
aC
olo
mbia
na))
TcII
(cep
aY
)T
cV
I(cep
aC
L)
A
B
Controle Interno
Duas lavagens com PBS 10% SFB
30min, 37ºC, Incubadora Humidificada com 5% CO2
Duas lavagens com PBS 10% SFB
Leitura no citômetro de fluxo
Pla
tafo
rma-A
TE
do
T. cru
ziG
enó
tip
o-E
sp
ecíf
ica
METODOLOGIA
40
Figura 1: Delineamento da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o sorodiagnóstico da
infecção pelo T. cruzi. (A) Representação esquemática do procedimento experimental da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a demonstrando as plataformas antigênicas separadas de TcI (cepa Colombiana)
= , TcVI (cepa CL) = and TcII (cepa Y) = . (B) Representação das estratégias de segregação
utilizando os antígenos (amastigota-AMA, tripomastigota-TRIPO e epimastigota-EPI) em cada
plataforma da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a. Representação dos histogramas utilizados para
quantificar a reatividade anti-T. cruzi IgG2a, expressa pelo percentual de parasitos fluorescentes positivos
(PPFP), baseado no limiar de positividade (PPFP<2%) no controle interno da reação.
4.6- Análises
CAPÍTULO- 1
DIAGNÓSTICO UNIVERSAL E GENÓTIPO-ESPECÍFICO NO CONTEXTO
DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL SIMPLES PELO T. cruzi
A análise dos dados no diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção
pelo T. cruzi no primeiro capítulo do trabalho foi realizado por meio do teste não
paramétrico Kruskal–Wallis seguido por Dunn's para comparar o perfil de reatividade
geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a. As diferenças foram consideradas
significativas quando p≤0,05.
Os índices de desempenho do teste no diagnóstico universal da infecção pelo T.
cruzi (acurácia global definida pela área sob a curva-AUC, sensibilidade-Se e
especificidade-Sp) para o par de atributos (―antígeno alvo/diluição do soro‖), foram
determinados pela curva ROC (receiver operating characteristic curve), por
distribuição por gráficos de dispersão e pela curva TG-ROC (Two-Graph ROC curve).
Cada ponto na curva ROC representa os valores dos referidos índices em diferentes
pontos de corte, determinando a área sob a curva (ASC), que indica a acurácia global do
teste. Quanto mais próximo a ASC de 1 melhor é o desempenho do teste avaliado. Um
teste diagnóstico pode ser classificado como: sem valor (ASC=0,5), de baixa acurácia
(0,5<ASC0,7), de moderada acurácia (0,7<ASC0,9), de elevada acurácia
(0,9<ASC<1,0) e como teste perfeito (ASC=1) (SWETS, 1988).
A distribuição pelos gráficos de histograma e as análises de regressão não linear
foram utilizadas para comparar o par de atributos (―antígeno alvo/ diluição do soro)
selecionados para a proposta de diagnóstico genótipo-específico de infecções
experimentais simples na fase crônica.
METODOLOGIA
41
A mediana global foi calculada para cada par de atributos (―antígeno alvo/
diluição do soro‖) para definição do melhor ponto de corte capaz de segregar a
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi, na fase
crônica com infecções simples. Para as análises de desempenho dos conjuntos de
atributos (―antígeno alvo/ diluição do soro/ ponto de corte‖) com aplicabilidade no
diagnóstico genótipo-específico de infecção simples pelo T. cruzi, na fase crônica,
foram construídos gráficos de dispersão. Para as análises estatísticas e montagem dos
gráficos foi utilizado o software GraphPad Prism, Version 5.0 (San Diego, CA, USA).
Foram construídas árvores de decisão para o conjunto de atributos selecionados
(―antígeno alvo/ diluição do soro/ ponto de corte‖) para criar algoritmos (atributos raiz e
ramos), para classificar o T. cruzi em distintos cenários de protótipos populacionais
(infecção por TcI/Colombiana x TcVI/CL x TcII/Y) e (infecção por TcI/Colombiana x
TcII/Y). O sotware WEKA (Waikato Environment for Knowledge Analysis, versão
3.6.11, Universidade de Waikato, Nova Zelândia) foi utilizado para a construção das
árvores de decisão por meio do algoritmo C.4.5 e uma implementação denominada J48.
Esse método analisa todas as características para selecionar o mínimo de conjuntos de
marcadores que pode eficientemente separar os grupos estudados. A árvore de decisão
surge como uma nova ferramenta de análise com o intuito de classificar, descobrir
regras de associações e clusterizar os dados. O foco é na classificação, em que o
objetivo é atribuir uma classe a um exemplo (registro), dentre o conjunto de classes pré-
definidas, com base nos valores de seus atributos.
Análises discriminantes foram realizadas para determinar a acurácia global do
teste e os valores de LOOCV- leave-one-out-cross-validation por meio do software R-
project versão 3.0.1.
CAPÍTULO- 2
DIAGNÓSTICO GENÓTIPO-ESPECÍFICO NO CONTEXTO DA INFECÇÃO
EXPERIMENTAL SIMPLES E MISTA PELO T. cruzi
Foram construídos gráficos de radares no programa Microsoft Excel 2010,
utilizando os valores de reatividade média das amostras de soros em percentual de
parasitos fluorescentes positivos (PPFP), com cada um dos grupos analisados.
METODOLOGIA
42
As curvas de titulação com a reatividade média em PPFP das amostras de soros,
nas oito diluições dos soros testadas (1:500 a 1:64000), foram empregadas para a
comparação entre diferentes grupos. Ainda por meio dessas análises, e utilizando o
programa R-project versão 3.0.1, foram calculadas as distâncias modulares em cada
ponto das curvas de titulação, para a pré-seleção dos nove pares de atributos
(―antígeno/diluição do soro‖).
A análise dos dados no diagnóstico diferencial de infecções na fase aguda e na
fase crônica, de infecções simples e mistas nas fases aguda e crônica e no diagnóstico
genótipo-específico de infecções experimentais simples e mistas pelo T. cruzi nas fases
aguda e crônica, foi realizada por meio do teste não paramétrico Kruskal–Wallis
seguido por Dunn's para comparação entre os grupos. As diferenças foram consideradas
significativas quando p≤0,05.
As análises pelas curvas ROC, ou pela média global ou pela mediana global
foram utilizadas para a definição dos pontos de corte para cada um dos nove pares de
atributos pré-selecionados (―antígeno/diluição do soro‖), dentro de cada uma das
diferentes propostas do estudo. Para as análises estatísticas e montagem dos gráficos foi
utilizado o software GraphPad Prism, Version 5.0 (San Diego, CA, USA).
Árvores de decisão foram construídas utilizando o conjunto de atributos pré-
selecionados (―antígeno alvo/ diluição do soro/ ponto de corte‖) para criar algoritmos
(atributos raiz e ramos) para classificar as amostras de soros nos diferentes grupos:
infecção aguda x infecção crônica; infecção simples aguda x infecção mista aguda;
infecção simples crônica x infecção mista crônica; infecção genótipo-específica simples
aguda, infecção genótipo-específica mista aguda; infecção genótipo-específica simples
crônica e infecção genótipo-específica mista crônica. O sotware WEKA (Waikato
Environment for Knowledge Analysis, versão 3.6.11, Universidade de Waikato, Nova
Zelândia) foi utilizado para a construção das árvores de decisão por meio do algoritmo
C.4.5 e uma implementação denominada J48.
RESULTADOS
43
5. RESULTADOS
RESULTADOS
44
RESULTADOS – CAPÍTULO 1
DIAGNÓSTICO UNIVERSAL E GENÓTIPO-ESPECÍFICO NO CONTEXTO
DA INFECÇÃO EXPERIMENTAL SIMPLES PELO T. cruzi
Os resultados apresentados na primeira parte do trabalho consistem na avaliação
do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal e
genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras de soros
de camundongos com infecções simples e tardias (IT).
Tendo em vista que, não se observou diferença estatística entre os valores de
reatividade dos camundongos em 90 e 180 dias pós-infecção, a avaliação do
desempenho dessa metodologia foi realizada considerando os valores de reatividade das
amostras de soros nesses dois tempos pós-infecção em conjunto.
5.1-Perfil de reatividade geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção crônica experimental pelo
T. cruzi
O perfil de reatividade geral das amostras de soros dos camundongos nas
infecções tardias pelo T. cruzi (cepa Colombiana/TcI n=29, cepa CL/TcVI n=29 e cepa
Y/TcII n=35) e das amostras de soros dos controles não-infectados (NI n=10) foram
avaliadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a e os resultados estão
demonstrados na Figura 2. A reatividade das amostras individuais foi testada com
distintos antígenos (amastigota-AMA, tripomastigota-TRIPO e epimastigota-EPI), dos
genótipos TcI- cepa Colombiana (Figura 2- painel esquerdo), do genótipo TcVI- cepa
CL (Figura 2- painel ao centro) e do genótipo TcII- cepa Y (Figura 2- painel direito),
ao longo das curvas de titulação (diluição seriada do soro de 1:500 a 1:64000).
Foram realizadas análises estatísticas comparativas para selecionar o par de
atributos (―antigeno/ diluição do soro‖) com maior habilidade para serem utilizados no
diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi.
As amostras de soros dos camundongos não infectados e as amostras de soros
em conjunto dos camundongos infectados pelo T. cruzi (cepas Colombiana/TcI,
CL/TcVI e Y/TcII) apresentaram maior diferença estatística com o par de atributos:
―antígeno de TRIPO TcII na diluição 1:500‖, e foram então selecionados para as
RESULTADOS
45
análises futuras de desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi (Figura 2- retângulo
contínuo cinza claro).
Os pares de atributos selecionados com aplicabilidade no diagnóstico genótipo-
específico da infecção experimental pelo T. cruzi foram: ―antígeno de AMA TcII na
diluição 1:1000‖, ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ e ―antígeno de EPI TcVI
na diluição 1:1000‖. O par de atributos ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖
apresentou maior habilidade para distinguir a menor reatividade das amostras de soros
dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI, da maior reatividade das
amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas CL/TcVI ou Y/TcII
(Figura 2- retângulo do lado direito pontilhado cinza escuro).
O par de atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ foi capaz de
discriminar a menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados
com a cepa Y/TcII, da reatividade intermediária observada para as amostras dos
camundongos infectados com a cepa CL/TcVI, da maior reatividade das amostras de
soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI (Figura 2- retângulo
do lado esquerdo pontilhado cinza escuro).
O par de atributos ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000‖ apresentou maior
habilidade para distinguir a menor reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Y/TcII, da maior reatividade observada para as amostras de
soros dos camundongos infectados com as cepas Colombiana/TcI ou CL/TcVI do T.
cruzi (Figura 2- retângulo no centro pontilhado cinza escuro). Esses três pares de
atributos foram selecionados para as análises futuras de desempenho da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental
pelo T. cruzi.
RESULTADOS
46
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Genótipo TcI do T. cruzi Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a – Antígenos Alvos
Am
astig
ota
-A
MA
Tri
pom
ast
igota
-T
RIP
OE
pim
astigota
-E
PI
PP
FP
PP
FP
PP
FP
500 640001000 2000 4000 8000 16000 32000500 6,0001000 2000 4000 8000 16000 32000500 640001000 2000 4000 8000 16000 32000
Inverso da Diluição do Soro Inverso da Diluição do Soro Inverso da Diluição do Soro
Não Infectado Infecção por TcI– cepa Colombiana Infecção por TcVI– cepa CL Infecção por TcII- cepa Y
Perfil de Reatividade Geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no Diagnóstico Universal e Genótipo-Específico da Infecção pelo T. cruzi
47
Figura 2: Perfil de reatividade geral da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
universal e genótipo-específico da infecção tardia pelo T. cruzi. A reatividade da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a foi avaliada nas amostras de soros dos camundongos infectados pelas cepas
representativas dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi, incluindo: cepa Colombiana/TcI ( , n=29),
cepa CL/TcVI ( , n=29) e cepa Y/TcII ( , n=35), como também nas amostras de soros dos
camundongos não infectados ( , n=10). A reatividade IgG2a genótipo-específica para cada antígeno
(amastigota-AMA, tripomastigota-TRIPO e epimastigota-EPI) dos genótipos TcI (gráficos do lado
esquerdo), do genótipo TcVI (gráficos ao centro) e do genótipo TcII (gráficos do lado direito) do T. cruzi
foi avaliada nas oito diluições do soro testadas (1:500 a 1:64000). Os resultados foram expressos como
percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP), utilizando grádicos de box plot que se estendem
dos valores mínimos aos máximos, cujos valores discrepantes estão representados por pontos cinza. As
caixas definem o percentil 25th
e 75th
e os valores médios (linhas dentro das caixas). As análises
estatísticas foram realizadas pelos testes Kruskal-Wallis seguindo por Dunn’s para comparações entre os
grupos. Diferenças significativas foram consideradas com p<0,05. O retângulo contínuo cinza claro
selecionou o par de atributos (―anígeno/diluição do soro‖) com maior habilidade para discriminar as
amostras de soros dos camundongos não infectados, de todas as amostras de soros dos camundongos
infectados pelo T. cruzi (infectados com as cepas Colombiana, CL e Y). Assim, esse par de atributos
(antígeno de TRIPO TcII na diluição 1:500) foi selecionado para o diagnóstico universal da infecção
experimental pelo T. cruzi. Os retângulos pontilhados cinza escuros selecionaram o par de atributos
―antígeno/diluição do soro‖ com maior habilidade para distinguir a reatividade das amostras de soro entre
os camundongos infectados com as cepas Colombiana, CL e Y do T. cruzi. Assim, esses pares de
atributos (antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000; antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000 e
antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000) foram selecionados para o diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi.
5.2- Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
universal da infecção experimental pelo T. cruzi
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 1:
Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras
de soros de camundongos com infecções tardias simples por TcI (cepa)
Colombiana, TcVI (cepa CL) e TcII (cepa Y) e amostras de soros de camundongos
não infectados. Foram utilizados como antígeno as formas amastigotas, tripomastigotas
e epimastigotas do T. cruzi das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi avaliada
a reatividade de 10 amostras de soros de camundongos não infectados (NI) e de 93
amostras de soros de camundongos com infecções tardias pelo T. cruzi (cepas
Colombiana/TcI n=29 + CL/TcVI n=29 + Y/TcII n=35).
O desempenho do par de atributos pré-selecionados ―antígeno de TRIPO TcII na
diluição 1:500‖ foi avaliado no diagnóstico universal da infecção pelo T. cruzi pela
técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a (Figura 3).
RESULTADOS
48
Análises comparativas demonstraram que os valores de reatividade das amostras
de soros dos camundongos não infectados diferem significativamente da reatividade das
amostras de soros de todos os camundongos infectados pelo T. cruzi (cepas
Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII), com ―o antígeno de TRIPO TcII na diluição
1:500‖ (Figura 3A).
Análises pela curva ROC indicaram o ponto de corte de 20% de PPFP, com
excelentes índices de desempenho (área sob a curva-AUC = 1, Sensibilidade-Se e
Especificidade-Sp = 100%) (Figura 3B). O gráfico de dispersão com os valores
individuais das amostras demonstrou a habilidade desse conjunto de atributos ―antígeno
de TRIPO TcII, na diluição 1:500, com ponto de corte de 20%‖ para segregar
completamente as amostras de soros do grupo NI, das amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi (Figura 3C). Análises complementares pela TG-
ROC confirmaram o PPFP de 20% como o melhor ponto de corte para o diangóstico
universal da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando o conjunto de atributos
selecionados (Figura 3D). Os dados demonstraram o excelente desempenho da
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal da infecção
experimental pelo T. cruzi com o conjunto de atributos ―antígeno de TRIPO TcII, na
diluição 1:500, com ponto de corte de 20%‖.
RESULTADOS
49
Figura 3: Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal da
infecção experimental pelo T. cruzi. (A) A reatividade de ―TRIPO TcII na diluição 1:500‖ (pares de
atributos pré-selecionados para o diagnóstico universal da infecção pelo T. cruzi) foram comparados por
Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn´s para comparações entre os grupos. As diferenças
significativas com *p <0,05, **p<0,001 e ***p<0,0001 estão destacadas pelas linhas conectoras. Os
dados foram expressos como a mediana dos valores de PPFP para os camundongos não infectados ( ) e
hospedeiros infectados pelo T. cruzi (TcI/cepa Colombiana= , TcVI/ cepa CL = e TcII/ cepa Y =
). A similaridade entre a reatividade de ―TRIPO TcII na diluição 1:500‖ observada nos três grupos
infectados pelo T. cruzi (cepas Colombiana + CL + Y) possibilitou o estabelecimento de um único grupo
denominado como ―hospedeiros infectados pelo T. cruzi‖ (n=93). O desempenho da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi foi comparado
com o grupo não infectado (NI, n=10). (B) As análises pela curva ROC definiram o ponto de corte para
discriminar os valores de PPFP de NI e dos hospedeiros infectados pelo T. cruzi (cepas Colombiana + CL
+ Y). Índices de desempenho adicionais foram calculados e fornecidos na figura, incluindo a área sob a
curva (AUC), definido como a acurácia global, a sensibilidade (Se) e a especificidade (Sp). (C) O gráfico
de dispersão demonstra a habilidade do conjunto de atributos selecionados (―antígeno/diluição do soro/
ponto de corte‖) para discriminar a reatividade do soro de não infectados (NI), da reatividade do soro de
hospedeiros infectados pelo T. cruzi (cepas Colombiana + CL + Y). A linha pontilhada representa o ponto
de corte de 20% de PPFP definido pelas análises da curva ROC. (D) As análises da TG-ROC foram
também realizadas para confirmar o ponto de corte selecionado com a maior ―Se‖ e ―Sp‖, destacado pelo
retângulo pontilhado cinza escuro. PPFP= percentual de parasitos fluorescentes positivos.
0
20
40
60
80
100
******
**
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
10
0
0
20
40
60
80
100
Ponto de corte: PPFP=20%AUC = 1.0 (1.0-1.0)
Se = 100% (96-100)
Sp = 100% (70-100)
0
20
40
60
80
10
0
0
20
40
60
80
100
Se
Sp
Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no Diagnóstico Universal da Infeção pelo T. cruzi
PP
FP
PP
FP
PPFP Pontos de corte
Índ
ices d
e D
esem
penho
Análises TG-ROC
Análises curva-ROC
100-Especif icidade
Sensib
ilid
ad
e
Gráfico de Dispersão
NI Infecção pelo T. cruzi
(Colombiana+CL+Y)
NI Colombiana
(TcI)
CL
(TcVI)
Y
(TcII)
Anti-TcII TRIPO 1:500A
C
B
D
100%
100%
Infecção pelo T. cruzi
RESULTADOS
50
5.3- Perfil de reatividade global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para
ser aplicado no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T.
cruzi
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 2:
Avaliar o desempenho e definir um critério de análise para a técnica
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras de soros de camundongos
com infecções tardias simples por TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y. Foram
utilizados como antígeno as formas amastigotas, tripomastigotas e epimastigotas do T.
cruzi das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi avaliada a reatividade de 29
amostras de soros de camundongos com infecções tardias pela cepa Colombiana/TcI, 29
amostras de soros de camundongos com infecções tardias pela cepa CL/TcVI e 35
amostras de soros de camundongos com infecções tardias pela cepa Y/TcII.
O perfil de reatividade global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi foi avaliado utilizando os
pares de atributos pré-selecionados: ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖,
―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ e ―antígeno de EPI TcVI na diluição
1:1000‖, como demonstrado na Figura 4.
A análise dos dados foi realizada por meio de gráficos de histograma e linhas de
tendência de regressão não linear. Os resultados demonstraram que com ―o antígeno de
AMA TcII na diluição 1:1000‖ as amostras de soros dos camundongos infectados com a
cepa Colombiana/TcI apresentaram um padrão de distribuição quase unimodal, com
uma alta proporção das amostras na região dos valores de PPFP=10%, contrastando
com a distribuição bimodal das amostras de soros dos camundongos infectados com as
cepas CL/TcVI e Y/TcII, que apresentaram uma maior frequência das amostras para
maiores valores de PPFP (Figura 4A).
As análises com o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ demonstraram
uma polarização das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa
Colombiana/TcI com um padrão de distribuição unimodal, com uma maior proporção
das amostras na região dos valores de PPFP próximos a 100%, constrastando com a
distribuição unimodal com uma maior frequência na região dos valores de PPFP
próximos a 0%, das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII.
RESULTADOS
51
Um padrão de distribuição atípico foi observado para as amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa CL/TcVI (Figura 4B).
Os gráficos de histograma com o ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000‖
demonstraram uma distribuição unimodal Gaussiana das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas Colombiana/TcI e CL/TcVI com uma maior
frequência dentro da região dos valores de PPFP próximos a 50%. Por outro lado, uma
distribuição unimodal foi observada para as amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Y/TcII, com uma alta proporção das amostras na região de
valores de PPFP < 50% (Figura 4C).
Análises comparativas da reatividade das amostras de soros com os pares de
atributos selecionados confirmaram os dados observados nos gráficos de histograma e
nas análises de regressão não linear. O ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖ foi
capaz de segregar as amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII
(e com a cepa CL/TcVI), das amostras de soros dos camundongos infectados com a
cepa Colombiana/TcI (Figura 4D). Por outro lado, o ―antígeno de TRIPO TcI na
diluição 1:4000‖ foi capaz de segregar as amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Colombiana/TcI (e com a cepa CL/TcVI), das amostras de soros
dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII (Figura 4E). Já o ―antígeno de EPI
TcVI na diluição 1:1000‖ foi capaz de discriminar as amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa CL/TcVI (e com a cepa Colombiana/TcI), das
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII (Figura 4F). Os
dados demonstraram o potencial da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser
utilizada no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi
com os atributos: ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖, ―antígeno de TRIPO TcI
na diluição 1:4000‖ e ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000‖.
RESULTADOS
52
Figura 4: Reatividade global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser aplicado no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi. (A) A reatividade ―anti-AMA
TcII na diluição 1:1000‖, (B) a reatividade ―anti-TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ e (C) a reatividade‖ anti-
EPI TcVI na diluição 1:1000‖, atributos pré-selecionados para o diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi, foram avaliados por gráficos de histograma e linhas de tendência de
regressão não linear. Os resultados foram expressos como a proporção de amostras que apresentaram
determinados valores de percentuais de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) entre os camundongos
infectados pelo T. cruzi incluindo: cepa Colombiana/TcI ( , n=29), cepa CL/TcVI ( , n=29) e cepa
Y/TcII ( , n=35). A reatividade entre as amostras de soros dos grupos infectados pelo T. cruzi foi
comparada para cada par de atributos: (D) ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖, (E) ―antígeno de
TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ e (F) ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000‖. Os resultados foram
expressos como a mediana dos valores de PPFP em gráficos box plot, com os valores atípicos
representados por pontos cinzas. As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de Kruskal-Wallis
seguido por Dunn’s para comparação entre os grupos. As diferenças significativas foram indicadas por
asterísco com *p<0,05, **p<0,001 e ***p<0,0001 e destacadas por linhas conectoras.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
25
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
35
70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
35
70
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
10
0
0
35
70
0
20
40
60
80
100***
***
An
ti-T
cII
AM
A 1
:10
00
An
ti-T
cVI
EPI
1:1
00
0A
nti
-TcI
TRIP
O 1
:40
00
Infecção por TcI(Cepa Colombiana)
Infecção por TcVI(Cepa CL)
Infecção por TcII(Cepa Y)
Fre
qu
ên
cia
(%)
Fre
qu
ên
cia
(%)
Fre
qu
ên
cia
(%)
PP
FPP
PFP
PP
FP
Infe
cçã
o T
cII
(cepa Y
)Valores de PPFP
0
20
40
60
80
100***
***
0
20
40
60
80
100***
***
Valores de PPFP
Valores de PPFP
Infe
cçã
o T
cI
(ce
pa
Co
lom
bia
na)
Infe
cçã
o T
cV
I(c
epa
CL)
Infe
cçã
o T
cII
(cepa Y
)
Infe
cçã
o T
cI
(ce
pa
Co
lom
bia
na)
Infe
cçã
o T
cV
I(c
epa C
L )
Infe
cçã
o T
cII
(cepa Y
)
Infe
cçã
o T
cI
(ce
pa C
olo
mbia
na)
Infe
cçã
o T
cV
I(c
epa
CL)
Reatividade Global da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para ser Aplicado no Diagnóstico Genótipo-Específico da Infecção pelo T. cruzi
A D
B E
C F
RESULTADOS
53
5.4- Estabelecimento dos pontos de corte e análise do desempenho TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção
experimental pelo T. cruzi
Com o intuito de avaliar a aplicabilidade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, linhas
de tendência foram sobrepostas (Figura 5A) ao longo da mediana global dos valores de
PPFP, com cada par de atributos pré-selecionados (Figura 5B), empregados para
estabelecer os pontos de corte e categorizar as amostras como negativas (< ponto de
corte) ou positivas (> ponto de corte).
Os pontos de corte específicos foram definidos para cada par de atributos pré-
selecionados (―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000‖, ―antígeno de TRIPO TcI na
diluição 1:4000‖ e ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000‖), sendo eles: PPFP=40%,
PPFP=50% e PPFP=45%, respectivamente (Figura 5B).
Os diagramas foram utilizados para avaliar os padrões de reatividade e calcular a
proporção de resultados positivos e negativos com cada conjunto de atributos
selecionados (―antígeno/ diluição do soro/ ponto de corte‖). A análise dos dados
demonstrou que 74% das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa
Y/TcII e 55% das amostras dos infectados com a cepa CL/TcVI foram positivas,
contrastando com a positividade de 14% das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Colombiana/TcI, com o conjunto de atributos ―antígeno de AMA
TcII na diluição 1:1000, com ponto de corte de 40%‖ (Figura 5C). O conjunto de
atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 50%‖
demonstrou resultados positivos com 83% das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Colombiana/TcI e 59% das amostras de soros dos infectados com
a cepa CL/TcVI, contrastando com a positividade de 14% das amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII (Figura 5C). Já o conjunto de atributos
―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000, com ponto de corte de 45%‖ demonstrou
resultados positivos com 72% das amostras de soros dos camundongos infectados com a
cepa Colombiana/TcI e 55% das amostras dos infectados com a cepa CL/TcVI,
contrastando com a positividade de 27% das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Y/TcII (Figura 5C).
RESULTADOS
54
Os gráficos de dispersão ilustram a reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com os distintos genótipos do T. cruzi, com os conjuntos de
atributos selecionados. Os dados demonstraram o desempenho do ―antígeno de AMA
TcII na diluição 1:1000, com ponto de corte de 40%‖ para discriminar a maioria das
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI e a
habilidade do ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 50%‖
e do ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000, com ponto de corte de 45%‖ para
discriminar a maioria das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa
Y/TcII. No geral, uma considerável porporção de amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa híbrida CL/TcVI apresentaram resultados positivos, utilizando os
conjuntos de atributos selecionados (Figura 5D).
RESULTADOS
55
TcI/cepa C
olo
mbia
na
TcIV
/cepa C
L
TcII/c
epa Y
TcI/cepa C
olo
mbia
na
TcIV
/cepa C
L
TcII/c
epa Y
TcI/cepa C
olo
mbia
na
TcIV
/cepa C
L
TcII/c
epa Y100
0
40
100
0
40
100
0
50
100
0
50
100
0
45
100
0
45
Val
ore
s d
e P
PFP
(%
)
Ne
gati
voP
osi
tivo
Universo dos Dados
a-AMA TcII 1000 a-EPI TcVI 1000 a-TRIPO TcI 4000
Pontos de corte
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
25
50
Anti- AMA TcII 1000 Anti-EPI TcVI 1000Anti-TRIPO TcI 4000
Valores de PPFP
Infecção por TcI(cepa Colombiana )
Infecção por TcVI(cepa CL)
Infecção por TcII(cepa Y)
Fre
qu
en
cy(%
)
a-AMA TcII 1000 a-EPI TcVI 1000 a-TRYPO TcI 4000
A
B CEstabelecimento dos Pontos de Corte pela Mediana Global
Estabelecimento dos Pontos de Corte e Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no Diagnóstico Genótipo-Específico da Infecção pelo T. cruzi
100
0
40
100
0
40
100
0
50
100
0
50
100
0
45
100
0
45
Val
ore
s d
e P
PFP
(%
)
Infe
cçã
o p
or
TcI
(cepa C
olo
mbia
na)
Infe
cç
ão
po
r T
cV
I
(ce
pa
CL
)
Infe
cção p
or
TcII
(cepa Y
)
D
86%
74% 83%
86% 73%
72%
55%
45%
59%
41%
55%
45%
14%
83%
55%
59%
74%
14%
72%
55%
27%
Anti-AMA TcII 1000 Anti-EPI TcVI1000Anti-TRIPO TcI 4000
Infe
cçã
o p
or
TcI
(cepa C
olo
mbia
na)
Infe
cç
ão
po
r T
cV
I
(ce
pa
CL
)
Infe
cção p
or
TcII
(cepa Y
)
Infe
cção p
or
TcI
(cepa C
olo
mbia
na)
Infe
cç
ão
po
r T
cV
I
(ce
pa
CL
)
Infe
cçã
o p
or
TcII
(cepa Y
)
RESULTADOS
56
Figura 5: Estabelecimento dos pontos de corte e análise do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-
Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi. (A) As
linhas de tendência de reatividade para ―anti-AMA TcII 1:1000‖, ―anti-TRIPO TcI 1:4000‖ e ―anti-EPI
TcVI 1:1000‖ observadas nas amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi (cepa
Colombiana= , cepa CL/TcVI = e cepa Y/TcII = ) foram sobrepostas com o intuito de
diferenciar o padrão de reatividade. Os resultados foram expressos em proporção de amostras que
apresentaram determinados valores de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) entre os
camundongos infectados pelo T. cruzi. (B) O conjunto dos dados de reatividade foi utilizado para calcular
a mediana global dos valores de PPFP e definição dos pontos de corte capazes de segregar as amostras
individuais como negativas ( ) ou positivas ( ), para cada antígeno/diluição do soro selecionados. (C)
Os diagramas foram utilizados para estabelecer os padrões de reatividade e calcular a prorporção de
resultados positivos e negativos para cada conjunto de atributos selecionados (―antígeno/diluição do soro/
ponto de corte‖). (D) Os gráficos de dispersão ilustram a habilidade de cada conjunto de atributos
(―antígeno/diluição do soro/ ponto de corte‖) para discriminar a reatividade das amostras de soros entre os
camundongos infectados pelo T. cruzi (Colombiana/TcI, n=29; CL/TcVI, n=29; Y/TcII, n=35). Os
resultados foram expressos como a mediana dos valores de PPFP para as amostras de soros individuais.
As linhas pontilhadas representam o ponto de corte para cada antígeno/diluição do soro. Os grupos com
padrões de reatividade distintos foram destacados por quadros pontilhados cinza claros, enquanto que os
grupos com padrão de distribuição indiscriminada foram destacados por quadros contínuos brancos.
5.5- Desempenho combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi em dois
distintos protótipos populacionais.
O desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a utilizando uma
análise combinada dos dados foi avaliado em dois protótipos populacionais (cepas
Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII e cepas Colombiana/TcI x Y/TcII), selecionados
para exemplificar a distribuição da infecção humana pelo T. cruzi em distintas regiões
geográficas da América Latina. A análise dos dados foi realizada utilizando o conjunto
de atributos pré-selecionados (―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000, com ponto
de corte de 40%‖, ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de
50%‖ e ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000, com ponto de corte de 45%‖), como
demonstrado na Figura 6.
Os gráficos tri-dimensionais foram construídos para a obtenção de uma visão
panorâmica da reatividade combinada das amostras, com os três conjuntos de atributos
pré-selecionados (Figuras 6A e 6B). A análise dos dados foi realizada nos dois
prótotipos populacionais (cepas Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII, Figura 6A) e
(cepas Colombiana/TcI x Y/TcII, Figura 6B).
Os resultados obtidos para o primeiro protótipo populacional (cepas
Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII) demonstraram que as amostras de soros dos
RESULTADOS
57
camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI foram confinadas para uma região
de alta reatividade ―anti-TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ (eixo lateral direito) e baixa
reatividade ―anti-AMA TcII na diluição 1:1000‖ (eixo vertical). Em contraste, as
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII foram confinadas
para uma região de baixa reatividade ―anti-TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ (eixo lateral
direito) e alta reatividade ―anti-AMA TcII na diluição 1:1000‖ (eixo vertical). Um sutil
deslocamento das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII
para a região de baixa reatividade ―anti-EPI TcVI na diluição 1:1000‖ foi também
observado. As amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa CL/TcVI
apresentaram um padrão de distribuição atípico (Figura 6A).
O padrão de distribuição dicotômico da reatividade das amostras com os três
conjuntos de atributos pré-selecionados foi mais evidente no segundo protótipo
populacional, o qual inclui apenas amostras de soros de camundongos infectados com as
cepas Colombiana/TcI e Y/TcII (Figura 6B).
As árvores de decisão foram construídas para os dois protótipos populacionais
(Figuras 6C e 6D). O algoritmo proposto para o primeiro protótipo populacional
demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 50%‖
como atributo raiz, seguido pelo ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000, com ponto
de corte de 40%‖ como primeiro ramo e o ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000,
com ponto de corte de 45%‖ como segundo ramo, para classificar as amostras de soros
dos camundongos infectados com as cepas Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII, com
uma baixa acurácia global (69%, LOOCV=58) (Figura 6C). Os dados obtidos para o
segundo protótipo populacional indicaram o mesmo algoritimo da árvore de decisão,
porém com uma alta acurácia global (93,8%, LOOCV=87,5%) (Figura 6D).
Os gráficos de barras foram construídos para ilustrar a classificação categórica
proposta pelas árvores de decisão, demonstrando o número de animais que foram
classificados dentro de cada ramo entre os camundongos infectados pelo T. cruzi, para o
primeiro protótipo populacional (cepas Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII, Figura
6E) e para o segundo protótipo populacional (cepas Colombiana/TcI x Y/TcII, Figura
6F). Os dados demonstraram que o algoritmo proposto para o primeiro protótipo
populacional não foi capaz de classificar as amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa CL/TcVI, disseminando-se dentro dos ramos (Figura 6E). Por
outro lado, o algoritmo proposto para o segundo protótipo populacional apresentou um
RESULTADOS
58
menor erro classificatório, sendo verificado em apenas quatro amostras (uma amostra de
camundongo infectado com a cepa Colombiana/TcI e três amostras de camundongos
infectados com a cepa Y/TcII) (Figura 6F).
20
40
60
80
10010010020
4060
80100100100
20
40
60
80
100100100
20
40
60
80
10010010020
4060
80100100100
20
40
60
80
100100100
20
40
60
80
10010010020
4060
80100100100
20
40
60
80
100100100
0
25
50
75
100
TcI (Cepa COL) TcVI (Cepa CL ) TcII (Cepa Y)
POSNEG
NEG POSNEGPOS
NEG POS
20
6
11
3
4
1
8
4
5
21
a-EPI TcVI
TODOS
4
5
1
0
25
50
75
100
TcI (Cepa COL) TcII (Cepa Y)
2
4
1
8 21 20
4
3
1
A B
E F
a-AMA TcII
a-TRIPO TcI POSNEG
NEG POSNEGPOS
POSNEG
TODOS
POSNEG
AII 1000AII 1000AII 1000 AII 1000
C TI 4000
COL (26/6) CL (20/9)Y (26/5)EVI 1000
COL (8/4)Y (13/5)
TI 4000
COL (20) EVI 1000
COL (6/2)Y (3)
Y (21)EVI 1000
COL (5/1)Y (9/1)
D≤ 50% > 50%
≤ 40% > 40% ≤ 40% > 40%
≤ 45% > 45% ≤ 45% > 45%
≤ 50% > 50%
≤ 40% > 40% ≤ 40% > 40%
≤ 45% > 45%
Fre
quên
cia (%
)
Fre
quên
cia (%
)
Desempenho Combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no Diagnóstico Genótipo-Específico da
Infecção pelo T. cruzi
a-EPI TcVI
a-AMA TcII
a-TRIPO TcI
Acurácia Global= 69%LOOCV = 58%
Acurácia Global = 93,8%LOOCV = 87,5%
Colombiana/TcI x Y/TcII
Protótipos Populacionais
20
40
60
80
10010010020
4060
80100100100
20
40
60
80
100100100
20
40
60
80
10010010020
4060
80100100100
20
40
60
80
100100100
Colombiana/TcI x CL/TcVI x Y/TcII
a-A
MA
TcII
1000
a-A
MA
TcII
1000
RESULTADOS
59
Figura 6: Desempenho combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi em dois protótipos populacionais. Os
gráficos 3D foram utilizados para identificar pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a a reatividade
entre as amostras de soros de camundongos infectados pelo T. cruzi em dois protótipos populacionais
incluindo: (A) Colombiana/TcI ( , n=29) x CL/TcVI ( , n=29) x Y/TcII ( , n=35) ou (B)
Colombiana/TcI ( , n=29) x Y/TcII ( , n=35), utilizando os três pares de atributos selecionados
(―antígeno/ diluição do soro‖). Os dados foram expressos em escala Log dos valores de percentual de
parasitos fluorescentes positivos (PPFP) para ―anti-TRIPO TcI na diluição 1:4000‖ (eixo lateral direito),
―anti-AMA TcII na diluição 1:1000‖ (eixo vertical) e ―anti-EPI TcVI na diluição 1:1000‖ (eixo lateral
esquerdo). As árvores de decisão foram construídas utilizando o conjunto de atributos (―antigeno/diluição
do soro/ ponto de corte‖) para criar algoritmos (atributos raiz e ramos) e classificar os camundongos
infectados pelo T. cruzi nos protótipos populacionais: (C) Colombiana/TcI ( ) x CL/TcVI ( ) x
Y/TcII ( ) ou (D) Colombiana/TcI ( ) x Y/TcII ( ). A acurácia global e o ―leave-one-out-cross-
validation-LOOCV‖ foram fornecidos na figura. Os gráficos de barras representam o desempenho das
árvores de decisão, demonstrando o número de animais classificados dentro de cada ramo entre os
camundongos infectados pelo T. cruzi: (E) (Colombiana/TcI= x CL/TcVI= x Y/TcII= ) e (F)
(Colombiana/TcI= x Y/TcII= ).
As análises discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o
diagnóstico genótipo-específico dos grupos infectados pelo T. cruzi, realizadas para os
dois protótipos populacionais, estão demonstradas na Figura 7. Na análise combinada
dos dados os resultados indicaram que para o primeiro protótipo populacional a
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a categorizou 82,8% das amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI e 82,9% das amostras de soros
dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII. Entretanto, apenas 38% das amostras
de soros dos camundongos infectados com a cepa CL/TcVI foram classificadas
corretamente (Figura 7A). Se considerarmos o cenário representado pelo segundo
protótipo populacional, os dados demonstraram que 96,6% das amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI e 91,4% das amostras de soros
dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII foram classificadas corretamente
(Figura 7B).
RESULTADOS
60
Figura 7: Análises discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico
genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi. (A) Foram realizadas as análises
discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico genótipo-específico da
infecção experimental pelo T. cruzi no primeiro protótipo populacional, compreendendo as cepas
Colombiana/TcI n=29, CL/TcVI n=29 e Y/TcII n=35. (B) Foram realizadas as análises discriminantes da
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental
pelo T. cruzi no segundo protótipo populacional, compreendendo as cepas Colombiana/TcI e Y/TcII. A
acurácia global e o leave-one-out-cross-validation-LOOCV estão representados na figura.
Infecção Verdadeira
TcI
(cepa COL )
TcVI
(cepa CL)
TcII
(cepa Y )GRUPOS
Cla
ssif
icaç
ãod
a In
fecç
ão
n=29 n=29 n=35
TcI
(cepa COL )24 (82,8%) 9 (31,0%) 1 (0,02%)
TcVI(cepa CL )
4 (13,7%) 11 (38,0%) 5 (17,08%)
TcII(cepa Y)
1 (3,4%) 9 (31,0%) 29 (82,9%)
LOO
CV
TcI
(cepa COL )20 (69,0%) 9 (31,0%) 1 (0,02%)
TcVI
(cepa CL )4(13,8%) 11 (38,0%) 11 (34,28%)
TcII
(cepa Y)5 (17,2%) 9 (31,0%) 23 (65,7%)
Total
n=93
64 (68.8%)
54 (58.0%)
Infecção Verdadeira
TcI(cepa COL )
TcII(cepa Y )
GRUPOS
Cla
ssif
icaç
ãod
a In
fecç
ão
n=29 n=35
TcI(cepa COL )
28 (96,6%) 3 (8,6%)
TcII
(cepa Y)1 (3,4%) 32 (91,4%)
LOO
CV
TcI(cepa COL )
24 (82,8%) 3 (8,6%)
TcII
(cepa Y)5 (17,2%) 32 (91,4%)
Total
n=64
60 (93,8%)
56 (87,5%)
A
B
Infecção pelo T. cruzi com as cepas Colombiana/TcI x CL/TcVI ou Y/TcII
Análises Discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no Diagnóstico Genótipo-Específico da Infecção pelo T. cruzi
Infecção com as cepas Colombiana/TcI ou Y/TcII
RESULTADOS
61
5.6- Definição de um critério de análise para ser utilizado no diagnóstico universal
e genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi por meio da técnica
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em dois distintos protótipos
populacionais
Foram construídos diagramas de reatividade utilizando o conjunto de atributos
pré-selecionados: ―antígeno de TRIPO TcII na diluição 1:500, com ponto de corte de
20%‖ para o diagnóstico universal e ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000, com
ponto de corte de 40%‖, ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de
corte de 50%‖ e ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000, com ponto de corte de
45%‖ para o diagnóstico genótipo-específico (Figura 8). A reatividade das amostras nas
diluições dos soros selecionadas (Figura 8- retângulos tracejados) foram utilizadas
para criar painéis de reatividade com aplicabilidade no diagnóstico universal (NI x
camundongos infectados pelo T. cruzi, Figura 8B), e no diagnóstico genótipo-
específico, para o primeiro protótipo populacional (cepas Colombiana/TcI x CL/TcVI x
Y/TcII, Figura 8B), e para o segundo protótipo populacional (cepas Colombiana/TcI x
Y/TcII, Figura 8C).
