avaliaÇÃo toxicolÓgica do Óleo-resina de...
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CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Brasiacutelia-DF 2010
UNIVERSIDADE DE BRASIacuteLIA
FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias de
Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia
Orientador Profordf Drordf Eloisa Dutra Caldas
Brasiacutelia-DF 2010
CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias de
Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia
Aprovado em 28 de janeiro de 2010
BANCA EXAMINADORA
Orientador Profordf Drordf Eloisa Dutra Caldas
Dra Laila Salmen Espiacutendola
Dr Albino Verccedilosa de Magalhatildees
Membro Interno do Programa de Mestrado em Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade de Brasiacutelia
Dr Mauriacutecio Homem de Mello
Universidade de Brasiacutelia
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo inicialmente agrave Deus por sua presenccedila constante nos momentos
difiacuteceis e alegres
Agrave Orientadora Eloisa Dutra Caldas principal responsaacutevel pela realizaccedilatildeo deste
projeto Agradeccedilo por ter confiado no meu trabalho desenvolvendo minha capacidade
cientiacutefica e acima de tudo por sua amizade
Agrave minha famiacutelia pelo apoio em meu crescimento profissional incentivo e amor
Ao Dr Francisco Joseacute Roma Paumgartten por me receber na Fundaccedilatildeo
Oswaldo Cruz e dedicar seu tempo para apoiar o presente trabalho
Agrave Rosacircngela Ribeiro de Carvalho por transmitir seu conhecimento com
dedicaccedilatildeo e exclusividade demonstrando sempre a importacircncia e seriedade do
estudo e o amor a pesquisa
Agrave colaboradora Maria Luiza Fascineli pelo auxiacutelio teacutecnico durante a realizaccedilatildeo
do projeto
Agrave estagiaacuteria Juliana Alves Sampaio que natildeo mediu esforccedilos em contribuir para
a efetiva realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos colegas do Laboratoacuterio de Toxicologia Andreacuteia Nunes Oliveira Jardim
Denise Carvalho de Mello e Juciecirc Roniery Costa Vasconcelos Silva pelo apoio teacutecnico
no Laboratoacuterio de Toxicologia da UnB
Aos colegas Eacuterica Lilian Juliana Bruno Maacutercia Maristela e Willian do
Laboratoacuterio de Toxicologia pela amizade e apoio
Agrave profa Fabiana Pirani Carneiro do Laboratoacuterio de Patologia da UnB pelas
anaacutelises histoloacutegicas
Aos meacutedicos veterinaacuterios da Cirurgia Experimental da UnB Helenira Melo de
Moura Rafael Andrade Rocha Gabriela Mariacircngela Farias de Oliveira e aos amigos
Joseacute Tavares e Maria Fernanda da Conceiccedilatildeo que nunca mediram esforccedilos em me
auxiliar nos procedimentos com os animais
Agrave profa Vacircnia Maria Morais Ferreira e agrave Greice Lucena que me auxiliaram em
algumas teacutecnicas no teste piloto com os animais
Ao prof Antocircnio Sebben do Laboratoacuterio de Toxinologia da UnB por conceder
temporariamente a lupa necessaacuteria para as anaacutelises
Ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Amazocircnia Oriental por conceder as
amostras de copaiacuteba
Aos amigos Andreacuteia Pedro e Liane Jardim minha famiacutelia em Brasiacutelia por me
receberem em sua casa e me apoiarem em todos os momentos alegres e difiacuteceis
Aos queridos amigos Bianca Frederico Leandro Rodrigues e pelas irmatildes
Carolina Bohorquez Herrera e Luciana Braga pela sincera amizade e
companheirismo
Agrave induacutestria de medicamentos Prati Donaduzzi amp Cia Ltda por ter me
proporcionado a oportunidade de estar em Brasiacutelia
Agrave UnB pela oportunidade acadecircmica na realizaccedilatildeo do mestrado bem como o
apoio financeiro
Aos animais experimentais deste projeto os ratos que deram as suas vidas
para realizaccedilatildeo deste trabalho
Enfim a todos que de uma maneira ou outra foram importantes para a
realizaccedilatildeo deste projeto meus sinceros agradecimentos
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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Vasconcelos KRF Veiga Junior VF Rocha WC Bandeira MFCL 2008 Avaliaccedilatildeo in
vitro da atividade antibacteriana de um cimento odontoloacutegico agrave base de oacuteleo-resina
de Copaifera multijuga Hayne Rev Bras Farmacogn 18 733-738
Veiga Juacutenior VF Pinto AC 2002 O gecircnero Copaifera L Quim Nova 25 273-286
Veiga Juacutenior VF Pinto AC Maciel MAM 2005 Plantas Medicinais Cura Segura
Quim Nova 28 (3) 51928
Veiga Juacutenior VF Rosas EC Carvalho MV Henriques MGMO Pinto AC 2007
Chemical composition and anti-inflammatory activity of copaiba oils from Copaifera
cearensis Huber ex Ducke Copaifera reticulata Ducke and Copaifera multijuga
Hayne A comparative study J Ethnopharm 112 248-254
Vieira RC Bombardiere E Oliveira JJ Lino-Juacutenior RS Brito LA Junqueira-Kipnis AP
2008 Influecircncia do oacuteleo de Copaifera langsdorffii no reparo de ferida ciruacutergica em
presenccedila de corpo estranho Pesq Vet Bras 28(8) 358-366
OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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Simpoacutesio Internacional de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica da USP Satildeo Paulo [sn] p 1
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Santos AO Ueda-Nakamura T Dias Filho BP Veiga Junior VF Pinto AC Nakamura
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species of the Copaifera genus Mem Inst Oswaldo Cruz 103 277-281
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tratada com enema de oacuteleo-resina de copaiacuteba An Fac Med Univ Fed Pernamb 45
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cearensis Huber ex Ducke Copaifera reticulata Ducke and Copaifera multijuga
Hayne-A comparative study J Ethnophar 112 248-254
CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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OECDs Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute
Toxic Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de
2001)
Oliveira ECP Lameira AO Zoghbi MGB 2006 Identificaccedilatildeo da eacutepoca de coleta do
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Pinto FCM 2005 Estudo da embriotoxicidade da Beta-Ionona em ratos Tese de
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Wickramaratne GA 1988 The post-natal fate of supernumerary ribs in rat
teratogenicity studies J Appl Toxicol 8(2)91-4
CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
UNIVERSIDADE DE BRASIacuteLIA
FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias de
Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia
Orientador Profordf Drordf Eloisa Dutra Caldas
Brasiacutelia-DF 2010
CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias de
Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia
Aprovado em 28 de janeiro de 2010
BANCA EXAMINADORA
Orientador Profordf Drordf Eloisa Dutra Caldas
Dra Laila Salmen Espiacutendola
Dr Albino Verccedilosa de Magalhatildees
Membro Interno do Programa de Mestrado em Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade de Brasiacutelia
Dr Mauriacutecio Homem de Mello
Universidade de Brasiacutelia
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo inicialmente agrave Deus por sua presenccedila constante nos momentos
difiacuteceis e alegres
Agrave Orientadora Eloisa Dutra Caldas principal responsaacutevel pela realizaccedilatildeo deste
projeto Agradeccedilo por ter confiado no meu trabalho desenvolvendo minha capacidade
cientiacutefica e acima de tudo por sua amizade
Agrave minha famiacutelia pelo apoio em meu crescimento profissional incentivo e amor
Ao Dr Francisco Joseacute Roma Paumgartten por me receber na Fundaccedilatildeo
Oswaldo Cruz e dedicar seu tempo para apoiar o presente trabalho
Agrave Rosacircngela Ribeiro de Carvalho por transmitir seu conhecimento com
dedicaccedilatildeo e exclusividade demonstrando sempre a importacircncia e seriedade do
estudo e o amor a pesquisa
Agrave colaboradora Maria Luiza Fascineli pelo auxiacutelio teacutecnico durante a realizaccedilatildeo
do projeto
Agrave estagiaacuteria Juliana Alves Sampaio que natildeo mediu esforccedilos em contribuir para
a efetiva realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos colegas do Laboratoacuterio de Toxicologia Andreacuteia Nunes Oliveira Jardim
Denise Carvalho de Mello e Juciecirc Roniery Costa Vasconcelos Silva pelo apoio teacutecnico
no Laboratoacuterio de Toxicologia da UnB
Aos colegas Eacuterica Lilian Juliana Bruno Maacutercia Maristela e Willian do
Laboratoacuterio de Toxicologia pela amizade e apoio
Agrave profa Fabiana Pirani Carneiro do Laboratoacuterio de Patologia da UnB pelas
anaacutelises histoloacutegicas
Aos meacutedicos veterinaacuterios da Cirurgia Experimental da UnB Helenira Melo de
Moura Rafael Andrade Rocha Gabriela Mariacircngela Farias de Oliveira e aos amigos
Joseacute Tavares e Maria Fernanda da Conceiccedilatildeo que nunca mediram esforccedilos em me
auxiliar nos procedimentos com os animais
Agrave profa Vacircnia Maria Morais Ferreira e agrave Greice Lucena que me auxiliaram em
algumas teacutecnicas no teste piloto com os animais
Ao prof Antocircnio Sebben do Laboratoacuterio de Toxinologia da UnB por conceder
temporariamente a lupa necessaacuteria para as anaacutelises
Ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Amazocircnia Oriental por conceder as
amostras de copaiacuteba
Aos amigos Andreacuteia Pedro e Liane Jardim minha famiacutelia em Brasiacutelia por me
receberem em sua casa e me apoiarem em todos os momentos alegres e difiacuteceis
Aos queridos amigos Bianca Frederico Leandro Rodrigues e pelas irmatildes
Carolina Bohorquez Herrera e Luciana Braga pela sincera amizade e
companheirismo
Agrave induacutestria de medicamentos Prati Donaduzzi amp Cia Ltda por ter me
proporcionado a oportunidade de estar em Brasiacutelia
Agrave UnB pela oportunidade acadecircmica na realizaccedilatildeo do mestrado bem como o
apoio financeiro
Aos animais experimentais deste projeto os ratos que deram as suas vidas
para realizaccedilatildeo deste trabalho
Enfim a todos que de uma maneira ou outra foram importantes para a
realizaccedilatildeo deste projeto meus sinceros agradecimentos
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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Hayne-A comparative study J Ethnophar 112 248-254
CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
CAMILE GIARETTA SACHETTI
AVALIACcedilAtildeO TOXICOLOacuteGICA DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM RATOS
ESTUDOS DE TOXICIDADE AGUDA NEUROTOXICIDADE E
EMBRIOFETOTOXICIDADE
Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias de
Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia
Aprovado em 28 de janeiro de 2010
BANCA EXAMINADORA
Orientador Profordf Drordf Eloisa Dutra Caldas
Dra Laila Salmen Espiacutendola
Dr Albino Verccedilosa de Magalhatildees
Membro Interno do Programa de Mestrado em Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade de Brasiacutelia
Dr Mauriacutecio Homem de Mello
Universidade de Brasiacutelia
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo inicialmente agrave Deus por sua presenccedila constante nos momentos
difiacuteceis e alegres
Agrave Orientadora Eloisa Dutra Caldas principal responsaacutevel pela realizaccedilatildeo deste
projeto Agradeccedilo por ter confiado no meu trabalho desenvolvendo minha capacidade
cientiacutefica e acima de tudo por sua amizade
Agrave minha famiacutelia pelo apoio em meu crescimento profissional incentivo e amor
Ao Dr Francisco Joseacute Roma Paumgartten por me receber na Fundaccedilatildeo
Oswaldo Cruz e dedicar seu tempo para apoiar o presente trabalho
Agrave Rosacircngela Ribeiro de Carvalho por transmitir seu conhecimento com
dedicaccedilatildeo e exclusividade demonstrando sempre a importacircncia e seriedade do
estudo e o amor a pesquisa
Agrave colaboradora Maria Luiza Fascineli pelo auxiacutelio teacutecnico durante a realizaccedilatildeo
do projeto
Agrave estagiaacuteria Juliana Alves Sampaio que natildeo mediu esforccedilos em contribuir para
a efetiva realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos colegas do Laboratoacuterio de Toxicologia Andreacuteia Nunes Oliveira Jardim
Denise Carvalho de Mello e Juciecirc Roniery Costa Vasconcelos Silva pelo apoio teacutecnico
no Laboratoacuterio de Toxicologia da UnB
Aos colegas Eacuterica Lilian Juliana Bruno Maacutercia Maristela e Willian do
Laboratoacuterio de Toxicologia pela amizade e apoio
Agrave profa Fabiana Pirani Carneiro do Laboratoacuterio de Patologia da UnB pelas
anaacutelises histoloacutegicas
Aos meacutedicos veterinaacuterios da Cirurgia Experimental da UnB Helenira Melo de
Moura Rafael Andrade Rocha Gabriela Mariacircngela Farias de Oliveira e aos amigos
Joseacute Tavares e Maria Fernanda da Conceiccedilatildeo que nunca mediram esforccedilos em me
auxiliar nos procedimentos com os animais
Agrave profa Vacircnia Maria Morais Ferreira e agrave Greice Lucena que me auxiliaram em
algumas teacutecnicas no teste piloto com os animais
Ao prof Antocircnio Sebben do Laboratoacuterio de Toxinologia da UnB por conceder
temporariamente a lupa necessaacuteria para as anaacutelises
Ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Amazocircnia Oriental por conceder as
amostras de copaiacuteba
Aos amigos Andreacuteia Pedro e Liane Jardim minha famiacutelia em Brasiacutelia por me
receberem em sua casa e me apoiarem em todos os momentos alegres e difiacuteceis
Aos queridos amigos Bianca Frederico Leandro Rodrigues e pelas irmatildes
Carolina Bohorquez Herrera e Luciana Braga pela sincera amizade e
companheirismo
Agrave induacutestria de medicamentos Prati Donaduzzi amp Cia Ltda por ter me
proporcionado a oportunidade de estar em Brasiacutelia
Agrave UnB pela oportunidade acadecircmica na realizaccedilatildeo do mestrado bem como o
apoio financeiro
Aos animais experimentais deste projeto os ratos que deram as suas vidas
para realizaccedilatildeo deste trabalho
Enfim a todos que de uma maneira ou outra foram importantes para a
realizaccedilatildeo deste projeto meus sinceros agradecimentos
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
AGRADECIMENTOS
Agradeccedilo inicialmente agrave Deus por sua presenccedila constante nos momentos
difiacuteceis e alegres
Agrave Orientadora Eloisa Dutra Caldas principal responsaacutevel pela realizaccedilatildeo deste
projeto Agradeccedilo por ter confiado no meu trabalho desenvolvendo minha capacidade
cientiacutefica e acima de tudo por sua amizade
Agrave minha famiacutelia pelo apoio em meu crescimento profissional incentivo e amor
Ao Dr Francisco Joseacute Roma Paumgartten por me receber na Fundaccedilatildeo
Oswaldo Cruz e dedicar seu tempo para apoiar o presente trabalho
Agrave Rosacircngela Ribeiro de Carvalho por transmitir seu conhecimento com
dedicaccedilatildeo e exclusividade demonstrando sempre a importacircncia e seriedade do
estudo e o amor a pesquisa
Agrave colaboradora Maria Luiza Fascineli pelo auxiacutelio teacutecnico durante a realizaccedilatildeo
do projeto
Agrave estagiaacuteria Juliana Alves Sampaio que natildeo mediu esforccedilos em contribuir para
a efetiva realizaccedilatildeo deste trabalho
Aos colegas do Laboratoacuterio de Toxicologia Andreacuteia Nunes Oliveira Jardim
Denise Carvalho de Mello e Juciecirc Roniery Costa Vasconcelos Silva pelo apoio teacutecnico
no Laboratoacuterio de Toxicologia da UnB
Aos colegas Eacuterica Lilian Juliana Bruno Maacutercia Maristela e Willian do
Laboratoacuterio de Toxicologia pela amizade e apoio
Agrave profa Fabiana Pirani Carneiro do Laboratoacuterio de Patologia da UnB pelas
anaacutelises histoloacutegicas
Aos meacutedicos veterinaacuterios da Cirurgia Experimental da UnB Helenira Melo de
Moura Rafael Andrade Rocha Gabriela Mariacircngela Farias de Oliveira e aos amigos
Joseacute Tavares e Maria Fernanda da Conceiccedilatildeo que nunca mediram esforccedilos em me
auxiliar nos procedimentos com os animais
Agrave profa Vacircnia Maria Morais Ferreira e agrave Greice Lucena que me auxiliaram em
algumas teacutecnicas no teste piloto com os animais
Ao prof Antocircnio Sebben do Laboratoacuterio de Toxinologia da UnB por conceder
temporariamente a lupa necessaacuteria para as anaacutelises
Ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Amazocircnia Oriental por conceder as
amostras de copaiacuteba
Aos amigos Andreacuteia Pedro e Liane Jardim minha famiacutelia em Brasiacutelia por me
receberem em sua casa e me apoiarem em todos os momentos alegres e difiacuteceis
Aos queridos amigos Bianca Frederico Leandro Rodrigues e pelas irmatildes
Carolina Bohorquez Herrera e Luciana Braga pela sincera amizade e
companheirismo
Agrave induacutestria de medicamentos Prati Donaduzzi amp Cia Ltda por ter me
proporcionado a oportunidade de estar em Brasiacutelia
Agrave UnB pela oportunidade acadecircmica na realizaccedilatildeo do mestrado bem como o
apoio financeiro
Aos animais experimentais deste projeto os ratos que deram as suas vidas
para realizaccedilatildeo deste trabalho
Enfim a todos que de uma maneira ou outra foram importantes para a
realizaccedilatildeo deste projeto meus sinceros agradecimentos
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
Moura Rafael Andrade Rocha Gabriela Mariacircngela Farias de Oliveira e aos amigos
Joseacute Tavares e Maria Fernanda da Conceiccedilatildeo que nunca mediram esforccedilos em me
auxiliar nos procedimentos com os animais
Agrave profa Vacircnia Maria Morais Ferreira e agrave Greice Lucena que me auxiliaram em
algumas teacutecnicas no teste piloto com os animais
Ao prof Antocircnio Sebben do Laboratoacuterio de Toxinologia da UnB por conceder
temporariamente a lupa necessaacuteria para as anaacutelises
Ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Amazocircnia Oriental por conceder as
amostras de copaiacuteba
Aos amigos Andreacuteia Pedro e Liane Jardim minha famiacutelia em Brasiacutelia por me
receberem em sua casa e me apoiarem em todos os momentos alegres e difiacuteceis
Aos queridos amigos Bianca Frederico Leandro Rodrigues e pelas irmatildes
Carolina Bohorquez Herrera e Luciana Braga pela sincera amizade e
companheirismo
Agrave induacutestria de medicamentos Prati Donaduzzi amp Cia Ltda por ter me
proporcionado a oportunidade de estar em Brasiacutelia
Agrave UnB pela oportunidade acadecircmica na realizaccedilatildeo do mestrado bem como o
apoio financeiro
Aos animais experimentais deste projeto os ratos que deram as suas vidas
para realizaccedilatildeo deste trabalho
Enfim a todos que de uma maneira ou outra foram importantes para a
realizaccedilatildeo deste projeto meus sinceros agradecimentos
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
Valeu a pena Tudo vale a pena
Se a alma natildeo eacute pequena
Quem querer passar aleacutem do Bojador
Tem que passar aleacutem da dor
Deus ao mar o perigo e o abismo deu
Mas nele eacute que espelhou o ceacuteu
Fernando Pessoa
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
SUMAacuteRIO
INTRODUCcedilAtildeO __________________________________________________ 12
Oacuteleo-resina de copaiacuteba ___________________________________________ 15
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba __________________ 17
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba _______________________ 21
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos _____________________ 23
REFEREcircNCIAS _________________________________________________ 27
OBJETIVOS ____________________________________________________ 33
CAPIacuteTULO I AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO
DA COPAIacuteBA ___________________________________________________ 34
CAPIacuteTULO II AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE
RATOS EXPOSTOS Agrave COPAIacuteBA ___________________________________ 52
CAPIacuteTULO III EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA EM
RATOS ________________________________________________________ 63
CONCLUSOtildeES FINAIS ___________________________________________ 91
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
RESUMO
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L Fabaceae eacute uma das
plantas com uso medicinal mais conhecido e utilizado no Brasil Embora haja vaacuterios
estudos mostrando algumas das atividades farmacoloacutegicas desse oacuteleo-resina
existem poucos trabalhos relacionados agrave sua toxicidade No presente estudo ratas
Wistar foram expostas a diferentes doses do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata via
