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Jerenice Esdras Ferreira
Avaliação de polimorfismos do gene SLC40A1 em pacientes
com Hemocromatose Hereditária e Adquirida
Dissertação apresentada ao Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Doenças Tropicais e Saúde Internacional
Orientadora: Profa. Dra. Ester Cerdeira Sabino
São Paulo
2015
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Ficha catalográfica
Preparada pela Biblioteca do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da
Universidade de São Paulo © Reprodução autorizada pelo autor
Ferreira, Jerenice Esdras
Avaliação de polimorfismos do gene SLC40A1 em pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida / Jerenice Esdras Ferreira. – São Paulo, 2015.
Dissertação (Mestrado) – Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Doenças Tropicais e Saúde Internacional Orientadora: Ester Cerdeira Sabino
Descritores: 1. HEMOCROMATOSE. 2. MUTAÇÃO. 3. POLIMORFISMO. 4. METABOLISMO – ALTERAÇÃO. 5. FERRO. 6. PROTEÍNAS.
USP/IMTSP/BIB-05/2015.
DEDICATÓRIA
Ao Senhor meu Deus e meu Pai,
Senhor, eu Te agradeço por tudo que tens me proporcionado: pela vida, a alegria de viver a força em todos os momentos difíceis, os dons, a minha família.
Aos meus pais,
que graças à dedicação, ao apoio e ao amor demostrados, estou conquistando esse sonho. Não há palavras para exprimir o meu eterno agradecimento, vocês são o melhor da minha vida. Mãe você é minha fortaleza.
À minha irmã Suzete C Ferreira S Lombardi,
pelo companheirismo, apoio incondicional e incentivo em todos os momentos da minha vida. Obrigada por acreditar em mim, mesmo quando eu não acreditava.
Aos meus irmãos, pela amizade e que acompanharam a realização desse sonho. Aos meus sobrinhos e sobrinhas, que são importantes na minha vida, pois os considero como meus “filhos postiços”.
Ao meu cunhado, cunhadas, por participarem desse momento tão importante. Aos meus amigos e professores, que me incentivaram e colaboraram em todas as etapas desse trabalho.
AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Ester Cerdeira Sabino, que aceitou ser minha orientadora,
que me recebeu, me integrou à sua equipe de pesquisa. Os seus ensinamentos,
seu apoio, paciência e compreensão, foram fundamentais para o êxito desse
trabalho. Por tudo, gostaria de expressar a minha sincera gratidão.
Ao Professor Dr. César de Almeida Neto, gostaria de expressar a minha
sincera gratidão, pelos seus ensinamentos, apoio, disponibilidade para
esclarecimentos teóricos durante a realização dessa dissertação.
Ao Dr. Alfredo Mendrone Júnior, Diretor Técnico da Fundação Pró-Sangue,
por ter proporcionado a realização desse estudo, pelo apoio, colaboração e
compreensão.
Ao Professor Dr. José Eduardo Levi, pelo apoio e colaboração nas
sugestões do trabalho.
A Sra Nanci Alves Salles, chefe da Divisão de Sorologia da Fundação Pró-
Sangue Hemocentro de São Paulo, pelo apoio e colaboração.
A todos os funcionários da Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São
Paulo, pelo apoio e colaboração.
A minha querida amiga, minha irmã, Suzete, que é uma maravilhosa
profissional, pelo apoio, motivação, incentivo e compreensão, e me ensinou cada
etapa para poder realizar esse trabalho.
As minhas queridas amigas Eliane Margareth P Carneiro, do Instituto Adolfo
Lutz, Anna Shoko Niyshia e Cecília Salete, da Fundação Pró-Sangue Hemocentro
de São Paulo, pelo apoio, motivação, companheirismo durante a realização desse
estudo.
A minha diretora do Instituto Adolfo Lutz, Raimunda Telma de Macedo
Santos pelo apoio e compreensão.
A Dra Sandra Gualandro e Dr Guilherme Fonseca do ambulatório de
Hematologia do Hospital das Clínicas da FMUSP pelo apoio e disponibilizar os
pacientes para a realização desse estudo.
Aos pacientes do ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da
FMUSP, pela confiança em participarem desse estudo.
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez”.
George Bernard Shaw
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
Ferreira JE. Avaliação de polimorfismos do gene SLC40A1 em pacientes com Hemocromatose Hereditária e Adquirida. (dissertação). São Paulo: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da Universidade de São Paulo; 2015.
A hemocromatose é uma desordem caracterizada por armazenamento alterado de ferro em órgãos vitais. A hemocromatose hereditária pode ser causada por mutações nos genes HFE, SLC40A1, HAMP, HJV e TfR2. A forma adquirida da doença pode ser ocasionada por sobrecarga de ferro, alcoolismo, infecção pelo vírus da hepatite C, anemias hemolíticas e doença hepática crônica. O objetivo deste estudo foi descrever as variantes do gene SLC401 em uma série de casos de pacientes em seguimento no ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da FMUSP com hemocromatose hereditária e adquirida e verificar se estas variantes poderiam estar associadas a um pior quadro de hemocromatose. No período de 2008 a 2011 foram coletadas 54 amostras de pacientes com diagnóstico prévio de hemocromatose, acompanhados no ambulatório de anemias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os pacientes foram separados, de acordo com a suspeita clínica, em dois grupos: 38 pacientes com Hemocromatose Hereditária e 16 pacientes com Hemocromatose Adquirida. O DNA foi extraído de sangue periférico pelo kit Qiamp Blood, e as amplificações dos exomas descrito por Wakusawa (2005). As reações de sequenciamento foram realizadas no aparelho AB 3130 e as sequências do gene editadas, alinhadas no programa Sequencer e comparadas com GenBank. Os pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) apresentaram uma frequência acima de 45% entre a faixa etária de 40 a 60 anos, mostrando uma sobrecarga de ferro mais tardia. O gênero masculino apresentou maior frequência em ambos os grupos (superior a 60%), já em relação à etnia/cor da pele, mais de 80% eram brancos. No diagnóstico laboratorial de ferritina, ferro, CTLF e IST dos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) mostra que não houve diferenças significativas. As mutações no gene HFE nos pacientes com hemocromatose hereditária foram C282Y homozigose (21%) e na adquirida (secundária) H63D heterozigose (25%). Entre as mutações do gene HFE, não houve diferença estatística significativa nos grupos. A mutação foi identificada no éxon 3 do gene SLC40A1, no códon 80, descrita p.I80L (c.586C>A). No éxon 4 do gene SLC40A1 foram identificados 3 polimorfismos com a substituição de um nucleotídeo nas posições: c. A630G (190437579), c.648A>G (190437597), c.738Y>C (190437688). Já no éxon 6 foram identificados dois polimorfismos c.1014C>T (190430229) e c.1014Y>T (190430229). As mutações encontradas no gene HFE e SLC40A1 estão associadas com a sobrecarga férrica caracterizando a hemocromatose hereditária. Os polimorfismos encontrados no gene SLC40A1 foram identificados nos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) numa frequência de 50%, semelhante aos doadores de sangue, sugerindo que este polimorfismo provavelmente não contribui para o desenvolvimento da doença.
Descritores: Hemocromatose. Mutação. Polimorfismo. Distúrbios do Metabolismo.
Sobrecarga de Ferro. Proteínas ligantes de ferro.
ABSTRACT
Ferreira JE. Polymorphisms evaluation of SLC40A1 gene in patients with Hereditary Hemochromatosis and Acquired. (dissertation). São Paulo: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo da Universidade de São Paulo; 2015.
Hemochromatosis is a disorder characterized by altered storage iron in vital organs. Hereditary hemochromatosis can be caused by mutations in the HFE gene, SLC40A1, HAMP, and HVJ TFR2. The acquired form of the disease can be caused by iron overload, alcoholism, infection by the hepatitis C virus, hemolytic anemias and chronic liver disease. The objective of this study was to describe variants of the SLC401 gene in a number of cases of patients being followed at hematology clinic Hospital das Clínicas FMUSP with hereditary hemochromatosis and acquired and verify that these variants could be associated with a worse hemochromatosis frame. In the period 2008 to 2011 were collected 54 samples from patients previously diagnosed with hemochromatosis, anemia accompanied the clinic of the Hospital das Clinicas, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo. The patients were divided, according to clinical suspicion, into two groups: 38 patients with Hereditary Hemochromatosis and 16 patients with Acquired Hemochromatosis. The DNA was extracted from peripheral blood by Qiamp Blood Kit, and amplifications of exomas described by Wakusawa (2005). The sequencing reactions were performed in AB 3130 apparatus and the sequences of the gene edited, aligned in Sequencer program and compared with GenBank. Patients with hereditary hemochromatosis and acquired (secondary) had a frequency above 45% between the age group 40-60 years showing a later iron overload. The males showed higher frequency in both groups (over 60%), as compared to ethnicity / skin color, over 80% were white. In the laboratory diagnosis of ferritin, iron, TIBC and STI patients with hereditary hemochromatosis and acquired (secondary) shows no significant differences. Mutations in the HFE gene in patients with hereditary hemochromatosis C282Y homozygosity were (21%) and acquired (secondary) H63D heterozygosity (25%). Between HFE mutations, there was no statistically significant difference in the groups. The mutation was identified in exon 3 of the SLC40A1 gene at codon 80, described p.I80L (c.586C> A). In exon 4 of the SLC40A1 gene were identified polymorphisms 3 with substitution of a nucleotide in position: c. A630G (190,437,579), c.648A> L (190,437,597), c.738Y> C (190 437 688). Already in exon 6 were identified two polymorphisms c.1014C> T (190 430 229) and c.1014Y> T (190 430 229). The mutations found in the HFE gene and SLC40A1 are associated with iron overload characterizing hereditary hemochromatosis. The polymorphisms found in the SLC40A1 gene have been identified in patients with hereditary hemochromatosis and acquired (secondary) at a frequency of 50%, similar to blood donors, suggesting that this polymorphism will probably not contribute to the development of the disease.
Descriptors: Hemochromatosis. Mutation. Polymorphism. Iron metabolismo disorders. Iron over load. Iron-binding proteins.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - O gene HFE está localizado no braço curto do cromossoma 6 (p), na
posição 21.3..............................................................................................................23
Figura 2 - O gene HJV está localizado no braço longo do cromossoma 1 (q), na
posição 21.1.............................................................................................................24
Figura 3 - O gene HAMP está localizado no braço longo do cromossoma 19 (q), na
posição 13.1. ............................................................................................................25
Figura 4 - O gene TfR2 está localizado no braço longo do cromossoma 7 (q), na
posição 22. ...............................................................................................................27
Figura 5 - O gene SLC40A1 está localizado no braço longo do cromossoma 2 (q),
na posição 32............................................................................................................28
Figura 6 - Homeostase sistêmico de ferro no organismo.........................................30
Figura 7 - Metabolismo do ferro: enterócito e proteínas envolvidas na absorção de
ferro. .........................................................................................................................32
Figura 8 - A hepcidina se liga a ferroportina e leva a sua degradação. No enterócito,
o ferro não é transportado para o exterior da célula, e a absorção é inibida (figura a
esquerda). No macrófago, o ferro fica acumulado no seu interior, diminuindo o ferro
disponível para a eritropoiese (figura a direita). .......................................................36
Figura 9 - Tipos de hemocromatose hereditária e evolução clínica.........................38
Figura 10 - Distribuição dos valores de ferritina, ferro, CTLF (capacidade total de
ligação do ferro) e IST (índice de saturação da transferrina) nos pacientes com
hemocromatose hereditária e adquirida (secundária)..............................................55
Figura 11 - PCR-RFLP na análise molecular da mutação C282Y do gene HFE, em
gel de agarose a 2% corado com brometo etídio.....................................................56
Figura 12 - PCR-RFLP na análise molecular da mutação H63D do gene HFE, em
gel de agarose a 2% corado com brometo etídio.....................................................56
Figura 13 - A. Cromatograma mostrando homozigose para a mutação no gene
SLC40A1 p.I80L (c.586C>A, éxon 3). B. Análise do alinhamento (blast) das
sequencias do gene SLC40A1 com a do paciente. C. Análise do alinhamento (blast)
das sequencias do RNAm do gene SLC40A1 com a do paciente............................59
Figura 14 - Cromatograma mostrando os polimorfismos do éxon 4 no gene
SLC40A1. A: amostra 4 (c.630A>G e c.648A>G) e nas amostras 18 (B), 23 (C), 48
(D) polimorfismo c.738Y>C.......................................................................................60
Figura 15 - A. Análise do alinhamento (blast) das sequencias do gene SLC40A1
com a identificação dos polimorfismos. B. Análise do alinhamento (blast) das
sequencias do RNAm do gene SLC40A1 dos polimorfismos...................................61
Figura 16 - A. Cromatograma mostrando polimorfismos no éxon 6 c.1014C>T e
c.1014Y>T no gene SLC40A1. B. Análise do alinhamento (blast) das sequencias do
gene SLC40A1. C. Análise do alinhamento (blast) das sequencias do RNAm do
gene SLC40A1..........................................................................................................62
Figura 17 - Heredograma da Família B, apresentando a mutação C282Y do gene
HFE...........................................................................................................................72
Gráfico 1 - Distribuição de pacientes com hemocromatose hereditária com
mutações no gene HFE e simultaneamente polimorfismos e mutação no gene
SLC40A1...................................................................................................................63
Gráfico 2 - Distribuição de pacientes com Hemocromatose Adquirida com mutações
no gene HFE e simultaneamente polimorfismos no gene SLC40A1........................64
LISTA DE TABELAS Tabela 1- Principais características epidemiológica e molecular dos tipos de
Hemocromatose Hereditária.....................................................................................22
Tabela 2- Classificação Molecular da Hemocromatose Hereditária........................39
Tabela 3- Principais causas de hemocromatose Adquirida (secundária)................43
Tabela 4- Sequência de primers utilizados na amplificação e reação de
sequenciamento do gene SLC40A1.........................................................................49
Tabela 5- Características demográficas dos pacientes com hemocromatose
hereditária e adquirida (secundária).........................................................................53
Tabela 6- Mutações encontradas no gene HFE nos pacientes com hemocromatose
hereditária e adquirida (secundária).........................................................................57
Tabela 7- Análise de sequenciamento do gene SLC40A1 nos pacientes com
Hemocromatose hereditária e adquirida (secundária)..............................................58
Tabela 8- Identificação das sequências submetidas no GenBank...........................65
Tabela 9- Diagnóstico laboratorial do paciente com Mutação no gene SLC40A1...68
Tabela 10- Características demográficas, dados laboratoriais bioquímicos e
moleculares da Família B.........................................................................................72
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT – alanina aminotransferase Asp – ácido aspártico AST – aspartato aminotransferase CHCM – concentração de hemoglobina corpuscular média CTLF – capacidade de ligação do ferro Cys - cisteína DMT-1 – transportador de metal divalente 1 DNA - ácido desoxirribonucleico DNTPs – desoxirribonucleotídeos fosfatados Fe2+ - ferro ferroso Fe3+ - ferro férrico fl – fentolitro FPN - ferroportina g – gramas g/dL – gramas por decilitro HAMP – gene da hepcidina Hb – hemoglobina HCM – hemoglobina corpuscular média HCP1 – proteína transportadora de heme 1 HFE - Hemocromatose proteína humana HH – hemocromatose hereditária His - histidina HJV - hemojuvelina HLA – antígeno leucocitário humano HO – heme oxygenase IREG-1 – proteína transportadora de ferro 1 IRE-IRP – proteínas de ligação de elementos do ferro IST – índice saturação de transferrina Kb - quilobase KDa – quilodalton LEAP-1 - peptídeo antimicrobiano expresso hepático mcg/dL – micrograma por decilitro mg - miligrama mg/dL – miligrama por decilitro mg/L – miligrama por litro MgCl2 – cloreto de magnésio mm – milimetro mM – milimolar
MTP-1 – proteínas de transporte de metais NCBI - National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional de Biotecnologia de Informação) ng – nanograma ng/mL – nanograma por mililitro OMIN - compendio de genes humanos e fenótipos genéticos pb – par de bases PCR – reação em cadeia da polimerase PCR-RFLP – reação em cadeia da polimerase de polimorfismo de comprimento por fragmentos de restrição pg – picograma
pH – medida de pH (potencial de hidrogênio) pmol/µL – picomol por microlitro RDW – (Red Cell Distribution Width) índice que avalia variação de tamanho RNAm – RNA mensageiro SLC40A1 – gene que codifica a ferroportina SNP – (single nucleotide polymorphism): polimorfismo de nucleotídeo simples TfR – receptor da transferrina TfR2 - receptor da transferrina 2 Tris-HCl – tris(hidroximetil)aminometano Tyr - tirosina U/µL - unidades internacionais por microlitro VCM – volume corpuscular médio VHS – velocidade de hemossedimentação WT – forma selvagem µg/g – micrograma por grama µL – microlitro µM – micromolar
106/µL – milhões de células por microlitro
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 Hemocromatose
O ferro, além de atuar como um cofator em determinados sistemas
enzimáticos, é um elemento essencial em alguns processos fisiológicos do
organismo humano, incluindo transporte de oxigênio (hemoglobina e mioglobina),
na produção de energia oxidativa (citocromo, catalase e peroxidase), na respiração
mitocondrial (succinato desidrogenase), na inativação de radicais livres (xantina
oxidase) e síntese de DNA (ribonucleotídeo redutase). Embora possam ser
encontrados na natureza em vários estados oxidados, os estados com valências 2+
e 3+ são os de maior importância para os sistemas biológicos1,2,3,4,5.