Na proposta de diagnóstico universal da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a, o atributo a-TII (tripomastigota TcII) 500 (>20%) quando positivo (+) define a
presença da infecção pelo T. cruzi e quando negativo (-) evidencia a ausência da
infecção pelo parasito.
Foram construídos painéis de reatividade para a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a com aplicabilidade no diagnóstico genótipo-específico, independente do
protótipo populacional. Nesses painéis, as sequências a-TI (tripomastigota TcI) 4000
(>50%)/a-AII (amastigota TcII) 1000 (>40%)/a-EVI (epimastigota TcVI) 1000(>45%)
foram utilizadas para indicar a infecção pelo T. cruzi com distintos genótipos, definidas
como: (+/-/não se aplica (na) ou -/-/+) infecção com a cepa Colombiana/TcI e (-/+/na ou
-/-/-) infecção com a cepa Y/TcII. A extensão da sequência (+/+) não possibilitou a
identificação correta do genótipo do T. cruzi, uma vez que ela pode pertencer a
camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI (+/+/+), ou com a cepa CL/TcVI
(+/+/na) ou ainda com a cepa Y/TcII (+/+/-) (Figuras 8B e 8C).
RESULTADOS
62
a-T
II500
(>20%
)
(-)
(+)
Co
nclu
são
NI
T. cruzi
Diluição Seriado do Soro (1:5001:64000)
Infe
cção
por
TcI
(cepa
Colo
mbia
na
))In
fecção
por
TcII
(cepa
Y)
Infe
cçã
oporTcV
I(c
epa
CL
)N
ão
Infe
cta
do
C
Diagnóstico COL vs Y
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow IgG2a
Painel de Reatividade- Segundo Protótipo
Populacional
Diagnóstico Universal Diagnóstico COL vs CL vs Y
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow IgG2a
Painel de Reatividade – Primeiro Protótipo
Populacional
TRIPO TcI
PPFP>50%PPFP>20% PPFP>40%
AMA TcII EPI TcVI
PPFP>45%
TRIPO TcII
Diagrama de Reatividade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow IgG2aA
B
Critério para Definição do Diagnóstico Universal e Genótipo-Específico da Infecção pelo T. cruzi pelaTcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
Diagnóstico Universal Diagnóstico Genótipo-Específico
a-T
I4000
(>50%
)
a-A
II 1
000
(>40%
)
a-E
VI 1
000
(>45%
)
(+) (-) na
(-) (-) (+)
(-) (+) na
(-) (-) (-)
(+) (+) na
Co
nclu
são
COL
COL
Y
Y
CL
a-T
I4000
(>50%
)
a-A
II 1
000
(>40%
)
a-E
VI 1
000
(>45%
)
(+) (+) (+)
(+) (-) na
(-) (-) (+)
(+) (+) (-)
(-) (+) na
(-) (-) (-)
Co
nclu
são
COL
COL
COL
Y
Y
Y
RESULTADOS
63
Figura 8: Critério para definição do diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção
experimental pelo T. cruzi pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em dois protótipos
populacionais. (A) Os diagramas de reatividade foram construídos para se obter uma visão panorâmica
da aplicabilidade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico universal e genótipo-
específico da infecção experimental pelo T. cruzi. Os dados fornecidos pelas análises foram utilizados
para pré-selecionar os antígenos e os pontos de corte específicos. Foram definidos os valores positivos
para a proposta de diagnóstico universal (TRIPO TcII, PPFP>20%) e o critério para o diagnóstico
genótipo-específico (TRIPO TcI, PPFP>50%; AMA TcII, PPFP>40% e EPI TcVI, PPFP>45%), baseado
na reatividade diferencial positiva das amostras de soros (cepa Colombiana/TcI= n=29, cepa CL/TcVI
= n=29 e cepa Y/TcII = n=35) e na reatividade negativa das amostras ( ), observada em
camundongos infectados pelo T. cruzi e não infectados. As diluições dos soros selecionadas pelas árvores
de decisão foram destacadas por retângulos pontilhados e dessa forma foram incluídos: TRIPO TcII
PPFP>20% na diluição 1:500 para o diagnóstico universal, e o conjunto de atributos (TRIPO
TcI/PPFP>50%/4000 seguido por AMA TcII/PPFP>40%/1000 e EPI TcVI/PPFP>45%/1000) como o
critério de diagnóstico genótipo-específico. Os painéis de reatividade foram construídos para classificar as
amostras de soros testadas na TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o (B) diagnóstico universal
da infecção pelo T. cruzi e para o diagnóstico genótipo-específico, nos protótipos populacionais
incluindo: as cepas Colombiana/TcI (COL), CL/TcVI ou Y/TcII ou (C) incluindo apenas as cepas
Colombiana/TcI (COL) ou Y/TcII.
Diante dos resultados obtidos, os painéis de reatividade para a TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a permitiram a classificação das amostras de soros como
pertencentes aos seus respectivos grupos, indicando assim o pontencial dessa
metodologia para o diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção
experimental pelo T. cruzi.
RESULTADOS
64
RESULTADOS – CAPÍTULO 2
DIAGNÓSTICO GENÓTIPO-ESPECÍFICO NO CONTEXTO DA INFECÇÃO
EXPERIMENTAL SIMPLES E MISTA PELO T. cruzi
Os resultados apresentados na no capítulo 2 do trabalho consistem na avaliação
do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-
específico da infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando amostras de soros de
camundongos com infecções simples e mistas, em infecções recentes e tardias. Tendo
em vista que não se observou diferença estatística entre os valores de reatividade dos
camundongos em 90 e 180 dias pós-infecção, a avaliação do desempenho dessa
metodologia foi realizada considerando os valores de reatividade em conjunto nesses
dois tempos. Vale a pena ressaltar que no capítulo 2 foram considerados também os
valores de reatividade das amostras com infecções recentes.
5.7- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
dicriminação das infecções experimentais recentes e tardias pelo T. cruzi
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 3:
Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais recentes e tardias pelo T. cruzi. Foram
utilizados como antígeno as formas amastigotas (AMA), tripomastigotas (TRIPO) e
epimastigotas (EPI) do T. cruzi das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi
avaliada a reatividade de 10 amostras de soros de camundongos não infectados (NI), de
110 amostras de soros de camundongos com infecções recentes e de 200 amostras de
soros de camundongos com infecções tardias, independente da cepa/genótipo que os
camundongos foram infectados e se foi uma infecção simples ou mista.
Foram construídos gráficos de radares com os valores de reatividade média de
cada um dos grupos em percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP), para
obter uma visão panorâmica da reatividade das amostras de soros dos camundongos NI
e dos camundongos nas infecções recentes e tardias (Figura 9A). De modo geral,
observou-se uma maior reatividade das amostras de soros com as formas amastigotas e
epimastigotas nas infecções tardias do que nas infecções recentes, independente do
RESULTADOS
65
genótipo do T. cruzi. A reatividade das amostras com as formas tripomastigotas se
manteve elevada tanto nas infecções recentes quanto nas infecções tardias, sendo um
pouco mais evidente nas infecções tardias para os genótipos TcI e TcII do T. cruzi
(Figura 9A).
Com o intuito de estabelecer possíveis pares de atributos (―antígeno/diluição do
soro‖) para diferenciar as amostras de soro dos camundongos infectados pelo T. cruzi
nas infecções recentes e tardias, foram traçadas curvas de titulação com a reatividade
média das amostras de soros em PPFP, nas oito diluições do soro testadas (1:500 a
1:64000) (Figura 9B). Em seguida, foram realizadas análises utilizando o programa R,
a fim de calcular a distância modular entre as infecções recentes e tardias, considerando
os diferentes pontos da curva, com cada antígeno (AMA, TRIPO e EPI dos genótipos
TcI, TcVI e TcII do T. cruzi) e diluição do soro (1:500 a 1:64000), separadamente. Os
resultados demonstraram que os seguintes pares de atributos discriminaram as amostras
de soro nas infecções recentes e tardias pelo T. cruzi: AMA TcI 1:500, TRIPO TcI
1:16000, EPI TcI 1:2000, AMA TcVI 1:500, TRIPO TcVI 1:4000, EPI TcVI 500, AMA
TcII 1:500, TRIPO TcII 1:32000 e EPI TcII 1:500, como demonstrado nos gráficos de
box plot (Figura 9C). As análises pelos testes de Kruskall-Wallis seguido por Dunn`s
para comparação entre os dois grupos, demonstraram que os pares de atributos: AMA
TcI 1:500, TRIPO TcI 1:16000, EPI TcI 1:2000, AMA TcVI 1:500, TRIPO TcVI
1:4000, EPI TcVI 1:500, AMA TcII 1:500, TRIPO TcII 1:32000 e EPI TcII 1:500
discriminaram a maior reatividade das amostras de soros nas infecções recentes e
tardias, da menor reatividade das amostras de soros dos camundongos não infectados.
Além dos mais, esse pares de atributos segregaram a maior reatividade das amostras de
soros dos camundongos nas infecções tardias, da menor reatividade das amostras de
soros dos camundongos nas infecções recentes (Figura 9C).
Foram realizadas análises pela curva ROC, ou pela média global ou pela
mediana global para definição dos pontos de corte com cada um dos nove pares de
atributos pré-selecionados. Os pontos de corte selecionados para a discriminação das
amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi, nas infecções recentes e
tardias foram definidos de acordo com os dados obtidos pela curva ROC, sendo: 30% de
PPFP para AMA TcI 1:500, 75% de PPFP para TRIPO TcI 1:16000, 55% de PPFP para
EPI TcI 1:2000, 20% de PPFP para AMA TcVI 1:500, 45% de PPFP para TRIPO TcVI
RESULTADOS
66
1:4000, 55% de PPFP para EPI TcVI 1:500, 60% de PPFP para AMA TcII 1:500, 30%
de PPFP para TRIPO TcII 1:32000 e 55% de PPFP para EPI TcII 1:500.
Análises subsequentes considerando a maior distância modular entre os grupos,
ou seja, o maior somatório do delta, selecionaram o melhor conjunto de atributos
(―antígeno/diluição do soro/ponto de corte‖) para diferenciar as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias. O conjunto de
atributos elegido foi o ―antígeno de epimastigota TcII na diluição 1:500, com ponto de
corte de 55%‖ (Figura 9C).
Com o intuito de avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico diferencial das infecções experimentais recentes e tardias pelo T.
cruzi, foram construídas árvores de decisão utilizando os nove conjuntos de atributos
pré-selecionados (―antígeno/ diluição do soro/ ponto de corte‖) (Figura 9D). O
algoritmo proposto pela árvore de decisão demonstrou o ―antígeno de EPI TcII na
diluição 1:500 com ponto de corte de 55%‖ como atributo raiz, assim como observado
na análise do maior somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em
seguida, foi selecionado o ―antígeno de EPI TcI na diluição 1:2000 com ponto de corte
de 55%‖ como primeiro ramo e o ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:500 com ponto
de corte de 60%‖ como segundo ramo, para classificar as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias, com uma
acurácia global moderada (81%, LOOCV=81%) (Figura 9D). Quando as amostras de
soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi forem positivas com EPI TcII 1:500
PPFP=55% elas serão classificadas como de infecção tardia. As amostras que forem
negativas com EPI TcII 1:500 PPFP=55% e positivas com EPI TcI 1:2000 PPFP=55%
serão classificadas como de infecção tardia. As amostras que forem negativas com EPI
TcI 1:2000 PPFP=55% e positivas com AMA TcII 1:500 PPFP = 60% serão
classificadas como de infecção tardia, e as que forem negativas com AMA TcII 1:500
PPFP = 60% serão classificadas como de infecção recente (Figura 9D). No total, das
310 amostras avaliadas, 250 (81%) foram classificadas corretamente como pertencentes
aos seus respectivos grupos. Das 110 amostras de soros das infecções recentes, 63
(57%) foram classificadas corretamente e das 200 amostras de soros das infecções
tardias, 187 (94%) foram classificadas adequadamente.
RESULTADOS
67
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
NI Acute Chronic
0
50
100
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI1
00
0
TI4
00
0
TI1
60
00
TI6
40
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I10
00
AV
I40
00
AV
I16
00
0
AV
I64
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I10
00
EV
I40
00
EV
I16
00
0
EV
I64
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
10
00
TII
40
00
TII
16
00
0
TII
64
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI1
00
0
TI4
00
0
TI1
60
00
TI6
40
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I10
00
AV
I40
00
AV
I16
00
0
AV
I64
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I10
00
EV
I40
00
EV
I16
00
0
EV
I64
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
10
00
TII
40
00
TII
16
00
0
TII
64
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI1
00
0
TI4
00
0
TI1
60
00
TI6
40
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I10
00
AV
I40
00
AV
I16
00
0
AV
I64
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I10
00
EV
I40
00
EV
I16
00
0
EV
I64
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
10
00
TII
40
00
TII
16
00
0
TII
64
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
PP
FP
A
B
Antígenos Alvo e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi
AI5
00
AI6
40
00
TI5
00
TI6
40
00
EI5
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AI6
40
00
TVI5
00
TIV
64
00
0EV
I50
0
EVI6
40
00
AII
50
0
AII
64
00
0TI
I50
0
TII6
40
00
EII5
00
EII6
40
00
CReatividade Geral
Curva de Titulação
Pares de Atributos Pré-Selecionados
D
Visão Panorâmica da Reatividade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a nas Fases Aguda e Crônica da Infecção Experimental pelo T. cruzi
NI Aguda Crônica
Grupos do Estudo
Aguda Crônica
Infecção pelo T. cruzi
Infecção pelo T. cruzi
AI 500
AVI 500
AII 500
TI 16.000
TVI 4.000
TII 32.000
EI 2.000
EVI 500
EII 500
PP
FPP
PFP
PP
FP
100
50
0
PP
FP
Não-Infectado(NI)
a-AMA a-TRIPO a-EPI
Antígenos Alvo
Genótipo TcVI do T. cruzi
Acurácia Global = 81% (250/310)
LOOCV = 81% (250/310)
Árvore de Decisão
NI Aguda Crônica NI Aguda Crônica
Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi
Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
EI 2000
EII 500
Crônica (196/34)
Crônica (28/10)AII 500
Crônica (10/3)Aguda (76/13)
≤ 55% > 55%
≤ 55% > 55%
≤ 60% > 60%
RESULTADOS
68
Figura 9: Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na discriminação
das amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias.
(A) Os gráficos foram construídos para se obter uma visão panorâmica da reatividade das amostras de
soros dos grupos (não infectados-NI = n=10, infectados pelo T. cruzi nas infecções recentes = n =
110 e infectados pelo T. cruzi nas infecções tardias = n= 200) pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a. Foi avaliada a reatividade das amostras com os antígenos alvo de AMA = , TRIPO = e EPI =
dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi. Os dados foram expressos como média dos valores de
percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP). (B) Foram traçadas curvas de titulação com a
reatividade média em PPFP das amostras de soros dos camundongos não infectados = , infectados pelo
T. cruzi nas infecções recentes = e infectados pelo T. cruzi nas infecções tardias= , com os antígenos
de AMA = dos genótipos TcI (AI), TcVI (AVI) e TcII (AII), TRIPO = dos genótipos TcI (TI), TcVI
(TVI) e TcII (TII) e EPI = dos genótipos I (EI), VI (EVI) e II (EII) do T. cruzi, nas oito diluições do
soro testadas (1:500 a 1:64000). (C) A reatividade entre as amostras de soros dos grupos não infectados
(NI), infectados pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias foram comparadas com cada par de
atributos pré-selecionados: AMA TcI na diluição 1:500 (AI 500), AMA TcVI na diluição 1:500 (AVI
500), AMA TcII na diluição 1:500 (AII 500), TRIPO TcI na diluição 1:16000 (TI 16000), TRIPO TcVI
na diluição 1:4000 (TVI 4000), TRIPO TcII na diluição 1:32000 (TII 32000), EPI TcI na diluição 1:2000
(EI 2000), EPI TcVI na diluição 1:500 (EVI 500) e EPI TcII na diluição 1:500 (EII 500). O gráfico
destacado em cinza representa os atributos nas quais as amostras de soros dos camundongos nas infecções
recentes e tardias apresentaram maior distância modular entre os grupos. Os resultados foram expressos
como a mediana dos valores de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) em gráficos de box
plot, com os valores atípicos representados por pontos cinza. Foram realizadas análises estatísticas pelos
testes Kruskall-Wallis seguido por Dunn`s para comparação entre os grupos. As diferenças foram
consideradas significativas com p<0,05 e as diferenças estatísticas entre os grupos estão representadas
pelas linhas conectoras dentro dos gráficos. (D) A árvore de decisão foi construída utilizando os
conjuntos de atributos pré-selecionados (―antigeno/diluição do soro/ ponto de corte‖) para criar
algoritmos (atributos raiz e ramos), a fim de classificar as amostras de soros dos camundongos infectados
pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias. A acurácia global e o ―leave-one-out-cross-validation-
LOOCV‖ foram fornecidos na figura.
Diante dos resultados obtidos, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
apresentou um bom desempenho no diagnóstico diferencial das fases aguda e crônica da
infecção experimental pelo T. cruzi.
5.8- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais simples e mistas com distintos genótipos
do T. cruzi nas infecções recentes e tardias
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 4:
Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na
discriminação das infecções experimentais simples e mistas com distintos genótipos
do T. cruzi nas infecções recentes e tardias. Foram utilizados como antígeno as
formas amastigotas, tripomastigotas e epimastigotas do T. cruzi das cepas
RESULTADOS
69
Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi avaliada a reatividade das amostras de soros
dos camundongos com infecções recentes, simples (n=50) e mistas (n=60) do T. cruzi, e
com infecções tardias, simples (n=93) e mistas (n=107) do T. cruzi, pela TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a (Figuras 10 e 11).
Foram construídos gráficos de radares e curvas de titulação (1:500 a 1:64000)
com os valores de reatividade média de cada um dos grupos, em percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP), para obter uma visão panorâmica da reatividade dos
soros dos camundongos com infecções simples e mistas do T. cruzi, em infecções
recentes e tardias (Figura 10). De modo geral, observou-se uma maior reatividade das
amostras de soros com as formas tripomastigotas nas infecções mistas, em relação às
infecções simples, tanto nas infecções recentes quanto nas infecções tardias. Nas
infecções recentes, houve um aumento da reatividade das amostras de soros com as
formas amastigotas e epimastigotas nas infecções mistas em relação às infecções
simples, com o antígeno do genótipo TcII para AMA e com os antígenos dos genótipos
TcVI e TcII para EPI. Nas infecções tardias, observou-se uma maior reatividade das
amostras de soros com o antígeno de epimastigota nas infecções mistas do que nas
infecções simples do T. cruzi (Figura 10A). Os resultados observados nas curvas de
titulação foram os mesmos demonstrados nos gráficos de radares (Figura 10B).
RESULTADOS
70
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
Perfil de Reatividade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em Infecções Simples e Mistas com Distintos Genótipos do T. cruzi
PP
FP
Infecção AgudaA
B
Infecção Crônica
a-AMA
a-TRIPO
a-EPI
+
Antígenos Alvo
*
SIMPLES MISTA SIMPLES MISTA
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi
AI5
00
AI6
40
00
TI5
00
TI6
40
00
EI5
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AI6
40
00
TVI5
00
TIV
64
00
0EV
I50
0
EVI6
40
00
AII
50
0
AII
64
00
0TI
I50
0
TII6
40
00
EII5
00
EII6
40
00
Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
AI5
00
AI6
40
00
TI5
00
TI6
40
00
EI5
00
EI6
4,0
00
AV
I50
0
AI6
4,0
00
TVI5
00
TIV
64
00
0EV
I50
0
EVI6
40
00
AII
50
0
AII
64
00
0TI
I50
0
TII6
40
00
EII5
00
EII6
40
00
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
Genótipo TcVI do T. cruzi
RESULTADOS
71
Figura 10: Reatividade geral TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em infecções simples e
mistas com distintos genótipos do T. cruzi. (A) Os gráficos de radares foram construídos para obter uma
visão panorâmica da reatividade das amostras de soros dos camundongos nas infecções recentes simples
(n=50) e mistas (n=60), e nas infecções tardias simples (n=93) e mistas (n=107) do T. cruzi, com os
antígenos alvo de AMA = , TRIPO = e EPI = dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi. Os dados
foram expressos como média dos valores de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP). (B)
Curvas de titulação com a reatividade média em PPFP das amostras de soros dos camundongos infectados
pelo T. cruzi, com infecções simples ( ) e mistas (+) nas infecções recentes e com infecções simples ( )
e mistas (*) nas infecções tardias, com os antígenos alvo de AMA = dos genótipos TcI (AI), TcVI
(AVI) e TcII (AII), TRIPO = dos genótipos TcI (TI), TcVI (TVI) e TcII (TII) e EPI = dos genótipos
TcI (EI), TcVI (EVI) e TcII (EII) do T. cruzi, nas oito diluições do soro testadas (1:500 a 1:64000).
As curvas de titulação foram utilizadas para estabelecer possíveis pares de
atributos (―antígeno/diluição do soro‖) para diferenciar infecções experimentais pelo T.
cruzi simples e mistas, nas infecções recentes e tardias (Figura 10B). Diante dos dados
obtidos, foram realizadas análises pelo programa R a fim de calcular a distância
modular em cada ponto da curva, comparando as amostras de soros com infecções
simples e mistas do T. cruzi, nas infecções recentes e nas infecções tardias. Os
resultados demonstraram que os seguintes pares de atributos (―antígeno/diluição do
soro‖) diferenciaram as amostras de soro com infecções simples e mistas do T. cruzi nas
infecções recentes: AMA TcI 1:1000, TRIPO TcI 1:2000, EPI TcI 1:2000, AMA TcVI
1:8000, TRIPO TcVI 1:2000, EPI TcVI 1:2000, AMA TcII 1:2000, TRIPO TcII 1:8000
e EPI TcII 1:1000 (Figura 11A). Já nas infecções tardias, os pares de atributos que
discriminaram as amostras de soro com infecções simples e mistas do T. cruzi foram:
AMA TcI 1:500, TRIPO TcI 1:8000, EPI TcI 1:4000, AMA TcVI 1:500, TRIPO TcVI
1:4000, EPI TcVI 1:2000, AMA TcII 1:32000, TRIPO TcII 1:16000 e EPI TcII 1:4000
(Figura 11B). As análises estatísticas pelos testes de Kruskall-Wallis seguido por
Dunn`s para comparação entre os dois grupos, demonstraram que nas infecções recentes
os pares de atributos: TRIPO TcI 1:2000, AMA TcVI 1:8000, TRIPO TcVI 1:2000, EPI
TcVI 1:2000, AMA TcII 1:2000, TRIPO TcII 1:8000 e EPI TcII 1:1000 discriminaram
a maior reatividade das amostras de soros nas infecções mistas, da menor reatividade
nas infecções simples do T. cruzi (Figura 11A). Nas infecções tardias, o par de
atributos AMA TcI 1:500 segregou a maior reatividade das amostras de soros dos
camundongos na infecção simples da menor reatividade na infecção mista (Figura
11B). Ainda nas infecções tardias, os pares de atributos: TRIPO TcI 1:8000, EPI TcI
1:4000, TRIPO TcVI 1:4000, EPI TcVI 1:2000, TRIPO TcII 1:16000 e EPI TcII 1:4000
RESULTADOS
72
diferenciaram a maior reatividade das amostras de soros nas infecções mistas, da menor
reatividade nas infecções simples do T. cruzi (Figura 11B). No geral, a reatividade dos
soros nas infecções mistas foi maior do que nas infecções simples, tanto nas infecções
recentes quanto nas tardias.
Foram realizadas análises pela curva ROC, ou pela média global ou pela
mediana global para definição dos pontos de corte com cada um dos nove pares de
atributos pré-selecionados. Os pontos de corte selecionados para a discriminação das
amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi em infecções simples e
mistas, nas infecções recentes e tardias separadamente, foram definidos pela curva
ROC. Nas infecções recentes os pontos de corte elegidos foram: 25% de PPFP para
AMA TcI 1:1000, 50% de PPFP para TRIPO TcI 1:2000, 15% de PPFP para EPI TcI
1:2000, 6% de PPFP para AMA TcVI 1:8000, 50% de PPFP para TRIPO TcVI 1:2000,
30% de PPFP para EPI TcVI 1:2000, 30% de PPFP para AMA TcII 1:2000, 60% de
PPFP para TRIPO TcII 1:8000 e 40% de PPFP para EPI TcII 1:1000. Os pontos de
corte elegidos nas infecções tardias foram: de 30% de PPFP para AMA TcI 1:500, 60%
de PPFP para TRIPO TcI 1:8000, 40% de PPFP para EPI TcI 1:4000, 45% de PPFP
para AMA TcVI 1:500, 45% de PPFP para TRIPO TcVI 1:4000, 45% de PPFP para EPI
TcVI 1:2000, 6% de PPFP para AMA TcII 1:32000, 65% de PPFP para TRIPO TcII
1:8000 e 40% de PPFP para EPI TcII 1:2000.
Análises subsequentes considerando a maior distância modular entre os grupos,
ou seja, o maior somatório do delta, selecionaram os melhores conjuntos de atributos
(―antígeno/diluição do soro/ponto de corte‖) para diferenciar as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi em infecções simples e mistas, nas infecções
recentes e nas infecções tardias. O conjunto de atributos selecionado nas infecções
recentes foi o ―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:2000, com ponto de corte
de 50%‖ (Figura 11A). Nas infecções tardias, o conjunto de atributos selecionado foi o
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:8000, com ponto de corte de 60%‖
(Figura 11B).
Com o intuito de avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico diferencial das infecções experimentais simples e mistas do T.
cruzi, nas infecções recentes e tardias separadamente, foram construídas árvores de
decisão utilizando os nove conjuntos de atributos pré-selecionados (―antígeno/ diluição
do soro/ ponto de corte‖) (Figuras 11C e 11D). O algoritmo proposto pela árvore de
RESULTADOS
73
decisão nas infecções recentes demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição
1:2000 com ponto de corte de 50%‖ como o atributo raiz, assim como observado na
análise do maior somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em
seguida, foi selecionado o ―antígeno de AMA TcI na diluição 1:1000 com ponto de
corte de 25%‖ como primeiro ramo e o ―antígeno de EPI TcII na diluição 1:1000 com
ponto de corte de 40%‖ como segundo ramo, para classificar as amostras de soros dos
camundongos com infecções simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções recentes, com
uma acurácia global moderada (85%, LOOCV=84%) (Figura 11C). Quando as
amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi forem negativas com
TRIPO TcI 1:2000 PPFP=50% elas serão classificadas como infecções simples. A
amostras que forem positivas com TRIPO TcI 1:2000 PPFP=50% e negativas com
AMA TcI 1:1000 PPFP=25% serão classificadas como infecções mistas. As amostras
que forem positivas com AMA TcI 1:1000 PPFP=25% e negativas com EPI TcII 1:1000
PPFP = 40% serão classificadas como infecções simples e as que forem positivas com
EPI TcII 1:1000 PPFP = 40% serão classificadas como infecções mistas (Figura 11C).
No total, das 110 amostras avaliadas, 94 (85%) foram classificadas corretamente como
pertencentes aos seus respectivos grupos. Das 50 amostras de soros oriundas de infeções
simples, 40 (80%) foram classificadas corretamente e das 60 amostras das infecções
mistas, 54 (90%) foram classificadas adequadamente. Nas infecções tardias, o algoritmo
proposto pela árvore de decisão demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição
1:8000 com ponto de corte de 60%‖ como o atributo raiz, assim como observado na
análise do maior somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em
seguida, foi selecionado o ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:32000 com ponto de
corte de 5%‖ como primeiro ramo, para classificar as amostras de soros dos
camundongos com infecções simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções tardias, com
uma acurácia global moderada (84%, LOOCV=84%) (Figura 11D). Quando as
amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi forem negativas com
TRIPO TcI 1:8000 PPFP=60% elas serão classificadas como infecções simples. As
amostras que forem positivas com TRIPO TcI 1:8000 PPFP=60% e negativas com
AMA TcII 1:32000 PPFP=5% serão classificadas como infecções simples. As amostras
que forem positivas com AMA TcII 1:32000 PPFP=5% serão classificadas como
infecções mistas (Figura 11D). No total, das 200 amostras avaliadas, 168 (84%) foram
classificadas corretamente como pertencentes aos seus respectivos grupos. Das 93
RESULTADOS
74
amostras de soros oriundas das infeções simples, 82 (91%) foram classificadas
corretamente e das 107 amostras das infecções mistas, 86 (80%) foram classificadas
adequadamente.
RESULTADOS
75
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
Single Dual
0
50
100
AI 500
AVI 500
AII 32.000
TI 8.000
TVI 4.000
TII 16.000
EI 4.000
EVI 2.000
EII 4.000
PP
FPP
PFP
PP
FP
AI 1.000
AVI 8.000
AII 2.000
TI 2.000
TVI 2.000
TII 8.000
EI 2.000
EVI 2.000
EII 1.000
PP
FPP
PFP
PP
FP
Infecção CrônicaInfecção Aguda
Seleção dos Atributos para TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a Discriminar Infecções Simples e Mistas com Distintos Genótipos do T. cruzi
SIMPLES MISTA
Grupos do Estudo
Infecção pelo T. cruzi
SIMPLES MISTA
Infecção pelo T. cruzi
SIMPLES MISTA
Infecção pelo T. cruzi
SIMPLES MISTA
Grupos do Estudo
Infecção pelo T. cruzi
SIMPLES MISTA
Infecção pelo T. cruzi
SIMPLES MISTA
Infecção pelo T. cruzi
DC
Árv
ore
de D
ecis
ãoPa
res
de A
trib
utos
Pré-
Sele
cion
ados
BA
Árv
ore
de D
ecis
ãoPa
res
de A
trib
utos
Pré-
Sele
cion
ados
AI 1000
TI 2000
Simples (32/4)
Mista (47/4) EII 1000
Simples (14/2) Dual (15/4)
≤ 50%
> 25%≤ 25%
> 50%
≤ 40% > 40%
Acurácia Global = 85% (94/110)
LOOCV = 84% (92/110)
AII 32000
TI 8000
Siimples (64/4)
Simples (39/17) Mista (97/11)
≤ 60%
≤ 5%
> 60%
> 5%
Acurácia Gobal = 84% (168/200)
LOOCV = 84% (168/200)
RESULTADOS
76
Figura 11: Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na discriminação
de infecções experimentais simples e mistas com distintos genótipos do T. cruzi, nas infecções
recentes e nas infecções tardias. Gráficos de box plot construídos a partir das medianas de cada grupo:
infecções simples (n=50) e mistas (n=60) do T. cruzi nas infecções recentes (A) e infecções simples
(n=93) e mistas (n=107) do T. cruzi nas infecções tardias (B), para cada um dos pares de atributos pré-
selecionados, por meio das análises estatísticas no programa R, do cálculo da distância modular entre os
diferentes pontos das curvas de titulação (1:500 a 1:64000). Os pares de atributos pré-selecionados para
as infecções recentes (A) foram: AMA TcI na diluição 1:1000 (AI 1000), AMA TcVI na diluição 1:8000
(AVI 8000), AMA TcII na diluição 1:2000 (AII 2000), TRIPO TcI na diluição 1:2000 (TI 2000), TRIPO
TcVI na diluição 1:2000 (TVI 2000), TRIPO TcII na diluição 1:8000 (TII 8000), EPI TcI na diluição
1:2000 (EI 2000), EPI TcVI na diluição 1:2000 (EVI 2000) e EPI TcII na diluição 1:1000 (EII 1000). Os
pares de atributos pré-selecionados para as infecções tardias (B) foram: AMA TcI na diluição 1:500 (AI
500), AMA TcVI na diluição 1:500 (AVI 500), AMA TcII na diluição 1:32000 (AII 32000), TRIPO TcI
na diluição 1:8000 (TI 8000), TRIPO TcVI na diluição 1:4000 (TVI 4000), TRIPO TcII na diluição
1:16000 (TII 16000), EPI TcI na diluição 1:4000 (EI 4000), EPI TcVI na diluição 1:2000 (EVI 2000) e
EPI TcII na diluição 1:4000 (EII 4000). Os gráficos destacados em cinza representam os pares de
atributos nas quais as amostras de soros dos camundongos com infecções simples e mistas do T. cruzi,
nas infecções recentes (A) e nas infecções tardias (B) apresentaram maiores distâncias modulares entre os
grupos. Os resultados foram expressos como a mediana dos valores de percentual de parasitos
fluorescentes positivos (PPFP) em gráficos box plot, com os valores atípicos representados por pontos
cinzas. Foram realizadas análises estatísticas pelos testes Kruskal Wallis seguido por Dun’s para
comparação entre os grupos. As diferenças foram consideradas significativas com p<0,05, e as diferenças
estatísticas entre os grupos estão representadas pelas linhas conectoras dentro dos gráficos. As árvores de
decisão foram construídas utilizando os conjuntos de atributos pré-selecionados (―antigeno/diluição do
soro/ ponto de corte‖) para criar algoritmos (atributos raiz e ramos), a fim de classificar as amostras de
soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi em infecções simples e mistas, nas infecções recentes (C)
e nas infecções tardias (D). A acurácia global e o ―leave-one-out-cross-validation-LOOCV‖ foram
fornecidos na figura.
Diante dos resultados obtidos, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
apresentou um bom desempenho no diagnóstico diferencial das infecções experimentais
simples e mistas do T. cruzi, nas infecções recentes e nas infecções tardias.
5.9- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais recentes, simples e
mistas pelo T. cruzi
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 5:
Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental recente pelo T. cruzi,
utilizando amostras de soros de camundongos com infecções simples por
TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y e mistas por TcI/Colombiana + TcVI/CL,
TcVI/CL + TcII/Y e TcI/Colombiana + TcII/Y. Foram utilizados como antígeno as
RESULTADOS
77
formas amastigotas (AMA), tripomastigotas (TRIPO) e epimastigotas (EPI) do T. cruzi
das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi avaliada a reatividade das amostras
de soros dos seguintes grupos de camundongos infectados pelo T. cruzi:
Colombiana/TcI n=16; CL/TcVI n=15; Y/TcII n=19; Colombiana/TcI + CL/TcVI
n=16; CL/TcVI + Y/TcII n=24 e Colombiana/TcI + Y/TcII n=20.
Foram construídos gráficos de radares e curvas de titulação (1:500 a 1:64000)
com a reatividade média em PPFP das amostras de soros, para obter uma visão
panorâmica da reatividade genótipo-específica dos soros dos camundongos com
infecções recentes, simples e mistas do T. cruzi (Figura 12). De modo geral, observou-
se por meio dos gráficos de radares que todas as amostras de soros dos camundongos
tanto em infecções simples quanto em infecções mistas apresentaram alta reatividade
com o antígeno de TRIPO TcII, demonstrando novamente ser um bom antígeno para o
diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi. Os soros dos
camundongos apresentaram baixa reatividade com o antígeno de amastigota nas
infecções recentes simples e mistas, exceto na infecção por CL/TcVI + Y/TcII com
AMA TcII. Além dos mais, amostras de soros oriundas de infecções simples e mistas
que envolvam a cepa Colombiana/TcI apresentam alta reatividade com TRIPO TcI. Os
soros dos camundongos infectados com CL/TcVI + Y/TcII apresentam alta reatividade
com as formas epimastigotas e tripomastigotas TcI, TcVI e TcII (Figura 12A).
A partir das curvas de titulação, observou-se que nas infecções recentes simples
as amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI reagem
mais com os antígenos de AMA TcI, TRIPO TcI e EPI TcI, do que com as amostras
provenientes das infecções com CL/TcI e Y/TcII. As amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa CL/TcVI reagem mais com AMA TcVI, do que as
amostras de soros das infecções com COL/TcI e Y/TcII. As amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII reagem menos com TRIPO TcVI e EPI
TcVI, do que as amostras provenientes das infecções com as outras duas cepas. Soros
de camundongos infectados com COL/TcI reagem menos com AMA TcII. Além disso,
todas as amostras de soros de camundongos com infecções simples apresentaram alta
reatividade com o antígeno de TRIPO TcII e EPI TcII (Figura 12B).
Analisando ainda as curvas de titulação, os resultados demonstraram que nas
infecções recentes mistas, soros de camundongos infectados com COL/TcI + Y/TcII
apresentaram maior reatividade e soros dos infectados com CL/TcVI + Y/TcII
RESULTADOS
78
apresentaram menor reatividade com o antígeno de AMA TcI. Amostras de soros
provenientes de infecções com COL/TcI + CL/TcVI reagiram mais com TRIPO TcI do
que as amostras de soros das outras duas infecções mistas. Amostras de soros
provenientes das infecções com CL/TcVI + Y/TcII reagiram menos com EPI TcI do que
as amostras de soros das outras duas infecções mistas. Os soros dos camundongos
infectados com COL/TcI + Y/TcII reagiram mais com AMA TcVI do que os soros dos
camundongos com as outras infecções mistas. Amostras de soros oriundas de infecções
com CL/TcVI + Y/TcII reagiram menos com AMA TcVI, TRIPO TcVI e EPI TcVI do
que as amostras das outras infecções mistas. Os soros dos camundongos infectados com
COL/TcI + Y/TcII reagiram mais com AMA TcII e EPI TcII do que os soros dos
camundongos com as outras duas infecções mistas. Além disso, todas as amostras de
soros de camundongos com infecções mistas apresentaram alta reatividade com o
antígeno de TRIPO TcII (Figura 12B).
RESULTADOS
79
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
Perfil de Reatividade Genótipo-Específico da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em Infecções Simples e Mistas AGUDAS com Distintos Genótipos do T. cruzi
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi
PP
FP
B
AI5
00
AI6
40
00
TI5
00
TI6
40
00
EI5
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AI6
40
00
TVI5
00
TIV
64
00
0EV
I50
0
EVI6
40
00
AII
50
0
AII
64
00
0TI
I50
0
TII6
40
00
EII5
00
EII6
40
00
AI5
00
AI6
4,0
00
TI5
00
TI6
4,0
00
EI5
00
EI6
4,0
00
AV
I50
0
AI6
4,0
00
TVI5
00
TIV
64
,000
EVI5
00
EVI6
4,0
00
AII
50
0
AII
64
,000
TII5
00
TII6
4,0
00EI
I50
0
EII6
4,0
00
Infecção AgudaA
a-AMA
a-TRIPO
a-EPI
*+
Antígenos Alvo
SIMPLES MISTA
TcII/YTcVI/CL TcVI/CL + TcII/Y
TcV
I/C
LTc
I/C
OL
TcI/
CO
L+
TcV
I/C
L
Genótipo TcVI do T. cruzi
Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
RESULTADOS
80
Figura 12: Perfil de reatividade genótipo-específico da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em
infecções recentes, simples e mistas, com distintos genótipos do T. cruzi. (A) Os gráficos de radares
foram construídos para obter uma visão panorâmica da reatividade das amostras de soros dos
camundongos com infecções recentes, simples (TcI/Colombiana-COL n=16, TcVI/CL n=15, TcII/Y
n=19) e mistas (TcI/COL + TcVI/CL n=16, TcVI/CL + TcII/Y n=24, e TcI/COL + TcII/Y n=20) do T.
cruzi, com os antígenos alvo de AMA = , TRIPO = e EPI = dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T.
cruzi. Os dados foram expressos em percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP). (B) Curvas de
titulação com a reatividade média em PPFP das amostras de soros dos camundongos infectados pelo T.
cruzi nas infecções recentes, com TcI/Colombiana-COL ( ), TcVI/CL ( ),TcII/Y ( ), TcI/COL +
TcVI/CL (+),TcVI/CL + TcII/Y (-) e TcI/COL + TcII/Y (*), com os antígenos de AMA = dos
genótipos TcI (AI), TcVI (AVI) e TcII (AII), TRIPO = dos genótipos TcI (TI), TcVI (TVI) e TcII (TII)
e EPI = dos genótipos TcI (EI), TcVI (EVI) e TcII (EII) do T. cruzi, nas oito diluições do soro testadas
(1:500 a 1:64000).
As curvas de titulação foram utilizadas para estabelecer possíveis pares de
atributos (―antígeno/diluição do soro‖) para diferenciar as infecções experimentais
genótipo-específicas simples pelo T. cruzi (Figura 13A) e para discriminar as infecções
experimentais genótipo-específicas mistas pelo T. cruzi (Figura 13B), nas infecções
recentes. Diante dos dados obtidos, foram realizadas análises pelo programa R a fim de
calcular a distância modular em cada ponto da curva, comparando as amostras de soros
com infecções recentes simples pelo T. cruzi e comparando as amostras de soros com
infecções recentes mistas pelo T. cruzi. Os resultados demonstraram que os seguintes
pares de atributos (―antígeno/diluição do soro‖) diferenciaram as amostras de soro com
infecções recentes simples pelo T. cruzi: AMA TcI 1:1000, TRIPO TcI 1:4000, EPI TcI
1:1000, AMA TcVI 1:500, TRIPO TcVI 1:500, EPI TcVI 1:500, AMA TcII 1:500,
TRIPO TcII 1:1000 e EPI TcII 1:500 (Figura 13A). Os pares de atributos que
discriminaram as amostras de soro com infecções recentes mistas pelo T. cruzi foram:
AMA TcI 1:500, TRIPO TcI 1:16000, EPI TcI 1:2000, AMA TcVI 1:1000, TRIPO
TcVI 1:500, EPI TcVI 1:2000, AMA TcII 1:2000, TRIPO TcII 1:8000 e EPI TcII
1:2000 (Figura 13B).