gavagem dissolvida em Tween 80 2 para se avaliar sua toxicidade aguda e
neurotoacutexica seu potencial toacutexico durante o periacuteodo gestacional e sua toxicidade
embriofetal O estudo de toxicidade oral aguda foi realizado com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas em grupos de doses uacutenicas de 300 e 2000 mgkg pc conforme o Guia
OECD-4232001 Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto
agrave funccedilatildeo comportamental motora e sensorial em Campo Aberto e em Labirinto em
Cruz Elevado A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc e natildeo
houve sinais cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade indicando uma baixa
toxicidade aguda A toxicidade do oacuteleo-resina no desenvolvimento embriofetal em
ratos foi avaliada de acordo com o Guia OECD- 4142001 Ratos prenhes foram
distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 25 fecircmeas cada e a partir do 6deg dia de
gestaccedilatildeo (DG) iniciou-se a administraccedilatildeo do oacuteleo resina nas doses de 500 1000 e
1250 mgkg e grupo controle No 20ordm DG as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo
de CO2 Os seguintes paracircmetros foram avaliados peso materno corpoacutereo consumo
de raccedilatildeo peso do fiacutegado rins ceacuterebro e uacutetero nuacutemero de reabsorccedilotildees nuacutemero de
corpos luacuteteos nuacutemero de fetos vivos e mortos peso dos fetos e suas respectivas
placentas peso dos rins baccedilo fiacutegado timo coraccedilatildeo e pulmatildeo dos fetos avaliaccedilatildeo
externa visceral e esqueleacutetica da prole e exame macro e microscoacutepico do fiacutegado rim
direito e esquerdo e ceacuterebro das fecircmeas adultas Todos os animais sobreviveram
nesse estudo e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental foi evidenciada bem como natildeo
foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa nos oacutergatildeos das fecircmeas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico para o organismo materno nas doses de 1000 e
1250 mgkg evidenciado pela reduccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e pela diminuiccedilatildeo
no consumo de raccedilatildeo Nas maiores doses o oacuteleo-resina tambeacutem afetou o
desenvolvimento embriofetal causando retardo no crescimento fetal evidenciado pela
diminuiccedilatildeo do peso da prole Uma ingestatildeo oral segura de 5 mgkg pcdia para
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
mulheres gestantes foi estimada baseada no NOAEL de 500 mgkg pcdia Natildeo houve
aumento da frequumlecircncia de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras nos
fetos indicando que o produto natildeo eacute teratogecircnico em ratos
Palavras-chaves Copaifera reticulata toxicidade aguda toxicidade reprodutiva ratos
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
ABSTRACT
Popularly known as copaiba the genus Copaifera L Fabaceae is one of the
medicinal plants most known and used in Brazil Although there are several studies
showing some of the pharmacological activities of this oil there are few studies related
to its toxicity In this study female Wistar rats were exposed orally to different doses of
Copaifera reticulata oilresin dissolved in Tween 80 2 to evaluate its acute toxicity
and neurotoxicity its potential toxicity during pregnancy and embryofetal toxicity The
study was performed with 15 nulliparous female rats distributed in groups with single
doses of 300 e 2000 mgkg bw according to Guide OECD-4232001 One hour after
administration the animals were evaluated for functional behavioral motor and
sensory function in open-field test and elevate plus-maze test The acute lethal dose
was estimated as greater than 2000 mgkg bw and there were no clinical signs of
toxicity or neurotoxicity indicating a low acute toxicity The toxicity of the oilresin on
fetal development was evaluated according to OECD Guide 4142001 Pregnat rats
were randomly distributed in 4 groups of 25 females each and the administration of
the oleoresin began from 6th day of gestation (DG) in doses of 500 1000 and 1250
mgkg plus the control group In the 20th DG the females were sacrificed by CO2
inhalation The following parameters were evaluated maternal body weight food
intake weight of liver kidney brain and uterus number of resorptions number of
corpora lutea live and dead fetuses weight of fetuses and their placentas weight of
fetus kidneys liver spleen thymus heart and lung external visceral and skeletal
evaluation of the offsprings The liver kidney and brain were examined visually and
microscopically All animals survived the study No abnormal behaviour was observed
and no significant pathological changes in the female organs were found The copaiba
oilresin was toxic to the female at doses of 1000 and 1250mgkg as evidenced by
decrease in body weight and decreased feed intake At the higher doses the oil-resin
also affected the developing embryo causing fetal growth retardation evidenced by
decreased in body weight of the offsprings A safe oral dose of 5 mgkg bwday for
pregnant human was estimated from a NOAEL of 500 mgkg bwday There was no
increased in the frequency of visceral andor skeletal gross fetus malformations
indicating that the product is not teratogenic in rats
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
Key-words Copaifera reticulata acute toxicity reproductive toxicity rats
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
Referecircncias
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas
INTRODUCcedilAtildeO
A fitoterapia praacutetica da medicina tradicional ou popular usada como forma
alternativa de cuidados com a sauacutede aumentou consideravelmente nos uacuteltimos anos
entre todos os grupos socioeconocircmicos da populaccedilatildeo sendo atualmente um
importante setor econocircmico no Brasil O setor movimenta globalmente US$ 217
bilhotildees por ano e no Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160
milhotildees por ano (Carvalho et al 2008) Grande parte da comercializaccedilatildeo de plantas
medicinais eacute feita em farmaacutecias e lojas de produtos naturais onde preparaccedilotildees
vegetais satildeo comercializadas com rotulaccedilatildeo industrializada Em geral essas
preparaccedilotildees natildeo possuem certificado de qualidade e satildeo produzidas a partir de
plantas cultivadas o que descaracteriza a medicina tradicional que utiliza quase
sempre plantas da flora nativa (Veiga Jr et al 2005) Em muitos casos essas plantas
satildeo consumidas com pouca ou nenhuma comprovaccedilatildeo de suas propriedades
farmacoloacutegicas propagadas por usuaacuterios ou comerciantes Muitas vezes satildeo
inclusive empregadas para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos
silviacutecolas
Numa pesquisa realizada nos Estados Unidos Eisenberg et al (1998)
demonstraram que 42 da populaccedilatildeo havia feito em 1996 o uso de plantas
medicinais pelo menos uma vez ao ano em tratamentos meacutedicos alternativos Esse
percentual eacute cerca de 338 maior em relaccedilatildeo ao ano de 1990 quando a mesma
pesquisa foi realizada Muitos paiacuteses da Europa utilizam plantas medicinais de forma
ampla como a Alemanha e a Franccedila que deteacutem 39 e 29 do total de vendas de toda
a Uniatildeo Europeacuteia respectivamente No caso do oacuteleo-resina de copaiacuteba ela vem
sendo exportada do Brasil principalmente para Franccedila Alemanha Inglaterra e
Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) Na Alemanha plantas medicinais satildeo
utilizadas pela populaccedilatildeo para tratar resfriados (66) gripe (38) doenccedilas do trato
digestivo ou intestinal (25) dores de cabeccedila (25) insocircnia (25) uacutelcera estomacal
(36) nervosismo (21) bronquite (15) doenccedilas de pele (15) fadiga e exaustatildeo
(12) (Calixto 2000)
O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo aleacutem de
inuacutemeras experiecircncias vinculadas ao conhecimento tradicional das plantas medicinais
e tecnologia para correlacionar o saber tradicional e cientiacutefico (Albuquerque amp
Hanazaki 2006) Num estudo realizado no municiacutepio de Campina Grande mdash Paraiacuteba
782 famiacutelias foram visitadas para entrevista e coleta de plantas (Amorin 1999) Em
829 delas havia uma pessoa que era considerada especialista usando as
plantas para sua famiacutelia e para ela 872 haviam aprendido sobre seu uso com a
famiacutelia As plantas eram utilizadas para vaacuterios problemas incluindo gastrointestinais
(211) garganta nariz e pulmotildees (182) febres e gripes (133)
psiconeuroloacutegicos (83) cardiacuteacos e circulatoacuterios (65) O chaacute foi citado como a
forma mais frequumlente de uso das plantas (634)
Pesquisas realizadas nas universidades brasileiras jaacute identificaram mais de 350
mil espeacutecies vegetais o que permite uma ampla variedade aos possiacuteveis usos
medicinais Entre tantas espeacutecies apenas dez mil tecircm algum uso medicinal
conhecido Segundo de Mesquita et al (2005) as populaccedilotildees das zonas rurais
dependem da medicina tradicional para o tratamento de muitas doenccedilas infecciosas
Entretanto poucos estudos tecircm focalizado os fitoteraacutepicos no acircmbito dos estudos
farmacoepidemioloacutegicos (Brandatildeo et al 2006 Ribeiro et al 2005) O
desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento das chamadas doenccedilas
negligenciadas tais como tuberculose malaacuteria mal de Chagas esquistossomose e
leishmaniose pouco interessa agrave induacutestria farmacecircutica Estas doenccedilas afetam
sobretudo populaccedilotildees de paiacuteses em desenvolvimento que reuacutenem 80 da
populaccedilatildeo mundial mas correspondem a apenas 20 das vendas globais de
medicamentos (Funari e Ferro 2005)
Em 2006 foi aprovada a Poliacutetica Nacional de Plantas Medicinais e Fitoteraacutepicos
(Brasil 2006) onde ficou estipulada a inserccedilatildeo de terapias alternativas e praacuteticas
populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Uacutenico de Sauacutede (SUS) Sendo assim a
necessidade de estudos toxicoloacutegicos e a implantaccedilatildeo de poliacuteticas de
fitofarmacovigilacircncia devem ser tomadas como prioridade para a sauacutede puacuteblica