A doença mais comum relacionada com o metabolismo deste metal é a
anemia por deficiência de ferro, que afeta 30% de toda a população mundial,
sendo, especialmente prevalente, nos países em desenvolvimento6,7. O outro
extremo desta condição se refere à sobrecarga de ferro no organismo, conhecida
como hemocromatose6,8.
O termo hemocromatose foi inicialmente utilizado para descrever as lesões
teciduais associadas ao excesso de ferro. Os órgãos alvo nos quais ocorre o
depósito de ferro são o fígado, o pâncreas, o coração e a hipófise. O excesso de
ferro nesses órgãos leva progressivamente a lesão celular e prejudica seu
funcionamento. A hemocromatose pode ter origem hereditária, quando é causada
por uma anomalia genética, ou secundária, quando é provocada por outra doença
ou por fatores ambientais8,9.
17
A quantidade de ferro no organismo depende da idade, sexo e estado
nutricional. O estoque de ferro no recém-nascido é limitado e aumenta
gradualmente ao longo da vida, durante o período de crescimento. Um homem
adulto possui cerca de 40 a 50 mg de ferro por quilograma de peso. Já as mulheres
em idade fértil possuem depósitos menores de ferro, devido às perdas menstruais,
gestação, lactação e uma menor massa muscular10.
A concentração de ferro encontra-se distribuída, em mais de dois terços, na
molécula de hemoglobina e, seu um terço restante, encontra-se estocada no fígado,
na mioglobina ou nos macrófagos do sistema reticuloendotelial. Apenas uma
pequena fração se encontra circulante no plasma ligado à transferrina11.
1.2 Histórico da Hemocromatose
Em 1865, na França, Trousseau apresentou a primeira referência de
hemocromatose em um paciente de 28 anos que apresentava manifestações
clínicas descritas como “tríade clássica” com diabetes mellitus grave, cirrose e
pigmentação bronze da pele12,13. Quase 25 anos depois, em 1889, na Alemanha,
von Recklinghausen14 (apud Souza13) foi o primeiro a utilizar o termo
hemocromatose, de origem grega que significa “haima” (sangue) e “chromatos”
(cor), após realizar autópsia num paciente com cirrose associada ao acúmulo de
ferro no fígado, pensando tratar-se de distúrbio hematológico que causava
pigmentação cutânea13,14. Entretanto, apenas em 1935, Sheldon em seu estudo
“Haemochromatosis” deduziu que esta doença decorreria de um distúrbio genético
do metabolismo do ferro e que todas suas manifestações eram devidas à
sobrecarga de depósito desse metal nos diversos órgãos13,15.
18
Em 1976, Simon et al. demonstraram a associação entre a hemocromatose
e o complexo de histocompatibilidade humano HLA-A3, localizado no braço curto
do cromossomo 6, determinando que esse gene era responsável pela doença13,15,
16,17,18,19.
Apesar do avanço nos estudos de Simon et al. o gene da hemocromatose
hereditária permaneceu indefinido até 1996, quando um grupo de pesquisadores
(Progenitor Inc.) o identificou precisamente, utilizando clonagem posicional, o gene
HLA-A3 encontrado no braço curto do cromossomo 6 foi rebatizado como HFE
(classical hereditary hemochromatosis gene). O gene interage com a microglobulina
beta-2, formando um polipeptídeo complexo Cys282Tyr e His63Asp16,17,18,20,21.
Em 1999, Kawabata et al. clonaram, sequenciaram e mapearam um gene
homólogo humano para TfR, denominado TfR2, que pode ser um segundo receptor
de transferrina a mediar o transporte de ferro intracelular. Contudo, dois transcritos
foram expressos a partir deste gene: α (~2.9 pares de kilobases), e β (-2,5 pares de
quilobases). A sequência de aminoácidos prevista revelou que a proteína TFR2-α
era uma proteína de membrana do tipo II e partilhou uma identidade de 45% e 66%
de semelhança no seu domínio extracelular com TfR. A proteína TFR2-β faltava à
porção amino-terminal da proteína TFR2-α incluindo o domínio transmembranar
putativo5,22.
Em 2001, dois estudos paralelos originaram a descoberta da hepcidina,
sendo um desenvolvido por Krause et al.23 que identificaram no ultrafiltrado de
sangue humano um novo peptídeo de 25 aminoácidos rico em cisteínas, com
propriedades antimicrobianas a que chamaram LEAP-1 (liver expressed
antimicrobial peptide); e outro por Park et al.24 que caracterizaram o mesmo
peptídeo na urina humana, denominando hepcidina, devido a síntese hepática (hep)
e ter atividade antimicrobiana (cidin). Nesse ano, Pigeon et al.25 demonstraram que
a produção do peptídeo era estimulada pela sobrecarga de ferro e, quase
19
simultaneamente, Nicolas et al.26,27,28 observaram que o silenciamento do gene da
hepcidina em ratos transgênicos, provocava um fenótipo de sobrecarga de ferro
semelhante à hemocromatose humana. No ano seguinte, estes mesmos autores
demonstraram que a expressão de hepcidina levava a uma deficiência grave de
ferro com anemia, confirmando-se assim o papel fundamental da hepcidina como
regulador dos níveis sistêmicos de ferro29.
Em 2004, Papanikolaou et al. 30 identificaram, por meio de análise de
transferência de Northern de tecidos humanos (fígado, coração e músculo
esquelético), o gene da hemojuvelina (HJV) dentro da região associada com
hemocromatose juvenil, no cromossoma 1q21 e denominaram de HFE2A. A
expressão da transcrição da hemojuvelina foi semelhante ao gene da hepcidina
(HAMP), uma proteína fundamental implicada no metabolismo do ferro30.
Em 2000, Donovan et al.31 identificaram o gene responsável pela exportação
de ferro na superfície basolateral usando clonagem posicional. O gene, ferroportin1,
expressa na superfície basolateral dos enterócitos no duodeno e exporta o ferro
celular na circulação. A função da Ferroportin1 pode ocasionar distúrbios como
deficiência ou sobrecarga de ferro31.
Bacon et al. em 1997, descrevem outras síndromes clínicas de sobrecarga
de ferro denominadas hemocromatose secundária, em que a excessiva absorção
do íon ferro depende de outras condições como: anemias por eritropoiese ineficaz,
hepatopatias, excessiva ingestão de ferro medicamentoso, transfusões de sangue,
injeções de ferro-dextran, sobrecarga neonatal de ferro, sobrecarga africana de
ferro (na qual existe fator genético não HLA ligado) e as sobrecargas de ferro dos
bebedores de cervejas caseiras32.
20
1.3 Epidemiologia
A Hemocromatose Hereditária (HH) afeta cerca de 0,25% indivíduos, e tem
uma frequência portadora estimada de 10% de ascendência do Norte da Europa,
resulta em disfunção de múltiplos órgãos causada pelo aumento da deposição de
ferro, e é tratável, se detectado precocemente13,33.
A mutação C282Y em homozigose é encontrada em mais de 80% a 90%
dos casos de Hemocromatose Hereditária na América do Norte e no norte da
Europa, respectivamente22,33,34,35.
A heterozigose composta (C282Y/H63D), ou homozigose H63D, é
responsável por pequeno percentual de casos de Hemocromatose Hereditária (1-
5%), sendo que na maioria das vezes, a sobrecarga de ferro é observada quando
essas mutações ocorrem em associação com outros fatores36,37.
Em caucasianos, o polimorfismo HFE é altamente prevalente, com
frequência alélica do C282Y de 10-12% e do H63D de 14-20%38,39,40. A frequência
de portadores da mutação C282Y no norte da Europa é de 15% em heterozigose e
de 0,5% em homozigose com diminuição da frequência no sul e leste da Europa; a
mutação H63D é mais comum, acometendo 15-40% da população europeia39.
Homozigotos para C282Y são encontrados na frequência de 0,4% brancos
caucasianos; entretanto, a doença completamente manifesta com lesão significativa
de órgãos é encontrada em menos de 10% desses indivíduos 27,28,41 (Tabela 1).
No Brasil, a prevalência é desconhecida, entretanto, em trabalhos realizados
em regiões do sudeste do País a prevalência de heterozigotos para C282Y foi de
1,2-2,8% e para H63D de 31,1-32,6%11,31. No estudo de Ferreira et al. mostra que a
prevalência da mutação C282Y estava presente em homozigose em 2,9% dos
indivíduos e 10,1% em heterozigose, enquanto a H63D estava presente em
homozigose em 4,3% e em heterozigose em 30,6% dos indivíduos estudados42.
21
Agostinho et al. avaliaram, no Brasil, as frequências das mutações C282Y
no gene HFE em 227 indivíduos: 71 caucasianos, 91 mestiços, 85 descendentes de
africanos e 75 índios parakanãs, confirmando que a frequencia do alelo Y é baixa
em negros e índios5.
A HH tipo 2 é uma doença rara (menos de 100 casos descritos) com uma
ampla distribuição geográfica. Ambos os sexos são igualmente afetados. Mutações
em HJV representam a maioria dos casos mundiais de hemocromatose juvenil, e
tem sido relatada em indivíduos do Norte-Europeu (incluindo Italiano, grego,
holandês, albanês, húngaro, romeno), americanos, australianos, japoneses,
chineses e franco-canadense de Saguenay-Lac-Saint-Jean. Há algumas mutações
HJV que apresenta uma frequência mais elevada na Itália e na Grécia. Foram
notificados um número muito menor de indivíduos italianos, gregos, árabes, e
portugueses com hemocromatose juvenil relacionada com HAMP43,44 (Tabela 1).
A hemocromatose tipo 3 é rara, com menos de 50 casos relartados na
literatura, sendo encontrada, principalmente, na população caucasiana, mas
também, descrita na Ásia. Atinge adultos de meia-idade, adolescentes e jovens
adultos (<30 anos de idade)33,44(Tabela 1).
A hemocromatose tipo 4 é uma forma de hemocromatose hereditária menos
rara do que as outras formas de HH (hemocromatose tipo 2 e 3), com menos de
200 casos relatados na literatura. Esta forma apresenta uma distribuição mundial,
ou seja, afeta ambos os sexos, caucasianos e não caucasianos e manifestando em
diferentes faixas etárias (10-80 anos de idade)44,45 (Tabela 1).
22
Tabela 1 - Principais características epidemiológica e molecular dos tipos de Hemocromatose Hereditária.
Tipo Clínico Tipo 1 Tipo 2 A Tipo 2 B Tipo 3 Tipo 4
Forma Clínica
HH Clássica HH Juvenil HH Juvenil HH Transferrina
HH Ferroportina
Gene Envolvido
HFE HJV HAMP TfR2 SLC40A1
Herança
Autossômica recessiva
Autossômica recessiva
Autossômica recessiva
Autossômica recessiva
Autossômica dominante
Idade de aparecimento de quadro clínico
40 a 60 anos 20 a 40 anos
20 a 40 anos
40 a 60 anos 40 a 60 anos
Frequência
Comum Rara Rara Rara Rara
Danos Teciduais
Diversificados Intensos Intensos Diversificados Baixos
HH: Hemocromatose Hereditária; HFE: gene da Hemocromatose Hereditária; HJV: gene da Hemojuvelina; HAMP: gene da hepcidina; TfR2: gene da Transferrina; SLC40A1: gene da Ferroportina. Fonte: Hemocromatosis: In: Online Mendelian Inheritance in Man; OMIM.
1.4 Proteínas que Regulam o Metabolismo do Ferro
1.4.1 HFE (Human Hemochromatosis Protein)
A proteína HFE é encontrada nos hepatócitos e enterócitos e sua função
está associada no metabolismo do ferro no organismo46.
O gene HFE foi descrito pela primeira vez por Feder em 1996. Na análise
citogenética o gene HFE está localizado no cromossomo 6p21.3 (Figura 1),
pertence ao complexo maior de histocompatibilidade e possui 6 éxons,
compreendendo aproximadamente 12kb de DNA. Várias mutações no gene HFE
têm sido identificadas, sendo as mais comuns a C282Y e a H63D47,48,49.
O gene HFE codifica uma proteína de 343 aminoácidos altamente expressa
nas células das criptas intestinais do duodeno, onde sua distribuição é perinuclear.
23
A interação da proteína HFE com o TfFR1 parece ter um importante papel na
regulação da absorção do ferro proveniente da dieta. Também, tem sido
demonstrado que a HFE inibe de maneira competitiva a ligação da transferrina ao
TfR1. A presença de HFE em células do sistema reticuloendotelial sugere que a
HFE pode modular o transporte e estoque de ferro nestas células41,50.
Figura 1- O gene HFE está localizado no braço curto do cromossoma 6 (p),
na posição 21.3. Fonte: OMIM44.
1.4.2 Hemojuvelina (HJV)
A HJV é uma molécula pertencente à família RGM (repulsive guidance
molecules) cuja expressão é restrita ao fígado, coração e músculo esquelético. O
gene da hemojuvelina, na análise citogenética, está localizado no cromossomo
1q21 (Figura 2), constituído por 4 éxons e constitui uma proteína de 426
aminoácidos44. Mutações no gene HJV estão relacionadas clinicamente com a
hemocromatose juvenil. Embora sua função precisa ainda seja desconhecida,
parece estar ligada à expressão de hepcidina. Baixos níveis urinários de hepcidina
têm sido observados em pacientes com mutação HJV34,43,48.
24
Figura 2 - O gene HJV está localizado no braço longo do cromossoma 1 (q), na posição 21.1. Fonte: OMIM44.
