avaliaÇÃo das propriedades psicofarmacolÓgicas …

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

MARCEL ANDRIGO MAIA

AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO

EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum:

ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA

Itajaí

2016

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

MARCEL ANDRIGO MAIA

AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO

EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum:


Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientação: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza

Co-orientação: Profa. Dra. Ângela Malheiros

Itajaí, setembro de 2016

FICHA CATALOGRÁFICA

M28a

Maia, Marcel Andrigo, 1988-

Avaliação das propriedades psicofarmacológicas do extrato etanólico

obtido das folhas de piper cernuum [Manuscrito] : ênfase na atividade antidepressiva / Marcel Andrigo Maia. – 2016.

161 f. : il. : 30 cm..

Cópia de computador (Printout(s)).

Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de

Mestrado em Ciências Farmacêuticas Área de Concentração em Produtos naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas 2016.

―Orientadora: Profª. Drª Márcia Maria de Souza ;

―Co-orientadora: Prof. Dra. Ângela Malheiros ‖.

Bibliografia: f. 129-160. Inclui: Gráficos.

1. Depressão mental. 2. Pariparoba – plantas medicinais.

3. Antidepressivos. 4. Extratos vegetais – uso terapêutico. I.

Souza, Márcia Maria de. II. Malheiros, Ângela. II. Título.

CDU: 615.214

Claudia Bittencourt Berlim – CRB 14/963

AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADEDES PSICOFARMACOLÓGICAS

DO EXTRATO ETANÓLICOOBITIDO DAS FOLHAS DE Piper

cernuum: ÊNFASE NA ATIVIDADE ANTIDEPRESSIVA

Marcel Andrigo Maia

‗Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.‘

____________________________________ Márcia Maria de Souza, Dra

Orientadora

__________________________________________________________

Clóvis Antonio Rodrigues, Dr Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________

Dra Márcia Maria de Souza Presidente

______________________________________ Dra Ângela Malheiros (UNIVALI)

Co-orientadora

______________________________________ Dr Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI)

Membro

______________________________________

Dra Fátima de Campos Buzzi (UNIVALI) Membro

____________________________________ Dra Ana Lúcia Bertarello Zeni (FURB)

Membro

Itajaí (SC), setembro de 2016

Dedico esse trabalho as duas pessoas mais importantes em minha vida, exemplo de seres humanos,

os quais são responsáveis pelo que sou hoje e serei amanhã, meus pais que amo muito,

Adelci e José.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meus pais Adelci e José, sempre me apoiando

nos momentos difíceis, sempre com uma palavra de apoio e incentivo. Tenho muito

orgulho de tê-los como referência em minha vida, e tudo que faço é para que sintam

orgulho de mim.

Aos meus irmãos Francielli e Rodrigo, pelo apoio e companheirismo.

E sem dúvida alguma, não posso deixar de agradecer a minha amada

Mariana, que juntos tivemos a coragem necessária para abandonar a nossa vida

tranquila, e arriscar a alcançar um dos nossos objetivos que tínhamos em comum,

que era o mestrado. Só nós sabemos as dificuldades que passamos as noites mal

dormidas, a saudade de nossas famílias, o pouco tempo que tivemos para ficarmos

juntos, mas sempre focando no que queríamos. Agradeço a Deus por ter colocado

você em meu caminho, te amo muito e obrigado por estar aqui comigo.

A professora Márcia Maria de Souza, que me acolheu no momento em que

cheguei aqui, perdido, sem projeto, sem nem saber o que fazer, mas conforme foi

passandoo tempo fomos nos conhecendo e tudo foi se encaminhando. Obrigado por

todo o conhecimento que me passou, e tenha certeza que será de grande valia para

o meu futuro.

Agradeço também a pós doc Luísa Mota, que me ajudou imensamente na

parte bioquímica e em tantas outras do meu trabalho. Sou muito grato por todo o

tempo que esteve disponível para mim no laboratório, e tenha certeza que aprendi

muito.

Agradeço a Jocilene Jurcevic, primeiramente por me familiarizar com os

modelos animais, e segundo, por me fornecer o extrato da Piper cernumm para

seguir o trabalho.

Aos meus colegas da iniciação científica Camila Cazarin, Camila do Espírito

Santo e o Lucas que sempre estiveram no laboratório me ajudando, meu muito

obrigado.

Agradeço a todos que de alguma forma estiveram ao meu lado, meu muito

obrigado.

“Você nunca sabe que resultados virão da sua ação. Mas se você não fizer nada, não existirão resultados.”

Mahatma Gandhi

AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES PSICOFARMACOLÓGICAS DO EXTRATO ETANÓLICO OBTIDO DAS FOLHAS DE Piper cernuum:


Marcel Andrigo Maia Setembro/2016

Orientadora: Márcia Maria de Souza, Dra.

Co-orientadora: Ângela Malheiros, Dra. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas. Número de Páginas: 161 p.

A depressão é considerada uma das principais doenças do sistema nervoso central

(SNC), e apresenta como principais sintomas humor deprimido, anedonia e retardo psicomotor. Vários fatores podem estar envolvidos na fisiopatologia dos processos depressivos, dentre eles os genéticos, ambientais e neuroquímicos. Em trabalhos

anteriores conduzidos em nossos laboratórios verificou-se que a Piper cernuum conhecida popularmente como ―Pariparoba‖, ―João-guarandi-do-grado‖ e ―Pimenta-

de-Morcego‖, apresentou atividade tipo-antidepressiva em experimentos preliminares. Dando continuidade nesse estudo investigou-se as propriedades psicoativas da planta em diversos modelos farmacológicos in vivo, além de avaliar o

possível mecanismo de ação da propriedade antidepressiva. Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas (25-30 g) de 3 meses os quais foram tratados com o

extrato etanólico de Piper cernuum (EEPC/50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles (negativo e positivo) e submetidos a avaliação das propriedades psicoativas em diferentes modelos animais. Para avaliação da atividade locomotora (teste de campo

aberto/TCA); atividade anticonvulsivante (teste do pentilenotetrazol/PTZ e da estricnina/ESTRIC); atividade hipnótica (modelo de indução do sono por

barbitúricos/MSB); atividade nootrópica (modelo da esquiva inibitória/MEI); atividade ansiolítica (labirinto em cruz elevado/LCE) e atividade antidepressiva (teste do nado forçado/TNF e teste de suspensão pela cauda/TSC). Para o estudo do mecanismo

de ação da atividade antidepressiva o modelo de depressão adotado foi o TNF, onde investigou-se a influência dos sistemas serotonérgico, noradrenérgico,

dopaminérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico, GABAérgico e opióide sobre a ação do EEPC (50 mg/kg, v.o.). Também foi avaliado o tempo de ação da propriedade tipo-antidepressiva do EEPC e seu efeito quando administrado subcronicamente. Em

modelos in vitro foi avaliado a capacidade antioxidante do EEPC pelo método de DPPH. Em modelos ex vivo foi avaliado seu efeito sobre a atividade das enzimas

glutationa reduzida (GSH); superóxido dismutase (SOD); catalase (CAT); glutationa peroxidase (GPx); glutationa-S-transferase (GST), bem como sua ação sobre a lipoperoxidação (LPO), a monoaminooxidase-A (MAO-A) e a influência sobre a

atividade do óxido nítrico (NO). O tratamento com EEPC (50, 100, 150 mg/kg) não alterou a performance motora dos animais, e nem exibiu efeito anticonvulsivante

tanto de forma aguda como subcrônica (14 dias) nas convulsões induzidas por PTZ ou ESTRIC. O EEPC (100 e 150 mg/kg) apresentou efeito hipnótico, mas não exibiu efeito nootrópico ou ansiolítico. O efeito tipo-antidepressivo foi observado no

tratamento agudo no TSC e agudo e subcrônico no TNF, tendo essa atividade duração de até 4 horas. Quando investigado os sistemas neurotransmissores e/ou

receptores farmacológicos envolvidos no efeito tipo-antidepressivo do EEPC,

verificou-se que seu efeito foi revertido com o pré-tratamento com reserpina (4

mg/kg, um inibidor do transportador vesicular das monoaminas), NAN-190 (0,5 mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT1A), ondansetrona (0,5

mg/kg, antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT3), prazosin (1 mg/kg, antagonista α1-adrenérgico), haloperidol (0,2 mg/kg, antagonista dopaminérgico não seletivo), pimozide (0,2 mg/kg, antagonista dopaminérgico D2), SCH23390 (0,05

mg/kg, antagonista dopaminérgico D1), L-arginina (750 mg/kg, precursor do óxido nítrico), L-NAME (10 mg/kg, inibidor inespecífico das óxido nítrico sintases (NOS), 7-

NI (25 mg/kg, inibidor da NOS neuronal), azul de metileno (20 mg/kg, inibidor da NOS e da guanilato ciclase solúvel (GCs), sildenafil (5 mg, i.p., inibidor PDE-5), bicuculina (1 mg/kg, antagonista dos receptores GABA-A). E ocorreu um sinergismo

entre EEPC e a quetamina (0,1 mg/kg, antagonista não competitivo do receptor NMDA). O EEPC apresentou atividade antioxidante pelo método de DPPH. Com

relação ao sistema de oxidação enzimática verificou-se que houve diminuição das atividades da CAT, GPx, GST e aumento na atividade da GSH. O EEPC não alterou a LPO. A atividade da MAO-A e do NO também foi diminuída pelo tratamento com

EEPC. Os resultados em conjunto sugerem que o EEPC exibe atividade antidepressiva e hipnótica. Porém não apresenta atividade ansiolítica e

anticonvulsivante. O tratamento com EEPC não afeta a performance motora dos animais nem a memória dos mesmos. O efeito tipo–antidepressivo do EEPC é duradouro e não altera-se com o uso subcrônico. O mecanismo de ação do efeito

tipo-antidepressivo dos EEPC parece envolver os sistemas das monoaminas (5-HT, NA e DA), a via oxidonitrérgica, glutamatérgica e GABAérgica. Além de inibir o

estresse oxidativo e a atividade da enzima MAO. Os resultados apontam o EEPC como potencial alvo para a terapêutica da depressão. Palavras-chave: Piper cernuum, depressão, mecanismo de ação antidepressivo.

EVALUATION OF THE PSYCOPHARMACOLOGICAL PROPERTIES OF ETHANOLIC EXTRACT OF LEAVES OF Piper cernuum:

EMPHASIS ON ANTIDEPRESSANT ACTIVITY

Marcel Andrigo Maia September/2016

Supervisor: Dr. Márcia Maria de Souza. Co-supervisor: Dr. Ângela Malheiros. Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances

Number of Pages: 161 p.

Depression is considered one of the main disorders of the central nervous system (CNS). Its main symptoms are depressive mood, anhedonia and psychomotor retardation. Several factors may be involved in the pathophysiology of depressive

processes, including genetic, environmental and neurochemical factors. In previous studies conducted in our laboratory, we found that Piper cernuum, popularly known

as "Pariparoba", "João-guarandi-do-grado" and "Pimenta-de-morcego" in Brazil, presented potential antidepressant in preliminary experiments. Continuing this study, we investigated the psychoactive properties of the plant in several in vivo

pharmacological models, and evaluated the possible mechanism of action of its antidepressant property. Three-month old female Swiss mice (25-30 g) were used in the study. The mice were treated with ethanolic extract of Piper cernuum (EEPC/50,

100 and 150 mg/kg, by the oral route) and controls (positive and negative), then the psychoactive properties were evaluated in different animal models. The following

activities were evaluated: locomotor activity (open field test/TCA); anticonvulsant activity (pentylenetetrazol test/PTZ and strychnine/ESTRIC); hypnotic activity (sleep-inducing model barbiturates/MSB); nootropic activity (memory test inhibitory

avoidance/MEI); anxiolytic activity (elevated plus maze/LCE) and antidepressant activity (forced swimming test/TNF) and tail suspension test/TSC). To study the

mechanism of action of antidepressant activity, the depression model adopted was TNF, in which we investigated the influence of the serotonergic, noradrenergic, dopaminergic , glutamatergic , oxidonitrergic , GABAergic and opioid systems on the

action of EEPC (50 mg/kg). We also assessed the duration of the action of the antidepressant property of EEPC, and its effect when used subchronically. In vitro

models, free radical scavenging activity of EEPC was evaluated by the DPPH method. In ex vivo models, its effect on reduced activity of gluthione enzymes (GSH); superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); glutathione peroxidase (GPx); and

glutathione-S-transferase (GST) was evaluated, as well as its action on lipid peroxidation (LPO); on enzyme monoamine oxidase-A (MAO-A), and the influence

on the activity of nitric oxide (NO). Treatment with EEPC (50, 100, 150 mg/kg) did not alter the motor performance of the animals, neither did it exhibit anticonvulsant effect, whether in acute or subchronic form (14 days) in PTZ or STRIC induced seizures.

EEPC (100 and 150 mg/kg ) had hypnotic effect, but did not exhibit nootropic or anxiolytic effect. Antidepressant-like effect was observed in acute treatment in TSC,

and acute and subchronic in TNF, and this activity lasted for up to 4 hours. When investigating the neurotransmitter systems and/or pharmacological receptors involved in the antidepressant effect of EEPC, it was demonstrated that its antidepressant-like

effect was reversed by pretreatment of mice with reserpine (4 mg/kg, an vesicular

monoamine carrier inhibitor), NAN-190 (0.5 mg/kg, of antagonist serotonergic 5-

HT1A), ondansetron (0.5 mg/kg, antagonist serotonergic 5-HT3), prazosin (1 mg/kg, α1 adrenergic antagonist), haloperidol (0.2 mg/kg, nonselective dopamine

antagonist), pimozide (0.2 mg/kg, dopaminergic D2 antagonist), SCH23390 (0.05 mg/kg, dopamine D1 antagonist), L-arginine (750 mg/kg, precursor to nitric oxide), L-NAME (10 mg/kg, nonspecific inhibitor of NO synthase nitric oxide), 7-NI (25 mg/kg,

of inhibitors NOS neuronal), blue methylene (20 mg/kg, a NOS and GCs inhibitor), sildenafil (5 mg, i.p., a PDE-5 inhibitor), and bicuculline (1 mg/kg, a GABA receptor

antagonist). There was synergy between EEPC and ketamine (0.1 mg/kg, non-competitive NMDA receptor antagonist). EEPC demonstrated antioxidant activity by the DPPH method. With regard to the effects of EEPC on the enzymatic oxidation

system, it was found that there was a decrease in the activities of CAT, GPx, GST, an increase in the GSH, and no change in LPO. MAO-A and NO activity was also

decreased with EEPC treatment. Taken together, the results suggest that EEPC displays antidepressant and hypnotic activity. However, it does not present anxiolytic and anticonvulsant activity. The motor performance and memory of the animals

treated with EEPC was not affected. The antidepressant-like effect of EEPC is long-lasting, and does not change with subchronic use. The mechanism of action of the

antidepressant-like effect of EEPC appears to involve the monoamines (5-HT, and NOR, DA) systems, the oxidonitregic, glutamatergic and GABAergic pathways. It also inhibited oxidative stress and MAO-A enzyme activity. The results show the potential

of EEPC as a possible target for depression therapy. Keywords: Piper cernuum, depression, antidepressant mechanism of action.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Teoria monoaminérgica da depressão ............................................................ 36

Figura 2. Síntese do NO ..................................................................................................... 41

Figura 3. Mercado mundial de medicamentos fitoterápicos.......................................... 51

Figura 4. Artigos científicos publicado por brasileiros entre os períodos de 1987 e

2015 ........................................................................................................................................ 51

Figura 5. Partes aéreas da Piper cernuum ...................................................................... 54

Figura 6. Estrutura química do trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina ..................... 57

Figura 7. Partes do SNC de camundongos utilizadas para obtenção das amostras.

................................................................................................................................................. 70

Figura 8. Efeito do EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) sobre os parâmetros

locomotores dos animais submetidos ao TCA............................................................... 75

Figura 9. Efeito do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ e estricnina. ...... 77

Figura 10. Efeito do tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre o sono

induzido por barbitúrico ........................................................................................................ 79

Figura 11. Efeito do tratamento do EEPC sobre a memória dos animais submetidos

ao MEI..................................................................................................................................... 80

Figura 12. Efeito do tratamento do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e diazepam (0.75

mg/kg) sobre parâmetros comportamentais de animais submetidos ao modelo de

ansiedade, o teste do labirinto em cruz elevado.............................................................. 81

Figura 13. Efeito tipo antidepressivo do EEPC e imipramina através do TNF .......... 82

Figura 14. Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30

mg/kg) em animais submetidos ao TSC .......................................................................... 83

Figura 15. Efeito tipo-antidepressivo com o tratamento sub-crônico do EEPC (50

mg/kg) e fluoxetina (10 mg/kg) em camundongos submetidos ao TNF ...................... 84

Figura 16. Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (50 mg/kg)

em animais submetidos ao TNF ......................................................................................... 85

Figura 17. Efeito tipo-antidepressivo do tratamento da αβ-cubebina e do trans-

dihidroagarofurano em camundongos submetidos ao TNF ........................................... 86

Figura 18. Efeito da reserpina sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC. ....... 87

Figura 19. Efeito do PCPA, NAN-190, ondansetrona e ketanserina, na atividade tipo-

antidepressivo do EEPC no TNF. ...................................................................................... 89

Figura 20. Influência da ioimbina e prazosin no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

(50 mg/kg, v.o.)...................................................................................................................... 91

Figura 21. Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC ...................................................................................................... 93

Figura 22. Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

................................................................................................................................................. 95

Figura 23. Influência dos tratamentos com L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de

metileno e sildenafi l sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC................................. 97

Figura 24. Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

................................................................................................................................................. 99

Figura 25. Influência da naloxona e naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

............................................................................................................................................... 100

Figura 26. Efeito antioxidante do EEPC, através da atividade sequestradora do

radical livre DPPH ............................................................................................................... 101

Figura 27. Efeito da administração do EEPC sobre os npiveis da GSH................... 102

Figura 28. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima SOD ... 102

Figura 29. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima CAT... 104

Figura 30. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima GPx .... 105

Figura 31. Efeito da administração do EEPC sobre a enzima GST .......................... 106

Figura 32. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da LPO.................. 107

Figura 33. Efeito da administração do EEPC sobre os níveis da enzima MAO-A .. 108

Figura 34. Efeito da administração do EEPC através dos níveis de NO .................. 109

LISTA DE ABREVIATURAS 5-HT = serotonina

7-NI = 7-nitroindazol

a.C = antes de Cristo

ACTH = hormônio adrenocorticotrófico

AMPA = ácido α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiônico

ATC = ácido tricloroacético

ATP = trifosfato de adenosina

Bcl-2 = proteína anti-apoptótica

BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro

BHT = butil hidróxi tolueno

CAT = catalase

CDNB = 1-cloro-2,4 dinitrobenzeno

CoQH2 = citocromo C redutase

DA = dopamina

DCFH = diclorofluoresceína

DMSO = dimetilsulfóxido

DPPH = 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

DSM-V = Manual Estatístico e Diagnóstico de Transtornos Mentais

DTNB = 5,5‘-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico

EEPC = extrato etanólico de Piper cernuum

eNOS = óxido nítrico sintase endotelial

EPM = erro padrão médio

EROs = espécies reativas de oxigênio

ESTRIC = estricnina

GABA = ácido gama-aminobutírico

GCs = guanilato ciclase solúvel

GLU = glutamato

GMPc - monofosfato cíclico de guanosina

GPx = glutationa peroxidase

GSH = glutationa reduzida

GST = glutationa-S-transferase

GTP = guanosina trifosfato

HPA = hipotálamo-pituitária-adrenal

i.c.v. = intracérebroventricular

i.p. = intraperitonial

IMAO = inibidores da monoaminoxidase

iNOS = óxido nítrico sintase induzível

ISRN – inibidores seletivos da recaptação da noradrenalina

ISRS = inibidores seletivos da recaptação da serotonina

LCE = labirinto em cruz elevado

L-NAME= N-nitro-L-arginina metil éster

LPO = lipoperoxidação

MAO = monoaminoxidase

MEI = teste de memória a esquiva inibitória

MSB = modelo de sono induzido por barbitúrico

NA = noradrenalina

NADPH = fosfato dinucleótideo adenina nicotinamida

NMDA = N-metil-D-aspartato

nNOS = óxido nítrico sintase neuronal

NO = óxido nítrico

NOS = óxido nítrico sintase

OMS = Organização Mundial da Saúde

PCPA = paraclorofenilalanina

PDE-5 = fosfodiesterase-5

PKG = proteínas quinases dependentes de GMPc

PTZ = pentilenotetrazol

SNC = Sistema Nervoso Central

SOD = superóxido dismutase

TCA = teste de campo aberto

TNF = teste do nado forçado

TNFα = fator de necrose tumoral

TRIS = hidroximetilaminometano

TSC = teste de suspensão pela cauda

v.o. = via oral

ZSG = zona subgranular

ZSV = zona subventricular

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................27

2 OBJETIVOS ........................................................................................................................31

2.1 Objetivo Geral: ...............................................................................................................31

2.2 Objetivos Específicos: .................................................................................................31

3 REVISÃO DA LITERATURA ...........................................................................................33

3.1 Depressão: aspectos gerais.......................................................................................33

3.1.1 Neuroquimica da depressão .................................................................................. 34

3.1.1.1 Teoria monoaminérgica ....................................................................................... 34

3.1.1.2 Glutamato e Depressão ....................................................................................... 39

3.1.1.3 Envolvimento da via L-arginina-NO-GMPc na depressão .......................... 40

3.1.1.4 Via GABAérgica e depressão ............................................................................. 42

3.1.1.5 Envolvimento da via opióide na depressão ................................................... 44

3.1.1.6 Estresse oxidativo e depressão ........................................................................ 45

3.1.1.7 Envolvimento da atividade da enzima MAO na depressão ........................ 48

3.1.1.8 Neurogênese e depressão .................................................................................. 49

3.2 Plantas medicinais com atividades antidepressivas. .........................................50

3.3 Da planta em estudo: Piper cernuum ......................................................................53

3.3.1 Compostos presentes na Piper cernuum: αβ-cubebina e o trans-

dihidroagarofurano ............................................................................................................ 56

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................59

4.1 Material.............................................................................................................................59

4.1.1 Preparação do extrato ............................................................................................. 59

4.1.2 Substâncias utilizadas e vias de administração .............................................. 59

4.2 Métodos ...........................................................................................................................60

4.2.1 Avaliação farmacológica in vivo........................................................................... 60

4.2.1.1 Animais .................................................................................................................... 60

4.2.1.2 Avaliação do EEPC sobre o sistema motor dos animais através do

modelo de deambulação - Teste de Campo Aberto (TCA) ...................................... 61

4.2.1.3 Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ

................................................................................................................................................. 61

4.2.1.4 Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas

quimicamente por ESTRIC ............................................................................................... 62

4.2.1.5 Avaliação do efeito do EEPC sobre o sono induzido por barbitúrico

(MSB) ...................................................................................................................................... 62

4.2.1.6 Avaliação do efeito do EEPC sobre a memória através do modelo da

esquiva inibitória (MEI)...................................................................................................... 63

4.2.1.7 Avaliação do efeito do EEPC sobre a ansiedade dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE) ................................................................ 63

4.2.1.8 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC através do TNF ... 64

4.2.1.9 Avaliação do efeito antidepressivo do EEPC através do Teste de

Suspensão pela Cauda (TSC) .......................................................................................... 64

4.2.1.10 Avaliação do efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento

sub-crônico dos animais .................................................................................................. 65

4.2.1.11 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EEPC (Time course) ........................................................................................................... 65

4.2.1.12 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados

presentes na Piper cernuum, αβ-cubebina e o trans-dihidroagarofurano. ........ 65

4.2.1.13 Determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do

EEPC ...................................................................................................................................... 66

4.2.1.13.1 Avaliação da influência da reserpina sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EEPC ................................................................................................... 66

4.2.1.13.2 Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade

tipo-antidepressiva do EEPC........................................................................................... 66

4.2.1.13.3 Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a atividade


4.2.1.13.4 Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade


4.2.1.13.5 Avaliação da influência do sistema glutamatérgico sobre a atividade


4.2.1.13.6 Avaliação da influência da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade


4.2.1.13.7 Avaliação da Influência do sistema GABAérgico sobre a atividade


4.2.1.13.8 Avaliação da Influência do sistema opióide sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EEPC ................................................................................................... 68

4.2.2 Modelos bioquímicos: Avaliação de parâmetros oxidativos ........................ 69

4.2.2.1 Preparação das amostras ................................................................................... 69

4.2.2.2 Mensuração da concentração de proteínas ................................................... 70

4.2.2.3 Avaliação da atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-

picrilhidrazil (DPPH) ........................................................................................................... 70

4.2.2.4 Quantificação dos níveis de GSH ..................................................................... 71

4.2.2.5 Determinação da atividade enzimática da SOD ............................................ 71

4.2.2.6 Quantificação da atividade da enzima CAT.................................................... 72

4.2.2.7 Quantificação dos níveis da atividade da enzima GPx ............................... 72

4.2.2.8 Determinação da atividade da atividade da GST .......................................... 72

4.2.2.9 Quantificação da lipoperoxidação (LPO) ........................................................ 73

4.2.2.10 Quantificação dos níveis da atividade da enzima MAO-A ....................... 73

4.2.2.11 Quantificação da atividade do NO .................................................................. 74

4.3 Análise estatística .........................................................................................................74

5 RESULTADOS ...................................................................................................................75

5.1 Efeito na atividade locomotora do EEPC através do TCA em camundongos75

5.2 Avaliação da atividade tipo-anticonvulsivante aguda e sub-crônica do

EEPC, nos modelos do PTZ e estricnina.......................................................................76

5.3 Avaliação da atividade tipo-hipnótica do EEPC sobre o sono induzido por

barbitúrico em camundongos ..........................................................................................78

5.4 Avaliação da atividade tipo-nootrópica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre

a memória de animais avaliados através do MEI ........................................................79

5.5 Avaliação da atividade tipo-ansiolítica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre

parâmetros de animais submetidos ao modelo de ansiedade, o LCE.................80

5.6 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC .........................................81

5.6.1 Efeito tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg)

em animais submetidos ao TNF ..................................................................................... 81

5.6.2 Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30

mg/kg) submetidos ao TSC .............................................................................................. 82

5.6.3 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC em o tratamento sub-

crônico ................................................................................................................................... 83

5.7 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC

(Time course) ........................................................................................................................84

5.8 Avaliação do efeito tipo-antidepressivo da αβ-cubebina e do trans-

dihidroagarofurano em animais submetidos ao TNF ................................................85

5.9 Avaliação do sistema monoaminérgico sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EEPC ....................................................................................................86

5.9.1 Influência da reserpina no efeito tipo-antidepressivo do EEPC .................. 86

5.10 Avaliação do sistema serotonérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC .................................................................................................................................87

5.10.1 Influência dos tratamentos com PCPA, NAN-190, ondansetrona e

ketanserina, sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC em camundongos

submetidos ao TNF ............................................................................................................ 87

5.11 Avaliação do sistema noradrenérgico sobre a atividade tipo-


5.11.1 Influência da ioimbina e do prazosin na atividade tipo-antidepressiva do

EEPC ...................................................................................................................................... 90

5.12 Avaliação do sistema dopaminérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC .................................................................................................................................91

5.12.1 Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC em animais submetidos ao TNF ...................................... 91

5.13 Avaliação do sistema glutamatérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC .................................................................................................................................94

5.13.1 Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

em animais submetidos ao TNF ..................................................................................... 94

5.14 Avaliação da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade tipo-


5.14.1 Influência dos tratamentos com da L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de

metileno e sildenafil no efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do TNF ... 95

5.15 Avaliação do sistema GABAérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC .................................................................................................................................98

5.15.1 Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do

EEPC em animais submetidos ao TNF ......................................................................... 98

5.16 Avaliação do sistema opióide sobre a sobre a atividade tipo-


5.16.1 Influência da naloxona e do naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do

EEPC através do TNF via receptores opióides........................................................... 99

5.17 Modelos bioquímicos: Estresse Oxidativo ....................................................... 101

5.17.1 Avaliação da atividade sequestradora do radical livre (DPPH) ............... 101

5.17.2 Quantificação da atividade da GSH ................................................................. 101

5.17.3 Quantificação da atividade da enzima SOD .................................................. 102

5.17.4 Avaliação da atividade da enzima CAT ......................................................... 103

5.17.5 Quantificação da atividade da enzima GPx ................................................... 104

5.17.6 Quantificação da atividade da enzima GST................................................... 105

5.17.7 Quantificação da atividade da LPO ................................................................. 106

5.17.8 Quantificação dos níveis da enzima MAO-A ................................................. 107

5.17.9 Quantificação dos níveis de NO ....................................................................... 108

6. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 111

7. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 127

REFERÊNCIAS................................................................................................................... 129

ANEXO – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS

CEUA/UNIVALI ................................................................................................................... 161

27

1 INTRODUÇÃO

A depressão é um transtorno mental que afeta a população mundial

indiferentemente da classe social a qual o indivíduo pertença. A depressão maior

(forma de depressão mais expressiva na população) apresenta como principais

características as alterações de humor, baixa autoestima, distúrbios do sono,

prejuízo nas funções cognitivas, psicomotoras e sociais, podendo até mesmo

culminar no suicídio (TANTI; BELZUNG, 2010).