As análises estatísticas pelos testes de Kruskall-Wallis seguido por Dunn`s para
comparação entre os grupos, demonstraram que nas infecções recentes simples pelo T.
cruzi observou-se que: os pares de atributos AMA TcI 1:1000, TRIPO TcI 1:4000 e EPI
TcI 1:1000 segregaram a maior reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa COL/TcI, da menor reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas CL/TcVI e Y/TcII. O par de atributos AMA
TcVI 1:500 discriminou a menor reatividade das amostras dos camundongos infectados
com COL/TcI, da maior reatividade das amostras dos infectados com CL/TcVI. Os
RESULTADOS
81
pares de atributos TRIPO TcVI 1:500 e EPI TcVI 1:500 segregaram a maior reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa COL/TcI, da menor
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII, além
da maior reatividade das amostras dos camundongos infectados com CL/TcVI, da
menor reatividade das amostras dos infectados com Y/TcII. O par de atributos AMA
TcII 1:500 discriminou a menor reatividade das amostras dos camundongos infectados
com COL/TcI, da maior reatividade das amostras dos infectados com as cepas CL/TcVI
e Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcII 1:1000 segregou a menor reatividade das
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa COL/TcI, da maior
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII. Já
par de atributos EPI TcII 1:500 segregou a maior reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa COL/TcI, da menor reatividade das amostras de
soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII (Figura 13A). Nas infecções
recentes mistas pelo T. cruzi observou-se que: o par de atributos AMA TcI 1:500,
segregou a maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as
cepas COL/TcI + CL/TcVI, da menor reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, além da menor reatividade
das amostras dos camundongos infectados com COL/TcI + CL/TcVI, da maior
reatividade das amostras dos infectados com CL/TcVI + Y/TcII, e a menor reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, da
maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
CL/TcVI + Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcI 1:16000 discriminou a maior
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI
+ CL/TcVI, da menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados
com as cepas COL/TcI + Y/TcII e CL/TcVI + Y/TcII. Os pares de atributos EPI TcI
1:2000, AMA TcVI 1:1000, TRIPO TcVI 1:500 e EPI TcVI 1:2000, segregaram a
maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
COL/TcI + CL/TcVI, da menor reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, além da menor reatividade das amostras
dos camundongos infectados com COL/TcI + Y/TcII, da maior reatividade das amostras
dos infectados com CL/TcVI + Y/TcII. Os pares de atributos AMA TcII 1:2000 e EPI
TcII 1:2000 discriminaram a maior reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com as cepas CL/TcVI + Y/TcII, da menor reatividade das amostras de soros
RESULTADOS
82
dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI e COL/TcI + Y/TcII. O
par de atributos TRIPO TcII 1:8000 segregou a menor reatividade das amostras de soros
dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI, da maior reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII e
CL/TcVI + Y/TcII (Figura 13B).
Foram realizadas análises pela média global ou pela mediana global para
definição dos pontos de corte com cada um dos nove pares de atributos pré-
selecionados. Os pontos de corte selecionados para a discriminação das amostras de
soros dos camundongos com infecções genótipo-específicas simples pelo T. cruzi, nas
infecções recentes, foram definidos pela média global, sendo: 25% de PPFP para AMA
TcI 1:1000, 35% de PPFP para TRIPO TcI 1:4000, 40% de PPFP para EPI TcI 1:1000,
20% de PPFP para AMA TcVI 1:500, 45% de PPFP para TRIPO TcVI 1:500, 30% de
PPFP para EPI TcVI 1:500, 25% de PPFP para AMA TcII 1:500, 70% de PPFP para
TRIPO TcII 1:1000 e 30% de PPFP para EPI TcII 1:500. Os pontos de corte
selecionados para a discriminação das amostras de soros dos camundongos com
infecções genótipo-específicas mistas pelo T. cruzi, nas infecções recentes, foram
definidos pela mediana global, sendo: 15% de PPFP para AMA TcI 1:500, 30% de
PPFP para TRIPO TcI 1:16000, 35% de PPFP para EPI TcI 1:2000, 15% de PPFP para
AMA TcVI 1:1000, 60% de PPFP para TRIPO TcVI 1:500, 30% de PPFP para EPI
TcVI 1:2000, 25% de PPFP para AMA TcII 1:2000, 70% de PPFP para TRIPO TcII
1:8000 e 30% de PPFP para EPI TcII 1:2000.
Análises subsequentes considerando a maior distância modular entre os grupos,
ou seja, o maior somatório do delta, selecionaram os melhores conjuntos de atributos
(―antígeno/diluição do soro/ponto de corte‖) para diferenciar as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi em infecções recentes simples e em infecções
recentes mistas. O conjunto de atributos selecionado em infecções recentes simples foi o
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 35%‖
(Figura 13A). Em infecções recentes mistas, o conjunto de atributos selecionado foi o
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:16000, com ponto de corte de 30%‖
(Figura 13B).
Com o intuito de avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais recentes simples
e mistas pelo T. cruzi separadamente, foram contruídas árvores de decisão utilizando os
RESULTADOS
83
nove conjuntos de atributos pré-selecionados (―antígeno/ diluição do soro/ ponto de
corte‖) (Figuras 13C e 13D). O algoritmo proposto pela árvore de decisão em infecções
genótipo-específicas recentes simples demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na
diluição 1:4000 com ponto de corte de 35%‖ como o atributo raiz, assim como
observado na análise do maior somatório do delta, das distâncias modulares entre os
grupos. Em seguida, foi selecionado o ―antígeno de TRIPO TcVI na diluição 1:500 com
ponto de corte de 45%‖ como primeiro ramo e o ―antígeno de TRIPO TcII na diluição
1:1000 com ponto de corte de 70%‖ como segundo ramo, para classificar as amostras de
soros dos camundongos com infecções recentes simples pelo T. cruzi, com uma
acurácia global moderada (72%, LOOCV=60%) (Figura 13B). Quando as amostras de
soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi forem positivas com TRIPO TcI 1:4000
PPFP = 35% elas serão classificadas como infecção pela cepa Colombiana/TcI. A
amostras que forem negativas com TRIPO TcI 1:4000 PPFP = 35% e negativas com
TRIPO TcVI 1:500 PPFP = 45% serão classificadas como infecção pela cepa Y/TcII.
As amostras que forem positivas com TRIPO TcVI 1:500 PPFP = 45% e negativas com
TRIPO TcII 1:1000 PPFP = 70% serão classificadas como infecção pela cepa CL/TcVI,
e as que forem positivas com TRIPO TcII 1:1000 PPFP = 70% serão classificadas como
infecção pela cepa Y/TcII (Figura 13B). No total, das 50 amostras avaliadas, 36 (72%)
foram classificadas corretamente como pertencentes aos seus respectivos grupos. Das
16 amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI, das 15
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa CL/TcVI e das 19 amostras
de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII foram classificados de
maneira correta: 14 (88%) amostras de COL/TcI, 6 (40%) de CL/TcVI e 16 (84%) de
Y/TcII.
O algoritmo proposto pela árvore de decisão em infecções genótipo-específicas
recentes mistas demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:16000 com ponto
de corte de 30%‖ como o atributo raiz, assim como observado na análise do maior
somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em seguida, foi
selecionado o ―antígeno de EPI TcI na diluição 1:2000 com ponto de corte de 35%‖ e o
―antígeno de EPI TcII na diluição 1:2000 com ponto de corte de 30%‖ como primeiros
ramos e o ―antígeno de AMA TcI na diluição 1:500 com ponto de corte de 15%‖ e o
―antígeno de TRIPO TcVI na diluição 1:500 com ponto de corte de 60%‖ como
segundos ramos, para classificar as amostras de soros dos camundongos com infecções
RESULTADOS
84
recentes mistas pelo T. cruzi, com uma acurácia global moderada (80%, LOOCV=68%)
(Figura 13D). Quando as amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi
forem negativas com TRIPO TcI 1:16000 PPFP = 30% e positivas com EPI TcI 1:2000
PPFP=35% elas serão classificadas como infecções pelas cepas CL/TcVI + Y/TcII. As
amostras que forem negativas com EPI TcI 1:2000 PPFP = 35% e negativas com AMA
TcI 1:500 PPFP = 15% serão classificadas como infecções pelas cepas COL/TcI +
Y/TcII, enquanto as positivas com AMA TcI 1:500 PPFP = 15% serão classificadas
como infecções pelas cepas CL/TcVI + Y/TcII. As amostras que forem positivas com
TRIPO TcI 1:16000 PPFP = 30% e negativas com EPI TcII 1:2000 PPFP = 30% serão
classificadas como infecções pelas cepas COL/TcI + CL/TcVI. As amostras que forem
positivas com EPI TcII 1:2000 PPFP = 30% e negativas com TRIPO TcVI 1:500 PPFP
= 60% serão classificadas como infecções pelas cepas COL/TcI + Y/TcII, e as que
forem positivas com TRIPO TcVI 1:500 PPFP = 60% serão classificadas como
infecções pelas cepas CL/TcVI + Y/TcII (Figura 13D). No total, das 60 amostras
avaliadas, 48 (80%) foram classificadas corretamente como pertencentes aos seus
respectivos grupos. Das 20 amostras de soros dos camundongos infectados com as
cepas COL/TcI + Y/TcII, das 24 amostras de soros dos camundongos infectados com as
cepas CL/TcVI + Y/TcII e das 16 amostras de soros dos camundongos infectados com
as cepas COL/TcI + CL/TcVI foram classificados de maneira correta: 15 (75%)
amostras de COL/TcI + Y/TcII, 20 (83%) de CL/TcVI + Y/TcII e 13 (81%) de COL/TcI
+ CL/TcVI.
RESULTADOS
85
Grupos do Estudo
Infecção pelo T. cruzi
AI 1.000
AVI 500
AII 500
TI 4.000
TVI 500
TII 1.000
EI 1.000
EVI 500
EII 500
PP
FPP
PFP
PP
FP
MISTASIMPLES
Seleção dos Atributos para TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para Discriminar Infecções Simples e Mistas AGUDAS com Distintos Genótipos do T. cruzi
AI 500
AVI 1000
AII 2.000
TI 16.000
TVI 500
TII 8.000
EI 2.000
EVI 2000
EII 2.000
PP
FPP
PFP
PP
FP
Acurácia Global = 72% (36/50)
LOOCV = 60% (30/50) Acurácia Global = 80% (48/60)
LOOCV = 68% (41/60)
Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruziInfecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100C
OL
CL Y
0
50
100
CO
L
CL Y
0
50
100
CO
L
CL Y
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL
+Y
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL
+Y
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL
+Y
0
50
100
DC
Árv
ore
de D
ecis
ãoP
are
s d
e A
trib
uto
sP
ré-S
ele
cio
na
do
s
BA
Pa
res
de
Atr
ibu
tos
Pré
-Se
leci
on
ad
os
Árv
ore
de D
ecis
ão
TVI 500
TI 4,00
COL (19/5)
Y (14/4)
Y (10/4)CL (7/1)
≤ 35%
> 70%
≤ 45%
> 35%
≤ 70%
> 45%
TII 1000
EI 2000
TI 16000
Y + COL (14/2) Y + CL (10/4)Y + COL (4/1)
≤ 30%
> 30%≤ 35%
> 30%
≤ 60%
> 35%
TVI 500
Y + CL (5/1)
CL + COL (16/3)
≤ 30%
> 60%
Y+ CL (11/1)AI 500
≤ 15% > 15%
EII 2000
Grupos do Estudo
RESULTADOS
86
Figura 13: Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
genótipo-específico das infecções recentes, simples e mistas pelo T. cruzi. Gráficos de box plot
construídos a partir das medianas de cada grupo: infecções recentes simples (A) (TcI/Colombiana-COL
n=16 - , TcVI/CL n=15, TcII/Y n=19) e infecções recentes mistas (B) (TcI/COL + TcVI/CL n=16,
TcVI/CL + TcII/Y n=24, e TcI/COL + TcII/Y n=20), para cada um dos pares de atributos pré-
selecionados, por meio das análises estatísticas no programa R, do cálculo da distância modular entre os
diferentes pontos das curvas de titulação. Os pares de atributos pré-selecionados para as infecções
recentes simples (A) foram: AMA TcI na diluição 1:1000 (AI 1000), AMA TcVI na diluição 1:500 (AVI
500), AMA TcII na diluição 1:500 (AII 500), TRIPO TcI na diluição 1:4000 (TI 4000), TRIPO TcVI na
diluição 1:500 (TVI 500), TRIPO TcII na diluição 1:1000 (TII 1000), EPI TcI na diluição 1:1000 (EI
1000), EPI TcVI na diluição 1:500 (EVI 500) e EPI TcII na diluição 1:500 (EII 500). Para as infecções
recentes mistas (B) os seguintes pares de atributos foram pré-selecionados: AMA TcI na diluição 1:500
(AI 500), AMA TcVI na diluição 1:1000 (AVI 1000), AMA TcII na diluição 1:2000 (AII 2000), TRIPO
TcI na diluição 1:16000 (TI 16000), TRIPO TcVI na diluição 1:500 (TVI 500), TRIPO TcII na diluição
1:8000 (TII 8000), EPI TcI na diluição 1:2000 (EI 2000), EPI TcVI na diluição 1:2000 (EVI 2000) e EPI
TcII na diluição 1:2000 (EII 2000). Os gráficos destacados em cinza representam os pares de atributos nas
quais as amostras de soros dos camundongos com infecções recentes simples (A) e recentes mistas (b) do
T. cruzi apresentaram as maiores distâncias modulares entre os grupos. Os resultados foram expressos
como a mediana dos valores de percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP) em gráficos de box
plot, com os valores atípicos representados por pontos cinzas. Foram realizadas análises estatísticas pelos
testes Kruskal Wallis seguido por Dun’s para comparação entre os grupos. As diferenças foram
consideradas significativas com p<0,05, e as diferenças estatísticas entre os grupos estão representadas
pelas linhas conectoras dentro dos gráficos. As árvores de decisão foram construídas utilizando os
conjuntos de atributos pré-selecionados (―antigeno/diluição do soro/ ponto de corte‖) para criar
algoritmos (atributos raiz e ramos), a fim de classificar as amostras de soros dos camundongos infectados
pelo T. cruzi em infecções genótipo-específicas recentes simples (c) e mistas (D). A acurácia global e o
―leave-one-out-cross-validation-LOOCV‖ foram fornecidos na figura
Diante dos resultados obtidos, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
apresentou um bom desempenho no diagnóstico genótipo-específico das infecções
experimentais recentes, simples e mistas pelo T. cruzi.
5.10- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais tardias, simples e
mistas pelo T. cruzi
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 6:
Avaliar o desempenho da técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental tardia pelo T. cruzi,
utilizando amostras de soros de camundongos com infecções simples por
TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y e mistas por TcI/Colombiana + TcVI/CL,
TcVI/CL + TcII/Y e TcI/Colombiana + TcII/Y. Foram utilizados como antígeno as
RESULTADOS
87
formas amastigotas (AMA), tripomastigotas (TRIPO) e epimastigotas (EPI) do T. cruzi
das cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII. Foi avaliada a reatividade das amostras
de soros dos seguintes grupos de camundongos infectados pelo T. cruzi:
Colombiana/TcI n=29; CL/TcVI n= 29; Y/TcII n=35; Colombiana/TcI + CL/TcVI
n=28; CL/TcVI + Y/TcII n =43 e Colombiana/TcI + Y/TcII n=36.
Foram construídos gráficos de radares e curvas de titulação (1:500 a 1:64000)
com a reatividade média das amostras de soros em PPFP, para obter uma visão
panorâmica da reatividade genótipo-específica dos soros dos camundongos com
infecções tardias simples pelo T. cruzi, e com infecções tardias mistas pelo T. cruzi
(Figura 14). De modo geral, observou-se por meio dos gráficos de radares que as
amostras de soros dos camundongos com infecções simples e mistas pelo T. cruzi
apresentaram alta reatividade com o antígeno de TRIPO TcII. As amostras de soros
oriundas de infecções simples e mistas que envolvam a cepa Colombiana/TcI
apresentam baixa reatividade com o antígeno de amastigota. As amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII apresentaram maior reatividade com AMA
TcII e TRIPO TcII (Figura 14A).
A partir das curvas de titulação observou-se que nas infecções tardias simples
pelo T. cruzi as amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII
reagem menos com TRIPO TcI e EPI TcI do que as infecções com COL/TcI e CL/TcVI.
As amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa CL/TcVI reagem mais
com AMA TcVI do que as infecções com COL/TcI e Y/TcII. As amostras de soros dos
camunondongos infectados com a cepa Y/TcII reagem menos com TRIPO TcVI e EPI
TcVI do que as infecções com as outras duas cepas. Soros de camundongos infectados
com COL/TcI reagem menos com AMA TcII. Além disso, todas as amostras de soros
de camundongos com infecções simples apresentaram alta reatividade com o antígeno
de TRIPO TcII e EPI TcII (Figura 14B).
Analisando ainda as curvas de titulação, os resultados demonstraram que nas
infecções tardias mistas soros de camundongos infectados com as cepas COL/TcI +
Y/TcII apresentaram maior reatividade com o antígeno de AMA TcI do que os soros
dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI e CL/TcVI + Y/TcII.
Amostras de soros provenientes de infecções com COL/TcI + CL/TcVI reagiram mais
com TRIPO TcI do que as amostras de soros das outras duas infecções mistas. Os soros
dos camundongos infectados com COL/TcI + Y/TcII reagiram mais com AMA TcVI do
RESULTADOS
88
que os soros dos camundongos com as outras infecções mistas. Amostras de soros
oriundas de infecções com CL/TcVI + Y/TcII reagiram menos com AMA TcVI, TRIPO
TcVI e AMA TcII do que as amostras das outras infecções mistas. Os soros dos
camundongos infectados com COL/TcI + Y/TcII reagiram mais com AMA TcII e EPI
TcII do que os soros dos camundongos com as outras duas infecções mistas. Além
disso, todas as amostras de soros de camundongos com infecções mistas apresentaram
alta reatividade com o antígeno de TRIPO TcII (Figura 14B).
RESULTADOS
89
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
0
50
100
AI1
00
0
AI4
00
0
AI1
60
00
AI6
40
00
TI5
00
TI2
00
0
TI8
00
0
TI3
20
00
EI1
00
0
EI4
00
0
EI1
60
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AV
I20
00
AV
I80
00
AV
I32
00
0
TV
I10
00
TV
I40
00
TV
I16
00
0
TV
I64
00
0
EV
I50
0
EV
I20
00
EV
I80
00
EV
I32
00
0
AII
10
00
AII
40
00
AII
16
00
0
AII
64
00
0
TII
50
0
TII
20
00
TII
80
00
TII
32
00
0
EII
10
00
EII
40
00
EII
16
00
0
EII
64
00
0
Perfil de Reatividade Genótipo-Específico da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em Infecções Simples e Mistas CRÔNICAS com Distintos Genótipos do T. cruzi
PP
FP
B
A Infecção Crônica
SIMPLES MISTA
TcII/YTcVI/CL TcVI/CL + TcII/Y
TcV
I/C
LTc
I/C
OL
TcI/
CO
L+
TcV
I/C
L
*+
a-AMA
a-TRIPO
a-EPI
Antígenos Alvo
Genótipo TcVI do T. cruzi
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi
AI5
00
AI6
40
00
TI5
00
TI6
40
00
EI5
00
EI6
40
00
AV
I50
0
AI6
40
00
TVI5
00
TIV
64
00
0EV
I50
0
EVI6
40
00
AII
50
0
AII
64
00
0TI
I50
0
TII6
40
00
EII5
00
EII6
40
00
AI5
00
AI6
4,0
00
TI5
00
TI6
4,0
00
EI5
00
EI6
4,0
00
AV
I50
0
AI6
4,0
00
TVI5
00
TIV
64
,000
EVI5
00
EVI6
4,0
00
AII
50
0
AII
64
,000
TII5
00
TII6
4,0
00EI
I50
0
EII6
4,0
00
Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
Antígenos e Inverso da Diluição do Soro
Genótipo TcI do T. cruzi Genótipo TcVI do T. cruzi Genótipo TcII do T. cruzi
RESULTADOS
90
Figura 14: Perfil de reatividade genótipo-específico da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em
infecções tardias, simples e mistas, com distintos genótipos do T. cruzi. (A) Os gráficos de radares
foram construídos para obter uma visão panorâmica da reatividade das amostras de soros dos
camundongos com infecções tardias simples (TcI/Colombiana-COL n=29, TcVI/CL n=29, TcII/Y n=35)
e mistas (TcI/COL + TcVI/CL n=28, TcVI/CL + TcII/Y n=43 e TcI/COL + TcII/Y n=36) pelo T. cruzi,
com os antígenos de AMA = , TRIPO = e EPI = dos genótipos TcI, TcVI e TcII do T. cruzi. Os
dados foram expressos em percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP). (B) Curvas de titulação
com a reatividade média em PPFP das amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi nas
infecções tardias, com TcI/Colombiana-COL ( ), TcVI/CL ( ),TcII/Y ( ), TcI/COL + TcVI/CL
(+),TcVI/CL + TcII/Y (-) e TcI/COL + TcII/Y (*), com os antígenos alvo de AMA = dos genótipos
TcI (AI), TcVI (AVI) e TcII (AII), TRIPO = dos genótipos TcI (TI), TcVI (TVI) e TcII (TII) e EPI =
dos genótipos TcI (EI), TcVI (EVI) e TcII (EII) do T. cruzi, nas oito diluições do soro testadas (1:500 a
1:64000).
As curvas de titulação foram utilizadas para estabelecer possíveis pares de
atributos (―antígeno/diluição do soro‖) para diferenciar as infecções experimentais
genótipo-específicas tardias simples pelo T. cruzi (Figura 13A) e para discriminar as
infecções experimentais genótipo-específicas tardias mistas pelo T. cruzi (Figura 13B).
Diante dos dados obtidos, foram realizadas análises pelo programa R a fim de calcular a
distância modular em cada ponto da curva, comparando as amostras de soros com
infecções tardias simples pelo T. cruzi e comparando as amostras de soros com
infecções tardias mistas pelo T. cruzi. Os resultados demonstraram que os seguintes
pares de atributos (―antígeno/diluição do soro‖) diferenciaram as amostras de soro com
infecções tardias simples pelo T. cruzi: AMA TcI 1:2000, TRIPO TcI 1:4000, EPI TcI
1:2000, AMA TcVI 1:1000, TRIPO TcVI 1:1000, EPI TcVI 1:1000, AMA TcII 1:1000,
TRIPO TcII 1:16000 e EPI TcII 1:4000 (Figura 15A). Os pares de atributos que
discriminaram as amostras de soro com infecções tardias mistas pelo T. cruzi foram:
AMA TcI 1:2000, TRIPO TcI 1:64000, EPI TcI 1:4000, AMA TcVI 1:500, TRIPO
TcVI 1:16000, EPI TcVI 1:16000, AMA TcII 1:000, TRIPO TcII 1:64000 e EPI TcII
1:4000 (Figura 15B).
As análises estatísticas pelos testes de Kruskall-Wallis seguido por Dunn`s para
comparação entre os grupos, demonstraram que em infecções tardias simples pelo T.
cruzi observou-se que: o par de atributos TRIPO TcI 1:4000 segregaram a maior
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa COL/TcI, da
menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
CL/TcVI e Y/TcII, além da maior reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa CL/TcVI, da menor reatividade da amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII. O par de atributos EPI TcI 1:2000
RESULTADOS
91
discriminou a menor reatividade das amostras dos camundongos infectados com a cepa
Y/TcII, da maior reatividade das amostras dos infectados com as cepas COL/TcI e
CL/TcVI. Os pares de atributos AMA TcVI 1:1000 e AMA TcII 1:1000 segregaram a
menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa
COL/TcI, da maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com
as cepas CL/TcVI e Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcVI 1:1000 discriminou a
menor reatividade das amostras dos camundongos infectados com COL/TcI, da maior
reatividade das amostras dos infectados com a cepa CL/TcVI, além da menor
reatividade dos infectados com a cepa Y/TcII, da maior reatividade dos infectados com
as cepas COL/TcI e CL/TcVI. Os pares de atributos EPI TcVI 1:1000 e TRIPO TcII
1:16000 segregaram a menor reatividade das amostras de soros dos camundongos
infectados com a cepa Y/TcII, da maior reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI e CL/TcVI (Figura 15A). Nas
infecções tardias e mistas pelo T. cruzi observou-se que: o par de atributos AMA TcI
1:2000 segregou a menor reatividade das amostras dos camundongos infectados com
COL/TcI + Y/TcII, da maior reatividade das amostras dos infectados com CL/TcVI +
Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcI 1:64000 discriminou a maior reatividade das
amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI, da
menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
COL/TcI + Y/TcII e CL/TcVI + Y/TcII, além da maior reatividade das amostras de
soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, da menor
reatividade dos camundongos infectados com as cepas CL/TcVI + Y/TcII. O par de
atributos EPI TcI 1:4000 segregou a menor reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI, da maior reatividade das
amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII e
CL/TcVI + Y/TcII. Os pares de atributos AMA TcVI 1:500 e AMA TcII 1:1000
discriminaram a maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados
com as cepas COL/TcI + CL/TcVI, da menor reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, além da maior reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas CL/TcVI + Y/TcII, da
menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
COL/TcI + CL/TcVI e COL/TcI + Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcVI 1:16000
segregou a maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as
RESULTADOS
92
cepas COL/TcI + CL/TcVI, da menor reatividade das amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, além da menor reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, da
maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
CL/TcVI + Y/TcII. O par de atributos EPI TcVI 1:16000 discriminou a menor
reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI
+ Y/TcII, da maior reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com
as cepas CL/TcVI + Y/TcII. O par de atributos TRIPO TcII 1:64000 segregou a maior
reatividade das amostras dos camundongos infectados com as cepas COL/TcI +
CL/TcVI, da menor reatividade das amostras dos camundongos infectados com as cepas
COL/TcI + Y/TcII. O par de atributos EPI TcII 1:4000 discriminou a maior reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas CL/TcVI + Y/TcII, da
menor reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
COL/TcI + CL/TcVI e COL/TcI + Y/TcII (Figura 15B).
Foram realizadas análises pela média global ou pela mediana global para
definição dos pontos de corte com cada um dos nove pares de atributos pré-
selecionados. Os pontos de corte selecionados para a discriminação das amostras de
soros dos camundongos com infecções genótipo-específicas simples pelo T. cruzi, nas
infecções tardias, foram definidos pela mediana global, sendo: 25% de PPFP para AMA
TcI 1:2000, 50% de PPFP para TRIPO TcI 1:4000, 60% de PPFP para EPI TcI 1:2000,
30% de PPFP para AMA TcVI 1:1000, 60% de PPFP para TRIPO TcVI 1:1000, 45%
de PPFP para EPI TcVI 1:1000, 40% de PPFP para AMA TcII 1:1000, 40% de PPFP
para TRIPO TcII 1:16000 e 30% de PPFP para EPI TcII 1:4000. Os pontos de corte
selecionados para a discriminação das amostras de soros dos camundongos com
infecções genótipo-específicas mistas pelo T. cruzi, nas infecções tardias, foram
definidos pela média global, sendo: 30% de PPFP para AMA TcI 1:2000, 40% de PPFP
para TRIPO TcI 1:64000, 60% de PPFP para EPI TcI 1:4000, 40% de PPFP para AMA
TcVI 1:500, 30% de PPFP para TRIPO TcVI 1:16000, 30% de PPFP para EPI TcVI
1:16000, 50% de PPFP para AMA TcII 1:1000, 35% de PPFP para TRIPO TcII
1:64000 e 50% de PPFP para EPI TcII 1:4000.
Análises subsequentes considerando a maior distância modular entre os grupos,
ou seja, o maior somatório do delta, selecionaram os melhores conjuntos de atributos
(―antígeno/diluição do soro/ponto de corte‖) para diferenciar as amostras de soros dos
RESULTADOS
93
camundongos infectados pelo T. cruzi em infecções tardias simples e em infecções
tardias mistas. O conjunto de atributos selecionado em infecções tardias simples foi o
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 50%‖
(Figura 15A). Em infecções tardias mistas, o conjunto de atributos selecionado foi o
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:64000, com ponto de corte de 40%‖
(Figura 15B).
Com o intuito de avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico genótipo-específico das infecções experimentais tardias simples e
mistas pelo T. cruzi separadamente, foram construídas árvores de decisão utilizando os
nove conjuntos de atributos pré-selecionados (―antígeno/ diluição do soro/ ponto de
corte‖) (Figuras 15C e 15D). O algoritmo proposto pela árvore de decisão em infecções
genótipo-específicas tardias simples demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição
1:4000 com ponto de corte de 50%‖ como o atributo raiz, assim como observado na
análise do maior somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em
seguida, foi selecionado o ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000 com ponto de
corte de 40%‖ como primeiro ramo e o ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000 com
ponto de corte de 45%‖ como segundo ramo, para classificar as amostras de soros dos
camundongos com infecções tardias simples pelo T. cruzi, com uma acurácia global
baixa (69%, LOOCV=58%) (Figura 15C). Quando as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi forem negativas com TRIPO TcI 1:4000 PPFP =
50% e positivas com AMA TcII 1:1000 PPFP = 40% elas serão classificadas como
infecção pela cepa Y/TcII. As amostras que forem negativas com AMA TcII 1:1000
PPFP = 40% e negativas com EPI TcVI 1:500 PPFP = 45% serão classificadas como
infecção pela cepa Y/TcII, enquanto as positivas com EPI TcVI 1:500 PPFP = 45%
serão classificadas como infecção pela cepa COL/TcI. As amostras de soros que forem
positivas com TRIPO TcI 1:4000 PPFP = 50% e negativas com AMA TcII 1:1000
PPFP = 40% serão classificadas como infecção pela cepa COL/TcI, enquanto as
positivas com AMA TcII 1:1000 PPFP = 40% serão classificadas como infecção pela
cepa CL/TcVI (Figura 15C). No total, das 93 amostras avaliadas, 64 (69%) foram
classificadas corretamente como pertencentes aos seus respectivos grupos. Das 29
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI, das 29
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa CL/TcVI e das 35 amostras
de soros dos camundongos infectados com a cepa Y/TcII foram classificados de
RESULTADOS
94
maneira correta: 24 (83%) amostras de COL/TcI, 11 (38%) de CL/TcVI e 29 (83%) de
Y/TcII.
O algoritmo proposto pela árvore de decisão em infecções genótipo-específicas
tardias mistas demonstrou o ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:64000 com ponto de
corte de 40%‖ como o atributo raiz, assim como observado na análise do maior
somatório do delta, das distâncias modulares entre os grupos. Em seguida, foram
selecionados o ―antígeno de AMA TcVI na diluição 1:500 com ponto de corte de 40%‖
e o ―antígeno de AMA TcI na diluição 1:2000 com ponto de corte de 30%‖ como
primeiros ramos e o ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000 com ponto de corte de
50%‖ e o ―antígeno de EII TcII na diluição 1:4000 com ponto de corte de 50%‖ como
segundos ramos, para classificar as amostras de soros dos camundongos com infecções
tardias mistas pelo T. cruzi, com uma acurácia global moderada (76%, LOOCV=73%)
(Figura 15D). Quando as amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi
forem negativas com TRIPO TcI 1:64000 PPFP = 40% e positivas com AMA TcVI
1:500 PPFP=40% elas serão classificadas como infecções pelas cepas CL/TcVI +
Y/TcII. As amostras que forem negativas com AMA TcVI 1:500 PPFP=40% e
negativas com AMA TcII 1:1000 PPFP = 50% serão classificadas como infecções pelas
cepas COL/TcI + Y/TcII, enquanto as positivas com AMA TcII 1:1000 PPFP = 50%
serão classificadas como infecções pelas cepas CL/TcVI + Y/TcII. As amostras que
forem positivas com TRIPO TcI 1:64000 PPFP = 40% e negativas com AMA TcI
1:2000 PPFP = 30% serão classificadas como infecções pelas cepas COL/TcI +
CL/TcVI. As amostras que forem positivas com AMA TcI 1:2000 PPFP = 30% e
negativas com EPI TcII 1:4000 PPFP = 50% serão classificadas como infecções pelas
cepas COL/TcI + CL/TcVI, e as que forem positivas com EPI TcII 1:4000 PPFP = 50%
serão classificadas como infecções pelas cepas CL/TcVI + Y/TcII (Figura 15D). No
total, das 107 amostras avaliadas, 82 (76%) foram classificadas corretamente como
pertencentes aos seus respectivos grupos. Das 36 amostras de soros dos camundongos
infectados com as cepas COL/TcI + Y/TcII, das 43 amostras de soros dos camundongos
infectados com as cepas CL/TcVI + Y/TcII e das 28 amostras de soros dos
camundongos infectados com as cepas COL/TcI + CL/TcVI foram classificados de
maneira correta: 21 (58%) amostras de COL/TcI + Y/TcII, 38 (88%) de CL/TcVI +
Y/TcII e 23 (82%) de COL/TcI + CL/TcVI.
RESULTADOS
95
Seleção dos Atributos para TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a Discriminar Infecções Simples e Mistas CRÔNICAS com Distintos Genótipos do T. cruzi
Grupos do Estudo
Infecção pelo T. cruzi
AI 2.000
AVI 1.000
AII 1.000
TI 4.000
TVI 1.000
TII 16.000
EI 2.000
EVI 1.000
EII 4.000
PP
FPP
PFP
PP
FP
Árv
ore
sd
e D
ecis
ão
Pre
sd
e A
trib
uto
sP
ré-S
elec
ion
ad
os
MISTASIMPLES
AI 2.000
AVI 500
AII 1.000
TI 64.000
TVI 16.000
TII 64.000
EI 4.000
EVI 16.000
EII 4.000
PP
FPP
PFP
PP
FP
Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi
Grupos do Estudo
Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi Infecção pelo T. cruzi
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
CO
L
CL Y
0
50
100
CO
L
CL Y
0
50
100
CO
L
CL Y
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL+
Y
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL+
Y
0
50
100
CO
L+
CL
CO
L+
Y
CL+
Y
0
50
100
DC
BA
Pre
sd
e A
trib
uto
sP
ré-S
elec
ion
ad
os
Árv
ore
sd
e D
eci
são
AII 1000
TI 4000
Y (13/5)
CL (20/9)
≤ 50%
> 40%≤ 40%
> 50%
> 40%
AII 1000
COL (8/4)
COL (26/6)
≤ 40%
Y (26/5)EVI 1000
≤ 45% > 45%
AVI 500
TI 64000
Y + COL (27/6) Y + CL (9/2)CL + COL (4)
≤ 40%
> 30%≤ 40%
> 40%
≤ 50%
> 40%
Y + CL (13/5)
CL + COL (29/10)
≤ 30%
> 50%
Y+ CL (25/2)AII 1000
≤ 50% > 50%
AI 2000
EII 4000
Acurácia Global = 69% (64/93)
LOOCV = 58% (54/93) Acurácia Global = 76% (82/107)
LOOCV = 73% (79/107)
RESULTADOS
96
Figura 15: Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
genótipo-específico das infecções tardias, simples e mistas pelo T. cruzi. Gráficos de box plot
construídos a partir das medianas de cada grupo: infecções tardias simples na fase crônica (A)
(TcI/Colombiana-COL n=29, TcVI/CL n=29, TcII/Y n=35) e infecções tardias mistas na fase crônica (B)
(TcI/COL + TcVI/CL n=28, TcVI/CL + TcII/Y n=43, e TcI/COL + TcII/Y n=36), para cada um dos pares
de atributos pré-selecionados, por meio das análises estatísticas no programa R, do cálculo da distância
modular entre os diferentes pontos das curvas de titulação. Os pares de atributos pré-selecionados para as
infecções tardias simples (A) foram: AMA TcI na diluição 1:2000 (AI 2000), AMA TcVI na diluição
1:1000 (AVI 1000), AMA TcII na diluição 1:1000 (AII 1000), TRIPO TcI na diluição 1:4000 (TI 4000),
TRIPO TcVI na diluição 1:1000 (TVI 1000), TRIPO TcII na diluição 1:16000 (TII 16000), EPI TcI na
diluição 1:2000 (EI 2000), EPI TcVI na diluição 1:1000 (EVI 1000) e EPI TcII na diluição 1:4000 (EII
4000). Para as infecções tardias mistas (B) os seguintes pares de atributos foram pré-selecionados: AMA
TcI na diluição 1:2000 (AI 2000), AMA TcVI na diluição 1:500 (AVI 500), AMA TcII na diluição
1:1000 (AII 1000), TRIPO TcI na diluição 1:64000 (TI 64000), TRIPO TcVI na diluição 1:16000 (TVI
16000), TRIPO TcII na diluição 1:64000 (TII 64000), EPI TcI na diluição 1:4000 (EI 4000), EPI TcVI na
diluição 1:16000 (EVI 16000) e EPI TcII na diluição 1:4000 (EII 4000). Os gráficos destacados em cinza
representam os pares de atributos nas quais as amostras de soros dos camundongos com infecções tardias
simples (A) e mistas (B) do T. cruzi apresentaram as maiores distâncias modulares entre os grupos. Os
resultados foram expressos como a mediana dos valores de percentual de parasitos fluorescentes positivos
(PPFP) em gráficos de box plot, com os valores atípicos representados por pontos cinzas. Foram
realizadas análises estatísticas pelos testes Kruskal Wallis seguido por Dun’s para comparação entre os
grupos. As diferenças foram consideradas significativas com p<0,05, e as diferenças estatísticas entre os
grupos estão representadas pelas linhas conectoras dentro dos gráficos. As árvores de decisão foram
construídas utilizando os conjuntos de atributos pré-selecionados (―antigeno/diluição do soro/ ponto de
corte‖) para criar algoritmos (atributos raiz e ramos), a fim de classificar as amostras de soros dos
camundongos infectados pelo T. cruzi em infecçõesgenótipo-específicas tardias simples (C) e mistas (D).
A acurácia global e o ―leave-one-out-cross-validation-LOOCV‖ foram fornecidos na figura.
Diante dos resultados obtidos, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
apresentou um bom desempenho no diagnóstico genótipo-específico das infecções
experimentais tardias, simples e mistas pelo T. cruzi.
5.11- Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi utilizando algoritmos
sequenciais estabelecidos pela análise das árvores de decisão
Os resultados apresentados correspondem ao objetivo específico número 7:
Avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico
da infecção experimental pelo T. cruzi utilizando algoritmos sequenciais
estabelecidos pela análise das árvores de decisão.
Com o intuito de avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico da infecção experimental pelo T. cruzi, foram construídos
diagramas de reatividade com todos os conjuntos de atributos (―antígeno/diluição do
RESULTADOS
97
soro/ponto de corte‖) selecionados pelos algoritmos das árvores de decisão, para as
infecções recentes (diagrama do lado esquerdo) e para as infecções tardias (diagrama do
lado direito) (Figura 16A). As letras acima dos diagramas de reatividade representam
os conjuntos de atributos dados por cada uma das sete árvores de decisão do estudo,
sendo: letra a (conjuntos de atributos para a discriminação das infecções recentes e
tardias Figura 9), letra b (conjuntos de atributos para a discriminação das infecções
simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções recentes- Figura 11C), letra c (conjuntos de
atributos para a discriminação das infecções simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções
tardias- Figura 11D), letra d (conjuntos de atributos para a discriminação das infecções
recentes simples com diferentes genótipos do T. cruzi - Figura 13C), letra e (conjuntos
de atributos para a discriminação das infecções recentes mistas com diferentes
genótipos do T. cruzi - Figura 13D), letra f (conjuntos de atributos para a discriminação
das infecções tardias simples com diferentes genótipos pelo T. cruzi - Figura 15C) e
letra g (conjuntos de atributos para a discriminação das infecções tardias mistas com
diferentes genótipos do T. cruzi - Figura 15D). As cores nas extremidades dos
diagramas de reatividade representam cada uma das diferentes infecções pelo T. cruzi:
amarelo (infecções recentes), marrom (infecções tardias), cinza claro (infecções
simples), cinza escuro (infecções mistas), vermelho (infecção pela cepa Colombiana),
verde (infecção pela cepa CL), azul escuro (infecção pela cepa Y), laranja (infecção
pelas cepas COL + CL), azul claro (infecção pelas cepas CL + Y) e rosa (infecção pelas
cepas COL + Y) (Figura 16B). Nos diagramas, os quadrados preenchidos em preto
demonstram quando as amostras de soros testadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a foram positivas com cada um dos conjuntos de atributos selecionados pelas
árvores de decisão, em contraste, os quadrados que não foram preenchidos demonstram
a negatividade das amostras de soros com esses conjuntos de atributos. Tanto para as
infecções recentes quanto para as infecções tardias, a extremidade esquerda significa a
infecção verdadeira das amostras de soros, enquanto a extremidade direita representa a
classificação correspondente das infecções das amostras de soros avaliadas pela
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a (Figura 16A).
Os resultados apresentados pelos diagramas demonstraram um maior número de
amostras de soros das infecções recentes classificadas incorretamente do que das
infecções tardias, o que demonstra que a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a é
melhor para classificar amostras nas infecções tardias. Os dados demonstraram também
RESULTADOS
98
que soros de camundongos com infecções simples pelo T. cruzi foram classificados
mais corretamente do que soros de camundongos com infecções mistas pelo T. cruzi,
nas infecções recentes. Em relação à categorização genótipo-específica das amostras,
soros de camundongos infectados com as cepas Y e COL + CL nas infecções recentes, e
com as cepas COL, Y, COL + CL e CL + Y nas infecções tardias, foram identificados
corretamente em maior número do que às outras infecções (Figura 16A).
Os gráficos da Figura 16C demonstraram por meio das linhas conectoras a
correspondência entre as infecções verdadeiras das amostras de soro, e a classificação
dessas mesmas amostras quando testadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a,
com cada um dos grupos separadamente, nas infecções recentes e nas infecções tardias.
No primeiro gráfico observa-se a correspêndencia das amostras de soros em relação ao
tempo de infecção (recente ou tardia), ao tipo de infecção (simples ou mista) e ao
genótipo. Os resultados demonstraram que das 310 amostras de soros testadas, 163
(53%) foram categorizadas corretamente quanto ao tempo de infecção, tipo e genótipo,
havendo uma grande correspondência de infecções verdadeiras e de infecções
classificadas nas infecções recentes com as cepas Y e COL + CL e nas infecções tardias
com as cepas COL, Y, COL + CL e CL + Y, representadas pelas linhas mais grossas. O
segundo gráfico demonstra a correspondência das amostras de soros verdadeiras e
classificadas quanto ao tipo de infecção e ao genótipo, sendo que das 310 amostras de
soros testadas, 22 (7%) foram definidas corretamente quanto a esses dois parâmetros,
porém foram categorizadas incorretamente em relação ao tempo de infecção. Os dados
evidenciaram uma grande correspondência de infecções verdadeiras e de infecções
classificadas com as cepas Y e COL + CL (linhas mais grossas). Já no terceiro gráfico
observa-se a correlação das amostras apenas quanto ao tipo de infecção, em que dos 310
soros testados, 66 (21%) foram classificados corretamente quanto a esse parâmetro e
incorretamente quanto ao tempo de infecção e ao genótipo. As infecções simples foram
categorizadas mais corretamente do que as mistas, nas infecções recentes, como
demonstrado pelas linhas. Avaliando a classificação em conjunto nessas três situações,
um total de 251 (81%) amostras de soros foram categorizadas corretamente, seja pela
tempo de infecção + tipo + genótipo (n=163), ou somente pelo tipo + genótipo (n=22),
ou ainda apenas pelo tipo (n=66), pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a. Além
do mais, avaliando essas três situações, o método classifica melhor nas infecções tardias
(85%), do que nas infecções recentes (75%) (Figura 16C).