As pesquisas realizadas para avaliaccedilatildeo do uso seguro de plantas medicinais e
fitoteraacutepicos no Brasil poreacutem ainda satildeo incipientes assim como o controle da
comercializaccedilatildeo pelos oacutergatildeos oficiais em feiras livres mercados puacuteblicos ou lojas de
produtos naturais (Veiga Jr et al 2005) A normatizaccedilatildeo do registro de fitoteraacutepicos eacute
responsabilidade da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA) A Resoluccedilatildeo
da Diretoria Colegiada (RDC) no 48 de 16 de marccedilo de 2004 determina entre outros
a necessidade de controle de qualidade do produto acabado com meacutetodos analiacuteticos
que incluam perfis cromatograacuteficos e resultados de prospecccedilatildeo fitoquiacutemica aleacutem de
comprovaccedilatildeo de seguranccedila de uso incluindo estudos de toxicidade preacute-cliacutenica
Outras resoluccedilotildees sobre o tema incluem a RE nordm 90 de 2004 (DOU Poder Executivo
290404) com o lsquoGuia para realizaccedilatildeo de estudos de toxicidade preacute-cliacutenica de
fitoteraacutepicoslsquolsquo que tem como objetivo indicar meacutetodos padronizados para os estudos
de toxicologia preacute-cliacutenica a RE nordm 88 de 2004 (DOU Poder Executivo 18032004) que
determina a publicaccedilatildeo da Lista de referecircncias bibliograacuteficas para avaliaccedilatildeo de
seguranccedila e eficaacutecia de fitoteraacutepicos a RE ndeg 89 de 2004 que foi revogada pela
Instruccedilatildeo Normativa nordm 5 de 11 de dezembro de 2008 que determina a publicaccedilatildeo da
Lista de registro simplificado de fitoteraacutepicos e a RE ndeg 91 (DOU Poder Executivo
160304) que determina a publicaccedilatildeo do Guia para realizaccedilatildeo de alteraccedilotildees
inclusotildees notificaccedilotildees e cancelamentos poacutes registro de fitoteraacutepicos
O uso milenar de plantas medicinais mostrou ao longo dos anos que
determinadas plantas apresentam substacircncias potencialmente toacutexicas e devem ser
utilizadas com cuidado respeitando seus riscos toxicoloacutegicos Os efeitos adversos
dos fitoteraacutepicos possiacuteveis adulteraccedilotildees e toxicidade bem como a accedilatildeo sineacutergica
(interaccedilatildeo com outras drogas) ocorrem comumente O aumento no nuacutemero de
reaccedilotildees adversas eacute possivelmente justificado pelo aumento do uso dessas plantas
(Gallo et al 2000) Mais de 5000 suspeitas de reaccedilotildees adversas relacionadas ao uso
de ervas foram informadas a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) ateacute 1996 Entre
janeiro de 1993 e outubro de 1998 2621 eventos adversos incluindo 101 mortes
associadas com suplementos dieteacuteticos foram informadas ao FDA poreacutem esses
eventos adversos natildeo foram bem reportados Fatores que contribuem para natildeo
notificaccedilatildeo desses eventos incluem o desconhecimento dos meacutedicos associados ao
uso de fitoteraacutepicos e ao fato que os pacientes nem sempre informam o uso desses
medicamentos durante a consulta (Adusumilli et al 2002)
O intenso apelo comercial advindo do forte movimento cultural dos naturalistas
aqueceu em todo o mundo o consumo de plantas medicinais Entretanto em muitos
casos natildeo haacute respeito aos limites de uso dos fitoteraacutepicos e natildeo se fornecem
informaccedilotildees sobre efeitos colaterais Estudos multidisciplinares associando
fitoquiacutemicos e farmacoacutelogos tornam-se cada vez mais importantes para a definiccedilatildeo
dos potenciais terapecircuticos e toacutexicos de extratos vegetais (Maciel et al 2002)
Oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem descrito como copaiacuteba copaiacuteva ou pau-de-
oacuteleo eacute amplamente conhecido no Brasil por sua atividade terapecircutica baseada no uso
popular O oacuteleo-resina eacute extraiacutedo do tronco das aacutervores do gecircnero Copaifera L
pertencente agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth
encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste do Brasil (Veiga Jr e
Pinto 2002) Em 1996 o Index Kewensis apresentou 72 espeacutecies do genecircro
Copaifera sendo 16 somente no Brasil A designaccedilatildeo correta para o oacuteleo da copaiacuteba
eacute a de oacuteleo-resina por ser um exudato constituiacutedo por aacutecidos resinosos e compostos
volaacuteteis (Bruneton 1987 apud Veiga Jr e Pinto 2002)
As espeacutecies do gecircnero Copaifera em geral satildeo aacutervores com altura de 15 a 40
metros (Figura 1) casca aromaacutetica folhagem densa flores pequenas frutos secos
do tipo vagem monospeacutermica e deiscente As sementes satildeo de cor preta ovoacuteides
com um arilo amarelo rico em lipiacutedeos (Rigamonte-Azevedo 2004) Segundo alguns
autores o oacuteleo-resina essencial funciona como defesa da planta contra animais
fungos e bacteacuterias Em todas as espeacutecies os canais secretores acham-se na regiatildeo
cortical dos caules poreacutem dispostos de modo que se prolonguem ateacute o lenho onde
existem em notaacutevel abundacircncia formando bolsas (Correcirca 1984)
Figura 1 Copaifera sp (Foto Ibama)
A Figura 2 mostra um exemplo do processo de coleta do oacuteleo-resina descrita
em Oliveira et al (2006) As aacutervores satildeo perfuradas com um trado tradicional de 2 cm
de diacircmetro e 45 cm de comprimento (Figura 2A) fazendo-se dois orifiacutecios na altura
de 1m e 150 m respectivamente (Figura 2B) O orifiacutecio da aacutervore apoacutes o completo
escoamento do oacuteleo-resina eacute vedado com cano do tipo PVC com frac34 de diacircmetro e 10
cm de comprimento contendo uma tampa de plaacutestico visando facilitar as outras
coletas e evitar resiacuteduos de madeira (Figura 2C) As espeacutecies mais frequumlentemente
utilizadas na produccedilatildeo do oacuteleo-resina satildeo C reticulata (70) C guianensis (10) C
multijuga (5) e C officinalis (5) (apud Veiga Jr e Pinto 2002)
Figura 2 Processo utilizado na extraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Trado tradicional (A) Orifiacutecios (B)
e Cano PVC (C) Embrapa Amazocircnia Oriental 2003 Fonte Oliveira et al (2006)
Estudos fitoquiacutemicos realizados com o oacuteleo-resina da Copaifera revelaram a
presenccedila de cerca de 72 sesquiterpenos e 20 diterpenos mas uma diferenccedila
significativa na composiccedilatildeo quiacutemica ocorreu entre as espeacutecies (Cascon e Gilbert
2000 Pontes et al 2003) A presenccedila de substacircncias quiacutemicas em uma determinada
espeacutecie vegetal pode estar atrelada a sua sazonalidade variando conforme o
ambiente e fatores climaacuteticos (Moraes e Bastos 1972) Nas espeacutecies de Copaifera a
concentraccedilatildeo das substacircncias pode variar em funccedilatildeo da temperatura radiaccedilatildeo solar
e precipitaccedilatildeo pluviomeacutetrica dentre outros fatores (Oliveira et al 2006)
Propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba
As propriedades farmacoloacutegicas do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm sido bastante
estudadas e incluem sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al
2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria principalmente contra o parasita Leishmania (Santos et al 2008b)
Fernandes et al (1992) avaliaram o efeito antiiflamatoacuterio e analgeacutesico do oacuteleo-
resina da Copaifera cearensis comparando-a com a indometacina e com outros
derivados isolados do oacuteleo-resina como o aacutecido copaacutelico o eacuteter metiacutelico do agravecido
solidago e bisabolol Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba
possui atividade antiinflamatoacuteria e analgeacutesica maiores que aquelas dos trecircs
compostos estudados isoladamente poreacutem menor que a indometacina Basile et al
(1988) estudaram a atividade antiinflamatoacuteria do oacuteleo-resina em ratos utilizando
diversos modelos como inibiccedilatildeo de edema induzido por carragenina inibiccedilatildeo de
formaccedilatildeo de granuloma ―Cotton-pellet e aumento de permeabilidade vascular O
estudo foi realizado com oacuteleo-resina comercial sem identificaccedilatildeo botacircnica da espeacutecie
Os resultados indicam que o oacuteleo-resina possui atividade antiinflamatoacuteria e baixa
toxicidade (DL50 3790 mLkg pc) Efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastro-intestinal
diarreacuteia sialorreacuteia e depressatildeo do sistema nervoso central foram observadas nas
doses mais altas
Vieira et al (2008) avaliaram o efeito do tratamento toacutepico com C langsdorffii
no processo de reparo quando um corpo estranho eacute o indutor da inflamaccedilatildeo Para
isso 60 camundongos da linhagem BALBc foram submetidos agrave incisatildeo ciruacutergica
linear de 1 cm no dorso para realizar o implante de uma lamiacutenula de vidro com 12 mm
de diacircmetro no tecido subcutacircneo Quatro tratamentos para a ferida foram
estabelecidos controle (C) tratado com soluccedilatildeo salina esteacuteril controle veiacuteculo (CV)
tratado com oacuteleo mineral esteacuteril tratamento 1 (T1) tratado com diluiccedilatildeo (vv) de oacuteleo
mineral esteacuteril e oacuteleo-resina de C langsdorffii tratamento 2 (T2) tratado com oacuteleo-
resina de C langsdorffii puro As avaliaccedilotildees foram realizadas em periacuteodos de 1 a 14
dias Foram verificadas caracteriacutesticas da fase proliferativa como a reepitelizaccedilatildeo a
presenccedila de fibroblastos e a neovascularizaccedilatildeo poreacutem os grupos tratados com o oacuteleo
(T1 e T2) natildeo apresentavam reepitelizaccedilatildeo aos trecircs dias Esses grupos aos 5 e 7 dias
apresentavam no exame macroscoacutepico maior intensidade de edema hiperemia e
permanecircncia de crostas Na microscopia a reepitelizaccedilatildeo ainda natildeo estava completa
e a crosta era serocelular Nos grupos C e CV apesar de discreta era predominante
a presenccedila de mononucleares enquanto nos grupos T1 e T2 o infiltrado inflamatoacuterio
era misto e com maior intensidade que nos outros grupos Quatorze dias depois da
incisatildeo ciruacutergica os aspectos macroscoacutepicos dos grupos C e CV eram semelhantes e
os grupos T1 e T2 apesar de a ferida estar completamente fechada e sem crostas a