O índice desse transtorno é altamente prevalente, sendo uma das

reclamações mais comuns em serviços de atenção primária. Além disso, é uma das

formas de doença mental que mais compromete a qualidade de vida dos pacientes,

sendo considerada a principal causa de incapacidade dentre as desordens

neuropsiquiátricas (ROSENBAUM et al., 2016). A depressão afeta 5% da população

mundial, ou seja, mais de 350 milhões de pessoas, de todas as faixas etárias,

apresentando maior incidência em mulheres. E, estudos longitudinais sugerem que a

incidência da depressão aumente para 41% na população mundial até o ano de

2020 (MOFFITT et al., 2010; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016).

A dificuldade em fazer um diagnóstico preciso, e o alcance de melhores

resultados nos tratamentos dos pacientes depressivos se deve ao fato de que a

fisipatologia da depressão maior permanece obscura. A partir do momento que for

elucidado os processos envolvidos na etiologia da doença, poder-se-á direcionar

tratamentos mais específicos para cada indivíduo, estabelecendo dessa forma,

resultados mais satisfatórios aos pacientes (NESSE; STEIN, 2012).

Em termos fisiopatológicos, estudos sugerem que morfologicamente ocorre

uma atrofia e alteração no volume de algumas regiões cerebrais de pacientes

depressivos como o hipocampo e o prosencéfalo e, também alguns sistemas

cerebrais apresentam alterações importantes (KRISHNAN; NESTLER, 2008;

SERAFINI et al., 2014). Várias vias de sinalização intracelular que regulam a

neuroplasticidade também estão alteradas, por exemplo, ocorre alterações nos

sistemas das monoaminas, como a serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT),

noradrenalina (NA) e dopamina (DA) havendo uma diminuição desses

neurotransmissores na fenda sináptica (MALYKHIN; COUPLAND, 2015; SHENG;

ERTÜRK, 2013; STAHL, 2010), ou ainda, ocorre uma ineficiência e/ou disfunção dos

seus receptores específicos (DURISKO et al., 2015; SAVEANU; NEMEROFF, 2012).

28

Entretanto, outros sistemas de neurotransmissores estão sendo estudados

atualmente, como por exemplo, o sistema glutamatérgico (GERHARD et al., 2016),

opióide (PANKSEPP; YOVELL, 2014), oxidonitrérgico (DHIR ;KULKARNI, 2011),

GABAérgico, colinérgico (PYTKA et al., 2016), também estão sendo associados com

a fisiopatologia da depressão, mostrando que as bases neuroquímicas dessa

doença não se resume somente ao sistema monoaminérgico.

O avanço nas pesquisas e a quantidade de fármacos disponíveis no mercado

ainda não suprem as necessidades reais na terapêutica da depressão, uma vez que

a maioria desses medicamentos não são eficazes em grande parte dos pacientes.

Essa carência de fármacos faz com que haja atualmente, principalmente em países

Europeus o aumento na utilização de plantas medicinais na terapêutica da doença e,

várias são as espécies usadas baseadas na medicina tradicional que possuem essa

atividade antidepressiva (BARTH et al., 2013; BUTLER; PILKINGTON, 2013;

SARRIS et al., 2012).

Nos países em desenvolvimento a prática de utilizar plantas medicinais para o

tratamento de determinadas patologias é muito comum. Percebe-se também um

aumento significativo no uso de plantas em países desenvolvidos. Cerca de 80% da

população mundial faz o uso de plantas medicinais. Estimativas indicam que dos 4

bilhões de habitantes do mundo, 80% desses, não podem pagar pelos

medicamentos industrializados, o que acarreta em um maior consumo de produtos

de origem natural (JOY et al., 2001). O Brasil apresenta uma grande biodiversidade

de plantas, o que favorece os estudos para o desenvolvimento de novos fármacos.

Nesse contexto, o gênero Piper apresenta grande potencial farmacológico,

dentre os quais são apontados às ações antifúngicas e bacteriostáticas

(BAUMGARRT, 2007). Além disso, já foram descritos efeitos analgésicos (SILVA et

al., 2014), vasodilatadores CARVALHO et al., 2013), antioxidante (SALLEH et al.,

2015), antitumoral (GIROLA et al., 2015) e anti-inflamatórios (DORMAN; DEANS,

2000; SALLEH et al., 2015; BRAIT et al., 2015). Também é reportado na literatura

para o gênero, espécies que apresentam atividade sobre o SNC, atuando em

distúrbios de ansiedade (HRITCU, et al., 2015), convulsão (SCHMITZ et al., 1995) e

depressão (SARRIS et al., 2009). Dentre os representantes do gênero com

propriedades psicoativas, destaca-se a Kava-kava (Piper methysticum), indicada no

tratamento da insônia e ansiedade, atuando como sedativo leve (JUSTO; SILVA,

2008; SARRIS, 2012).

29

A Piper cernuum conhecida popularmente como ―Pariparoba‖ é uma planta

nativa da Mata Atlântica. Suas folhas são amplamente utilizadas na medicina

popular como analgésico, em distúrbios renais e no tratamento da hepatite (DI

STASI et al., 2002). Estudos realizados por Jurcevic (2015) demonstraram que o

extrato etanólico das folhas exibe efeito tipo-antidepressivo em testes preditivos de

depressão. Por pertencer a um gênero no qual há inúmeras espécies com

características farmacológicas importantes e, por ser pouco explorada

farmalogicamente, no presente estudo nós propomos aprofundar a investigação das

propriedades psicoativas da planta e investigar os mecanismos de ação envolvidos

na propriedade antidepressiva, a partir dos resultados preliminares já existentes.

Acreditando que o efeito tipo-antidepressivo da planta ocorre em decorrência dos

seus compostos majoritários, torna-se relevante avaliar também a atividade do trans-

dihidroagarofurano e da αβ-cubebina.

31

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar as propriedades psicofarmacológicas do extrato etanólico obtido das

folhas de Piper cernuum, aprofundando a investigação sobre a ação antidepressiva.

2.2 Objetivos Específicos:

Avaliar o efeito do extrato etanólico da planta em animais submetidos a modelos

utilizados no estudo de substâncias psicoativas (teste de campo aberto, convulsão

induzida por pentilenotetrazol e estricnina, sono induzido por barbitúrico, esquiva

inibitória e labirinto em cruz elevado);

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC em modelos agudos de depressão o

TNF e TSC;

Avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC administrado subcronicamente;

Determinar o tempo de ação (time course) do efeito tipo- antidepressivo do EEPC;

Investigar se o efeito tipo antidepressivo do EEPC está relacionado aos dois

fitoconstituíntes majoritários do extrato da planta, a αβ-cubebina e o trans-

dihidroagarofurano;

Investigar o envolvimento do sistema serotonérgico, noradrenérgico, dopaminérgico,

glutamatérgico, oxidonitrérgico, GABAérgico e sistema opióide no mecanismo de

ação do efeito tipo- antidepressivo do EEPC;

Avaliar o potencial antioxidante do EEPC, através de modelos in vitro;

Avaliar a ação do EEPC sobre as enzimas antioxidantes cerebrais e sobre a

peroxidação lipídica através de modelos ex vivo;

32

Avaliar a ação do EEPC sobre a atividade da enzima MAO-A através de modelos ex

vivo;

Avaliar a influência do EEPC sobre os níveis de óxido nítrico através de modelos ex

vivo.

33

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Depressão: aspectos gerais

A depressão é conhecida como uma doença da contemporaneidade e ganhou

tal status após ser considerada um efeito colateral da pós-modernidade. Entretanto,

a depressão é uma patologia já descrita há séculos. O primeiro termo a ser utilizado

para descrever os distúrbios de humor foi a melancolia, a qual teve sua origem na

Grécia antiga, alguns séculos a.C. Esse mesmo termo já era descrito nas produções

médicas de Hipócrates e nos textos de Aristóteles. Somente em meados do século

XIX, melancolia foi substituída pelo vocábulo ―depressão‖ e permanece até os

tempos atuais (SCLIAR, 2003; TEIXEIRA, 2005; CROCQ, 2015).

As síndromes que afetam o SNC são muito impactantes na população atual.

A depressão e a ansiedade, por exemplo, afetam mais de 740 milhões de pessoas

no mundo, ou seja, metade dos transtornos mentais. No Brasil essa incidência passa

dos 50%. Os transtornos depressivos são considerados os mais importantes do

SNC, sendo o principal fator de morbidade e incapacidade. Tais transtornos atingem

todas as classes socioeconômicas, aparecem em todas as idades indiferentemente

do sexo. Estimativas apontam que no Brasil cerca de 17 milhões de pessoas sofrem

com distúrbios depressivos, e crianças tem uma incidência de 2 a 5% (COLLINS et

al., 2011; GONÇALVES et al., 2014).

A depressão apresenta uma variedade de sintomas, e segundo o Manual

Estatístico e Diagnóstico de Transtornos Mentais – V (DSM-V) o paciente que

apresentar mais de cinco dos sintomas descritos abaixo, podem estar sofrendo de

distúrbio depressivo. São sintomas depressivos: acentuada diminuição do prazer ou

interesse em todas ou quase todas as atividades na maior parte do dia; humor

deprimido; sensação de cansaço e fadiga; baixa auto estima; perda da

concentração; perda ou ganho de peso acentuado; sentimento de culpa; insônia;

retardo psicomotor e pensamentos recorrentes de morte. Dependendo da

intensidade dos sintomas, os quadros depressivos podem até levar ao suicídio.

Esses sintomas têm que perdurar por pelo menos duas semanas, para cumprir os

critérios de diagnósticos (DUAILIB; SILVA, 2014; OMS, 2016).

O DSM-V classificou a depressão entre leve, moderada e grave, segundo a

quantidade e a gravidade dos sintomas presentes:

34

Leve: o paciente apresenta dois sintomas depressivos. Perde o interesse e o

prazer por coisas antes prazerosas. Porém mantém a sua rotina habitual sem perda

de rendimento;

Moderada: o paciente apresenta três sintomas. A rotina diária começa a ser

afetada, torna-se uma pessoa emocionalmente instável;

Moderada a grave: o paciente passa a apresentar quatro ou cinco sintomas.

Torna-se limitado e é comum apresentar comportamento suicida;

Grave: o paciente apresenta de cinco ou mais sintomas, além de agitação

motora, e tentativas diversas de suicídio. Torna-se incapaz de desempenhar as

funções rotineiras e necessita de acompanhamento intensivo.

Apesar da depressão maior apresentar uma alta incidência entre a população,

a etiologia desse processo permanece em partes obscura. Vários estudos buscam

compreender melhor as alterações cerebrais causadas nos processos depressivos.

Entretanto, alguns fatores dificultam essa descoberta: grande parte dos processos

depressivos são idiopáticos e, a etiologia encontra-se relacionada a fatores de risco

(doenças crônicas, estresse, endocrinopatias, efeitos colaterais de algumas drogas);

dificuldade em verificar alterações cerebrais em indivíduos vivos, possível somente

com a neuroimagem, utilizando marcadores indiretos de ativação que detectam

mudanças na atividade neuronal, porém, isto ainda é insuficiente para explicar a

variedade de sintomas envolvidos. Além disso, não há um modelo animal ideal que

mimetize todas as alterações cerebrais envolvidas em humanos; a limitação do

diagnóstico fenomenológico da depressão, assentada na heterogeneidade clínica do

transtorno e na sobreposição de sintomas com outras desordens neurológicas

(KRISHNAN; NESTLER, 2008).

3.1.1 Neuroquimica da depressão

3.1.1.1 Teoria monoaminérgica

Por muitos anos a teoria descrita por Schildkraut (1965) conhecida como

―teoria monoaminérgica‖ permaneceu absoluta para a depressão. Segundo a teoria

ocorre uma diminuição das catecolaminas cerebrais, promovendo um desequilíbrio

bioquímico da neurotransmissão, resultando na deficiência de 5-HT, DA e NA, e/ou

35

uma diminuição quantitativa dos seus receptores ou ainda ineficiência dos mesmos

(MEYER, 2012). Essa hipótese foi descrita na década de 60, e a partir daí, houve um

avanço significativo nas pesquisas. Nesse período, dois compostos utilizados para o

tratamento de doenças psiquiátricas, demostraram apresentar atividade

antidepressiva em humanos, aumentando a neurotransmissão de 5-HT e NA, a

imipramina e iproniazida. E, verificou-se que pacientes hipertensos que utilizavam

reserpina (um inibidor do transportador vesicular das monoaminas, deixando-as

expostas no citoplasma à degradação enzimática) apresentavam sintomas

depressivos graves (GARDNER; BOLES, 2011).

Muitos fármacos antidepressivos comprovam que a teoria das monoaminas

está diretamente envolvida nos processos depressivos, pois, suas funções são

restaurar os níveis das monoaminas cerebrais ocasionando a diminuição dos

sintomas depressivos (figura 1). Há várias classes de antidepressivos disponíveis,

dentre eles os tricíclicos, inibidores da monoaminooxidase (IMAO), inibidores

seletivos da recaptação da 5-HT (ISRS) e NA (ISRN), de dupla recaptação (5-

HT/NA) e ainda há os antidepressivos atípicos, sem um mecanismo farmacológico

conhecido (SHIROMA et al., 2010).

Os antidepressivos provocam aumento imediato nas monoaminas cerebrais,

porém sua ação antidepressiva ocorre apenas semanas após o início do tratamento.

A latência prolongada para o início do efeito dos antidepressivos provavelmente

ocorre em decorrência do tempo necessário para que fatores tróficos como o fator

neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e a proteína anti-apoptótica (Bcl-2) sejam

expressos e exerçam seus efeitos, uma vez que este é um processo lento e gradual.

Após o início do tratamento o estado comportamental e o humor se reestabelecem.

No entanto, o cérebro de um indivíduo tratado com antidepressivos não será igual a

do indivíduo não deprimido (CHEN; MANJI; 2006; WILLNER et al., 2013).

36

Figura 1. Teoria monoaminérgica da depressão

(a) Em sinapses saudáveis, as monoaminas (5-HT, NA e DA) são liberadas na fenda sináptica mediante estímulos e ligam-se em seus receptores nos neurônios pós-sinápticos. Uma vez liberadas,

as monoaminas podem ser recaptadas novamente pelos neurônios pré-sinápticos por transportadores específicos ou degradadas por enzimas como a monoaminaoxidase. (b) Nas sinapses de pacientes depressivos ocorre redução da síntese e liberação dos neurotransmissores, diminuindo a

biodisponibilidade na fenda sináptica. (c) O tratamento com antidepressivos é capaz de bloquear os transportadores de monoaminas ou inibir a monoaminoxidase, aumentando assim, as concentrações sinápticas das monoaminas (Adaptado de HOLZMANN, 2014).

A 5-HT é uma monoamina neurotransmissora, sendo sintetizada a partir dos

neurônios serotonérgicos no núcleo da rafe no mesencéfalo e pelas células de

Kulchitsky no trato gastrointestinal, onde está em grande concentração,

aproximadamente 90% do total presente no corpo humano. Desempenha várias

funções fisiológicas importantes no corpo humano, atuando sobre a motilidade

intestinal, no controle do apetite, sono, dor e humor (ARTIGAS, 2013; SANGARE et

al., 2016; STIEDL et al., 2015). Esse neurotransmissor exerce atividade moduladora

no SNC (PUIG; GENER, 2015) isso graças aos axônios dos neurônios

serotonérgicos estarem presentes em quase todas as estruturas cerebrais, o que

permite uma melhor modulação das funções cerebrais (CELADA et al., 2013).

Estudos sugerem que a 5-HT é um potente modulador da plasticidade sináptica,

sendo de fundamental importância na manutenção da homeostasia entre o equilíbrio

inibitório e excitatório do SNC (LESCH; WAIDER, 2012).

Os efeitos desempenhados pela 5-HT são mediados por 14 subtipos de

receptores, que estão divididos em sete famílias. A maioria dos receptores são do

tipo metabotrópicos e somente o receptor 5-HT3 é ligado a um canal iônico. Os

37

receptores 5-HT1 são subdivididos em receptores 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D

enquanto que o subtipo de 5-HT2 incluem os receptores 5-HT2A, 5-HT2B, e 5-

HT2C. Alguns são mais estudados atualmente por serem mais abundantes no SNC,

como os receptores 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT3A (PUIG; GENER, 2015).

Regiões cerebrais como o córtex pré-frontal e o hipocampo, são os principais

alvos dos neurônios serotonérgicos. Essas regiões cerebrais estão diretamente

envolvidas com fatores comportamentais, o córtex pré-frontal com a memória de

trabalho, aprendizagem e cognição (MILLER; COHEN, 2001; ROBBINS; ARNSTEN,

2009), e o hipocampo nos processos de memórias declarativas, tomada de

decisões, relações sociais e humor (BUZSAKI; MOSER, 2013).

A disfunção e/ou diminuição nos níveis da 5-HT é postulada como uma das

principais causas para a etiologia da depressão, principalmente após a teoria das

monoaminas emergir. Isso fez com que houvesse um aumento significativo nas

pesquisas de novos fármacos na terapêutica da depressão envolvendo os

receptores de 5-HT. Além dos antidepressivos reestabelecerem os níveis

serotonérgicos, também influenciam nos processo bioquímicos de alguns receptores

ocorrendo a melhora dos sintomas depressivos (FERNANDEZ; GASPAR., 2012; LIN

et al., 2016).

A DA é um neurotransmissor independente pertencente à classe das

catecolaminas. É produzida pela descarbonização da dihidroxifenilalanina, sendo

precursora da adrenalina e da noradrenalina (BROADLEY, 2010; CARLSSON et al.,

1958). São conhecidos cinco receptores dopaminérgicos D1, D2, D3, D4 e D5 os

quais estão disseminados em várias regiões cerebrais e nos tecidos periféricos, em

diferentes densidades (BLANDINI; ARMENTERO, 2014). Há estudos bem atuais

sugerindo diferenças nas densidades de receptores dopaminérgicos em cérebros de

pacientes depressivos, ressaltando o envolvimento da via dopaminérgica na

patogênese da doença e seu tratamento (PYTKA et al., 2016).

A sinalização dopaminérgica ocorre através de cinco vias diferentes (BUTINI

et al., 2016). A mais importante é através da substância nigra, que está localizada no

mesencéfalo, que se dissemina para o corpo estriado através da via nigroestriatal.

Quando essa via é afetada, ocorrem os sinais Parkinsonianos (BLANDINI;

ARMENTERO, 2014). Outra via importante é o sistema tuberoinfundibular, nessa

região a DA atua mediando a liberação de prolactina (LYONS et al., 2012), e

também no transporte de sódio através da musculatura lisa vascular (ZENG; JOSÉ,

https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Dihidroxifenilalanina&action=edit&redlink=1

38

2011). A via mesolímbica decorre da área tegmentar, que está ligada ao núcleo

accumbens e ao córtex límbico. Essa via exerce importante papel, pois essa região

cerebral está diretamente relacionada com o controle das emoções e recompensa

(EGERTON et al., 2009). Algumas evidências em neuroimagem demonstraram

alterações nas funções cerebrais na região frontal-límbica de pacientes depressivos

(ARNONE et al., 2012; BUSATTO, 2013), caracterizando o envolvimento dessa via

na doença.

Estudos tem demonstrado que o sistema dopaminérgico apresenta atividades

em regiões relacionadas com o comportamento, sobretudo a região mesolímbica.

Uma das principais características dos pacientes depressivos é apresentar a

anedonia, caracterizada pelo total desinteresse por atividades ou aspectos que eram

até então prazerosos. A anedonia é um dos sintomas característicos da depressão,

esse sintoma ocorre provavelmente por alterações nos receptores dopaminérgicos

presentes na região mesolímbica ou pela deficiência da neurotransmissão da DA

(SHIMAMOTO et al., 2015). A bupropiona um antidepressivo que atua inibindo a

recaptação da DA/NA, sobretudo nessa área cerebral tem sido uma opção de

tratamento para a depressão com características anedônicas elevadas (PATEL et

al., 2016).

A NA denominada também como norepinefrina, é um neurotransmissor

neuromodulatório, pertencente a classe das catecolaminas. No SNC a região do

locus coeruleus localizado na ponte rostral, é o principal secretor de NA, além de

estimular outras regiões cerebrais a secretarem o neurotransmissor. Em resposta ao

estresse, a NA apresenta a capacidade de induzir uma resposta rápida e

coordenada de múltiplos órgãos, a fim de coordenar a resposta de ―luta e fuga‖ a

partir do sistema simpatoadrenal que modula essa resposta (HENDRICKSON;

RASKIND et al., 2016; JOHNSON et al., 1992)

A NA exerce suas funções no organismo humano via receptores

metabotrópicos conhecidos como receptores noradrenérgicos, uma família composta

por duas subfamílias: os receptores α – adrenérgicos (α1A, α1B, α1D, α2A, α2b,

α2C) e β- adrenérgicos (β1, β2 e β3). Há estudos que postulam que os receptores

do sistema noradrenérgico, estão envolvidos em alguns sintomas da depressão,

como no caso da excitação e medo. Além disso, há uma diferença na densidade de

alguns receptores noradrenérgicos entre pacientes depressivos e não depressivos

(GURGUIS et al., 1999; PYTKA et al., 2016). Outro estudo conduzido por Gonzalez-

39

Maeso et al., (2002), sugerem o envolvimento de receptores adrenérgicos em

pacientes depressivos que cometeram suicídio.

3.1.1.2 Glutamato e Depressão

O glutamato (GLU) e o ácido - aminobutírico (GABA) são respectivamente

os principais neurotransmissores excitatórios e inibitórios do SNC. Ambos precisam

estar em equilíbrio para manter a homeostasia fisiológica do SNC. O GLU após ser

liberado na fenda sináptica, pode se ligar a uma série de receptores ionotrópicos

como o n-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-

isoxazolpropiônico (AMPAR) e kainato. Os receptores metabotrópicos para o GLU

abrangem oito subtipos os quais são acoplados a proteína G, estando presente na

maioria das sinapses centrais (MCKENNA, 2007) atuando em vários processo

biológicos como na regulação neuronal, crescimento neuronal (SELVAKUMAR et al.,

2013), aprendizado e memória (KALIVAS, 2009; REIS et al., 2009). O GLU está

presente em mais de 80% dos neurônios, estando em maiores concentrações no

cérebro em relação às monoaminas (KORNMEIER; SOSIC-VASIC, 2012;

SANACORA et al., 2008).