RESULTADOS
99
A tabela na Figura 16D evidencia as análises discriminantes das amostras de
soros testadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a. Considerando as amostras
de soros dos camundongos com infecções simples e mistas por diferentes genótipos do
T. cruzi: 71% das amostras dos infectados com a cepa COL, 27% das amostras dos
infectados com a cepa CL, 83% das amostas dos infectados com a cepa Y, 73% das
amostras dos infectados com as cepas COL + CL, 63% das amostras dos infectados com
as cepas CL + Y e 39% das amostras dos infectados com as cepas COL + Y, foram
classificadas corretamente como pertencentes aos seus respectivos grupos. A
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um grande potencial para
categorizar amostras de soros com infecções pelas cepas Y > COL + CL > COL >
CL+Y. Além do mais, das 310 amostras de soros testadas, essa técnica classificou
corretamente 125 (40%) infecções simples e 126 (41%) infecções mistas, num total de
acertos de 81% (Figura 16D).
RESULTADOS
100
Proposta de Algoritmo Sequencial
163/310 – 53% 22/310 – 7% 66/310 – 21%(a) (b) (e)(c) (d) (f) (g)
16
9/2
00
85
%8
2/1
10
75
%
25
1/3
10
81
%
Diagramas de Reatividade – Conjuntos de Atributos Selecionados
Análises Discriminantes
Desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a na Avaliação da Reatividade de Infecções Experimentais Agudas e Crônicas com Diferentes Genótipos do T. cruzi
D
B
A
(a)
(b) (e)
(c) (d) (f) (g)
Aguda
Crônica
Simples
Mista
COL+Y
CL+Y
COL+CL
Y
CL
COL
Fases Tipos
Genótipos
Co
res
Ch
ave
s
Todas
Verdadeira Classificada
Concordância total – 251/310 Amostras–81%CInfecção AGUDA Infecção CRÔNICA
Fase
sTi
po
sG
enó
tip
os
EII5
00
55
%EI
20
00
55%
AII
50
0 6
0%TI
20
00
50%
AI1
00
0 2
5%EI
I10
00
40%
TI4
00
0 3
5%TV
I50
0 4
5%
TII1
00
0 7
0%TI
16
00
0 30
%EI
20
00
35%
AI5
00
15
%EI
I20
00
30%
TVI5
00
60
%TI
80
00
60%
AII
32
000
5%
TI4
00
0 5
0%A
II1
00
0 40
%EV
I10
00
45%
TI6
40
00
40%
AV
I50
0 4
0%A
I20
00
30%
AII
10
00
50%
EII4
00
0 5
0%G
enó
tip
os
Tip
os
Fase
s
(a) (b) (e)(c) (d) (f) (g)
Fase
sTi
po
sG
enó
tip
os
EII5
00
55
%EI
20
00
55%
AII
50
0 6
0%TI
20
00
50%
AI1
00
0 2
5%EI
I10
00
40%
TI4
00
0 3
5%TV
I50
0 4
5%
TII1
00
0 7
0%TI
16
00
0 30
%EI
20
00
35%
AI5
00
15
%EI
I20
00
30%
TVI5
00
60
%TI
80
00
60%
AII
32
000
5%
TI4
00
0 5
0%A
II1
00
0 40
%EV
I10
00
45%
TI6
40
00
40%
AV
I50
0 4
0%A
I20
00
30%
AII
10
00
50%
EII4
00
0 5
0%G
enó
tip
os
Tip
os
Fase
s
Fase & Tipo & Genótipo Tipo & Genótipo Tipo
Crô
nic
aA
gud
a
InfecçãoVerdadeira
InfecçãoClassificada
InfecçãoVerdadeira
InfecçãoClassificada
InfecçãoVerdadeira
InfecçãoClassificada
Verdadeira Classificada
Yn=54
4%(2)
7%(4)
83% (45)
0%(0)
4%(2)
2%(1)
Infecções Originais
GRUPOS
Sim
ple
s
Simples (n=143) Mista (n=167)
Mis
ta
COL
CL
Y
COL+CL
CL+Y
COL+Y
COLn=45
71% (32)
2%(1)
7%(3)
7%(3)
9%(4)
4%(2)
CLn=44
23%(10)
27% (12)
36%(16)
0%(0)
14%(6)
0%(0)
COL+CLn=44
9%(4)
0%(0)
0%(0)
73% (32)
11%(5)
7%(3)
CL+Yn=67
9%(6)
7%(5)
9%(6)
5%(3)
63% (42)
7%(5)
COL+Yn=56
23%(13)
7%(4)
5%(3)
13%(7)
13%(7)
39% (22)
Infe
cção
Cla
ssif
icad
a
Totaln=310
40%(125)
41%(126)
81%(251)
RESULTADOS
101
Figura 16: Avaliação do desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico da
infecção experimental pelo T. cruzi utilizando algoritmos sequenciais estabelecidos pela análise das
árvores de decisão. (A) Os diagramas de reatividade foram construídos para se obter uma visão
panorâmica da aplicabilidade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no diagnóstico da infecção
experimental pelo T. cruzi. Foram utilizados os conjuntos de atributos (―antígeno/diluição do soro/ponto
de corte‖) definidos pelos algoritmos sequenciais das árvores de decisão para a construção dos diagramas
de reatividade para as infecções recentes (lado esquerdo) e para as infecções tardias (lado direito). As
letras representam cada conjunto de atributos fornecidos pelas as árvores de decisão: a- discriminação das
infecções recentes e tardias, b- discriminação das infecções recentes, simples e mistas, c- discriminação
das infecções tardias simples e mistas, d- discriminação das infecções recentes simples, e- discriminação
das infecções recentes mistas, f- discriminação das infecções tardias simples, g- discriminação das
infecções tardias mistas na fase crônica. (B) As cores representam cada uma das diferentes infecções pelo
T. cruzi: amarelo (infecções recentes), marrom (infecções tardias), cinza claro (infecções simples), cinza
escuro (infecções mistas), vermelho (infecção pela cepa Colombiana), verde (infecção pela cepa CL),
azul escuro (infecção pela cepa Y), laranja (infecção pelas cepas COL + CL), azul claro (infecção pelas
cepas CL + Y) e rosa (infecção pelas cepas COL + Y). Os quadrados preenchidos em preto demonstram
quando as amostras de soros testadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a foram positivas com
cada um dos conjuntos de atributos, e os quadrados que não foram preenchidos demonstram a
negatividade das amostras de soros com esses conjuntos de atributos. A extremidade esquerda representa
a infecção verdadeira das amostras de soros, e a extremidade direita à classificação correspondente dessas
infecções. (C) Gráficos de linhas demonstrando a correspondência entre as infecções verdadeiras das
amostras de soro, e a classificação dessas mesmas amostras, por meio das linhas conectoras, com cada um
dos grupos separadamente, nas infecções recentes e nas infecções tardias, para tempo de infecção + tipo +
genótipo, somente para tipo + genótipo e apenas para tipo. As cores dos grupos indicam: vermelho
(infecção pela cepa Colombiana), verde (infecção pela cepa CL), azul escuro (infecção pela cepa Y),
laranja (infecção pelas cepas COL + CL), azul claro (infecção pelas cepas CL + Y), rosa (infecção pelas
cepas COL + Y), cinza claro (infecções simples), cinza escuro (infecções mistas). (D) Análises
discriminantes das amostras de soros testadas pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em infecções
simples e mistas, e em infecções genótipo específicas pelas cepas: Colombiana (COL), CL, Y, COL +
CL, CL + Y e COL + Y. Os números dentro das tabelas representam o percentual e o número de amostras
que foram classificadas dentro de cada grupo. Os percentuais e o número de amostras que foram
classificadas corretamente dentro dos seus respectivos grupos estão destacados em negrito.
DISCUSSÃO
102
6. DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
103
Diversos estudos vêm associando a variabilidade genética do T. cruzi com as
características biológicas (ANDRADE & MAGALHÃES, 1997; LAURENT et al.,
1997; LANA et al., 1998; TOLEDO et al., 2002, 2003; TESTON et al., 2013;
OLIVEIRA-SILVA et al., 2015), epidemiológicas (MILES et al., 2009; ZINGALES et
al., 2012; TIBAYRENC & AYALA, 2015) e com as manifestações clínicas da doença
de Chagas (LAGES-SILVA et al., 2006; VIRREIRA et al., 2006; VALADARES et al.,
2007).
Trabalhos anteriores demonstraram que hospedeiros infectados com TcI (ou com
classificações equivalentes obtidas por outros marcadores) apresentaram resistência
total ou parcial, infectados com TcV ou TcVI (ou com classificações equivalentes)
resistência parcial e infectados com TcII (ou com classificações equivalentes)
susceptibilidade total ou parcial ao tratamento com benzonidazol (ANDRADE, 1974;
ANDRADE & MAGALHÃES, 1997; TOLEDO et al., 2003). Além do mais, foram
observadas mudanças no perfil de susceptibilidade ao tratamento com benzonidazol nas
infecções mistas experimentais, quando comparado às respectivas monoinfecções
(MARTINS et al., 2007). Diante destes estudos, a padronização da TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico genótipo-específico da infecção pelo T.
cruzi torna-se de extrema importância em estudos futuros de monitoração pós-
terapêutica em pacientes chagásicos tratados.
Em relação às manifestações clínicas da doença de Chagas, ainda que não haja uma
correlação direta entre as diferentes formas clínicas e a genética do T. cruzi, estudos
demonstraram que os distintos genótipos do parasito estão associados com a doença de
Chagas mais ou menos grave clinicamente. A DTU TcI está associada com a doença de
Chagas menos grave, incluindo casos raros de cardiomiopatia chagásica, a DTU TcII
com as manifestações cardíacas, megacólon e megaesôfago e já a DTU TcVI com a
doença de Chagas aguda e crônica severa na região Cone Sul (LAGES-SILVA et al.,
2006; MILES et al., 2009; ZINGALES et al., 2012; MONJE-RUMI et al., 2015).
Assim, a padronização da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o diagnóstico
genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi poderá auxiliar nesses estudos clínicos.
Além do mais, considerando a distinta distribuição geográfica das DTUs nas Américas
(ZINGALES et al., 2012; TIBAYRENC AND AYALA, 2015), a TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a poderá ser uma nova ferramenta para genotipagem do T.
DISCUSSÃO
104
cruzi, e assim auxiliar em estudos de implementação de vigilância epidemiológica e
controle da doença de Chagas em diferentes regiões.
As técnicas de biologia molecular utilizadas para a genotipagem do T. cruzi
apresentam algumas limitações metodológicas, tais como: complexidade, sensibilidade
(CONSENTINO AND AGUERO, 2012; ZINGALES et al., 2012; HIGUERA et al.,
2013; CURA et al., 2015), necessidade de uma combinação de vários marcadores
genéticos para detectar e distinguir os genótipos do T. cruzi (D´ÁVILLA et al., 2009;
LEWIS et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2015), o isolamento do parasito do sangue por
métodos parasitológicos de baixa sensibilidade na fase crônica, a possibilidade da
genotipagem subestimar as cepas presentes nos tecidos e a possível seleção clonal
desses parasitos, devido ao crescimento in vitro (MACEDO et al., 1998; VAGO et al.,
2000; D´AVILLA et al., 2009; MACEDO et al., 2004; BURGOS et al., 2010;
MANTILLA et al., 2010; LO PRESTI et al., 2014; SALES-CAMPOS et al., 2014).
Diante dessas limitações, é também necessário o desenvolvimento de métodos para o
diagnóstico e sorotipagem da doença de Chagas.
Com o intuito de desenvolver uma técnica sorológica inovadora para o diagnóstico
universal e genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, o objetivo desse
trabalho foi otimizar a metodologia Chagas-Flow ATE, descrita originalmente por
ALESSIO et al. (2014). Essa técnica utiliza como antígenos um conjunto de cepas de
distintas DTUs do T. cruzi (Figura 1), representativas dos três mais importantes
genótipos do parasito associados com a infecção humana da doença de Chagas na
América Latina (TcI, TcVI, TcII) (LAGES-SILVA et al., 2006; RAMÍREZ et al., 2010;
ZINGALES et al., 2012), embora outras DTUs existam tais como TcIII (CARDINAL et
al., 2008; MARCILI et al., 2009; CÂMARA et al., 2010), TcIV recentemente descrita
como associada à transmissão oral (COURA et al., 2002; VALENTE et al., 2009) e
TcV relacionada com as formas clínicas clássicas da doença de Chagas (cardíaca e
digestiva) (VIRREIRA et al., 2006).
Trabalhos anteriores já demonstraram a influência do genótipo do parasito no
padrão do perfil de anticorpos em modelos experimentais (SANTOS et al., 2009). Além
do mais, foi descrito a cepa dependência do T. cruzi na detecção de anticorpos líticos no
teste de lise mediada pelo complemento, sugerindo que características genótipo-
específicas podem estar envolvidas na indução de anticorpos líticos (KRETTLI et al.,
1979; WALLACE et al., 1995; ZULANTAY et al., 1998). Assim, é necessário
DISCUSSÃO
105
considerar a variabilidade genética do T. cruzi no desenvolvimento de testes de
diagnóstico da doença de Chagas, tendo em vista que pacientes de diferentes áreas
geográficas, infectados com distintos genótipos do parasito, apresentaram uma
reatividade diferencial das suas amostras no diagnóstico da doença de Chagas, quando
os mesmos antígenos foram empregados (UMEZAWA et al., 1999; UMEZAWA et al.,
2004; VERANI et al., 2009).
DISCUSSÃO – CAPÍTULO 1
Nesse estudo, foi avaliado o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a no diagnóstico universal e genótipo-específico da infecção experimental pelo T.
cruzi, simulando dois protótipos populacionais, que podem representar a distribuição
geográfica da doença na América Latina. O primeiro protótipo populacional representa
regiões onde TcI, TcVI e TcII são co-endêmicos, como no Brasil (ZINGALES et al.,
2012). No segundo protótipo populacional foi avaliado o desempenho combinado da
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para discriminar infecções com as cepas
TcI/Colombiana x TcII/Y (Figura 6). Os resultados demonstraram que independente do
protótipo populacional, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um
excelente desempenho no diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi,
com uma área sob a curva de 1, o que significa uma excelente acurácia do teste, e
sensibilidade e especificidade de 100%, utilizando os conjuntos de atributos ―antígeno
de TRIPO TcII na diluição 1:500, com ponto de corte de 20%‖ (Figuras 2 e 3).
Embora a sensibilidade da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a varia de acordo
com o antígeno empregado, o antígeno de TRIPO TcII foi capaz de detectar a
sororeatividade em todas as amostras de soros dos camundongos infectados com
distintos genótipos do T. cruzi e a soronegatividade nas amostras de soros dos
camundongos não infectados pelo parasito (Figuras 2 e 3). Corroborando com esse
trabalho, BHATTACHARYYA et al. (2014) também observaram por meio de uma
sorotipagem, que todas as amostras de soros de hospedeiros infectados pelo T. cruzi
reconheceram o lisado antigênico TcII do parasito. Um dos antígenos mais utilizados no
diagnóstico da doença de Chagas é também originário da cepa Y, obtido por extração
alcalina (VITOR AND CHIARI, 1987) e usado nas técnicas de ELISA e IFI, sugerindo
a utilização dessa DTU para o diagnóstico universal da infecção pelo T. cruzi,
DISCUSSÃO
106
corroborando assim com os resultados de BHATTACHARYYA et al. (2014). Uma
vantagem da utilização do antígeno TcII para o diagnóstico universal da doença de
Chagas no Brasil é o fato desta DTU estar mais relacionada ao ciclo doméstico da
infecção, além do mais ela apresenta uma alta prevalência no centro, sul e sudeste do
Brasil (ZINGALES et al., 2012; TIBAYRENC AND AYALA, 2015).
A TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um bom desempenho para
segregar infecções tardias simples com as cepas TcI/Colombiana, TcVI/CL e TcII/Y
com os conjuntos de atributos: ―antígeno de amastigota TcII na diluição 1:1000, com
ponto de corte de 40%‖, ―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:4000, com ponto
de corte de 50%‖ e ―antígeno de epimastigota TcVI na diluição 1:1000, com ponto de
corte de 45%‖ (Figuras 2, 4, 5 e 6). No geral, camundongos infectados com
TcI/Colombiana e TcII/Y apresentaram padrões opostos de reatividade das amostras de
soros nas infecções tardias, com os antígenos de tripomastigota TcI e amastigota TcII,
enquanto camundongos infectados com TcVI/CL apresentaram um padrão de
distribuição atípico (Figuras 4, 5 e 6). Esse fenômeno reflete a origem filogenética das
DTUs (ZINGALES et al., 2012), em que TcI e TcII são DTUs ancestrais e apresentam
localizações polares no dendograma, assim como são também polares as suas
características biológicas (LAURENT et al., 1997; REVOLLO et al., 1998; GUEDES et
al., 2002; TOLEDO et al., 2003; FREITAS et al., 2006; ANDRADE et al., 2011),
enquanto TcVI por ter uma origem híbrida, apresenta características de intensidade
intermediária em relação aos genótipos polares (REVOLLO et al., 1998; GUEDES et
al., 2002, FREITAS et al., 2006). As DTUs TcI e TcII apresentam características
opostas quanto à multiplicação e diferenciação ou metaciclogênese em culturas
(ANDRADE AND MAGALHÃES, 1997; LAURENT et al., 1997; ANDRADE et al.,
2011), infectividade e metaciclogênese no vetor (LANA et al., 1998), infectividade,
parasitemia, tropismo tecidual e patogenicidade em animais de experimentação
(ANDRADE, 1985; ANDRADE AND MAGALHÃES, 1997; TOLEDO et al., 2002),
susceptibilidade ou resistência ao tratamento (ANDRADE, 1974; FILARDI AND
BRENER, 1987, ANDRADE AND MAGALHÃES et al., 1997, TOLEDO et al.,
2003), bem como em relação as manifestações clínicas da doença (LAGES-SILVA et
al., 2006; ZINGALES et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2017), embora esta associação
não tenha sido claramente demonstrada.
DISCUSSÃO
107
O desempenho combinado da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a no
diagnóstico genótipo-específico da infecção pelo T. cruzi nas infecções tardias, difere
dependendo do protótipo populacional utilizado para representar distintas regiões
geográficas de infecções pelo parasito na América Latina. No primeiro protótipo
populacional (TcI/TcVI/TcII), os dados demonstraram uma baixa acurácia global
(68,8%, LOOCV=58%) para discriminar infecções com as cepas TcI/Colombiana,
TcVI/CL e TcII/Y (Figura 6). Por outro lado, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2
foi capaz de discriminar infecções com as cepas TcI/Colombiana e TcII/Y, no segundo
protótipo populacional (TcI/TcII), com uma alta acurácia global (93,8%,
LOOCV=87.5%) (Figura 6). Outros estudos também vêm buscando padronizar
métodos sorológicos para a genotipagem do T. cruzi. No entanto, corroborando com
esse trabalho, essas metodologias também não foram capazes de discriminar todos os
genótipos do parasito, principalmente as DTUs híbridas (DI NOIA et al. 2002;
BHATTACHARYYA et al., 2010; MENDES et al., 2013, BHATTACHARYYA et al.,
2014, 2015).
DI NOIA et al., (2002) descreveram dois antígenos do T. cruzi, denominados
antígeno pequeno de superfície de tripomastigotas (TSSA), porém com habilidade
apenas para distinguir as linhagens T. cruzi I (TcI) e T. cruzi II (TcII a TcVI). Dando
continuidade a esses estudos, BHATTACHARYYA et al. (2010) identificou TSSA II
como um antígeno capaz de reconhecer infecções por TcII, TcV e TcVI, como distintas
de infecções por TcI, TcIII e TcIV. Os autores encontraram uma maior diversidade
linhagem-específica do que havia sido previamente descrito, porém esse antígeno não
foi capaz de identificar as DTUs individualmente. Nessa mesma proposta,
BHATTACHARYYA et al. (2014) avaliaram por ELISA a reatividade de amostras de
soros de camundongos infectados por diferentes genótipos do T. cruzi e amostras de
soros humanas de diferentes países das Américas, com o antígeno TSSA. Estes autores
observaram que os soros dos camundongos infectados com TcII, TcV e TcVI
reconheceram o peptídeo comum de TSSApep-II/V/VI, e as amostras dos camundongos
infectados com TcIII e TcIV reagiram com seus respectivos peptídeos TSSA. Em
relação às amostras de soros humanas, 79/83 soros que reconheceram o peptídeo
comum de TSSA-pepII/V/VI eram provenientes de países do Cone Sul e quatro do
Equador. Desses 83 soros, 13 também reconheceram o peptídeo TSSApep-V/VI, sendo
12 amostras dos países do Cone Sul e uma do Equador. Os soros da Venezuela,
DISCUSSÃO
108
Argentina, Brasil e Colômbia que reconheceram TSSApep-III também reconheceram
TSSApep-IV. Nenhuma reação específica com o peptídeo TSSApep-I foi observada
dentre as amostras de soros provenientes dos países do Norte. Além do mais, esse
antígeno não foi capaz de detectar anticorpos independente da origem do soro
chagásico, com exceção de duas amostras.
Ainda que o peptídeo TSSA seja um marcador sorológico para identificar os
genótipos do T. cruzi em infecções humanas e experimentais, esse antígeno não foi
capaz de identificar as DTUs individualmente, e a reatividade das amostras de soros
com o antígeno TSSA-pepI. Em contraste a esse trabalho, a técnica TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a foi capaz de reconhecer a alta reatividade da maioria das
amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI com o
antígeno da cepa Colombiana/TcI e a baixa reatividade com o antígeno da cepa Y/TcII;
e a alta reatividade da maioria das amostras de soros dos camundongos infectados com a
cepa Y/TcII com o antígeno da cepa Y/TcII e a baixa reatividade com o antígeno da
cepa Colombiana/TcI, com uma alta acurácia global de 94%, para infecções com TcI e
TcII (Figura 6), demonstrando o potencial dessa técnica para o diagnóstico genótipo-
específico da infecção experimental pelo T. cruzi.
Nas análises discriminantes da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a em
infecções tardias pelo T. cruzi, com as cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII,
apenas 11 (38%) das amostras de soros dos camundongos infectados com a cepa
CL/TcVI foram classificadas corretamente como pertencentes ao seu respectivo grupo,
em contraste a 24 (82,8%) e 29 (82,9%) amostras de soros dos camundongos infectados
com as cepas Colombiana/TcI e Y/TcII, respectivamente (Figura 7A). Os dados
demonstram novamente que o fato de TcVI ser híbrida, possuir TcI, TcII e TcIII como
grupos ancestrais (WESTENBERGER et al., 2005, FREITAS et al., 2006, STURM
AND CAMPBELL, 2010), seja natural que compartilhe características com TcI e TcII,
o que justifica a reatividade cruzada dessa DTU com antígenos de TcI e TcII e o fato de
apenas 38% das amostras serem classificadas corretamente como TcVI.
Trabalhos como o de MENDES et al. (2013) identificaram epitopos de células B
derivados do genoma da cepa CL Brener, conservados e polimórficos, para serem
utilizados no sorodiagnóstico e na sorotipagem da doença de Chagas por ELISA. A
reatividade de amostras de soros de camundongos na fase crônica infectados com as
cepas Colombiana (TcI), CL (TcVI) e Y (TcII) e de amostras de soros humanas de
DISCUSSÃO
109
indivíduos infectados com TcI e TcII foram testadas com esses peptídeos. Os autores
demonstraram haver um peptídeo conservado com alta sensibilidade e especificidade
para a identificação do T. cruzi em pacientes infectados com diferentes cepas do
parasito e três peptídeos polimórficos para discriminar os genótipos TcI, TcVI e TcII do
T. cruzi. Em concordância com o presente trabalho, na qual os soros dos camundongos
infectados com a cepa CL/TcVI apresentou reatividade cruzada com os antígenos
testados na TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a, MENDES et al. (2013) também
observaram reatividade cruzada dos soros dos camundongos infectados com TcVI com
os peptídeos polimórficos utilizados para discriminar os genótipos TcI e TcII do T.
cruzi.
Uma vantagem desse atual trabalho é o grande número de amostras de soros de
camundongos nas infecções tardias pelo T. cruzi (n=93) que foram testadas pela
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a, frente a apenas 18 amostras de soros testadas
por MENDES et al. (2013). Resultados contraditórios foram descritos posteriormente
por BHATTACHARYYA et al. (2014), ao demonstrar que o epitopo TcI descrito por
MENDES et al. (2013) foi observado como conservado em todas as linhagens do T.
cruzi. O desenvolvimento da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o
diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi reforça a
necessidade da melhoria da pesquisa antigênica e do desenvolvimento de painéis
robustos de epitopos cepa-específicos, a fim de desenvolver um método que possa ser
utilizado em estudos epidemiológicos de larga escala. Uma diferença desse trabalho em
relação aos de MENDES et al. (2013), BHATTACHARYYA et al. (2010, 2014, 2015),
é a utilização da citometria de fluxo, ao invés do teste de ELISA, que apresenta como
principal vantagem a possibilidade de uma análise multiparamétrica em plataforma
única (MARTINS-FILHO et al., 1995; CORDEIRO et al., 2001; VITELLI-AVELAR et
al., 2007; ALESSIO et al., 2014; TEIXEIRA-CARVALHO et al., 2015). Além do mais,
algumas técnicas que utilizam como ferramenta a citometria de fluxo, como a
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a, empregam a análise pelo algoritmo invertido
dessincronizado. Nesse algoritmo é possível avaliar a presença de anticorpos específicos
para diferentes espécies ou formas evolutivas de parasitos, padronizados com distintas
diluições, para avaliação da reatividade em uma única amostra de soro e em um único
teste. A utilização de tais técnicas, que utilizam esse algoritmo, possibilita a avaliação
DISCUSSÃO
110
de maiores diluições das amostras de soros testadas do que as metodologias sorológicas
convencionais, sendo assim testes altamente sensíveis e específicos (LEMOS et al.,
2007; GARCÍA et al., 2009; ALESSIO et al., 2014; TEIXEIRA-CARVALHO et al.,
2015).
Na primeira parte do trabalho, foi avaliada a reatividade apenas das amostras de
soros dos camundongos com infecções tardias simples pelo T. cruzi pela TcI/TcVI/TcII
Chagas Flow ATE-IgG2a. Essa abordagem inicial foi essencial para verificar o
potencial dessa metodologia no diagnóstico genótipo-específico da infecção
experimental pelo T. cruzi.
Uma vez que em infecções recentes simples, o parasito é encontrado facilmente na
circulação (parasitemia patente), a genotipagem do T. cruzi pode ser realizada por
métodos moleculares que isolam o parasito diretamente do sangue (D´ÁVILLA et al.,
2009; LEWIS et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2015), sem o viés de algumas populações
poderem estar presentes nos tecidos, como ocorre em infecções mistas (MACEDO
AND PENA, 1998; VAGO et al., 2000; MACEDO et al.,2002; MANTILLA et al.,
2010; LO PRESTI et al., 2014; SALES-CAMPOS et al., 2014), ou serem diluídas ou
até mesmo perdidas após o manuseio em cultivo celular e acelular (LAURIA-PIRES et
al., 1997; BOSSENO et al., 2000; SOLARI et al., 2001; ORTIZ et al., 2015).
As metodologias utilizadas na tipagem molecular do T. cruzi compreendem: o
critério de LEWIS et al. (2009), baseado na variabilidade da sequência do domínio
divergente D7 do gene ribossômico da subunidade 24SαrRNA (LSU-rDNA) (SOUTO
et al., 1996) e em duas tipagem do polimorfismo do comprimento do fragmento de
restrição do kDNA dos mincírculos (RFLP), por meio da PCR (PCR-RLFP), da
proteína de choque térmico 60 (HSP60) e da glicose-6-fosfato-isomerase (GPI). O
critério de D´ÁVILLA et al. (2009), baseado no polimorfismo do gene mitocondrial da
citocromo oxidase subunidade II pela RFLP-PCR (FREITAS et al., 2006), do espaçador
intergênico SL-IL do mini-exon (BURGOS et al., 2007) e na LSU-rDNA, também pode
ser utilizado para a genotipagem do T. cruzi em infecções simples. A PCR-RFLP
multilocus (MLP), o qual analisa o polimorfismo genético de distintos loci do T. cruzi
(ROZAS et al., 2007), a eletroforese isoenzimática multilocus-MLEE (BARNABÉ et
al., 2000) e a técnica de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente-RAPD (BRISSE
et al., 2000) também tem sido utilizadas para a genotipagem do parasito, principalmente
em infecções simples do T. cruzi, ambos empregando diferentes marcadores e etapas.
DISCUSSÃO
111
No entanto, essas estratégias necessitam da análise de um grande número de loci para
discriminar as linhagens do T. cruzi, além da análise de complexos padrões
eletroforéticos (TIBAYRENC et al., 1993). Esses métodos são capazes de discriminar
as linhagens do parasito, mas a interpretação dos resultados é frequentemente propícia a
erros, devido ao poder discriminatório de um teste que se baseia na inspeção visual de
pequenas diferenças nas bandas eletroforéticas ou mesmo na avaliação da intensidade
de alguns produtos de amplificação (BRISSE et al., 2001).
DISCUSSÃO – CAPÍTULO 2
Na segunda parte do trabalho foi avaliada a reatividade das 310 amostras de
soros do estudo, compreendendo: camundongos com infecções simples pelo T. cruzi nas
infecções recentes e tardias e camundongos com infecções mistas pelo T. cruzi nas
infecções recentes e tardias (Figuras 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e 16). Essa abordagem
mais ampla foi essencial para avaliar o desempenho da TcI/TcVI/TcII Chagas Flow
ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi.
Além de verificar o desempenho do método proposto para diferenciar infecções
experimentais pelo T. cruzi infecções recentes e tardias e em infecções simples e mistas
do parasito.
Na maioria das áreas endêmicas para a doença de Chagas, os indivíduos estão
expostos à várias reinfecções, e consequentemente apresentam diferentes populações do
T. cruzi ao longo do curso da doença (BOSSENO et al., 1996; BRENIÉRE et al., 1998;
SOLARI et al., 2001; LEHANE et al., 2000; MANTILLA et al., 2010; MONJE-RUMI
et al., 2015). Dessa maneira, essa segunda parte do estudo teve como objetivo avaliar
em modelo experimental o que ocorre na natureza em humanos. Além do mais, a
inclusão das infecções recentes nesse caso foi essencial, devido ao tropismo do parasito
por diferentes tecidos do hospedeiro em infecções mistas pelo T. cruzi (VAGO et al.,
2000; MANTILLA et al., 2010; LO PRESTI et al., 2014; SALES-CAMPOS et al.,
2014). De acordo com o ―Modelo Histiotrópico Clonal‖ para o T. cruzi, as linhagens do
parasito presentes no tecido podem ser distintas daquelas que são isoladas do sangue, e
consequentemente as populações disponíveis para análise podem diferir daquelas que
causam lesão tecidual (MACEDO AND PENA, 1998; MACEDO et al., 2002). Em
infecções mistas, distintos genótipos do parasito podem ser encontrados no sangue e nos
DISCUSSÃO
112
órgãos, de acordo com a fase ou tempo de infecção. Paralelamente, o conhecimento que
se tem do polimorfismo sanguíneo (BRENER AND CHIARI, 1963) do T. cruzi e do
papel da resposta imune específica, que surgem ao longo da infecção na modulação da
presença de uma ou outra cepa na circulação sanguínea (KRETTLI et al., 1979), em
função da morfologia predominante na população deste parasito, já foram relatados.
VAGO et al. (2000) demonstraram que diferentes populações do T. cruzi estavam
associadas com o coração e esôfago dos pacientes. Parasitos de distintas DTUs,
infecções mistas por TcII + TcV e simples por TcI no sangue periférico, além de
infecções simples por TcI no fluido cerebroespinhal, foram encontrados no mesmo
hospedeiro (BURGOS et al., 2008). MANTILLA et al. (2010) observaram a presença
de T. cruzi II no coração e T. cruzi I no esôfago de um mesmo paciente na Colômbia,
em uma área endêmica onde supostamente T. cruzi I é o principal agente da doença de
Chagas. De fato, T. cruzi II foi detectado em 25% dos corações dos pacientes que
apresentavam cardiomiopatia, contrastando como apenas 9% no sangue do mesmo
paciente. SALES-CAMPOS et al. (2014) demonstraram que as populações sanguíneas
do T. cruzi foram associadas com TcII durante as fases aguda e crônica e na
imunossupressão. Nos tecidos, na fase aguda a DTU TcII foi mais prevalente do que a
TcI, já na fase crônica a DTU TcI foi mais prevalente do que a TcII. Outros estudos,
porém, observaram um predomínio de TcI no sangue sob TcII (TOLEDO et al., 2002;
ANEZ et al., 2004; BOTERO et al., 2007). TOLEDO et al. (2002) detectaram um
aumento do parasitismo no sangue e nos tecidos em camundongos infectados com os
clones dos genótipos 19 (TcI), 20 (TcI) e 39 (híbrido) do T. cruzi na fase aguda,
enquanto que na fase crônica apenas clones do genótipo 39 (híbrido) foram
correlacionados com o alto parasitismo tecidual. A sobrevivência de uma população
parasitária no sangue é provavelmente relacionada com o seu escape da resposta imune
do hospedeiro (KRETTLI et al., 1979; WALLACE et al., 1995). Geralmente cepas
largas do parasito são mais resistentes à lise mediada pelo complemento, permanecendo
assim mais tempo na circulação do que cepas com predomínio de formas mais delgadas.
Assim, a padronização da TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a foi essencial para o
diagnóstico genótipo-específico de infecções experimentais mistas do T. cruzi nas
infecções recentes e tardias.
Alguns métodos moleculares são utilizados para a genotipagem do T. cruzi
diretamente de amostras biológicas, sem a necessidade de isolamento do parasito do
DISCUSSÃO
113
sangue e cultivo in vitro, tais como pela PCR primer específico único de baixa
adstringência (LSSP-PCR) (VAGO et al., 2000; LAGES-SILVA et al., 2006), pela
análise do polimorfismo do rDNA (FREITAS et al., 2005; BURGOS et al., 2007) e
pelas análise do polimorfismo de microssatélites (BURGOS et al., 2008; VALADARES
et al., 2008), sendo importantes para o melhor entendimento da patogênese da doença
de Chagas. No entanto, essas técnicas apresentam uma alta complexidade, necessitam
de equipamentos e reagentes especializados com um custo elevado, e de operadores
bem treinados. Devido a este fato, a padronização de métodos sorológicos para o
diagnóstico genótipo-específico da infeção pelo T. cruzi, com um amplo repertório
antigênico é de grande importância para agregar esse processo e reduzir os custos
(BHATTACHARYYA et al., 2010, MENDES et al., 2013; BHATTACHARYYA et
al., 2014, 2015), como proposto nesse trabalho pela TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-
IgG2a.
Nesta segunda parte do trabalho repetiu-se o algoritmo proposto para a
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a no diagnóstico genótipo-específico de
camundongos com infecções recentes e simples (Figuras 6, 14 e 15). No entanto, foram
utilizadas análises estatísticas complementares, como as realizadas pelo programa R, do
cálculo da distância modular entre as médias dos grupos a serem segregados. Essas
análises selecionaram os mesmos conjuntos de atributos (―antígeno/diluição do
soro/ponto de corte‖) empregados no diagnóstico genótipo-específico de infecções
recentes simples pelo T. cruzi, já padronizados na primeira parte do trabalho,
confirmando assim a coerência e veracidade dos dados obtidos (Figuras 6, 14 e 15).
A TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou um bom desempenho
para discriminar infecções recentes e tardias pelo T. cruzi, com uma acurácia global
moderada (81%). O conjunto de atributos: ―antígeno de EPI TcII na diluição 1:500, com
ponto de corte de 55%‖ foi o melhor para distinguir infecções pelo T. cruzi nas
infecções recentes e tardias, e por isso foi escolhido pela árvore de decisão como
atributo raiz (Figura 9). Esse dado é de extrema importância, uma vez que em
laboratórios de pesquisas, por diversas vezes não se sabe ao certo a procedência das
amostras que serão avaliadas. Além disso, trabalhos prévios demonstraram o
comportamento distinto dos diferentes genótipos do T. cruzi em hospedeiros de acordo
com o tempo de infecção (ANDRADE et al., 1992; TOLEDO et al., 2003, 2004), sendo
essencial distinguí-lo.
DISCUSSÃO
114
ANDRADE et al. (1992) observaram que na fase aguda cepas do grupo genético
T. cruzi (híbridos) foram susceptíveis, do grupo genético T. cruzi II (TcII) parcialmente
a altamente susceptíveis e do grupo genético T. cruzi I (TcI) resistentes ao tratamento
com benzonidazol e nifurtimox. Já na fase crônica, as cepas do grupo T. cruzi I (TcI)
foram parcialmente susceptíveis ao tratamento com benzonidazol. TOLEDO et al.
(2003) também demonstram diferenças na resposta ao tratamento de acordo com o
genótipo do parasito e a fase da infecção. Clones do genótipo 39 (híbridos) foram
resistentes ao tratamento com itraconazol na fase aguda e parcialmente susceptíveis à
esse tratamento na fase crônica. Já clones do genótipo 32 (TcII) foram parcialmente
susceptíveis ao tratamento com itraconazol na fase aguda e susceptíveis à esse fármaco
na fase crônica. TOLEDO et al. (2004) observaram após o tratamento com
benzonidazol uma redução no parasitismo tecidual em camundongos infectados com
clones do genótipo 19 (TcI) e uma diminuição no processo inflamatório em clones dos
genótipos 20 (TcI) e 32 (TcII) do T. cruzi na fase aguda. Já na fase crônica foi
demonstrado após o tratamento com benzonidazol, uma redução no parasitismo tecidual
em camundongos infectados com clones do genótipo 39 (híbrido), enquanto que na fase
aguda esse grupo genético apresentou um maior parasitismo em relação ao grupo não
tratado. Diante disso, a TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a surge como uma nova
ferramenta capaz de distinguir infecções pelo T. cruzi nas infecções recentes e tardias.
Um dado interessante desse trabalho foi a alta reatividade das amostras de soros
com o antígeno das formas tripomastigotas nas infecções recentes e tardias, elevando-se
nas infecções tardias, e a baixa reatividade dessas mesmas amostras de soros com o
antígeno das formas amastigotas e epimastigotas nas infecções recentes, porém
elevando-se nas infecções tardias (Figura 9). Esse resultado condiz exatamente com o
ciclo biológico do T. cruzi, em que na fase aguda predominam as formas
tripomastigotas, já na fase crônica essas formas desaparecem da circulação e
permanecem nos tecidos do hospedeiro, transformando-se em amastigotas que se
multiplicam por divisão binária simples longitudinal, diferenciando-se em
tripomastigotas sanguíneas, que com o rompimento da célula caem na corrente
sanguínea junto com algumas formas amastigotas que não se diferenciaram (BRENER,
1973; DIAS, 2000). No entanto, elas não serão mais facilmente detectáveis na
circulação devido a imunidade específica existente na fase crônica. As formas
epimastigotas, mesmo não estando presentes nos hospedeiros vertebrados,
DISCUSSÃO
115
compartilham antígenos com outras formas evolutivas do T. cruzi, o que pode explicar o
sucesso de seu uso nas técnicas sorológicas empregadas no diagnóstico de rotina da
doença de Chagas. As amostras de soros dos camundongos infectados pelo T. cruzi
apresentaram alta reatividade tanto nas infecções recentes, quanto nas infecções tardias
com o antígeno de tripomastigota do genótipo TcII, demonstrando novamente ser um
bom antígeno para o diagnóstico universal da infecção experimental pelo T. cruzi, assim
como observado na primeira parte do estudo (Figura 9). Os resultados demonstraram
ainda uma maior reatividade das amostras de soros dos camundongos nas infecções
tardias em relação às infecções recentes com as três formas evolutivas do parasito
(AMA, TRIPO e EPI), dentro do conjunto dos nove pares de atributos pré-selecionados
(Figura 9). Esse fato pode estar relacionado com uma maior espeficidade da resposta
imune do hospedeiro, e consequentemente com uma maior reatividade dos anticorpos
adquiridos ao longo das infecções tardias (ROWLAND et al., 1992; BRENER AND
GAZZINELII, 1997; CORDEIRO et al., 2001; SANTOS et al., 2009).
A técnica TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou um maior
potencial para discriminar infecções tardias pelo T. cruzi, uma vez que das 200 amostras
de soros provenientes das infecções tardias avaliadas, 187 (94%) foram classificadas
corretamente, em contraste a 63 (57%) das 110 amostras de soros das infecções
recentes.
Um grande diferencial da TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a foi a
capacidade dessa metodologia de discriminar infecções pelo T. cruzi simples e mistas na
nas infecções recentes com uma acurácia global moderada (85%). O conjunto de
atributos ―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:2000, com ponto de corte de
50%‖ foi o melhor para segregar infecções recentes, simples e mistas pelo T. cruzi,
sendo escolhido pela árvore de decisão como atributo raiz (Figura 11). Essa
metodologia também foi capaz de segregar infecções pelo T. cruzi tardias, simples e
mistas com uma acurácia global moderada (84%). O conjunto de atributos ―antígeno de
tripomastigota TcI na diluição 1:8000, com ponto de corte de 60%‖ foi o melhor para
segregar infecções tardias, simples e mistas pelo T. cruzi, sendo escolhido pela árvore
de decisão como atributo raiz (Figura 11). Esses dados são de extrema importância,
uma vez que o comportamento dos genótipos do parasito nos hospedeiros difere em
infecções simples e mistas pelo T. cruzi (MARTINS et al., 2006, 2007). Trabalhos
prévios demonstraram que em infecções mistas pelo T. cruzi ocorre uma interação entre
DISCUSSÃO
116
os grupos genéticos do parasito e não apenas uma justaposição das suas características,
resultando assim em mudanças nas propriedades biológicas dos parasitos em associação
(DEANE et al., 1984; PINTO et al., 1998; DA SILVEIRA et al., 2000; MARTINS et
al., 2006, 2007; RAGONE et al., 2012). Trabalhos como os de MARTINS et al. (2006)
demonstraram diferenças significativas nos parâmetros relacionados à parasitemia:
período pré-patente, período patente, máximo de parasitemia e dia do pico máximo, em
camundongos infectados com clones do T. cruzi em infecções simples e mistas.