pele desses animais estava espessada e na derme do grupo T2 parecia ter fibrose
mais acentuada do que nos outros grupos Neste estudo os resultados demonstraram
que o tratamento toacutepico com oacuteleo-resina de C langsdorffii prejudicou o processo de
reparaccedilatildeo normal de ferida na presenccedila de corpo estranho
Estevatildeo et al (2009) avaliaram morfometricamente a neoangiogecircnese de
retalhos cutacircneos subdeacutermicos em ratos tratados com oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera langsdorffii) em pomada a 10 Trinta ratos Wistar foram submetidos agrave
elevaccedilatildeo do retalho cutacircneo dorsal subdeacutermico e distribuiacutedos em trecircs grupos grupo
controle absoluto no qual os animais natildeo receberam nenhum tratamento grupo
controle no qual os animais receberam tratamento toacutepico diaacuterio com pomada com
apenas veiacuteculo (glicerina e vaselina) e grupo tratado no qual os animais foram
tratados diariamente com oacuteleo-resina de copaiacuteba em pomada a 10 Os ratos foram
tratados e observados por oito dias apoacutes o ato operatoacuterio No oitavo dia de poacutes-
operatoacuterio realizou-se a anaacutelise macroscoacutepica do retalho e foram coletados
fragmentos das porccedilotildees cranial meacutedia e caudal do retalho cutacircneo para anaacutelise
histopatoloacutegica A anaacutelise morfomeacutetrica mostrou diferenccedila significativa para o nuacutemero
de novos vasos sanguiacuteneos nas partes meacutedia e caudal do retalho cutacircneo no grupo
tratado Neste caso oacuteleo-resina de copaiacuteba mostra-se eficiente no aumento da
neoangiogecircnese em retalhos cutacircneos subdeacutermicos de ratos
Brito et al (2005) demonstraram a proteccedilatildeo da Copaifera multijuga Hayne na
funccedilatildeo renal de ratos submetidos a isquemia e reperfusatildeo apresentando diminuiccedilatildeo
nos niacuteveis de creatinina e ureacuteia apoacutes 48 horas de exposiccedilatildeo A atividade
gastroprotetora do oacuteleo-resina (Copaifera langsdorffii) foi verificada em estudo
conduzido em ratos por Paiva et al (1998) A administraccedilatildeo oral do oacuteleo-resina nas
doses de 200 e 400mgkg promoveu uma proteccedilatildeo dose dependente contra as lesotildees
gaacutestricas provocadas por etanol e nas doses de 400mgkg tambeacutem preveniu a
ulceraccedilatildeo gaacutestrica induzida por indometacina Essa atividade gastroprotetora se deve
agrave diminuiccedilatildeo de acidez gaacutestrica provavelmente atraveacutes da promoccedilatildeo da secreccedilatildeo de
muco gaacutestrico e bicarbonato
A Copaifera multijuga Hayne foi avaliada quanto a sua atividade antimicrobiana
em cepas de Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 As placas foram incubadas em estufas por 24
h em temperatura de 35 ordmC Como padrotildees foram utilizados os antibioacuteticos amoxicilina
(AMO-10 mgdisco) cloranfenicol (CLO-30 mgdisco) e tetraciclina (TET-30 mgdisco)
Os resultados mostraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba possui capacidade de inibir o
crescimento das trecircs bacteacuterias avaliadas apresentando uma concentraccedilatildeo inibitoacuteria
miacutenima de 156 312 e 125 para E coli S aureus e P aeruginosa
respectivamente (Mendonccedila e Onofre 2009)
Vasconcelos et al (2008) formularam um cimento odontoloacutegico obtido da
associaccedilatildeo do ZnO Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de Copaifera multijuga Hayne para avaliar
a atividade antibacteriana atraveacutes do teste de diluiccedilatildeo em meio liacutequido frente agraves cepas
padratildeo de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e S sanguinis (ATCC 15300) Nesse
ensaio utilizaram-se os seguintes grupos experimentais o cimento contendo ZnO
Ca(OH)2 e oacuteleo-resina de copaiacuteba (G1) ZnO (G2) Ca(OH)2 (G3) e oacuteleo-resina de
copaiacuteba (G4) Todos os grupos analisados demonstraram atividade antibacteriana o
G4 apresentou os melhores resultados e o G1 mostrou-se um cimento promissor a
ser utilizado em odontologia
A atividade antimicrobiana do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem foi testada contra
as bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas leveduras e dermatoacutefitos Os oacuteleos
obtidos da Copaifera martii Copaifera officinalis e Copaifera reticulata foram ativos
contra as espeacutecies Gram-positivas (Staphylococcus aureus meticilina resistente S
aureus Staphylococcus epidermidis Bacillus subtilis e Enterococcus faecalis) com
concentraccedilatildeo miacutemina inibitoacuteria na faixa de 313-625 microgmL Os oacuteleos amostraram
atividade bactericida diminuindo a viabilidade das bacteacuterias Gram-positivas em 3
horas Atividade moderada foi observada contra os fungos dermatoacutefitos Trichophyton
rubrum e Microsporum canis A microscopia eletrocircnica das colocircnias de S aureus
tratados com o oacuteleo-resina obtido do C martii revelou lise das bacteacuterias causando
aglomerados celulares Microscopia de transmissatildeo eletrocircnica revelou lesatildeo na
parede celular resultando na liberaccedilatildeo de compostos citoplasmaacuteticos alteraccedilotildees na
morfologia e uma diminuiccedilatildeo no volume da ceacutelula indicando que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode afetar a parede celular (Santos et al 2008a)
A atividade larvicida de diterpenos isolados do oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata sobre Aedes aegypti principal vetor de dengue e febre amarela urbana
tambeacutem foi avaliada por Geris et al (2008) Quatro diterpenoacuteides foram obtidos a
partir da extraccedilatildeo do oacuteleo-resina com solventes orgacircnicos e subsequumlentes
procedimentos cromatograacuteficos e espectroscoacutepicos permitiram o isolamento e a
identificaccedilatildeo desses compostos como aacutecido 3-β-acetoxylabdan-8(17)-13-dien-15-oacuteico
(1) aacutecido alepteroacutelico (2) aacutecido 3-β-hidroxylabdan-8(17)-en-15-oacuteico (3) e aacutecido ent-
agaacutetico (4) Cada um desses compostos foi previamente solubilizado em
dimetilsulfoacutexido acrescentando-se aacutegua ateacute se obterem as concentraccedilotildees desejadas
Em cada bioensaio foram utilizadas 20 larvas de 3deg estaacutedio de Ae aegypti colocadas
em 25 mL da soluccedilatildeo-teste Foram feitas cinco repeticcedilotildees e a mortalidade avaliada
48 h apoacutes a exposiccedilatildeo indicada pela ausecircncia de movimentos e escurecimento da
caacutepsula cefaacutelica Os dados obtidos da mortalidade x concentraccedilatildeo (ppm) foram
analisados em graacutefico de Probit para avaliar as concentraccedilotildees letais (CL50 e CL90)
Este estudo revelou que os diterpenoacuteides 1 e 2 mostraram atividade larvicida com
CL50 de 08 e 873 ppm respectivamente sendo o diterpeno 1 o composto mais
promissor a ser usado como larvicida para o controle de Aedes aegypti
Silva et al (2007) avaliaram a atividade larvicida das fraccedilotildees do oacuteleo-resina de
Copaifera reticulata Ducke (Leguminosae-Caesalpinoideae) em larvas de 3ordm estaacutedio
de Aedes aegypti na busca de alternativas para o controle desse mosquito As
fraccedilotildees bioativas foram monitoradas quimicamente atraveacutes de cromatografia de
camada delgada analisada por ressonacircncia magneacutetica nuclear (1H e 13C) e
espectrometria de massa As fraccedilotildees mais ativas foram CRM1-4 (sesquiterpenos) e
CRM5-7 (diterpeno labdano) que mostraram os valores de CL50 de 02 e 08 ppm
respectivamente
Gomes et al (2007) realizaram um estudo para verificar a atividade
antinociceptiva do oacuteleo-resina (C multijuga Hayne) O estudo foi conduzido com
camundongos machos Swiss administrando-se via oral de 1 a 150 mgkg de copaiacuteba
Os resultados demonstraram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba apresentou atividade
antinociceptiva perifeacuterica e central provavelmente atraveacutes de receptores opioacuteides
Entretanto natildeo foram observados durante os 5 dias apoacutes a dosagem nenhuma
alteraccedilatildeo comportamental perda dos reflexos da luz aumento ou diminuiccedilatildeo da
respiraccedilatildeo e ingestatildeo de aacutegua e comida e lesotildees ou hemorragias no estocircmago
Estudos da toxicidade do oacuteleo-resina de copaiba
Poucos estudos para avaliar o potencial toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba tecircm
sido conduzidos e nenhum avaliou sua toxicidade durante o desenvolvimento
embriofetal de maneira a garantir a utilizaccedilatildeo segura por gestantes
Souza Jr et al (2002) analisaram o efeito intra-cavitaacuterio da copaiacuteba (C
multijuga Hayne) em ratos infundido na cavidade peritoneal dos animais 05mLkg pc
do oacuteleo-resina Os resultados demonstraram fiacutegado estocircmago baccedilo e ceco aderidos
em 80 dos animais possivelmente explicadas pela accedilatildeo caacuteustica irritativa do oacuteleo
Aleacutem disso 80 dos animais apresentaram abcessos de ateacute 2 mm de diacircmetro
principalmente no intestino fiacutegado e parede abdominal o qual se deveu segundo os
autores pela dificuldade de absorccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
O oacuteleo-resina da Copaifera duckei natildeo produziu efeitos mutagecircnicos nas
ceacutelulas da medula oacutessea ou em reticuloacutecitos perifeacutericos mas mostrou atividade
citotoacutexica em doses elevadas (Maistro et al 2005) Para avaliar a mutagenicidade
ratos foram tratados com doses de 10 25 e 50 da dose da DL50 (7467 mgkg pc)
do oacuteleo-resina por 3 dias consecutivos e coletado sangue perifeacuterico em 0 24 48 e 72
h para anaacutelise dos micronuacutecleos Nas trecircs concentraccedilotildees e nos trecircs intervalos de
tempo testados natildeo foram encontradas diferenccedilas estatisticamente significativas na
meacutedia do nuacutemero de reticuloacutecitos micronucleados e no nuacutemero de aberraccedilotildees
cromossomais comparados com o controle negativo No entanto em 25 e 50 da
dose de DL50 do oacuteleo-resina apresentou uma diminuiccedilatildeo significativa no iacutendice
mitoacutetico quando comparado com o controle A caracterizaccedilatildeo quiacutemica do oacuteleo-resina
revelou a presenccedila de sesquiterpenos hidrocarbonados e um diterpeno aacutecido natildeo