Estudos indicam que em processos depressivos ou estresse crônico, os

glicocorticoides endógenos aumentam a liberação de GLU na região CA/3 do

hipocampo, aumentando o fluxo de cálcio e, consequentemente a neurotoxicidade,

levando a um processo de atrofia hipocampal, culminando na morte celular

(LUCASSEN et al., 2015; MANJI et. al, 2003). Além disso, foi observado em estudos

pós-morte níveis elevados de GLU no tecido cerebral, (HASHIMOTO et al., 2007), no

plasma (KUÇUKIBRAHIMOGLU et al., 2009) e no fluido cerebroespinhal (FRYE et

al., 2007) de pacientes depressivos.

As enzimas responsáveis pelo metabolismo e captação do GLU, estão

presentes em neurônios e nas células da glia, as quais parecem ter um papel

relevante na fisiopatologia dos processos depressivos (HASHIMOTO et al., 2016).

Em estudos pós-morte foi observado que pacientes depressivos apresentavam um

volume glial reduzido, quando comparados com indivíduos normais (RAJKOWSKA;

MIGUEL-HIDALGO, 2007). Resultados semelhantes, foram obtidos por Banasr et al.,

(2010) em modelos animais, nos quais verificaram que animais quando submetidos

40

a protocolos de estresse, apresentavam um decréscimo significativo na proliferação

de células da glia.

Como já reportado, os achados científicos a respeito do GLU demonstram

que o sistema glutamatérgico apresenta um importante papel na etiologia dos

processos depressivos (GERHARD et al., 2016). Pesquisas focando em fármacos

que atuam nesse sistema têm se tornado cada vez mais frequente. Agentes

farmacológicos que atuam antagonizando os receptores ionotrópicos

glutamatérgicos como o receptor NMDA, tanto em estudos pré-clínicos (WOLAK et

al., 2015) como em estudos clínicos (OHGI et al., 2015), demonstraram apresentar

atividade tipo-antidepressiva de forma rápida, aumentando a sinaptogênese e

prevenindo a atrofia hipocampal (LANG; BORGWARDT, 2013; NICIU et al., 2014;

ZARATE et al., 2013).

3.1.1.3 Envolvimento da via L-arginina-NO-GMPc na depressão

Desde 1962, quando a Science designou o óxido nítrico (NO) como a

substância do ano, aumentou drasticamente os estudos envolvendo essa molécula,

sobretudo seu envolvimento tanto na fisiologia quanto na patologia de doenças

cerebrais. O NO é uma das menores e mais simples moléculas biosintetizadas no

organismo. Atua principalmente nos vasos sanguíneos e nas plaquetas, sendo o

principal responsável por causar o relaxamento do músculo liso da parede do vaso

(DHIR; KULKARNI, 2011). Apresenta atividade neurotransmissora entre as células

nervosas, e está envolvido em processos de neuromorfogênese (MANE et al., 2014),

plasticidade sináptica (YUI et al., 2016), regulação da expressão gênica

(YAMANAKA; O´CONNOR, 2011), modulação sexual (BAI et al., 2015), percepção

da dor (ABBASNEZHAD et al., 2016) e como mensageiro retrógrado em processos

de memória (ZHIHUI, 2013).

O NO é sintetizado por um grupo de proteínas denominadas óxido nítrico

sintases (NOS), que utilizam como susbtrado a L-arginina para produzir NO e L-

citrulina, necessitando da presença de dois co-fatores: o oxigênio e o fosfato

dinucleótideo adenina nicotinamida (NADPH) (figura 2). O NO pode ser produzido

por uma variedade de células epiteliais, nervosas, endoteliais e inflamatórias. Sendo

que existem três isoformas de NOS: a neuronal (nNOS) e endotelial (eNOS)

dependentes de cálcio, as quais são sintetizadas em condições normais. Há

41

também a induzída (iNOS), que independe de cálcio, sendo induzida por citocinas e

lipopolissacarídeos, em resposta a estímulos inflamatórios (ZHOU; ZHU, 2009).

Figura 2. Síntese do NO

Síntese do NO e da via L-arginina-NO-GMPc (adaptado de DHIR; KULKARNI, 2011).

A nível de SNC, o NO está envolvido na fisiopatologia de diversas desordens

neurológicas, como: esquizofrenia (HERNADEZ et al., 2016), epilepsia (ZHU et al.,

2015), ansiedade (CHANANA; KUMAR, 2016) e depressão (OSTADHADI et al.,

2016). Na depressão maior, a paroxetina (um ISRS) quando utilizado por pacientes

depressivos, apresenta a propriedade de inibir a NOS, apontando não só, que a

diminuição das monoaminas, mas que níveis elevados de NO podem estar

envolvidos na etiologia da depressão (DHIR; KULKARNI, 2011).

Estudos demonstram que o NO pode atuar em conjunto com as monoaminas,

uma vez que a ativação da GMPc media a captação de NA (DHIR; KULKARNI,

2011), bem como, na modulação do sistema serotonérgico (IKENOUCHI-SUGITA et

al., 2009). Em conjunto com a NA e a 5-HT, exercem um papel fundamental, na

modulação do sistema dopaminérgico, inibindo a ação dos transportadores de DA

(KISS et al., 2004). Essa atuação em várias vias de neurotransmissores deve-se ao

42

fato de o NO, apresentar a capacidade de difundir-se facilmente através das

membranas celulares, e estar presente nas mais diversas reações químicas inicias

(DHIR; KULKARNI, 2011).

Vários fármacos que atuam inibindo a síntese de NO através da via L-

arginina-NO-GMPc demonstraram tanto em modelos animais como em humanos

exercer um efeito tipo-antidepressivo, como por exemplo: a venlafaxina (inibidor da

recaptação da NA e 5-HT) (KRASS et al., 2011), memantina (antagonista dos

receptores NMDA) (ALMEIDA et al., 2006) e a bupropiona (inibidor da recaptação de

NA e DA) (DHIR; KULKARNI, 2007). Um estudo realizado por Harkin e

colaboradores (2004) descreveram um possível sinergismo entre fármacos inibidores

da NOS com antidepressivos serotonérgicos seletivos (imipramina e fluoxetina),

ocorrendo uma melhora significativa no quadro depressivo, quando comparado com

antidepressivos serotonérgicos usados isoladamente.

Evidências clínicas em humanos relacionados a essa via, demonstraram que

pacientes deprimidos que cometeram suicídio e pacientes com quadro depressivo

crônico, apresentam produção aumentada de NO (SUZUKI et al., 2001; KUDLOW et

al., 2016) e níveis elevados de metabólitos de NO no plasma sanguíneo (LEE et al.,

2006; TALAROWSKA et al., 2012; MORENO et al., 2013).

Relacionando todos esses dados, pode-se aferir que a via L-arginina-NO-

GMPc exerce uma expressiva influência na fisiopatologia da depressão maior, o que

torna essa via uma boa ferramenta de estudo, a fim de desenvolver novas

abordagens terapêuticas para o tratamento da depressão.

3.1.1.4 Via GABAérgica e depressão

O GABA é sintetizado no cérebro através da descarboxilação do glutamato,

utilizando o ácido glutâmico carboxilase e o piridoxal fosfato como co-fatores. Esse

processo ocorre principalmente nos neurônios GABAérgicos enquanto que o

processo de recaptação ocorre preferencialmente na glia. O GABA é o principal

neurotransmissor inibitório do SNC compreendendo quase 40% de toda

neurotransmissão, estando presente em todos os níveis do neuroeixo. Apresenta

como a principal caraterística a regulação da excitabilidade neuronal em todo o

sistema nervoso (MARTIN; RIMVALL, 1993; PEHRSON et al., 2015). Suas funções

ocorrem através de três familias de receptores, GABA-A e GABA-C que são

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kudlow%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=26812915

43

receptores ionotrópicos, e GABA-B, um receptor metabotrópico ligado a uma

proteína Gq (LUSCHER et al., 2011).

A transmissão GABAérgica é exercida através de interneurônios que

desempenham uma importante função reguladora em conexões neuronais e na

neurotransmissão, atuando na modulação de neurônios dopaminérgicos,

noradrenérgicos e serotonérgicos (PEHRSON et al., 2015), sendo responsável pelo

controle de humor e das funções cognitivas (MCDONALD et al., 2004).

O primeiro estudo avaliando o envolvimento do GABA em distúrbios

depressivos ocorreu na década de 70, sendo que a progabida (agonista GABA-A)

utilizada nos testes com pacientes depressivos, produziu efeitos semelhantes aos

efeitos produzidos com antidepressivos tradicionais (BARTHOLINI et al., 1979).

Porém apenas na década de 90 que os primeiros estudos comprovaram a relação

do sistema GABAérgico com a fisiopatologia da depressão (MAGNI et al., 1989;

NIELSEN et al., 1990) e, atualmente vem sendo explorada essa via em vários

estudos (REN et al., 2016).

Algumas pesquisas mais antigas corroborando com achados mais atuais

demonstraram que os receptores GABAérgicos apresentam níveis diminuídos no

fluído cerebroespinhal (GOLD et al., 1980), na região do córtex occipital

(BHAGWAGAR et al., 2008; KUGAYA et al., 2003; PRICE et al., 2009; SANACORA

et al., 2004) e no córtex cinculado anterior (BHAGWAGAR et al., 2008; LUSCHER et

al., 2011) de pacientes depressivos. Além disso, há outras evidências mais recentes

utilizando espectroscopia de ressonância magnética que também confirmam a

diminuição dos níveis GABAérgicos no SNC de pacientes depressivos, sugerindo

que a diminuição da neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA está envolvida

na fisiopatologia da depressão (PEHRSON et al., 2015).

Alguns fármacos moduladores dos receptores GABA-A, quando utilizados

concomitantemente com ISRS, causaram uma potencialização nos efeitos

antidepressivos dos mesmos (MOHLER, 2012). Alguns autores sugerem ainda que

esses fármacos moduladores do receptor GABA-A, podem no futuro ser utilizados

isoladamente como uma nova ferramenta de tratamento para pacientes depressivos

(LUSCHER et al., 2011; MOHLER, 2012; SAMARDZIC et al., 2014).

Os receptores GABA-B estão presentes em todo o cérebro, estando em

maiores concentrações nas regiões límbicas como no tálamo, córtex e no cerebelo

(BOWERY et al., 2002; MCDONALD et al., 2004). Através dessas evidências

44

algumas pesquisas envolvendo moduladores dos receptores GABA-B, tem se

tornado constante. Visto que, os antagonistas de receptores GABA-B já

demonstraram em modelos animais exercer atividade antidepressiva (PYTKA et al.,

2016).

3.1.1.5 Envolvimento da via opióide na depressão

No ano de 1900 surgiram as primeiras evidências de que a via opióide

poderia estar envolvida nos processos depressivos. Percebeu-se que pacientes que

fizeram o uso de baixas doses de uma mistura de opióides obtiveram a remissão dos

sintomas depressivos, mas a dependência ligada aos opióides limitou a utilização

dos mesmos na terapêutica da depressão. Após 80 anos, em 1980 ficou claro o

envolvimento da via opióide endógena na depressão, quando alguns pacientes

depressivos começaram a responder satisfatoriamente a infusão de β-endorfina, a

qual produziu efeito antidepressivo no primeiro dia de tratamento (TENORE, 2008).

Dados recentes sugerem o envolvimento dos receptores opióides (µ/mu,

δ/delta e κ/kappa) na regulação dos estados de humor em áreas do sistema límbico

(LUTZ; KIEFFER, 2013). Esses receptores são do tipo metabotrópicos acoplados a

diferentes sistemas efetores intracelulares e são difundidos na área tegmental

ventral, núcleo acumbens e o córtex pré-frontal. Os receptores opióides estão

envolvidos nos processos de recompensa e respostas emocionais, tornando-se

diferentes alvos para a ação de fármacos antidepressivos (HEGADOREN et al.,

2009).

Os receptores opióides são responsáveis pela regulação de vários sistemas

ou elementos envolvidos nos transtornos de humor como o BDNF, e principalmente

o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), o qual apresenta uma hiperatividade em

pacientes depressivos. Pacientes tratados com morfina apresentaram uma

diminuição da atividade do eixo HPA e aumento dos níveis de BNDF, elemento

importante na sobrevida neuronal e na neurogênese (LUTZ; KIEFFER, 2013;

TAKAYAMA; UEDA, 2005). Utilizado para o tratamento da depressão refratária a

buprenorfina (agonista/antagonista parcial opiáceo que se liga aos receptores µ e κ

do cérebro) tem demostrado minimizar os sintomas depressivos (BALON, 2016). Os

receptores opióides delta (TAYLOR; MANZELLA, 2016) e kappa (JONES et al.,

2016) estão presentes em regiões cerebrais envolvidas com o humor, na região da

45

amidala onde modula o estado de ansiedade, na região do córtex e do hipocampo,

regiões associadas a depressão (VARONA et al., 2003). Estudos demonstram que o

tratamento agudo em animais com um agonista delta, aumentou a expressão do

BDNF e produziu efeito tipo antidepressivo no teste do nado forçado (TNF) (NEGUS

et al., 2012; TORREGROSSA et al., 2006).

A estimulação dos receptores kappa causam a diminuição das funções

dopaminérgicas em diferentes regiões cerebrais. Além de produzir efeito tipo-

depressivo em modelos animais e em humanos. Em modelos animais de depressão

a naloxona (antagonista opióide) bloqueou o efeito antidepressivo da venlafaxina e

dos antidepressivos tricíclicos. Sugerindo em partes, que o efeito desse

medicamento ocorre através da via opiácea (BERROCOSO et al., 2004; CARLEZON

et al., 2009).

Como reportado anteriormente, os receptores µ estão amplamente presentes

em diversas regiões cerebrais, envolvidas no humor e na regulação do estresse

(LUTZ; KIEFFER, 2013). Estudos em modelos animais sugerem que agonistas dos

receptores µ, apresentam efeito tipo-antidepressivo (REEVES; COX, 2008). Um

estudo realizado por Kennedy e colaboradores (2006) envolvendo mulheres que

sofriam com depressão maior demonstraram que as mesmas apresentavam uma

desregulação nos receptores de opióides endógenos (LUTZ; KIEFFER, 2013).

3.1.1.6 Estresse oxidativo e depressão

O cérebro humano utiliza a respiração aeróbia para a produção de energia, e

para desempenhar as suas funções fisiológicas normais necessita de milhares de

moléculas de trifosfato de adenosina (ATP) por minuto. Essa alta demanda de ATP,

ocorre pela necessidade de manter e restaurar os gradientes iônicos, que são

dissipados em processos de sinalização, como potencial de ação (mantendo

potássio alto e sódio baixo em meio intracelular), liberação de neurotransmissores

através de exocitose (mantendo níveis intracelulares de cálcio baixo, permitindo

reações sensíveis após o influxo de cálcio, induzido por potencial de ação com o

sequestro de cálcio no retículo endoplasmático e na mitocôndria) e participação no

processo de captação e reciclagem dos neurotransmissores (ALLE et al, 2009;

SIMPSON; RUSSELL, 1998). Apesar do cérebro compreender apenas 2% do peso

total do corpo, ele é responsável por consumir 20% do oxigênio e 25% da glicose

46

que o corpo utiliza (BELANGER et al., 2011). Desta forma, os processos oxidativos

exigem do cérebro um alto consumo de oxigênio tornando-o vulnerável ao estresse

oxidativo e nitrosativo, que em demasia são responsáveis por alterações lipídicas,

proteicas e genéticas (YAO; KESHAVAN, 2011).

O estresse oxidativo é uma condição biológica em que as espécies reativas

de oxigénio (EROs) geradas excedem a capacidade antioxidante das células,

ocorrendo um desequilíbrio entre a produção de EROs e o sistema biológico que tem

a função de remover e/ou reparar os danos causados por elas (MILLER; SADEH,

2014). Este estado provoca diferentes tipos de danos oxidativos nos componentes

celulares e conduz a várias desordens. Evidêncas clínicas e pré-clínicas indicam que

em doenças psiquiátricas a produção de EROs prevalece sobre os sistemas de

defesa do cérebro. O dano oxidativo pode desempenhar um papel crucial na

fisiopatologia de certas doenças neuropsiquiátricas, incluindo depressão (ZHANG et

al., 2016), ansiedade (CHANANA; KUMAR, 2016), esquizofrenia (RUIZ-LITAGO et

al., 2012), autismo (KHAN et al., 2016) e epilepsia (RAHMAN, 2015). Também, o

estresse oxidativo parece estar envolvido em processos neurodegenerativos de

várias doenças dentre elas o Parkinson e Alzheimer (LI; REICHMANN, 2016).

As EROs podem ser geradas através de radiação ultravioleta, radiação

ionizante, exposição a herbicidas, metais pesados e xenobióticos (exógena). A

geração principal do estresse oxidativo é endógena que ocorre nas mitocôndrias,

mas também pode ocorrer através de elétrons contidos nas cadeias de transportes

nos retículos endoplasmáticos e nas membranas nucleares. Outras formas

endógenas de produção de EROs são originadas por enzimas como a: xantina

oxidase, NADPH oxidase, citocromo P450 monooxigenase, ciclooxigenase e

monoamina oxidase (LEE et al., 2013; PIAO et al., 2014). As principais EROs

formadas pelo estresse oxidativo, classificam-se em dois grupos, radicalares:

hidroxila (HO•), superóxido (O2•-), peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•); e não-radicalares:

oxigênio (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e ácido hipocloroso (HOCl)

(SUTHAMMARAK et al., 2013). Quando aumentadas causam danos celulares,

alterando as funções fisiológicas e a morte celular (SCANDALIOS, 2005).

As EROs podem ser combatidas por antioxidantes endógenos ou

antioxIdantes absorvidos na dieta. Os antioxidantes enzimáticos endógenos

compreendem glutationa peroxidase (GPx), catalase (CAT) e a superóxido

dismutase (SOD) e os antioxidantes não enzimáticos como a glutationa (GSH),

47

peptídeos de histidina, proteínas ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido

diidrolipóico e o citocromo C redutase (CoQH2). Dentre os antioxidantes adquiridos

na dieta se destacam o ácido ascórbico, a-tocoferol (vitamina-E), -caroteno (pró-

vitamina-A) (SMAGA et al., 2015).

A GSH é o antioxidante hidrossolúvel não proteico mais importante nos seres

vivos. É constituída por três aminoácidos, o ácido glutâmico, cisteína, glicina e é

catalisada sequencialmente por duas enzimas citosólicas, a gama-glutamilcisteína

sintetase e GSH-sintetase (GU et al, 2015). Apresenta um papel muito importante no

metabolismo de nutrientes, regulação do metabolismo celular e na defesa

antioxidante. Estudos demonstram que a deficiência da atividade da GSH, contribui

para a formação de EROs, e essa diminuição parece estar relacionada com a

fisiopatologia de doenças psiquiátricas (MORRIS et al., 2014), dentre elas se

destacam a ansiedade, esquizofrenia e depressão (SMAGA et al, 2015).

A SOD, tem a função de catalisar a dismutação do superóxido em oxigênio e

peróxido de hidrogênio, causando a proteção das células expostas as reações do

superóxido, além de evitar o envelhecimento precoce causado pelas EROs. Estudos

apontam que ocorre uma disfunção na atividade da SOD em pacientes deprimidos

(LOPRESTI et al., 2014). E pacientes com depressão maior apresentam diminuição

da atividade da SOD, acarretando no aumento dos níveis do ânion superóxido

(RYBKA et al., 2013).

A CAT é uma enzima antioxidante endógena, que atua inibindo a formação

das EROs ou promove a remoção dessas espécies, através da decomposição do

peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, tornando-o inofensivo ao corpo

(GALECKI et al., 2008). Em pacientes com quadro depressivos a atividade da CAT

foi encontrada em níveis mais elevados (SZEBENI et al., 2014).

Segundo Maes et al., (2011) outra enzima com caracerísticas antioxidantes

que exerce função protetora é a GPx. Trata-se de uma enzima eritrocitária

intracelular que é responsável pela remoção de hidroperóxidos, hidroxila e lipídeos

peroxidados. Alguns estudos in vivo (MAES et al., 2011) e pós-morte

(STEFANESCU; CIOBICA, 2012) relataram a diminuição da atividade e dos níveis

de GPx no plasma e no córtex pré-frontal de pacientes com depressão maior,

sugerindo que a diminuição da GPx aumenta os níveis de EROs no interior da

célula, ocasionando a morte celular.

48

Há evidências clinicas de que pacientes deprimidos, apresentam níveis

elevados de EROs no plasma e no soro (WEY et al., 2009; YUMRU et al., 2009),

além de níveis elevados de xantinas oxidases (HERKEN et al., 2007) e peroxidação

lipídica (MAES et al., 2010). Em estudos pós-morte verificou-se que a peroxidação

lipídica é aumentada no cortéx cingulado anterior (WANG et al., 2009) e a oxidação

proteica aumentada no córtex pré frontal (ANDREAZZA et al., 2010).

3.1.1.7 Envolvimento da atividade da enzima MAO na depressão

A MAO é uma enzima presente no corpo humano, cuja função é degradar

uma variedade de monoaminas primárias, secundárias e terciárias, mantendo a

homeostasia no ambiente extracelular e intracelular, evitando que se acumulem e

gerem efeitos indesejáveis. A MAO está presente em várias regiões do corpo, porém

encontra-se em maiores concentrações nos tecidos neurais e não neurais, como o

intestinal e o hepático (EDMONDSON et al., 2009).

A MAO apresenta-se em duas isoformas, semelhantes estruturalmente, mas

diferentes quanto a preferência pelo substrato. A enzima MAO-A utiliza como

substrato a 5-HT, enquanto a MAO-B utiliza a NA e a DA, ambas são encontradas

nos neurônios e astrócitos no SNC, e estão presentes na membrana mitocondrial

externa (FINBERG, 2014). A atividade anormal dessas isoenzimas foram associadas

a várias desordens neurológicas, a MAO-B na doença de Parkinson e doença de

Alzheimer, e a MAO-A na ansiedade e depressão (YOUDIN; BAKHLE, 2006).

O envolvimento da enzima MAO, é considerado uma das principais hipóteses

na fisiopatologia dos processos depressivos, visto que pacientes depressivos

apresentam níveis baixos de metabólitos de 5-HT no líquido cefalorraquidiano. Além

disso, já é reportado na literatura que a depressão pós-parto pode estar associada a

um aumento dos níveis e da atividade da MAO (BLAKELEY et al., 2013). Baseado

nesses achados foi importante desenvolver fármacos que atuassem inibindo a

atividade da enzima MAO. Os primeiros inibidores da MAO (IMAOs) eram fármacos

utilizados no tratamento da tuberculose (isoniazida), mas percebeu-se que quando

administrados por pacientes depressivos ocasionavam uma melhora do quadro de

humor. Porém, atualmente o uso desses medicamentos é quase obsoleto. Já se

observava desde há muito tempo que tais medicamentos desencadeavam efeitos

colaterais graves o que limitava o seu uso (MASSART et al., 2012).

49

3.1.1.8 Neurogênese e depressão

Os primeiros estudos detalhados a respeito das células nervosas foram

realizados por Camilo Golgi e Ramón y Cajal, através de técnicas de coloração com

sais de prata, no final do século XIX. Os pesquisadores afirmavam que não havia o

surgimento de neurônios no decorrer da vida, além daqueles formados no

nascimento. Outros autores da época, em consenso com Camilo Golgi e Ramón y

Cajal, postulavam que o SNC possuia conexões fixas e imutáveis, sem qualquer

possibilidade de que novos neurônios surgissem (SILVA, 2009).

Percebeu-se que essa teoria era controversa e a formação de novos

neurônios ocorre. Dessa forma a neurogênese adulta compreende o processo de

formação de novos neurônios a partir de células-tronco neurais (TAVERNA et al.,

2014). Outros mecanismos da neurogênese são a diferenciação neuronal,

proliferação de células estaminais e a integração de novos neurônios gerados com

circuitos neuronais existentes (MING; SONG, 2005).

No hipocampo, a neurogênese ocorre em duas regiões cerebrais, a zona

subgranular (ZSG) do giro dentado no hipocampo e na zona subventricular

(ZSV) situada nas paredes dos ventrículos laterais, onde as novas células migram

para o bulbo olfatório através do fluxo migratório rostral (APPLE et al., 2016). A

diminuição da neurogênese está associada a várias doenças neurológicas e dentre

elas a depressão (WANG et al., 2015), doença de Alzheimer (HERBERT;

LUCASSEN, 2016) e a esquizofrenia (SCHOENFELD; CAMERON, 2015).

Para ocorrer a neurogênese, às regiões onde os novos neurônios serão

sintetizados precisam estar em equilíbrio com vários fatores, como oxigênio,

nutrição, hormônios, fatores tróficos e o sistema imune (KOHMAN; RHODES, 2013;

YIRMIYA; GOSHEN, 2011). A regulação da neurogênese hipocampal ocorre por

fatores neurotróficos, como o BNDF (SCHMIDT; DUMAN, 2010; WATERHOUSE et

al., 2012), GABA (SONG et al., 2012) e as monoaminas cerebrais como a 5-HT

(DIAZ et al., 2012), NA (JHAVERI et al., 2010; MASUDA et al., 2012), e DA (VEENA

et al., 2011; YANG et al., 2008). Há estudos que relacionam níveis aumentados de

citocinas pró-inflamatórias, neuroinflamação (MYINT; KIM, 2014) e estresse crônico

(CAMERON; GLOVER, 2015; EGELAND et al., 2015) como os principais

responsáveis pela diminuição da neurogenênese. Acredita-se que os sintomas

50

presentes em algumas desordens neurológicas, incluindo a depressão, ocorrem pela

diminuição da neurogênese na região hipocampal (SERAFINE et al., 2014).