MARTINS et al. (2007) também observaram mudanças na resposta ao tratamento com
benzonidazol em camundongos com infecções simples e mistas com clones do T. cruzi,
sendo que nove das 24 infecções mistas modificaram o perfil de susceptibilidade ao
benzonidazol, quando comparado às respectivas infecções simples ou monoclonais. Nas
infecções simples a taxa de cura foi de: 70% para camundongos infectados com clones
do genótipo 19 (TcI), 70% para clones do genótipo 32 (TcII) e 50% para clones do
genótipo 39 (híbrido). Já nas infecções mistas, o percentual de cura foi de: 0% para
camundongos infectados com os clones 19 + 20 (TcI + TcI), 59,1% para a mistura dos
clones 39 + 32 (híbrido + TcII), 25,9% para a mistura dos clones 19 + 39 (TcI +
híbrido) e 22,7% para a mistura dos clones 19 + 32 (TcI + TcII). ARAÚJO et al. (2007)
demonstraram que isolados do T. cruzi I (TcI) apresentaram um longo tempo de
multiplicação em culturas in vitro (19,5h), quando comparado ao isolado T. cruzi II
(TcII) em que o tempo foi de 9,6h. Por outro lado, infecções mistas de T. cruzi I + T.
cruzi II (TcI + TcII) apresentaram um tempo de multiplicação intermediário de 13,9h.
Além do mais, esses autores demonstraram que a coinfecção resultou em um padrão de
colonização dos parasitos distinto no trato intestinal de Triatoma brasiliensis quando
comparado às infecções simples; em que T. cruzi I (TcI) e T. cruzi I + T. cruzi II (TcI +
TcII) colonizaram predominantemente a parede e o lúmen retal e T. cruzi II (TcII) o
intestino delgado dos triatomíneos.
Diante das mudanças do comportamento biológico e resposta ao tratamento das
distintas DTUs do T. cruzi em infecções simples e mistas, a TcI/TcVI/TcII Chagas Flow
ATE-IgG2a passa a ser de extrema importância para discriminar ambas as infecções.
Sendo assim, esse estudo foi pioneiro no desenvolvimento de um método sorológico por
citometria de fluxo capaz de distinguir infecções simples e mistas do T. cruzi, tanto em
infecções recentes quanto em infecções tardias. Os testes sorológicos que vem sendo
padronizados para a sorotipagem das distintas DTUs do parasito avaliaram apenas a
DISCUSSÃO
117
reatividade dos soros de hospedeiros com infecções simples pelo T. cruzi, e não
consideraram os distintos tempos pós-infecção (BHATTACHARYYA et al., 2010,
MENDES et al., 2013; BHATTACHARYYA et al., 2014, 2015), como avaliado na
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a. Além do mais, quando amostras de humanos
de diferentes países foram testadas, esses métodos sorológicos não apresentaram a
capacidade de detectar infecções mistas (BHATTACHARYYA et al., 2014), sendo
assim a nova metodologia proposta nesse trabalho apresenta uma vantagem adicional.
Um dado interessante desse trabalho foi que no geral observou-se uma maior
reatividade das amostras de soros com infecções mistas pelo T. cruzi, com os atributos
pré-selecionados, do que infecções simples pelo parasito, tanto nas infecções recentes
quanto nas tardias (Figuras 10 e 11). Isso pode estar relacionado ao fato de que
infecções mistas por apresentarem um maior repertório antigênico estimulam mais a
resposta imune humoral do hospedeiro, com anticorpos anti-T. cruzi ainda mais
específicos (ROWLAND et al., 1992; BRENER AND GAZZINELII, 1997;
CORDEIRO et al., 2001; SANTOS et al., 2009).
A técnica TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou um maior
potencial para discriminar infecções mistas pelo T. cruzi nas infecções recentes, uma
vez que das 60 amostras de soros provenientes das infecções mistas, 54 (90%) foram
classificadas corretamente, em contraste a 40 (80%) das 50 amostras de soros oriundas
das infecções simples. De maneira distinta, nas infecções tardias essa metodologia
apresentou um maior desempenho para distinguir infecções simples pelo T. cruzi, uma
vez que das 93 amostras de soros provenientes das infecções simples, 82 (91%) foram
classificadas corretamente, em contraste a 86 (80%) das 107 amostras de soros oriundas
das infecções mistas.
A TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou um bom desempenho no
diagnóstico genótipo-específico de infecções simples e mistas pelo T. cruzi, tanto nas
infecções recentes, quanto nas infecções tardias. Nas infecções recentes, essa
metodologia foi capaz de diferenciar infecções simples entre si, com uma acurácia
moderada (72%) (Figura 13). Considerando ainda as infecções recentes, a técnica de
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a foi capaz de discriminar infecções mistas entre
si, com uma acurácia moderada (80%) (Figuras 13). Os conjuntos de atributos
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 35%‖ e
―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:16000, com ponto de corte de 30%‖
DISCUSSÃO
118
foram os melhores para segregar para o diagnóstico genótipo-específico de infecções
simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções recentes, sendo escolhidos pelas árvores de
decisão como atributos raízes (Figuras 13). Já nas infecções tardias, essa metodologia
também foi capaz de diferenciar infecções simples entre si, com uma baixa acurácia
(69%) (Figura 15). Os resultados obtidos para as infecções recentes simples foram os
mesmos encontrados na primeira parte do estudo, porém foram utilizadas análises
estatísticas complementares, confirmando assim os dados obtidos. Nas infecções tardias
ainda, a TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a foi capaz de discriminar infecções
mistas entre si, com uma acurácia moderada (76%) (Figura 15). Os conjuntos de
atributos ―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de
50%‖ e ―antígeno de tripomastigota TcI na diluição 1:64000, com ponto de corte de
40%‖ foram os melhores para segregar para o diagnóstico genótipo-específico de
infecções simples e mistas pelo T. cruzi nas infecções tardias, sendo escolhidos pelas
árvores de decisão como atributos raízes (Figuras 15).
Essa abordagem dos dados, separação inicial das infecções recentes e tardias, e
posterior separação das infecções simples e mistas, foram de extrema importância, pois
além do comportamento distinto dos genótipos do T. cruzi nessas circunstâncias,
quando os dados foram analisados em conjunto, as árvores de decisão geradas foram
extremamente complexas e com uma baixa acurácia, em torno de 40% (dados não
mostrados). Em todas as situações abordadas: diagnóstico diferencial de infecções
recentes e tardias, diagnóstico para distinguir infecções simples e mistas dentro das
infecções recentes e tardias e diagnóstico genótipo-específico para infecções simples e
para infecções mistas dentro das infecções recentes e tardias, a acurácia do teste foi
determinada por meio da análise dos algoritmos por árvores de decisão. As árvores de
decisão estão entre os métodos mais utilizados em aprendizado de máquina. O passo
principal de um algoritmo que constrói uma árvore de decisão é a escolha de um
atributo que tenha o maior poder de discriminação entre as classes. Nesse sentido, a
árvore de decisão surge como uma nova ferramenta de análise com o intuito de
classificar, descobrir regras de associações e ―clusterizar‖ os dados (QUINLAN, 1993).
Um dado interessante desse trabalho foi que nos algoritmos das árvores de decisão,
discriminação das infecções simples e mistas nas infecções recentes e tardias, e
diagnóstico genótipo-específico de infecções simples e mistas nas infecções recentes e
tardias, o atributo raiz foi sempre o antígeno de tripomastigota do genótipo TcI. A alta
DISCUSSÃO
119
reatividade das amostras de soros com TRIPO TcI pode estar relacionado com a
morfologia predominante dos parasitos deste genótipo (cepas muito largas), e portanto
com a maior resistência à lise mediada pelo complemento (KRETTLI AND
BRENER,1982), mecanismo da resposta imune humoral importante na manutenção da
parasitemia subpatente, presente ao longo de toda a fase crônica (KRETTLI et al., 1979;
WALLACE et al., 1995).
Os resultados apresentados pela TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
demonstraram que o antígeno de tripomastigota TcII além de ser um bom antígeno para
o diagnóstico universal de infecções tardias simples (Figura 3-primeira parte do
trabalho), também desempenha um importante papel no diagnóstico universal de
infecções recentes simples e mistas (Figura 12) e de infecções tardias mistas (Figura
14). Além do mais, observou-se o mesmo comportamento das infecções tardias simples
para as infecções recentes simples: as amostras de soros dos camundongos infectados
com a cepa Colombiana/TcI apresentaram alta reatividade com o antígeno de TRIPO
TcI e baixa reatividade com o antígeno de AMA TcII e as amostras de soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII apresentaram alta reatividade com o
antígeno de AMA TcII e baixa reatividade com os antígenos de TRIPO TcI e EPI TcVI
(Figura 13). Nas infecções mistas tanto nas infecções recentes, quanto nas infecções
tardias, a reatividade das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas
CL/TcVI + COL/TcI (ambas cepas largas do parasito) é maior com o antígeno de
TRIPO TcI do que as infecções mistas por Y/TcII + CL/TcVI e Y/TcII + COL/TcI
(Figuras 13 e 15). Interessante notar que os soros dos camundongos infectados com a
cepa Colombiana/TcI reagem muito com TRIPO TcI, e os soros dos camundongos
infectados com a cepa Y/TcII reagem pouco com TRIPO TcI, nas infecções simples,
podendo haver alguma correlação nas infecções mistas. Da mesma maneira, nas
infecções mistas tanto nas infecções recentes, quanto nas infecções tardias, a reatividade
das amostras de soros dos camundongos infectados com as cepas Y/TcII + CL/TcVI é
maior com o antígeno de AMA TcII do que as infecções mistas por COL/TcI +
CL/TcVI e Y/TcII + COL/TcI (Figuras 13 e 15). Devido ao fato dos soros dos
camundongos infectados com a cepa Y/TcII reagirem muito com AMA TcII, e os soros
dos camundongos infectados com a cepa Colombiana/TcI reagirem pouco com AMA
TcII, nas infecções simples, pode haver alguma correlação nas infecções mistas.
DISCUSSÃO
120
No diagnostico genótipo-específico de infecções recentes simples, a
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou maior capacidade de classificar
infecções pela cepa Colombiana/TcI, uma vez que das 16 amostras, 14 (88%) foram
categorizadas corretamente, em contraste a 6 (40%) das 16 amostras de soros dos
infectados com a cepa CL/TcVI e 16 (84%) das 19 amostras dos infectados com a cepa
Y/TcII (Figura 13). Nas infecções recentes mistas, o método apresentou maior
capacidade de classificar infecções pelas cepas Y/TcII + CL/TcVI, 20/24 (83%), do que
infecções pelas cepas CL/TcVI + COL/TcI, 13/16 (81%) e Y/TcII + COL/TcI, 15/20
(75%) (Figura 13). No diagnóstico genótipo-específico de infecções tardias simples, a
TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a apresentou maior capacidade de classificar
infecções pelas cepas Colombiana/TcI, 24/29 (83%) e Y/TcII, 29/35 (83%) do que
infecções pela cepa CL/TcVI, 11/29 (38%) (Figura 15). Nas infecções tardias mistas, o
método apresentou maior capacidade de classificar infecções pelas cepas Y/TcII +
CL/TcVI, 38/43 (88%), do que infecções pelas cepas CL/TcVI + COL/TcI, 23/28 (82%)
e Y/TcII + COL/TcI, 21/36 (75%) (Figura 15). Esses dados também foram observados
nos diagramas de reatividade da TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a (Figura 18).
Algumas técnicas de biologia molecular são capazes de detectar infecções mistas
pelo T. cruzi, tais como: as metodologias em conjunto utilizadas no método de
D´ÁVILLA et al. (2009) baseada na análise do polimorfismo do gene mitocondrial da
citocromo oxidase subunidade II pela RFLP-PCR (FREITAS et al., 2006), do
espaçador intergênico SL-IL do mini-exon (BURGOS et al., 2007) e do gene
ribossômico da subunidade 24Sα (24SαrRNA) (D´ÁVILLA et al., 2009; ANDRADE et
al., 2011; SÁ et al., 2016). ANDRADE et al. (2011) demonstraram a presença de
infecções mistas do T. cruzi das DTUs TcI + TcIII, TcII + TcVI em isolados do
parasito de pacientes com doença de Chagas aguda adquirida por transmissão oral, em
triatomíneos e reservatórios silvestres, por meio das técnicas de PCR-RFLP do gene da
citocromo oxidase subunidade II e do polimorfismo da região intergênica do gene mini-
exon e do gene 24SαrRNA. Alguns trabalhos identificaram infecções mistas por meio
amplificação do kDNA pela PCR e subsequente hibridização utilizando sondas DTU-
específicas (DTU-blot) (BOSSENO et al., 2000; SOLARI et al., 2001; DIEZ et al.,
2010; ORTIZ et al., 2015), por meio da PCR-Real Time utilizando sondas Taq-Man
(MTq-PCR) (CURA et al., 2015) e por meio da amplificação de outros alvos do
genoma no T. cruzi, como o gene cSC5D pela PCR-RFL (CONSENTINO AND
DISCUSSÃO
121
AGUERO, 2012). No entanto, mesmo utilizando metodologias de alta complexidade
alguns desses estudos não foram capazes de detectar todas as infecções mistas presentes
nos hospedeiros, assim como observado pela técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a. Trabalhos como os de SÁ et al. (2016) utilizaram a PCR-RFL e como alvos do
genoma a citocromo oxidase subunidade II e o gene da subunidade 24SαrRNA para
identificar infecções mistas do T. cruzi no conteúdo intestinal de Rhodinus prolixus.
Esses autores identificaram 79,4% das infecções mistas, no entanto, a PCR-RFLP da
citocromo oxidase subunidade II não foi capaz de identificar infecções mistas por TcV
+ TcVI, sendo necessário associar essa técnica com a análise do gene da 24SαrRNA
para tipagem dessas infecções mistas. CURA et al. (2015) utilizaram a PCR-Real Time
com sondas Taq-Man (MTq-PCR) para identificar infecções mistas de isolados do T.
cruzi provenientes de humanos, triatomíneos e reservatórios silvestres. Em amostras
clínicas, a infecção mista por TcI + TcII/TcV/TcVI encontrada em pacientes
sintomáticos, não foi detectada pela MTq-PCR, além do mais, essa metodologia revelou
apenas seis das 16 infecções mistas pelo T. cruzi provenientes de amostras de
triatomíneos, e confirmou apenas um caso de infeção por TcI + TcII, falhando na
identificação das outras 17 infecções mistas oriundas de amostras de reservatórios
silvestres. CONSENTINO et al. (2012) por meio da PCR-RFLP do gene cSC5D do T.
cruzi não conseguiram detectar infecções mistas pelas DTUs TcV + TcVI.
A TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a é um método sorológico capaz de
identificar infecções simples e mistas pelo T. cruzi, e portanto não necessita isolar o
parasito do sangue por técnicas de baixa sensibilidade, como a hemocultura e o
xenodiagnóstico, e cultivar in vitro, como em alguns métodos moleculares, podendo
levar a erros na identificação dos genótipos que infectam os hospedeiros, por seleção de
populações decorrentes do manuseio do parasito nestas diferentes circunstâncias.
Trabalhos prévios demonstraram que as populações do parasito presentes no sangue dos
indivíduos foram distintas daquelas isoladas por xenodiagnóstico e cultivadas em meios
de cultura (BOSSENO et al., 2000; SOLARI et al., 2001; ORTIZ et al., 2015).
BOSSENO et al. (2000) demonstraram a presença de infecções mistas de clones dos
genótipos 20 (TcI) + 39 (híbrido) isolados do trato digestivo de triatomíneos e
identificados pela amplificação do kDNA pela PCR e subsequente hibridização
utilizando sondas específicas. No entanto, após o cultivo in vitro dos parasitos, apenas
6% das infecções mistas foram detectadas, com um grande predomínio de infecção
DISCUSSÃO
122
simples por clones do genótipo 20 (81%), demonstrando assim que a etapa do cultivo
selecionou esses clones. SOLARI et al. (2001) observaram infecções mistas de clones
dos genótipos 19 (TcI) e 20 (TcI), isolados de pacientes chagásicos do México, por
hibridização utilizando sondas específicas. No entanto, quando foi realizado o
isolamento do parasito por xenodiagnóstico seguido pelo seu cultivo in vitro foram
identificados apenas clones do genótipo 39 (híbrido). ORTIZ et al. (2015)
demonstraram por meio da amplificação do kDNA pela PCR e subsequente hibridização
utilizando sondas específicas, a presença de infecções mistas do T. cruzi das DTUs TcI,
TcII, TcV e TcVI no sangue de indivíduos chagásicos. Porém, quando foi realizado o
xenodiagnóstico, seguido do cultivo in vitro dos parasitos, apenas a DTU TcV foi
identificada. Assim, diante disso, a TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a é um
método sorológico por citometria de fluxo inovador com grande potencial para o
diagnóstico genótipo-específico de infecções experimentais simples e mistas pelo T.
cruzi. No geral, pela análise dos algoritmos sequenciais das árvores de decisão, essa
técnica apresentou uma acurácia de 81% como uma prova diagnóstica complementar
para a infecção experimental pelo T. cruzi, uma vez que das 310 amostras de soros
testadas 251 tiveram o diagnóstico correto, seja pela tempo de infecção + tipo de
infecção + genótipo (163/251- 65%), ou apenas pelo tipo de infecção + genótipo
(22/251 - 9%) ou ainda somente pelo tipo de infecção (66/251-26%) (Figura 18).
Em resumo e diante dos resultados obtidos nesse trabalho, a TcI/TcVI/TcII
Chagas Flow ATE-IgG2a surge como uma nova ferramenta para classificar as amostras
de soros dos camundongos como pertencentes aos seus respectivos grupos, infectados
com distintos genótipos do T. cruzi (Figuras 8 e 16), sugerindo sua aplicabilidade no
diagnóstico universal e genótipo-específico de infecções experimentais simples e mistas
do T. cruzi. A metodologia proposta inclui algumas vantagens como: alta sensibilidade
e especificidade, capacidade de diferenciar amostras de soros em infecções
experimentais recentes e tardia, em infecções simples e mistas e genótipo-específicas do
T. cruzi. Além do mais, por ser um método sorológico, ele apresenta uma simplificação
do processo de genotipagem e apresenta ainda, como vantagem, a utilização de um
amplo repertório antigênico em plataforma única por citometria de fluxo. Testes
adicionais de otimização da TcI/TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a, como o
desenvolvimento de ensaios de ELISA ou de beads multiplex podem contribuir para
aplicações práticas em laboratórios de rotina.
DISCUSSÃO
123
Uma extensão desse estudo pode ser aplicável a outros grupos genéticos do T.
cruzi não incluídos nesse trabalho (TcIII, TcIV, TcV). Estudos futuros, incluindo
amostras de soros de pacientes com diagnóstico genótipo-específico da doença de
Chagas, realizado por métodos moleculares, estão atualmente sob investigação a fim de
propor um protótipo para fins clínicos, estudos epidemiológicos e de resposta pós-
terapêutica.
EVIDÊNCIAS
124
7. EVIDÊNCIAS
EVIDÊNCIAS
125
A técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um bom
desempenho no diagnóstico universal de infecções simples pelas cepas Colombiana/TcI,
CL/TcVI e Y/TcII do T. cruzi, nas infecções tardias, utilizando o conjunto de atributos
―antígeno de TRIPO TcII na diluição 1:500, com ponto de corte de 20%‖, com 100% de
sensibilidade e especificidade. Na avaliação do diagnóstico genótipo-específico de
infecções tardias simples pelo T. cruzi, essa metodologia apresentou uma acurácia de
69% para distinguir infecções pelas cepas Colombiana/TcI, CL/TcVI e Y/TcII, e uma
alta acurácia para discriminar infecções pelas cepas Colombiana/TcI e Y/TcII, por meio
dos conjuntos de atributos: ―antígeno de AMA TcII na diluição 1:1000, com ponto de
corte de 40%‖, ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:400, com ponto de corte de 50%‖
e ―antígeno de EPI TcVI na diluição 1:1000, com ponto de corte de 45%‖. No geral, os
soros dos camundongos infectados com as cepas Colombiana/TcI e Y/TcII
apresentaram padrões opostos de reatividade com os antígenos de AMA TcII e TRIPO
TcI. Soros provenientes de infecções pela cepa Colombiana/TcI apresentaram alta
reatividade com o antígeno de TRIPO TcI e baixa reatividade com o antígeno de AMA
TcII, em contraste, soros de infecções pela cepa Y/TcII apresentaram alta reatividade
com o antígeno de AMA TcII e baixa reatividade com o antígeno de TRIPO TcI. Esses
resultados demonstraram o potencial da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a para o
diagnóstico genótipo-específico de infecções experimentais tardias e simples pelo T.
cruzi.
A TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um bom desempenho
para discriminar infecções recentes e tardias pelo T. cruzi, com uma acurácia de 81%. O
―antígeno de EPI TcII na diluição 1:500, com ponto de corte de 55%‖ foi o melhor para
distinguir esses dois grupos. No geral, o método apresentou uma melhor acurácia para
discriminar infecções tardias. Essa metodologia também foi capaz de segregar infecções
simples e mistas pelo T. cruzi, nas infecções recentes, com uma acurácia de 85%,
principalmente por meio do conjunto de atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição
1:2000, com ponto de corte de 50%‖, e de distinguir infecções simples e mistas, nas
infecções tardias, com uma acurácia de 84%, principalmente por meio do conjunto de
atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:8000, com ponto de corte de 60%‖. A
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a apresentou um bom desempenho no
diagnóstico genótipo-específico de infecções recentes simples pelo T. cruzi, , com uma
acurácia de 72%, principalmente por meio do conjunto de atributos ―antígeno de TRIPO
EVIDÊNCIAS
126
TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte de 35%‖ e de infecções recentes mistas,
com uma acurácia de 82%, principalmente por meio do conjunto de atributos ―antígeno
de TRIPO TcI na diluição 1:16000, com ponto de corte de 30%‖. Essa metodologia
ainda apresentou um bom desempenho no diagnóstico genótipo-específico de infecções
tardias simples pelo T. cruzi, com uma acurácia de 69%, principalmente por meio do
conjunto de atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:4000, com ponto de corte
de 50%‖ e de infecções tardias mistas, com uma acurácia de 76%, principalmente por
meio do conjunto de atributos ―antígeno de TRIPO TcI na diluição 1:64000, com ponto
de corte de 40%‖. No geral, pela análise dos algoritmos sequenciais das árvores de
decisão, a TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a demonstrou ser uma técnica
diagnóstica complementar para infecções experimentais pelo T. cruzi, com uma acurácia
de 81%, seja para identificar infecções pelo seu tempo de infecção, tipo e genótipo, ou
apenas pelo tipo de infecção e genótipo, ou ainda pelo tipo de infecção.
Os resultados em conjunto demonstraram o potencial da TcI/TcVI/TcII Chagas-
Flow ATE-IgG2a no diagnostico universal, no diagnóstico de infecções recentes e
tardias pelo T. cruzi, de infecções simples e mistas nas infecções recentes e tardias pelo
parasito e no diagnóstico genótipo-específico de infecções simples e mistas pelo T.
cruzi, nas infecções recentes e tardias.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
127
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
CONSIDERAÇÕES FINAIS
128
A TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a surge como uma nova
metodologia para o diagnóstico universal e genótipo-específico de infecções
experimentais pelo T. cruzi. A metodologia proposta inclui algumas vantagens como:
alta sensibilidade e especificidade, capacidade de diferenciar amostras de soros em
infecções experimentais recentes e tardias, em infecções simples e mistas e genótipo-
específicas do T. cruzi. Além do mais, por ser um método sorológico, ela apresenta uma
simplificação do processo de genotipagem, e ainda o diferencial da utilização de um
amplo repertório antigênico em plataforma única por citometria de fluxo. Os resultados
corroboram a hipótese do trabalho da existência de correlação entre a diversidade
genética do T. cruzi e a reatividade de seu hospedeiro à seus antígenos avaliada pelo
técnica TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a. Assim, os dados demonstraram que
as amostras de soros dos camundongos infectados com TcI e TcII apresentaram alta
reatividade com seus antígenos homólogos e baixa reatividade com seus antígenos
heterólogos, enquanto as amostras dos camundongos infectados com TcVI
apresentaram reatividade intermediária, o que condiz exatamente com a árvore
filogenética do T. cruzi. No geral, observou-se uma tendência para um maior
compartilhamento de características biológicas entre TcI e TcVI, uma vez que ambas
apresentaram alta reatividade com o antígeno TcVI, o que condiz com a morfologia dos
parasitos dessas DTUs e com o seu escape da resposta imune do hospedeiro.
PERSPECTIVAS
129
9. PERSPECTIVAS
PERSPECTIVAS
130
Testes adicionais de otimização da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a, como o desenvolvimento de ensaios multiplex podem contribuir para aplicações
práticas em laboratórios de rotina.
Além do mais, uma extensão desse estudo pode ser aplicável a outros
grupos genéticos do T. cruzi não incluídos nesse trabalho (TcIII, TcIV e TcV).
Estudos futuros visando a padronização da TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a para o diagnóstico genótipo-específico de infecções humanas pelo T. cruzi
serão de extrema importância para a proposta clínica, estudos epidemiológicos e de
monitoração pós-terapêutica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
131
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
132
AGUILAR H.M, ABAD-FRANCH F, DIAS J.C, JUNQUEIRA A.C, COURA J.R. Chagas disease in the
Amazon region. Mem Inst Oswaldo Cruz. 102: Suppl 1:47-56, 2007.
ALESSIO G.D, CÔRTES D.F, MACHADO-DE-ASSIS G.F, SALES-JÚNIOR P.A, FERRO E.AV,
ANTONELLI L.R, TEIXEIRA-CARVALHO A, MARTINS-FILHO O.A, DE LANA M. Inovations in
diagnosis and post-therapeutic monitoring of Chagas disease: Simultaneous flow cytometric detection of
IgG1 antibodies anti-live amastigote, anti-live trypomastigote, and anti-fixed epimastigote forms of
Trypanosoma cruzi. Journal of Immunological Methods, 413:32-44, 2014.
AMATO NETO V, DE MARCHI C.R, FERREIRA C.S, FERREIRA AW. Observations on the use of
TESA blot for the serological diagnosis of Chagas' disease. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, 38(6):534 – 535, 2005.
ANDRADE LO, ANDREWS NW. Lysosomal fusion is essential for the retention of Trypanosoma cruzi
inside host cells. J Exp Med, 200(9):1135-43, 2004.
ANDRADE L.O, GALVÃO L.M, MEIRELLES M.N, CHIARI E, PENA S.D, MACEDO A.M.
Differential tissue tropism of Trypanosoma cruzi strains: an in vitro study? Mem. Inst. Oswaldo Cruz.
105 (6), 834–837, 2010.
ANDRADE SG. Caracterização de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas no Recôncavo Baiano. Rev Pat
Trop. 65-121, 1974.
ANDRADE S.G. Morphological and behavioural characterization of Trypanosoma cruzi strains.
Rev.Soc.Bras.Med.Trop, 39-46, 1985.
ANDRADE S.G, RASSI A, MAGALHÃES J.B, FERRIOLLI F.F, LUQUETTI A.O. Specific
chemotherapy of Chagas disease: a comparison between the response in patients and experimental
animals inoculated with the same strains. Trans R Soc Trop Med Hyg 86: 624-626, 1992.
ANDRADE S.G, MAGALHÃES J. B. Biodemes and zimodemes of Trypanosoma cruzi strains:
correlations with clinical data and experimental pathology. Rev.Soc.Bras.Med.Trop, 27-35, 1997.
ANDRADE S.G, CAMPOS R.F, STEINDEL M, GUERREIRO M.L, MAGALHÃES J.B, ALMEIDA
M.C, REIS J.N, SANTOS V.C, VALADARES H.M, REIS M.G, MACEDO A.M. Biological,
biochemical and molecular features of Trypanosoma cruzi strains isolated from patients infected through
oral transmission during a 2005 outbreak in the state of Santa Catarina, Brazil: its correspondence with
the new T. cruzi Taxonomy Consensus (2009). Mem Inst Oswaldo Cruz,106(8):948-56, 2011.
ANEZ N, CRISANTE G, DA SILVA F.M, ROJAS A, CARRASCO H, UMEZAWA E.S, STOLF A.M,
RAMIREZ J.L, TEIXEIRA M.M. Predominance of lineage I among Trypanosoma cruzi isolates from
Venezuelan patients with different clinical profiles of acute Chagas' disease. Trop Med Int Health. 9 (12)
:1319–1326, 2004.
ANONYMOUS; Recommendations from a Satellite Meeting. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 94:513 -517,
1999.
ARAÚJO C.A.C, CABELLO P.H, JANSEN A.M. Growth behaviour of two Trypanosoma cruzi strains in
single and mixed infections: In vitro and in the intestinal tract of the blood-sucking bug, Triatoma
brasiliensis. Acta Tropica. 101: 225-231, 2007.
BARNABÉ C, BRISSE S, TIBAYRENC M. Population structure and genetic typing of Trypanosoma
cruzi, the agent of Chagas disease: a multilocus enzyme electrophoresis approach. Parasitology.120 (Pt
5): 513-26, 2000.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
133
BENJAMIN R.J, STRAMER S.L, LEIBY D.A, DODD R.Y, FEARON M, et al. Trypanosoma cruzi
infection in North America and Spain: evidence in support of transfusion transmission. Transfusion
52:1913-1921; quis 1912, 2012.
BERTELLI M.S, GOLGHER R.R, BRENER Z. Intraspecific variation in Trypanosoma cruzi: effect of
temperature on the intracellular differentiation in tissue culture. Journal Parasitology, 63:434–437, 1977.
BHATTACHARYYA T, BROOKS J, YEO M, CARRASCO H.J, LEWIS M.D, LLEWELLYN M.S,
MILES M.A. Analysis of molecular diversity of the Trypanosoma cruzi trypomastigote small surface
antigen reveals novel epitopes, evidence of positive selection and potential implications for lineage-
specific serology. Int J Parasitol. 40(8): 921-8, 2010.
BHATTACHARYYA T, FALCONAR A.K, LUQUETTI A.O, COSTALES J.A, GRIJALVA M.J,
LEWIS M.D, MESSENGER L.A, TRAN T.T, RAMIREZ J.D, GUHL F, CARRASCO H.J, DIOSQUE
P, GARCIA L, LITVINOV S.V, MILES M.A. Development of peptide-based lineage-specific serology
for chronic Chagas disease: geographical and clinical distribution of epitope recognition. Plos Negl Trop
Dis. 8(5): e2892, 2014.
BHATTACHARYYA T, MILLS E.A, JANSEN A.M, MILES M.A. Prospects for T. cruzi lineage-
specific serological surveillance of wild mammals. Acta Trop. 151: 182-6, 2015.
BORGES-PEREIRA J, COURA J.R. Morbidade da doença de Chagas em populações urbanas do sertão
da Paraíba. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 20: 101-107, 1987.
BOSSENO M.F, TELLERIA J, VARGAS F, YAKSIC N, NOIREAU F, MORIN A, BRENIÈRE S.F.
Trypanosoma cruzi: study of the distribution of two widespread clonal genotypes in Bolivian Triatoma
infestans vectors shows a high frequency of mixed infections. Exp.Parasitol. 83: 275–282, 1996.
BOSSENO M.F, YACSIK N, VARGAS F, BRENIÈRE S.F. Selection of T. cruzi clonal genotypes
(clonet 20 and 39) isolated from Bolivian triatomines following subculture in liquid medium. Memórias
do Instituto Oswaldo Cruz. 95: 601–607, 2000.
BOTERO L.A, MEJIA A.M, TRIANA O. Biological and genetic characterization of two Colombian
clones of Trypanosoma cruzi groups I and II. Biomedica 27(Suppl 1):64–74, 2007.
BRASIL P.E, DE CASTRO L, HASSLOCHER-MORENO A.M, SANGENIS L.H, BRAGA J.U. ELISA
versus PCR for diagnosis of chronic Chagas disease: systematic review and meta-analysis. BMC Infect Dis,
10, 337, 2010.
BRENER Z, CHIARI E. Morphological variations observed in different strains of Trypanosoma cruzi.
Rev Inst Med Trop São Paulo. 5: 220-4, 1963.
BRENER Z. Biology of Trypanosoma cruzi. Annu. Rev. Microbiol, 27: 347-382, 1973.
BRENER Z, CANÇADO J.R, GALVÃO L.M, LUZ Z.P, FILARDI L.S, PEREIRA M.E, SANTOS L.M,
CANÇADO C.B. An experimental and clinical assay with ketoconazole in the treatment of Chagas
disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 88: 149 – 153, 1993.
BRENER Z, GAZZINELLI R.T. 1997. Immunological control of Trypanosoma cruzi infection and
pathogenesis of Chagas’ disease. Int. Arch. Allergy Immunol. 114:103–110.
BRENIÈRE S.F, TIBAYRENC M, ANTEZANA G, PABON J, CARRASCO R, SELAES H, DEJEUX
P. Résultats préliminares en faveur d’une relation faible ou inexistante entre les formes cliniques de la
maladie de Chagas et le souches isoenzymatiques de Trypanosoma cruzi.. Comptes Rendus de
l’Academie des Sciences de Paris. 300: 555–558, 1985.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
134
BRENIÈRE S.F, BOSSENO M.F, TELLERIA J, BASTRENTA B, YACSIK N, NOIREAU F,
ALCAZAR J.L, BARNABÉ C, WINCKER P, TIBAYRENC M. Diferent behavior of two T. cruzi major
clones: transmission and circulation in young Bolivian patients. Experimental Parasitology. 89: 285–295,
1998.
BRISSE S, BARNABE C, TIBAYRENC, M. Identification of six Trypanosoma cruziphylogenetic
lineagens by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Int. J.
Parasitol, 30:35-40, 2000.
BRISSE S, VERHOEF J, TIBAYRENC M. Characterisation of large and small subunit rRNA and mini-
exon genes further supports the distinction of six Trypanosoma cruzi lineages. Int J Parasitol 31: 1218–
1226, 2001.
BRITTO C, CARDOSO M.A, VANNI C.M, HASSLOCHER-MORENO A, XAVIER S.S, OELEMANN
W. Polymerase chain reaction detection of Trypanosoma cruzi in human blood samples as a tool for
diagnosis and treatment evaluation. Parasitology, 110: 241-247, 1995.
BRITTO C.C. Usefulness of PCR-based assays to assess drug efficacy in Chagas disease chemotherapy:
value and limitations. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 104(I):122–135, 2009.
BRONFEN E, ALVARENGA N.J. O xenodiagnóstico e os critérios para avaliar o nível de parasitemia do
paciente chagásico crônico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24: 37-42, 1991.
BRUMPT E. Le xenodiagnostic. Application au diagnostic de quelques infections parasitaires et en
particulier à la Trypanosomose de Chagas. Bull Soc Pat Exot, 7:706-710, 1914.
BURGOS J.M, ALTCHEN J, BISIO M, DUFFY T, VALADARES H.M, SEIDENSTEIN M.E,
PICCINALI R, FREITAS J.M, LEVIN M.J, MACCHI L, MACEDO A.M, FREILIJ H, SCHIJMAN AG.
Direct molecular profiling of minicircle signatures and lineages of Trypanosoma cruzi bloodstream
populations causing congenital Chagas disease. Int J Parasitol, 37(12):1319-27, 2007.
BURGOS J.M, BEGHER S, SILVA H.M, BISIO M, DUFFY T, LEVIN M.J, et al. Molecular
identification of Trypanosoma cruzi I tropism for central nervous system in Chagas reactivation due to
AIDS. Am. J. Trop. Med. Hyg. 78: 294- 297, 2008.
BURGOS J.M, DIEZ M, VIGLIANO C, BISIO M, RISSO M, DUFFY T, CURA C, BRUSSES B,
FAVALORO L, LEGUIZAMON M.S, LUCERO R.H, LAGUENS R, LEVIN M.J, FAVALORO R,
SCHIJMAN A.G. Molecular identification of Trypanosoma cruzi discrete typing units in end-stage
chronic Chagas heart disease and reactivation after heart transplantation. Clin Infect Dis, 51(5):485-95,
2010.
BUSCAGLIA C.A, DI NOIA J.M. Trypanosoma cruzi clonal diversity and the epidemiology of
Chagas`disease. Micribes. Infect, 5:419-427, 2003.
CABALLERO Z.C, SOUSA O.E, MARQUES W.P, SAEZ-ALQUEZAR A, UMEZAWA E.S.Evaluation
of serological tests to identify Trypanosoma cruzi infection in humans and determine cross-reactivity with
Trypanosoma rangeli and Leishmania spp. Clin Vaccine Immunol. 14(8):1045-9, 2007.
CALDAS S, CALDAS I.S, DINIZ L.F, LIMA W.G, OLIVEIRA R.P, CECÍLIO A.B, RIBEIRO I,
TALVANI A, BAHIA M.T. Real-time PCR strategy for parasite quantification in blood and tissue samples
of experimental Trypanosoma cruzi infection. Acta Tropica, 123:170-177, 2012.
CALDAS S, CALDAS I.S, CECÍLIO A.B, DINIZ L.D, TALVANI A, RIBEIRO I, BAHIA M.T.
Therapeutic responses to different anti-Trypanosoma cruzi drugs in experimental infection by
benznidazole-resistant parasite stock. Parasitology. 21:1-10, 2014.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
135
CALDAS I.S, MATTA GUEDES P.M, DOS SANTOS F.M, DE FIGUEIREDO D.L, MARTINS T.A, DA
SILVA DO NASCIMENTO A.F, AZEVEDO M.A, DE LIMA W.G, NETO R.M, TORRES R.M,
TALVANI A, BAHIA M.T. Myocardial scars correlate with eletrocardiographic changes in chronic
Trypanosoma cruzi infection for dogs treated with Benznidazole? Trop. Med. Int. Health. 18 (1): 75–84,
2013.
CAMARGO, E.P. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic
trypanosomes in liquid media. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 6: 6 – 93,1964.
CAMARGO ME. Fluorescent antibody test for the serodiagnosis of American trypanosomiasis. Technical
modification employing preserved culture forms of Trypanosoma cruzi in a slide test. Revista do Instituto
de Medicina Tropical de São Paulo, 8:227 – 234, 1966.
CAMARGO M.E, HOSHINO-SHIMIZU S, CORREA N.S, PERES B.A. Hemaglutination test for
Chagas disease with chromium chloride, formalin-treated erythocytes, sensitized with Trypanosoma cruzi
extracts. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 13:45-50, 1971
CÂMARA A.C, VARELA-FREIRE A.A, VALADARES H.M, MACEDO A, D’ÁVILA D.A,
MACHADO C.R, et al. Genetic analyses of Trypanosoma cruzi isolates from naturally infected
triatomines and humans in northeastern Brazil. Acta Trop. 115: 205-211, 2010.
CANÇADO J.R. Tratamento específico da doença de Chagas. In: CANÇADO, J.R, CHUSTER, M.
(Eds). Cardiopatia chagásica. Belo Horizonte: Fundação Carlos Chagas, 327-355, 1985.
CANÇADO J.R. Criteria of Chagas disease cure. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 94:331-335,
1999.
CARDINAL M.V, LAURICELLA M.A, CEBALLOS L.A, LANATI L, MARCET P.L, LEVIN M.J, et
al. Molecular epidemiology of domestic and sylvatic Trypanosoma cruzi infection in rural northwestern
Argentina. Int J Parasitol. 38: 1533-1543, 2008.
CARRASCO H.J, SEGOVIA M, LLEWELLYN M.S, MOROCOIMA A, URDANETA-MORALES S,
MARTÍNEZ C, MARTÍNEZ C.E, GARCIA C, RODRÍGUEZ M, ESPINOSA R, DE NOYA BA, DÍAZ-
BELLO, HERRERA L, FITZPATRICK S, YEO M, MILES MA, FELICIANGELI M.D. Geographical
distribution of Trypanosoma cruzi genotypes in Venezuela.Plos Negl Trop Dis. 6(6):e1707, 2012.
CARVALHO M.R, KRIEGER M.A, ALMEIDA E, OELEMANN W, SHIKANAI-YASSUDA M.A,
FERREIRA A.W, PEREIRA J.B, SÁEZ-ALQUÉZAR A, DORlLHIAC-LLACER P.E, CHAMONE D.F,
et al. Chagas' disease diagnosis: evaluation of several tests in blood bank screening. Transfusion, 33(10):
830–834, 1993.
CASTRO A.M, LUQUETTI A.O, RASSO A, RASSI G.G, CHIARI E, GALVÃO L.M.C. Blood culture
and polymerase chain reaction for the diagnosis of the chronic phase of human infection with
Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 88: 894 – 900, 2002.
CASTRO C.N, PRATA A, MACÊDO V. Influência da parasitemia na evolução da doença de Chagas
crônica. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 38(1): 1 – 6, 2005.
CASTRO-SESQUEN Y.E, GILMAN R.H, MEJIA C, CLARK DE, CHOI J, REIMER-MCATEE
M.J, CASTRO R, VALENCIA-AYALA E, FLORES J, BOWMAN N, CASTILLO-NEYRA
R, TORRICO F, LIOTTA L, BERN C, LUCHINI A; CHAGAS/HIV WORKING GROUP IN BOLIVIA
AND PERU. Use of a Chagas Urine Nanoparticle Test (Chunap) to Correlate with Parasitemia Levels in
T. cruzi/HIV Co-infected Patients. Plos Negl Trop Dis. 10(2):e0004407, 2016.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
136
CERISOLA J.A, CHABEN M.F, LAZZARI J.O. Test de hemaglutinación para el diagnostic de la
enfermedad de Chagas. Prensa Méd Argent, 49:1761-1767, 1962.
CERISOLA J.A, ROHWEDDWE R, SEGURA E.L, DEL PRADO C.E, ALVAREZ M, MARTINI
G.J.W. El xenodiagnóstico. Buenos Aires: Imp Inst Nac Invest Cardiovasc, 157p, 1974.