identificado
Basile et al (1988) num estudo para demonstrar a accedilatildeo antiinflamatoacuteria de
oacuteleos comerciais de copaiacuteba estimaram sua DL50 em 38 mLkg pc Estudos
conduzidos com vaacuterias espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem
reportam uma baixa toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por
Fernandes et al (1992) com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a
doses de 1250 2500 3700 e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos
os sexosgrupo) e a DL50 estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007)
estimaram a DL50 de Copaifera reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em
3900 mgkg pc e 4300 mgkg pc respectivamente
Ateacute o momento da conclusatildeo desta dissertaccedilatildeo natildeo existiam na literatura
estudos disponiacuteveis sobre o potencial embriofetotoacutexico da copaiacuteba em ratos Costa-
Lotufo et al (2002) verificaram o potencial embriotoacutexico e citotoacutexico do agravecido
caurenoacuteico um diterpeno encontrado abundantemente nas espeacutecies de Copaifera A
exposiccedilatildeo contiacutenua (30 horas) de agravecido caurenoacuteico no desenvolvimento embrionaacuterio
de ouriccedilos do mar iniciando apoacutes a fertilizaccedilatildeo inibiu a primeira clivagem (IC50 842
μM) e progressivamente induziu destruiccedilatildeo embrionaacuteria (IC50 447 μM e lt10 μM para
blaacutestula e estaacutegio de larva respectivamente) Por outro lado o aacutecido caurenoacuteico inibiu
o crescimento de ceacutelulas leucecircmicas (CEM) ceacutelulas do cacircncer de mama (MCF-7) e
ceacutelulas do cacircncer de coacutelon (HCT-8)
Cunha et al (2003) isolaram o diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii e analisaram sua accedilatildeo no muacutesculo uterino de ratos reportando
propriedades de relaxamento uterino causados principalmente atraveacutes do bloqueio do
transporte de caacutelcio e em parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
Brito et al (2000) estudaram os aspectos morfoloacutegicos e morfomeacutetricos do colo
uterino de ratas ooforectomizadas apoacutes a aplicaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba
administradas via vaginal na dose de 03 mL diariamente uma vez ao dia ateacute os dias
determinados para o sacrifiacutecio (7deg 14deg e 21deg dia do estudo) O colo uterino dos
animais dos grupos controles (aacutegua e oacuteleo de milho) mostraram epiteacutelio atroacutefico de 1
ou 2 fileiras de ceacutelulas em todos os dias analisados (7ordm 14ordm 21ordm dia do estudo)
Foram observadas no colo uterino de fecircmeas tratadas um epiteacutelio exuberante
pavimentoso estratificado e queratinizado nos mesmos dias analisados Segundo os
autores este epiteacutelio exuberante natildeo devia estar presente pois as ratas natildeo estavam
sob accedilatildeo de estrogecircnio para induzir tal epitelizaccedilatildeo sugerindo que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba pode ter agido por um efeito pseudo-hormonal por accedilatildeo sistecircmica ou por
irritaccedilatildeo toacutepica Os autores sugerem que outros modelos experimentais satildeo
necessaacuterios para comprovar estes efeitos assim como conhecer melhor as
propriedades do oacuteleo-resina
Avaliaccedilatildeo da toxicidade reprodutiva de xenobioacuteticos
A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo materno pode
ser influenciado por agentes toacutexicos que poderatildeo afetar o sucesso da implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto (Daruich et al 2001) Nesse periacuteodo os
mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
aleacutem da funccedilatildeo materna normal ser indispensaacutevel para o desenvolvimento adequado
dos fetos e para a sauacutede da prole A resposta fetal pode ser diferente da resposta
materna podendo ocorrer toxicidade embriofetal A exposiccedilatildeo preacute-natal em testes
com animais prenhes pode incluir avaliaccedilatildeo dos efeitos maternos bem como a morte
anormalidades estruturais ou alteraccedilatildeo no crescimento dos fetos (OECD Guideline
for the Testing of Chemicals- TG 414 2001)
A toxicidade reprodutiva se refere a algum tipo de interferecircncia na capacidade
reprodutiva de machos eou fecircmeas (incluindo o desenvolvimento preacute-natal)
provocada por um agente toxicante Alteraccedilotildees especiacuteficas como anomalias
congecircnitas podem ocorrer espontaneamente (mutaccedilotildees causadas por fatores
endoacutegenos) ou pela influecircncia de substacircncias toacutexicas (efeitos teratogecircnicos)
Entretanto a incidecircncia de anomalias espontacircneas eacute prevista dentro das espeacutecies de
animais modelo como tambeacutem para a espeacutecie humana (EPA 1996)
Agecircncias regulatoacuterias e induacutestrias farmacecircuticas e quiacutemicas despendem um
grande esforccedilo e recursos para avaliar os efeitos dos medicamentos e produtos
quiacutemicos no desenvolvimento humano Para prevenir trageacutedias como a da talidomida
estudos de toxicidade do desenvolvimento preacute-natal satildeo conduzidos em animais de
laboratoacuterio como parte da avaliaccedilatildeo toxicoloacutegica de medicamentos pesticidas e
produtos quiacutemicos industriais Estes estudos satildeo destinados a identificar os produtos
quiacutemicos que satildeo potencialmente perigosos para o concepto em desenvolvimento e
fornecem dados adequados para a extrapolaccedilatildeo das informaccedilotildees obtidas a partir de
estudos em animais de laboratoacuterio para o perigo a sauacutede humana e avaliaccedilatildeo de risco
(Daston and Seed 2007)
Os estudos preacute-cliacutenicos de toxicidade reprodutiva de faacutermacos consistem em
ensaios realizados em animais a fim de verificar o potencial de uma substacircncia
quiacutemica nova em provocar efeitos adversos sobre o processo reprodutivo incluindo a
fertilidade o acasalamento o desenvolvimento embriofetal o parto e o
desenvolvimento poacutes-natal dos descendentes ateacute a maturidade reprodutiva Eacute uma
das aacutereas mais complexas da Toxicologia Preditiva porque o ciclo reprodutivo
prolonga-se por grande parte da vida do indiviacuteduo iniciando-se com a produccedilatildeo dos
gametas nos pais (ainda no periacuteodo preacute-natal) seguindo pela fertilizaccedilatildeo e
desenvolvimento embriofetal nascimento e desenvolvimento poacutes-natal ateacute a
maturidade sexual quando os descendentes jaacute adultos tornam-se capazes de
procriar As diretrizes metodoloacutegicas embora natildeo possuam forccedila de lei traduzem as
expectativas das agecircncias regulatoacuterias e por isto satildeo seguidas agrave risca pelas
induacutestrias As diretrizes da Agecircncia Americana de Controle de Medicamentos FDA
(US Food and Drug Administration 2001) e da Uniatildeo Europeacuteia EEC (European
Economic Community) recomendam a realizaccedilatildeo de abrangentes estudos de
toxicidade reprodutiva em trecircs segmentos (Figura 3) como segue
a) segmento I ndash de toxicidade crocircnica avalia os efeitos sobre a fertilidade de
machos e fecircmeas sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as
fecircmeas durante gestaccedilatildeo e lactaccedilatildeo
b) segmento II ndash de teratogenicidade avalia as possiacuteveis alteraccedilotildees no
desenvolvimento da progecircnie exposta durante a fase de organogecircnese
c) segmento III ndash de toxicidade peri e poacutes-natal avalia os efeitos sobre o
desenvolvimento preacute e poacutes-natal de progecircnies expostas durante as fases de
desenvolvimento fetal e lactaccedilatildeo
Figura 3 Esquema geral dos estudos de Toxicidade Reprodutiva denominados Segmentos I II e III
Simultaneamente a criaccedilatildeo das diretrizes harmonizadas observou-se por parte
da comunidade cientiacutefica e oacutergatildeos regulatoacuterios uma maior preocupaccedilatildeo com
possiacuteveis sequelas funcionais induzidas in utero Neste contexto a avaliaccedilatildeo de
toxicidade funcional que em geral inclui a avaliaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos sobre o
desenvolvimento neurocomportamental e da funccedilatildeo reprodutiva Tais avaliaccedilotildees
incluem atividade locomotora teste de memoacuteria desenvolvimento de reflexos
maturaccedilatildeo do tempo sexual acasalamento e fertilidade (―Reviewer Guidance - FDA
2001) O Brasil natildeo participa ativamente deste Foacuterum podendo ser considerado
apenas como paiacutes observador que procura seguir as recomendaccedilotildees contidas nas
diretrizes ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) sobretudo nos casos em que natildeo
possui regulamentaccedilatildeo proacutepria
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Executivo de 18 de marccedilo de 2004) ANVISA - Agecircncia Nacional de Vigilacircncia
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Ribeiro AQ Leite JPV Dantas-Barros AM 2005 Perfil de utilizaccedilatildeo de fitoteraacutepicos
em farmaacutecias comunitaacuterias de Belo Horizonte sob a influecircncia da legislaccedilatildeo
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Souza Juacutenior OG Guimaratildees Neto HP Pinto NT Santos MT Carvalho RA 2002
Achados macroscoacutepicos na cavidade peritoneal de ratos apoacutes aplicaccedilatildeo do oacuteleo
de copaiacuteba Rev Par Med 16 14-18
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AG Hernaacutendez BV 2002 Antimicrobial terpenoids from the oleoresin of the
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Veiga Juacutenior VF Pinto AC Maciel MAM 2005 Plantas Medicinais Cura Segura
Quim Nova 28 (3) 51928
Veiga Juacutenior VF Rosas EC Carvalho MV Henriques MGMO Pinto AC 2007
Chemical composition and anti-inflammatory activity of copaiba oils from Copaifera
cearensis Huber ex Ducke Copaifera reticulata Ducke and Copaifera multijuga
Hayne A comparative study J Ethnopharm 112 248-254
Vieira RC Bombardiere E Oliveira JJ Lino-Juacutenior RS Brito LA Junqueira-Kipnis AP
2008 Influecircncia do oacuteleo de Copaifera langsdorffii no reparo de ferida ciruacutergica em
presenccedila de corpo estranho Pesq Vet Bras 28(8) 358-366
OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o efeito de oacuteleo-resina de copaiacuteba