O envolvimento da neurogênese na etiologia da depressão é baseado em

alguns resultados que identificaram a diminuição da região hipocampal em pacientes

depressivos (PASCUAL-BRAZO et al., 2014). Em adição, pacientes deprimidos que

utilizavam terapia farmacológica com antidepressivos, apresentavam aumento da

neurogênese hipocampal e aumento no volume da camada de células granulares

(MAHAR et al., 2014). Estudos reportam que há uma diminuição no número de

células granulares e diminuição do volume da camada celular granular na região

anterior do giro dentado no hipocampo, quando comparado com o grupo tratado com

antidepressivos (BOLDRINI et al., 2009, 2012, 2013). O déficit da neurogênese pode

estar relacionada com a alta latência para o efeito farmacológico dos

antidepressivos, nos quais os novos neurônios formados levam um tempo para

tornar-se hiperplásicos e funcionais (GE et al., 2007).

3.2 Plantas medicinais com atividades antidepressivas.

Por possuir fácil acesso as plantas, torna-se cada vez mais frequente a

população buscar nos produtos de origem vegetal o tratamento para as

enfermidades, porém, a utilização de plantas medicinais como alternativa terapêutica

ocorre há milhares de anos a.C. (DAL CERO et al., 2015). Estimativas apontam que

o mercado global de produtos de origem natural atingiu mais de 27 bilhões de

dólares no ano de 2014, sendo o continente Europeu que mais utiliza medicamentos

fitoterápicos, seguido pela Ásia e EUA (figura 3). Apesar da grande biodiversidade

brasileira, correspondendo a cerca de 46 mil espécies de plantas, o Brasil apresenta

uma participação modesta no mercado de medicamentos fitoterápicos,

representando apenas 261 milhões de dólares (DUTRA el al., 2016; (SISTEMA DE

INFORMAÇÃO SOBRE A BIODIVERSIDADE BRASILEIRA – SIBBR, 2016).

51

Figura 3. Mercado mundial de medicamentos fitoterápicos

Outros Países EUA Ásia Europa0%

10%

20%

30%

40%

7%

18%

27%30%

Mercado de medicamentos fitoterápicos distribuídos entre, Europa, Ásia e EUA. (adaptado de Dutra

et al., 2016).

Em 1994 o Ministério da Saúde estabeleceu a primeira diretiva para avaliar a

segurança, eficácia e qualidade dos medicamentos fitoterápicos, diretiva essa

baseada nas normas da OMS, e nas diretivas alemãs e francesas. E, com o passar

dos anos as diretivas brasileiras foram melhorando e outras foram lançadas, pois

fitoterápicos são medicamentos, e o seu registro é baseado em provas científicas.

Desta forma, o foco em pesquisas utilizando produtos de origem vegetal vem

ganhando cada vez mais ênfase por pesquisadores brasileiros com o passar dos

anos (figura 4), em vários tipos de patologias (DUTRA et al., 2016).

Figura 4. Artigos científicos publicado por brasileiros entre os períodos de 1987 e 2015

19

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10474 9875

Nú

mero

de a

rtig

os

pu

blicad

os

Números de artigos científicos publicados por cientistas brasileiros sobre plantas medicinais entre os

períodos de 1987 e 2015 (adaptado de Dutra et al., 2016).

52

Os pesquisadores do mundo todo vêm avaliando a atividade farmacológica

de plantas em diversos processos patológicos, como na dor (KIMANGA et al., 2016),

inflamação (BIND et al., 2015), câncer (CHAUDHARY et al., 2015; NHO et al., 2015,

dispepsias (BI et al., 2014), infestações parasitárias (MBAYA, OGWIJI, 2014) dentre

outras. Também tem crescido nos últimos anos as pesquisas relacionadas a

validação das propriedades farmacológicas de plantas em diversas desordens

neurológicas, como na doença de Azheimer (ZHANG et al., 2016), doença de

Parkinson (BHANGALE; ACHARYA, 2016), epilepsia (PAHWA; GOEL, 2016),

ansiedade (BAHI et al., 2014) e depressão (SULAKHIYA et al., 2016).

Uma planta nativa da Europa e Ásia, que é amplamente estudada e utilizada

no tratamento da ansiedade e depressão, é o Hypericum perforatum (L),

popularmente conhecido como Erva-de-São João. Em revisão de Schmidt e

Butterweck, (2015) o mecanismo de ação da propriedade antidepressiva em

humanos descrito para a planta ocorre através da inibição da recaptação da 5-HT na

fibra pós-sináptica (efeito semelhante aos da fluoxetina, um ISRS), além de inibir a

atividade da MAO (SCHMIDT; BUTTERWECK, 2015). Também tem sido descrito na

literatura os efeitos da planta em ensaios pré-clinicos. Em estudos com animais o

Hypericum perforatum (L) reduziu significativamente o estresse induzido nos ratos e

diminuiu os níveis do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) e corticoesteróides

plasmáticos. Além disso, a planta também reduziu o estresse induzido através do

aumento dos níveis do fator de necrose tumoral (TNF-α), sugerindo um possível

mecanismo de ação através da inter-relação entre sistema imune, a defesa oxidativa

do organismo e o sistema neuroendócrino (GRUNDMANN et al., 2010;

BUTTERWECK et al., 2004)

Outra planta que merece destaque por suas atividades psicotrópicas, é a

Valeriana officinalis (L). Nativa da América, Europa e Ásia, exerce várias atividades

farmacológicas, como atividade anticonvulsivante, sedativa, ansiolítica e

antidepressiva. Vários mecanismos podem estar envolvidos nos efeitos

farmacológicos periféricos e centrais da Valeriana officinalis (L), como o efeito

agonista dos receptores GABA-A (KAKEHASHI et al., 2014) e o antagonismo de

receptores da adenosina (REZVANI et al., 2010). Para a depressão, estudos

demonstraram que após o uso, as concentração cerebrais de 5-HT encontraram-se

aumentadas (TANG et al., 2008), e pode ser sugerido que exerça a suas ações

53

através da sua interação com os receptores glutamatérgicos do tipo: NMDA, AMPA e

kainato (DEL VALLE-MOJICA et al., 2011).

A Piper methysticum Forst, popularmente conhecida como Kava- Kava é uma

planta nativa da Oceania e utilizada pela medicina tradicional há mais 3 mil anos

(JOHNSTON; ROGERS, 2006). Na Europa, no ano de 1880 iniciou-se o seu uso no

alívio do estresse e para o tratamento da ansiedade, infecções do trato urinário e

reumatismo. Porém, só mais recentemente, focou-se o seu uso nos distúrbios do

SNC como o estresse, ansiedade e depressão, sendo que muitas vezes, a Kava-

kava é retratada como análogo "natural" de ansiolíticos e antidepressivos

industrializados. Durante os anos de 1999 a 2002, a Kava- kava esteve na lista dos

10 medicamentos fitoterápicos mais vendidos no Brasil (JUSTO; SILVA, 2008;

SARRIS, 2012; SHOWMAN et al., 2015).

Alguns estudos recentes avaliando a atividade antidepressiva de algumas

espécies de plantas foram publicados, como por exemplo a Gastrodia elata Blume

(CHEN et al., 2016), Chrysactinia mexicana (CASSANI et al., 2015), Cecropia

pachystachya (GAZAL et al., 2014) e a Lafoensia pacari A.St.-Hil (GALDINO et al.,

2015).

Como demonstrado, vários trabalhos sugerem que as plantas exercem um

relevante papel no tratamento das desordens neurológicas, pincipalmente nos

processos depressivos. O que torna relevante avaliar as atividades psicotrópicas das

mesmas.

3.3 Da planta em estudo: Piper cernuum

A Piper cernuum (figura 5) é uma espécie com até 6 metros de altura, possui

folhas grandes medindo até 40 cm. É uma planta comum em florestas primárias e

secundárias e está amplamente distribuída nos estados do Amazonas, Ceará, Bahia,

Espirito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina

(MARIOT et al., 2003). É conhecida popularmente como ―Pariparoba‖, ―João-

guarandi-do-grado‖ e ―Pimenta-de-Morcego‖ e é usada na medicina popular como

analgésico, principalmente para dores no estômago, problemas renais, hepáticos e

circulatórios (DI STASI et al., 2002).

54

Figura 5. Partes aéreas da Piper cernuum

Fonte: SOLETTI (2015)

Alguns estudos com a Piper Cernuum estão relacionados a investigações

fitoquímicas. Danelutte et al., (2005) relatam o isolamento a partir de extratos de

suas folhas derivados de ácidos cinâmicos, di-hidrocinâmicos e a lignana cubebina,

além de outros compostos em quantidades menores. Capello e colaboradores

(2015) isolaram do extrato metanólico das folhas seis compostos derivados

fenilpropanoides, sendo eles: ácido 3',4'-dimetoxidihidrocinamico, piplaroxide, 4'-

hidroxi-3',5'-dimetoxicinamato de metila, ácido 3',4',5'-trimetoxidihidrocinamico,

dihidropiplartina e piplartina.

Alguns trabalhos também relatam a obtenção do óleo essencial com

predomínio de sesquiterpenos oxigenados (DE ABREU et al., 2005; TORQUILHO et

al., 2000, CONSTANTIN et al., 2001). O óleo apresenta propriedades antimicrobiana

e antifúngica (COSTANTIN et al., 2001; CORDOVA et al., 2010). Recentemente

Capello e colaboradores (2015) avaliaram a atividade citotóxica e leishmanicida in

vitro do óleo essencial e os resultados foram significativos.

Estudos com esta espécie vegetal também vêm sendo realizados por

pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI e os resultados são bastante promissores.

Muller (2011) avaliou a atividade microbiológica de diversas espécies do gênero

Piper e como resultado o extrato da Piper cernuum apresentou atividade contra

Staphylococcus aureus. Além disso Gon e Shaefer (2016), através da bioautografia

foi possível observar que os extratos de caules e eflorescência também foram ativos

contra cepas de Staphylococcus aureus, já o extrato das folhas não apresentou

atividade antimicrobiana; dentre as frações analisadas foi observado ação

55

antimicrobiana somente na qual o cumarato de bornila estava presente, sugerindo

que este seja o responsável por tal atividade biológica.

Recentemente Soletti (2015) determinou a composição e avaliou a atividade

antimicrobiana dos óleos essenciais obtidos nas diferentes estações do ano. O óleo,

independente da estação de coleta apresentou atividade contra Bacillus subtilis,

Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, além de apresentar atividade

contra dermatófitos como o Microscoprum gypseum, Trichophyton mentagrophytes,

Trichophyton rubrum, Epidermophyton flocosum e contra a levedura oportunista

Cryptococcus neoformans. Nesta pesquisa constatou-se que aproximadamente 48%

do óleo foi constituído pelos isômeros trans-dihidroagarofurano e 4-epi-cis-

dihidroagarofurano. Outros compostos identificados foram y-eudesmol (7.64 a

11.65%), β-cariofileno (5.94 a 8.69%), elemol (5.89 a 9.15%), α-pineno (2.63 a

5.43%) e canfeno (2.16 a 4.55%).

O extrato etanólico das folhas de Piper cernuum foi avaliado em relação à

genotoxicidade através do ensaio cometa in vitro, em cinco diferentes

concentrações. Foi possível observar que em nenhuma destas concentrações

resultou em aumento significativo de dano ao DNA, sendo possível concluir que,

abaixo de 250 µg/mL não houve genotoxicidade (GUOLLO; TRAVESSINI;

VITORINO, 2014).

Gon e Shaefer (2016) isolaram de extratos etanólicos dos caules o

sesquiterpeno trans-dihidroagarofurano, um derivado de ácido cinâmico o cumarato

de bornila, e outras substâncias que pertencem à classe das lignanas, a α-cubebina

e β-cubebina. Além das substâncias acima mencionadas também foram

identificadas por CG/EM o elemol, guaiol, beta-eudesmol, éster do ácido palmítico,

aldol, fitol, ácido linoleico, éster do ácido linoleico, ferulato de bornila, as lignanas

hinoquinina e asarinina.

Além disso, Gon e colaboradores (2016) avaliaram as frações de caules e

folhas obtidas com diclorometano através de cromatografia a gás com detector de

massas. Dentre os principais compostos encontrados estão sesquiterpenos e

lignanas, destacando-se nas folhas o sesquiterpeno trans-dihidroagarafurano com

aproximadamente 25% e uma mistura da lignana α e β-cubebina compreendendo

aproximadamente 8%.

Jurcevic (2015) avaliou a composição química e o efeito tipo antidepressivo

de extratos de caules e folhas em diferentes graduações alcoólicas. O extrato

56

etanólico das folhas 100 ºGL apresentou atividade tipo-antidepressiva, diminuíndo o

tempo de imobilidade dos animais no teste do nado forçado (TNF), além de não

afetar a atividade locomotora dos camundongos no teste do campo aberto (TCA).

Atualmente encontram-se em andamento por pesquisadores do grupo

NIQFAR algumas outras pesquisas com a espécie Piper cernuum, entre elas a

avaliação da sazonalidade na atividade antimicrobiana de extratos das folhas, caules

e inflorescência da aluna de mestrado Anays Aust. Além disso, um fator relacionado

com a segurança da planta também está sendo avaliado. Trata-se da análise do

potencial citotóxico do extrato das folhas e caules, que está sendo realizado pelo

aluno de mestrado Felipe Wolf. Alguns resultados preliminares apontam que a Piper

cernuum não apresenta citotoxicidade, sugerindo que a planta apresenta segurança

no seu uso.

3.3.1 Compostos presentes na Piper cernuum: αβ-cubebina e o trans-

dihidroagarofurano

Nas últimas décadas houve um avanço significativo nas pesquisas

relacionadas com o isolamento de compostos a partir de recursos naturais. As

principais vantagens da utilização de compostos isolados em formulações são uma

toxicidade relativamente baixa, completa biodegradabilidade e em alguns casos

menores custos de produção (TEPONNO et al., 2016).

As lignanas representam uma enorme classe de compostos metabólitos

secundários farmacologicamente ativos, que estão amplamente espalhadas dentro

do reino vegetal. A principal função das lignanas nas plantas é a proteção contra

herbívoros e microorganismos (TEPONNO et al., 2016). No gênero Piper, é

frequente a ocorrência de lignanas, destacando-se as espécies P. solmsianum, P.

regnelli, P. richardiefolium, P. cubataonum e P. cernuum (YOSHIDA, 2013). As

lignanas majoritárias presentes na P. cernuum são a αβ-cubebina (figura 6B) e a

hinoquinina (JURCEVIC, 2015).

Já são reportadas na literatura, que as lignanas apresentam importantes

atividades biológicas como, por exemplo, contra leishmaniose, malária, doença de

Chagas, atividade antitumoral, antitrombótica, inseticida, fungicida, atividade

antimicrobiana, anti-inflamatória e analgésica (SHI et al., 2015), atividade

neuroprotetora (YANG et al., 2016) e atividades ansiolíticas (CHEN et al., 2011).

57

As espécies Piper apresentam não só as lignanas, mas também apresentam

uma variedade de sesquiterpenos. Um estudo recente realizado por Oyemitan et al.,

(2015) identificaram mais de 30 compostos no óleo essencial da P. guineense,

sendo que 64% do óleo é constituído por sesquiterpenos. Algumas pesquisas

apontam que os sesquiterpenoides agarofuranos possuem diversas atividades

biológicas relatadas na literatura, sendo elas: inseticidas, anti-tumoral, anti-HIV,

atividade imunossupressora e citotóxica (TANTRY et al., 2013).

Alguns estudos apontam que os dihidroagarafuranos (figura 6A) apresentam

um papel biológico muito importante, porém os estudos com esses compostos a

nível de SNC são escassos. Um estudo recente realizado por Alarcon et al., (2015)

demonstrou que o dihidroagarofurano apresenta atividade inibitória da

acetilcolinesterase, podendo ser considerado uma nova estratégia de tratamento na

desordens neurológicas.

Figura 6. Estrutura química do trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina

Apesar de apresentarem características farmacológicas importantes, atuando

em vários tipos de patologias, tanto a αβ-cubebina como o trans-dihidroagarofurano

não foram amplamente estudadas, representando uma fonte de estudos a ser

explorada.

59

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 Preparação do extrato

O extrato etanólico das folhas de Piper cernuum e os compostos isolados αβ-

cubebina e trans-dihidroagarofurano utilizados no experimento foram fornecidas pelo

laboratório de Análise Fitoquímica da UNIVALI, sob a orientação da Profª Drª Angela

Malheiros.

As folhas da Piper cernuum foram secas em estufa a 40 ºC, moídas em

multiprocessador (granulometria 9 Mesh) e submetidas à maceração com diferentes

líquidos extratores. O processo de extração foi realizado pelo método de extração

por agitação mecânica com solução hidroalcoólicas de etanol a 100 ºGL, proporção

droga-vegetal de 1:20, com tempo de extração de 2 horas. Após filtração, o extrato

foi obtido por evaporação completa do solvente e as massas dos resíduos foram

pesadas em balança analítica. Detalhes sobre a preparação do extrato podem ser

verificados no trabalho de mestrado de Jocilene Demetrio Jurcevic

(JURCEVIC, 2015).

Os compostos isolados α e β-cubebina e trans-dihidroagarofurano foram

isolados pelas acadêmicas do curso de farmácia Ana Cristina Gon e Andressa

Schaefer como parte do Trabalho de Iniciação Científica. Detalhes sobre os

procedimentos de extração podem ser verificados no trabalho de Gon e Schaefer

(2016).

4.1.2 Substâncias utilizadas e vias de administração

Durante os ensaios farmacológicos in vivo foram utilizadas as seguintes

substâncias: EEPC, trans-dihidroagarofurano, αβ-cubebina, pentilenotetrazol,

fenobarbital, estricnina, diazepam, fluoxetina, imipramina, reserpina,

paraclorofenilalanina (PCPA), NAN-190, ketanserina, ondansetrona, prazosin,

ioimbina, haloperidol, SCH23390, quetamina, L-arginina, N-nitro-L-arginina metil

éster (L-NAME), sildenafil, azul de metileno, 7-nitroindazol (7-NI), bicuculina,

faclofeno, NMDA, naloxona e naltrindol. (SIGMA, EUA).

60

A maioria das substâncias foram solubilizadas em salina com 1% de Tween-

80 e administrados por via intraperitoneal (i.p.). Enquanto o EEPC foi solubilizado em

salina com 1% de Tween-80, e administrado por gavagem (v.o.). O NMDA foi

solubilizado em salina com 1% de dimetilsulfóxido (DMSO) e administrado pela via

intracerebroventricular (i.c.v). Para esse procedimento em particular, os

camundongos foram anestesiados com xilazina/quetamina e preparados para

retirada do tecido cutâneo levando a exposição do crânio. Após 24 horas foram

realizados os experimentos. Para o experimento, os camundongos foram

anestesiados com éter, e receberam 3 µl da solução através de uma agulha

hipodérmica acoplada a uma seringa de Hamilton de 10 µl, por via i.c.v. A fissura do

bregma foi utilizada como referência para a administração i.c.v., sendo a aplicação

direta no ventrículo cerebral, 1 mm lateral 1 mm posterior ao bregma, com 2,4 mm

de profundidade.

Os animais tratados com veículo receberam salina com 1% de Tween-80, ou

seja, a mesma solução em que o EEPC foi solubilizado. As doses dos reagentes

foram obtidas de trabalhos anteriores realizados em nossos laboratórios

(GONÇALVES et al., 2010; HOLZMANN et al., 2015).

Para a realização dos testes ex vivo e in vitro foram utilizados os seguintes

reagentes, reagente de Bradford, ácido tricloroacético (ATC),

hidroximetilaminometano (TRIS), 5,5‘-ditiobis 2-ácido nitrobenzóico (DTNB), metanol,

água destilada, butil hidróxi tolueno (BHT), ácido sulfúrico, xilenol, ferro, tampão

Tris/EDTA, peróxido de hidrogênio, água milli-q, pirogallol, ácido clorídrico, 1-cloro-

2,4 dinitrobenzeno (CDNB), glutationa reduzida (GSH), azida sódica, β-NADPH,

glutationa redutase de levedura, tampão fosfato de sódio, 5-HT, butil acetato,

vanádio, sulfonilamida, etilenodiamina, nitrato de sódio, sulfato de zinco e ácido

ascórbico.

4.2 Métodos

4.2.1 Avaliação farmacológica in vivo

4.2.1.1 Animais

61

Para o experimento foram utilizados camundongos Swiss fêmeas (25 a 35 g).

Os animais foram obtidos do biotério central da UNIVALI, e mantidos no biotério de

farmacologia experimental com ciclo claro/escuro de 12 horas e aclimatados a

temperatura de 22 ± 2ºC. Os animais foram divididos em grupos com N experimental

constituído de 8 a 10 indivíduos. Para o processo de adaptação, os animais foram

colocados 1 hora antes da realização do experimento, nos locais dos testes. Os

protocolos experimentais de pesquisa foram encaminhados para o comitê de ética

em pesquisa com animais (CEUA) o qual foi aprovado com o parecer 037/2014.

(ANEXO 01).

4.2.1.2 Avaliação do EEPC sobre o sistema motor dos animais através do

modelo de deambulação - Teste de Campo Aberto (TCA)

Para avaliar possíveis efeitos inespecíficos do EEPC sobre o SNC e a

coordenação motora dos animais, seja por sedação e/ou por relaxamento muscular,

o teste de campo aberto foi utilizado conforme descrito por Tolardo et al., (2009).

O TCA utilizado é um aparato de madeira, com um lado de vidro transparente

e com o assoalho dividido em 9 quadrantes. Os animais foram, pré-tratados com o

EEPC, (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e veículo. Ambos foram administrados por via oral

e após 60 minutos, os animais foram transferidos individualmente para o aparato.

Por um período de 6 minutos foi observado o número de cruzamento entre os

quadrantes (crossings) bem como o número de posturas de exploração (rearings)

(TOLARDO et al., 2009).

4.2.1.3 Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ

O teste do PTZ foi utilizado para avaliar o efeito anticonvulsivante agudo e

sub-crônico (15 dias) da administração do EEPC. Num primeiro experimento os

animais receberam o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e

o veículo. Decorridos 60 minutos da administração do EEPC e veículo e 30 minutos

da administração do fenobarbital, os animais receberam o PTZ (100 mg/kg, i.p) e

foram imediatamente transferidos sob funis de vidro. Os animais foram analisados

por 60 minutos, para a verificação do tempo de latência para a primeira crise

convulsiva (NGUELEFACK et al., 2006).

62

Num segundo experimento, os animais foram pré-tratados diariamente por 15

dias com EEPC (50 mg/kg), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e veículo. No 15º dia de

tratamento decorridos 60 minutos da administração do EEPC e veículo e 30 minutos

da administração do fenobarbital, os animais receberam o PTZ (100 mg/kg, i.p) e

foram imediatamente transferidos sob funis de vidro. Os animais foram analisados

por 60 minutos, para a verificação do tempo de latência para a primeira crise

convulsiva.

4.2.1.4 Avaliação dos efeitos do EEPC sobre as convulsões induzidas

quimicamente por ESTRIC

O efeito anticonvulsivante do EEPC também foi avaliado através das

convulsões induzidas por estricnina. Os animais receberam o extrato da planta (50

mg/kg, v.o.), fenobarbital (30 mg/kg, i.p) e o veículo (v.o). Após 30 minutos da

administração do fenobarbital e 60 minutos da administração do veículo e o EEPC,

os animais receberam a estricnina (4 mg/kg,i.p) e foram imediatamente transferidos

sob funis de vidro. Os animais foram analisados por 60 minutos, para a verificação

do tempo de latência da primeira crise convulsiva (NGUELEFACK et al., 2006).

4.2.1.5 Avaliação do efeito do EEPC sobre o sono induzido por barbitúrico

(MSB)

Para investigação de um possível efeito hipnótico do EEPC, foi utilizado o

MSB conforme descrito por Devi et al., (2003) e padronizado por Holzmann (2014)

com pequenas modificações. Como controle positivo foi utilizado o diazepam (DZP)

(2 mg/kg, i.p.) e como negativo o veículo (v.o.). Os animais receberam os

tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles. Após 60 minutos da

administração do EEPC e controle negativo e 30 minutos da administração do DZP

foi administrado a cada grupo o pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.). Imediatamente após

administração do indutor do sono, os animais foram colocados individualmente sob

funis de vidro e a latência para o sono bem como o tempo total de sono foi

cronometrado, representado respectivamente pela perda e recuperação do reflexo

postural (HOLZMANN et al., 2014).

63

4.2.1.6 Avaliação do efeito do EEPC sobre a memória através do modelo da

esquiva inibitória (MEI)

Para a avaliação dos possíveis efeitos do EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) sobre

a memória de longa duração dos animais foi utilizado o modelo da esquiva inibitória

conforme procedimento descrito por Holzmann et al., (2014). O aparato consiste de

uma caixa automatizada (ALBARSCH), medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de

largura e 25 cm de altura, com a fase frontal de vidro. Parte do assoalho da caixa

consiste de uma plataforma de madeira com 5 cm de altura. O restante do assoalho

é constituído de uma grade de barras de bronze, com 1 cm de diâmetro espaçadas 1

cm uma das outras, através das quais é possível aplicar uma diferença de potencial

regulável de 0 a 1 mÅ. Durante a sessão de treino cada animal foi colocado sobre a

plataforma, acionando-se o cronômetro até sua total descida. Imediatamente era

acionado o dispositivo para os choques (0,4 mÅ), por 2 segundos. Na sessão de

teste repetiu-se o procedimento, mas com omissão dos choques. A diferença da

latência de descida entre treino e o teste foi considerado o índice de memória

(IZQUIERDO, 2002). Os animais foram treinados e receberam os tratamentos com o

EEPC e controles. Após 24 hs dos tratamentos foram submetidos ao teste da

esquiva inibitória.

4.2.1.7 Avaliação do efeito do EEPC sobre a ansiedade dos animais através do

modelo de labirinto em cruz elevado (LCE)

O modelo de ansiedade utilizando nesse estudo foi o LCE. O experimento foi

realizado conforme descrito por Pellow et al., (1985), e padronizado por Holzmann,

(2014) com pequenas modificações. O aparato utilizado é constituído de madeira,

em forma de cruz grega, com dois braços abertos (30 x 5 x 2,5 cm), e dois fechados

(30 x 5 x 15 cm), os braços são conectados por uma área central aberta (5 x 5 cm).