CERVANTES-LANDÍN A.Y, MARTÍNEZ-MARTÍNEZ I, REYES P.A, SHABIB M, ESPINOZA-
GUTIÉRREZ B. [Standardization of Dot-ELISA for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies,
compared to ELISA and Western blot]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 32(6):363-8, 2013.
CHAGAS C. Nova Tripanozomiase Humana. Estudo sobre a morfologia e o ciclo evolutivo do
Schizotrypanum cruzi. n. gen., n. sp. agente etiológico de nova entidade mórbida do homem. Memórias
do Instituto Oswaldo Cruz, 1: 159 – 218, 1909.
CHAGAS C. Nova entidade mórbida do homem. Resumo geral de estudos etiológicos e clínicos.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 3(2): 219 – 275, 1911.
CHAPPUIS F, MAURIS A, HOLST M, ALBAJAR-VINAS P, JANNIN J, LUQUETTI A.O, JACKSON
Y. Validation of a rapid immunochromatographic assay for diagnosis of Trypanosoma cruzi infection
among Latin-American Migrants in Geneva, Switzerland. J Clin Microbiol. 48(8):2948-52, 2010.
CHIARI E, BRENER Z. Contribuição ao diagnóstico parasitológico da doença de Chagas na sua fase
crônica. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 8: 134 - 138, 1966.
CHIARI E, DIAS J.C.P, LANA M, CHIARI C.A. Hemocultures for the parasitological diagnosis of
human chronic Chaga’s disease. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 22: 19 – 23, 1989.
CHIPPAUX J.P, SANTALLA J.A, POSTIGO J.R, ROMERO M, SALAS CLAVIJO N.A, SCHNEIDER
D, BRUTUS L. Sensitivity and specificity of Chagas Stat-Pak test in Bolivia. Trop Med Int Health.
14(7):732-5, 2009.
CONSENTINO RO, AGUERO F. A. Simple Strain Typing Assay for Trypanosoma cruzi: Discrimination
of Major Evolutionary Lineages from a Single Amplification Product. PLoS Negl Trop Dis. 6(7): 1777,
2012.
CORDEIRO F.D, MARTINS-FILHO A.O, ROCHA M.O.C, ADAD S.J, CORREA OLIVEIRA R,
ROMANHA A.J. Anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G1 can be a useful tool for diagnosis and
prognosis of human Chagas disease. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8:112–118, 2001.
COURA J.R, CASTRO S.L. A critical review on Chagas disease chemotherapy. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, 97: 3 – 24, 2002.
COURA J.R, JUNQUEIRA A.C, FERNANDES O, VALENTE S.A, MILES M.A. Emerging Chagas
disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitol, 18:171-176, 2002.
COURA J.R. Transmission of chagasic infection by oral route in the natural history of Chagas disease.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop, 39(3):113-7, 2006.
COURA J.R. Chagas disease: what is known and what is needed a background article. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, 102(I):113-122, 2007.
COURA J.R, DIAS J.C. Epidemiology, control and surveillance of Chagas disease: 100 years after its
Discovery. Men. Inst. Oswaldo Cruz 104 Suppl, 1:31-40, 2009.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
137
COURA J.R, JUNQUEIRA A.C. Chagas disease. What is known and what should be improved: a
systemic review. Rev Soc Bras Med Trop 45: 286-96, 2012.
CURA CI, DUFFY T, LUCERO RH, BISIO M, PÉNEAU J, JIMENEZ-COELLO M, et al. Multiplex
real-time PCR assay using TaqMan probes for the identification of Trypanosoma cruzi DTUs in
biological and clinical samples. Plos Negl Trop Dis. 9(5): 1371-88, 2015.
DA SILVEIRA PINTO A, LANA M, BRITTO C, BASTRENTA B, TIBAYRENC M. Experimental
Trypanosoma cruzi biclonal infection in Triatoma infestans:detection of distinct clonal genotypes using
kinetoplast DNA probes.Int. J. Parasitol. 30: 843–848, 2000.
D’ÁVILA D.A, MACEDO A.D, VALADARES H.M.S, GONTIJO E.D, DE CASTRO A.M,
MACHADO C.R, CHIARI E, GALVÃO L.M.C. Probing Population Dynamics of Trypanosoma cruzi
during Progression of the Chronic Phase in Chagasic Patients. J. OF CLIN. MICRO, 1718–1725, 2009.
DEANE M.P, SOUZA M.A, PEREIRA N.M, GONÇALVES A.M, MOMEN H, MOREL C.M,
Trypanosoma cruzi: inoculation schedules and reisolation methods select individual strains from doubly
infected mice,as demonstrated by schyzodeme and zymodeme analyses. Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz. 79: 513–515, 1984.
DE FREITAS V.L, DA SILVA S.C, SARTORI A.M, BEZERRA R.C, WESTPHALEN E.V, MOLINA
T.D, TEIXEIRA A.R, IBRAHIM K.Y, SHIKANAI-YASUDA M.A.Real-time PCR in HIV/Trypanosoma
cruzi coinfection with and without Chagas disease reactivation: association with HIV viral load and CD4
level. PLoS Negl Trop Dis. 5(8):e1277, 2011.
DIEZ C, LORENZ V, ORTIZ S, GONZALEZ V, RACCA A, BONTEMPI I, MANATTINI S, SOLARI
A, MARCIPAR I. Genotyping of Trypanosoma cruzi sublineage in human samples from a North-
East Argentinaarea by hybridization with DNA probes and specific polymerase chain reaction (PCR). Am
J Trop Med Hyg. 82(1):67-73, 2010.
DI NOIA J.M, BUSCAGLIA C.A, DE MARCHI C.R, ALMEIDA I.C, FRASCH A.C. A Trypanosoma
cruzi small surface molecule provides the first immunological evidence that Chagas´disease is due to a
single parasite lineage. J. Exp. Med, 195(4):401-413, 2002.
DIAS J.C.P. Epidemiology of Chagas disease. In S WENDEL, Z BRENER, MS CAMARGO, A
RASSI(eds), Chagas disease (American Trypanosomiasis): its Impact on Transfusion and Clinical
Medicine, ISBTBrazil, São Paulo, 49-80, 1992.
DIAS J.C.P. Natural history of Chagas’ disease. Arq Bras Cardiol, 65: 359–66, 1995.
DIAS J.C.P. Epidemiological surveillance of Chagas disease. Caderno de Saúde Pública, 16: 43 – 59,
2000.
DIAS J.C.P, SILVEIRA A.C, SCHOFIELD C.J. The impact of Chagas disease control in Latin America:
a review. Men. Inst. Oswaldo Cruz, 97:603-612, 2002.
DUFFY T, BISIO M, ALTCHEH J, BURGOS JM, DIEZ M, LEVIN MJ, FAVOLERO RR, FREILIJ H,
SCHIJMAN AG. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in Chagas
disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases, 3 (4): e419, 2009.
DUFFY T, CURA C.I, RAMIREZ J.C, ABATE T, CAYO N.M, PARRADO R, BELLO
Z.D, VELAZQUEZ E, MUÑOZ-CALDERON A, JUIZ N.A, BASILE J, GARCIA L, RIARTE
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
138
A, NASSER J.R, OCAMPO S.B, YADON Z.E, TORRICO F, DE NOYA B.A, RIBEIRO I, SCHIJMAN
A.G. Analytical performance of a multiplex Real-Time PCR assay using TaqMan probes for
quantification of Trypanosoma cruzi satellite DNA in blood samples. PLoS Negl Trop Dis. 7(1):e2000,
2013.
FEDERECI E.E, ALBEMANN W.H, NEVA F.A. Chronic and progressive myocarditis and myositis in
C3H mice infected with Trypanosoma cruzi. Am J Trop Med Hyg. 13: 272-80, 1964.
FERREIRA A.W, AVILA S.L.M. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-
Imunes.2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 22: 24 -249, 2001.
FILARDI L.S, BRENER Z. Susceptibily and natural resistance os Trypanosoma cruzi strains to drugs
used clinically in Chagas disease. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg, 81(5):755-759, 1987.
FREITAS JM, LAGES-SILVA E, CREMA E, PENA SD, MACEDO A.M. Real time PCR strategy for
the identification of major lineages of Trypanosoma cruzi directly in chronically infected human tissues.
Int. J. Parasitol. 35: 411-417, 2005.
FREITAS J. M, AUGUSTO-PINTO L, PIMENTA J. R, BASTOS-RODRIGUES L, GONÇALVES V. F,
TEIXEIRA S.M.R, CHIARI E, JUNQUEIRA A.C.V, FERNANDES O, MACEDO A.M, MACHADO,
C.R, PENA S.D.J. Ancestral genomes, sex, and the population struture of Trypanosoma cruzi. PLOS
Pathogens, 2:226-235, 2006.
GADELHA A.A, VERÇOSA A.F, LORENA V.M, NAKAZAWA M, CARVALHO A.B, SOUZA W.V,
FERREIRA A.G, SILVA E.D, KRIEGER M.A, GOLDENBERG S, GOMES Y.M. Chagas' disease
diagnosis: comparative analysis of recombinant ELISA with conventional ELISA and the
haemagglutination test. Vox Sang, 85(3):165 – 170, 2003.
GALVÃO L.M, CHIARI E, MACEDO A.M, LUQUETTI A.O, SILVA A.S, ANDRADE A.L.S.S. PCR
assay for monitoring Trypanosoma cruzi parasitemia in childhood after specific chemotherapy. Journal of
Clinical Microbiology, 41: 5066 – 5070, 2003.
GARCIA L.M, COELHO-DOS-REIS J.G, PERUHYPE-MAGALHÃES V, TEIXIERA-CARVALHO A,
ROCHA R.D, ARAÚJO M.S, GOMES I.T, CARVALHO S.F, DIETZE R, LEMOS E.M, ANDRADE
M.C, MARTINS-FILHO O.A. Anti-fixed Leishmania chagasi promastigotes IgG antibodies detected by
flow cytometry (FC-AFPA-IgG) as a tool for serodiagnosis and for post-therapeutic cure assessment in
American visceral leishmaniasis. Journal of Immunology Methods, 350(1-2):36–45, 2009.
GOMES M.L, MACEDO A.M, VAGO A.R, PENA S.D, GALVÃO L.M, CHIARI E. Trypanosoma
cruzi: optimization of polymerase chain reaction for detection in human blood. Experimental
Parasitology, 88:28-33, 1998.
GOMES Y.M, LORENA V.M, LUQUETTI A.O. Diagnosis of Chagas disease: what has been achieved?
What remains to be done with regard to diagnosis and follow up studies? Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz, 104(1):115–121, 2009.
GUEDES P.M, VELOSO V.M, TAFURI W.L, GALVÃO L.M, CARNEIRO C.M, LANA M, CHIARI E,
ATAIDE SOARES K, BAHIA M.T. The dog as model for chemotherapy of the Chagas´s disease. Acta
Trop, 84(1):9-17, 2002.
GUHL F, RAMÍREZ J.D. Retrospective molecular integrated epidemiology of Chagas disease in
Colombia. Infect Genet Evol. 20: 148- 154, 2013.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
139
HIGUERA S.L, GUHL F, RAMÍREZ J.D. Identification of Trypanosoma cruzi Typing Units (DTUs)
through the implementation of a High-Resolution Melting (HRM) genotyping assay. Parasites & Vector.
6: 112-117, 2013.
JUNQUEIRA A.C.V, CHIARI E, WINCKER P. Comparison of the polymerase chain reaction with two
classical parasitological methods for the diagnosis of Chagas disease in an endemic region of north-
eastern Brazil. Transactions of the Royals Society of Tropical Medicine and Hygiene, 90: 129 – 132,
1996.
KRETTLI A.U, WEISZ-CARRINGTON P, NUSSENZWEIG R.S. Membrane-bound antibodies to
bloodstream Trypanosoma cruzi in mice: strain differences in susceptibility to complement-mediated
lysis. Clin Exp Immunol. 37(3): 416-23, 1979.
KRETTLI AU, BRENER Z. Resistance against Trypanosoma cruzi associated to anti-living
trypomastigote antibodies. Journal of Immunology, 128: 2009 – 2012, 1982.
LAGES-SILVA E, RAMÍREZ L.E, PEDROSA A.L, CREMA E, DA CUNHA GALVÃO L.M, JUNHO
PENA S.D, MACEDO A.M, CHIARI E. Variability of kinetoplast DNA gene signatures of Trypanosoma
cruzi II strains from patients with different clinical forms of Chagas' disease in Brazil. J Clin Microbiol,
44:2167-71, 2006.
LANA M, DA SILVEIRA P.A, BARNABE C, QUESNEY V, NOEL S, TIBAYRENC M. Trypanosoma
cruzi: compared vectorial transmissibility of three major clonal genotypes by Triatoma infestans. Exp.
Parasitol, 90:20-25, 1998.
LANA M, PINTO A.S, BASTRENTA B, BARNABÉ C, NOEL S, TIBAYRENC M. Trypanosoma cruzi:
infectivity of clonal genotypes infections in acute and chronic phases in mice. Experimental Parasitology.
96: 61–66, 2000.
LANA M, MARTINS-FILHO O.A. Revisiting the Posttherapeutic Cure Criterion in Chagas Disease:
Time for New Methods, More Questions, Doubts, and Polemics or Time to Change Old Concepts?
Biomed Res Int. 2015:652985, 2015.
LAURENT J.P, BARNABE C, QUESNEY V, NOEL S, TIBAYRENC M. Impact of clonal evolution on
the biological diversity of Trypanosoma cruzi. Parasitology 114:213-218, 1997.
LAURIA-PIRES L, TEIXEIRA A.R. Virulence and pathogenicity associated with diversity of
Trypanosoma cruzi stocks and clones derived from Chagas' disease patients. Am J Trop Med Hyg. 55(3):
304-310, 1996.
LAURIA-PIRES L, SANTANA, J.M, TEIXEIRA A.R.L. Diversity ofTrypanosoma cruzi stocks and
clones derived from Chagas disease patients: I—Behavior characterization ―in vitro‖. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 30: 187–192, 1997.
LEHANE M.J, MSANGI A.R, WHITAKER C.J, LEHANE S.M. Grouping of trypanosome species in
mixed infections in Glossina pallidipes. Parasitology. 120: 583-592, 2000.
LEMOS E.M, GOMES I.T, CARVALHO S.F, ROCHA R.D, PISSINATE J.F, MARTINS-FILHO O.A,
et al. Detection of anti-Leishmania (Leishmania) chagasi immunoglobulin G by flow cytometry for cure
assessment following chemotherapeutic treatment of American visceral leishmaniasis. Clin Vaccine
Immunol. 14: 569–576, 2007.
LEWIS M.D, JONATHAN M.A, MATTHEW Y.E.O, HERNÁN J, CARRASCO, MARTIN S,
LLEWELLYN A.N.D, MICHAEL A, MILES. Genotyping of Trypanosoma cruzi: Systematic Selection
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
140
of Assays Allowing Rapid and Accurate Discrimination of All Known Lineages. Am J Trop Med Hyg,
81(6):1041–1049, 2009.
LO PRESTI M.S, ESTEVES B.H, MOYA D, BANZÁN P.C, STRAUSS M, BÁEZ A.L, PIZZI R,
QUISPE RICALDE M.A, VALLADARES B, RIVAROLA H.W, PAGLINI-OLIVA P.A. Circulating
Trypanosoma cruzi populations differ from those found in the tissues of the same host during acute
experimental infection. Acta Trop. 133: 98-109, 2014.
LUQUETTI A.O, MILES M.A, RASSI A, DE REZENDE J.M, DE SOUZA A.A, POVOA M.M,
RODRIGUES I. Trypanosoma cruzi: zymodemes associated with acute and chronic Chagas´disease in
central Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg 80:462-470, 1986.
LUQUETTI AO, RASSI A. Conferencia: Perspectiva del uso de la serología (Ag naturals y otros) em la
evaluación de la eficácia del tratamiento etiológico. Available:
www.fac.org.ar/fec/chagas2/llave/c003/luque.htm. 2002.
LUQUETTI A.O, PONCE C, PONCE E, ESFANDIARI J, SCHIJMAN A, REVOLLO S, AÑEZ
N, ZINGALES B, RAMGEL-ALDAO R, GONZALEZ A, LEVIN M.J, UMEZAWA E.S, FRANCO DA
SILVEIRA J. Chagas' disease diagnosis: a multicentric evaluation of Chagas Stat-Pak, a rapid
immunochromatographic assay with recombinant proteins of Trypanosoma cruzi. Diagn Microbiol Infect
Dis. 46(4):265-71, 2003.
LUZ Z.M.P, COUTINHO M.C, CANÇADO J.R, KRETTLI A.U. Hemocultura: técnica sensível na
detecção do Trypanosoma cruzi em pacientes chagásicos na fase crônica da doença de Chagas. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 27: 143-148, 1994.
MACEDO A.M, PENA S.D.J. Genetic variability of Trypanosoma cruzi: implications for the
pathogenesis of Chagas disease. Parasitol. Today, 14, 119-123, 1998.
MACEDO A.M, OLIVEIRA R.P, PENA S.D. Chagas disease: role of parasite genetic variation in
pathogenesis. Expert Rev Mol Med. 4(5): 1-16, 2002.
MACEDO A.M., MACHADO C.R., OLIVEIRA R.P, PENA S.D. Trypanosoma cruzi: genetic structure
of populations and relevance of genetic variability to the pathogenesis of chagas disease.
Mem.Inst.Oswaldo Cruz, 99, 1-12, 2004.
MANTILLA J.C, ZAFRA G.A, MACEDO A.M, GONZÁLEZ C.I. Mixed infection of Trypanosoma
cruzi I and II in a Colombian cardiomyopathic patient. Hum Pathol. 41(4): 610-3, 2010.
MARCILI A, LIMA L, VALENTE VC, VALENTE SA, BATISTA JS, JUNQUEIRA AC, et al.
Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TcIIc: new hosts, association with terrestrial
ecotopes, and spatial clustering. Infect Genet Evol. 9: 1265-1274, 2009.
MARTINS H.R, TOLED M.J.O, VELOSO V.M, et al. Trypanosoma cruzi: Impact of dual-clone
infections on parasite biological properties in BALB/c mice. Exp Parasitol. 112: 237–46, 2006.
MARTINS H.R, SILVA R.M, VALADARES H.M, et al. Impact of dual infections on chemotherapeutic
efficacy in BALB/c mice infected with major genotypes of Trypanosoma cruzi. Antimicrob Agents
Chemother. 51: 3282–9, 2007.
MARTINS H.R, FIGUEIREDO L.M, VALAMIEL-SILVA J.C, CARNEIRO C.M, MACHADO-
COELHO G.L, VITELLI-AVELAR D.M, BAHIA M.T, MARTINS-FILHO A.O, MACEDO A.M,
LANA M. Persistence of PCR-positive tissue in benznidazole-treated mice with negative blood
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
141
parasitological and serological tests in dual infections with Trypanosoma cruzi stocks from different
genotypes. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61: 1319 – 1327, 2008.
MARTINS-FILHO O.A, PEREIRA M.E.S, CARVALHO J.A.C, CANÇADO J.R, BRENER Z. Flow
cytometry, a new approach to detect anti-live trypomastigote antibodies and monitor the efficacy of
specific treatment in human chagas disease. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2: 569 –
573, 1995.
MARTINS-FILHO O.A, ELOI-SANTOS S.M, CARVALHO A.T, CÔRREA-OLIVEIRA R, RASSI A,
LUQUETTI A.O, RASSI G.G, BRENER Z. Double-Blind study to evaluate flow cytometry analysis of
anti-live trypomastigote antibodies for monitoring treatment efficacy in cases of human Chagas disease.
Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 9:1107-1113, 2002.
MATOS C.S, COELHO-DOS-REIS J.G, RASSI A, LUQUETTI A.O, DIAS J.C.P, ELOI-SANTOS S.M,
GOMES I.T, VITELLI-AVELAR D.M, WENDLING A.P.B, ROCHA R.D.R, TEIXEIRA-CARVALHO
A, PERUHYPE-MAGALHÃES V, ANDRADE M.C, MARTINS-FILHO A.O. Applicability of an
optimized non-conventional flow cytometry method to detect anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G
for the serological diagnosis and cure assessment following chemotherapeutic treatment of Chagas
disease. Journal of Immunological Methods, 369:22–32, 2011.
MATSUMOTO T.K, HOSHINO-SHIMIZU S, NAKAMURA P.M, ANDRADE JR H.F, UMEZAWA
ES. High resolution of Trypanosoma cruzi amastigote antigen in serodiagnosis of different clinical forms
of Chagas' disease. Journal of Clinical Microbiology, 31:1486–1492, 1993.
MAZZA S, FREIRE RS. Manifestaciones cutâneas de inoculacion, metastáticas y hematógenas em
enfermedad de Chagas. Chagomas de inoculación, chagomas metastáticos y chagomas hematógenos.
Public MEPRA, 46: 3 – 38, 1940.
MENDES T.A, REIS-CUNHA J.L, DE ALMEIDA L.R, RODRIGUES L.G, LEMOS L.D, DOS
SANTOS A.R, DA CÂMARA A.C, GALVÃO L.M, BERN C, GILMAN R.H, FUJIWARA R.T,
GAZZINELLI R.T, BARTHOLOMEU D.C. Identification of strain-specific B-cell epitopes in
Trypanosoma cruzi using genome-scale epitope prediction and high-throughput immunoscreening with
peptide arrays. Plos Negl Trop Dis.7(10): e2524, 2013.
MESSENGER L.A, MILES M.A, BERN C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic
diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Rev Anti Infect Ther. 13(8):995-1029,
2015.
MILES M.A, CEDILLOS R.A, POVOA M.M, DE SOUZA A.A, PRATA A, MACEDO V. Do radically
Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Venezuelan and Brazilian forms of Chagas disease?
Lancet, 1:1338-1340, 1981.
MILES M.A, LLEWELLYN M.S, LEWIS M.D, YEO M, BALEELA R, FITZPATRICK S, GAUNT
M.W, MAURICIO I.L. The molecular epidemiology and phylogeography of Trypanosoma cruzi and
parallel research on Leishmania: looking back and to the future. Parasitology. 136(12):1509-28, 2009.
MINISTÉRIO DA SAÚDE, COORDENAÇÃO DE DST/AIDS e COSAH Telelab No.11. Doença de
Chagas - Triagem e diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e laboratórios de saúde pública.
Brasília, Manual, 75 p, 1998.
MIYAMOTO C.T, GOMES M.L, MARANGON A.V, ARAUJO S.M, BAHIA M.T, MARTINS-FILHO
A.O, LANA M, TOLEDO M.J.O. Usefulness of the polymerase chain reaction for monitoring cure of
mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes following treatment with benznidazole.
Experimental Parasitology 120: 45 – 49, 2008.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
142
MONJE-RUMI M.M, BRANDÁN C.P, RAGONE P.G, TOMASINI N, LAUTHIER J.J, ALBERTI D’
AMATO A.M, CIMINO R.O, ORELLANA V, BASOMBRÍO M.A, DIOSQUE P. Trypanosoma cruzi
diversity in the Gran Chaco: mixed infections and differential host distribution of TcV and TcVI. Infect.
Genet. Evol. 29: 53-9, 2015.
MONTEIRO W.M, MAGALHÃES L.K, DE SÁ A.R, GOMES M.L, TOLEDO M.J, BORGES L, PIRES
I, GUERRA JA, SILVEIRA H, BARBOSA M.D. Trypanosoma cruzi IV causing outbreaks of
acute Chagas disease and infections by different haplotypes in the Western Brazilian Amazonia. Plos
One. 7(7):e41284, 2012.
MOREIRA C.I.C, PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ A. Attempts to improve xenodiagnosis:
comparative test of sensitivity using Rhodnius neglectus, Panstrongylus megistus, Triatoma vitticeps,
Triatoma infestans in endemic areas of Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 92(1): 91-96, 1997.
MOREIRA O.C, Ramírez J.D, Velázquez E, Melo M.F, Lima-Ferreira C, Guhl F, Sosa-Estani S, Marin-
Neto J.A, Morillo C,A, Britto C. Towards the establishment of a consensus real-time qPCR to monitor
Trypanosoma cruzi parasitemia in patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy: a substudy from
the BENEFIT trial. Acta Trop. 125(1):23-31, 2013.
MOTT K.E, FRANÇA J.T, BARRETT T.V, HOFF R, OLIVEIRA T.S, SHERLOCK I.A. Cutaneous
allergic reactions to Triatoma infestans after xenodiagnosis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 75: 3-
10,1980.
MURCIA L, CARRILERO B, MUÑOZ M.J, IBORRA M.A, SEGOVIA M. Usefulness of PCR for
monitoring benznidazole response in patients with chronic Chagas’ disease: a prospective study in a non-
disease-endemic country. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65(8): 1759 – 1764, 2010.
NAGARKATTI R, BIST V, SUN S, FORTES DE ARAUJO F, NAKHASI H.L, DEBRABANT A.
Development of an aptamer-based concentration method for the detection of Trypanosoma cruzi in blood.
Plos One. 7(8):e43533, 2012.
NOGUEIRA-PAIVA N.C, VIEIRA P.M, OLIVERI L.M, FONSECA S, POUND-LANA G, DE
OLIVEIRA M.T, DE LANA M, VELOSO V.M, REIS A.B, TAFURI W.L, CARNEIRO C.M.Host-
Parasite Interactions in Chagas Disease: Genetically Unidentical Isolates of a Single Trypanosoma cruzi
Strain Identified In Vitro via LSSP-PCR. PLoS One 10 (9), e0137788, 2015.
OELEMANN W.M.R, TEIXEIRA M.G.M, VERÍSSIMO D.A, COSTA G.C,BORGES-PEREIRA J, DE
CASTRO J.A.F, COURA J.R, PERALTA J.M. Evaluation of three commercial enzyme-linked
immunosorbent assays for diagnosis of Chagas disease. Journal of Clinical and Microbiology, 36: 2423-
2427, 1998.
OLIVEIRA M.T, MACHADO-DE-ASSIS G.F, OLIVEIRA-SILVA J.C, MACHADO E.M, DA SILVA
G.N, VELOSO V.M, MACEDO A.M, MARTINS H.R, LANA M. Trypanosoma cruzi Discret Typing
Units (TcII and TcVI) in samples of patients from two municipalities of the Jequitinhonha Valley, MG,
Brazil, using two molecular typing strategies. Parasit Vectors. 8: 568, 2015.
OLIVEIRA M.T, BRANQUINHO R.T, ALESSIO G.D, MELLO C.G, NOGUEIRA-DE-PAIVA N.C,
CARNEIRO C.M, TOLEDO M.J, REIS A.B, MARTINS-FILHO O.A, LANA M. TcI, TcII and TcVI
Trypanosoma cruzi samples from Chagas disease patients with distinct clinical forms and critical analysis
of in vitro and in vivo behavior, response to treatment and infection evolution in murine model. Acta
Trop. 167: 108 – 120, 2017.
OLIVEIRA-SILVA J.C.V, MACHADO-DE-ASSIS G.F, OLIVEIRA M.T, PAIVA N.C.N, ARAÚJO
M.S.S, CARNEIRO C.M, MARTINS-FILHO O.A, MARTINS H.R, DE LANA M. Experimental
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
143
benznidazole treatment of Trypanosoma cruzi II strains isolated from children of Jequitinhonha Valley,
Minas Gerais, Brazil, with Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 110:86-94, 2015.
ORTIZ S, ZULANTAY I, APT W, SAAVEDRA M, SOLARI A. Transferability of Trypanosoma cruzi
from mixed human host infection to Triatoma infestans and from insects to axenic culture. Parasitol
Int. 64(1):33-6, 2015.
PEREIRA DA SILVA LH, NUSSENZWEIG. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta
para o camundongo branco. Folia Clin Biol. 20: 191-208, 1953.
PEREIRA J.B, JUNQUEIRA A.C.V, SANTOS L.C, CASTRO J.A.F, ARAUJO I.B, COURA J.R.
Xenodiagnóstico na doença de Chagas crônica. I. Sensibilidade de Panstrongylus megistus e Triatoma
infestans. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 29: 241 - 247, 1996.
PEREZ-MOLINA J.A, NORMAN F, LOPEZ-VELEZ R. Chagas disease in non-endemic countries:
epidemiology, clinical presentation and treatment. Curr. Infect. Dis. Rep, 14:263-274, 2012.
PIFANO C.F. El diagnostico parasitológico de laenfermidad de Chagas crônica. Estudio comparativo
entre la gota gruesa, el xenodiagnóstico, el hemocultivo y lãs inoculaciones experimentales em animales
sensibles. ArchVenez Patol Parasitol Med, 21: 20-55, 1954.
PINTO A.S, LANA M, BASTRENTA B, BARNABÉ C, QUESNEY V, NOEL S, TIBAYRENC M.
Compared vectorial transmissibility of pure and biclonal infections of Trypanosoma cruzi in Triatoma
infestans. Parasitology Research. 84: 348–353, 1998.
PINTO A.S, LANA M, BRITTO C, BASTRENTA B, TIBAYRENC M. Experimental Trypanosoma
cruzi biclonal infection in Triatoma infestans: detection of distinct clonal genotypes using kinetoplast
DNA probes. International Journal of Parasitology. 30: 843–848, 2000.
PIRON M, FISA R, CASAMITJANA N, LÓPEZ-CHEJADE P, PUIG L, VERGÉS M, GÁSCON J,
PRAT J.G, PORTÚS M, SAULEDA S. Developmentof a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi
detection in blood samples. ActaTropica, 103: 195 – 200, 2007.
PISSINATI J.F, GOMES I.T, PERUHYPE-MAGALHÃES V, DIETZE R, MARTINS-FILHO O.A,
LEMOS E.M. Upgrading the flow-cytometric analysis of anti-Leishmania immunoglobulins for the
diagnosis of American tegumentary leishmaniasis. J. of Immunology Methods, 336(2):193–2002, 2008.
PRATA A. Classification of Chagas' infection in humans.Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, 23:109 - 113, 1990.
PRIMAVERA K.S.C, UMEZAWA E.S, PERES B.A, CAMARGO M.E, HOSHINO-SHIMIZU S.
Chagas' disease: IgA, IgM and IgG antibodies to T. cruzi amastigote, tripomastigote and epimastigote
antigens in acute and in different chronic forms of the disease. Rev. Inst. Med. Trop. 32:172–180, 1990.
QUINLAN JR. C4.5: Programs for Machine Learning. Morgan Kaufmann Publishers Inc.; 1993 302.
RAGONE P.G, PÉREZ BRANDÁN C, PADILLA A.M, MONJE RUMI M, LAUTHIER J.J, ALBERTI
D’AMATO A.M, TOMASINI N, CIMINO R.O, ROMERO N.M, NASSER J.R, BASOMBRÍO M.A,
DIOSQUE P. Biological behavior of different Trypanosoma cruzi iso-lates circulating in an endemic area
for Chagas disease in the Gran Chaco regionof Argentina. Acta Tropica. 123: 196–220, 2012.
RAMIRÉZ J.D, GUHL F, UMEZAWA E.S, MORILLO C.A, ROSAS F, MARIN-NETO J.A,
RESTREPO S. Evaluation of adult chronic Chagas’ heart disease diagnosis by molecular and serological
methods. Journal Clinical Microbiology, 47: 3945 – 3951, 2009.
RASSI AJR, RASSI A, MARIN-NETO J. Chagas disease. Lancet, 375: 1388 – 1402, 2010.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
144
RASSI A.J.R, RASSI A. Letter by Rassi and Rassi regarding article, "Ten-year incidence of Chagas
cardiomyopathy among asymptomatic, Trypanosoma cruzi-seropositive former blood donors".
Circulation. 128:135, 2013.
REIS-CUNHA J.L, MENDES T.A, DE ALMEIDA LOURDES R, RIBEIRO D.R, MACHADO-DE-
AVILA R.A, DE OLIVEIRA TAVARES M, LEMOS D.S, CÂMARA A.C, OLÓRTEGUI C.C, DE
LANA M, DA CUNHA GALVÃO L.M, FUJIWARA R.T, BARTHOLOMEU D.C. Genome-wide
screening and identification of new Trypanosoma cruzi antigens with potential application of chronic
Chagas disease diagnosis. Plos One, 9(9), 2014.
REVOLLO S, OURY B, LAURENT J.P, BARNABE C, QUESNEY V, CARRIERE V, NOEL S. &
TIBAYRENC M. Trypanosoma cruzi: impact of clonal evolution of the parasite on its biological and
medical properties. Exp.Parasitol, 89:30-39, 1998.
RIMOLDI A, ALVES R.T, AMBRÓSIO D.L, FERNANDES M.Z.T, MARTINEZ I, ARAÚJO R.F.
Morphological, biological and molecular characterization of three strains of Trypanosoma cruzi Chagas,
1909 (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) isolated from Triatoma sordida (Stal) 1859 (Hemiptera,
Reduviidae) and a domestic cat. Parasitology. 139, 37–44, 2012.
ROMAÑA C. Acerca de um sintoma inicial de valor para el diagnóstico de forma aguda de La
enfermedadde Chagas. La conjuntivitises quizotripanósica unilateral. (Hipótesissobre puerta de entrada
conjuntival de la enfermedad) Public MEPRA, 22: 16 – 28, 1935.
ROMANHA A.J. Heterogeneidade Isoenzimatica em Trypanosoma cruzi, PhD Tese, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 110 pp, 1982.
ROZAS M, DE DONCKER S, ADAUI V, CORONADO X, BARNABÉ C, TIBYARENC M, SOLARI
A, DUJARDIN J.C. Multilocus polymerase chain reaction restriction fragment--length polymorphism
genotyping of Trypanosoma cruzi (Chagas disease): taxonomic and clinical applications. J Infect
Dis.195(9):1381-8, 2007.
ROWLAND E.C, MIKHAIL K.S, MC CORMICK T.S. Isotype determination of anti-Trypanosoma cruzi
antibody in murine Chagas' disease. J Parasitol.78(3):557-61, 1992.
SÁ A.R, DIAS G.B, KIMOTO K.Y, STEINDEL M, GRISARD E.C, TOLEDO M.J, GOMES M.L.
Genotyping of Trypanosoma cruzi DTUs and Trypanosoma rangeli genetic groups in experimentally
infected Rhodnius prolixus by PCR-RFLP. Acta Trop.156:115-21, 2016.
SALES-CAMPOS H, KAPPEL H.B, ANDRADE C.P, LIMA T.P, MATTOS M.E JR, DE CASTILHO
A, CORREIA D, GIRALDO L.E, LAGES-SILVA E. A DTU-dependent blood parasitism and a DTU-
independent tissue parasitism during mixed infection of Trypanosoma cruzi in immunosuppressed mice.
Parasitol Res. 113(1): 375-85, 2014.
SALES-CAMPOS N.O, KAPPEL H.B, ANDRADE C.P, LIMA T.P, DE CASTILHO A, GIRALDO L.E,
LAGES-SILVA E. Trypanosoma cruzi DTU TcII presents higher blood parasitism than DTU TcI in an
experimental model of mixed infection. Acta Parasitol. 60 (3): 435–44, 2015.
SÁNCHEZ N.O, SÁNCHEZ V.F.J, LACUNZA C.D, GARCÍA B.M.F, MORA M.C, UNCOS A.D,
BASOMBRÍO M.A. Serological evaluation of specific-antibody levels in patients treated for chronic
Chagas' disease. Clin. Vaccine Immunol, 15, 297, 2008.
SANTOS D.M, TALVANI A, GUEDES P.M, MACHADO-COELHO G.L, DE LANA M, BAHIA M.T.
Trypanosma cruzi: Genetic diversity influences the profile of immunoglobulins during experimental
infection. Exp. Parasitol, 121(1):8-14, 2009.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
145
SCHENONE H, ALFARO E, REYES H, TAUCHER E. Valor Del xenodiagnóstico em la infección
chagásica crônica. Bolletin Chileno Parasitologia, 23: 149-154, 1968.
SCHENONE H, ALFARO E, ROJAS A. Bases y rendimento del xenodiagnóstico em la infección
chagásica humana. Bol Chil Parasitol, 29: 24-26, 1974.
SCHENONE H, ROJAS A, CASTILLO D. Comparative study of sensitivity and mortality of
Triatomainfestan nymphs III and IV used in the xenodiagnosis of chronic chagasic patients.Bol Chil
Parasitol, 55(1-2): 14 – 17, 2000.
SCHMUNIS GA. A Tripanossomíase Americana e seu Impacto na Saúde Pública das Américas.
Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1:1-12, 2000.
SCHMUNIS GA, YADON ZE. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world
health problem. Acta Trop115: 14-21, 2010.
SCHOFIELD C.J, DIAS J.C. The Southern Cone Initiative against Chagas disease. Adv. Parasitol, 42:1-
27, 1999.
SOLARI A, CAMPILLAY R, ORTIZ S, WALLACE A. Identification of Trypanosoma cruzi genotypes
circulating in Chilean chagasic patients. Experimental Parasitology, 97: 226 – 233, 2001.
SOUTO R.P, FERNANDES O, MACEDO A.M, CAMPBEL D. A, ZINGALES B. DNA markers define
two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol, 83:141-152, 1996.
STURM N.R, CAMPBELL D.A. Alternative lifestyles: the population structure of Trypanosoma cruzi.
Acta Trop. 115:35–43, 2010.
SWETS J.A. Measuring the accuracy of diagnostic systems.Science. 240: 1285 – 1293, 1988.
TESTON A.P, MONTEIRO W.M, REIS D, BOSSOLANI G.D, GOMES M.L, DE ARAÚJO S.M,
BAHIA M.T, BARBOSA M.G, TOLEDO M.J. In vivo susceptibility to benznidazole of Trypanosoma
cruzi strains from the western Brazilian Amazon. Trop Med Int Health. 18(1): 85-95, 2013.
TEIXEIRA-CARVALHO A, CAMPOS F.M, GEIGER S.M, ROCHA R.D, DE ARAÚJO F.F, VITELLI-
AVELAR D.M, ANDRADE M.C, ARAÚJO M.S, LEMOS E.M, DE FREITAS CARNEIRO PROIETTI
A.B, SABINO E.C, CALDAS R.G, FREITAS C.R, CAMPI-AZEVEDO A.C, ELÓI-SANTOS S.M,
MARTINS-FILHO O.A. FC-TRIPLEX Chagas/Leish IgG1: a multiplexed flow-cytometry method for
differential serological diagnosis of Chagas disease and leishmaniasis. Plos One, 10(4), 2015.
TIBAYRENC M, CARIOU M.L, SOLIGNAC J.P, DEDET J.P, POCH O, DEJEUX P. New
electrophoretic evidence of genetic variation & diploidy in Trypanosoma cruzi, the causative agent of
Chagas disease. Genetic. 23: 223–225, 1985.
TIBAYRENC M, NEUBAUER K, BARNABE´ C, GUERRINI F, SKARECKY D, et al. Genetic
characterization of six parasitic protozoa: parity between randomprimer DNA typing and multilocus
enzyme electrophoresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 1335–1339, 1993.
TIBAYRENC M. Genetic epidemiology of parasitic protozoa and other infectious agents: the need for an
integrated approach. Int. J. Parasitol, 28:85–104, 1998.
TIBAYRENC M, AYALA F.J. The population genetics of Trypanosoma cruzi revisited in the light of the
predominant clonal evolution model. Acta Trop.151: 156-65, 2015.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
146
TYLER, K.M, ENGMAN D.M. The life cycle of Trypanosoma cruzi revisited. Int. J. Parasitol, 31:472-
481, 2001.
TOLEDO M.J, LANA M, CARNEIRO C.M, BAHIA M.T, MACHADO-COELHO G.L, VELOSO V.M,
BARNABÉ C, TIBAYRENC M, TAFURI W.L. Impact of Trypanosoma cruzi clonal evolution on its
biological properties in mice. Exp Parasitol. 100(3): 161-7, 2002.
TOLEDO M.J. BAHIA M.T, CARNEIRO C.M, MARTINS-FILHO O.A, TIBAYRENC M, BARNABE
C, TAFURI W.L, DE L.M. Chemotherapy with benznidazole and itraconazole for mice infected with
different Trypanosoma cruzi clonal genotypes. Antimicrob.Agents Chemother, 47:223-230, 2003.
TOLEDO M.J, BAHIA M.T, VELOSO V.M, CARNEIRO C.M, MACHADO-COELHO G.L, ALVES
C.F, MARTINS H.R, CRUZ R.E, TAFURI W.L, LANA M. Effects of specific treatment on
parasitological and histopathological parameters in mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal
genotypes. J Antimicrob Chemother, 53(6):1045-53, 2004.
UMEZAWA E.S, NADCIMENTO M.S, KESPER N Jr, COURA J.R, BORGES-PEREIRA J,
JUNQUEIRA A.C, CAMARGO M.E. Immunoblot assay using excreted-secreted antigens of
Trypanosoma cruzi in serodiagnosis of congenital, acute, and chronic Chagas' disease. Journal Clinical
Microbiology, 34(9): 2143 – 2147, 1996.
UMEZAWA E.S, BASTOS S.F, CAMARGO M.E, YAMAUCHI L.M, SANTOS M.R, GONZALEZ A,
ZINGALES B, LEVIN M.J, SOUZA O, RANGEL-ALDAO R AND SILVEIRA J.F. Evaluation of
recombinant antigens for serodiagnosis of Chagas disease in South and Central America. Journal of
Clinical Microbiology, 37:1554-1560, 1999.
UMEZAWA E.S, LUQUETTI A, LEVITUS G, PONCE C, PONCE E, HENRIQUEZ D, REVOLLO S,
ESPINOZA B, SOUZA O, KHAN B AND SILVEIRA J.F. Serodiagnosis of chronic and acute Chagas
disease with Trypanosoma cruzi recombinant proteins: Results of a collaborative study in six Latin
American Countries. Journal of Clinical Microbiology, 42:449-452, 2004.
VAGO A.R, ANDRADE L.O, LEITE A.A, D'AVILA REIS D, MACEDO A.M, ADAD S.J, TOSTES S.
J.R, MOREIRA M.C, FILHO G.B, PENA S.D. Genetic characterization of Trypanosoma cruzi directly
from tissues of patients with chronic Chagas disease: differential distribution of genetic types into diverse
organs. Am J Pathol. May, 156(5):1805-9, 2000.