(Copaifera reticulata) durante o periacuteodo gestacional em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Os objetivos especiacuteficos foram
Determinar a toxicidade oral aguda (DL50) do oacuteleo-resina de copaiacuteba em
ratos fecircmeas Wistar
Conduzir uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do oacuteleo-
resina apoacutes exposiccedilatildeo aguda oral
Avaliar os efeitos histopatoloacutegicos do oacuteleo-resina nos oacutergatildeos fiacutegado rins
e ceacuterebro de ratos durante o periacuteodo gestacional
Investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-resina de copaiacuteba no
desenvolvimento embriofetal em ratos
Os resultados do presente estudo estatildeo apresentados na forma de trecircs
trabalhos cientiacuteficos que foram preparados para publicaccedilatildeo em revistas indexadas
1 Avaliaccedilatildeo da toxicidade aguda e potencial neurotoacutexico do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (C reticulata)
Aceito para publicaccedilatildeo na ―Revista Brasileira de Farmacognosiarsquorsquo em 28 de
setembro de 2009 ISSN 0102-695X
2 Avaliaccedilatildeo histopatoloacutegica de oacutergatildeos maternos de ratos expostos ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba (C reticulata)
A ser submetido no lsquoJornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratoriallsquolsquo
ISSN 1676-2444
3 Embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina (C reticulata) de copaiacuteba em ratos
A ser submetido ao Jornal rsquoReproductive Toxicologyrsquorsquo ISSN 0890-6238
CAPIacuteTULO I
AVALIACcedilAtildeO DA TOXICIDADE AGUDA E POTENCIAL NEUROTOacuteXICO DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Camile Giaretta Sachetti1 Maria Luiza Fascineli2 Juliana Alves Sampaio1 Osmar
Alves Lameira3 Eloisa Dutra Caldas1
1 Laboratoacuterio de Toxicologia Curso de Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade de
Brasiacutelia (UnB) CEP 70910-900 Brasiacutelia DF Brasil
2 Departamento de Geneacutetica e Morfologia Universidade de Brasiacutelia CEP 70919-970
Brasilia DF
3 Laboratoacuterio de Biotecnologia Embrapa Amazocircnia Oriental CEP 66095-100 Beleacutem
PA
E-mail eloisaunbbr Tel 61- 3307 3671
Resumo O oacuteleo-resina de copaiacuteba obtido da Copaifera L Fabaceae eacute largamente
utilizado na medicina popular como antiinflamatoacuterio antimicrobiano e antitumoral
Poreacutem informaccedilotildees sobre seu potencial toacutexico satildeo escassos na literatura O objetivo
deste estudo foi estabelecer a toxicidade oral aguda e os possiacuteveis efeitos
neurotoacutexicos relacionados agrave ingestatildeo do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke
Fabaceae em ratas Wistar O estudo foi conduzido com 15 ratas nuliacuteparas
distribuiacutedas nos grupos de doses 300 e 2000 mgkg pc de oacuteleo-resina administrado
por gavagem Os resultados obtidos mostraram que nestas doses natildeo houve sinais
cliacutenicos de toxicidade ou neurotoxicidade alteraccedilatildeo no consumo de raccedilatildeo ou
alteraccedilatildeo no peso corpoacutereo A dose letal aguda foi estimada como maior que 2000
mgkg pc e classificada como categoria 5 segundo o Guia OECD 423 Estes
resultados indicam que existe uma relativa margem de seguranccedila para o uso do oacuteleo-
resina de copaiacuteba como agente terapecircutico embora estudos toxicoloacutegicos adicionais
sejam ainda necessaacuterios principalmente com a administraccedilatildeo repetida de baixas
doses
Unitermos copaiacuteba ratos toxicidade aguda neurotoxicidade
Abstract ldquoAssessment of the neurotoxic potential and acute toxicity of
copaibardquo Copaiba oil-resin obtained from Copaifera L genus Fabaceae is largely
used in popular medicine as antinflammatory antimicrobial and antitumoral
Information concerning the potential toxicity of this oil is limited in the literature The
goal of this study was to investigate the acute toxicity and the possible neurotoxic
effects related to the ingestion of Copaifera reticulata Ducke Fabaceae oil-resin using
female Wistar rats Fifteen nulliparous rats were used and distributed in the
experimental groups orally exposed to doses of 300 e 2000 mgkg bw of oil-resin
(gavage) No overt clinical signs of toxicity or neurotoxicity alteration of food
consumption or body weight were observed in the animals at the tested doses The
lethal oral toxicity was estimated to be higher than 2000 mgkg bw classified as
category 5 according to OECD Guide 423 These results indicate that there is a certain
safety margin associated with the use of copaiba as therapeutic agent although
additional toxicological studies are still necessary mainly using repeated low doses
Keywords copaiba rats acute toxicity neurotoxicity
Introduccedilatildeo
Procedimentos cliacutenicos com plantas medicinais tecircm sido largamente utilizados
desde os primoacuterdios da histoacuteria humana muitas vezes sem restriccedilotildees e de forma
indiscriminada A Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (2002) reconhece que ateacute 80 da
populaccedilatildeo de alguns paiacuteses em desenvolvimento utilizam preparaccedilotildees de plantas
medicinais para os cuidados baacutesicos da sauacutede Eacute fundamental poreacutem o
estabelecimento da seguranccedila eficaacutecia e garantia da qualidade destas preparaccedilotildees
pois seu uso inadequado sem o conhecimento toxicoloacutegico necessaacuterio pode originar
efeitos adversos retardados eou assintomaacuteticos (Vendruscolo et al 2005)
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (apud Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica
Latina e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeira ou pau dlsquooacuteleo-
resina No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste
O gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia
Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas
preparaccedilotildees medicinais eacute um exsudado do tronco destas aacutervores apresentando-se
como um liacutequido transparente cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom e
constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr
e Pinto 2002)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba pode ser encontrado nas farmaacutecias de todo o paiacutes
em diversas apresentaccedilotildees O seu uso tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et al 2007) antitumoral (Lima et
al 2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Apesar da existecircncia de estudos da accedilatildeo
terapecircutica do oacuteleo-resina de copaiacuteba os estudos de toxicidade deste produto satildeo
escassos na literatura cientiacutefica alguns destes estudos obtiveram resultados
contraditoacuterios Segundo Tisserand amp Balancs (1995) apud Cavalini et al (2005) natildeo
haacute relatos de toxicidade oral cutacircnea ou fotossensibilidade devido agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina de copaiacuteba A administraccedilatildeo de 500 mgkg peso corpoacutereo do oacuteleo-resina
(Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) em
camundongos por via oral natildeo foi relacionada a alteraccedilotildees comportamentais perda
dos reflexos a luz aumento ou diminuiccedilatildeo da ingestatildeo de aacutegua e raccedilatildeo e lesotildees ou
hemorragias no estocircmago (Gomes et al 2007) Por outro lado Souza et al (2000)
observaram que a administraccedilatildeo de 04 mL do oacuteleo-resina pela via transdiafragmaacutetica
ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados Basile et al (1988)
realizaram estudos com a copaiacuteba avaliando a atividade antiinflamatoacuteria em ratos e
observaram alguns efeitos adversos como irritaccedilatildeo gastrintestinal diarreacuteia sialorreacuteia
e depressatildeo do sistema nervoso central (SNC) Embora esse estudo sugira accedilatildeo da
copaiacuteba sobre o SNC natildeo foi encontrado ateacute o presente momento estudos que
avaliem a neurotoxicidade desta planta
O objetivo do presente estudo foi estimar a toxicidade aguda (DL50) do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratos apoacutes administraccedilatildeo oral
Adicionalmente se conduziu uma avaliaccedilatildeo preliminar do potencial neurotoacutexico do
oacuteleo-resina nesses animais
Material e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 15 ratas Wistar saudaacuteveis com idade entre 90
e 120 dias e com variaccedilatildeo maacutexima de peso de 15 (270 plusmn 41g) provenientes do
Bioteacuterio Central da Universidade de Brasiacutelia (UnB) Antes do iniacutecio do estudo os
animais foram aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB
por um periacuteodo de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de
polipropileno em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro)
temperatura (23 plusmn 2degC) e umidade relativa (70) e receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial Purinareg ad libitum O manejo e cuidado com os animais seguiram os
princiacutepios eacuteticos da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo
Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UNB
cujo protocolo experimental adotado foi previamente aprovado pelo CEUA (protocolo
aprovado ndeg773332007)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) foi fornecido
pela Embrapa Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do
Campo Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O
Campo se situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de
2o 08 14 agrave 2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de
Greenwich e altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha
(Costa et al 1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP
(Diacircmetro na Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β
cariofileno e β bisaboleno (Figura 1) foram de 454 e 123 respectivamente
(Oliveira et al 2006) A responsaacutevel pela identificaccedilatildeo da espeacutecie foi a Dra Regina
Celia Viana Martins da Silva da Embrapa Amazocircnia Oriental
Figura 1 Substacircncias presentes na C reticulata
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em soluccedilatildeo Tween 80 2 e o volume final
administrado foi fixado em 10 mLkg peso corpoacutereo Aos animais do grupo controle