1.4.3 Hepcidina
A hepcidina é uma proteína sintetizada pelo gene HAMP ou LEAP1, na
análise citogenética, localizado no cromossomo 19q13 constituído de 3 éxons que
codifica um peptídeo de 84 aminoácidos (Figura 3). A proteína é expressa no
coração, cérebro e quase na sua totalidade pelo fígado, com propriedades
antimicrobianas, que recentemente foram associadas à regulação da homeostase
do ferro27,28,51. A expressão de hepcidina é regulada pelo nível de ferro corporal, por
processos inflamatórios e por hipóxia. Sua expressão está aumentada na
sobrecarga de ferro sugerindo uma resposta compensatória para limitar a absorção
intestinal de ferro. A sua administração exógena em camundongos inibe a absorção
intestinal de ferro51,52. Também tem sido observado que a hepcidina inibe a
liberação de ferro pelos macrófagos. Alguns autores postulam que a hepcidina seria
um regulador do estoque de ferro: uma proteína cuja síntese e secreção pelo fígado
ocorrem de acordo com o nível de estoque de ferro com a finalidade de sinalizar
enterócitos e macrófagos a alterar a absorção e o transporte intracelular do metal.
Quando a expressão hepática de hepcidina é alta, a absorção pelo duodeno e a
25
exportação de ferro pelos macrófagos é diminuída, e vice-versa. Níveis de
hepcidina são elevados na sobrecarga hepática de ferro e reduzidos na deficiência
de ferro. No entanto, níveis inapropriadamente baixos já foram observados em
pacientes e camundongos com HH, demonstrando perda de regulação do nível de
hepcidina nessa condição, apesar do alto nível de estoque de ferro53,54.
A ligação da hepcidina a ferroportina resulta em internalização e degradação
da FPN55. A interação hepcidina-FPN implica que quando os níveis de hepcidina
são baixos, como nos estados de depleção de ferro ou em alguns casos de HH, a
expressão de FPN e a liberação de ferro pelos macrófagos e células das criptas
intestinais estão aumentadas. O inverso também ocorre, há uma elevação dos
níveis de hepcidina, enquanto que a expressão de FPN e a liberação de ferro por
estas células estão diminuídas56.
Figura 3 - O gene HAMP está localizado no braço longo do cromossoma 19 (q), na posição 13.1. Fonte: OMIM44.
1.4.4 Receptor 1 da Transferrina (TfR1 = Transferrin Receptor 1)
O TfR1 foi identificado como um receptor específico para captar o ferro a
partir da transferrina. O gene TfR1, na análise citogenética, está localizado no
cromossomo 3q29, contém 19 éxons, 18 íntrons e 32kb, codificando uma proteína
26
com 760 aminoácidos. O TfR1 é uma glicoproteína que consiste de duas
subunidades idênticas de 90 kDa ligadas entre si por pontes dissulfídas. O TfR1 é
expresso na maioria das células, com exceção dos eritrócitos maduros. Sua
expressão é alta em proeritroblastos, no sinciciotrofoblasto placentário e em células
que se encontram em rápida proliferação. A síntese de TfR1 é estimulada quando
há um baixo nível intracelular de ferro e inibida quando o nível do ferro na célula
estiver alto35,50.
Quando a transferrina se liga ao receptor TfR1 presente na membrana dos
eritroblastos, o complexo transferrina-TfR1 é endocitado. No interior dos
endossomas ocorre queda do pH. Esta acidificação diminui a afinidade da
transferrina pelo ferro, liberando o ferro da transferrina. O complexo apotransferrina-
TFR1 é reciclado para a superfície da célula, sem degradação. Na superfície
celular, a apotransferrina é então liberada do TfR1. O ferro liberado para o citosol é
transportado para as mitocôndrias para ser acoplado à protoporfirina pela ação da
heme sintetase, e consequente formação do heme, ou então pode ser incorporado
a ferritina para permanecer sob a forma de estoque57.
1.4.5 Receptor 2 da Transferrina (TfR2 = Transferrin Receptor 2)
Em 1999, Kawabata et al. identificam e caracterizam um segundo receptor
humano para transferrina, o TfR2. O gene que expressa essa proteína, na análise
citogenética, está localizado no cromossomo 7q22 (Figura 4), apresenta 18 éxons e
codifica uma proteína de 355 aminoácidos22. É uma glicoproteína transmembrana
com alto grau de homologia com o TfR1. O TfR2 é predominantemente expresso no
fígado e se localiza primariamente na membrana basolateral dos hepatócitos. Sua
expressão também tem sido observada em células do baço, intestino, coração, rins,
27
testículos e em células hematopoéticas normais e leucêmicas. Assim como o TfR1,
a interação entre o TfR2 e a transferrina é dependente do pH. Entretanto,
diferentemente do TfR1, a expressão do TfR2 não é reciprocamente regulada em
resposta ao nível de ferro no plasma. Ao invés disto, sua expressão é regulada pelo
nível de saturação da transferrina58. Em situações normais ou de sobrecarga de
ferro, a expressão de TfR2 nos hepatócitos excede a de TfR1 sugerindo que o TfR2
desempenha um importante papel na sobrecarga hepática de ferro em pacientes
com HH59.
Figura 4 - O gene TfR2 está localizado no braço longo do cromossoma 7 (q), na
posição 22. Fonte: OMIM44.
1.4.6 Ferroportina (FPN)
A proteína transportadora que exporta ferro das células tem sido identificada
e caracterizada. Esta proteína foi clonada quase ao mesmo tempo por três
laboratórios diferentes e independentes, usando técnicas diferentes. Por isso
recebeu três nomenclaturas diferentes: Ferroportina (FPN), Iron-Regulated
Transponder 1 (IREG1) e Metal Transport Protein 1 (MTP1), mas também pode ser
denominada de SLC40A1 e SLC11A3. Neste texto, o exportador celular do ferro
28
será sempre referido como ferroportina. A ferroportina é o único mecanismo
exportador de ferro do interior da célula conhecido até o momento e é expressa na
membrana basolateral dos enterócitos, nos macrófagos do fígado, baço e medula
óssea, nas células de Kupffer hepáticas e nos hepatócitos dos capilares
sinusóides60,61,62.
O gene FPN, na análise citogenética, está localizado no cromossomo 2q32,
contém 8 éxons e 20 kb (Figura 5). Ele codifica uma proteína de 571 aminoácidos
de aproximadamente 62kDa e contém 9-10 domínios transmembrana com o
terminal amino da proteína (N-terminal) voltado para o lado intracelular da
membrana31.
A FPN é o receptor para hepcidina, um hormônio produzido pelo fígado em
resposta ao aumento do conteúdo intracelular de ferro. Aumento da expressão de
FPN resulta em aumento da liberação celular tanto do ferro localizado no citosol
quanto do ferro estocado na célula sob a forma de ferritina. A liberação da
hepcidina leva a diminuição intracelular do metal. O mecanismo preciso pelo qual a
FPN media a exportação celular do ferro ainda não está totalmente elucidado63.
Estudos genéticos em pacientes revelaram que mutações no gene FPN
levam a retenção de ferro, especialmente nos macrófagos do sistema
reticuloendotelial, reafirmando seu papel na exportação de ferro intracelular64,65,66,67.
Figura 5 - O gene SLC40A1 está localizado no braço longo do cromossoma 2 (q), na posição 32. Fonte: OMIM44.
29
1.5 Metabolismo do Ferro
1.5.1 Absorção de Ferro
O ferro é um mineral vital para a homeostase celular. É essencial para o
transporte de oxigênio, para a síntese de DNA e metabolismo energético. É um
cofator importante para enzimas da cadeia respiratória mitocondrial e na fixação do
nitrogênio. Nos mamíferos é utilizado principalmente na síntese da hemoglobina
(Hb) nos eritroblastos, da mioglobina nos músculos e dos citocromos no fígado2,5.
O ferro utilizado pelo organismo pode ser obtido de duas fontes: dieta e da
reciclagem das hemácias senescentes1,2.
Em adultos normais, a quantidade de ferro absorvida diariamente equivale à
quantidade excretada. Aproximadamente 1-2 mg de ferro entram e saem do
organismo a cada dia, e a quantidade de ferro absorvida é regulada pela
necessidade do organismo. A aquisição na forma heme equivale a 1/3 do total,
provenientes da quebra da hemoglobina mioglobina1,2,68,69.
O ferro da dieta pode se apresentar de duas formas: o ferro hemínico,
proveniente de alimentos à base de carne animal e o ferro não hemínico, também
denominado de ferro inorgânico, proveniente de alimentos de origem vegetal e
grãos e é encontrado na forma férrica (Fe3+)1,2 (Figura 6). Uma vez que o organismo
não tem nenhum mecanismo eficaz de excreção do ferro, a regulação da sua
absorção pelo epitélio intestinal é fundamental para a manutenção da homeostase
do ferro1,2,69.
A absorção intestinal é favorecida por alguns fatores como a acidez e a
presença de agentes solubilizantes como os açúcares1,2.
30
Figura 6 - Homeostase sistêmico de ferro no organismo. Fonte: Adaptado de Hentze et al69.
O ferro é absorvido pela borda em escova das células epiteliais dos vilos
intestinais, ao nível do duodeno e jejuno proximal. O ferro não hemínico pode ser
absorvido sob a forma férrica (Fe3+) ou ferrosa (Fe2+); no entanto, como a forma
ferrosa é absorvida mais eficientemente, na borda em escova das células
intestinais, uma redutase férrica transmembrana converte o ferro férrico em ferro
ferroso. A partir da dieta, o átomo de ferro precisa atravessar duas membranas da
célula epitelial intestinal para atingir o plasma: a membrana apical e a membrana
basolateral. Um transportador chamado DMT1 (divalent metal transporter 1), o qual
é acoplado à redutase férrica, facilita a passagem do ferro não hemínico do lúmen
intestinal para o citoplasma do enterócito. O DMT1 não é específico para o ferro e
também facilita a absorção do cobalto, manganês, cobre, zinco, etc1,2.
31
As hemácias senescentes representam uma fonte importante de ferro, pois
dois terços do ferro total no organismo se encontram na forma de hemoglobina. A
degradação da hemoglobina no interior dos macrófagos é seguida pela liberação de
uma parte proteica da hemoglobina (cadeia globínica), o heme será degradado e o
ferro que será reutilizado na síntese de novas proteínas1,2,69.
Já o ferro hemínico é absorvido através de um receptor do heme também
presente na borda da célula intestinal (HCP1). Uma vez internalizado no enterócito,
o ferro é liberado do heme pela enzima heme oxigenase (HO). O ferro livre no
citoplasma do enterócito segue o mesmo trajeto, independente se é proveniente do
ferro hemínico ou do ferro não hemínico inorgânico 1,2,5,70,71.
No citoplasma do enterócito, o ferro pode seguir dois caminhos: ou ser
armazenado sob a forma de ferritina ou atravessar a membrana basolateral e
chegar até o plasma. Assim que o ferro na sua forma ferrosa atravessa a
membrana plasmática, é capturado pela hefestina que o oxida para sua forma
férrica. Nesta forma o ferro pode se ligar a transferrina plasmática e ser
transportado. O ferro que não é oxidado pela Hefaestina pode ser feito por outra
ferroxidase plasmática chamada ceruloplasmina. Esta liberação do ferro através da
membrana basolateral é facilitada por outra proteína transmembrana considerada
um exportador do ferro chamado ferroportina (FPN). Este transportador age
acoplado a hefestina, a qual oxida o ferro da forma ferrosa (2+) para a forma férrica
(3+). O ferro então se liga à transferrina e é transportado pelo plasma (Figura 7). O
átomo de ferro que não ultrapassa a membrana basolateral da célula para atingir o
plasma permanecerá estocado no enterócito ligado a ferritina, e acompanhará o
ciclo de vida da célula sendo perdido na descamação do epitélio intestinal. Este é
um importante mecanismo de perda de ferro1,2,6,31,57,70,71,72.
32
A absorção de ferro é regulada por três mecanismos: 1) bloqueio mucoso:
nas células das criptas, o complexo formado pela proteína HFE e o receptor 1 da
transferrina (HFE-TfR1) parecem modular a capacidade absortiva do enterócitos, de
forma que, quando a quantidade de ferritina dos enterócitos está elevada, o
complexo HFE-TfR1 inibe a absorção de ferro pelas células intestinal. Este
fenômeno é conhecido como bloqueio mucoso; 2) bloqueio causado pelo estoque
de ferro: estados de sobrecarga de ferro levam à diminuição da absorção intestinal
e inversamente, estados de ferropenia, aumentam a absorção de ferro e 3)
mecanismo hematopoético: modula a absorção de acordo com as necessidades da
eritropoese provavelmente através de um sinalizador solúvel transportado pelo
plasma da medula óssea para o intestino1,2,73.
Figura 7 - Metabolismo do ferro: enterócito e proteínas envolvidas na absorção de
ferro. Dcytb: ferroredutase; DMT-1: transportador de metal divalente-1;
HCP-1: proteína transportadora do heme-1; Nu: núcleo; HFE: proteína
da hemocromatose; TfR: receptor de transferrina (Grotto1).
33
Além desses mecanismos fisiológicos de controle, a absorção de ferro é
retardada na presença de fitatos, oxalatos e fostatos e facilitada na presença de
hidroquinonas, ácido ascórbico, sorbitol, cisteína, lactato, piruvato e frutose1,2,72.
1.5.2 Transporte do Ferro
Em indivíduos normais, virtualmente todo o transporte do ferro plasmático
entre os sítios de absorção, estoque e utilização são realizados pela transferrina. A
transferrina oferta quase todo o ferro necessário para os processos celulares do
organismo1,2,6.
A transferrina é uma glicoproteína de 80 kDa sintetizada primariamente pelo
fígado e em menor parte pelo cérebro, testículos e glândulas mamárias. A molécula
consiste de uma única cadeia polipeptídica com capacidade de se ligar a dois
átomos de ferro, conseguindo transportar até 12 mg de ferro, mas em geral, apenas
3 mg de ferro é ligada. A capacidade de ligação da transferrina ao ferro é pH
dependente de maneira que a afinidade da transferrina pelo ferro diminui com a
queda do pH. A transferrina está presente no plasma nas seguintes formas:
apotransferrina (livre de ferro), transferrina monoférrica (apenas um átomo de ferro
ligado) e transferrina diférrica (com dois átomos de ferro ligado)1,2,6.
A concentração plasmática normal da transferrina varia de 22-35 uM e 20-
50% está ocupada pelo ferro. A saturação incompleta dos sítios da transferrina
circulante oferece uma segurança contra um possível aumento agudo do nível
plasmático de ferro, que pode ocorrer em determinados estados patológicos,
funcionando como um sistema tampão para o ferro1,2.
34
1.5.3 Estoque de Ferro
O fígado, mais especificamente o hepatócito, é o principal sítio de depósito e
estoque do ferro no organismo. Quando o estoque de ferro está repleto, os
macrófagos do fígado, baço e medula óssea também passam a estocar ferro
captado por fagocitose de eritrócitos senescentes. O estoque de ferro presente nos
hepatócitos e macrófagos podem ser mobilizados para utilização na eritropoese e
no metabolismo celular1,2,6.
A maior parte do ferro estocado no fígado está incorporada a ferritina ou a
hemossiderina (aproximadamente 80%)1,2.
A ferritina é uma molécula solúvel em água, composta de 24 subunidades as
quais formam uma estrutura esférica capaz de armazenar até 4500 átomos de
ferro. As subunidades podem ser de duas isoformas: uma subunidade pesada
(heavy) de 21 kDa e uma leve (light) de 19 kDa. A síntese de ferritina é induzida
quando o nível de ferro intracelular é alto e bloqueado quando o nível de ferro
intracelular for baixo. Esta regulação da síntese de ferritina de acordo com o nível
intracelular de ferro é mediada por uma proteína chamada element-iron regulatory
protein (IRE-IRP)1,2,57,70.
Em contraste, a hemossiderina é uma molécula insolúvel em água,
usualmente encontrada no baço, medula óssea e células de Kupffer. Tanto a
ferritina quanto a hemossiderina estão aumentadas na HH e na talassemia. O ferro
estocado pela hemossiderina é mais inacessível e menos eficaz em produzir
radicais livres do que o ferro estoque na ferritina1,2.