VALADARES H.M, PIMENTA J.R, DE FREITAS J.M, DUFFY T, BARTHOLOMEU D.C, OLIVEIRA
R.P, CHIARI E, MOREIRA M.C, FILHO G.B, SCHIJMAN A.G, FRANCO G.R, MACHADO C.R,
PENA S.D, MACEDO A.M. Genetic profiling of Trypanosoma cruzi directly in infected tissues using
nested PCR of polymorphic microsatellites. Int J Parasitol, 38(7):839-50, 2007.
VALADARES HM, PIMENTA JR, FREITAS JM, DUFFY T, BARTHOLOMEU DC, OLIVEIRA R.P,
et al. Genetic profiling of Trypanosoma cruzi directly in infected tissues using nested PCR of
polymorphic microsatellites. Int. J. Parasitol. 38: 839-850, 2008.
VALENTE S.A, VALENTE DA COSTA.V, PINTO D.N.A.Y, BARBOSA D.J.C.M, DOS SANTOS
M.P, MIRANDA C.O, CUERVO P, FERNANDES O. Analysis of an acute Chagas disease outbreak in
the Brazilian Amazon: human cases, triatomines, reservoir mammals and parasites. Trans R Soc Trop
Med Hyg, 103(3): 291-7, 2009.
VERANI J.R, SEITZ A, GILMAN R.H, LAFUENTE C, GALDOS-CARDENAS G, KAWAI V, DE
LAFUENTE E, FERRUFINO L, BOWMAN N.M, PINEDO-CANCINO V, LEVY M.Z, TODD C.W,
KIRCHHOFF L.V, CABRERA L, VERASTEGUI M, BERN C. Geographic variation in the sensitivity of
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
147
recombinant antigen-based rapid tests chronic Trypanosoma cruzi infection. Am. J. Trop. Med. Hyg,
80(3):410-415, 2009.
VEXENAT A.C, SANTNA J.M, TEIXEIRA A.R. Cross-reactivity of antibodies in human infections by
the kinetoplastid protozoa Trypanosomacruzi, Leishmania chagasi and Leishmania (viannia) braziliensis.
Revista Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 38(3): 177 – 185, 1996.
VIRREIRA M, SERRANO G, MALDONADO L, SVOBODA M. Trypanosoma cruzi: typing of
genotype (sub)lineages in megacolon samples from bolivian patients. Acta Trop, 100(3):252-5, 2006.
VITELLI-AVELAR D, SATHLER-AVELAR R, WENDLING A.P.B, ROCHA R.D.R, TEIXEIRA-
CARVALHO A, MARTINS N.E, DIAS J.C.P, RASSI A, LUQUETTI A.O, ELÓI-SANTOS S,
MARTINS-FILHO A.O. Non-conventional flow cytometry approaches to detect anti-Trypanosoma cruzi
immunoglobulin G in the clinical laboratory. Journal of Immunological Methods, 318:102-112, 2007.
VITOR R.W, CHIARI E. Evaluation of Trypanosoma cruzi antigens for the indirect hemaglutination
reaction. . II. Antigens of different samplings and evolutive forms. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo,
29(3):183-188, 1987.
VOLLER A, DRAPER C, BIDWELL D.E, BARTLETT A.A. Microplate enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) for Chagas disease. Lancet, 305: 426 – 428, 1975.
WALLACE A, SANCHEZ G, VENEGAS J, SOLARI A. Lack of cross-reactivity of lytic antibodies with
bloodstream forms of Trypanosoma cruzi zymodemes generated in a mouse experimental model. Exp
Parasitol. 80(2): 176-85, 1995.
WESTENBERGER S.J, BARNABE C, CAMPBELL D.A, STURM N.R. Two hybridization events
define the population structure of Trypanosoma cruzi. Genetics, 171:527-43, 2005.
WHO -. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Tropical Disease Research, progress 1995-96, ed. WHO
Publications, Geneva, Switzerland, 1997.
WHO- WORLD HEALTH ORGANIZATION. Control of Chagas disease.WHO technical report series
905, World Health Organization, Geneva, 2002.
WHO -. WORLD HEALTH ORGANIZATION. First WHO report on neglected tropical diseases 2010:
working to overcome.the global impact of neglected tropical diseases.Genebra, 2010.
WHO- WORLD HEALTH ORGANIZATION. Chagas disease (American trypanosomiasis) Fact sheet
N°340, 2015.
YOSHIDA N. Molecular basis of mammalian cell invasion by Trypanosoma cruzi. Anais da Academia
Brasileira de Ciências, 78(1): 87-111, 2006.
ZINGALES B, ANDRADE S.G, BRIONES M.R.S, CAMPBELL D.A, CHIARI E, FERNANDES O,
GUHL F, LAGES-SILVA E, MACEDO A.M, MACHADO C.R, MILES M.A, ROMANHA A.J,
STURM N.R, TIBAYRENC M, SCHIJMAN A.G. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific
nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, 104(7):1051-1054, 2009.
ZINGALES, B., MILES M.A., CAMPBELL D.A., TIBAYRENC M., MACEDO A.M., TEIXEIRA,
M.M.G., SCHIJMAN A.G., LLEWELLYN, M.S., LAGES-SILVA, E., MACHADO, C.R., ANDRADE,
S.G., STURM N.R. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: Rationale,
epidemiological relevance and research applications. Infect. Gene t. Evolut, 12: 240-253, 2012.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
148
ZULANTAY I, VENEGAS J, APT W, SOLARI A, SANCHEZ G. Lytic antibodies in Trypanosoma
cruzi-infected persons with low parasitemia. Am J Trop Med Hyg. 58(6): 775-9, 1998.
ZULANTAY I, HONORES P, SOLARI A, APT W, ORTIZ S, OSUNA A, ROJAS A, LÓPES B,
SÁNCHES G. Use of polymerase chain reaction (PCR) and hibridization assays to detect Trypanosoma
cruzi in chronic chagasic patients treated with itraconazole or allopurinol. Diagnostic Microbiology and
Infectious Disease, 48: 253-257, 2004.
ANEXOS
149
11. ANEXO
RESEARCH ARTICLE
Performance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a for universal and genotype-specific
serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
Glaucia Diniz Alessio1, Fernanda Fortes de Araujo2, Denise Fonseca Cortes1, Policarpo
Ademar Sales Junior3, Daniela Cristina Lima2, Matheus de Souza Gomes4, Laurence
Rodrigues do Amaral4, Marcelo Antonio Pascoal Xavier5, Andrea Teixeira-Carvalho2,
Olindo Assis Martins-Filho2*, Marta de Lana1
1 Laboratorio de Doenca de Chagas, Nucleo de Pesquisas em Ciências Biologicas (NUPEB), Instituto de
Ciências Exatas e Biologicas (ICEB), Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Ouro Preto, Minas
Gerais, Brazil, 2 Grupo Integrado de Pesquisas em Biomarcadores, Centro de Pesquisas Rene Rachou
(CPqRR-FIOCRUZ/ MG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 3 Grupo de Genomica Funcional e
Proteomica de Leishmania spp e Trypanosoma cruzi, Centro de Pesquisas Rene Rachou (CPqRR-
FIOCRUZ/ MG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 4 Laboratorio de Bioinformatica e Analises
Moleculares, Universidade Federal de Uberlandia, INGEB/FACOM, Campus Patos de Minas, Patos de
Minas, Minas Gerais, Brazil, 5 Grupo de Pesquisas Clınicas e Polıticas Publicas em Doencas Infecciosas e
Parasitarias, Centro de Pesquisas Rene Rachou (CPqRR-FIOCRUZ/ MG), Belo Horizonte, Minas Gerais,
Brazil
Abstract
Distinct Trypanosoma cruzi genotypes have been considered relevant for patient manage-
ment and therapeutic response of Chagas disease. However, typing strategies for geno-
type-specific serodiagnosis of Chagas disease are still unavailable and requires
standardization for practical application. In this study, an innovative TcI/TcVI/TcII Chagas
Flow ATE-IgG2a technique was developed with applicability for universal and genotype-
specific diagnosis of T. cruzi infection. For this purpose, the reactivity of serum samples
(percentage of positive fluorescent parasites-PPFP) obtained from mice chronically infected
with TcI/Colombiana, TcVI/CL or TcII/Y strain as well as non-infected controls were deter-
mined using amastigote-AMA, trypomastigote-TRYPO and epimastigote-EPI in parallel
batches of TcI, TcVI and TcII target antigens. Data demonstrated that “α-TcII-TRYPO/
1:500, cut-off/PPFP = 20%” presented an excellent performance for universal diagnosis of
T. cruzi infection (AUC = 1.0, Se and Sp = 100%). The combined set of attributes “α-TcI-
TRYPO/1:4,000, cut-off/PPFP = 50%”, “α-TcII-AMA/1:1,000, cut-off/PPFP = 40%” and “α-
TcVI-EPI/1:1,000, cut-off/PPFP = 45%” showed good performance to segregate infections
with TcI/Colombiana, TcVI/CL or TcII/Y strain. Overall, hosts infected with TcI/Colombiana
and TcII/Y strains displayed opposite patterns of reactivity with “α-TcI TRYPO” and “α-TcII
AMA”. Hosts infected with TcVI/CL strain showed a typical interweaved distribution pattern.
The method presented a good performance for genotype-specific diagnosis, with global
accuracy of 69% when the population/prototype scenario include TcI, TcVI and TcII infec-
tions and 94% when comprise only TcI and TcII infections. This study also proposes a
receiver operating reactivity panel, providing a feasible tool to classify serum samples from
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 1 / 24
a1111111111
a1111111111
a1111111111
a1111111111
a1111111111
OPENACCESS
Citation: Alessio GD, de Araujo FF, Cortes DF,
Sales Junior PA, Lima DC, Gomes MdS, et al.
(2017) Performance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a for universal and genotype-specific
serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection.
PLoS Negl Trop Dis 11(3): e0005444. https://doi.
org/10.1371/journal.pntd.0005444
Editor: Carlos A. Buscaglia, Instituto de
Investigaciones Biotecnologicas, ARGENTINA
Received: December 6, 2016
Accepted: March 1, 2017
Published: March 23, 2017
Copyright: © 2017 Alessio et al. This is an open
access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution License, which
permits unrestricted use, distribution, and
reproduction in any medium, provided the original
author and source are credited.
Data Availability Statement: All relevant data are
within the paper and its Supporting Information
files.
Funding: This work was supported by European
Community’s Seventh Framework Program No.
602773- Project KINDRED). Fundacão de Amparo
à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientıfico e
Tecnologico (CNPq), Ciências sem Fronteiras
(CAPES), Centro de Pesquisas Rene Rachou—
hosts infected with distinct T. cruzi genotypes, supporting the potential of this method for
universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection.
Author summary
Chagas disease remains a significant public health issue infecting 6–7 million people
worldwide. The factors influencing the clinical heterogeneity of Chagas disease have not
been elucidated, although it has been suggested that different clinical outcome may be
associated with the genetic diversity of T. cruzi isolates. Moreover, differences in therapeu-
tic response of distinct T. cruzi genotypes have been also reported. Typing strategies for
genotype-specific diagnosis of Chagas disease to identify the T. cruzi discrete typing units
(DTU) have already been developed, including biochemical and molecular methods, how-
ever the techniques have limitations. The majority of these methods can not directly be
performed in biological and clinical samples. In addition, it has been proposed that para-
site isolates from blood may not necessarily represent the full set of strains current in the
individual as some strains can be confined to tissues. The improvement of genotype-spe-
cific serology to identify the T. cruzi DTU(s) present in a given host may provide a useful
tool for clinical studies. In the present investigation, we developed an innovative TcI/
TcVI/TcII Chagas Flow ATE-IgG2a technique with applicability for universal and geno-
type-specific diagnosis of T. cruzi infection that may contribute to add future insights for
genotype-specific diagnosis of Chagas disease.
Introduction
Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease [1] infects 6–7 million people
worldwide, mainly in Latin America causing serious consequences for public health and
national economies [2]. Geographical variations in the prevalence of clinical forms and mor-
bidity of Chagas disease in different countries have been recorded [3]. Although the factors
underlying the clinical heterogeneity of Chagas disease are still not completely understood, it
has been suggested that different clinical outcome may be associated with the genetic diversity
of T. cruzi isolates observed in the Americas [4]. Moreover, differences in therapeutic response
of distinct T. cruzi genotypes have been also reported previously in mice infection [5–8].
Typing strategies for genotype-specific diagnosis of Chagas disease to identify the six T.
cruzi discrete typing units (DTU), named TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV and TcVI [9] have
already been developed, including biochemical and molecular methods [4]. However, none
of these methods allows a full resolution when used individually and a combinatory three-
marker sequential typing strategy is usually required to confirm the T. cruzi genotype [10–12].
Straightforward, genotyping methods to identify the T. cruzi DTUs are currently available, but
research is still required to optimize sensitivity and simplify methods so that they can be easily
applied in clinical laboratories. In fact, molecular methods require a measurable parasite load
to directly identify T. cruzi DTUs in samples. Because of this, the approaches used for T. cruzigenotyping requires parasite isolation by hemoculture/xenoculture followed by in vitro growth
that may lead to clonal selection [13–16].
A feasible solution to overcome these problems is the design and development of genotype-
specific serology to provide a current/historical profile of T. cruzi DTUs infecting an individual
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 2 / 24
Fundacão Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) and
Universidade Federal de Ouro Preto. DCL received
fellowship from CNPq/PIBITI program. DFC
received a post-doc fellowship from FAPEMIG PDJ
program. GDA received PhD research fellowship
form CAPES. OAMF, ATC and MdL received
financial support from CNPq PQ Fellowship
program. FFdA received financial support from
CAPES BJT Fellowship program. The authors thank
the program for technological development in tools
for health- PDTIS-FIOCRUZ for the use of its
facilities. The funders had no role in study design,
data collection and analysis, decision to publish, or
preparation of the manuscript.
Competing interests: The authors have declared
that no competing interests exist.
patient [17–20]. Moreover, genotypic-specific serodiagnosis has the potential to predict thera-
peutic response and provide insights upon re-activation episodes.
Recently, a flow cytometry-based assay, named Chagas-Flow ATE (Amastigote, Trypomas-
tigote and Epimastigote), has been developed for simultaneous measurement of anti-amasti-
gote, anti-trypomastigote and anti-epimastigote antibodies displaying high performance for
the diagnosis and post-therapeutic monitoring of Chagas disease [21]. Aiming at optimizing
the Chagas-Flow ATE for universal and genotypic-specific diagnosis of T. cruzi infection, the
present study proposed the development of modified Chagas-Flow ATE, using parallel batches
of distinct T. cruzi genotypes as target antigens. Standard T. cruzi strains, representative of
three major genotypes (TcI, TcII and TcVI) were used to setup the Chagas-Flow ATE-IgG2a
methodology.
High-dimensional data handling were applied to select the sets attributes (“target-antigen/
serum dilution/cut-off”) applicable for universal and genotypic-specific diagnosis of T. cruzi-infection. A receiver operating reactivity panel was proposed as a feasible tool to identify hosts
infected with distinct T. cruzi genotypes. The results demonstrated the high-quality perfor-
mance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for universal and genotype-specific diagno-
sis of T. cruzi infection.
Methods
Ethics statement
All animals included in this study were maintained at the Animal Science Center of the Uni-
versidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brazil, in strict accordance with the Brazil-
ian College of Animal Experimentation Guidelines for ethical conduct in use of animals in
research. Efforts were performed to reduce animal suffering. The study protocols were
approved by the Ethics Committee on Animal Experimentation of the Federal University of
Ouro Preto (Protocol approval numbers #2013/48 from December, 6th, 2013 for the experi-
mental infection and collected blood by ocular plexus puncture in mice).
Trypanosoma cruzi strains
Standard T. cruzi strains, representative of three major genotypes [9], involved in the domes-
tic cycle of Chagas disease in Brazil, were used to setup the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a methodology for the serodiagnosis of T. cruzi infection. The Colombiana, acro-
nyms “COL” (TcI) [22], CL (TcVI) [23] and Y (TcII) T. cruzi strains were used in this study
[24]. All isolates were obtained from the T. cruzi cryobank at Grupo de Genomica Funcional
e Proteomica de Leishmania spp e Trypanosoma cruzi, Centro de Pesquisas Rene Rachou
(CPqRR-FIOCRUZ/ MG). The T. cruzi strains were maintained by consecutive in vivopassages in Swiss female mice. Blood samples obtained from infected mice were used for
experimental infection as well as for preparation of target antigens (amastigote-AMA,
trypomastigote-TRYPO and epimastigote-EPI) used on each TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a platform.
Experimental infection with TcI, TcVI and TcII T. cruzi genotypes
Female Swiss mice (n = 118, 28–30 days old), obtained from the Animal Science Centre at the
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), MG, Brazil, were maintained in temperature-
controlled room with access to water and food ad libitum. Animals were subdivided into four
groups referred as T. cruzi-infected TcI/Colombiana/COL strain (n = 36), TcVI/CL strain
(n = 36) or TcII/Y strain (n = 36) as well as non-infected mice (NI, n = 10).
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 3 / 24
The infection was confirmed in all T. cruzi-infected mice, by positivity at fresh blood exami-
nation performed at day 7, 10 or 15 post-infection. The serum samples used for the TcI/TcVI/
TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a serology were prepared from whole blood samples collected
by ocular plexus puncture. Samples were collected from non-infected controls and T. cruzi-infected mice (day 90 and day180 post-infection) were inactivated at 56˚C for 30 min and
stored at -20˚C until use. Considering the animal mortality during the experimental timeline,
the final number of animals/group were (TcI/Colombiana strain, n = 29, TcVI/CL strain,
n = 29, TcII/Y strain, n = 35 and NI, n = 10).
Preparation of AMA, TRYPO, EPI (ATE) target antigens from TcI, TcVI
and TcII T. cruzi genotypes
The amastigote/trypomastigote/epimastigote forms of TcI, TcVI and TcII T. cruzi genotypes
were obtained as described previously by Alessio et al. (2014) [21]. Enriched trypomastigotes
(TRYPO) and amastigote (AMA) preparations were obtained from desynchronized in vitro tis-
sue cultures (L929 cell-line) harvested at day 4–6 and 8–15 post-inoculation, respectively. Epi-
mastigote forms were obtained at log-phase growth of axenic culture in liver infusion tryptose
medium [25]. Live amastigotes and trypomastigotes as well as fixed epimastigotes forms were
stained with fluorescein isothiocyanate (FITC) as described by Alessio et al. (2014) [21].
Briefly, AMA/TRYPO mix and EPI suspensions (1x107 parasites/mL) were stained with FITC
(100μg/mL for TcI/Colombiana strain and 200μg/mL for TcVI/CL strain and TcII/Y strain)
for 30 min at 37˚C. After staining, AMA/TRYPO mix were kept at 37˚C for 60min and EPI
preparation stored at 4˚C for 24h prior to use. The three FITC-labeled parasite preparations
were mixed accordingly to obtain an equivalent proportion of AMA (33%), TRYPO (33%) and
EPI (33%) in the final ATE-parasite Mix Platforms, monitored by flow cytometry checking
performed prior use. The FITC-labeling approach led to a differential staining phenomenon
previously described by Alessio et al., (2014) [21] that allowed the segregation of AMA,
TRYPO and EPI organisms in distinct clusters, based on the FITC (Fluorescence 1- FL1) vsForward Scatter (FSC) dot plot distribution (Fig 1).
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a serodiagnosis of T. cruzi
infection
An outline of the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied to the serodiagnosis of T.
cruzi infection is provided in the Fig 1. The method comprises two steps referred as: i) Experi-
mental Procedure (Fig 1A) and ii) Analysis of genotype-specific anti-T. cruzi IgG2a reactivity
(Fig 1B).
Experimental procedure. The TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a serodiagnosis was
performed as described previously by Alessio et al. (2014) [21] modified as follows: frozen
serum samples were thawed from -20˚C storage, filtered through 0.22μm syringe filter and
submitted to serial dilution (1:500 to 1:64,000) with phosphate-buffered-saline supplemented
with 10% fetal bovine serum (PBS-10%FBS) in a U-bottom 96-well plate. A final volume of
50μL of pre-diluted serum samples were incubated with 50μL of each ATE-parasite Mix prepa-
ration (TcI, TcVI and TcII genotype-specific platforms, in parallel batches) for 30 min at 37˚C
in a 5% CO2 humidified incubator. Following incubation, parasites were washed twice with
PBS-10%FBS and the supernatant discarded. The pellet of parasite mix was re-suspended and
incubated with 50μL biotin-conjugated anti-mouse IgG2a that is equivalent of human IgG1
(1:3,000 in PBS-10%FBS) plus 20μL of secondary reagents (phycoerytrin-conjugated streptavi-
din-SAPE, 1:800 in PBS-10%FBS) for 30 min at 37˚C in a 5% CO2 humidified incubator. Para-
sites were washed once with PBS-10%FBS and fixed with 200μL of FACS fixing solution
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 4 / 24
Fig 1. Outline of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi
infection. (A) The experimental procedure display a schematic representation of genotype-specific T. cruzi ATE-
parasite Mix Platforms using TcI (Colombiana strain) = black bar, TcVI (CL strain) = light gray bar and TcII (Y
strain) = dark gray bar antigens in separate batches. (B) Representative gating strategies used to select the
target antigens (amastigote-AMA, trypomastigote-TRYPO and epimastigote-EPI) on each Chagas-Flow
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 5 / 24
(10g/L of paraformaldehyde, 10.2g/L of sodium cacodylate and 6.65g/L of sodium chloride,
pH 7.2), and store at 4˚C until flow cytometric data acquisition in a FACSCan flow cytometer
(Beckton Dickinson, USA). An internal control (“second step reagents control” = anti-mouse
IgG2a-biotin+SAPE) to monitor unspecific bindings was included in all experimental batches,
in which the ATE-parasite Mix preparations were incubated in the absence of mouse serum
but in the presence of secondary reagents. A total of 10,000 events were acquired for each
tested serum dilution. Acquisition was performed with appropriate instrument settings on log
scale (FSC = E00, Side Scatter -SSC = 427, threshold = 400; FL1 = 620 and FL2 = 500). Data
were stored for off-line analysis.
Analysis of genotype-specific anti-T. cruzi IgG2a reactivity. The FlowJo software ver-
sion 10.1 (TreeStar, San Diego, CA, USA) was used for off-line data analysis. The genotype-
specific reactivity of anti-T. cruzi IgG2a was performed for each ATE-parasite mix platform—
TcI (Colombiana strain), TcVI (CL strain) and TcII (Y strain). Appropriate gating strategies
were used to select the target antigens (amastigote-AMA, trypomastigote-TRYPO and epimas-
tigote-EPI) on each Chagas-Flow ATE-IgG2a platform, based on the differential FITC-labeling
features of AMA, TRYPO and EPI. Following the selection of target-antigens, one-dimen-
sional histograms were employed to quantify the genotype-specific anti-T. cruzi IgG2a reactiv-
ity, based on the positivity limit (PPFP<2%), set based on the internal control. The results
were expressed as percentage of positive fluorescent parasites (PPFP) for each tested sample
dilution (Fig 1B).
Data mining and analysis
Data mining for universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection was first per-
formed by non-parametric Kruskal—Wallis test followed by Dunns’ multiple comparison
post-test to compare the overall reactivity profile of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-
IgG2a. Significant differences were considered at p� 0.05. The performance indices (global
accuracy defined by the area under the curve-AUC, sensitivity-Se and specificity-Sp) for the
pair of attributes (“target antigen/serum dilution”) selected for universal diagnosis purposes
were determined by the receiver operating characteristic (ROC) curve, scatter plot distribu-
tion and Two-Graph ROC curve (TG-ROC) analysis. Histogram plot distributions and non-
linear regression analysis was used for comparative analysis of pair of attributes (“target
antigen/serum dilution”) selected for genotypic-specific diagnosis purposes. The global
median was calculated for each pair of attributes (“target antigen/serum dilution”) to define
putative cut-off edges to segregate the reactivity amongst T. cruzi-infected hosts. Scatter plot
distribution was used for performance analysis of sets of selected attributes (“target-antigen/
serum dilution/cut-off”) applicable for genotypic-specific diagnosis of T. cruzi-infection.
The GraphPad Prism software, Version 5.0 (San Diego, CA, USA) was used for statistical
analysis and graphic arts.
Decision trees were built for the set of selected attributes (“target-antigen/serum dilution/
cut-off”) to create algorithms (root and branch attributes) to classify T. cruzi in distinct popu-
lation/prototype scenarios (TcI-infection/Colombiana vs TcVI/CL vs TcII/Y) and (TcI-infec-
tion/Colombiana vs TcII/Y). The WEKA software (Waikato Environment for Knowledge
Analysis, version 3.6.11, University of Waikato, New Zealand) was used for decision tree
construction.
ATE-IgG2a platform and the histograms employed to quantify the genotype-specific anti-T. cruzi IgG2a reactivity,
expressed by the percentage of positive fluorescent parasites (PPFP), based on the positivity limit (PPFP<2%),
set based on the internal control.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g001
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 6 / 24
Step-wise discriminant analysis was applied to determine the global accuracy and the leave-
one-out-cross-validation-LOOCV values. The R-project for statistical computing software,
Version 3.0.1 was used for discriminant analysis. The algorithm C4.5 was used to build the
decision tree using an implementation named J48. This method analyzed all characteristics to
select a minimum set of markers that could efficiently separate study groups.
Results
Overall reactivity profile of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for
universal and genotypic-specific diagnosis of T. cruzi infection
The overall profiles of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a reactivity observed for T. cruziinfected mice (TcI/Colombiana strain, TcVI/CL strain and TcII/Y strain) and non-infected
controls are presented in the Fig 2. The reactivity of individual samples were assessed for dis-
tinct target-antigen (amastigote-AMA, trypomastigote-TRYPO and epimastigote-EPI) from
T. cruzi genotype I—Colombiana strain (Fig 2—left panels), genotype VI—CL strain (Fig 2—
middle panels) and genotype II—Y strain (Fig 2—right panels) along the titration curves
(serum dilutions ranging from 1:500 to 1:64,000).
Comparative analysis allowed the selection of pair of attributes (“target antigen/serum dilu-
tion”) with the most promising perspective to be used for universal and genotypic-specific
diagnosis of T. cruzi infection.
The pair of attributes “anti-TcII TRYPO reactivity at 1:500” presented the highest signifi-
cant difference between non-infected mice and all T. cruzi-infected hosts (TcI/Colombiana,
TcVI/CL and TcII/Y strains), and therefore was further evaluated for universal diagnosis pur-
pose (Fig 2—light gray continuous rectangle).
The pairs of attributes with putative applicability to genotype-specific diagnosis of T. cruziinfection comprise: (“anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000”; “anti-TcI TRYPO reactivity at
1:4,000” and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000”). The pair of attributes “anti-TcII AMA
reactivity at 1:1,000” presented the highest ability to distinguish the lower reactivity of hosts
infected with TcI/Colombiana strain from the higher reactivity observed for hosts infected
with TcVI/CL or TcII/Y strains (Fig 2—right dark gray dotted frame). The pair of attributes
“anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” presented the highest ability to discriminate lower reac-
tivity of hosts infected with TcII/Y strain from the intermediate reactivity observed for hosts
infected with TcVI/CL strain and the higher reactivity observed for hosts infected with TcI/
Colombiana strain (Fig 2—left dark gray dotted frame). The pair of attributes “anti-TcVI EPI
reactivity at 1:1,000” presented the most relevant potential to distinguish the lower reactivity
of hosts infected with TcII/Y strain from the higher reactivity observed for hosts infected
with TcI/Colombiana or TcVI/CL T. cruzi strains (Fig 2—middle dark gray dotted frame).
Together, these pairs of attributes were selected for further performance assessment applicable
to the genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection.
Performance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for universal
diagnosis of T. cruzi infection
The performance of the pre-selected pair of attributes “anti-TcII TRYPO reactivity at 1:500”
applied to the universal diagnosis of T. cruzi infection is present in the Fig 3.
Comparative analysis demonstrated that the median value of “anti-TcII TRYPO reactivity
at 1:500” differ significantly between non-infected mice and all T. cruzi-infected hosts (TcI/
Colombiana, TcVI/CL and TcII/Y strains) (Fig 3A).
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 7 / 24
ROC curve analysis indicated the PPFP value of 20% as the cut-off edge with excellent per-
formance indices (area under the curve-AUC = 1.0 along with Sensitivity-Se and Specificity-
Sp of 100%) (Fig 3B). Scatter plot distribution of individual values illustrates the ability of this
set of attributes to completely segregate the serum samples of the NI and T. cruzi-infected
hosts (Fig 3C). Additional analysis by TG-ROC confirmed the selected PPFP value of 20% as
the best cut-off for universal diagnosis of T. cruzi infection using the selected set of attributes
(Fig 3D).
Fig 2. Overall reactivity profile of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for universal and genotypic-specific diagnosis of T. cruzi infection. The
Chagas-Flow ATE-IgG2a reactivity was determined for sera samples from T. cruzi-infected mice, including TcI/TcVI/TcII genotype-representative strains,
including: TcI/Colombiana strain (black dotted frame, n = 29), TcVI/CL strain (light gray dotted frame, n = 29) and TcII/Y strain (dark gray dotted frame, n = 35)
as well as non-infected mice (white dotted frame, n = 10). Genotype-specific IgG2a reactivity to each target-antigen (amastigote-AMA, trypomastigote-
TRYPO and epimastigote-EPI) from T. cruzi genotype I (left panels), genotype VI (middle panels) and genotype II (right panels) was assessed at eight serum
dilutions (1:500 to 1:64,000). The results are expressed as the percentage of positive fluorescent parasites (PPFP), using the box plot format, stretching from
min to max values with outliers represented by gray-shaded dots and the box defining the 25th and 75th percentile and the median value (line across the box).
Comparative analyses were performed by the Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post test for multi-group comparisons. Significant differences were
considered at p<0.05. The light gray continuous rectangle selects the pair of attributes (“target antigen/serum dilution”) with the most consistent ability to
discriminate non-infected mice from all T. cruzi-infected hosts (Colombiana, CL and Y strains). Therefore, these features (anti-TcII TRYPO reactivity at 1:500)
were selected for universal diagnosis of T. cruzi infection. The dark gray dotted frame select the pair of attributes “target antigen/serum dilution” with the most
promising perspective to distinguish the reactivity of sera samples amongst host infected with Colombiana, CL or Y T. cruzi strains. Therefore, these features
(anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000; anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000 and anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000) were selected for genotype-specific
diagnosis of T. cruzi infection.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g002
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 8 / 24
Fig 3. Performance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for universal diagnosis of T. cruzi infection. (A) The anti-TcII TRYPO reactivity at 1:500,
pre-selected as attributes pairs for universal T. cruzi infection diagnosis, were compared by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post test for multi-group
comparisons and significant differences at *p <0.05, **p<0,001 and ***p<0,0001, highlighted by connecting lines. Data are expressed as median PPFP
values for non-infected mice (white bar) and T. cruzi-infected hosts (TcI/Colombiana strain = black bar, TcVI/CL strain = light gray bar and TcII/Y strain = dark
gray bar). The similarity amongst the anti-TcII TRYPO IgG2a reactivity at 1:500 observed for the three T. cruzi infected groups (Colombiana + CL + Y strains)
allows the establishment of a single group referred to as T. cruzi infected hosts (n = 93) and the performance of the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a in
the universal diagnosis of T. cruzi infection carried out as compared to a group of non-infected mice (NI, n = 10). (B) ROC-curve analysis was applied to define
the appropriated cut-off to discriminate the PPFP values from NI and T. cruzi-infected host (Colombiana + CL + Y strains). Additional performance indices
were also calculated and provided in the figure, including the area under the curve (AUC), defined as global accuracy, the sensitivity (Se) and the specificity
(Sp). (C) Representative scatter plot illustrates the ability of the selected set of attributes (“target-antigen/serum dilution/cut-off”) to discriminate the reactivity
of the sera from non-infected (NI) and T. cruzi-infected hosts (Colombiana+CL+Y). The dotted line represented the cut-off of PPFP = 20% defined by the
ROC-curve analysis. (D) TG-ROC analysis was also performed to confirm the cut-off selection at higher “Se” and “Sp”, highlighted by dark gray dotted frame.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g003
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 9 / 24
Overall reactivity of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied for
genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection
The overall reactivity profile of the pre-selected pairs of attributes (“anti-TcII AMA reactivity
at 1:1,000”; “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000”)
are shown in the Fig 4.
Data mining was carried out by histogram graph and trendlines drawn by non-linear
regression analysis. The results showed that the “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000” of serum
samples from hosts infected with TcI/Colombiana strain displayed a nearly unimodal distribu-
tion in the region of PPFP values = 10%, contrasting with the bimodal distribution of serum
samples from hosts infected with TcVI/CL and TcII/Y strains that shows a shift towards higher
PPFP values (Fig 4A).
The analysis of “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” revealed a clear polarization of
serum samples from hosts infected with TcI/Colombiana strain with a unimodal distribution
in the region of PPFP values around 100%, contrasting with a unimodal distribution in the
region of PPFP values around 0% observed for serum samples from hosts infected with TcII/Y
strain. Again, a typical bimodal distribution was noticed for serum samples from hosts infected
with TcVI/CL strain (Fig 4B).
The histogram distribution of “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000” revealed a clear Gauss-
ian unimodal distribution of serum samples from hosts infected with TcI/Colombiana and
TcVI/CL strains within the region of PPFP values around 50%. On the other hand, the unimo-
dal distribution observed for serum samples from hosts infected with TcII/Y strain showed a
clear shift towards PPFP values< 50% (Fig 4C).
Comparative analysis of median reactivity pattern of the selected pairs of attributes con-
firmed the trend observed by histogram and non-linear regression analysis, pointing out the
ability of “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000” to segregate hosts infected with TcII/Y strain
(and TcVI/CL strain) apart from those infected with TcI/Colombiana strain (Fig 4D). On the
other hand, the “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” was able to segregate hosts infected
with TcI/Colombiana strain (and TcVI/CL strain) apart from those infected with TcII/Y strain
(Fig 4E). Moreover, the “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000” was capable to discriminate the
hosts infected with TcVI/CL strain (and TcI/Colombiana strain) apart from those infected
with TcII/Y strain (Fig 4F).
Establishment of cut-off edges and performance of TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a for genotype-specific diagnosis of T. cruzi
infection
Aiming at making the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applicable to the genotypic-
specific diagnosis of T. cruzi infection, the overlaid trendlines for the overall reactivity (S1A
Fig) along with the global median PPFP value of each pair of pre-selected attributes (S1B Fig)
were employed to establish potential cut-off edges to categorize individual samples as they
present negative (<cut-off) or positive (>cut-off) reactivity.
Using this approach, specific cut-off edges were defined for each pre-selected pairs of attri-
butes (“anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000”; “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” and
“anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000”), comprising PPFP = 40%, PPFP = 50% and PPFP = 45%,
respectively (S1B Fig).
Diagrams were used to compile the reactivity patterns and calculate the proportion of nega-
tive and positive results for each selected set of attributes (“target-antigen/serum dilution/cut-
off”). Data analysis showed that the set of attributes “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, cut-
off = 40%” were able to show positive results in 74% of hosts infected with TcII/Y strain (and
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 10 / 24
Fig 4. Overall reactivity of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied for genotype-specific diagnosis of T. cruzi-
infection. (A) The anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, (B) the anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000 and (C) the anti-TcVI EPI reactivity
at 1:1,000, pre-selected as attributes for genotypic-specific diagnosis of T. cruzi-infection, were further evaluated by histogram plot
distributions and trendlines built by nonlinear regression. The results were expressed as the proportion of samples displaying a given
PPFP values amongst T. cruzi-infected hosts, including: TcI/Colombiana strain (red bar, n = 29), TcVI/CL strain (green bar, n = 29)
and TcII/Y strain (blue bar, n = 35). The reactivity amongst T. cruzi-infected groups was further compared for each pair of attributes,
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 11 / 24
55% of TcVI/CL strain) apart from 14% of those infected with TcI/Colombiana strain (S1C
Fig). Moreover, the set of attributes “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000, cut-off = 50%”
showed positive results in 83% of hosts infected with TcI/Colombiana strain (and 59% of
TcVI/CL strain) contrasting with 14% of those infected with TcII/Y strain (S1C Fig). Further-
more, the set of attributes “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000, cut-off = 45%” showed positive
results in 72% of hosts infected with TcI/Colombiana strain (and 55% of TcVI/CL strain) dis-
tinct from 27% of those infected with TcII/Y strain (S1C Fig).
Scatter plot distribution further illustrated the pre-selected sets of attributes segregated the
reactivity of hosts infected with distinct T. cruzi genotypes, emphasizing the performance of
“anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, cut-off = 40%” to discriminate the majority of the hosts
infected with TcI/Colombiana strain and the ability of “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000,
cut-off = 50%” and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000, cut-off = 45%” to discriminate the
majority of the hosts infected with TcII/Y strain. In general, considerable proportion of hosts
infected with the hybrid TcVI/CL strain presented positive results using the pre-selected set of
attributes (S1D Fig).
Performance of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for
genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection in two population/
prototype scenarios
The performance of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a was evaluated in two
population/prototypes (TcI/Colombiana vs TcVI/CL vs TcII/Y strains and TcI/Colombiana vsTcII/Y strains) selected to exemplify the distribution of human T. cruzi infection in distinct
geographical regions around the world. Data analysis was carried out using the sets of pre-
selected attributes (“anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, cutoff = 40%”; “anti-TcI TRYPO reac-
tivity at 1:4,000, cut-off = 50%” and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000, cut-off = 45%”), as
presented in the Fig 5.
Three-dimensional plots were built to obtain a panoramic snapshot provided by the com-
bined reactivity of the three sets of pre-selected attributes (Fig 5A and 5D). Data analysis was
carried out in two population/prototypes (TcI/Colombiana vs TcVI/CL vs TcII/Y strains, Fig
5A) and (TcI/Colombiana vs TcII/Y strains, Fig 5D).
The results obtained for the first population/prototype (TcI/Colombiana vs TcVI/CL vsTcII/Y strains) demonstrated clearly that sera samples from hosts infected with TcI/Colombi-
ana strain was confined in a region of high “anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000” (left lateral
axis) and low “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000” (vertical axis). In contrast, sera from hosts
infected with TcII/Y strain presented a shift towards lower “anti-TcI TRYPO reactivity at
1:4,000” (left lateral axis) and higher “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000” (vertical axis). A
slight translocation of samples from hosts infected with TcII/Y strain towards lower “anti-
TcVI EPI reactivity at 1:1,000” (right lateral axis) was also observed. A notable evidence was
that the sera samples from hosts infected with TcVI/CL strain displayed a typical interweaved
distribution pattern (Fig 5A).
The dichotomic reactivity pattern of the three sets of pre-selected attributes was more evi-
dent when data analysis was performed in the second population/prototype which included
only hosts infected with TcI/Colombiana vs TcII/Y strains (Fig 5D).
including: (D) anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, (E) the anti-TcI TRYPO reactivity at 1:4,000 and (F) the anti-TcVI EPI reactivity at
1:1,000. The results are expressed as median PPFP values in box plot format with the outliers underscored by gray-shaded dots.
Data analyses were carried out by Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post test for multi-group comparisons The significant differences
were indicated by asterisk at *p <0.05, **p<0,001 and ***p<0,0001 and highlighted by connecting lines.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g004
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 12 / 24
Fig 5. Performance of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for genotype-specific diagnosis of T. cruzi
infection in two population/prototype scenarios. 3D plots were employed to identify clusters of TcI/TcVI/TcII Chagas-
Flow ATE-IgG2a reactivity amongst sera samples from T. cruzi-infected mice in two population/prototypes including (A) TcI/
Colombiana (red circle, n = 29) vs TcVI/CL (green circle, n = 29) vs TcII/Y (blue circle, n = 35) or (D) TcI/Colombiana (red
circle, n = 29) vs TcII/Y(blue circle, n = 35), using the three selected pair of attributes (“target-antigen/serum dilution”). Data
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 13 / 24
Decision tree analyses were built for the two population/prototypes (Fig 5B and 5E). The
algorithm proposed for the first population/prototype indicated the “anti-TcI TRYPO reactiv-
ity at 1:4,000, cut-off = 50%” as the root attribute, followed by “anti-TcII AMA reactivity at
1:1,000, cut-off = 40%” as the first branch and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000, cut-
off = 45%” as the second branch to classify sera samples from hosts infected with TcI/Colombi-
ana vs TcVI/CL vs TcII/Y strains with a moderate global accuracy (68.8%, LOOCV = 58.0%)
(Fig 5B). Data obtained for the second population/prototype indicated that the same decision
tree algorithm presented high global accuracy (93.8%, LOOCV = 87.5%) (Fig 5E).
Bar charts were constructed to illustrate the categorical classification proposed by the deci-
sion trees, demonstrating the number of animals that ranked within each branch amongst the
T. cruzi-infected hosts for the first population/prototype (TcI/Colombiana vs TcVI/CL vs TcII/
Y strains, Fig 5C) and the second population/prototype (TcI/Colombiana vs TcII/Y strains, Fig
5F). Data demonstrated that the algorithm applied to the first population/prototype was not
able to clusterize the serum samples from hosts infected with the TcVI/CL strain that display
a spread ranking within branches (Fig 5C). On the other hand, the algorithm applied to the
second population prototype yielded lower classification error with only four samples mis-
placed within branches (one sample from TcI/Colombiana strain and three from TcII/Y
strain) (Fig 5F).
Discriminant analysis of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for genotype-
specific diagnosis of T. cruzi infection groups performed for the two population/prototypes are
provided in the S2 Fig. Data analysis demonstrate that for the first population/prototype, the
combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a categorize 82.8% of serum samples from
hosts infected with TcI/Colombiana strain apart from 82.9% of those infected with TcII/Y
strain. However, only 38% of serum samples from hosts infected with TcVI/CL strain were
clusterized in a particular branch (S2A Fig). If we consider the scenario represented by the sec-
ond population/prototype, the data showed that 96.6% of serum samples from samples TcI/
Colombiana strain were correctly classified apart from 91.4% of those infected with TcII/Y
strain (S2B Fig).