O aparato é elevado a uma altura de 50 cm sobre o chão.

Para a realização dos testes utilizou-se como controle positivo (diazepam 0,75

mg/kg, i.p.) e o controle negativo (veículo, v.o.). O EEPC foi administrada em três

concentrações diferentes 50, 100 e 150 mg/kg. Decorridos 60 minutos após a

administração do EEPC e/ou veículo e 30 minutos após a administração do

64

diazepam os animais foram colocados individualmente no centro do aparato com a

cabeça voltada ao braço fechado e observados durante 5 minutos.

Durante o período do experimento foi observado e registrado a freqüência de

entrada e o tempo de permanência nos braços abertos (FEA e TPA,

respectivamente), e nos fechados (FEF e TPF, respectivamente). As entradas foram

definidas quando o animal esteve com todas as quatro patas no braço visitado.

Para análise estatística, as percentagens das frequências de entradas nos

braços abertos (%FEA) e tempo permanência nesses braços (%TPA) foram

calculados de acordo com as fórmulas: %FEA = FEA / FEA + FEF X 100 e %TPA =

TPA / TPA + TPF X 100, para a análise estatística nos braços fechados foram

seguidas da mesma maneira.

4.2.1.8 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC através do TNF

Para avaliar possíveis efeitos antidepressivos do EEPC foi utilizado o TNF

conforme descrito Porsolt e colaboradores (1977) e padronizado por Holzmann et al.,

(2014) com algumas modificações. Nesse modelo, os animais foram colocados em

uma cuba com água a uma temperatura de 23+-2 Cº para nadarem por um período

de 5 minutos. Nesse período foi cronometrado o tempo de imobilidade dos animais,

ou seja, o tempo em que cada animal permanece imóvel. Fármacos antidepressivos

fazem com que os animais permaneçam mais agitados diminuíndo o tempo de

imobilidade. Os animais receberam os tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150

mg/kg, v.o), controle positivo imipramina (30 mg/kg, i. p.) e negativo veículo. Após 60

minutos (da administração do EEPC e controle negativo) e 30 minutos (da

administração da imipramina) os animais foram submetidos ao TNF.

4.2.1.9 Avaliação do efeito antidepressivo do EEPC através do Teste de

Suspensão pela Cauda (TSC)

A metodologia do TSC foi descrita por Steru et al., (1985) e padronizada por

Holzmann et al., (2014) para avaliar os possíveis efeitos antidepressivos de

substâncias. Nesse teste a parte terminal da cauda dos camundongos foi fixada com

fita adesiva, a uma altura de 50 cm do chão, em um aparato de madeira com

capacidade para 4 animais, os quais ficaram isolados visível e acusticamente. O

65

tempo de observação dos animais suspensos foi de 6 minutos, e foi analisado o

tempo de imobilidade dos mesmos. Substâncias com atividade antidepressiva tende

a diminuir o tempo de imobilidade aumentando a agitação dos animais. Os animais

receberam os tratamentos com o EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) e controles

positivo (fluoxetina 20 mg/kg, i.p.) e negativo (veículo). Após 60 minutos (da

administração do EEPC e controle negativo) e 30 minutos (da administração da

fluoxetina os animais foram submetidos ao TSC.

4.2.1.10 Avaliação do efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento

sub-crônico dos animais

Para avaliar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do tratamento sub-

crônico, os animais foram pré-tratados diariamente por 14 dias com o EEPC (50

mg/kg, v.o), fluoxetina (20 mg/kg, v.o) e veículo. No 7º e no 14º dias de tratamento,

após 60 minutos da administração do extrato e/ou veículo e 30 minutos da

administração da fluoxetina os animais foram submetidos ao TNF.

4.2.1.11 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do

EEPC (Time course)

Com o intuito de avaliar o tempo de duração do efeito tipo-antidepressivo do

EEPC foi realizado o time course. Nesse experimento, seis grupos de animais

receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o) e um grupo o veículo. Passados 1, 2, 3, 4, 5 e 6

horas da administração do extrato e/ou veículo, os animais foram submetidos ao

TNF.

4.2.1.12 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva dos compostos isolados

presentes na Piper cernuum, αβ-cubebina e o trans-dihidroagarofurano.

Foi relevante avaliar se os dois compostos presentes na planta são os

responsáveis pelo efeito tipo-antidepressivo. Para a realização dos testes, os

animais foram pré-tratados com αβ-cubebina (4 mg/kg, v.o.) e trans-

dihidroagarofurano (12,5 mg/kg, v.o.) e veículo. Após 60 minutos da administração

dos compostos e o veículo, os animais foram submetidos ao TNF.

66

4.2.1.13 Determinação do mecanismo de ação da atividade antidepressiva do

EEPC

Após os resultados sugerirem o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, tornou-se

relevante avaliar o mecanismo de ação desse efeito. Para avaliar o mecanismo de

ação, foi investigado a influência dos sistemas de monoaminas (envolvendo os

sistemas serotonérgico, noradrenérgico, dopaminérgico), sistemas glutamatérgico,

óxidonitrérgico, GABAérgico, oxidonitrérgico e sistema opióide sobre o efeito do

EEPC.

4.2.1.13.1 Avaliação da influência da reserpina sobre a atividade tipo-

antidepressiva do EEPC

Para avaliar o possível envolvimento do sistema monoaminérgico no

mecanismo de ação do EEPC, os animais foram pré-tratados por 4 dias

consecutivos com reserpina (4 mg/kg, i.p.), agente que causa depleção de

catecolaminas das vesículas sinápticas. Decorrido 30 minutos do último tratamento

(no quarto dia) com a reserpina, os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e/ou

veículo e foram submetidos ao TNF 60 minutos após o tratamento.

4.2.1.13.2 Avaliação da influência do sistema serotonérgico sobre a atividade

tipo-antidepressiva do EEPC

Para avaliar o possível envolvimento do sistema serotonérgico no mecanismo

de ação tipo-antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados durante 4 dias

consecutivos com PCPA (depletor dos estoques de 5-HT no SNC o qual inibe a

enzima triptofano-hidroxilase, que é responsável pela síntese de 5-HT) na dose de

100 mg/kg, i.p. Decorridos 24 horas após a última administração de PCPA e

ou/veículo, os animais foram tratados com o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e foram

submetidos ao TNF 60 minutos após os tratamentos.

Também foi avaliado o envolvimento dos receptores serotonérgicos subtipos

5-HT1A e 5-HT2A. Os camundongos foram pré-tratados com NAN-190 (0,5 mg/kg

i.p., antagonista 5-HT1A), ketanserina (5 mg/kg i.p., antagonista 5-HT2A) e/ou

67

veículo. Decorridos 30 minutos do tratamento com os antagonistas, os animais

receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e após 60 minutos foram submetidos ao TNF.

Para avaliar a influência do receptor serotonérgico subtipo 5-HT3, os

camundongos foram pré-tratados com ondansetrona (0,5 mg/kg, i.p., antagonista

seletivo 5-HT3). Após 30 minutos da administração da ondansetrona, os

camundongos receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.) e após 60 minutos foram

submetidos ao TNF.

4.2.1.13.3 Avaliação da influência do sistema noradrenérgico sobre a atividade


Para avaliar a influência do sistema noradrenérgico no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados com prazosin (1 mg/kg, i.p.,

antagonista α1), ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista α2), e/ou veículo. Passados 30

minutos os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e decorridos 60 minutos os

animais foram submetidos ao TNF.

4.2.1.13.4 Avaliação da influência do sistema dopaminérgico sobre a atividade


Para avaliar o possível envolvimento do sistema dopaminérgico no

mecanismo de ação tipo-antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados

com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p., antagonista não-seletivo dos receptores de

dopamina), SCH23390 (0,05 mg/kg, i.p., antagonista D1), pimozide (0,2 mg/kg, i.p.,

antagonista D2) e/ou veículo. Passando-se 30 minutos dos tratamentos com os

antagonistas, os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e decorrido 60

minutos foram submetidos ao TNF.

4.2.1.13.5 Avaliação da influência do sistema glutamatérgico sobre a atividade


Com o intuito de avaliar o possível envolvimento do sistema glutamatérgico no

mecanismo de ação tipo- antidepressivo do EEPC, os animais receberam NMDA (N-

metil-D-aspartato, 0,1 picomol/sítio, i.c.v.) e após 30 minutos foi administrado o

68

EEPC (50 mg/kg, v.o.). Decorridos mais 60 minutos os animais foram submetidos ao

TNF. Para a avaliação do efeito sinérgico EEPC com um antagonista dos receptores

NMDA, utilizou-se a quetamina (0,1 mg/kg, i.p). Primeiramente foi administrado a

quetamina (0,1 mg/kg, i.p) e após 30 minutos, foi administrado o EEPC (50 mg/kg,

v.o.) e o veículo. Decorridos 60 minutos os animais foram submetido TNF.

4.2.1.13.6 Avaliação da influência da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade


Para avaliar a influência do sistema sobre o efeito tipo-antidepressivo do

EEPC, administrou-se a L-arginina (750 mg/kg, i.p., precursor do NO), L-NAME (10

mg/kg, i.p., inibidor da NOS), 7-nitroindazol (25 mg/kg, i.p., um inibidor específico da

óxido nítrico sintase neuronal (NOSn), azul de metileno (20 mg/kg i.p., inibidor da

NOS e da GCs) e o sildenafil (5 mg, i.p., inibidor específico da fosfodiasterase 5

(PDE-5) enzima responsável pela degradação do GMPc) e/ou veículo. E, após 30

minutos dos tratamentos, os animais receberam o tratamento com o EEPC (50

mg/kg, v.o.). Decorridos 60 minutos os animais foram submetidos ao TNF.

4.2.1.13.7 Avaliação da Influência do sistema GABAérgico sobre a atividade


Para avaliar o possível envolvimento do sistema GABAérgico no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC os animais foram pré-tratados com bicuculina (1 mg/kg, i.p.,

antagonista dos receptores GABA-A) e faclofeno (1 mg/kg, i.p., antagonista dos

receptores GABA-B) e/ou veículo. Após 30 minutos da administração dos

antagonistas os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e após 60 minutos

foram submetidos ao TNF.

4.2.1.13.8 Avaliação da Influência do sistema opióide sobre a atividade tipo-


Para avaliar o possível envolvimento do sistema opióide no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC os animais foram pré-tratados com naloxona (1 mg/kg, i.p.,

antagonista não seletivo dos receptores opióides) e naltrindol (3 mg/kg, i.p.,

69

antagonista dos receptores δ-opioide) e/ou veículo. Após 30 minutos da

administração dos antagonistas os animais receberam o EEPC (50 mg/kg, v.o.), e

após 60 minutos foram submetidos ao TNF.

4.2.2 Modelos bioquímicos: Avaliação de parâmetros oxidativos

4.2.2.1 Preparação das amostras

As amostras utilizadas para a realização dos modelos bioquímicos, foram

coletadas pelo método da guilhotina, após o tratamento sub-crônico por 14 dias

consecutivos dos animais no TNF. Foram utilizados amostras de animais naíve

(animal que não recebeu nenhum tipo de tratamento, manuseio ou passou por

teste), controle negativo (veículo), controle positivo (fluoxetina, 10 mg/kg, i.p.) e o

EEPC (50 mg/kg, v.o.). Por ser a principal região cerebral envolvida em distúrbios

depressivos a região límbica foi utilizada para a realização dos testes. Fazem parte

da região límbica estruturas cerebrais corticais que se situam em volta do tronco

encefálico, na face interna (medial) e inferior dos hemisférios cerebrais (dentre essas

estruturas destaca-se o hipocampo, a amigdala, a substância cinzenta

periaquedutal, o hipotálamo) e subcorticais dentre as quais foram incluídos os bulbos

olfatórios. A região límbica dos animais foi pesada e homogeneizada em tampão

fosfato 200 mM (pH=6,5) a 4°C. Esse homogenato foi utilizado para a quantificação

dos níveis de GSH, SOD, CAT, GPx, GST, LPO, MAO-A, NO.

70

Figura 7. Partes do SNC de camundongos utilizadas para obtenção das amostras.

(A) parte do cérebro utilizada, (B) parte do cérebro descartada, (linha tracejada) corte (Fonte: Autor,

2016).

4.2.2.2 Mensuração da concentração de proteínas

A concentração de proteínas foi mensurada em espectrofotômetro a 590 nm

utilizando o reagente de Bradford (Amresco®) e albumina bovina (0,012 – 0,100

mg/ml) foi utilizada como curva padrão.

4.2.2.3 Avaliação da atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-

picrilhidrazil (DPPH)

Para avaliar o potencial antioxidante do EEPC, utilizou-se a metodologia

descrita por BLOIS (1958) e CHEN et al., (2004) com algumas modificações. Nessa

metodologia o EEPC foi avaliado através da sua capacidade em reduzir o radical

livre estável DPPH, através de alterações da absorbância a 517 nm. O sistema de

reação foi constituído de 750 μL de solução teste (fração) e 250 μL de solução

metanólica de DPPH (1 mg em 25 mL). Após 5 minutos o decréscimo da

absorbância foi medido. A solução do agente redutor ácido ascórbico (50 μg/mL) foi

utilizada como controle positivo do teste e como grupo controle negativo foi utilizado

água com 0,32 % DMSO (veículo). Os valores foram expressos em μg/ml.

71

4.2.2.4 Quantificação dos níveis de GSH

Para quantificar os níveis de GSH utilizou-se o método de (SEDLAK;

LINDSAY, 1968), com algumas modificações. Nos microtubos de polipropileno foi

adicionado 50 µL do homogenato, preparado como descrito anteriormente, e 40 µL

de ácido tricloroacético (ATC) 12,5%, os quais foram agitados para homogeneizar e

levados a microcentrifuga por um período de 15 minutos a 4000 RPM a uma

temperatura de 4ºC. Posteriormente foi adicionado uma alíquota de 20 μL do

sobrenadante, seguido de 270 μL de TRIS 0,4 M (pH 8,9) e 10 μL de DTNB (5,5‘-

ditiobis 2-ácido nitrobenzóico) 1 mM em uma placa de 96 poços. Para a realização

do branco foi utilizado 300 µL de TRIS 0,4 M (pH 8,9). Em seguida foi realizada a

leitura em espectrofotômetro a uma absorbância de 415 nm. Os valores individuais

foram interpolados em uma curva padrão de GSH (1,23–9,9 μg/mL), com os valores

expressos em μg de GSH/g de tecido.

4.2.2.5 Determinação da atividade enzimática da SOD

A atividade enzimática da SOD foi determinada através da capacidade desta

enzima em inibir a auto-oxidação do pirogallol, como descrito por Marklund;

Marklund, (1974). Em um microtubos de polipropileno foi adicionado 442,5 μl

Tampão Tris/EDTA (pH= 8,5) e 40 µL do sobrenadante da amostra. A mistura

reacional acrescida da amostra foi homogeneizada e adicionou-se 25 µL de

pirogallol. Posteriormente o meio reacional foi armazenado em temperatura

ambiente por um período de 20 minutos. Ao término do período de incubação, foi

adicionado 12,5 µL de HCl 1M, com o objetivo de parar a reação. Os microtubos de

polipropileno foram centrifugados por 4 minutos, a 14000 RPM a uma temperatura

de 4ºC. Em uma placa de 96 poços foram adicionados 300 µL do sobrenadante, a

absorbância foi quantificada no espectrofotômetro em 405-440 nm. Os resultados

foram comparados com o controle (tampão Tris-EDTA com pirogallol sem incubação

+ média sem amostra sem incubação), sendo este valor igual a 100%. A quantidade

de proteína que inibe a reação em 50% (IC50) equivale a 1 unidade (U) de SOD. Os

resultados foram expressos em U de SOD/mg de proteína.

72

4.2.2.6 Quantificação da atividade da enzima CAT

A metodologia utilizada foi descrita por AEBI (1984) com algumas

modificações. Para a realização do ensaio para determinação da atividade da CAT o

homogenato cerebral foi centrifugado por 20 minutos a 9000 RPM a uma

temperatura de 4ºC. Posteriormente 20 µL do sobrenadante foi transferido para uma

cubeta de quartzo com 1960 µL de solução de reação (Tampão Tris/ EDTA 5mM, pH

8,0; peróxido de hidrogênio 30%; água Milli-q ultrapura). O decréscimo da

absorbância foi medida em comprimento de onda de 240 nm por 1 minuto. Os

resultados foram expressos em μmol de H2O2 consumidos/min/g de tecido.

4.2.2.7 Quantificação dos níveis da atividade da enzima GPx

Para quantificar os níveis da atividade da GPx foram adicionados em uma

placa de 96 poços, 20 µL do sobrenadante ou água destilada (para o branco), 180

µL da solução de reação (3,08 mM de azida sódica, 0,31 mM de β-NADPH, 1,54

unidades/mL de glutationa redutase de levedura e 3,08 mM de GSH em 100 mM de

tampão fosfato de sódio, pH 7,0). A placa permaneceu em temperatura ambiente por

10 minutos, após esse período a reação foi iniciada pela adição de 25 μL de

peróxido de hidrogênio 5 mM em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7.0. O

decréscimo de absorbância foi imediatamente medida a 340 nm por 1 min em

intervalos de 10 s. A atividade da GPx foi expressa em mmoles/mg de proteína/min.

(LAWRENCE; BURK, 1976).

4.2.2.8 Determinação da atividade da atividade da GST

A metodologia utilizada foi descrita por Wu et al., (1996) para quantificar a

atividade da GST, consiste em avaliar a conjugação de 1 mM de GSH, com 1 mM do

reagente CDNB, processo catalisado pela enzima GST. Na placa de 96 poços foram

adicionados 50 µL do sobrenadante da amostra, 50 µL (Tampão Tris/ EDTA 5mM,

pH8,0 e 200 µL do meio reacional. Posteriormente a placa foi levada ao

espectrofotômetro para realização da leitura em 340 nm. Os resultados foram

expressos em nmols de GST/mg proteínas/min.

73

4.2.2.9 Quantificação da lipoperoxidação (LPO)

Para avaliar o dano no tecido cerebral produzido pelo estresse oxidativo

ocasionado pela peroxidação lipídica, utilizamos o método de Jiang et al., (1992).

Primeiramente, em 100 μL de homogenato foi adicionado 10 μL de metanol e

homogeneizados, e levados a centrifuga por um período de 20 minutos a 9.000 RPM

a uma temperatura de 4ºC. Posteriormente, em uma placa de 96 poços foi

adicionado 30 μL do sobrenadante e 140 μL do meio reacional (4 mM hidroxitolueno

butilado, 250 mM FeSO4, 25 mM H2SO4 e 100 mM xilenol laranja) a placa

permaneceu por 30 min ao abrigo da luz, e após esse período foi levada ao

espectrofotômetro, e a leitura ocorreu em 560 nm e a concentração de LPO foi

ajustada a 1 mg de tecido. Os resultados foram expressos em mmol/mg de tecido,

utilizando o coeficiente de extinção de 43.6/M/cm de H2O2.

4.2.2.10 Quantificação dos níveis da atividade da enzima MAO-A

Primeiramente o homogenato foi centrifugado por 10 minutos a 4000 RPM a

uma temperatura de 4ºC. Após, o sobrenadante foi retirado e centrifugado por 120

minutos a 15000 G/4ºC. Os sedimentos foram resuspensos com tampão fosfato.

A concentração de proteínas foi ajustada a 1 mg/ml, e medida pelo método de

Lowry (1951) utilizando albumina bovina como padrão.

A avaliação da MAO-A seguiu da seguinte maneira, 50 µL de amostra

acrescidos de 30 µL de 4 mM de 5-HT (como substrato específico para MAO-A) e

100 µL de tampão fosfato foram incubados por 20 minutos a 37ºC. Após 20 minutos

a reação foi parada com 50 µL de HCl 1 M. O produto da reação foi extraído com

2200 µL de butil acetato. A fase orgânica foi utilizada, e medida em

espectrofotômetro em 280 nm.

Para a realização do branco 50 µL de amostra, acrescida de 50 µL de HCl 1

M, 100 µL de tampão fosfato foram incubados por 20 minutos a 37ºC.

Posteriormente foi adicionado 30 µL de 4mM de 5-HT e 2200 µL de butil acetato. A

fase orgânica foi utilizada, e medida em espectrofotômetro em 280 nm. A atividade

da enzima MAO-A foi expressa em nmol/mg de proteína (YU et al., 2002).

74

4.2.2.11 Quantificação da atividade do NO

Para quantificar os níveis de NO utilizou-se a reação de Griess

(MOORCROFT et al., 2001). Neste procedimento, 300 µl de homogenato foi

adicionado 300 µl de água destilada, 60 µl de sulfato de zinco 20%, e imediatamente

foi homogeneizado e permaneceu 1 hora em 4º C e posteriormente foi centrifugado

por 15 minutos a 10.000 RPM a uma temperatura de 4ºC. Nos microtubos de

polipropileno foi transferido 200 µl do sobrenadante e 800 µl do mix reacional (HCl

500 mM; vanádio 0,09 mM; sulfonilamida 0,116 mM; etilenodiamina 0,016 mM). Foi

adicionado em uma placa de 96 poços, 300 µl do composto formado pelo

sobrenadante e o mix, e a leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro

em 540 nm.

4.3 Análise estatística

Os dados obtidos foram apresentados com médias seguido pelos respectivos

erro padrão médio (EPM) para os testes paramétricos e à análise de variância

(ANOVA) de uma via e/ou duas vias, quando necessário realizou-se o teste de

múltipla comparação a partir dos modelos pos hoc de Bonferroni, utilizando o

software GraphPad PRISM® 5. Para os modelos não paramétricos como o MEI, foi

utilizado o teste pos hoc de Mann-Whitney. Nesses casos os resultados foram

apresentados como medianas seguidas dos intervalos interquatil. Foram

considerados estatisticamente significantes os valores de p menor do que 0,05 (p <

0,05) (MANSOURI et al., 2014).

75

5 RESULTADOS

5.1 Efeito na atividade locomotora do EEPC através do TCA em camundongos

Na figura 8 está representado o efeito do tratamento do EEPC sobre a

atividade locomotora dos animais submetidos ao TCA. Conforme demonstrado, o

tratamento dos animais com EEPC (50, 100, 150 mg/kg) não alterou a performance

motora dos animais como demonstrado pelos dados referentes ao número de

cruzamento (crossings) [F(3,36)=0,3370, p>0,05] (figura 8A), e a atividades

exploratórias (rearings) [F(3.36)=0,5570, p>0,05] (figura 8B) quando comparado

com o grupo controle tratado com veículo.

Figura 8. Efeito do EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o) sobre os parâmetros locomotores dos animais submetidos ao TCA

Veículo 50 100 1500

50

100

150

200

Veículo EEPC

Tratamento (mg/kg, v.o)

A

Núm

ero

de C

rossin

gs

Veículo 50 100 1500

25

50

75

Tratamento (mg/kg, v.o)

B

Núm

ero

de R

eari

ng

(A) refere-se ao número de cruzamentos (crossings) e (B) o número de atividade exploratória

(rearings). O EEPC (50 mg/kg, v.o. ) foi administrado 60 minutos antes do teste. Os valores foram expressos como média seguido dos EPM (N=8-10). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA, seguido pelo teste de Bonferroni.

76

5.2 Avaliação da atividade tipo-anticonvulsivante aguda e sub-crônica do

EEPC, nos modelos do PTZ e estricnina

O efeito do tratamento do EEPC nos modelos de convulsões induzida por

PTZ e estricnina é mostrado na figura 9. No teste do PTZ (figura 9A), o EEPC nas

doses de 50, 100 e 150 mg/kg não foram capazes de promover aumento do tempo

de latência para o início das crises convulsivas, quando comparado com o grupo

veículo [F(4,43)=3,332, p>0,05], [F(4,43)=9,119, p>0,05] e [F(4,43)=3,597, p>0,05],

respectivamente. Em contrapartida, o fenobarbital utilizado como controle positivo,

apresentou um aumento significativo no tempo de latência para o início da crise

convulsiva quando comparado com o grupo veículo [F(4,43)=7,165, p<0,001] .

Nas crises convulsivas induzidas por estricnina (figura 9B) o tratamento dos

animais com EEPC [F(2,22)=2,188, p>0,05] e fenobarbital [F(2,22)=1,632, p>0,05]

não foram capazes de aumentar o tempo de latência para o início das crises

convulsivas quando comparado com o grupo veículo.

A atividade anticonvulsivante do EEPC também foi avaliada após tratamento

subcrônico, por um período de 14 dias utilizando-se o teste do PTZ conforme

demonstrado na figura 9C, porém, o tratamento dos animais com EEPC não foi

capaz de aumentar o tempo de latência para o início das crises convulsivas quando

comparado com o grupo veículo [F(2,24)=8,638, p>0,05]. Já, o fenobarbital utilizado

como controle positivo, apresentou aumento da latência para início da crise

convulsiva, quando comparado com o grupo veículo [F(2,24)=146,8, p<0,001].

77

Figura 9. Efeito do EEPC sobre as convulsões induzidas por PTZ e estricnina.

Veículo 30 50 100 1500

100

200

300

400

500

Veículo Fenobarbital EEPC

***

A

Tratamento mg/kg

Tem

po d

e la

tência

(s)

Veículo 30 500

50

100

150B

Tratamento mg/kg

Tem

po d

e la

tência

(s)

Veículo 30 500

100

200

300

***

C

Tratamento mg/kg

Tem

po d

e la

tência

(s)

(A) tratamento agudo dos animais com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) submetidos as convulsões

induzidas por PTZ. (B) tratamento agudo dos animais com EEPC (50 mg/kg, v.o.) submetidos aos testes de convulsão induzida por STRIC. (C) tratamento subcrônico de animais com EEPC (50 mg/kg) submetidos ao teste de convulsão induzida por PTZ. O EEPC foi administrado 60 minutos, e

o fenobarbital 30 minutos antes do teste. Os valores foram expressos como média seguido dos respectivos EPMs (N=8-10). **p<0,01, ***p<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com veículo. Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA, seguido pelo teste de

Bonferroni.