35
1.6 Patogenia
1.6.1 Sobrecarga de ferro
A sobrecarga de ferro pode ser classificada em hereditária ou secundária.
Na hereditária estão incluídas as alterações em genes de proteínas relacionadas à
homeostase do ferro no organismo. É o que se observa nos pacientes com
hemocromatose hereditária (HH), os quais apresentam aumento inapropriado da
absorção intestinal de ferro, na maioria das vezes, associado à mutação no gene
HFE5,74.
A sobrecarga de ferro secundária está associada às doenças congênitas ou
adquiridas: como doenças hepáticas, anemia hemolítica e/ou eritropoese ineficaz
que requerem múltiplas transfusões de hemácias5.
A gravidade do acúmulo do ferro depende da importância específica da
proteína reguladora comprometida. A proteína HFE é uma proteína que interage
com o receptor 1 da transferrina, mediando a captação do ferro ligado à transferrina
pela maioria das células. A mutação C282Y causa ruptura na ponte dissulfeto da
proteína HFE, diminuindo sua afinidade pela ligação com a β2 microglobulina e
interferindo na interação com o receptor 1 da transferrina. O TfR2 é o mediador da
captação do ferro ligado à transferrina nos hepatócitos, esse interage com a HFE
formando um complexo, que pode modular a expressão da hepcidina em resposta
aos níveis de ferro sanguíneos. A mutação H63D não interfere na interação da
proteína HFE e o receptor 1 da transferrina21,50,75.
A HJV tem importante papel na regulação da síntese da hepcidina. A
hepcidina é o principal regulador do transporte de ferro pelo intestino delgado e
36
macrófagos, se liga a ferroportina, internalizando-a e degradando-a, diminuindo sua
expressão inibindo a mobilização de ferro dos enterócitos e macrófagos para o
sangue. Quando o ferro é necessário para a síntese de hemoglobina na medula
óssea, a produção da hepcidina é reduzida, a ferroportina é reexpressa na
superfície celular e o ferro é exportado para a circulação, mantendo o ferro
circulante em níveis adequados para eritropoiese (Figura 8)46,55,56,76.
A perda de uma das proteínas reguladoras resulta em aumento da liberação
do ferro das células para o sangue; entretanto, as outras proteínas mantêm a
síntese de hepcidina, embora em taxa menor, e o acúmulo nos parênquimas dos
tecidos será gradual44,46,55,56,76.
Figura 8 - A hepcidina se liga a ferroportina e leva a sua degradação. No enterócito, o ferro não é transportado para o exterior da célula, e a absorção é inibida (figura a esquerda). No macrófago, o ferro fica acumulado no seu interior, diminuindo o ferro disponível para a eritropoiese (figura a direita) (Grotto2).
37
O fenótipo de HH manifestada em adultos apresenta sobrecarga de ferro
mais leve quando relacionada com as mutações nos genes da HFE e TfR2. Na
perda da HJV a sobrecarga de ferro é mais grave, sendo semelhante àquela da
perda da hepcidina, e o fenótipo de sobrecarga de ferro é mais grave na HH juvenil.
Nos casos de mutação na hepcidina, a sobrecarga de ferro é ainda mais intensa.
Fenótipos de grave sobrecarga de ferro também podem ser observados quando
ocorre perda concomitante da regulação de duas proteínas, HFE e TfR2,
manifestando-se como formas graves de hemocromatose. As situações em que a
expressão da hepcidina é normal, com ocorrência de mutações na ferroportina,
podem ser caracterizadas como “resistência à hepcidina” com fenótipo de
hemocromatose clássica44,46,55,56,76.
Na hemocromatose, a idade de manifestação e a rapidez da evolução
clínica dependem da magnitude da saturação de ferro na circulação. Mutações em
HFE estão associadas a uma saturação gradual com longa fase assintomática, com
quantidades pequenas de ferro (0-5g). Em um segundo estágio, com o progressivo
acúmulo de ferro nas células parenquimatosas (10-20g), há uma produção de
radicais livres, que danificam as estruturas intracelulares. Quando a quantidade de
ferro atinge 20g ocorre lesão dos órgãos, geralmente após os 40 anos de idade
com risco de óbito39.
Nas formas mais graves de hemocromatose, o acúmulo de ferro no sangue
é precoce (Figura 9), e resultado de mutações em outros genes, como o HAMP,
HJV, TfR2 e FPN. Na hemocromatose clássica, causada por mutações em HFE, o
acúmulo de ferro se dá ao longo dos anos, com dano progressivo a órgãos vitais39.
38
Figura 9 - Tipos de hemocromatose hereditária e evolução clínica39.
1.7 Hemocromatose Hereditária (HH)
A hemocromatose é um distúrbio metabólico genético ocasionado pelo
depósito excessivo de ferro em células de diversos órgãos do corpo humano, sendo
o fígado o mais comprometido, a maioria dos portadores da doença apresenta pele
bronzeada, decorrente da deposição de pigmentos que contêm ferro11.
A classificação dos tipos de hereditárias de hemocromatose pode ser visualizada
na tabela 2.
39
Tabela 2 - Classificação Molecular da Hemocromatose Hereditária
Tipos HH
Gene Exons Proteína Cromossomo (Posição)
Referência
1
HFE
7
HFE
348
aminoácidos
6 (6p21.3)
Feder et al., 1996
2A
HJV
4
Hemojuvelina
426
aminoácidos
1 (1q21)
Papanikolaou et al., 2004
2B
HAMP
3
Hepcidina
84
aminoácidos
19 (19q13)
Park et al., 2001
3
TfR2
18
Receptor 2 da Transferrina
355
aminoácidos
7 (7q22)
Kawabata et al., 1999
4
SLC40A1
8
Ferroportina
571
aminoácidos
2 (2q32)
Donovan et al., 2000
HFE: gene da Hemocromatose Hereditária clássica; HJV: gene da Hemojuvelina; HAMP:
gene da hepcidina; TfR2: gene receptor da transferrina; SC40A1: gene da ferroporetina5.
40
1.7.1 Hemocromatose Hereditária HFE
A Hemocromatose tipo 1 é a mais clássica e comum das hemocromatoses
primárias. É uma doença autossômica recessiva que resulta na sobrecarga de ferro
e disfunção de vários órgãos. O gene HFE foi identificado no cromossoma 6 por
Feder em 199647. Dos indivíduos afetados, 90-95% são homozigotos para uma
mutação no gene HFE que resulta na substituição de tirosina por cistina na posição
282 (C282Y). Outra mutação também comum é a substituição de aspartato por
histidina no aminoácido 63 (H63D)36. Esta mutação pode contribuir para aumento
da quantidade de ferro no organismo, mas sua presença isolada raramente leva a
sobrecarga importante de ferro, somente quando há concomitância da mutação
C282Y (heterozigose composta. Outra mutação não tão frequente no gene HFE,
S65C, resulta na substituição da serina por cisteína na posição 65, também pode
levar à discreta sobrecarga de ferro no paciente34,48,49,77,78,79.
A mutação C282Y resulta na diminuição da afinidade da HFE pela β2
microglobulina, com consequente diminuição da sua expressão. Isto resulta em
redução na captação do ferro ligado à transferrina pelas células das criptas
duodenais. Apesar do aumento do ferro corporal total, isto levaria as células
duodenais a uma “falsa” impressão de deficiência de ferro, acarretando em
aumento da absorção de ferro e do fluxo de ferro do enterócito para a
circulação34,48,79.
41
1.7.2 Hemocromatose Hereditária não-HFE
Hemocromatose não-HFE é um termo utilizado para definir toas às formas
de hemocromatose hereditária não relacionada com mutação no gene HFE. Inclui
os tipos 2A, 2B, 3 e 4 das HH. São doenças raras e por isso não são pesquisadas
rotineiramente. Somente devem ser consideradas quando HH não pode ser
explicada por mutações no gene HFE34,62.
O tipo II ou hemocromatose juvenil é uma forma rara, autossômica
recessiva, em que a sobrecarga de ferro ocorre já a partir da segunda ou terceira
décadas de vida. Mutações nos genes da hepcidina ou da hemojuvelina já foram
observadas em pacientes com HH do tipo II30,31,62,80.
A hemocromatose tipo III foi à segunda forma de hemocromatose
caracterizada a nível molecular. Trata-se de uma mutação no gene TfR2, sua
herança é autossômica recessiva e é similar à HH HFE em termos de
anormalidades dos parâmetros laboratoriais, apresentação clínica, complicações e
estoque hepático de ferro24,34,30,62,80,81.
A doença da ferroportina, impropriamente chamada de HH tipo 4, tem
herança autossômica dominante e é causada por mutação no gene SLC40A1, que
codifica a ferroportina, exportador de ferro da célula. A primeira mutação foi
relatada por um grupo italiano em uma família com HH de traço autossômico
dominante. Apresenta algumas diferenças clínicas e laboratoriais em relação aos
outros tipos de HH: tem saturação de transferrina normal ou baixa, o acúmulo de
ferro é preferencial nos macrófagos do sistema retículo endotelial e menor nos
hepatócitos e é comum a ausência de complicações
clínicas30,34,48,60,61,62,82,83,84,85,86,87,88.
42
A doença é fenotipicamente heterogénea com dois subtipos. A forma A da
doença da ferroportina é a forma comum e é geralmente assintomática sem danos
nos tecidos e sem outras complicações. Com a idade, podem ocorrer danos no
fígado, que em alguns casos podem levar a fibrose. A forma B da ferroportina é
mais rara e assemelha-se à hemocromatose tipo 1, e também, pode afetar
crianças66,85,86,87,88.
A forma A da doença da ferroportina apresenta níveis elevados de ferritina
sérica associados à saturação da transferrina normal ou baixa e acumulação de
ferro nos macrófagos hepáticos (células de Kupffer) e esplênicos66,85,86,87,88.
A forma B da doença da ferroportina apresenta saturação da transferrina
elevada associada a acúmulo de ferro nos tecidos, preferencialmente dentro dos
hepatócitos66,85,86,87,88.
1.8 Hemocromatose Adquirida (Secundária)
A forma adquirida da doença pode ser ocasionada por sobrecarga de ferro
decorrente de transfusões sanguíneas associadas a algumas doenças, entre elas:
talassemia alfa e beta, síndrome mielodisplásica, anemia sideroblástica e anemias
hemolíticas. Também a ingestão excessiva de ferro, alcoolismo, infecção pelo vírus
da hepatite C, esteato-hepatite não-alcoólica e doença hepática crônica estão
associadas à presença de hemocromatose9,33 (Tabela 3).
43
Tabela 3 - Principais causas de hemocromatose adquirida (secundária)
Na hemocromatose secundária, as principais causas são os distúrbios
associados à eritropoiese ineficaz, como forma severa as hemoglobinopatias como
a talassemia maior, anemia falciforme, síndromes mielodisplásicas e anemia
megaloblástica. Nas hemoglobinopatias, o excesso de ferro resulta da destruição
crônica de hemácias, que libera a hemoglobina rica em ferro no sangue, e
consequentemente, há acúmulo de ferro em órgãos-alvo. Infelizmente, muitas
vezes portadores de anemias hereditárias desenvolvem hemocromatose pelo
próprio mecanismo da anemia, pela necessidade de transfusões para controlá-la, e
ainda por fazer uso de complementos de ferro, devido tratamento errôneo de
anemia. Outra causa estatisticamente significativa é a administração excessiva de
ferro, seja pela necessidade de múltiplas transfusões sanguíneas ou por
medicação9,13,32,33.
A sobrecarga transfusional de ferro causa dano a esses órgãos e também
acúmulo de ferro nos macrófagos do sistema reticuloendotelial. Transfusões
sanguíneas isoladas quando administradas repetidamente durante um período de
anos, pode provocar hemossiderose sistêmica e lesão de órgãos
parenquimatosos9,33. Ainda a sobrecarga de ferro parenteral também está
associada à hemodiálise de longa duração, leucemias, sobrecarga de ferro africana
(siderose dos Bantu), porfiria cutânea tardia e hemocromatose neonatal9,13,32,33.
Causas de Hemocromatose Adquirida (secundária)
Anemias
Talassemia major , anemia hemolítica crônica, anemia sideroblástica, anemia aplásica
Sobrecarga de ferro parenteral
Transfusões de hemácias, administração de ferro, hemodiálise crônica
Sobrecarga de ferro associada às doenças hepáticas crônicas
Porfiria cutânia tardia, hepatites virais,
doença hepática alcoólica, esteato hepatite não alcoólica
44
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 OBJETIVOS
O objetivo deste estudo foi descrever as variantes do gene SLC401 em uma
série de casos de pacientes em seguimento no ambulatório de Hematologia do
Hospital das Clínicas da FMUSP com hemocromatose hereditária e adquirida e
verificar se estas variantes poderiam estar associadas a um pior quadro de
hemocromatose.
45
2.2 CASUÍSITICA E MÉTODOS
2.2.1 Casuística
No período de 2008 a 2011 foram coletadas 54 amostras de pacientes com
diagnóstico prévio de hemocromatose, acompanhados no ambulatório de anemias
do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Os pacientes foram separados, de acordo com a suspeita clínica, em dois
grupos:
a) 38 pacientes com Hemocromatose Hereditária;
b) 16 pacientes com Hemocromatose Adquirida (secundária).
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo - HCFMUSP (CAPPesqCEP) sob o nº 0116/08.
2.2.2 Métodos
2.2.2.1 Extração do DNA
O DNA foi extraído das amostras de sangue periférico utilizando-se o kit
Qiamp Blood® (Qiagen GmbH®, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções
dos fabricantes. A lise por detergente foi realizada na presença da proteinase K por
10 minutos a 56º C. O material lisado foi aplicado em uma coluna de gel de sílica e
lavado por duas vezes. O DNA purificado foi eluído de uma coluna em 200µL Tris-
HCL (10 mM, pH 8,0) e armazenado a –20 º C antes da amplificação por PCR.
46
2.2.2.2 Amplificação do DNA
2.2.2.2.1 Gene HFE
A amplificação do DNA dos pacientes foi realizada para amplificar as
mutações C282Y e H63D do gene HFE, por meio da técnica de PCR-RFLP descrito
por Bittencourt et al.89.
Para a reação de PCR da região C282Y (400pb) os reagentes utilizados foram:
22,7µL de água deionizada ultrapura; 3,0µL tampão de reação 10x (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 1,2µL MgCL2 50mM
(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 0,6µL
solução de deoxiribonucleotídeo trifosfato dNTPs 2,5mM (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 0,15 µL (10 µM) de cada
primer específico para amplificação do éxon 4: C282Y 1: 5
'TGGCAAGGGTAAACAGATCC 3' e C282Y 2: 5 'CTCAGGCACTCCTCTCAACC 3'
(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 0,2µL Taq
Polimerase 5U/µL (Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados
Unidos); 2,0 µL amostra de DNA extraído na quantidade de 500ng, num volume
final de 30 µL. A amplificação foi realizada num termociclador Eppendorf
Mastercycler DNA Engine Thermal Cycler PCR® (Eppendorf, Hamburg, Alemanha)
na seguinte condição: 94°C por 5 minutos, 35 ciclos de 94°C por 20 segundos e
60°C por 20 segundos e 72°C por 20 segundos e uma extensão final de 72°C por 6
minutos.
Para a reação de PCR da região H63D (200pb) os reagentes utilizados foram: 19,0
µL de água deionizada ultrapura; 3,0µL tampão de reação 10x (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 1,2µL MgCL2 50mM
(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 0,6µL
47
solução de deoxiribonucleotídeo trifosfato dNTPs 2,5mM (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 2,0µL 10 µM de cada primer
específico para amplificação do éxon 2: H63D 1: 5'ACATGGTTAAGGCCTGTTGC3'
e H63D 2 5'GCCACATCTGGCTTGAAATT3' (Invitrogen®, Life Technologies,
Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 0,2µL Taq Polimerase 5U/µL (Invitrogen®,
Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 2,0µL amostra de DNA
extraído na quantidade de 500ng, num volume final de 30 µL. A amplificação foi
realizada num termociclador Eppendorf Mastercycler DNA Engine Thermal Cycler
PCR® (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) na seguinte condição: 94°C por 5 minutos,
40 ciclos de 94°C por 20 segundos e 54°C por 20 segundos e 72°C por 20
segundos e uma extensão final de 72°C por 6 minutos.
Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 2% contendo 50 ng
de brometo de etídio/mL após eletroforese no fotodocumentador Eagle Eye II
(Stratagene, La Jolla, Califórnia, USA).
2.2.2.3 Digestão do DNA amplificado com enzima de restrição
O DNA amplificado para as mutações C282Y e H63D do gene HFE foi
submetido à digestão enzimática. Para a mutação C282Y foi utilizada a enzima
SnaBI® 5000U/mL (New England Biolabs Inc, Ipswich, Massachusetts, Estados
Unidos): 2,5µL de tampão da enzima Y (50 mM acetato de potássio, 20 mM Tris-
acetato, 10 mM acetato de magnésio e 100 μg/mL soro albumina bovina, pH 7,9)
0,5µL da enzima de restrição SnaBI (clivagem
5’...TACGTA...3’/3’...ATGCAT...5’), 12µL água deionizada ultrapura e 5,0µL de
produto amplificado, e incubado a 37°C por 2h. Para a mutação H63D foi utilizada
a enzima BclI® 10000U/mL (New England Biolabs Inc, Ipswich, Massachusetts,
48
Estados Unidos): 2,5µL de tampão da enzima G (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10
mM MgCl2, 100 μg/ml soro albumina bovina, pH 7,9), 12,2µL água deionizada
ultrapura, 0,3µL Bcl I (clivagem 5’...TGATCA...3’/3’...ACTAGT5’), 5,0µL de
produto amplificado, e incubado a 50°C por 2h. Os produtos de PCR fragmentados
foram visualizados em gel de agarose a 3% contendo 50 ng de brometo de
etídio/mL após electroforese no fotodocumentador Eagle Eye II (Stratagene, La
Jolla, Califórnia, Estados Unidos). A interpretação técnica para identificar a mutação
C282Y foi normal: visualização de 1 fragmento de 400 pb; homozigoto: visualização
de 2 fragmentos de 290 e 110 pb; heterozigoto: visualização de 3 fragmentos de
400, 290 e 110 pb. Para a mutação H63D foi normal: visualização de 2 fragmentos
de 153 e 55 pb; homozigoto: visualização de 1 fragmento: 208 pb; heterozigoto:
visualização de 3 fragmentos de 208, 153 e 55 pb.
2.2.2.4 PCR para amplificação do gene SLC40A1
As condições da reação em cadeia da polimerase foram padronizadas de
acordo com Wakusawa 90.
Para a reação de PCR para o gene SLC40A1 os reagentes utilizados foram: 37,7µL
de água deionizada ultrapura; 5,0µL tampão de reação 10x (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 1,5µL MgCL2 50mM
(Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 1,5µL
solução de deoxiribonucleotídeo trifosfato dNTPs 2,5mM (Invitrogen®, Life
Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 1,0µL (10 µM) de cada par de
primers descritos na tabela 1 (Invitrogen®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia,
Estados Unidos); 0,3µL Taq Polimerase 5U/µL (Invitrogen®, Life Technologies,
Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos); 2,0µL amostra de DNA extraído na
concentração de 500ng, num volume final de 50 µL. A amplificação foi realizada
49
num termociclador Eppendorf Mastercycler DNA Engine Thermal Cycler PCR®
Eppendorf, Hamburg, Alemanha) na seguinte condição: 95°C por 10 minutos, 35
ciclos de 95°C por 30 segundos, temperatura de anelamento (vide tabela 4), 72°C
por 60 segundos e uma extensão final de 72°C por 5 minutos.
Na análise molecular do gene SLC40A1, região do éxon 6, foi utilizado 20
doadores de sangue para verificar se havia similaridade da frequência de
polimorfismos entre pacientes do estudo e os doadores de sangue.
Tabela 4 - Sequência de primers utilizados na amplificação e reação de
sequenciamento do gene SLC40A1.
Exons PCR - Primers Temperatura de
Anelamento (º C)
Tamanho do Fragmento
(pb)
1 F 5’- ATAGCAGCCGCAGAAGAGCCAGCG - 3’ R 5’- GTAGAGTTGCTTGTCTCCAAAGC - 3’
62 149
2 F 5’- ATGTACGTGGTTTGTCCTGCAAAG - 3’ R 5’- GGCTTAATACAACTGGCTAGAACG - 3’
60 277
3 F 5’- CATTTTCTCTTTTCATTT - 3’ R 5’- TTAATTATATAACAACAC - 3’
40 203
4 F 5’- GAGACATTTTGATGTAATGTACAC - 3’ R 5’- CTACCAGATATTCAATTTTCTGCC - 3’
58 210
5 F 5’- CCACCAAAGACTATTTTAAACTGC - 3’ R 5’- TCACCACCGATTTAAAGTGAATCC - 3’
62 283
6 F 5’- GATGGGTTTGCACACTTACCTGCC - 3’ R 5’- AGGTCTGAACATGAGAACAAAAGG - 3’
62 337
7 - I F 5’- GGCTTTTATTTCTACATGTCCTCC - 3’ R 5’- GCTTCCAGGCATGAATACAGAG - 3’
58 483
7 - II F 5’- CTGGAATAATGGGAACTGTAGC - 3’ R 5’- GGATTCTCTGAACCTACATTACA - 3’
57 415
8 F 5’- CTGTGATTTGAAATGTATGCCTG - 3’ R 5’ - TCTAGTAACAGGATAGCAACAGT - 3’
57 409
pb = pares de base.
50
2.2.2.5 Purificação das Amostras de PCR para Reação de Sequenciamento
Os produtos da reação de PCR das amostras para cada éxon do gene
SLC40A1 foram purificados de acordo com o protocolo do fabricante do kit
QIAquick PCR Purification® (Qiagen GmbH®, Hilden, Alemanha).
2.2.2.6 Reação de Sequenciamento
A reação de sequenciamento foi realizada segundo as instruções de uso do
fabricante do “kit” ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction® (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados
Unidos) sequenciado no aparelho Genetic Analyzer ABI 3100® (Applied
Biosystems®, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos).
2.2.2.7 Genotipagem
As sequências foram analisadas utilizando-se o programa SEQUENCHER
3.0 DNA Sequencing Software® (Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos). A
sequência genômica sem mutação dos éxons do gene SLC40A1 (NX_Q9NP59) foi
obtida de banco de dados genômicos nextprot.org e GenBank (Gene ID: 30061 -
National Center for Biotechnology Information - NCBI- Bethesda, Maryland, Estados
Unidos).
51
2.2.2.8 Método estatístico As análises estatísticas foram realizadas utilizando os programas GraphPad
Prism®. versão 6.0 (San Diego, Califórnia, Estados Unidos) e Excel versão Office
2010® (Redmond, Washington, Estados Unidos), utilizando os testes de t-Student
não pareados, Chi-quadrado e Fischer para avaliar os dados epidemiológicos e
clinico-laboratoriais.
52
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Descrições dos Casos de Pacientes com Hemocromatose Hereditária
e Adquirida (secundária)
Os pacientes estudados foram separados em grupos de acordo com a
suspeita clínica. Entre os grupos 70% (38/54) apresentaram suspeita clínica de
hemocromatose hereditária e 30% (16/54) hemocromatose adquirida (secundária).
Os pacientes com hemocromatose adquirida (secundária) apresentavam as
seguintes suspeitas clínicas: 6% anemia hemolítica (1/16), 6% com hepatite B e
porfiria (1/16), 31% hepatite C (5/16) e 56% com hepatopatia crônica (9/16).
A Tabela 5 resume as características demográficas dos pacientes com
hemocromatose hereditária e adquirida (secundária).
53
Tabela 5 - Características demográficas dos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária).
Dados
Hereditária
(N=38)
Adquirida
(N=16)
Valor de p
Idade
< 40 anos
40 – 60 anos
> 60 anos
10 (26%)
17 (45%)
11 (29%)
02 (13%)
08 (50%)
06 (38%)
0,523
Gênero
Feminino
Masculino
13 (37%)
22 (63%)
02 (13%)
14 (88%)
0,104
Etnia/Cor da Pele
Branco
Amarelo
Pardo
32 (91%)
02 (6%)
01 (3%)
13 (81%)
01 (6%)
02 (13%)
0,343
Escolaridade
Analfabeto
Fundamental
Médio
Superior
03 (9%)
18 (51%)
06 (17%)
08 (23%)
01 (6%)
09 (56%)
04 (25%)
02 (13%)
0,885
N= número de pacientes. Teste qui-quadrado (Mantel-Haenszel).
Em relação à faixa etária, ambos pacientes com hemocromatose hereditária
e adquirida (secundária) apresentaram uma frequência acima de 45% entre 40 a 60
anos, mostrando uma sobrecarga de ferro mais tardia. O gênero masculino
apresentou maior frequência em ambos os grupos (superior a 60%), já em relação
à etnia/cor da pele, mais de 80% eram brancos. Portanto, foi observado que os
dados demográficos avaliados não apresentaram diferenças significativas entre os
54
pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida, ou seja, em ambos os
grupos as frequências foram semelhantes.
O diagnóstico laboratorial dos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida (secundária) mostra que não houve diferenças significativas entre os
parâmetros estudados. A distribuição dos valores obtidos de ferritina, ferro, CTLF e
IST dos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida foram representadas
na figura 10. Os dados de ferritina nos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida (secundária) foram respectivamente; <150ng/mL: 23% (08/38) e 19%
(03/16) e >150ng/mL: 77% (27/38) e 81% (13/16). Os valores de ferro nos
pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) foram
respectivamente; <150µg/dL: 51% (18/38) e 44% (07/16) e >150µg/dL 49% (17/38)
e 56% (09/16). A capacidade de ligação do ferro (CTLF) nos pacientes com
hemocromatose hereditária e adquirida foram respectivamente; <350µg/dL: 83%
(29/38) e 75% (12/16) e >350µg/dL: 17% (16/38) e 25% (04/16). O índice de
saturação de transferrina (IST) nos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida (secundária) foram respectivamente; <50%: 43% (15/38) e 31% (05/16) e
>50%: 57% (20/38) e 69% (11/16).
55
Here
dit
ár i
a
Ad
qu
irid
a
-5 0 0 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
F e rr it in a
ng
/mL
Here
dit
ár i
a
Ad
qu
irid
a
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
F e r r o
mc
g/d
L
Here
dit
ár i
a
Ad
qu
irid
a
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
C T L F
mc
g/d
L
Here
dit
ár i
a
Ad
qu
irid
a
0
5 0
1 0 0
1 5 0
IS T
%
p=0,075 p=0,808
p=0,584 p=0,568
Figura 10 - Distribuição dos valores de ferritina, ferro, CTLF (capacidade total de
ligação do ferro) e IST (índice de saturação da transferrina) nos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária). Os Valores de Referência: Ferritina: 13 a 150 ng/mL; Ferro: 37 a 150 mcg/dL; *CTLF: Capacidade total de ligação de ferro: 112-346 mcg/dL; **IST Índice de Saturação de Transferrina (%):20-50%. Teste qui-quadrado (Mantel-Haenszel) e Teste de Fisher.
No diagnóstico laboratorial dos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida (secundária), o valor médio da ferritina sérica foi de 743ng/mL e
1649ng/mL, respectivamente. Valores de ferritina sérica superiores a 1000 ng/mL
56
foram encontrados em 29% dos pacientes com hemocromatose hereditária e 31%
com hemocromatose adquirida (secundária), demonstrando uma predisposição à
sobrecarga de ferro no fígado. Os valores de IST superiores a 50% foram
observados em ambos os grupos numa frequência acima de 60%.
Em todas as amostras foram avaliadas a análise molecular por PCR-RFLP
para as mutações no gene da HFE (figuras 11 e 12). A tabela 6 descreve as
mutações encontradas nestes pacientes.
Figura 11 - PCR-RFLP na análise molecular da mutação C282Y do gene HFE, em gel de agarose a 2% corado com brometo etídio.
Figura 12 - PCR-RFLP na análise molecular da mutação H63D do gene
HFE, em gel de agarose a 2% corado com brometo etídio.
57
Tabela 6 - Mutações encontradas no gene HFE nos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária).
Mutação
Gene HFE
Hemocromatose
Hereditária
N = 38 (%)
Hemocromatose
Adquirida
N= 16 (%)
Valor de
p
Homozigoto C282Y 08 (21%) 0 (0%)
0,379
Heterozigoto C282Y/WT 03 (8%) 02 (13%)
Homozigoto H63D 01 (3%) 01 (6%)
Heterozigoto H63D/ WT 06 (16%) 04 (25%)
Heterozigoto C282Y e H63D 05 (13%) 01 (6%)
Sem mutação 15 (39%) 08 (50%)
N= número de pacientes. Teste qui-quadrado (Mantel-Haenszel).
As mutações no gene HFE que se sobressaiu entre os pacientes com
hemocromatose hereditária foram C282Y homozigose (21%) e na adquirida
(secundária) H63D heterozigose (25%). Entre as mutações do gene HFE, não
houve diferença estatística significativa nos grupos.
Na análise do sequenciamento dos 8 éxons que compõem o gene
SLC40A1, pelo método de Sanger, foram identificados uma mutação no éxon 3, 3
polimorfismos no éxon 4 e um polimorfismo no éxon 6 (tabela 8). Nos éxons 1, 2, 5,
7 e 8 não foram encontradas nenhuma alteração genética.
A mutação foi identificada no éxon 3 do gene SLC40A1, no códon 80,
descrita p.I80L (c.586C>A), sendo que a substituição do nucleotídeo foi nas
posições 586 do RNAm e 190440009 no gene (Figura 13).
58
No éxon 4 do gene SLC40A1 foram identificados 3 polimorfismos com a
substituição de um nucleotídeo nas posições: c. A630G (190437579), c.648A>G
(190437597), c.738Y>C (190437688) (figura 14 e 15). Já no éxon 6 (figura 16)
foram identificados dois polimorfismos c.1014C>T (190430229) e c.1014Y>T
(190430229).
Os gráficos 1 e 2 representam a distribuição de pacientes com
hemocromatose hereditária e adquirida que apresentam mutações no gene HFE e
simultaneamente polimorfismos e mutação no gene SLC40A1.
As sequências dos pacientes que apresentaram mutação e polimorfismo no
gene SLC40A1 foram submetidas ao GenBank (tabela 9).
Os polimorfismos no éxon 6 foram identificados em 50% (27/54) nos
pacientes e 60% (10/20) nos doadores de sangue.
Tabela 7 - Anál ise de sequenciamento do gene SLC40A1 nos pacientes com Hemocromatose hereditária e adquirida (secundária).
Gene SLC40A1
Hereditária
N=38 (%)
Adquirida
N=16 (%)
Valor de
p
Polimorfismo
Éxon 3
p.I80L (c.586C>A)
01(2,6%) 0 (0%)
0,142 Polimorfismos
Silenciosos
Éxon 4 c. 630A>G c. 648A>G
01(2,6%) 0 (0%)
Éxon 4 c.738Y>C
03 (7,9%) 0 (0%)
Éxon 6
c.1014C>T c.1014Y>T
17 (45%) 10 (59%)
N= número de pacientes. Teste qui-quadrado (Mantel-Haenszel).