Criteria to define universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi
infection by TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a in two population/
prototype scenarios
Reactivity boards were constructed using the pre-selected set attributes, including “anti-TcII
TRYPO reactivity at 1:500, cut-off = 20%” for universal diagnosis purpose and “anti-TcI
TRYPO reactivity at 1:4,000, cut-off = 50%”, “anti-TcII AMA reactivity at 1:1,000, cut-
off = 40%” and “anti-TcVI EPI reactivity at 1:1,000, cut-off = 45%” for genotype-specific diag-
nosis (Fig 6). The reactivity at selected serum dilutions (Fig 6—dashed frames) were used to
further create a receiver operating reactivity panel, applicable for universal diagnosis (NI
vs T. cruzi-infected hosts, Fig 6B) and for genotype-specific diagnosis applied to the first
are expressed as Log of PPFP values for anti-TcI TRYPO at 1:4,000 (left lateral axis), anti-TcII AMA at 1:1,000 (vertical axis)
and anti-TcVI EPI at 1:1,000 (right lateral axis). Decision trees were constructed using the set of attributes (“target-antigen/
serum dilution/cut-off”) to create algorithms (root and branch attributes) to classify T. cruzi infected mice in a population/
prototype including (B) TcI/Colombiana (red rectangle) vs TcVI/CL (green rectangle) vs TcII/Y (blue rectangle) or including
(E) TcI/Colombiana (red rectangle) vs TcII/Y(blue rectangle). Global accuracy and leave-one-out-cross-validation-LOOCV
are provided in the Figure. Bar charts representing the performance of the decision trees demonstrate the number of animals
that ranked within each branch amongst the T. cruzi-infected hosts for (C) (TcI/Colombiana = red bar vs TcVI/CL = green bar
vs TcII/Y = blue bar) and (F) (TcI/Colombiana = red bar vs TcII/Y = blue bar).
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g005
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 14 / 24
Fig 6. Criteria to define universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection by TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a in two population/prototype scenarios. (A) Reactivity boards were built to provide a panoramic snapshot of TcI/
TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied to the universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection. Data mining
approaches were used to pre-select the target-antigens and specific cut-off edges to define positive results for universal
diagnosis purpose (TcII TRYPO, PPFP>20%) and genotype-specific diagnosis criteria (TcI TRYPO, PPFP>50%; TcII AMA,
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 15 / 24
population/prototype (TcI/Colombiana vs TcVI/CL vs TcII/Y strains, Fig 6B) and the second
population/prototype (TcI/Colombiana vs TcII/Y strains, Fig 6C).
When using the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied for the universal diagnosis
purpose, the attribute α-TII 500 (>20%) presenting a positive score (+) define the presence of
T. cruzi infection, while a negative score (-) ruled out the presence of T. cruzi infection.
The reactivity panel for TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a applied for the genotype-
specific diagnosis regardless the population/prototype scenario indicated scores sequences of
α-TI (trypomastigote TcI) 4,000(>50%)/α-AII (amastigote TcII) 1,000(>40%)/α-EVI (epi-
mastigote TcVI) 1,000(>45%) to define the T. cruzi infection with distinct genotypes defined
as: (+/-/not applicable (na) or -/-/+) for TcI/Colombiana and (-/+/na or -/-/-) for TcII/Y strain
infection. The extensions of the score (+/+) do not allow the proper identification the T. cruziinfection genotype, since in can belongs to hosts infected with TcI/Colombiana (+/+/+), TcVI/
CL (+/+/na) or even TcII/Y strain (+/+/-) (Fig 6B and 6C).
Together, the proposed receiver operating reactivity panels for TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2a provided a feasible tool to classify the serum samples as they belong to the true
respective groups, supporting the potential of this method for universal and genotype-specific
diagnosis of T. cruzi infection.
Discussion
The broad genetic variability of T. cruzi has been related to biological characteristics (infectiv-
ity, parasitemia, tissue tropism, mortality during the acute phase of infection [13,26–30] and
susceptibility/resistance to drugs [5,8,31–34] in murine model and infectivity, replication and
differentiation in vector o) [35], epidemiological characteristics [4,36,37] and clinical manifes-
tations [38–40] of Chagas disease. Therefore, the knowledge of parasite genetics may offer
insights about the biology of the parasite, patient’s treatment outcome, clinical aspects of
human disease, as well as how to establish epidemiological surveillance and control of Chagas
disease [41, 42]. So, the genetic diversity of T. cruzi infection may also influence the sensitivity
of the techniques used for Chagas disease diagnosis [43–45].
The currently available methods for genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection, most
based on molecular biology approaches present distinct levels of complexity and in general dis-
play high specificity but moderate sensitivity [4, 10–12, 46–52]. Moreover, a combination of
several genetic markers is necessary to detect and distinguish the T. cruzi genotypes [10–12].
Furthermore, the majority of these methods can not directly be performed in biological and
clinical samples, requiring previous parasite isolation by hemoculture/xenoculture followed by
in vitro growth and maintenance that may lead to clonal selection [14,53–55]. Besides, it is
known that the parasitemia in patients and reservoirs of T. cruzi are variable and that the suc-
cess of parasite isolation is dependent on the host parasitemia. The full extent of lineage distri-
bution in nature using genetic markers it is not known due to the low levels of circulating
parasitemia and possible lineage-specific tissue sequestration [34,56–58]. In addition, it has
PPFP>40% and TcVI EPI, PPFP>45%) based on the differential positive reactivity of sera samples (TcI/Colombiana
strain = black rectangle, TcVI/CL strain = light gray rectangle and TcII/Y strain = dark gray rectangle) from negative reactivity
(white rectangle) observed for T. cruzi infected hosts and non-infected mice. The pre-selected sera dilutions defined by decision
tree analysis are underscored by dotted rectangles and include TcII TRYPO PPFP>20% at 1:500 for universal diagnosis and the
set of attributes (TcI-TRYPO/PPFP>50%/4,000 followed by TcII-AMA/PPFP>40%/1,000 and TcVI-EPI/PPFP>45%/1,000) for
genotype-specific diagnosis criteria. Reactivity panels were constructed to define the diagnosis conclusion when applying TcI/
TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for (B) universal diagnosis of T. cruzi infection and genotype-specific diagnosis in a
population/prototype including TcI/Colombiana strain (COL), TcVI/CL strain (CL) or TcII/Y (Y) strain or (C) including TcI/
Colombiana strain (COL) or TcII/Y strain (Y).
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444.g006
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 16 / 24
been proposed that parasite isolates from blood may not necessarily represent the full set of
strains current in the individual, hence some strains of T. cruzi can be confined to tissues
[11,13,16,15]. In general, PCR (polymerase chain reaction) based genotyping has limitations
that hamper the analysis of large numbers of samples. Therefore, the development of methods
for diagnosis and serotyping of Chagas disease are urgently required.
Attempting to address this matter, Mendes et al. (2013) [18] have described a set of B-cell
epitopes able to discriminate TcI and TcII infections, demonstrating the potential of these tar-
gets for Chagas disease serotyping. Later on, the putative TcI epitope reported by Mendes et al.(2013) [18] was found to be conserved across all T. cruzi lineages by studies developed by
Bhattacharyya et al. (2014) [19]. Moreover, samples from animals infected with TcVI pre-
sented cross-reactivity with a range of T. cruzi-derived peptides, suggesting the need of
improved antigen search and the development of a robust panel of strain-specific epitopes to
achieve a method applicable in large epidemiological studies [18].
Aiming at developing innovative serological approaches for universal and improved geno-
typic-specific diagnosis of T. cruzi experimental infection, our goal was optimize the Chagas-
Flow ATE methodology, proposed originally by Alessio et al. (2014) [21]. The present
approach is based on parallel batches of distinct T. cruzi genotypes as target antigens, employ-
ing parasites strains of three more important genotypes associated with human infection and
Chagas disease (TcI, TcVI and TcII) [4,38,59] although others genotypes exist such as TcIII
[60–62], TcIV recently described as associated to oral transmission [63, 64] and TcV associated
to the classical clinical forms of Chagas disease (cardiac and digestive) [39].
Previous studies have demonstrated that patients from distinct geographic areas, infected
with different genotypes of T. cruzi seem to display differential serological pattern upon sero-
diagnosis of Chagas disease, when employing distinct methodological approaches and differ-
ent T. cruzi target antigens [4,43,44,65]. Verani et al. (2009) [44] have demonstrated that the
performance of two serological tests, using serum samples from distinct geographical regions
(Bolivia and Peru) displayed distinct sensitivity, ranging from 26.6%-87.5%, corroborating the
hypothesis that intrinsic features of regional parasite strains may influence the serological
tests. Studies using six recombinant antigens of T. cruzi tested in samples from Argentina, Bra-
zil, Chile, Colombia, El Salvador, Guatemala, Honduras and Venezuela also reported discrep-
ancy in the serological reactivity ranging from 79% to 100% [43].
In this study, we have intended to evaluate the performance of combined TcI/TcVI/TcII
Chagas-Flow ATE-IgG2a for universal diagnosis of T. cruzi infection, simulating two popula-
tion prototypes that may represent the geographic distribution of T. cruzi infection in the
Latin America. The first population prototype, represent regions were TcI, TcVI and TcII
genotypes are co-endemic. In the second population setting, we intended to evaluate the per-
formance of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a to discriminate the infections
with TcI/Colombiana vs TcII/Y strains. Our findings demonstrated that regardless the popula-
tion prototype, the TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a presented an outstanding perfor-
mance for universal diagnosis of T. cruzi infection using the set of attributes “anti-TcII
TRYPO reactivity at 1:500, cut-off = 20%” (Fig 3). In fact, although the sensitivity of TcI/TcVI/
TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a varies according to the target antigen employed, the TcII
TRYPO antigen was able to detect seroreactivity in all mice infected with distinct T. cruzigenotypes (Figs 2 and 3). Corroborating with our study, Bhattacharyya et al. (2014) [19] also
observed that all sera from patients with chronic Chagas disease recognized the T. cruzi TcII
lysate antigen preparation.
Previous studies have also demonstrated the influence of parasite genotype on the pattern
of antibody response in experimental models [66]. It has been described that the profile of lytic
antibodies varies when distinct T. cruzi strains are used as targets, suggesting that genotypic-
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 17 / 24
specific antigenic features may be involved in the induction of lytic antibodies [67–69]. More-
over, Di Noia et al. (2002) [70] have reported that two T. cruzi antigens, named small surface
antigen of trypomastigotes (TSSAI and TSSAII) presented the ability of genotypic-specific rec-
ognition of T. cruzi infection. These studies were expanded by Bhattacharyya et al. (2010, 2014
and 2015) [17,19,20] that reported that TSSA pepII/V/VI isoforms were able to distinguish
samples of hosts infected with distinct T. cruzi genotypes. Based on these findings, the authors
proposed that TSSA isoforms are feasible serological markers to identify a T. cruzi lineage in
human and experimental infection. However, the TSSA pepI did not yield significant reactiv-
ity, suggesting that novel targets for TcI is still required.
The innovative TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a methodology presented a high-
quality performance to segregate infections with TcI/Colombiana, TcVI/CL or TcII/Y strain.
The performance of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for genotype-specific
diagnosis of T. cruzi infection differs depending on the population prototypes used to repre-
sent distinct geographic regions of T. cruzi infection in the Latin America. In the first proto-
type (TcI/TcVI/TcII), our data demonstrated that the proposed method showed a moderate
global accuracy (68.8%, LOOCV = 58.0%) to discriminate the infections with TcI/Colombiana
vs TcVI/CL vs TcII/Y strains. On the other hand, the combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow
ATE-IgG2 was capable to discriminate the infections with TcI/Colombiana vs TcII/Y
strains in the second population prototype (TcI/TcII) with high global accuracy (93.8%,
LOOCV = 87.5%) (Fig 5). Overall, hosts infected with TcI/Colombiana and TcII/Y strains dis-
played opposite patterns of reactivity with “anti-TcI TRYPO” and “anti-TcII AMA” and hosts
infected with TcVI/CL strain showed a typical interweaved distribution pattern (Figs 4 and
S1). This phenomenon may reflect the phylogenetic origin of DTUs [4] where TcI and TcII are
ancestral DTUs presenting polar characteristics [5,27,28,30,71–73], whereas the TcVI has a
hybrid origin, showing intermediate characteristics of both polar genotypes [73,74].
In conclusion, based on the receiver operating characteristic, the TcI/TcVI/TcII Chagas-
Flow ATE-IgG2a seems to be a feasible tool to classify the serum samples as they belong to the
true respective groups infected with distinct T. cruzi genotypes (Fig 6), suggesting its applica-
bility for both, universal and genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection in clinical labora-
tories. The proposed methodology includes essential advantages such as high sensitivity and
specificity, ease to perform, using a wide range of antigenic preparation into a single flow cyto-
metric platform [21,75–79]. Future derivation of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a as
the development of a suitable ELISA or multiplex beads assay would contribute to practical
applications in routine clinical laboratories, since the original version of this fluorescence-
based methodology is more reliable for applications in reference laboratories. Additional tests
are under investigation to establish accuracy of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a to
identify mixed infections with distinct T. cruzi genotypes. An extension of this study may be
applicable to other genetic groups not included in this work (TcIII, TcIV and TcV). Further
studies including serum samples from patients with genotypic-specific diagnosis Chagas dis-
ease performed by molecular methods are currently under investigation as a proof-of-concept
to propose a prototype for clinical purposes, epidemiological studies and post-therapeutic
monitoring applications.
Supporting information
S1 Fig. Cut-off edges and performance of TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for
genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection. (A) The trendlines of anti-TcII AMA at
1:1,000, anti-TcI TRYPO at 1:4,000 and anti-TcVI EPI at 1:1,000 reactivity observed for T.
cruzi-infected hosts, (TcI/Colombiana strain = black dashed line, TcVI/CL strain = light gray
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 18 / 24
dashed line and TcII/Y strain = dark gray dashed line) were overlaid aiming to differentiate
the reactivity pattern. The results were expressed as the proportion of samples displaying a
given PPFP values amongst T. cruzi-infected hosts. (B) The whole set of reactivity data were
used to calculate the global median PPFP values applied as the cut-off edge to segregate the
individual samples as they present negative (white square) or positive (black square) reactivity
at the selected target-antigen/serum dilution. The results were expressed as the range of PPFP
values in scatter plots for individual serum samples (C) Diagrams were used to compile the
reactivity patterns and calculate the proportion of negative and positive results for each
selected set of attributes (“target-antigen/serum dilution/cut-off”). (D) Representative scatter
plots were also used to illustrate the ability of each set of attributes (“target-antigen/serum dilu-
tion/cut-off”) to discriminate the reactivity of serum samples amongst the T. cruzi-infected
mice (TcI-infection/Colombiana, n = 29; TcVI/CL, n = 29 and TcII/Y, n = 35). The results
were expressed as the range of PPFP values in scatter plots for individual serum samples. The
dotted line represents the cut-off for each target-antigen/serum dilution. Clusters of distinct
reactivity patterns are highlighted by light-gray doted frames whereas indiscriminate distribu-
tion pattern underscore by white-background frame.
(TIF)
S2 Fig. Discriminant analysis of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a for
genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection. (A) Discriminant analyses of combined
TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a were performed for genotype-specific diagnosis of T.
cruzi infection in a population/prototype including TcI/Colombiana strain, TcVI/CL strain or
TcII/Y strain. (B) Discriminant analyses of combined TcI/TcVI/TcII Chagas-Flow ATE-IgG2a
were performed for genotype-specific diagnosis of T. cruzi infection in a population/prototype
including TcI/Colombiana strain or TcII/Y strain. The global accuracy and leave-one-out-
cross-validation-LOOCV provided in the Figure.
(TIF)
Author Contributions
Conceptualization: GDA ATC OAMF MdL.
Data curation: GDA FFdA DFC PASJ DCL.
Formal analysis: GDA MdSG LRdA MAPX OAMF.
Funding acquisition: ATC OAMF MdL.
Investigation: GDA FFdA DFC PASJ DCL OAMF.
Methodology: GDA DFC PASJ DCL.
Project administration: ATC OAMF MdL.
Resources: GDA FFdA ATC OAMF MdL.
Software: MdSG LRdA MAPX.
Supervision: OAMF MdL.
Validation: GDA DFC DCL OAMF MdL.
Visualization: GDA FFdA ATC OAMF MdL.
Writing – original draft: GDA FFdA OAMF MdL.
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 19 / 24
Writing – review & editing: GDA FFdA PASJ ATC OAMF MdL.
References1. Chagas C. Nova Tripanozomiase Humana. Estudo sobre a morfologia e o ciclo evolutivo do Schizotry-
panum cruzi. n. gen., n. sp. agente etiologico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Insti-
tuto Oswaldo Cruz. 1909; 1: 159–218.
2. WHO- World Health Organization- Chagas disease (American trypanosomiasis) Fact sheet N˚ 340;
2015.
3. Dias JC. Epidemiology of Chagas disease. In Wendel S, Brener Z, Camargo MS, Rassi A (eds), Chagas
disease (American Trypanosomiasis): its Impact on Transfusion and Clinical Medicine. ISBT Brazil,
São Paulo. 1992; 49–80.
4. Zingales B, Miles MA, Campbell DA, Tibayrenc M, Macedo AM, Teixeira MG, Schijman AG, Llewellyn
MS, Lages-Silva E, Machado CR, Andrade SG, Sturm NR. The revised Trypanosoma cruzi subspecific
nomenclature: Rationale, epidemiological relevance and research applications. Infect. Gene Evolut.
2012; 12: 240–253.
5. Toledo MJ, Bahia MT, Carneiro CM, Martins-Filho OA, Tibayrenc M, Barnabe C, Tafuri WL, Lana M.
Chemotherapy with benznidazole and itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi
clonal genotypes. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47: 223–230. https://doi.org/10.1128/AAC.47.
1.223-230.2003 PMID: 12499195
6. Toledo MJ, Bahia MT, Veloso VM, Carneiro CM, Machado-Coelho GL, Alves CF, Martins HR, Cruz RE,
Tafuri WL, Lana M. Effects of specific treatment on parasitological and histopathological parameters in
mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal genotypes. J Antimicrob Chemother. 2004; 53(6):
1045–53. https://doi.org/10.1093/jac/dkh224 PMID: 15102747
7. Martins HR, Figueiredo LM, Valamiel JC, Carneiro CM, Machado-Coelho GL, Bahia MT, Macedo AM,
Lana M. Persistence of PCR-positive tissue in benznidazole-treated mice with negative blood parasito-
logical and serological tests in dual infections with Trypanosoma cruzi stocks from different genotypes.
J. Antimicrob Chemother. 2008; 61(6): 1319–27. https://doi.org/10.1093/jac/dkn092 PMID: 18343804
8. Oliveira-Silva JC, Machado-de-Assis GF, Oliveira MT, Paiva NC, Araujo MS, Carneiro CM, Martins-
Filho OA, Martins HR, Lana M. Experimental benznidazole treatment of Trypanosoma cruzi II strains
isolated from children of Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, Brazil, with Chagas disease. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2015; 110: 86–94. https://doi.org/10.1590/0074-02760140260 PMID: 25742267
9. Zingales B, Andrade SG, Briones MR, Campbell DA, Chiari E, Fernandes O, Guhl F, Lages-Silva E,
Macedo AM, Machado CR, Miles MA, Romanha AJ, Sturm NR, Tibayrenc M, Schijman AG. A new con-
sensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends TcI to
TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104(7): 1051–1054. PMID: 20027478
10. Lewis MD, Jonathan MA, Matthew YE, Hernan J, Carrasco MS, Llewellyn AN, Michael AM. Genotyping
of Trypanosoma cruzi: Systematic Selection of Assays Allowing Rapid and Accurate Discrimination of
All Known Lineages. Am J Trop Med Hyg. 2009; 81(6): 1041–1049. https://doi.org/10.4269/ajtmh.2009.
09-0305 PMID: 19996435
11. D’avilla DA, Macedo AD, Valadares HM, Gontijo ED, De Castro AM, Machado CR, Chiari E, Galvão
LM. Probing Population Dynamics of Trypanosoma cruzi during Progression of the Chronic Phase in
Chagasic Patients. J Clin Microbiol. 2009; 1718–1725. https://doi.org/10.1128/JCM.01658-08 PMID:
19357212
12. Oliveira MT, Machado-de-Assis GF, Oliveira-Silva JC, Machado EM, Da Silva GN, Veloso VM, Macedo
AM, Martins HR, Lana M. Trypanosoma cruzi Discret Typing Units (TcII and TcVI) in samples of
patients from two municipalities of the Jequitinhonha Valley, MG, Brazil, using two molecular typing
strategies. Parasit Vectors. 2015; 8: 568. https://doi.org/10.1186/s13071-015-1161-2 PMID: 26520576
13. Vago AR, Andrade LO, Leite AA, D’avilla RD, Macedo AM, Adad SJ, Tostes SJ, Moreira MC, Filho GB,
Pena SD. Genetic characterization of Trypanosoma cruzi directly from tissues of patients with chronic
Chagas disease: differential distribution of genetic types into diverse organs. Am J Pathol. 2000; 156
(5): 1805–9. PMID: 10793092
14. Macedo AM, Pena SD. Genetic variability of Trypanosoma cruzi: implications for the pathogenesis of
Chagas disease. Parasitol Today. 1998; 14: 119–123. PMID: 17040719
15. Macedo AM, Machado CR, Oliveira RP, Pena SD. Trypanosoma cruzi: genetic structure of populations
and relevance of genetic variability to the pathogenesis of Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2004; 99: 1–12.
16. Burgos JM, Diez M, Vigliano C, Bisio M, Risso M, Duffy T, Cura C, Brusses B, Favaloro L, Leguizamon
MS, Lucero RH, Laguens R, Levin MJ, Favaloro R, Schijman AG. Molecular identification of Trypanosoma
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 20 / 24
cruzi discrete typing units in end-stage chronic Chagas heart disease and reactivation after heart trans-
plantation. Clin Infect Dis. 2010; 51(5): 485–95. https://doi.org/10.1086/655680 PMID: 20645859
17. Bhattacharyya T, Brooks J, Yeo M, Carrasco HJ, Lewis MD, Llewellyn MS, Miles MA. Analysis of molec-
ular diversity of the Trypanosoma cruzi trypomastigote small surface antigen reveals novel epitopes,
evidence of positive selection and potential implications for lineage-specific serology. Int J Parasitol.
2010; 40(8): 921–8. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2010.01.002 PMID: 20097201
18. Mendes TA, Reis-Cunha JL, de Almeida LR, Rodrigues LG, Lemos LD, dos Santos AR, da Camara
AC, Galvão LM, Bern C, Gilman RH, Fujiwara RT, Gazzinelli RT, Bartholomeu DC. Identification of
strain-specific B-cell epitopes in Trypanosoma cruzi using genome-scale epitope prediction and high-
throughput immunoscreening with peptide arrays. Plos Negl Trop Dis. 2013; 7(10): e2524. https://doi.
org/10.1371/journal.pntd.0002524 PMID: 24205430
19. Bhattacharyya T, Falconar AK, Luquetti AO, Costales JA, Grijalva MJ, Lewis MD, Messenger LA, Tran
TT, Ramirez JD, Guhl F, Carrasco HJ, Diosque P, Garcia L, Litvinov SV, Miles MA. Development of
peptide-based lineage-specific serology for chronic Chagas disease: geographical and clinical distribu-
tion of epitope recognition. Plos Negl Trop Dis. 2014; 8(5): e2892. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.
0002892 PMID: 24852444
20. Bhattacharyya T, Mills EA, Jansen AM, Miles MA. Prospects for T. cruzi lineage-specific serological sur-
veillance of wild mammals. Acta Trop. 2015; 151: 182–6. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2015.06.
017 PMID: 26116784
21. Alessio GD, Cortes DF, Machado-de-Assis GF, Sales-Junior PA, Ferro EA, Antonelli LR, Teixeira-Car-
valho A, Martins-Filho OA, Lana M. Inovations in diagnosis and post-therapeutic monitoring of Chagas
disease: Simultaneous flow cytometric detection of IgG1 antibodies anti-live amastigote, anti-live trypo-
mastigote, and anti-fixed epimastigote forms of Trypanosoma cruzi. Journal of Immunological Methods.
2014; 413: 32–44. https://doi.org/10.1016/j.jim.2014.07.005 PMID: 25064148
22. Federeci EE, Albemann WH, Neva FA. Chronic and progressive myocarditis and myositis in C3H mice
infected with Trypanosoma cruzi. Am J Trop Med Hyg. 1964; 13: 272–80. PMID: 14125879
23. Brener Z, Chiari E. Morphological variations observed in different strains of Trypanosoma cruzi. Rev
Inst Med Trop São Paulo. 1963; 5: 220–4. PMID: 14110094
24. Pereira da Silva LH, Nussenzweig. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o
camundongo branco. Folia Clin Biol. 1953; 20: 191–208.
25. Camargo EP. Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes in
liquid media. Rev Inst Med Trop São Paulo. 1964; 6: 93–100. PMID: 14177814
26. Andrade SG. Caracterizacão de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas no Reconcavo Baiano. Rev Pat
Trop. 1974; 65–121.
27. Andrade SG, Magalhães JB. Biodemes and zimodemes of Trypanosoma cruzi strains: correlations with
clinical data and experimental pathology. Rev Soc Bras Med Trop. 1997; 27–35. PMID: 8993106
28. Laurent JP, Barnabe C, Quesney V, Noel S, Tibayrenc M. Impact of clonal evolution on the biological
diversity of Trypanosoma cruzi. Parasitology. 1997; 114: 213–218. PMID: 9075341
29. Toledo MJ, Lana M, Carneiro CM, Bahia MT, Machado-Coelho GL, Veloso VM, Barnabe C, Tibayrenc
M, Tafuri WL. Impact of Trypanosoma cruzi clonal evolution on its biological properties in mice. Exp
Parasitol. 2002; 100(3): 161–7. PMID: 12173401
30. Andrade SG, Campos RF, Steindel M, Guerreiro ML, Magalhães JB, Almeida MC, Reis JN, Santos VC,
Valadares HM, Reis MG, Macedo AM. Biological, biochemical and molecular features of Trypanosoma
cruzi strains isolated from patients infected through oral transmission during a 2005 outbreak in the
state of Santa Catarina, Brazil: its correspondence with the new T. cruzi Taxonomy Consensus (2009).
Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011; 106(8): 948–56. PMID: 22241116
31. Andrade SG. Morphological and behavioural characterization of Trypanosoma cruzi strains. Rev Soc
Bras Med Trop. 1985; 39–4624.
32. Filardi LS, Brener Z. Susceptibily and natural resistance os Trypanosoma cruzi strains to drugs used
clinically in Chagas disease. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1987; 81(5): 755–759. PMID: 3130683
33. Andrade SG, Rassi A, Magalhães JB, Ferriolli FF, Luquetti AO. Specific chemotherapy of Chagas dis-
ease: a comparison between the response in patients and experimental animals inoculated with the
same strains. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1992; 86: 624–626. PMID: 1287919
34. Teston AP, Monteiro WM, Reis D, Bossolani GD, Gomes ML, de Araujo SM, Bahia MT, Barbosa MG,
Toledo MJ. In vivo susceptibility to benznidazole of Trypanosoma cruzi strains from the western Brazilian
Amazon. Trop Med Int Health. 2013; 18(1): 85–95. https://doi.org/10.1111/tmi.12014 PMID: 23130989
35. Lana M, da Silveira Pinto A, Barnabe C, Quesney V, Noel S, Tibayrenc M. Trypanosoma cruzi: com-
pared vectorial transmissibility of three major clonal genotypes by Triatoma infestans. Exp Parasitol.
1998; 90(1): 20–5. PMID: 9709026
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 21 / 24
36. Tibayrenc M, Ayala FJ. The population genetics of Trypanosoma cruzi revisited in the light of the pre-
dominant clonal evolution model. Acta Trop. 2015; 151: 156–65. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.
2015.05.006 PMID: 26188332
37. Miles MA, Llewellyn MS, Lewis MD, Yeo M, Baleela R, Fitzpatrick S, Gaunt MW, Mauricio IL. The
molecular epidemiology and phylogeography of Trypanosoma cruzi and parallel research on Leish-
mania: looking back and to the future. Parasitology. 2009; 136(12): 1509–28. https://doi.org/10.1017/
S0031182009990977 PMID: 19691868
38. Lages-Silva E, Ramırez LE, Pedrosa AL, Crema E, Da Cunha GL, Junho PS, Macedo AM, Chiari E.
Variability of kinetoplast DNA gene signatures of Trypanosoma cruzi II strains from patients with differ-
ent clinical forms of Chagas’ disease in Brazil. J Clin Microbiol. 2006; 44: 2167–71. https://doi.org/10.
1128/JCM.02124-05 PMID: 16757616
39. Virreira M, Serrano G, Maldonado L, Svoboda M. Trypanosoma cruzi: typing of genotype (sub)lineages
in megacolon samples from bolivian patients. Acta Trop. 2006; 100(3): 252–5. https://doi.org/10.1016/j.
actatropica.2006.11.005 PMID: 17157796
40. Valadares HM, Pimenta JR, De Freitas JM, Duffy T, Bartholomeu DC, Oliveira RP, Chiari E, Moreira
MC, Filho GB, Schijman AG, Franco GR, Machado CR, Pena SD, Macedo AM. Genetic profiling of Try-
panosoma cruzi directly in infected tissues using nested PCR of polymorphic microsatellites. Int J Para-
sitol. 2007; 38(7): 839–50. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2007.10.017 PMID: 18154957
41. Coura JR, Junqueira AC. Surveillance, health promotion and control of Chagas disease in the Amazon
Region-Medical attention in the Brazilian Amazon Region: a proposal. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015;
110(7): 825–30. https://doi.org/10.1590/0074-02760150153 PMID: 26560976
42. Martinez-Perez A, Poveda C, Ramırez JD, Norman F, Girones N, Guhl F, Monge-Maillo B, Fresno M,
Lopez-Velez R. Prevalence of Trypanosoma cruzi Discrete Typing Units in a cohort of Latin American
migrants in Spain. Acta Trop. 2016; 157: 145–50. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2016.01.032
PMID: 26851167
43. Umezawa ES, Bastos SF, Camargo ME, Yamauchi LM, Santos MR, Gonzalez A, Zingales B, Levin MJ,
Souza O, Rangel-Aldao R, Silveira JF. Evaluation of recombinant antigens for serodiagnosis of Chagas
disease in South and Central America. Journal of Clinical Microbiology. 1999; 37: 1554–1560. PMID:
10203520
44. Verani JR, Seitz A, Gilman RH, Lafuente C, Galdos-Cardenas G, Kawai V, De Lafuente E, Ferrufino L,
Bowman NM, Pinedo-Cancino V, Levy MZ, Todd CW, Kirchhoff LV, Cabrera L, Verastegui M, Bern C.
Geographic variation in the sensitivity of recombinant antigen-based rapid tests chronic Trypanosoma
cruzi infection. Am J Trop Med Hyg. 2009; 80(3): 410–415. PMID: 19270291
45. Reis-Cunha JL, Mendes TA, De Almeida LR, Ribeiro DR, Machado-De-Avila RA, Oliveira MT, Lemos
DS, Camara AC, Olortegui CC, Lana M, Da Cunha GLM, Fujiwara RT, Bartholomeu DC. Genome-wide
screening and identification of new Trypanosoma cruzi antigens with potential application of chronic
Chagas disease diagnosis. Plos One. 2014; 9(9).
46. Souto RP, Zingales B. Sensitive detection and strain classification of Trypanosoma cruzi by amplifica-
tion of a ribossomal RNA sequence. Mol Biochem Parasitol. 1993; 62: 45–52. PMID: 8114825
47. Clark CG, Pung OJ. Host specificity of ribosomal DNA variation in sylvatic Trypanosoma cruzi from
North America. Mol Biochem Parasitol. 1994; 66: 175–179. PMID: 7984184
48. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbel DA, Zingales B. DNA markers define two major phylo-
genetic lineages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol. 1996; 83: 141–152. PMID: 9027747
49. Brisse S, Barnabe C, Tibayrenc M. Identification of six Trypanosoma cruzi phylogenetic lineages by ran-
dom amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Int J Parasitol. 2000; 30: 35–
40. PMID: 10675742
50. Consentino RO, Aguero F. A Simple Strain Typing Assay for Trypanosoma cruzi: Discrimination of Major
Evolutionary Lineages from a Single Amplification Product. PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(7): 1777.
51. Higuera SL, Guhl F, Ramırez JD. Identification of Trypanosoma cruzi Typing Units (DTUs) through the
implementation of a High-Resolution Melting (HRM) genotyping assay. Parasites & Vector. 2013; 6:
112–117.
52. Cura CI, Duffy T, Lucero RH, Bisio M, Peneau J, Jimenez-Coello M, et al. Multiplex real-time PCR
assay using TaqMan probes for the identification of Trypanosoma cruzi DTUs in biological and clinical
samples. Plos Negl Trop Dis. 2015; 9(5): 1371–88.
53. Brener Z, Cancado JR, Galvão LM, Luz ZP, Filardi LS, Pereira ME, Santos LM, Cancado CB. An exper-
imental and clinical assay with ketoconazole in the treatment of Chagas disease. Memorias do Instituto
Oswaldo Cruz. 1993; 88: 149–153. PMID: 8246750
54. Schenone H, Rojas A, Castillo D. Comparative study of sensitivity and mortality of Triatoma infestan
nymphs III and IV used in the xenodiagnosis of chronic chagasic patients. Bol Chil Parasitol. 2000; 55:
14–17. PMID: 11757411
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 22 / 24
55. Marcet PL, Duffy T, Cardinal MV, Burgos JM, Lauricella MA, Levin MJ, et al. PCR-based screening and
lineage identification of Trypanosoma cruzi directly from fecal samples of triatomine bugs from north-
western Argentina. Parasitology. 2006; 132(1): 57–65.
56. Abolis NG, Araujo SM, Toledo MJ, Fernandez MA, Gomes ML. Trypanosoma cruzi I-III in southern Bra-
zil causing individual and mixed infections in humans, sylvatic reservoirs and triatomines. Acta Trop.
2011; 120(3): 167–72. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2011.08.001 PMID: 21855523
57. Oliveira-Silva JC, Machado-de-Assis GF, Oliveira MT, Valadares HM, Valle IF, Paiva NC, Martins HR,
Lana M. Molecular and biology characterization of Trypanosoma cruzi strains isolated from children
from Jequitinhonha Valley of Minas Gerais, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 2013; 46(4): 433–40.
https://doi.org/10.1590/0037-8682-0077-2013 PMID: 23982097
58. Sales-Campos H, Kappel HB, Andrade CP, Lima TP, de Castilho A, Giraldo LE, Lages-Silva E. Trypa-
nosoma cruzi DTU TcII presents higher blood parasitism than DTU TcI in an experimental model of
mixed infection. Acta Parasitol. 2015; 60(3): 435–41. https://doi.org/10.1515/ap-2015-0060 PMID:
26204180
59. Ramırez JD, Guhl F, Rendon LM, Rosas F, Marin-Neto JA, Morillo CA. Chagas cardiomyopathy mani-
festations and Trypanosoma cruzi genotypes circulating in chronic Chagasic patients. PLoS Negl Trop
Dis. 2010; 4(11): e899. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000899 PMID: 21152056
60. Cardinal MV, Lauricella MA, Ceballos LA, Lanati L, Marcet PL, Levin MJ, et al. Molecular epidemiology
of domestic and sylvatic Trypanosoma cruzi infection in rural northwestern Argentina. Int J Parasitol.
2008; 38: 1533–1543. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2008.04.010 PMID: 18585717
61. Marcili A, Lima L, Valente VC, Valente SA, Batista JS, Junqueira AC, et al. Comparative phylogeogra-
phy of Trypanosoma cruzi TcIIc: new hosts, association with terrestrial ecotopes, and spatial clustering.
Infect Genet Evol. 2009; 9: 1265–1274. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2009.07.003 PMID: 19632356
62. Camara AC, Varela-Freire AA, Valadares HM, Macedo A, D’Avila DA, Machado CR, et al. Genetic anal-
yses of Trypanosoma cruzi isolates from naturally infected triatomines and humans in northeastern Bra-
zil. Acta Trop. 2010; 115: 205–211. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2010.03.003 PMID: 20303924
63. Coura JR, Junqueira AC, Fernandes O, Valente SA, Miles MA. Emerging Chagas disease in Amazo-
nian Brazil. Trends Parasitol. 2002; 18: 171–176. PMID: 11998705
64. Valente SA, da Costa V.V, das Neves P.A, de Jesus B.M, dos Santos MP, Miranda CO, et al. Analysis
of an acute Chagas disease outbreak in the Brazilian Amazon: human cases, triatomines, reservoir
mammals and parasites.Trans R Soc Trop. Med Hyg. 2009; 103: 291–297. https://doi.org/10.1016/j.
trstmh.2008.10.047 PMID: 19118852
65. Umezawa ES, Luquetti A, Levitus G, Ponce C, Ponce E, Henriquez D, Revollo S, Espinoza B, Souza O,
Khan B, Silveira JF. Serodiagnosis of chronic and acute Chagas disease with Trypanosoma cruzi
recombinant proteins: Results of a collaborative study in six Latin American Countries. Journal of Clini-
cal Microbiology. 2004; 42: 449–452. https://doi.org/10.1128/JCM.42.1.449-452.2004 PMID: 14715803
66. Dos Santos DM, Talvani A, Guedes PM, Machado-Coelho GL, Lana M, Bahia MT. Trypanosoma cruzi:
Genetic diversity influences the profile of immunoglobulins during experimental infection. Exp Parasitol.
2009; 121(1): 8–14. https://doi.org/10.1016/j.exppara.2008.09.012 PMID: 18848935
67. Krettli AU, Weisz-Carrington P, Nussenzweig RS. Membrane-bound antibodies to bloodstream Trypa-
nosoma cruzi in mice: strain differences in susceptibility to complement-mediated lysis. Clin Exp Immu-
nol. 1979; 37(3): 416–23. PMID: 116784
68. Wallace A, Sanchez G, Venegas J, Solari A. Lack of cross-reactivity of lytic antibodies with bloodstream
forms of Trypanosoma cruzi zymodemes generated in a mouse experimental model. Exp Parasitol.
1995; 80(2): 176–85. https://doi.org/10.1006/expr.1995.1022 PMID: 7895829
69. Zulantay I, Venegas J, Apt W, Solari A, Sanchez G. Lytic antibodies in Trypanosoma cruzi-infected per-
sons with low parasitemia. Am J Trop Med Hyg. 1998; 58(6): 775–9. PMID: 9660462
70. Di Noia JM, Buscaglia CA, De Marchi CR, Almeida IC, Frasch AC. A Trypanosoma cruzi small surface
molecule provides the first immunological evidence that Chagas0disease is due to a single parasite line-
age. J Exp Med. 2002; 195(4): 401–413. https://doi.org/10.1084/jem.20011433 PMID: 11854354
71. Revollo S, Oury B, Laurent JP, Barnabe C, Quesney V, Carriere V, Noel S, Tibayrenc M. Trypanosoma
cruzi: impact of clonal evolution of the parasite on its biological and medical properties. Exp.Parasitol.
1998; 89: 30–39. https://doi.org/10.1006/expr.1998.4216 PMID: 9603486
72. Guedes PM, Veloso VM, Tafuri WL, Galvão LM, Carneiro CM, Lana M, Chiari E, Ataide SK, Bahia. The
dog as model for chemotherapy of the Chagas0s disease. Acta Trop. 2002; 84(1): 9–17. PMID:
12387906
73. Freitas JM, Augusto PL, Pimenta JR, Bastos RL, Goncalves VF, Teixeira SM, Chiari E, Junqueira AC,
Fernandes O, Macedo AM, Machado CR, Pena SD. Ancestral genomes, sex, and the population struc-
ture of Trypanosoma cruzi. PLOS Pathogens. 2006; 2: 226–235.
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 23 / 24
74. Westenberger SJ, Barnabe C, Campbell DA, Sturm NR. Two hybridization events define the population
structure of Trypanosoma cruzi. Genetics. 2005; 171: 527–43. https://doi.org/10.1534/genetics.104.
038745 PMID: 15998728
75. Martins-Filho OA, Pereira ME, Carvalho JA, Cancado JR, Brener Z. Flow cytometry, a new approach to
detect anti-live trypomastigote antibodies and monitor the efficacy of specific treatment in human cha-
gas disease. Clin Diag Lab Immunol. 1995; 2: 569–573.
76. Martins-Filho OA, Eloi-Santos SM, Carvalho AT, Correa-Oliveira R, Rassi A, Luquetti AO, Rassi GG,
Brener Z. Double-Blind study to evaluate flow cytometry analysis of anti-live trypomastigote antibodies
for monitoring treatment efficacy in cases of human Chagas disease. Clinical and Diagnostic Laboratory
Immunology. 2002; 9: 1107–1113. https://doi.org/10.1128/CDLI.9.5.1107-1113.2002 PMID: 12204967
77. Vitelli-Avelar D, Sathler-Avelar R, Wendling AP, Rocha RD, Teixeira-Carvalho A, Martins NE, Dias JC,
Rassi A, Luquetti AO, Eloi-Santos SM, Martins-Filho OA. Non-conventional flow cytometry approaches
to detect anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G in the clinical laboratory. J Immunol Met. 2007;
318: 102–112.
78. Matos CS, Coelho-Dos-Reis JG, Rassi A, Luquetti AO, Dias JC, Eloi-Santos SM, Gomes IT, Vitelli-Ave-
lar DM, Wendling AP, Rocha RD, Teixeira-Carvalho A, Peruhype-Magalhães V, Andrade MC, Martins-
Filho OA. Applicability of an optimized non-conventional flow cytometry method to detect anti-Trypano-
soma cruzi immunoglobulin G for the serological diagnosis and cure assessment following chemothera-
peutic treatment of Chagas disease. J Immunol Methods. 2010; 369: 22–32.
79. Teixeira-Carvalho A, Campos FM, Geiger SM, Rocha RD, De Araujo FF, Vitelli-Avelar DM, Andrade
MC, Araujo MS, Lemos EM, De Freitas CP, Sabino EC, Caldas RG, Freitas CR, Campi-Azevedo AC,
Elois-Santos SM, Martins-Filho OA. FC-TRIPLEX Chagas/Leish IgG1: a multiplexed flow-cytometry
method for differential serological diagnosis of Chagas disease and leishmaniasis. Plos One. 2015; 10
(4).
Chagas-Flow ATE-IgG2a for serodiagnosis of Trypanosoma cruzi infection
PLOS Neglected Tropical Diseases | https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005444 March 23, 2017 24 / 24