78

5.3 Avaliação da atividade tipo-hipnótica do EEPC sobre o sono induzido por

barbitúrico em camundongos

Os resultados obtidos demonstram que o tratamento dos animais com EEPC

(100 e 150 mg/kg) promoveu uma diminuição significativa no tempo de latência para

o sono [F(4,43)=9,119, p<0,01] e [F(4,43)=3,597, p<0,05], quando comparados com

o grupo veículo, respectivamente. O diazepam utilizado como controle positivo,

também apresentou uma diminuição no tempo de latência para o sono quando

comparado com o grupo veículo [F(4,43)=5,840, p<0,001] (figura 10A).

Na figura 10B, foi verificado o tempo total de sono, no entanto, foi alterado

apenas com o tratamento do EEPC (150 mg/kg). Observa-se o aumento no tempo

total de sono quando comparado com o grupo veículo [F(4,44)=1,201, p<0,001].

Neste parâmetro, o diazepam utilizado como controle positivo, também apresentou

resultado semelhante, ocasionando um aumento no tempo total de sono, produzindo

seu característico efeito hipnótico [F(4,44)=33,58, p<0,001].

79

Figura 10. Efeito do tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre o sono induzido por barbitúrico

Veículo DZP 50 100 1500

50

100

150

200

250 A

Veículo Diazepam EEPC

*

***

**

Tratamento (mg/kg)

Late

ncia

para

o s

ono (

s)

Veiculo DZP 50 100 1500

4000

8000

12000

***

***

B

Tratamento (mg/kg)

Tem

po tota

l de s

ono (

s)

Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total de sono (B). Os valores foram expressos como média seguido dos respectivos EPMs (N=8-10).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.4 Avaliação da atividade tipo-nootrópica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre

a memória de animais avaliados através do MEI

Na figura 11 estão representados os efeitos do EEPC sobre a retenção de

memória dos animais submetido ao MEI. Comparando as seções de teste com as de

treino para cada grupo de tratamento, observa-se que os animais aprenderam a

tarefa da esquiva inibitória, ocorrendo um aumento no tempo de permanência dos

mesmos sobre a plataforma de forma estatisticamente significante (*p<0,05 e

**p<0,01). Porém, quando se avalia a sessão de teste (somente barras escuras da

figura 10) e compara-se com o veículo (representado pela dose 0 de EEPC) verifica-

se que estatisticamente não houve efeito do tratamento sobre a memória dos

80

animais. Sendo assim, o EEPC não exibiu efeito nootrópico positivo ou negativo

sobre a memória dos animais.

Figura 11. Efeito do tratamento do EEPC sobre a memória dos animais submetidos ao MEI

0

50

100

150

**

***

Sessão de treino Sessão de Teste

EEPC (mg/kg, v.o.)

50 1500 300

Latê

ncia

de d

escid

a (

s)

Efeito do EEPC (50, 100, 150 mg/kg) e/ou veículo (0), na retenção da memória na esquiva inibitória

Cada barra representa a mediana (gama interquartil) (N=8-10). dos experimentos. Barras claras

correspondem as sessões de treino e as escuras as sessões de teste. *p<0,05 e **p<0,01

comparando-se treino e teste para cada tratamento. Os dados foram analisados pelo teste de

análise de variância de Kruskal-Wallis.

5.5 Avaliação da atividade tipo-ansiolítica do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) sobre

parâmetros de animais submetidos ao modelo de ansiedade, o LCE

Os resultados apresentados abaixo na figura 12 demonstram que o

tratamento dos animais com EEPC nas doses de 100, 150 e 300 mg/kg, não alterou

a frequência de entrada (figura 12A) e o tempo de permanência (figura 12B) nos

braços abertos do aparato quando comparados com o grupo veículo. Também não

foram observadas diferenças significativas quanto a frequência de entradas (figura

12C) e o tempo de permanência nos braços fechados (figura 12D) quando

comparados com o grupo que recebeu veículo. Por outro lado, durante o

experimento foi observado o efeito tipo- ansiolítico clássico do DZP, o qual promoveu

aumento da frequência de entradas (figura 12A) e o tempo de permanência nos

braços abertos (figura 12B) quando comparados com o grupo veículo.

81

Figura 12. Efeito do tratamento do EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e diazepam (0.75 mg/kg) sobre parâmetros comportamentais de animais submetidos ao modelo de ansiedade, o teste do labirinto em cruz elevado

Veículo 50 100 150 0,750

20

40

60

80

***

B

Tratamento (mg/kg)

Tem

po d

e p

erm

anência

nos

bra

ços

abert

os

(%)

Veículo 50 100 150 0,750

20

40

60

80

***

D

Tratamento (mg/kg)

Tem

po d

e p

erm

anência

nos

bra

ços

fechados

(%)

Veículo 50 100 150 0,750

20

40

60

80A

***

Tratamento (mg/kg)

Fre

quencia

de e

ntr

ada

nos

bra

ços

abert

os

(%)

Veículo 50 100 150 0,750

20

40

60

80

***

C

Tratamento (mg/kg)

Fre

quencia

de e

ntr

ada

nos

bra

ços

fechados

(%)

Veículo EEPC Diazepam

Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B),

frequência de entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). ***p<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.6 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC

5.6.1 Efeito tratamento com EEPC (50,100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg)

em animais submetidos ao TNF

Na figura 13 é observado que o tratamento dos animais com EEPC promoveu

uma diminuição no tempo de imobilidade dos mesmos quando submetidos ao TNF,

nas doses de 50, 100 e 150 mg/kg, v.o, quando comparados com o grupo controle

tratado com veículo, [F(4,44)=2,356, p<0,001], [F(4,44)=9,619, p<0,001] e

[F(4,44)=27,29, p<0,001], respectivamente. Observa-se também que a imipramina

(30 mg/kg), também promoveu uma diminuição no tempo de imobilidade dos animais

82

[F(4,44)=6,352, p<0,001], quando comparado com o grupo controle tratado com

veículo.

Figura 13. Efeito tipo antidepressivo do EEPC e imipramina através do TNF

Veículo 50 100 150 300

50

100

150

Veículo EEPC Imipramina

***

*** ******

Tratamento (mg/kg)

Tem

po d

e I

mobili

dade (

s)

Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). ***p<0,001 quando comparado com o grupo tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.6.2 Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30

mg/kg) submetidos ao TSC

Na figura 14 estão representados os resultados obtidos com o tratamento de

animais com EEPC e avaliados no modelo de TSC. Conforme demonstrado o EEPC

promoveu a diminuição do tempo de imobilidade dos camundongos nas doses de 50

e 150 mg/kg [F(4,49)=2,621, p>0,05] e [F(4,49)=6,365, p>0,05] quando comparado

com o grupo controle tratado com veículo. Na dose de 100 mg/kg, houve uma

tendência a diminuir o tempo de imobilidade, porém sem significância estatística. O

tratamento dos animais com imipramina diminui o tempo de imobilidade

[F(4,49)=2,124, p<0,001], quando comparado com o grupo veículo.

83

Figura 14. Efeito do tratamento com EEPC (50, 100 e 150 mg/kg) e imipramina (30 mg/kg) em animais submetidos ao TSC

Veículo 50 100 150 300

50

100

150

Tratamento (mg/kg)

Veículo EEPC Imipramina

**

***

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs (n=8-10). *p<0,05 e ***p<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com veículo; (ANOVA de uma via seguida do teste

de Bonferroni).

5.6.3 Avaliação da atividade tipo-antidepressiva do EEPC em o tratamento sub-

crônico

Os resultados observados na figura 15A e 15B demonstram que após 7 e 14

dias de tratamento, o EEPC (50 mg/kg, v.o.) continua a promover a diminuição do

tempo de imobilidade dos camundongos quando submetidos a TNF [F(2,23) =1,026,

p<0,05] e [F(2,22)=1,210, p<0,001] respectivamente, quando comparado com o

grupo controle tratado com veículo. Porém, a fluoxetina (10mg/kg) utilizada como

controle positivo, apresentou apenas no 14º dia a diminuição do tempo de

imobilidade [F(2,22)=8,202, p<0,001] quando comparado com o grupo controle

tratado com veículo.

84

Figura 15. Efeito tipo-antidepressivo com o tratamento sub-crônico do EEPC (50 mg/kg) e fluoxetina (10 mg/kg) em camundongos submetidos ao TNF

Veículo 50 100

40

80

Veículo FluoxetinaEEPC

Tratamento (mg/kg)

*

A

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Veículo 50 100

50

100

Tratamento (mg/kg)

******

B

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

EEPC (50 mg/kg, v.o) e fluoxetina (10 mg/kg, i.p) administrados por um período de 7 dias (A) e 14 dias (B) no TNF. Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). *p<0,05 e ***p<0,001 denotam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado com

veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.7 Avaliação do tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC

(Time course)

Na figura 16 estão representados os resultados sobre o tempo de ação da

atividade tipo-antidepressiva do EEPC. O tratamento com EEPC (50 mg/kg, v.o)

produziu um efeito significativo ao reduzir o tempo de imobilidade dos animais, após

1 hora [F(6,52)=1,260, p<0,05], 2 horas [F(6,52)=2,546, p<0,001, 3 horas

[F(6,52)=1,561, p<0,05] e 4 horas [F(6,52)=1,819, p<0,05] da sua administração,

quando comparado com o grupo controle tratado com véiculo.O pico do efeito tipo-

antidepressivo foi observado 2hs após a aplicação do EEPC

85

Figura 16. Tempo de duração da atividade tipo-antidepressiva do EEPC (50 mg/kg) em animais submetidos ao TNF

1 2 3 4 5 6 0

40

80

Veículo EEPC (50 mg/kg, v.o)

Duração do efeito (h)

****

* *

Veículo

Tem

po d

e im

obili

dade

(s)

O EEPC (50 mg/kg) foi administrado 1, 2, 3, 4, 5 e 6 horas antes do teste. Os resultados foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=8-10). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 denotam

significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.8 Avaliação do efeito tipo-antidepressivo da αβ-cubebina e do trans-

dihidroagarofurano em animais submetidos ao TNF

Na figura 17 estão representados resultados da avaliação do efeito tipo-

antidepressivo de dois dos compostos majoritários presentes no EEPC, a αβ-

cubebina (4 mg/kg, v.o) e o trans-dihidroagarofurano (12,5 mg/kg, v.o). O tratamento

dos animais com a αβ-cubebina promoveu uma diminuição no tempo de imobilidade

dos camundongos no TNF [F(2,22)=4,616, p<0,01], assim como o controle positivo

imipramina [F(2,22)=8,437, p<0,01], quando comparados com o grupo veículo (figura

17A). Na figura 17B o mesmo perfil farmacológico foi observado com o trans-

dihidroagarofurano [F(2,23)=2,099, p<0,01] e a imipramina [F(2,23)=8,437, p<0,01]

quando comparados com o grupo controle tratado com veículo.

86

Figura 17. Efeito tipo-antidepressivo do tratamento da αβ-cubebina e do trans-dihidroagarofurano em camundongos submetidos ao TNF

Veículo 4 300

40

80

120

Veículo -cubebina Imipramina

**

**

Tratamento (mg/kg)

A

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Veículo 12,5 300

40

80

120

Veículo Trans-dihidroagarofurano Imipramina

Tratamento mg/kg

** **

B

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

(A) efeito da administração da αβ-cubebina (4 mg/kg, v.o), (B) e do trans-dihidroagarofurano (12,5 mg/kg, v.o) sobre tempo do imobilidade de camundongos no TNF. Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). **p<0,01 denotam significâncias estatísticas quando comparado

com o grupo controle tratado com veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.9 Avaliação do sistema monoaminérgico sobre a atividade tipo-


5.9.1 Influência da reserpina no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

O pré-tratamento dos camundongos com reserpina (depletora das

monoaminas) por 4 dias consecutivos foi capaz de reverter de forma significativa o

efeito tipo-antidepressivo do EEPC (50 mg/kg, v.o.). Pré-tratamento com reserpina

[F(3,32)=3,783, p>0,05], tratamento com EEPC [F(3,32)=14,78, p<0,01], interação

reserpina x EEPC [F(3,32)=12,94, p<0,001] (figura 18).

87

Figura 18. Efeito da reserpina sobre a atividade tipo-antidepressiva do EEPC.

Veículo EEPC Veículo EEPC0

50

100

150

200

###**

Salina Reserpina (4 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Influência do pré-tratamento dos camundongos com reserpina (4 mg/kg, i.p) por 4 dias consecutivos, no efeito anti-imobilidade do EEPC (50 mg/kg, v.o. ) em animais no TNF. Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10).**p<0,01 quando comparado com o grupo

controle tratado com veículo; ###p<0,001 quando comparado com o grupo tratado com EEPC sozinho (ANOVA de duas vias seguida do teste de Bonferroni).

5.10 Avaliação do sistema serotonérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC

5.10.1 Influência dos tratamentos com PCPA, NAN-190, ondansetrona e

ketanserina, sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC em camundongos

submetidos ao TNF

O pré-tratamento dos animais com PCPA (inibidor da enzima triptofano

hidroxilase) por 4 dias consecutivos, reverteu de forma significativa o efeito tipo-

antidepressivo do EEPC (50 mg/kg, v.o.). Pré-tratamento com PCPA


PCPA x EEPC [F(3,37)=7,870, p>0,05] (figura 19A).

O pré-tratamento dos animais com NAN-190 (antagonista dos receptores

serotonérgicos 5-HT1A) 30 minutos antes da administração do EEPC (50 mg/kg,

v.o.), reverteu de forma significativa o efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Pré-

tratamento com NAN-190 [F(3,26)=1,476, p>0,05], tratamento com EEPC

88

[F(3,26)=9,351, p<0,01], interação NAN x EEPC [F(3,26)=31,23, p<0,001] (figura

19B). Da mesma forma, o pré-tratamento dos camundongos com ondansetrona

(antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT3) 30 minutos antes da

administração do EEPC (50 mg/kg, v.o.), reverteu de forma significativa o efeito tipo-

antidepressivo do EEPC. Pré-tratamento com ondansetrona [F(3,25)=3,906, p>0,05],

tratamento com EEPC [F(3,25)=14,35, p<001], interação ondansetrona x EEPC

[F(3,25)=6,103, p<0,05] (figura 19C). Porém, o pré-tratamento dos camundongos

com ketanserina (antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT2A) 30 minutos

antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o.), não foi capaz de reverter o efeito

tipo-antidepressivo do EEPC. Pré-tratamento com ketanserina [F(3,27)=0,3363,

p>0,05], tratamento com EEPC [F(3,27)=87,38, p<0,001], interação ketanserina x

EEPC [F(3,27)=0,8295, p>0,05] (figura 19D).

89

Figura 19. Efeito do PCPA, NAN-190, ondansetrona e ketanserina, na atividade tipo-antidepressivo do EEPC no TNF.


50

100

150

A

***

Salina PCPA (100 mg/kg, i.p.)

Tem

po

de im

ob

ilid

ad

e (

s)


50

100

150

B

###

**

Salina NAN-190 (0,5mg/kg, i.p.)

Tem

po

de im

ob

ilid

ad

e (

s)


50

100

150

C

#***

Salina Ondansetrona (0,5 mg/kg, i.p.)

Tem

po

de im

ob

ilid

ad

e (

s)


50

100

150

D

******

Salina Ketanserina (5 mg/kg, i.p.)

Tem

po

de im

ob

ilid

ad

e (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com PCPA (100 mg/kg, i.p) (A). NAN-190 (0,5 mg/kg, i.p) (B), ondansetrona (0,5 mg/kg, i.p) (C) e ketanserina (5 mg/kg, i.p) (D), administrados 30 minutos antes

da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o) e submetidos ao TNF. Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 quando comparado com o grupo controle tratado com veículo; #p<0,05 e ###p<0,001 quando comparados com o grupo tratado com

EEPC sozinho, (ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni).

90

5.11 Avaliação do sistema noradrenérgico sobre a atividade tipo-


5.11.1 Influência da ioimbina e do prazosin na atividade tipo-antidepressiva do

EEPC

A via noradrenérgica também foi avaliada como um possível mecanismo de

ação do EEPC. O pré-tratamento dos camundongos com prazosin (antagonista dos

receptores α-1 adrenérgicos) 30 minutos antes da administração do EEPC (50

mg/kg, v.o.), reverteu de forma significativa o efeito tipo-antidepressivo do EEPC,

(pré-tratamento com prazosin [F(1,25)=7,40, p<0,05], tratamento com EEPC

[F(1,25)=4,49, p<0,001], interação prazosin x EEPC [F(1,25)=12,67, p<0,01]) (figura

20A). Por outro lado, o pré-tratamento com ioimbina (antagonista dos receptores α-2

adrenérgicos) 30 minutos antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o.), não foi

capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do EEPC (Pré-tratamento com

ioimbina [F(1,25)=0,25, p>0,05], tratamento com EEPC [F(1,25)=38,05, p<0,001],

interação ioimbina x EEPC [F(1,25)=6,445, p>0,05]) (figura 20B).

91

Figura 20. Influência da ioimbina e prazosin no efeito tipo-antidepressivo do EEPC (50 mg/kg, v.o.)


50

100

150

A

##***

Salina Prazosin (1 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

B

***

***

Salina Ioimbina 1 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com prazosin (1 mg/kg, i.p) (A) e ioimbina (1 mg/kg, i.p)

(B), administrados 30 minutos antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o) em animais no TNF. Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10).***p<0,001 denotam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado com veículo e, #p<0,05

quando comparados com o grupo EEPC sozinho (ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni).

5.12 Avaliação do sistema dopaminérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC

5.12.1 Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC em animais submetidos ao TNF

Na figura 21A observa-se que o pré-tratamento dos camundongos com

haloperidol (antagonista não seletivo dos receptores dopaminérgios) 30 minutos

antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o.), reverteu de forma significativa o

efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Pré-tratamento com haloperidol [F(3,32)=34,20,

92

p<0,001], tratamento com EEPC [F(3,32)=19,48, p<0,001], interação haloperidol x

EEPC [F(3,32)=13,53, p<0,001]. Da mesma forma, o pré-tratamento dos

camundongos com pimozide (antagonista dos receptores dopaminérgicos D2) (Pré-

tratamento com pimozide [F(3,33)=16,99, p<0,001], tratamento com EEPC

[F(3,33)=14,83, p<0,01], interação pimozide x EEPC [F(3,33)=12,51, p<0,001] (figura

21B) e SCH23390 (antagonista dos receptores dopaminérgicos D1), reverteram de

forma significativa o efeito tipo-antidepressivo do EEPC (50 mg/kg, v.o.). Pré-

tratamento com SCH23390 [F(3,32)=3,956, p>0,05], tratamento com EEPC

[F(3,32)=9,912, p<0,01], interação SCH23390 x EEPC [F(3,32)=7,534, p<0,05]

(figura 21C).

93

Figura 21. Influência do haloperidol, pimozide e SCH23390 no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com haloperidol (0,2 mg/kg, i.p), (A), pimozide (0,2 mg/kg, i.p) (B), SCH23390 (0,05 mg/kg, i.p) (C) administrados 30 minutos antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o) e submetidos ao TNF. Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs

(n=8-10).**p<0,01 e ***p<0,001 denotam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo controle tratado com veículo e, #p<0,05 e ###p<0,001 quando comparado com o grupo tratado EEPC sozinho (ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni).


50

100

150

200

A

*** ###

Salina Haloperidol (0,2 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

200

B

###***

Salina Pimozide 0,2 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

C

#**

Salina SCH23390 (0,05 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

94

5.13 Avaliação do sistema glutamatérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC

5.13.1 Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC

em animais submetidos ao TNF

Um possível sinergismo entre a quetamina (antagonista não competitivo do

receptor NMDA) e o EEPC foi avaliado. O pré-tratamento dos camundongos com

quetamina 30 minutos antes da administração do EEPC, foi capaz de potencializar o

efeito tipo-antidepressivo do EEPC (Pré-tratamento com quetamina [F(3,26)=33,84,

p<0,001], tratamento com EEPC [F(3,26)=50, p<0,001], interação quetamina x

EEPC [F(3,26)=4,719, p<0,01] (figura 22A). Porém, o pré-tratamento dos

camundongos com NMDA (agonista glutamatérgico) 30 minutos antes da

administração do EEPC, não foi capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do

EEPC (Pré-tratamento com NMDA [F(3,29)=2,251, p>0,05], tratamento com EEPC

[F(3,29)=18,88, p<0,001], interação NMDA x EEPC [F(3,29)=2,527, p>0,05] (figura

22B).

95

Figura 22. Influência da quetamina e NMDA no efeito tipo-antidepressivo do EEPC


25

50

75

100

A

***

***

##*

Salina Ketamina (0,1 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

B

***

Salina NMDA (0,1 pmol/sítio, i.c.v)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com quetamina (0,1 mg/kg, i.p) (A) e NMDA (0,1 pmol/sítio, i.c.v) (B), 30 minutos antes da administração do EEPC (50 mg/kg, v.o) em animais no TNF.

Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10).***p<0,001 expressam diferenças quando comparado com o grupo controle tratado com veículo e ##p<0,01 quando comparados com o grupo tratado EEPC sozinho (ANOVA de duas vias, seguida do teste de

Bonferroni).

5.14 Avaliação da via L-arginina-NO-GMPc sobre a atividade tipo-


5.14.1 Influência dos tratamentos com da L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de

metileno e sildenafil no efeito tipo-antidepressivo do EEPC através do TNF

Outra via relevante nos processos depressivos que foi avaliada como possível

mecanismo de ação do EEPC, é a via L-arginina-NO-GMPc. O pré-tratamento dos

camundongos com L-arginina (precursor do NO) 30 minutos antes da administração

do EEPC, reverteu de forma significativa o efeito tipo-antidepressivo do EEPC (50

mg/kg, v.o.) (Pré-tratamento com L-arginina [F(3,23)=2,808, p>0,05], tratamento com

96

EEPC [F(3,23)=10,47, p<0,01], interação L-arginina x EEPC [F(3,23)=17,71,

p<0,001] (figura 23A).

Da mesma forma, o pré-tratamento dos camundongos com L-NAME (inibidor

inespecífico das NOS), 7-NI (inibidor da NOSn), azul de metileno (inibidor da NOS e

da GCs) e sildenafil (inibidor da PDE-5), administrados 30 minutos antes do EEPC

(50 mg/kg, v.o.), reverteram de forma significativa o efeito tipo-antidepressivo do

EEPC. Pré-tratamento com L-NAME [F(3,33)=3,915, p>0,05], tratamento com EEPC

[F(3,33)=3,191, p<0,05], interação L-NAME x EEPC [F(3,33)=6,892, p<0,05] (figura

23B). Pré-tratamento com 7-NI [F(3,27)=5,089, p>0,05], tratamento com EEPC

[F(3,27)=4,626, p<0,05], interação 7-NI x EEPC [F(3,27)=5,089, p<0,05] (figura 23C).

Pré-tratamento com azul de metileno [F(3,27)=3,828, p>0.05], tratamento com EEPC

[F(3,27)=33,05, p<0,001], interação azul de metileno x EEPC [F(3,27)=6,093,

p<0,05] (figura 23D). Pré-tratamento com sildenafil [F(3,27)=3,567, p>0,05],

tratamento com EEPC [F(3,27)=16,06, p<0,001], interação sildenafil x EEPC

[F(3,27)=3,106, p>0,05] (figura 23E).

97

Figura 23. Influência dos tratamentos com L-arginina, L-NAME, 7-NI, azul de metileno e sildenafil sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC


50

100

150

200

A

**###

Salina L-arginina (750 mg/Kg, i.p)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


20

40

60

80

100

B

*

#

Salina L-NAME (10 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

C

*#

Salina 7-NI (25 mg/kg, i.p)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

200

D

***#

Salina Azul de metileno (20 mg/kg, i.p)Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


50

100

150

200

E

** *

Salina Sildenafil (5 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com L-arginina (750 mg/kg, i.p) (A), L-NAME (10 mg/kg, i.p) (B), 7-NI (25 mg/kg, i.p) (C), azul de metileno (20 mg/kg, i.p) (D) e sildenafil (5 mg/kg, i.p) (E)

administrados 30 minutos antes do EEPC (50 mg/kg, v.o) em animais submetidos ao TNF. Os resultados foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 representam diferenças quando comparado com o grupo controle tratado com veículo; e #p<0,05 e

###p<0,001 quando comparados com o grupo tratado com EEPC sozinho (ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni).

98

5.15 Avaliação do sistema GABAérgico sobre a atividade tipo-antidepressiva

do EEPC

5.15.1 Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do

EEPC em animais submetidos ao TNF

O pré-tratamento dos camundongos com bicuculina (antagonistas dos

receptores GABA-A) 30 minutos antes da administração do EEPC, reverteu de forma

significativa o efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Pré-tratamento com bicuculina


bicuculina x EEPC [F(3,31)=6,178, p<0,05] (figura 24A). Porém, foi observado que o

pré-tratamento dos camundongos com faclofeno (antagonista dos receptores GABA-

B) 30 minutos antes da administração do EEPC, não foi capaz de reverter o efeito

tipo-antidepressivo do EEPC. Pré-tratamento com faclofeno [F(3,32)=10,52, p>0,05],

tratamento com EEPC [F(3,32)=0,7861, p<0,05], interação faclofeno x EEPC

[F(3,32)=3,507, p>0,05] (figura 24B).