59
B
C
A
Figura 13 - A. Cromatograma mostrando heterozigose para a mutação no gene
SLC40A1 p.I80L (c.586C>A, éxon 3). B. Análise do alinhamento (blast)
das sequencias do gene SLC40A1 com a do paciente. C. Análise do
alinhamento (blast) das sequencias do RNAm do gene SLC40A1 com
a do paciente.
60
A A B
C D
Figura 14 - Cromatograma mostrando os polimorfismos do éxon 4 no gene
SLC40A1. A: amostra 4 (c.630A>G e c.648A>G) e nas amostras 18
(B), 23 (C), 48 (D) polimorfismo c.738Y>C.
61
A
B
Figura 15 - A. Análise do alinhamento (blast) das sequencias do gene SLC40A1
com a identificação dos polimorfismos. B. Análise do alinhamento
(blast) das sequencias do RNAm do gene SLC40A1 dos
polimorfismos.
62
A
C
B
Figura 16 - A. Cromatograma mostrando polimorfismos no éxon 6 c.1014C>T e
c.1014Y>T no gene SLC40A1. B. Análise do alinhamento (blast) das
sequencias do gene SLC40A1. C. Análise do alinhamento (blast) das
sequencias do RNAm do gene SLC40A1.
63
Gráfico 1 - Distribuição de pacientes com hemocromatose hereditária com mutações no gene HFE e simultaneamente polimorfismos e mutação no gene SLC40A1.
64
Gráfico 2 - Distribuição de pacientes com Hemocromatose Adquirida com mutações no gene HFE e simultaneamente polimorfismos no gene SLC40A1.
65
Tabela 8 - Identificação das sequências submetidas no GenBank.
Gene SLC40A1 – Éxon
Número das Sequências ID GenBank
Éxon 3 BankIt1831536 72 KT152236
Éxon 4
BankIt1831532 4 KT152232
BankIt1831532 18 KT152233
BankIt1831532 23 KT152234
BankIt1831532 43 KT152235
Éxon 6
BankIt1831458 1 KT152201
BankIt1831518 2 KT152202
BankIt1831518 3 KT152203
BankIt1831518 4 KT152204
BankIt1831518 5 KT152205
BankIt1831518 6 KT152206
BankIt1831518 7 KT152207
BankIt1831518 8 KT152208
BankIt1831518 10 KT152213
BankIt1831518 11 KT152209
BankIt1831518 13 KT152211
BankIt1831518 14 KT152212
BankIt1831518 20 KT152216
BankIt1831518 25 KT152217
BankIt1831518 26 KT152218
BankIt1831518 27 KT152219
BankIt1831518 28 KT152220
BankIt1831518 30 KT152221
BankIt1831518 33 KT152222
BankIt1831518 39 KT152223
BankIt1831518 57 KT152227
BankIt1831518 58 KT152228
BankIt1831518 64 KT152225
BankIt1831518 65 KT152226
BankIt1831518 71 KT152230
BankIt1831518 72 KT152231
ID: identificação.
Nos diagnósticos de imagem realizados pelos métodos de tomografia
computadorizada, ressonância magnética e ultrassonografia, dos pacientes com
hemocromatose hereditária apresentaram 18% com sobrecarga de ferro hepática,
8% ausência de sinais de sobrecarga férrica detectável, 13% com outras
hepatopatias e 61% não tinham diagnóstico por imagem. Já os pacientes com
66
hemocromatose adquirida (secundária) apresentaram 63% com hepatopatia
crônica; 18% hepatocarcinoma, 13% hepatopatia associada à hepatite C e 6% não
tinham em seus prontuários registros do diagnóstico por imagem.
Considerando os dados fornecidos no diagnóstico de imagem, foram
comparados os valores médios da idade e ferritina nos pacientes com
hemocromatose hereditária, respectivamente: hepatopatia 52 anos e ferritina de
709 ng/mL; sobrecarga de ferro: 49 anos e 1138ng/mL e ausência de sobrecarga:
33 anos e 321 ng/mL de ferritina. Já na hemocromatose adquirida (secundária)
apresentaram respectivamente: hepatopatia 55 anos e ferritina de 1763 ng/mL;
hepatopatia associada à hepatite C: 51 anos e 666 ng/mL e hepatocarcinoma: 62
anos e 2497 ng/mL.
Os pacientes que não apresentaram nenhuma mutação ou polimorfismo nos
genes pesquisados para caracterizar hemocromatose no estudo (26%), HFE e
SLC40A1, apresentaram valores médios de ferritina (1057 ng/mL e IST de 59%), e
estes dados estão diretamente relacionados com hepatocarcinoma e hepatopatias
crônicas.
2.3.2 Descrição do Caso de Mutação no Gene SLC40A1 no paciente com
Hemocromatose Hereditária
Paciente I.L.O., idade de 51 anos, branco, sexo masculino, casado,
procedente da cidade de Santa Cruz do Piauí, Piauí, foi encaminhado ao
ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da FMUSP em 10/11/2008,
com suspeita clínica de hemocromatose hereditária. Foram solicitados os exames
de hemograma, VHS, transaminases (ALT e AST), proteína C reativa, ferritina,
67
ferro, CTLF e glicose. Os exames laboratoriais foram realizados de forma contínua
entre o período de 2009 a 2013 e na tabela 10 apresenta um resumo dos valores
médios dos dados laboratoriais. Além disso, o paciente não tinha anticorpos para os
vírus da hepatite B e C. Para confirmar o diagnóstico de hemocromatose hereditária
foi realizada a pesquisa molecular para identificar a presença de mutações e
polimorfismos nos genes HFE (mutações C282Y e H63D) e SLC40A1.
O paciente apresentou hemograma com alterações significativas em todos
os valores do eritrograma, demonstrando uma anemia persistente, e uma piora no
quadro laboratorial em 2013, apresentando alterações não somente no eritrograma,
mas também, no leucograma que mostrou desvio a esquerda com 2% de mielócitos
e plaquetopenia. Os marcadores inflamatórios (VHS e proteína C reativa) as
enzimas hepáticas (ALT e AST) e a glicemia apresentaram aumento gradual
durante esse período. No último ano, todos os exames laboratoriais do paciente
apresentaram-se discordantes com os valores de normalidade, retratando uma
piora no quadro clínico. No ano de 2013 foi realizado um mielograma para a
pesquisa de neoplasias hematológicas, devido à presença de células imaturas
leucocitárias no sangue periférico (mielócitos) observadas por meio do hemograma,
sendo constatado que não havia a presença de clonalidade, e a medula óssea
estava compatível com a idade do paciente.
68
Tabela 9 - Diagnóstico laboratorial do paciente com Mutação no gene SLC40A1.
Dados Laboratoriais
2009 2010 2011 2012 2013
Hemograma Eritrócitos
Hemoglobina
Hematócrito
VCM
HCM
CHCM
RDW
3,40
11,7
32,2
94,7
35,0
36,3
18,0
3,38
12,7
31,5
94,1
38,3
39,6
15,7
4,49
13,3
38,7
86,2
29,6
34,4
14,7
3,36
11,1
33,7
100,3
33,0
32,9
14,9
2,80
8,7
25,9
92,9
31,2
33,8
18,2
Ferritina
Ferro
CTLF
1337
89
275
1770
128
312
1248
115
292
1106
232
244
1648
42
205
Proteína C reativa 1,95 2,43 1,1 3,4 55,8
VHS 65 43 16 10 111
ALT 44 41 49 33 61
AST 29 23 15 19 60
Glicose 94 112 103 96 137
Valores de referência: Eritrócitos (4,4-5,9 106/µL), Hemoglobina (13-18 g/dL), Hematócrito
(40-52%), VCM (80-100 fl*), HCM (27-32 pg**), CHCM (32-37 g/dL), RDW (9,5-16%)*fl: fentolitro; **pg: picograma; Ferritina: 13 a 150 ng/mL; Ferro: 37 a 150 mcg/dL; *CTLF: Capacidade total de ligação de ferro: 112-346 mcg/dL; Proteína C reativa: <3,0mg/L; VHS: velocidade de hemossedimentação: 5,6-18,6mm; ALT: inferior a 37; AST: inferior a 41; Glicose: 70-99mg/dL.
Na pesquisa molecular ao paciente era heterozigoto para a mutação H63D
do gene HFE e mutação no éxon 3 (p.I80L) no gene SLC40A1 e o polimorfismo no
éxon 6 (c.1014Y>T). Não há conhecimento de familiares com essa doença. A
ferritina elevada, em média de 1422ng/mL, e sobrecarga de ferro hepática,
observada na tomografia computadorizada, pode estar associada com as mutações
no gene SLC40A1 e HFE.
69
2.3.3 Descrições dos Casos de Polimosfismo no Gene SLC40A1
Os polimorfismos no éxon 4 do gene SLC40A1 foram identificados em
quatro pacientes descritos abaixo.
O paciente A.G. branco, sexo masculino, com idade de 43 anos com
suspeita clínica de hemocromatose hereditária, no sequenciamento, foram
identificados dois polimorfismos no éxon 4 (c. 630A>G, c.648A>G). Esse paciente
também apresentou mutação heterozigótica C28Y/H63D para o gene HFE, com um
aumento discreto da ferritina (383ng/mL).
Os pacientes E.G.O., P.A.A. e C.A.S. com suspeita clínica de
hemocromatose, brancos, todos do sexo masculino, com idades respectivas de 66,
59 e 69 anos. Na análise molecular do sequenciamento foi identificado nos
pacientes um polimorfismo no éxon 4 (c.738Y>C), e também, apresentava mutação
no gene HFE (2 indivíduos C282Y/H63D e um heterozigoto H63D). No diagnóstico
laboratorial os pacientes apresentavam respectivamente, ferritina: 435 ng/mL, 578
ng/mL e 639 ng/mL; IST: 72%, 59% e 59%.
2.3.4 Descrições dos Casos de Mutação C282Y no Gene HFE e
polimorfismo no gene SLC40A1 nos pacientes com Hemocromatose
Hereditária
Nesse estudo, dentre os 38 pacientes com suspeita clínica de
hemocromatose hereditária, nove pertencem a uma mesma família. A tabela 10
resume os dados demográficos, laboratoriais e moleculares dos genes HFE
(mutação C282Y) e polimorfismo no gene SLC40A1 (éxon 6: c.1014 C>T). No
heredograma analisamos os aspectos moleculares para as mutações no gene HFE.
70
Na primeira (I) e segunda geração (II) não há relato dos progenitores, devido já ser
falecidos. A partir da terceira e quarta geração está definido o perfil dos
descendentes. Alguns membros da família apresentam a mutação C282Y no gene
HFE, e também, polimorfismo no éxon 6 (c.1014C>T).
De acordo com o heredograma podemos visualizar a presença da mutação
entre os descendentes (III) de três ancestrais (II) (figura 17).
A descendente (III) do primeiro ancestral (II), V.B.B, branca, sexo feminino,
idade 80 anos, com suspeita clínica de hemocromatose hereditária, apresentava
ferritina 382ng/mL e IST de 34%, e não foram identificadas as mutações C282Y e
H63D no gene HFE e polimorfismo no gene SLC40A1. A sua filha I.B.M. branca,
sexo feminino, idade 53 anos, suspeita de hemocromatose hereditária, no
diagnóstico molecular não apresentou a mutação no gene HFE (C282Y e H63D),
mas foi identificado o polimorfismo no gene SLC40A1 (éxon 6 c.1014 C>T), e o
diagnóstico laboratorial mostrou ferritina de 92ng/mL e IST 27%.
Os descendentes (III) do segundo ancestral (II) são irmãos, todos com
suspeita clínica de hemocromatose hereditária. Os pacientes A.B., C.B.
apresentaram homozigose para mutação C282Y do gene HFE, e concomitante foi
identificado o polimorfismo (éxon 6: c.1014C>T) no gene SLC40A1. O indivíduo
A.B. branco, masculino, idade de 58 anos, apresentava ferritina sérica de
3184ng/mL e IST de 92% e na ultrassonografia apresentava sobrecarga de ferro
hepática confirmando o diagnóstico de hemocromatose hereditária. O paciente O.B.
branco, sexo masculino, idade de 50 anos, no exame laboratorial tinha 601ng/mL
de ferritina e IST de 45% com discreta sobrecarga de ferro no exame de imagem,
mas com ausência da mutação C282Y e H63D no gene HFE. Portanto, esse
indivíduo apresentou o polimorfismo no gene SLC40A1. A paciente C.B. branca,
feminino, idade de 45 anos, apresentou ferritina de 652ng/mL e IST de 86%. Na
71
quarta geração a filha de A.B., R.N.B. branca, sexo feminino, idade 28 anos, com
suspeita de hemocromatose hereditária apresentou heterozigose para a mutação
C282Y no gene HFE e o polimorfismo no gene SLC40A1 (éxon 6: c.1014C>T) com
ferritina normal 122ng/mL e IST de 86%.
O descendente (III) R.B. branco, sexo masculino, idade 54 anos,
diagnosticado com suspeita clínica de hemocromatose hereditária, foi identificada
homozigose para a mutação C282Y do gene HFE, e polimorfismo c.1014C>T no
gene SLC40A1. Aferritina desse indivíduo estava discretamente elevada
(224ng/mL) e com IST de 45%, mas no diagnóstico por imagem (tomografia
computadorizada) apresentou sobrecarga de ferro hepática, confirmando a
presença de hemocromatose hereditária. A cônjuge B.F.C.B. branca, sexo feminino,
idade 50 anos não apresentou as mutações C282Y e H63D do gene HFE e
polimorfismo no gene SLC40A1, sendo que os dados laboratoriais de ferritina
40ng/mL e IST 22% estavam normais. A filha desse casal, C.C.B., branca, sexo
feminino, idade de 31 anos, com suspeita de hemocromatose hereditária, não
apresentou as mutações C282Y e H63D do gene HFE, e polimorfismo no gene
SLC40A1, e os dados laboratoriais mostrou ferritina 40ng/mL normal e IST 53%
discretamente elevado.
72
Tabela 10 - Características demográficas, dados laboratoriais bioquímicos e moleculares da Família B.
ID Etnia/cor da pele
Gênero Idade Suspeita
clínica
Ferritina IST (%)
Mutação Polimorfismo
(ng/mL) Gene HFE Gene SLC40A1
VBB B F 80 HH 382 34 - -
IBM B F 53 HH 92 27 - c.1014 C>T
AB B M 58 HH 3184 92 C282Y c.1014 C>T
CB B F 45 HH 652 86 C282Y c.1014 C>T
OB B M 50 HH 601 45 c.1014 C>T
RNB B F 28 HH 122 86 C282Y c.1014 C>T
RB B M 54 HH 224 45 C282Y c.1014 C>T
BFCB B F 50 HH 40 22 - -
CCB B F 31 HH 40 53 - -
ID: Identificação do paciente (iniciais do nome); HH: Hemocromatose Hereditária; IST (%): Índice de saturação de transferrina; polimorfismo no éxon 6 c.1014 C>T.
I ? ?
II ? ? ? ? ? ?
III
IV
? Sem Identificação
molecular
Figura 17 - Heredograma da Família B, apresentando a mutação C282Y do gene HFE.
73
2.4 DISCUSSÃO
A hemocromatose hereditária é uma desordem do metabolismo do ferro
amplamente estudada, e desde a descoberta desses genes, houve uma melhora
expressiva na elucidação dessa doença. A hiperferritinemia é um achado comum
na prática clínica que pode ser congênita ou adquirida e nem sempre associada à
sobrecarga de ferro91.
Nesse estudo foram realizadas as análises moleculares no gene SLC40A1 e
no gene HFE, o tipo de hemocromatose mais frequente na população mundial, pois
esses dois genes apresentam características clínicas semelhantes.
Os pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida mostraram maior
frequência na faixa etária entre 40 a 60 anos, pois a sobrecarga de ferro no
organismo ocorre de forma lenta, progressiva e silenciosa, o que torna a princípio,
essa doença assintomática, principalmente em indivíduos mais jovens. Os
indivíduos na faixa etária entre 40 a 60 anos apresentam sintomatologia, por já
apresentarem acúmulo de ferro em órgãos vitais como fígado, coração, pâncreas e
hipófise92,93,94,95. Cançado e al.93 mostraram a influência da idade e o acúmulo de
ferro entre as faixas etárias, mostrando que acima de 40 anos os pacientes
apresentam sobrecarga de ferro superior a 1000 µg/g com lesões em órgãos,
fibrose e/ou cirrose hepática93.
Embora o gene defeituoso seja igualmente distribuído entre homens e
mulheres, nesse estudo houve maior frequência no sexo masculino em ambos os
grupos (HH 63% e adquirida 88%). Essa maior frequência nesse gênero foi
observada na maioria dos estudos, na proporção de 4 a 10:1. Isso ocorre, pois as
mulheres tem perdas periódicas de ferro por causa da menstruação e gestação, o
74
que retarda o início do acúmulo de ferro em órgãos vitais, por pelo menos uma
década, portanto, a sintomatologia inicia após a menopausa3,13.
A etnia/cor da pele nos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida teve maior frequência (91% e 81%) na população branca (caucasóides).
No Brasil, mesmo com a intensa miscigenação de povos europeus com índios e
africanos, prevalece uma maior frequência, variando de 10-40%, nessa
população3,5,34,95,96,97.
O diagnóstico de hemocromatose baseia-se na identificação de sintomas
sugestivos da doença, deteção de anormalidades bioquímicas do ferro, avaliação
de acúmulo de ferro em fragmento de biopsia hepática e/ou por meio da realização
de testes genéticos para detectar mutações13. No diagnóstico laboratorial realizado
para ferritina, ferro, CTLF e IST nos pacientes com hemocromatose hereditária e
adquirida não houve diferença estatisticamente significativa. Uma das justificativas,
é que os parâmetros de ferro são influenciados pela idade, sexo, presença de
outras doenças, variabilidade fisiológica e biológica34. A variabilidade fisiológica
reflete a variação dia a dia relacionadas com a ingesta, secreção gástrica,
motilidade e absorção intestinal, enquanto que a variabilidade biológica indica as
condições de reserva de ferro existente em cada indivíduo34.
Nos pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida a ferritina sérica
estava elevada em mais de 70%, com uma distribuição homogênea nesses dois
grupos, entretanto, dois pacientes com hepatopatia crônica apresentaram valores
de ferritina acima de 5000ng/mL. A ferritina na fase aguda se encontra elevada
também nas hepatopatias alcoólicas, hepatites virais em estado crônico, incluindo
processos infecciosos e malignos (hepatocarcinomas)8. A hepatopatia crônica inicia
nas fases mais tardias da doença, em que há lesão das células hepáticas e
75
consequentemente aumento da concentração de ferritina sérica. Esse processo se
agrava no estágio de cirrose e hepatocarcinoma95,98.
O mecanismo de toxicidade do ferro está relacionado quando a quantidade
de ferro absorvido ultrapassa a capacidade ferroquelante do organismo, ou seja, de
armazená-lo e "neutralizá-lo", ocorre saída de ferro dos macrófagos para a
circulação e, quando ultrapassa a capacidade de saturação da transferrina
plasmática, o ferro livre em excesso (sobrecarga primária ou secundária) deposita-
se nos hepatócitos e em outras células parenquimatosas98.
Embora a ferritina sérica seja um marcador altamente sensível para o
diagnóstico de hemocromatose, apresenta uma baixa especificidade, devido esse
marcador se elevar apenas na presença de grandes acúmulos de ferro8,13. Portanto,
os indivíduos com hemocromatose hereditária que apresentaram valores de ferritina
normal (inferior a 150ng/mL) não podem ser excluídos do diagnóstico antes de
realizar uma avaliação complementar, pois o paciente pode estar em tratamento
com dieta pobre em ferro, flebotomias ou quelantes de ferro. Outro ponto a ser
considerado são adultos jovens que ainda não apresentam a sintomatologia e o
acúmulo de ferro ocorre de forma discreta e gradual.
Nesse estudo observamos uma correlação entre o aumento de ferritina nos
pacientes com mutação no gene HFE e mutação e polimorfismo no gene SLC40A1,
na faixa etária entre 40 a 60 anos, devido ao agravo da deficiência no metabolismo
com o avanço da idade. Entretanto, é necessário o diagnóstico molecular para
confirmar a suspeita clínica e adequar a terapia para cada tipo de hemocromatose,
evitando o desencadeamento de outras doenças secundárias, pois o início da
doença é insidioso, com sintomas inespecíficos que incluem astenia, letargia,
fadiga, artralgias, perda da libido (homens) e amenorreia. No decorrer, a
sobrecarga de ferro tanto na hemocromatose hereditária do tipo 1 (gene HFE)
76
quanto a do tipo 4 (gene SLC40A1), ocasiona outras doenças como diabetes
Mellitus, síndrome metabólica, insuficiência cardíaca congestiva (ICC), artropatia
hemocromatótica e predisposição a infecções13,39.
Nesse estudo os pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida
(secundária) apresentaram respectivamente média de valores de IST acima de
50%. Esse índice é importante, pois altera precocemente, sendo considerado mais
sensível para o diagnóstico do que a ferritina sérica, que apenas se torna elevada
na presença de grandes acúmulos de ferro5,34,99. A combinação de IST superior a
45% e ferritina sérica elevada em um indivíduo saudável tem sensibilidade de 93%
para o diagnóstico de hemocromatose hereditária13.
A análise molecular do gene HFE no estudo da frequência nos pacientes
com hemocromatose hereditária mostrou que foi maior para homozigose e
heterozigose para a mutação C282Y do que para a mutação H63D. Já os pacientes
com hemocromatose adquirida (secundária) apresentaram maior frequência para o
mutante H63D heterozigoto, seguido C282Y/WT e dupla heterozigose
C282Y/H63D. Nesse estudo foi observado uma frequência de 30%, semelhante aos
resultados de Cançado et al., que as alterações no gene HFE é menor quando
comparado aos outros países que apresentam uma frequência de até 90% na
população, mas em relação aos outros tipos de hemocromatose hereditária a
frequência é semelhante, ou seja, varia de 2 a 4%33,93. Outro dado a ser
considerado foram os casos selecionados no estudo com suspeita clínica de
hemocromatose hereditária, mas que não apresentaram alterações moleculares
para o gene HFE, e também os que foram inseridos no estudo com hemocromatose
adquirida, mas foi identificado mutação no gene HFE, mostrando a complexidade
no diagnóstico clínico da doença.
77
Na análise molecular, ainda é questionável a hipótese de penetrância gênica
incompleta das mutações do gene HFE, devido ao número reduzido de indivíduos
com diagnóstico de hemocromatose frente à elevada frequência das mutações do
gene, pois 40% a 70% dos indivíduos homozigotos para a mutação C282Y
desenvolverão evidência laboratorial de sobrecarga de ferro e que, pelo menos,
50% dos homens e 25% das mulheres com esse genótipo desenvolverão
complicações clínicas secundárias ao acúmulo de ferro3,93,100. Em relação à
penetrância gênica do duplo heterozigótico (C282Y/H63D) encontra-se de 5-10%
no grupo de pacientes com hemocromatose hereditária8,47,94. Um achado de
relevância foi observado em homens heterozigotos para a mutação C282Y, pois
apresentaram maior penetrância gênica, quando esse alelo mutante é proveniente
de hereditariedade paterna8,94.
A mutação H63D não foi elucidada de forma concisa, pois alguns estudos
apontam que o fenótipo não acarreta o acúmulo de ferro, somente quando
associada à mutação C282Y, apresentando um distúrbio do ferro de forma mais
branda. Entretanto, em outros estudos foram encontrados a mutação H63D
associada a sobrecarga de ferro77,92. Estudos recentes mostraram que para a
mutação H63D devem ser considerados fatores que acarretam a sobrecarga de
ferro, como a hiperferritinemia3,36,93. Curiosamente, em nosso estudo houve 3 casos
de pacientes heterozigotos para a mutação H63D que apresentaram
hiperferritinemia, sendo 2 com hemocromatose hereditária e 1 com hemocromatose
adquirida que tinha associado hepatite C. Dentre esses pacientes com
hemocromatose hereditária um apresentou a mutação no gene SLC40A1 (doença
da ferroportina), caracterizando a sobrecarga de ferro, e outro com polimorfismo no
éxon 4 desse mesmo gene, mostrando a necessidade de avaliar a expressão
fenotípica, uma vez que, pode sofrer a influência de fatores epigenéticos, clínicos e
78
ambientais que interferem no metabolismo do ferro e no curso da
doença3,93,100,101,102,103. O estudo da frequência dos mutantes C282Y e H63D ainda é
alvo a ser investigado na população brasileira, sendo que estão presentes em 2/3
dos pacientes brasileiros com hemocromatose hereditária, indicando outras
mutações no gene HFE, como S65C (menos frequente), ou a presença de outros
genes que possam estar envolvidos na regulação metabólica do ferro, como HJV,
HAMP e SLC40A13,5,93.
A mutação identificada no gene SLC40A1, (éxon 3, p.I80L), não descrita no
país, comprovou a associação da mutação com o quadro clínico e laboratorial do
paciente, que apresentava uma anemia persistente com uma hiperferritinemia
significativa e sobrecarga de ferro hepática, causando uma hepatopatia. Esse
paciente apresentava sintomatologia de hemocromatose com artralgia, diabetes
Mellitus, gonodopatia, processos inflamatórios e infecciosos. Os dados laboratoriais
mostraram alterações nas enzimas hepáticas (ALT e AST), aumento da ferritina
sérica que acometem acúmulo em órgãos vitais como o fígado. No diagnóstico por
imagem foi observado sobrecarga de ferro hepática. Evidenciando a necessidade
de um diagnóstico precoce, para ser introduzida uma terapia adequada,
principalmente com o uso de quelantes de ferro, pois a flebotomia só agravaria o
quadro clínico, complicando o prognóstico do paciente.
Na doença da ferroportina ocorre comprometimento da capacidade da célula
em exportar o ferro, o qual se acumula principalmente em macrófagos, com
acúmulo na forma de ferritina e diminuição da disponibilidade do ferro para circular
ligado a transferrina; portanto, caracteriza-se por baixa saturação de transferrina. A
diminuição da disponibilidade do ferro pode ser responsável por anemia leve104.
A Hemocromatose hereditária do tipo 4, associada às mutações do gene
SLC40A1, esta forma de HH pode apresentar características clínicas e laboratoriais
79
diferentes em relação às demais hemocromatoses, com uma discreta anemia antes
da sobrecarga férrica e anemia persistente moderada a grave, durante o agravo da
sobrecarga de ferro. Portanto, nesses casos a terapêutica por flebotomia pode
agravar o quadro anêmico do paciente88,91,104,105.
Os polimorfismos encontrados no gene SLC40A1 foram identificados nos
pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) numa
frequência acima de 50%. Nesses grupos em média 65% estavam correlacionados
com as mutações no gene HFE. Até o momento, não há estudos que indicam uma
relação potencial do polimorfismo com alteração funcional da proteína5.
Altés et al.77 identificaram cinco conhecidos polimorfismos de nucleotídeo
único (SNPs), sendo que dois deles foram associados a características fenotípicas.
O polimorfismo IVS1-24 C>G no gene da ferroportina parece ser um modificador
genético para a agressividade clínica de hemocromatose do tipo 1 (HFE)77,105.
O estudo molecular no gene SLC40A1 contribui para elucidar o panorama
significativo na homeostase do ferro sistêmico, revelando uma variabilidade
genética e fenotípica existente nos mecanismos patogênicos comuns subjacentes a
esta doença. Esses achados enfatizam a necessidade de analisar o fenótipo para
avaliar a funcionalidade da proteína e estimar dentre os polimorfismos que são ou
não funcionais e verificar se contribuem na sobrecarga de ferro48,94,106,107,108,109,110.
A associação entre as alterações genotípicas nos tipos de hemocromatose
hereditária necessitam estudos para avaliar a heterogeneidade fenotípica, que
apresentam diferentes níveis de sobrecarga de ferro, pois pode haver indivíduos
que apresentam mutações e polimorfismos nos genes que causam a
hemocromatose hereditária107.
Na pesquisa do gene SLC40A1, que causa a doença ferroportina, a princípio
foi encontrado uma frequência acima de 50% na identificação do polimorfismo
80
silencioso no éxon 6, tanto nos pacientes do estudo como nos doadores de sangue,
mostrando uma prevalência na população. Estudos em doadores de sangue
evidenciaram polimorfismos e mutações nos genes que causam a hemocromatose
hereditária, mostrando que o diagnóstico de hemocromatose tardio não ocorre
somente, mas também em outros países 8,111,112.
Niewiadonski et al,111 estudaram a frequência do gene HFE pela análise no
sequenciamento direto OpenArray dos doadores de sangue da FPS-HSP, e
obtiveram os seguintes resultados de cada SNP: HFE C282Y 96% (G/G), 4% (G/A),
HFE H63D 78,1% (C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/D), 1,9%
(A/T). Estes resultados são importantes para melhorar o conhecimento dos perfis
genéticos de doadores de sangue brasileiros, e também para estabelecer as
frequências dos genes que ocasionam a hemocromatose na população, além de
fornecer uma nova metodologia para ser empregada no diagnóstico molecular dos
genes que causam a hemocromatose hereditária e possibilitar uma melhor
terapêutica diminuindo os riscos de cronicidade da doença. A detecção precoce de
mutação nesses doadores de sangue pode fornecer benefícios para os indivíduos e
os bancos de sangue, pois os indivíduos que atenderem a todos os critérios na
entrevista pré-doação, podendo então, serem considerados como doadores
seguros. A doação de sangue beneficiaria a saúde desses indivíduos, e também,
aumentar a oferta de banco de sangue8,111,112.
Na análise fenotípica deve-se avaliar a consequência de splicing alternativo,
pois isoformas de proteínas solúveis podem ser originadas, assumindo, em alguns
casos, um papel importante na regulação de processos fisiológicos. Na verdade,
variações de splicing nos genes HFE, HAMP, SLC40A1 ocasiona uma variante no
RNAm já descritos e, embora sem estudos em nível de proteína, sugere-se que o
peptídeo solúvel correspondente pode regular o transporte de ferro celular83,101,102.
81
A função variável da ferroportina torna difícil o diagnóstico, sendo necessário
o estudo de famílias e grupo controle para avaliar a frequência da variante genética
e fenotípica na identificação de polimorfismos no gene SLC40A134,107.
No diagnóstico de imagem, houve a confirmação da presença de sobrecarga
férrica em 30% dos pacientes com hemocromatose hereditária, desses 20% já
apresentavam alterações morfológicas para hepatopatia crônica e
hepatocarcinoma.
Os pacientes com hemocromatose adquirida (secundária) com maior
frequência na mutação H63D no gene HFE, também apresentavam polimorfismo no
gene SLC40A1. Esses achados comprovam que a hemocromatose hereditária e
adquirida devem ser diagnosticadas com antecedência para evidenciar se as
alterações no metabolismo do ferro estão sendo ocasionadas por mutação
genética, ou em consequência de uma doença secundária que acarreta o acúmulo
de ferro; ou em casos mais graves quando há a associação de uma mutação com
uma doença adquirida.
Dados semelhantes foram evidenciados no estudo de Cançado et al.93 em
que o diagnóstico genotípico de HH foi confirmado em 23/50 (15 C282Y/C282Y e
sete C282Y/H63D) dos doentes estudados, o que corresponde a 46%. Entretanto,
60% (30/50) dos pacientes heterozigotos para as mutações C282Y e H63D,
apresentavam siderose hepática grau III/IV93,95.