99

Figura 24. Influência da bicuculina e faclofeno no efeito tipo-antidepressivo do EEPC


20

40

60

80

100

A

#*

Salina Bicuculina (1 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)


20

40

60

80

100

*

B

*

Salina Faclofeno (1 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com bicuculina (1 mg/kg, i.p) (A) e faclofeno (1 mg/kg, i.p) (B), adnministrados 30 minutos antes do EEPC (50 mg/kg, v.o) sobre o efeito anti-imobilidade do

mesmo. Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10).*p<0,05 indicam diferenças quando comparado com o grupo controle tratado com veículo e #p<0,05 quando comparado com o grupo tratado com EEPC sozinho. (ANOVA de duas vias, seguida do teste de

Bonferroni).

5.16 Avaliação do sistema opióide sobre a sobre a atividade tipo-


5.16.1 Influência da naloxona e do naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do

EEPC através do TNF via receptores opióides

O pré-tratamento dos camundongos com naloxona (antagonista não seletivo

dos receptores opióides) e naltrindol (antagonista de receptores δ-opióide)

administrados 30 minutos antes do EEPC, não foi capaz de reverter o efeito tipo-

antidepressivo do extrato. (Pré-tratamento com naloxona [F(3,30)=1,634, p>0,05],

tratamento com EEPC [F(3,30)=14,83, p<0,05], interação naloxona x EEPC

100

[F(3,30)=0,7809, p>0,05] (figura 25A). Pré-tratamento com naltrindol [F(3,32)=0,094,

p>0,05], tratamento com EEPC [F(3,32)=52,18, p<0,001], interação naltrindol x

EEPC [F(3,32)=0,9873, p>0,05] (figura 25B).

Figura 25. Influência da naloxona e naltrindol no efeito tipo-antidepressivo do EEPC


50

100

150*

*

ASalina Naloxona (1 mg/kg, v.o.)

Tem

po d

e I

mobili

dade (

s)


50

100

150

B

******

Salina Naltrindol (3 mg/kg, i.p.)

Tem

po d

e im

obili

dade (

s)

Efeito do pré-tratamento dos camundongos com naloxona (1 mg/kg, i.p) (A) e naltrindol (3 mg/kg, i.p)

(B), administrado 30 minutos antes do EEPC (50 mg/kg, v.o) sobre o efeito anti-imobilidade no TNF. Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=8-10). (ANOVA de duas vias, seguida do teste de Bonferroni).

101

5.17 Modelos bioquímicos: Estresse Oxidativo

5.17.1 Avaliação da atividade sequestradora do radical livre (DPPH)

Na figura 26 foi avaliado o potencial antioxidante do EEPC através do ensaio

bioquímico da redução do radical DPPH. O EEPC (10 e 100 µg/ml) apresentou

atividade antioxidante, pela redução dos níveis do radical livre no meio reacional,

quando comparado com o grupo controle tratado com veículo, [F(7,15)=3,548,

p<0,05] e [F(7,15)=2,312, p<0,05], respectivamente. Esse efeito foi semelhante ao

produzido pelo ácido ascórbico utilizado como controle positivo [F(7,15)=8,355,

p<0,05].

Figura 26. Efeito antioxidante do EEPC, através da atividade sequestradora do radical livre DPPH

Veículo 50 0.1 1 10 1000

10

20

30

40

**

*

EEPC (g/ml)

Veículo Ácido ascórbicoEEPC

DP

PH

(M

)

Atividade sequestradora de radicais livres do EEPC (0.1, 1, 10 e 100 µg/ml). Os valores foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=3). *p<0,05 denotam diferenças estatísticas quando

comparados com o grupo veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.2 Quantificação da atividade da GSH

102

A atividade da glutationa em sua forma reduzida foi quantificada e está

demonstrada na figura 27. Observa-se que o EEPC produziu um aumento

significativo na atividade da enzima GSH [F(3,18)=33,06, p<0,01], quando

comparado com o grupo veículo

Figura 27. Efeito da administração do EEPC sobre os npiveis da GSH

Naive Veículo Fluoxetina EEPC0

10

20

30

40

**

GS

H

( g/m

g d

e tecid

o)

Os animais receberam por um período de 14 dias tratamentos com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=5). **p<0,01

quando comparados com o grupo veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.3 Quantificação da atividade da enzima SOD

Através dos resultados apresentados na figura 28 percebe-se que não houve

diferenças significativas estatísticas nos níveis da SOD entre os grupos tratados.

Sendo que o EEPC demonstrou uma leve diminuição da atividade da enzima SOD.

Figura 28. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima SOD

103

Naíve Veículo Fluoxetina EEPC0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5U

SO

D/

mg o

f pro

tein

Os animais receberam o tratamento com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=5). (ANOVA de uma via seguida do teste

de Bonferroni).

5.17.4 Avaliação da atividade da enzima CAT

Na figura 29 o grupo dos animais tratados com EEPC e os animais do grupo

naíve apresentaram uma diminuição nos níveis da atividade enzimática da enzima

CAT, quando comparado com grupo veículo [F(3,16)=2438, p<0,05] e

[F(3,16)=9108, p<0,05] e quando comparado com o grupo fluoxetina [F(3,16)=1159,

p<0,05] e [F(3,16)=4329, p<0,05], respectivamente.

104

Figura 29. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima CAT

Naíve Veículo Fluoxetina EEPC0

1

2

3

4

5#

#*

*

CA

T

(mm

ol/m

in/m

g p

rote

ína)

Os animais receberam o tratamento por um período de 14 dias com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p),

EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=5). *p<0,05 representa didefenças quando comparado com o grupo veículo e #p<0,05 quando comparado com o grupo fluoxetina (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.5 Quantificação da atividade da enzima GPx

Verificou-se na figura 30, que animais que receberam EEPC [F(3,13)=32,89,

p<0,01], fluoxetina [F(3,13)=371,3, p<0,01] e os animais naíve [F(3,13)=31,13,

p<0,01] apresentaram uma diminuição significativa na atividade da enzima GPx

quando comparado com o grupo controle tratado com veículo.

105

Figura 30. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da enzima GPx


10

20

30

40 ****

**G

PX

(um

ols

/mg p

rote

in/m

in)

Os animais receberam o tratamento por um período de 14 dias com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p),

EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=5). **p<0,01 indicam significâncias estatísticas quando comparado com o grupo veículo (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.6 Quantificação da atividade da enzima GST

Na figura 31 estão representados os resultados da atividade da enzima GST.

A atividade dessa enzima foi diminuída pelo EEPC quando comparado com o grupo

controle tratado com veículo [F(3,20)=2,491, p<0,05] e naíve [F(3,20)=1,479,

p<0,05].

106

Figura 31. Efeito da administração do EEPC sobre a enzima GST


5

10

15

20 *

#

GS

T (

nm

ols

/mg p

rote

in/m

in)

Os animais receberam o tratamento com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=5). *p<0,05 indica diferenças

estatísticas quando comparado com o grupo veículo e #p<0,05 quando comparado com o grupo naíve (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.7 Quantificação da atividade da LPO

Para avaliar os possíveis danos causados a membrana celular, ocasionado

pela peroxidação lipídica, utilizou-se a LPO para determinar a extensão dos danos

oxidativo causado na membrana. Na figura 32 os resultados demonstram que não

houve danos das membranas celulares cerebrais em nenhum dos grupos

experimentais

107

Figura 32. Efeito da administração do EEPC sobre a atividade da LPO


10

20

30

40LO

OH

(mm

ol/g d

e tecid

o)

Os animais receberam o tratamento com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=5). (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

5.17.8 Quantificação dos níveis da enzima MAO-A

Ainda com relação a determinação do mecanismo de ação da propriedade

tipo-antidepressiva do EEPC, foi analisado os efeitos dos tratamentos sobre a

atividade da enzima MAO-A. Na figura 33 é observado que o EEPC promoveu uma

diminuição da atividade da MAO-A [F(3,13)=1,342, p<0,01], quando comparado com

o grupo veículo.

108

Figura 33. Efeito da administração do EEPC sobre os níveis da enzima MAO-A

Naíve Veículo Fluoxetina EEPC0.0

0.5

1.0

1.5

2.0# **

Ativi

dade d

a M

AO

-A

(nm

ol/m

g d

e p

rote

ína)

Os animais receberam o tratamento com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média, seguido dos EPMs (N=5). **p<0,01 quando comparado com o grupo veículo; #p<0,05 quando comparado com o grupo naíve (ANOVA de uma via seguida do teste

de Bonferroni).

5.17.9 Quantificação dos níveis de NO

Na figura 34, os animais tratados com EEPC e a fluoxetina apresentaram uma

diminuição nos níveis de NO [F(3,14)=4,914, p<0,01] e [F(3,14)=1,466, p<0,01],

respectivamente, quando comparados com o grupo veículo. Da mesma forma

percebe-se que o grupo tratado com veículo quando comparado animais naive

tiveram um aumento nos níveis de NO [F(3,14)=1,299, p<0,05].

109

Figura 34. Efeito da administração do EEPC através dos níveis de NO

Naive Veículo Fluoxetina EEPC0

100

200

300

**

**N

OX

(g/g

tecid

o)

*

Os animais receberam o tratamento com veículo, fluoxetina (10 mg/kg, i.p), EEPC (50 mg/kg, v.o). Os valores foram expressos como média seguido dos EPMs (N=5). **p<0,01 representa diferenças

quando comparado com o grupo veículo e #P<0,05 quando comparado com o grupo naíve (ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni).

111

6. DISCUSSÃO

Pela grande biodiversidade mundial e, em particular a biodiversidade

brasileira, vários estudos buscam novas abordagens terapêuticas, a fim de validar as

propriedades farmacológicas das plantas medicinais no tratamento de várias

doenças que envolvem o SNC, principalmente a depressão (ZHANG et al., 2016,

BHANGALE; ACHARYA, 2016, PAHWA; GOEL, 2016, BAHI et al., 2014,

SULAKHIYA et al., 2016).

A depressão apresenta uma prevalência alta entre a população, sendo uma

das principais doenças incapacitantes do SNC (ROSENBAUM et al., 2016). Apesar

do amplo arsenal terapêutico disponível no mercado, não há um tratamento ideal

para o transtorno depressivo, e várias pesquisas utilizando produtos de origem

natural, sobretudo as plantas, com o propósito de obter um alvo farmacológico para

a terapêutica da doença têm sido realizadas (CHEN et al., 2016; GALDINO, et al.,

2015; XING et al., 2015).

Estudos anteriores conduzidos por Jurcevic (2015) demonstram que o EEPC

exibiu efeito tipo-antidepressivo no TNF. Considerando que espécies do gênero

Piper como, por exemplo, Piper methysticum (Kava-Kava) são conhecidas por

apresentarem efeitos no SNC, no presente estudo, foi realizado um screening

farmacológico para detectar outras propriedades psicoativas da planta além de

aprofundar a investigação sobre o mecanismo de ação da atividade antidepressiva.

Uma vez que os ensaios farmacológicos pré-clínicos referentes aos efeitos

psicoativos de substâncias envolvem comportamentos caracterizados por

movimentos, faz-se necessário a avaliação de possíveis efeitos da substância sobre

o sistema motor dos animais (BASSO et al., 2009). Desta forma, primeiramente

avaliou-se o efeito do EEPC sobre a atividade locomotora dos animais através do

TCA. O TCA é utilizado em vários protocolos experimentais, podendo ser

considerado um modelo de ansiedade, memória e deambulação sendo amplamente

utilizado para avaliar efeitos sedativos, tóxicos ou efeitos depressores e/ou

estimulantes de determinados compostos, dependendo dos parâmetros

comportamentais a serem avaliados. No caso específico da investigação de

possíveis efeitos sobre a atividade motora, os parâmetros mais usados são número

de cruzamentos (crossings), e o número de atividade exploratória (rearings) (TATEM

et al., 2014).

112

Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que o EEPC administrado

em diferentes doses, não promoveu alterações comportamentais com relação à

atividade exploratória (rearings) e no número de cruzamentos (crossings), quando

comparado com o grupo controle (veículo) o que sugere que nas doses estudadas o

extrato da planta não exerce efeitos sobre o controle motor dos animais. Resultados

semelhantes a este e, também contrários foram obtidos por Lopes e colaboradores

(2012) estudando respectivamente Piper amalago e Piper mikanianum, o que

demonstra que efeitos inespecíficos e motores podem ser promovidos por plantas

desse gênero dependendo provavelmente do tipo de extrato e/ou fitoconstituintes

presentes na planta.

A atividade tipo-anticonvulsivante é uma das propriedades psicoativas mais

encontradas no gênero Piper. Espécies como Piper tuberculatum, Piper guineense

L, Piper longum, Piper methysticum (L) já tem validação científica com relação a

essa propriedade (FELIPE et al., 2007; ABILA et al., 1993; ABDOLLAHI et al., 2013).

A piperina, um alcaloide presente no gênero Piper, apresentou atividade

anticonvulsivante em vários modelos farmacológicos de convulsão e epilepsia, tendo

seu mecanismo de ação relação direta com a via GABAérgica (CRUZ et al., 2013).

No presente estudo, o efeito tipo-anticonvulsivante do EEPC foi avaliado em

animais com crises convulsivas induzidas quimicamente por PTZ, um convulsivante

clássico, e pela estricnina, ambos amplamente utilizados em triagens pré-clínicas

(KANDRATAVICIUS et al., 2014). O PTZ exerce sua atividade convulsivante através

do bloqueio dos canais de cloreto associado aos receptores GABA-A, podendo ser

utilizado para a pesquisa em tipos específicos de crises convulsivas, como as

generalizadas, do tipo crise de ausência ou mioclônicas, bem como as crises tônico-

clônicas (OLIVEIRA et al., 2016; SMITH et al., 2007). A estricnina, por sua vez,

bloqueia a ação do neurotransmissor inibitório glicina de forma competitiva e

reversível, causando aumento da excitabilidade reflexa da medula

(KANDRATAVICIUS et al., 2014).

No presente estudo, nas doses utilizadas, não foi detectado no EEPC efeito

anticonvulsivante como era esperado, independente do tipo de tratamento utilizado

(agudo ou crônico) demonstrando que a espécie estudada não exibe efeito tipo-

anticonvulsivante. O fenobarbital utilizado no estudo como controle positivo inibiu

de forma efetiva as crises convulsivas induzidas pelo PTZ e não pela estricnina

(como esperado), foi um dos primeiros anticonvulsivantes a serem desenvolvidos, e

113

ainda hoje é um dos principais fármacos utilizado no tratamento da epilepsia. Seu

mecanismo de ação consiste em modular a ação pós-sináptica do GABA-A e

também pelo bloqueio do efeito pós-sináptico excitatório induzido pelo glutamato,

mediado pela ativação do receptor AMPA (MARANHÃO et al., 2011).

Com o intuito de verificar um possível efeito hipnótico da planta, utilizou-se o

modelo de sono induzido por barbitúrico. Os barbitúricos apresentam suas ações

farmacológicas através da interação com receptores GABA, ou seja, prolongam e

potencializam a ação do neurotransmissor GABA nos receptores GABA-A, os quais

estão presentes nas membranas neuronais do SNC (LOSCHER; ROGAWSKI,

2012). O modelo de sono induzido por barbitúricos é amplamente utilizado em

ensaios pré-clinicos (SIRISANGTRAGUL; SRIPANIDKULCHAI, 2013).

Quando administrado aos animais, o EEPC nas doses de 100 e 150 mg/kg

promoveu diminuição da latência para o sono induzido pelo pentobarbital, e aumento

no tempo total de sono dos animais (na dose de 150 mg/kg). Efeitos semelhantes

aos obtidos com o diazepam, um benzodiazepínico convencional amplamente

utilizado como sedativo e hipnótico (OLIVEIRA et al., 2008). Esses resultados

sugerem que o EEPC apresenta atividade tipo-hipnótica, efeito este, encontrado em

outras espécies do gênero Piper, como por exemplo na Piper guineense

(OYEMITAN et al., 2016), Piper capense L. (PEDERSEN et al., 2009) e Piper

methysticum (WHEATLEY, 2001).

Substâncias psicoativas com características hipnóticas e/ou anticonvulsivante

podem exercer efeitos deletérios sobre a memória. Os benzodiazepínicos, por

exemplo, utilizado na terapêutica da epilepsia, ansiedade e insônia exibem efeitos

sobre a memória, causando a chamada amnésia anterógrada (LEÃO et al., 2016).

Desta forma, procurou-se no presente estudo, avaliar os efeitos do EEPC sobre a

memória dos animais. Para tanto foi utilizado, o MEI. Nesse modelo o processo de

aprendizagem consiste de uma sessão de treino e outra de teste. Por ser um teste

que produz aprendizado a partir de uma única tentativa, é um modelo ideal de

estudo para avaliar processos envolvidos no aprendizado e na memória

(IZQUIERDO; MEDINA, 1997, WALLACE et al., 2015). Os resultados obtidos no

presente estudo demonstraram que o EEPC, não produziu efeitos sobre a memória

dos animais avaliados no MEI, ou seja, seu uso não altera o processo de

consolidação de memória.

114

O efeito ansiolítico do EEPC também foi avaliado. Para este objetivo optou-se

por um dos modelos de ansiedade mais utilizados em ensaios pré-clínicos, o LCE

(BOUWKNECHT, 2015). Esse modelo foi desenvolvido por Handley e Mithani

(1984), porém apenas no ano seguinte ele foi validado comportamental, fisiológica e

farmacologicamente por Pellow e colaboradores (1985). E, tornou-se nos últimos

anos um dos modelos mais confiáveis e valiosos para estudos da neurobiologia da

ansiedade e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas com atividades

ansiolíticas (HALLER; ALICKLI, 2012).

Ensaios pré-clínicos utilizando o LCE para investigar e/ou validar os efeitos

ansiolíticos de plantas são constantes, inclusive aquelas que pertencem ao gênero

Piper como reportado na literatura para Piper amalago (MULLALLY et al., 2016),

Piper nigrum L. (HRITCU et al., 2015), Piper guineense (OYEMITAN et al., 2015),

Piper tuberculatum (FELIPE et al., 2007) e a própria Piper methysticun (GARRETT

et al., 2003). Neste estudo, porém o efeito tipo-ansiolítico tão característico no

gênero não foi evidenciado.

O segundo objetivo deste estudo foi de aprofundar a investigação sobre o

efeito tipo-antidepressivo já detectado por Jurcevic (2015). Também é reportado na

literatura que há várias espécies de Piper com essa propriedade (HRITCU et al.,

2015; XIE et al., 2011). Optou-se primeiramente por repetir os experimentos

utilizando um modelo animal de depressão, o TNF. O TNF foi primeiramente descrito

por Porsolt e colaboradores (1977) o qual se baseia no paradigma do ―desespero

comportamental‖. Esse teste é um dos mais utilizados nos laboratórios de pesquisa,

quando busca avaliar a atividade antidepressiva de substâncias (CHEN et al., 2016;

WANG et al., 2016).

No TNF quando se utiliza antidepressivos clássicos, os animais apresentam

um tempo de imobilidade menor (GALDINO et al., 2015, LI et al., 2016). No presente

estudo o tratamento dos animais com EEPC promoveu diminuição no tempo de

imobilidade dos animais nas três doses testadas (50, 100, 150 mg/kg), sugerindo um

efeito tipo-antidepressivo no teste já em dose aguda, confirmando os achados de

Jurcevic (2015) .

Para confirmar o efeito tipo-antidepressivo da planta em estudo, outro modelo

animal de depressão foi utilizado, o TSC, o qual tem sido amplamente utilizado no

screening de substâncias com efeitos tipo-antidepressivo. No ano de 1985, Steru e

colaboradores, desenvolveram o TSC, o qual foi baseado no TNF. Fármacos

115

antidepressivos clássicos quando testados no TSC causam diminuição no tempo de

imobilidade dos animais (ADONGO et al., 2015). Já é reportado na literatura que

algumas espécies de Piper também apresentam efeito tipo-antidepressivo no TSC

(MAO et al., 2011; LEE et al., 2008).

Os resultados relacionados aos efeitos tipo-antidepressivo do EEPC também

foram confirmados quando os animais tratados com o extrato foram submetidos ao

TSC. Sendo que nas concentrações de 50 e 150 mg/kg o EEPC promoveu

diminuição do tempo de imobilidade dos animais, confirmando que a planta em

estudo exerce efeito tipo-antidepressivo em estudos pré-clínicos.

Na terapêutica da depressão, mesmo os medicamentos exercendo seus

mecanismos distintos no que tange ao aumento dos níveis das monoaminas no

SNC, já na primeira dose, os efeitos farmacológicos dos mesmos não ocorrem de

maneira imediata, levam cerca de 3 a 4 semanas para produzirem melhora dos

sintomas (SARRIS et al., 2012). Aliás, esse é um dos problemas relacionados com o

seu uso. Um efeito imediato seria vantajoso para os medicamentos antidepressivos.

No presente estudo, o EEPC mostrou efeito tipo-antidepressivo em dose aguda e,

também em dose subcrônica, no qual os animais foram tratados por 14 dias com o

extrato. No 7º e no 14º dia foi realizado o TNF, e verificou-se que o extrato exerce

suas atividades antidepressivas nesses dois intervalos de tempo. Geralmente, a

avaliação dos efeitos de uma substância tipo-antidepressiva quando administrado

em doses subcrônicas é uma constante em qualquer estudo com o intuito de validar

e/ou avaliar a propriedade antidepressiva da mesma (MANANN et al., 2015, CHEN

et al., 2009).

Outro parâmetro importante na investigação de qualquer agente psicotrópico

ou não, é determinar seu tempo de ação farmacológica. Ou seja, a duração em

horas de seu efeito. No presente estudo foi verificado que o EEPC exerce seu efeito

tipo-antidepressivo, por um período de até 4 horas após a sua administração, tempo

esse semelhante com alguns fármacos antidepressivos como a nefazodona e a

trazodona, ambos antagonistas dos receptores 5-HT2. Quanto maior o Time-course

do fármaco, menor a probabilidade de várias administrações diárias e maior

vantagem para o paciente. Entretanto, o Hipericum perforatum, fitoterápico utilizado

clinicamente tem indicação de 3 tomadas diárias e, é um fármaco com boa

tolerabilidade em pacientes depressivos leves (SARRIS et al., 2012).

116

Com relação a princípios ativos responsáveis pelo efeito tipo-antidepressivo

do EEPC, Gon e Shaeffer (2016) isolaram e identificaram uma mistura das lignanas

α e β-cubebina e um sesquiterpeno o trans-dihidroagarofurano, ambos avaliados no

TNF. As lignanas são um importante grupo de metabólitos secundários presentes

em uma grande variedade de plantas, que exercem potencial efeito terapêutico

(SALEEM et al., 2005). Elas podem possuir atividade antitumoral (LUO et al., 2014),

reduzir os riscos de doenças cardiovasculares (PETERSON et al., 2010) e também

exibem atividade tipo-antidepressiva (LUO et al., 2015). Dentre as lignanas

presentes no extrato da Piper cernuum, a αβ-cubebina se destaca

(aproximadamente 8%) estando em maior concentração. A αβ-cubebina quando

avaliada no TNF, promoveu diminuição no tempo de imobilidade dos animais,

sugerindo apresentar um efeito tipo-antidepressivo.

Park et al., (2015) demonstrou que a αβ-cubebina reduziu a produção de

glutamato induzida pelas EROS após o influxo de cálcio, dessa forma impedindo a

morte celular por apoptose. Além disso, induz a expressão de elementos

relacionados com a resposta antioxidante, dessa maneira se concluiu que a αβ-

cubebina confere neuroproteção contra lesões oxidativas induzidas pelo glutamato.

Apesar de apresentar atividades farmacológicas importantes, os efeitos relacionados

às doenças do SNC não foram muito exploradas, tornando relevante avaliar tais

efeitos.

Resultado semelhante foi obtido com o trans-dihidroagarofurano, o principal

sesquiterpeno presente nas folhas (aproximadamente 25%), o qual produziu

diminuição no tempo de imobilidade nos animais, apresentando efeito tipo-

antidepressivo. Os sesquiterpenos vêm sendo amplamente estudados, e já são

descritas atividades psicotrópicas destacáveis dentre elas a antidepressiva (DATTA

et al., 2004; GONÇALVES et al., 2012). Em um estudo realizado por Oyemitan et al.,

(2015) foi identificado no óleo essencial da Piper guineense os sesquiterpenos como

os componentes majoritários presentes na planta, ao avaliar seus efeitos a nível de

SNC, a planta promoveu atividade antidepressiva, ansiolítica, sedativa e

anticonvulsivante. Portanto, os resultados em conjunto apontam que os dois

compostos presentes na Piper cernuum a αβ-cubebina e o trans-dihidroagarofurano

são os possíveis responsáveis pelo efeito tipo-antidepressivo do EEPC.

117

As doses utilizadas nos experimentos da αβ-cubebina (4 mg/kg) e o trans-

dihidroagarofurano (12,5 mg/kg), estão de acordo com a quantidade presente no

extrato das folhas na dose utilizada nos experimentos (50 mg/kg).

Após verificar que o EEPC exerce o efeito tipo-antidepressivo, tornou-se

relevante avaliar por quais mecanismos farmacodinâmicos ocorreria esse efeito.

Primeiramente foi avaliado o envolvimento da via monoaminérgica no mecanismo de

ação da propriedade antidepressiva, uma vez que a teoria monoaminérgica da

depressão ainda é aceita e comprovada pelos antidepressivos que alteram os níveis

de monoaminas no SNC (MEYER, 2012; SHIROMA et al., 2010).

Inicialmente foi utilizado a reserpina um fármaco anti-hipertensivo,

responsável pela depleção das reservas de monoaminas. Tal fármaco hoje em dia é

obsoleto no tratamento da hipertensão arterial sistêmica, pois percebeu-se que

pacientes que o utilizavam de forma contínua começavam a apresentar sintomas

depressivos (GARNER; BOLES, 2011).