A anemia hemolítica hereditária, hepatite C e consumo excessivo de bebida
alcoólica estão implicados na predisposição no aumento dos estoques de ferro do
organismo e constituem fatores de risco adicionais para a condição de sobrecarga
de ferro, aumentam as lesões hepáticas, acentuando a expressão fenotípica dos
doentes com mutação do gene HFE, salientando a importância do
acompanhamento dos indivíduos com mutação do gene HFE, mesmo em
heterozigose33,93,98.
82
Nos resultados da família B, alguns indivíduos apresentaram o polimorfismo
no éxon 6 para o gene SLC40A1 e a mutação C282Y para o gene HFE. Entretanto,
houve um indivíduo que apresentou o polimorfismo para o gene SLC40A1, aumento
na concentração de ferritina e IST, sem mutação C282Y para o gene HFE. Nesse
caso é necessário investigar se não há a presença de uma doença secundária
como a síndrome metabólica, artrose ou outras que contribuam para alteração nos
níveis de ferritina. Não foi possível atribuir à causa desse polimorfismo nos
pacientes dessa família, já que não foram realizados estudos do fenótipo que
indicam alteração funcional na ferroportina107,113. A paciente com apenas
polimorfismo não apresentou alterações nos níveis de ferritina e IST, mas está na
faixa etária considerada precoce para avaliar qualquer alteração clínica em
decorrência do polimorfismo. Faz-se necessário realizar estudos futuros para
compreender melhor os mecanismos moleculares no metabolismo do ferro e os
papéis do gene HFE e os outros envolvidos no metabolismo do ferro, como
SLC40A1, HMJ, HAMP e TRF2.
Deve ser considerado o diagnóstico clínico e laboratorial precoce, inclusive
no período assintomático, com a anamnese do histórico familiar de
hemocromatose, as alterações discretas do ferro e ferritina plasmáticos e das
enzimas hepáticas como ALT e AST, e a confirmação pelo diagnóstico molecular,
por metodologias de sequenciamento de última geração, que apresentam rapidez e
confiabilidade com os métodos padrão para prevenção da cronicidade da doença.
O aconselhamento genético deve ser oferecido às famílias afetadas
informando-as do risco de herdarem a mutação causadora da doença. Ao contrário
dos doentes com a forma B da doença da ferroportina, os doentes com a forma A
podem não tolerar as flebotomias e apresentam risco aumentado para anemia. A
forma A da doença da ferroportina tem um decurso benigno. Na forma B prevê-se
83
que tenha um prognóstico favorável desde que os doentes sejam tratados
precocemente, antes do desenvolvimento de complicações viscerais.
O recente progresso tem elucidado a função dessas moléculas na
homeostase do ferro sistémico, e revelou que, apesar da diversidade genética e
fenotípica de hemocromatose hereditária, existem mecanismos patogênicos
comuns subjacentes a esta doença. O mecanismo comum de sobrecarga de ferro
em hemocromatose hereditária compreende uma regulação anormal no eixo
hepcidina-ferroportina, que leva a uma falha, que não impede que o excesso de
ferro entre na circulação13,33.
O prognóstico da hemocromatose parece depender diretamente da
quantidade e duração do acúmulo de ferro. Os pacientes que iniciam terapia no
início da doença têm melhor sobrevida. A expectativa de vida é normal se as
flebotomias ou quelamento forem iniciadas antes do surgimento de cirrose e,
mesmo nos cirróticos, a taxa de sobrevida em 10 anos, após normalização dos
estoques de ferro. O prognóstico é mais grave quando há cirrose hepática
associada ao diagnóstico de diabetes mellitus, mas não é influenciado pelo sexo ou
pela existência de artropatia. O transplante ortotópico de fígado (TOF) tem sido
recomendado nos casos de cirrose descompensada, sendo importante ressaltar
que vários estudos têm demonstrado que nesses pacientes a mortalidade pós-
transplante é maior que a observada em outros tipos de cirrose, provavelmente em
decorrência de cardiopatias concomitantes e intercorrências infecciosas. Existem
evidências provenientes de estudos experimentais em humanos, que sustentam o
papel carcinogênico do ferro, seja em sua forma livre ou ligado à transferrina, e o
risco de morte por carcinoma hepatocelular em um indivíduo com HH é 100 vezes
maior que o da população geral13,33,34,98.
Do ponto de vista de saúde pública, as hemocromatose hereditária e
adquirida estão associadas a um maior risco de mortalidade, principalmente quando
84
estão associadas à síndrome metabólica, hepatopatias crônicas, hepatites virais
doenças cardíacas e hepatocarcinoma, e também, quando o diagnóstico para a
doença é tardio e não tratado, e diminui a sobrevida do paciente em poucos anos
após a sintomatologia. Quando o diagnóstico precede o início dessas doenças e o
tratamento é instituído antes do desenvolvimento de cirrose hepática, a sobrevida
dos pacientes passa a ser semelhante à da população geral.
85
3 CONCLUSÕES
As mutações encontradas no gene HFE e SLC40A1 estão associadas com a
sobrecarga férrica caracterizando a hemocromatose hereditária.
Os polimorfismos encontrados no gene SLC40A1 foram identificados nos
pacientes com hemocromatose hereditária e adquirida (secundária) numa
frequência de 50%. Foi observada frequência semelhante nos doadores de sangue,
sugerindo que este polimorfismo provavelmente não contribui para o
desenvolvimento da doença.
O diagnóstico precoce das doenças e uma terapia adequada diminuem o
risco de mortalidade, melhorando o quadro clínico e a sobrevida dos pacientes.
86
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93
ANEXOS
94
ANEXO A - APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE ÉTICA (CAPPesq)
95
ANEXO B - FICHA DE AVALIAÇÃO DO PACIENTE
Nome: RGHC:
Sexo: Idade ao diagnóstico (em anos):
Hepatopatia: ( ) sim ( ) não ( ) Não
avaliado
Hipogonadismo Hipogonadodrófico ( ) sim ( ) não ( ) Não
avaliado
Cardiomiopatia ( ) sim ( ) não ( ) Não
avaliado
Catarata ( ) sim ( ) não ( ) Não
avaliado
Outros sinais Clínicos avaliado ( ) sim ( ) não ( ) Não
Especificar:
Ferro Sérico(mol/L): Ferritina sérica (g/L):
Saturação de transferrina (%): TIBC
Eletroforese de Hemoglobina
Ferro Hepático:
Mutação C282Y ( )ausente
( )presente em homozigoze ( )presente em heterozigoze
Mutação H63D ( )ausente
( )presente em homozigoze ( )presente em heterozigoze
Mutação no Gene SLC40A1: ( )ausente ( ) presente:
96
Qual?__________________
( )presente em homozigoze ( )presente em heterozigoze
Resultado de Exames de interesse para o diagnóstico e evolução:
Exame Data Data
97
ANEXO C – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO
HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DA
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO-HCFMUSP
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
_______________________________________________________________
DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL
1. NOME: .:............................................................................. ...........................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : .M □ F □
DATA NASCIMENTO: ......../......../......
ENDEREÇO ................................................................................. Nº ........................... APTO:
..................
BAIRRO: ........................................................................ CIDADE
.............................................................
CEP:......................................... TELEFONE: DDD (............)
......................................................................
2.RESPONSÁVEL LEGAL
..............................................................................................................................
NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.)
..................................................................................
DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M □ F □
DATA NASCIMENTO.: ....../......./......
ENDEREÇO: ............................................................................................. Nº ................... APTO:
.............................
BAIRRO: ................................................................................ CIDADE:
......................................................................
CEP: .............................................. TELEFONE: DDD
(............).................................................................................. ________________________________________________________________________________________________
DADOS SOBRE A PESQUISA
TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA AVALIAÇÃO DO GENE SLC40A1 EM PACIENTES COM HEMOCROMATOSE HEREDITÁRIA NÃO ASSOCIADA À MUTAÇÕES DO GENE HEMOCROMASTOSE FAMILIAR (NÃO-HFE)
PESQUISADOR : ALFREDO MENDRONE JUNIOR
CARGO/FUNÇÃO: MÉDICO INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 50264
UNIDADE DO HCFMUSP: FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE/HEMOCENTRO DE SP
AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:
RISCO MÍNIMO X RISCO MÉDIO □
RISCO BAIXO □ RISCO MAIOR □
98
DURAÇÃO DA PESQUISA : 18 MESES
1 – Justificativa e objetivos da pesquisa: essas informações estão sendo fornecidas para
obter sua participação voluntária neste estudo, que visa avaliar a presença de novas
mutações genéticas relacionadas com o metabolismo do ferro e que podem estar
associadas com Hemocromatose Hereditária. No Brasil, ainda não há nenhum estudo de
prevalência destas novas mutações em pacientes com Hemocromatose Hereditária. Por
isso pretendemos estudar os pacientes com Hemocromatose Hereditária acompanhados
no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para
avaliar se estas mutações podem estar relacionadas com a sua doença.
2 – Procedimentos que serão utilizados e propósitos: Caso você concorde em
participar do estudo, além dos exames que são rotineiramente coletados para o seu
tratamento, iremos coletar duas amostras do seu sangue (02 tubos), com 10 mL de
volume cada um, para realizar os exames laboratoriais necessários para estudar as
mutações genéticas. Todos os exames necessários para o estudo serão realizados nessas
duas amostras de sangue coletadas. Nenhum outro procedimento será necessário para o
estudo.
3 – Relação dos procedimentos rotineiros e como são realizados: A coleta da amostra
de sangue será realizada em uma veia do seu braço. Após garroteamento e antissepsia do
local a ser puncionado, uma agulha será introduzida em uma veia de seu antebraço para
coleta das duas amostras de sangue. Após o término da coleta, a agulha será retirada e
será realizado um pequeno curativo no local, o qual deverá permanecer por 6 horas. As
amostras de sangue serão encaminhadas ao laboratório de biologia molecular da
Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de SP, onde serão realizados os exames.
4 – Descrição dos desconfortos e riscos esperados: Existe um pequeno risco de
infecção e formação de hematoma no local em que for feita a punção da veia para coleta
das amostras.
5 – Benefícios para o participante: Não há um benefício direto pela sua participação no
estudo. Trata-se de um estudo experimental testando a hipótese de que determinadas
mutações genéticas descritas em outros países também possam estar associadas com
hemocromatose hereditária no Brasil.
99
6 – Relação de procedimentos alternativos que possam ser vantajosos, pelos quais o
paciente pode optar: Não há.
7 – Garantia de acesso: em qualquer etapa do estudo, você terá acesso aos profissionais
responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de eventuais dúvidas. O principal
investigador é o Dr Alfredo Mendrone Júnior que pode ser encontrado no endereço: Av
Dr Enéas de Carvalho Aguiar 155, 1º andar, Telefone 3061-5544 r:343. Se você tiver
alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o
Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) – Rua Ovídio Pires de Campos, 225 – 5º andar – tel:
3069-6442 ramais 16, 17, 18 ou 20, FAX: 3069-6442 ramal 26 – E-mail:
8 – É garantido à você, a liberdade da retirada de consentimento a qualquer
momento e de deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de
seu tratamento na Instituição.
09 – Direito de confidencialidade – As informações obtidas serão analisadas em
conjunto com outros pacientes. Não será divulgada a identificação de nenhum paciente;
10 – É garantido à você o direito de se manter atualizado sobre os resultados
parciais da pesquisa ;
11 – Despesas e compensações: não há despesas pessoais para o participante em
qualquer fase do estudo, incluindo exames e consultas. Também não há compensação
financeira relacionada à sua participação;
12 – Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos relacionados
com o projeto de pesquisa (desde que com nexo causal comprovado), o participante terá
direito a tratamento médico nesta Instituição.
Fui suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim,
descrevendo o estudo ” AVALIAÇÃO DO GENE SLC40A1 EM PACIENTES COM
HEMOCROMATOSE HEREDITÁRIA NÃO ASSOCIADA À MUTAÇÕES DO GENE HFE
(NÃO-HFE)”. Ficaram claros para mim quais são os propósitos do estudo, os procedimentos a
serem realizados, seu desconforto e riscos, as garantias de confidencialidade e de
esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que minha participação é isenta de
despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário.
Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a
qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem penalidades ou prejuízo ou perda de
100
qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu atendimento neste Serviço. Autorizo
que a amostra de sangue coletada para esta pesquisa seja utilizada em pesquisas futuras
sobre novas mutações genéticas relacionadas com minha doença.
-------------------------------------------------
Assinatura do paciente/representante legal Data / /
-------------------------------------------------------------------------
Assinatura da testemunha Data / /
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e
Esclarecido deste paciente ou representante legal para a participação neste
estudo.
-------------------------------------------------------------------------
Assinatura do responsável pelo estudo Data / /
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................16 1.1 Hemocromatose ...............................................................................................16 1.2 Histórico da Hemocromatose ............................................................................17 1.3 Epidemiologia ...................................................................................................20 1.4 Proteínas que Regulam o Metabolismo do Ferro ..............................................22 1.4.1 HFE (Human Hemochromatosis Protein) .......................................................22 1.4.2 Hemojuvelina (HJV) .......................................................................................23 1.4.3 Hepcidina .......................................................................................................24 1.4.4 Receptor 1 da Transferrina (TfR1 = Transferrin Receptor 1) ..........................25 1.4.5 Receptor 2 da Transferrina (TfR2 = Transferrin Receptor 2) ..........................26 1.4.6 Ferroportina (FPN) .........................................................................................27 1.5 Metabolismo do Ferro .......................................................................................29 1.5.1 Absorção de Ferro .........................................................................................29 1.5.2 Transporte do Ferro .......................................................................................33 1.5.3 Estoque de Ferro ...........................................................................................34 1.6 Patogenia .........................................................................................................35 1.6.1 Sobrecarga de ferro .......................................................................................35 1.7 Hemocromatose Hereditária (HH) .....................................................................38 1.7.1 Hemocromatose Hereditária HFE ..................................................................40 1.7.2 Hemocromatose Hereditária Não-HFE ...........................................................41 1.8 Hemocromatose Adquirida (Secundária) ..........................................................42 2 DESENVOLVIMENTO .........................................................................................44 2.1 OBJETIVOS......................................................................................................44 2.2. CASUÍSITICA E MÉTODOS ............................................................................45 2.2.1 Casuística ......................................................................................................45 2.2.2 Métodos .........................................................................................................45 2.2.2.1 Extração do DNA ........................................................................................45 2.2.2.2 Amplificação do DNA ..................................................................................46 2.2.2.2.1 Gene HFE ................................................................................................46 2.2.2.3 Digestão do DNA amplificado com enzima de restrição ..............................47 2.2.2.4 PCR para amplificação do gene SLC40A1 ..................................................48 2.2.2.5 Purificação das Amostras de PCR para Reação de Sequenciamento .........50 2.2.2.6 Reação de Sequenciamento .......................................................................50 2.2.2.7 Genotipagem ..............................................................................................50 2.2.2.8 Método estatístico .......................................................................................51 2.3 RESULTADOS ................................................................................................52 2.3.1 Descrições dos Casos de Pacientes com Hemocromatose Hereditária e Adquirida (secundária) ............................................................................................52 2.3.2 Descrição do Caso de Mutação no Gene SLC40A1 no paciente com Hemocromatose Hereditária ...................................................................................66 2.3.3 Descrições dos Casos de Polimosfismo no Gene SLC40A1 ..........................69 2.3.4 Descrições dos Casos de Mutação C282Y no Gene HFE e polimorfismo no gene SLC40A1 nos pacientes com Hemocromatose Hereditária .......................69 2.4 DISCUSSÃO.....................................................................................................73 3 CONCLUSÕES ....................................................................................................85 REFERÊNCIAS ......................................................................................................86 ANEXOS ................................................................................................................93