No presente estudo foi realizada a administração da reserpina por 4 dias

consecutivos, com intuito de produzir a depleção das monoaminas no SNC dos

animais os quais foram tratados com o EEPC. Foi observado que, a reserpina foi

capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, sugerindo que os efeitos do

EEPC ocorrem em parte pelo envolvimento com o sistema monoaminérgico, e o

EEPC pode promover aumento das monoaminas.

Desde o surgimento da teoria monoaminérgica, o sistema serotonérgico é

considerado um dos principais alvos para o tratamento da depressão. Fármacos

como os ISRS são os mais prescritos pelos médicos, como por exemplo, a

fluoxetina, citalopram, escitalopram, paroxetina, fluvoxamina e a sertralina, todos

promovem aumento dos níveis de 5-HT no cérebro dos pacientes (ZHOU et al.,

2009).

O envolvimento do EEPC com o sistema serotonérgico também foi avaliado.

Num primeiro momento os camundongos receberam por 4 dias consecutivos o

PCPA, um inibidor da triptofano hidroxilase, enzima responsável pela biossíntese da

5-HT, induzindo a depleção dos níveis serotonérgicos no cérebro, acredita-se que

ocorra uma diminuição de 93% dos níveis corticais de 5-HT (BINEY et al., 2016),

porém a utilização do PCPA isolado não é capaz de causar alteração no tempo de

imobilidade dos animais no TNF (MAO et al., 2011). Pelos resultados obtidos, o

PCPA não reverteu o efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Em contrapartida MAO et

118

al., (2011) avaliou a atividade tipo-antidepressiva da piperina o principal alcaloide

presente na Piper nigrum Linn. e Piper longum Linn., as quais tiveram seus efeitos

antidepressivos revertidos pelo pré-tratamento com PCPA, acreditando que a

piperina necessita do sistema serotonérgico intacto para desempenhar suas

atividades antidepressivas.

Possíveis distúrbios na fisiologia de receptores serotonérgicos também estão

relacionados com os processos depressivos (LIN et al., 2016). Portanto, é comum

investigar se compostos com propriedade tipo–antidepressiva podem estar

modulando esses receptores. O receptor 5-HT1A exerce importante papel

regulatório no SNC, é responsável por modular a atividade dos neurônios

dopaminérgicos na área tegmental ventral, além de regular a liberação de dopamina

na região mesocortical (DIAZ-MATAIX et al., 2005) e alguns estudos demonstram

que esse receptor exerce atividade modulatória nos distúrbios de humor e de

ansiedade (JENSEN et al., 2016). O NAN-190 é um antagonista dos receptores 5-

HT1A, o qual foi utilizado neste estudo para avaliar o envolvimento do EEPC sobre

essa via. Os resultados demonstraram que o pré-tratamento dos animais com NAN-

190 reverteu o efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Os receptores 5-HT1A podem

estar localizados tanto em neurônios pré, quanto pós-sinápticos, dependendo da

região cerebral onde a via serotonérgica esteja presente. Os neurônios 5-HT1A pré-

sinápticos, por exemplo, modulam a liberação da 5-HT, inibindo-a. Agonistas 5-HT1A

como a buspirona, por exemplo, dessensibilizam esse auto-receptor com o

tratamento contínuo, e a inibição da liberação de 5-HT passa a não ocorrer,

explicando seu potencial ansiolítico e antidepressivo. Na farmacologia, os ISRS são

conhecidos não só por inibir a recaptação da 5-HT como também atuam como

agonistas indiretos dos receptores pós-sináptico 5-HT1A (DAVID; GARDIER, 2016).

Por outro lado, estudos recentes demonstram que antagonizando os receptores 5-

HT1A, pode-se diminuir sintomas depressivos e distúrbios de ansiedade (VICENTE;

ZANGROSSI, 2014).

O receptor 5-HT3 é um receptor pós-sináptico que está associado com a

regulação de vários outros sistemas neurotransmissores principalmente no tronco

cerebral (RAJKUMAR; MAHESH, 2010). Por conseguinte, o antagonismo nos

receptores 5-HT3 aumenta a liberação de monoaminas, o que é um mecanismo

importante para o tratamento da depressão. Os agentes que atuam como

antagonistas 5-HT3 são mirtazapina, a clozapina e o novo antidepressivo, a

119

vortioxetina (KOHLER et al., 2016). Neste estudo a ondansetrona (antagonista dos

receptores 5-HT3), administrada antes do EEPC, foi capaz de reverter o seu efeito

tipo-antidepressivo, sugerindo a participação desse receptor no mecanismo de ação

do EEPC. Também é reportado na literatura que os antagonistas dos receptores 5-

HT3 usados isoladamente podem ser uma possível alternativa para o

desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o tratamento dos distúrbios

depressivos (KURHE; MAHESH, 2015), ou associados com ISRS, no caso de

pacientes que não apresentem melhora no quadro depressivo com ISRS usados

isoladamente (SUMAYA et al., 2016).

Os receptores 5-HT2A são de grande importância para o sistema motor.

Todos os antipsicóticos de segunda geração bloqueiam o receptor 5-HT2A no

sistema nigroestriatal, onde a liberação de DA está aumentada, reduzindo a

probabilidade de sintomas motores extrapiramidais (SHIMIZU et al., 2013).

Receptores 5-HT2A também parecem desempenhar um papel importante no sistema

límbico, onde eles apresentam relevância para o tratamento da depressão. Alguns

antidepressivos, tais como a trazodona, nefazodona e mirtazapina são antagonistas

do receptor 5-HT2A. Os receptores 5-HT2A modulam as ações da 5-HT em vários

processos fisiológicos (AZNAR; KLEIN, 2013), estando envolvido nos processos

depressivos, e sendo alvo para a ação de vários fármacos antidepressivos

(ARTIGAS, 2013; DESMYTER et al., 2011).

O bloqueio do receptor 5-HT2A também resulta numa melhora da qualidade

do sono, uma vez que prolonga a duração do sono de ondas lentas (LANDOLT et

al., 1999). Para investigar uma possível participação do receptor 5-HT2A no efeito

tipo-antidepressivo do EEPC a ketanserina foi o fármaco de escolha, uma vez que

atua como antagonista dos receptores serotonérgicos 5-HT2A. Entretanto, a

ketanserina não foi capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do EEPC,

sugerindo que a planta em estudo não exerce seu efeito tipo-antidepressivo por

intermédio desse receptor em especial.

O sistema noradrenérgico vem sendo amplamente explorado em pesquisas

relacionadas com os processos depressivos, vários estudos descrevem que a NA

está diretamente ligada à regulação do humor e respostas a estímulos estressores.

Alguns achados científicos aumentam a relevância da NA nos distúrbios de humor,

reportando que há uma diminuição nos níveis noradrenérgicos na fenda sináptica de

120

pacientes depressivos, e a utilização de fármacos antidepressivos são capazes de

reestabelecer seus níveis (TAYLOR et al., 2005; HAMON; BLIER, 2013).

Nesse estudo avaliou-se o envolvimento dos receptores α1-adrenérgico e α2-

adrenérgico no efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Alguns achados científicos

descrevem que esses receptores quando presentes na região do córtex pré-frontal e

frontal, estão intimamente associados com os processos depressivos (HAMON;

BLIER, 2013). Como antagonista dos receptores α1-adrenérgico utilizou-se o

prazosin, o qual foi capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do extrato. No

entanto, o pré-tratamento dos animais com ioimbina, um antagonista dos receptores

α2-adrenérgico não foi capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do EEPC. Os

resultados sugerem então que a via noradrenérgica está envolvida em parte com o

efeito tipo-antidepressivo do EEPC, através dos receptores α1.

Assim como a 5-HT e a NA, a DA exibe um papel fisiológico muito importante

fazendo com que esse neurotransmissor seja extensivamente estudado. A DA está

envolvida com diferentes funções cerebrais, como no controle dos processos

motores, afeto, cognição e humor. Distúrbios na neurotransmissão da DA parecem

estar relacionados com processos depressivos (GRACE, 2016). Os sintomas

depressivos mais relacionados com a DA é a anedonia e a perda de motivação, os

quais envolvem a redução da sinalização dopaminérgica, principalmente na via

dopaminérgica mesolímbica (PANDIT et al., 2016).

Para avaliar o envolvimento da via dopaminérgica no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC, os animais foram pré-tratados primeiramente com

haloperidol (antagonista não seletivo dos receptores dopaminérgicos). Os resultados

demonstraram que o haloperidol antagonizou o efeito tipo-antidepressivo do EEPC.

Para verificar quais receptores dopaminérgicos estariam envolvidos nesse efeito, os

animais foram pré-tratados com o SCH23390 e o pimozide antagonistas dos

receptores D1 e D2, respectivamente. Os dois tratamentos reverteram o efeito tipo-

antidepressivo do EEPC, sugerindo que o mesmo pode ser exercido através da via

dopaminérgica.

O glutamato, atuando mais especificamente via receptor NMDA, tem papel de

destaque em atividades do SNC, atuando em transmissões sinápticas excitatórias,

plasticidade sináptica e excitotoxicidade. Está envolvido nos processos de memória,

além de desempenhar um importante papel em determinadas desordens

121

neurológicas, como na epilepsia, doença de Alzheimer e na depressão (CULL-

CANDY et al., 2001; PYTKA et al., 2016).

A quetamina é um antagonista não competitivo dos receptores NMDA, e

alguns estudos demostraram em modelos animais que essa substância apresenta

atividades tipo-antidepressiva tanto em administração aguda (PHAM et al., 2016)

como em tratamentos crônicos (GARCIA et al., 2009). Na clínica, seu uso é

discutível e não há recomendações da utilização da quetamina para esse fim, pelo

fato de apresentar vários efeitos colaterais e ser considerada uma droga de abuso

(SHIN et al., 2014). Porém, tem sido investigada a possibilidade de o composto

aumentar os efeitos antidepressivos de alguns fármacos tradicionais. Reus e

colaboradores (2011) demonstraram em estudos pré-clinicos que a coadministração

de quetamina com imipramina produzia aumento da ação antidepressiva da

imipramina.

Nesse estudo, foi avaliado um possível sinergismo entre o EEPC e a

quetamina, sendo demonstrado que houve uma potencialização do efeito tipo-

antidepressivo do extrato. No entanto, quando administrado o NMDA (agonista

glutamatérgico) nos animais, o mesmo não foi capaz de reverter o efeito tipo-

antidepressivo do extrato. Os resultados nos levam a aferir que provavelmente o

EEPC apresente compostos que possam atuar como antagonista específico do

receptor NMDA ou atuar através de outros receptores glutamatérgicos específicos.

A via L-arginina-NO-GMPc vem sendo muito estudada nos transtornos

depressivos (OSTADHADI et al., 2016; PESARICO et al., 2016). Como já reportado

anteriormente o NO está envolvido na fisiopatologia de diversas desordens

neurológicas dentre elas a depressão (OSTADHADI et al., 2016). Na depressão

maior, a paroxetina (um ISRS) quando utilizado por pacientes depressivos,

apresenta a propriedade de inibir a NOS, demonstrando que não só a diminuição

das monoaminas, mas que níveis elevados de NO podem estar envolvidos na

etiologia dessa patologia (DHIR; KULKARNI, 2011).

Para verificar se o mecanismo de ação da propriedade tipo-antidepressiva do

EEPC pudesse envolver a via L-arginina-NO-GMPc, nesse estudo os animais foram

primeiramente tratados com a L-arginina (precursor do NO) antes de receberem o

EEPC. Tem sido reportado na literatura que antidepressivos tradicionais como a

imipramina, venlafaxina e a bupropiona tem sua atividade tipo-antidepressiva

revertida pelo pré-tratamento com a L-arginina (DHIR; KULKARNI, 2007), assim

122

como a paroxetina (ISRS) que exerce também sua atividade antidepressiva por

diminuir os níveis de NO (SCAPAGNINI et al., 2012).

Os níveis de NO no SNC parecem depender da quantidade de L-arginina

disponíveis (DHIR; KULKARNI, 2011). Foi observado experimentalmente que em

doses mais baixas (100 mg/kg) exerce um efeito tipo-antidepressivo no TNF, porém

aumentando a dose (1000 mg/kg) ocasiona aumento no tempo de imobilidade no

TNF, sugerindo desempenhar um estado tipo-depressivo nos animais (DHIR;

KULKARNI, 2011). Nesse estudo, também foi observado que o pré-tratamento dos

animais com a L-arginina reverteu o efeito tipo-antidepressivo do EEPC no TNF,

sugerindo que o mesmo possa de alguma forma inibir a produção de NO.

Os inibidores de NOS são conhecidos por aumentar níveis extracelulares de

5-HT e DA no hipocampo, uma das principais áreas do cérebro envolvidas na

fisiopatologia da depressão maior (DHIR; KULKARNI, 2011). O pré-tratamento com

o L-NAME (inibidor inespecífico da NOS) assim como no estudo realizado por

Khulbe et al., (2013) não promoveu alteração no tempo de imobilidade dos animais

quando comparado com o veículo, mas foi capaz de reverter o efeito tipo-

antidepressivo do EEPC nos animais corroborando com a hipótese de que o EEPC

pode estar atuando inibindo a produção de NO.

Além disso, também foi avaliado através de modelos ex vivo o envolvimento

do EEPC sobre os níveis de NO, o qual já foi reportado estar aumentado em

indivíduos depressivos. Quando aumentado seus níveis no SNC, o NO participa de

ações neuroinflamatórias, apresenta características neurotóxicas, além de estar

diretamente envolvido no humor. Outro processo que pode ocorrer com o aumento

do NO, é a produção de EROS. Já é reportado na literatura que níveis mais baixos

de NO desempenham funções neuroprotetoras (KUDLOW et al., 2016). Nesse

estudo o EEPC diminuiu os níveis de NO, reforçando a idéia de que o potencial

efeito tipo-antidepressivo do extrato pode ser em partes mediado por essa via.

O 7-NI é um inibidor preferencial da nNOS que demonstra propriedades

antidepressivas em modelos animais assim como facilita a neurogênese e

neuroplasticidade hipocampais (JOCA; GUIMARÃES, 2006). Quando utilizado doses

sub-ativas de 7-NI e azul de metileno, os mesmos são capazes de aumentar a

atividade tipo-antidepressiva da bupropiona, venlafaxina, escitalopram e duloxetina

no TNF, e quando usados isoladamente ambos apresentam efeitos tipo-

antidepressivos no TNF (KUDLOW et al., 2016). Porém, há estudos que divergem

123

desses achados, apontando que não ocorrem diferenças no tempo de imobilidade

entre o tratamento com 7-NI e o tratamento com o veículo (OSTADHADI et al.,

2016). No presente estudo, o pré-tratamento dos animais com 7-NI foi capaz de

antagonizar o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, o que reforça novamente a

hipótese do envolvimento da via oxidonitrergica no efeito tipo-antidepressivo do

EEPC. Estudos pré-clínicos sugerem que a expressão da nNOS permanece

aumentada na região límbica de pacientes depressivos e em modelos de estresse

de animais (ZHANG et al., 2014). Sugerindo, portanto, que inibidores da nNOS

tornam-se potencial estratégia para o tratamento dos transtornos depressivos

Alguns estudos apontam que níveis excessivos de cGMP induzem a um

estado depressivo e, reduzindo seus níveis pode-se produzir ações semelhantes a

fármacos antidepressivos (DHIR; KULKARNI, 2011). Porém, Já foi demonstrado

também que o sildenafil (inibidor específico da PDE-5), apresenta atividade tipo-

antidepressiva, contrariando os achados acima, uma vez que teríamos aumento do

tempo da atividade do cGMP. Alguns autores acreditam que a ação antidepressiva

do sildenafil se deve pelo bloqueio dos receptores muscarínicos M3 e não devido a

inibição da PDE-5 (BRINK et al., 2008). No presente estudo ao avaliarmos o

envolvimento da PDE-5 sobre o efeito tipo-antidepressivo do EEPC, foi verificado

que o sildenafil foi capaz de reverter o efeito tipo-antidepressivo do extrato. Esse

resultado assemelha-se aos obtidos com antidepressivos convencionais como a

bupropiona e a venlafaxina os quais tiveram seu efeito tipo-antidepressivo

antagonizados pelo sildenafil (DHIR; KULKARNI, 2011, apontando que a inibição do

tempo de atividade do cGMP pode ser um alvo promissor na terapêutica da

depressão

O envolvimento dos sistemas GABAérgicos e opióide nos distúrbios

depressivos é pouco explorado se formos comparar com os demais sistemas de

neurotransmissão. Entretanto, a neurotransmissão GABAérgica ocorre em

interneurônios, que modulam a neurotransmissão local de diversos sistemas,

incluindo noradrenérgicos, dopaminérgicos e serotoninérgicos. Há evidências que

sugerem que os pacientes com depressão maior exibem uma diminuição dos níveis

de GABA no SNC, o que também é confirmado por dados recentes de ressonância

magnética de espectroscopia. Os resultados destas pesquisas sugerem que a

diminuição da neurotransmissão inibitória mediada pelo GABA está envolvida na

patogênese da depressão maior (PEHRSON et al., 2015). Por outro lado, há

124

trabalhos que reportam que antagonistas dos receptores GABA-A causam melhora

nos sintomas depressivos, e os agonistas aumentam os sintomas depressivos

(KOSARI-NASABI, 2013). Desta forma, há uma necessidade maior de se estudar

essa via e seu real papel nos transtornos depressivos.

Para avaliarmos o envolvimento da via GABAérgica no efeito tipo-

antidepressivo do EEPC utilizou-se como antagonista dos receptores GABA-A a

bicuculina, e dos receptores GABA-B, o faclofeno. Os resultados demonstram que

apenas o pré-tratamento dos animais com bicuculina, foi capaz de reverter o efeito

tipo-antidepressivo do EEPC, sugerindo o envolvimento da via GABAérgica em seu

mecanismo de ação, via receptores GABA-A.

Vários estudos vêm explorando a via opióide como possível mecanismo de

ação de compostos com atividades antidepressivas (YASAR et al., 2013). Tem sido

reportado na literatura que ISRS, tricíclicos e IMAOs apresentam certa afinidade

para os receptores opióides (AAN HET ROT et al., 2009). Dados recentes sugerem o

envolvimento dos receptores opióides (µ/mu, δ/delta e κ/kappa) na regulação dos

estados de humor em áreas do sistema límbico (LUTZ; KIEFFER, 2013). Esses

receptores são do tipo metabotrópicos acoplados a diferentes sistemas efetores

intracelulares e são difundidos na área tegmental ventral, núcleo acumbens e o

córtex pré-frontal. Os receptores opióides estão envolvidos nos processos de

recompensa e respostas emocionais, tornando-se alvos diferentes de ação de

fármacos (HEGADOREN et al., 2009). O receptor delta especificamente está

localizado em regiões cerebrais que estão envolvidas com a regulação do humor,

medo e ansiedade (KNOLL et al., 2011).

Neste estudo em particular, utilizou-se a naloxona (antagonista não seletivo

dos receptores opióides) e naltrindol antagonista dos receptores delta para avaliar o

possível envolvimento do EEPC. O pré-tratamento com ambos os antagonistas, não

reverteram o efeito tipo-antidepressivo do extrato, sugerindo que a via opióide não

está associada a tal efeito.

Após verificarmos que o EEPC apresenta atividades centrais importantes, foi

avaliado através de modelos bioquímicos in vitro, a atividade antioxidade do EEPC.

Um dos métodos tradicionais usualmente utilizados para a investigação das

propriedades antioxidantes de substâncias é o ensaio de sequestro do radical DPPH

(BORGES, 2011). Normalmente substâncias antioxidantes como o ácido ascórbico

(ZHOU et al., 2016) e o β-caroteno (GHASEMZADEH et al., 2016) tendem a

125

sequestrar os radicais livres. No presente estudo resultados obtidos nesse ensaio,

demonstraram um potencial efeito antioxidante do EEPC. Corroborando com dados

da literatura de que algumas espécies de Piper, como a Piper miniatum e a Piper

longum, apresentaram resultados semelhantes aos do EEPC, quando avaliado a

atividade antioxidante no ensaio do DPPH (KRISHNA et al., 2015; SALLEH et al.,

2015).

Após perceber que o EEPC apresenta atividade antioxidante tornou-se

relevante avaliar seus efeitos sobre as enzimas antioxidantes cerebrais em modelos

ex vivo. Tem sido demonstrado que o estresse oxidativo leva a um aumento das

EROS, e esse aumento causa efeitos deletérios sobre vários componentes celulares

lipídicos, proteicos e ao DNA, resultando em danos celulares culminando com a

neurodegeneração, sobretudo no hipocampo (SULAKHIYA et al., 2015). O

envolvimento das EROS na patogênese da depressão está principalmente

relacionado com as alterações causadas nas estruturas neuronais (UCHINARA et

al., 2016).

Normalmente as defesas antioxidantes do organismo começam com uma

cascata enzimática, porém há também componentes não enzimáticos que

desempenham essas funções antioxidantes, que é o caso da GSH, a qual apresenta

característica importante evitando a formação de radicais livres, sequestrando-os ou

degradando-os, evitando o dano celular (SERKEDJIEVA, 2011). No presente

estudo, o efeito do EEPC sobre os níveis de GSH também foi avaliado. Os

resultados demonstram que o EEPC promoveu o aumento nos níveis de GSH no

cérebro dos camundongos. É reportado que a GSH é um marcador da saúde celular

e sua diminuição é indicativo de lesão oxidante (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).

Uma das principais alterações causadas pelo aumento nos níveis das EROS

é a lipoperoxidação, afetando a viabilidade celular e causando danos a membrana

celular (KIM et al., 2016). No presente estudo, em todos os grupos estudados (naíve,

veículo, fluoxetina e EEPC) não foi observado alterações nas membranas celulares.

O que pode ser explicado pelo tipo de estresse produzido nos animais através do

TNF. Pode-se sugerir que o mesmo não foi suficiente para provocar uma

peroxidação lipídica na membrana celular dos animais. Em modelos de estresse

crônico a peroxidação lipídica pode ser melhor observada (KUBERA et al., 2011)

O organismo dos mamíferos apresentam várias enzimas antioxidantes que

são responsáveis em proteger as células das EROS produzidas por algum tipo de

126

estresse. As principais enzimas antioxidantes endógenas são a SOD, CAT e GPx, as

quais estão presentes em todos os tecidos, estando em maiores concentrações no

fígado. O mecanismo básico de defesa antioxidante dessas enzimas consiste da

conversão do ânion superóxido em O2 e H2O2 pela enzima SOD, sendo que o ânion

superóxido é a principal espécie reativa formada. Posteriormente a CAT (baixas

concentrações no cérebro) e a GPx participam da decomposição do H2O2 produzido

pela SOD em O2 e H2O eliminando os efeitos tóxicos (LEMAIRE et al., 1994; RAMA;

MANJABHAT, 2014). Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que o EEPC

não alterou os níveis da SOD, acreditando que não ocorreu a produção do ânion

superóxido para a sua atividade, em decorrência disso promoveu a diminuição da

atividade das enzimas CAT e GPx. Pode-se sugerir que a diminuição da atividade

enzimática da CAT e GPx se deve pelo fato de não ocorrer a dismutação do ânion

superóxido em H2O2 pela SOD. Não havendo a produção de H2O2

consequentemente não ocorre a atividade da CAT e da GPx.

O efeito do EEPC sobre a atividade da GST também foi avaliado. Os

resultados demonstraram que o EEPC promoveu diminuição na atividade da GST.

Resultados semelhantes foram demonstrados pela Piper betle, apresentando

diminuição da atividade dessa enzima (PRABU et al., 2012). A GST faz parte de um

conjunto de enzimas detoxificantes de fase II, que participam do metabolismo de

xenobióticos, como carcinógenos ambientais, EROS e agentes terapêuticos,

protegendo as células de metabólitos endógenos e exôgenos através da conjugação

da glutationa reduzida (HOLLEY et al., 2007).

Alguns estudos relacionados com a piperina, um alcaloide extraído das

espécies Pipers demonstraram que o mesmo diminuiu a atividade da enzima MAO-A

(AL-BAGHDADI et al., 2012; LEE et al., 2005; LEE et al., 2008). Embora não

saibamos até o momento que na espécie aqui estudada, sobretudo no EEPC a

piperina esteja presente, corroborando com esses achados, o EEPC diminuiu de

forma eficaz a atividade dessa enzima. Tal efeito foi relevante uma vez que a enzima

MAO-A está amplamente envolvida na fisiopatologia dos processos depressivos, e

fármacos que atuam diminuindo a atividade dessa enzima, são considerados

antidepressivos com eficácia comprovada no tratamento (LIAO et al., 2013).

127

7. CONCLUSÃO

Os resultados em conjunto nos permitem concluir que:

Através do screening farmacológico o EEPC apresentou efeitos psicotrópicos

do tipo hipnótico e antidepressivo sem a interferência de efeitos motores e sem

afetar a memória dos animais, porém é desprovido de efeitos ansiolíticos e

anticonvulsivantes;

O efeito tipo-antidepressivo do EEPC foi confirmado em dois testes preditivos

para depressão tanto na forma aguda como subcrônica;

Os compostos presentes no EEPC, a αβ-cubebina e o trans-

dihidroagarofurano apresentaram efeito tipo-antidepressivo no TNF;

Em modelos in vivo foi demonstrado que o mecanismo de ação do efeito tipo-

antidepressivo do EEPC parece envolver os sistemas serotonérgico, noradrenérgico,

dopaminérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico e GABAérgico, mas não o sistema

opióide;

Em ensaios in vitro o EEPC apresentou atividade antioxidante;

Em modelos ex-vivo na administração subcrônica o EEPC inibiu o estresse

oxidativo, através da sua ação sobre as enzimas antioxidantes endógenas.

Em uma última análise através de modelos ex-vivo, o mecanismo de ação do

EEPC parece envolver também a inibição da enzima MAO-A.

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ANEXO – Parecer comissão de ética no uso de animais CEUA/UNIVALI

avaliaÇÃo das propriedades psicofarmacolÓgicas …

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