foram administrados 10 mLkg de Tween 80 2 Em todos os casos a administraccedilatildeo
foi por gavagem (Figura 2)
Figura 2 Administraccedilatildeo oral via gavagem do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A toxicidade oral aguda foi realizada conforme o Guia OECD-4232001
―Toxicidade Aguda de Classe (OECD 2001) que determina as doses a serem
utilizadas no estudo (5 mgkg 50 mgkg 300 mgkg ou 2000 mgkg) e o nuacutemero de
animais por dose (3 ratas) (Figura 3) A dose inicial selecionada para o estudo foi de
300 mgkg pc definida a partir de dados de estudos preacutevios com outras espeacutecies
desta planta (Ribeiro et al 2007 Gomes et al 2007) A proacutexima dose testada foi
selecionada dependendo da mortalidade observada nas primeiras 24 horas de
exposiccedilatildeo Cada dose foi testada duas vezes e finalmente foi estimada a categoria
toxicoloacutegica segundo as especificaccedilotildees do Guia
Figura 3 Etapas para o procedimento da toxicidade aguda iniciando pela dose de 300mgkg pc e
usando 3 fecircmeas por etapa de acordo com o meacutetodo ―Toxicidade Aguda de Classe baseado no Guia
da OECD 423 2001a
Os animais ficaram em jejum por 10 horas anteriormente agrave administraccedilatildeo do
oacuteleo-resina com acesso livre apenas aacutegua e a raccedilatildeo foi permitida 3 horas apoacutes a
administraccedilatildeo O peso corporal dos animais foi verificado no dia da administraccedilatildeo da
copaiacuteba no 7deg e no 14deg dia poacutes-administraccedilatildeo Durante o periacuteodo experimental os
animais foram examinados diariamente quanto aos aspectos cliacutenicos incluindo a
postura convulsotildeestremores consistecircncia e aspecto das fezes fechamento da
paacutelpebra piloereccedilatildeo aspecto da pele e pecirclos estresse salivaccedilatildeo olhos e
comportamento
Uma hora apoacutes a administraccedilatildeo os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo
comportamental motora e sensorial para acessar os potenciais efeitos neurotoacutexicos
Os animais foram avaliados no Campo Aberto observando-se locomoccedilatildeo tempo de
parada tempo de limpeza frequumlecircncia de apoio passagem pelo quadrante central
bolos fecais (por 5 minutos) Pinccedilamento da Cauda Impressatildeo Plantar e
Endireitamento Postural (Moser et al 1997 abc) Adicionalmente foi realizada
observaccedilatildeo em Labirinto em Cruz Elevado para avaliar o potencial efeito ansioliacutetico
da copaiacuteba conduzido por 5 minutos segundo o aparato descrito por Handley e
Mithani (1984)
No 14deg dia os animais foram sacrificados em cacircmara de CO2 Durante a
necropsia os oacutergatildeos da cavidade corpoacuterea (pulmotildees traqueacuteia coraccedilatildeo estocircmago
fiacutegado baccedilo rins bexiga intestino e timo) viacutesceras glacircndulas vasos canais e
diafragma foram avaliados macroscopicamente quanto ao aspecto coloraccedilatildeo
tamanho e consistecircncia
Para detectar diferenccedilas estatiacutesticas entre os grupos experimentais foi
utilizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Dunnett com um niacutevel de significacircncia
de 5 Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad
Software InStatreg - version 30 (Motulsky 1998)
Resultados e Discussatildeo
Na menor dose testada (300 mgkg pc) nenhum dos 3 animais expostos
apresentou morbidade ou mortalidade nas primeiras 24 horas apoacutes a exposiccedilatildeo e
durante o periacuteodo do estudo Desta forma repetiu-se o teste nesta mesma dose com
outros 3 animais o que confirmou o resultado anterior O teste foi entatildeo realizado na
dose de 2000 mgkg pc onde natildeo foi verificado morbidade ou mortalidade em
nenhum dos 3 animais testados resultado confirmado na replicata realizada
utilizando-se a mesma dose Com os resultados obtidos observamos que a
toxicidade oral aguda do oacuteleo-resina de Copaifera reticulata Ducke Fabaceae eacute
maior que 2000 mgkg pc e classificado como categoria 5 segundo os criteacuterios do
protocolo experimental adotado
Os testes que avaliam a toxicidade aguda satildeo utilizados para classificar e
apropriadamente rotular substacircncias de acordo com o seu potencial de toxicidade ou
letalidade (Valadares 2006) Para que seus resultados sejam considerados pelas
agecircncias regulatoacuterias dos paiacuteses eacute essencial que estes testes sejam conduzidos
seguindo protocolos internacionalmente aceitos como aqueles publicados pela
Organizaccedilatildeo para Cooperaccedilatildeo e Desenvolvimento Econocircmico (Organization for
Economic Co-operation and Development - OECD) No presente estudo adotou-se o
Guia OECD 423 (OECD 2001) que apresenta boa reprodutibilidade usa poucos
animais e eacute capaz de classificar as substacircncias de acordo com sistemas
internacionalmente aceitos (Globally Harmonised System - GHS) O Guia 423
juntamente com os Guias 420 e 425 substituiu o de nuacutemero 401 introduzido haacute mais
de 50 anos e banido definitivamente pela OECD em 2001 Este uacuteltimo altamente
criticado pelas sociedades de proteccedilatildeo aos animais determina estatisticamente a
DL50 (dose que mata 50 da populaccedilatildeo em estudo) a partir de estudos com grupos
de animais (normalmente 20 animais de ambos sexos por grupo) expostos a doses
crescentes da substacircncia em estudo Os protocolos atualmente preconizados pela
OECD satildeo de grande aceitaccedilatildeo pelos oacutergatildeos reguladores na avaliaccedilatildeo da toxicidade
aguda para qualquer tipo de substacircncia e atende a requisitos da experimentaccedilatildeo
quanto aos princiacutepios do bem estar animal
O presente estudo foi o primeiro que avaliou a toxicidade letal aguda do oacuteleo-
resina de Copaifera reticulata em ratos Estudos publicados conduzidos com esta e
outras espeacutecies de copaiacuteba realizados em camundongos tambeacutem reportam uma baixa
toxicidade aguda desta planta Num estudo conduzido por Fernandes et al (1992)
com Copaifera cearensis camundongos foram expostos a doses de 1250 2500 3700
e 5000 mgkg pc de oacuteleo-resina (10 animais de ambos os sexosgrupo) e a DL50
estimada em 3090 mgkg pc Gomes et al (2007) estimaram a DL50 de Copaifera
reticulata e Copaifera multijuga em camundongos em 3900 mgkg pc e 4300 mgkg
pc respectivamente
No presente estudo natildeo foi observado sinais cliacutenicos de toxicidade nos animais
testados durante os 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina Tambeacutem natildeo foram
observadas diferenccedilas significativas no peso corporal (Tabela 1) ou consumo de
raccedilatildeo entre os animais das doses testadas (dados natildeo mostrados)
Tabela 1 Meacutedia do peso corporal (gramasplusmn desvio padratildeo) de ratas Wistar oralmente expostos ao
oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) nas doses de 300 e 2000 mgkg
Teste 1 Teste 2
Controle 300 mgkgpc 2000 mgkgpc 300 mgkgpc 2000 mgkgpc
Dia 0 2813plusmn15
(n=3)
2503plusmn15
(n=3)
2613plusmn64
(n=3)
2643plusmn81
(n=3)
2930plusmn89
(n=3)
Dia 7 293plusmn1
(n=3)
258plusmn85
(n=3)
2733plusmn212
(n=3)
2663plusmn117
(n=3)
3030plusmn50
(n=3)
Dia 14 293plusmn82
(n=3)
2573plusmn84
(n=3)
2790plusmn127
(n=3)
2676plusmn66
(n=3)
3050plusmn46
(n=3)
No intuito de averiguar a possiacutevel relaccedilatildeo entre a substacircncia testada e efeitos
neurotoacutexicos os animais foram avaliados quanto agrave funccedilatildeo motora sensorial e
comportamental apoacutes 1 hora da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba Para tanto
os animais foram observados no Campo Aberto no Labirinto em Cruz Elevado assim
como foram avaliados nos testes de Pinccedilamento da Cauda de Endireitamento
Postural e de Impressatildeo Plantar O teste de campo aberto eacute um dos instrumentos
mais utilizados na avaliaccedilatildeo comportamental e da funccedilatildeo motora de animais Dados
como aumento do tempo despendido na parte central do campo aberto eacute indicaccedilatildeo de
ansioacutelise locomoccedilatildeo aumentada pode ser um indicativo de um efeito estimulante
enquanto diminuiccedilatildeo da locomoccedilatildeo e da frequumlecircncia com que o animal permanece
sobre as patas traseiras eacute relatada como sedaccedilatildeo (Prut e Belzung 2003) Aleacutem disso
a ausecircncia de movimento (tempo de parada) eacute um paracircmetro utilizado como indicativo
de alto niacutevel de estresse e a defecaccedilatildeo reflete o iacutendice de emoccedilatildeo sendo relacionada
agrave ativaccedilatildeo do sistema simpatomimeacutetico (Hall 1934)
Na Tabela 2 estatildeo sumarizados os resultados obtidos nos grupos
experimentais Natildeo foram observadas alteraccedilotildees significativas dos paracircmetros
analisados entre os animais dos grupos testados e o controle natildeo indicando
portanto alteraccedilotildees neurocomportamentais nos ratas Esses resultados corroboram
aqueles reportados por Ribeiro et al (2007) que natildeo verificaram quaisquer alteraccedilotildees
no padratildeo de comportamento de roedores expostos ao oacuteleo-resina e fraccedilatildeo volaacutetil de
copaiacuteba (espeacutecie natildeo informada) em doses crescentes de 50 a 800 mgkg pc
Entretanto Brito et al (1999) observaram que a administraccedilatildeo oral de 063 mLkg do
oacuteleo-resina de copaiacuteba durante quatorze dias foi capaz de promover irritabilidade
nos ratos testados a espeacutecie de copaiacuteba testada neste estudo natildeo foi indicada pelos
autores
Tabela 2 Paracircmetros de neurotoxicidade de ratas Wistar 1 hora apoacutes administraccedilatildeo oral
de oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata)
Controle
n=3
300 mgkg
n=6
2000 mgkg
n=6
Campo aberto
Locomoccedilatildeo nordm 413plusmn96 420plusmn82 287plusmn93
Tempo de Parada (seg) 185plusmn205 297plusmn281 189plusmn174
Tempo de Limpeza (seg) 174plusmn66 169plusmn131 150plusmn91
Apoio Patas Traseiras (nordm) 203plusmn38 218plusmn62 157plusmn63
Quadrante Central (nordm) 20plusmn10 08plusmn10 07plusmn08
Bolos fecais (nordm) 07plusmn06 13plusmn15 02plusmn04
Pinccedilamento da cauda (mseg) 547plusmn127 5335plusmn8239 283plusmn81
Impressatildeo Plantar
30 cm 1006plusmn109 859plusmn94 906plusmn207
40 cm 1142plusmn86 855plusmn107 937plusmn255
Endireitamento Postural (mseg) 480plusmn17 388plusmn15 387plusmn37
Labirinto em cruz-elevada
Braccedilo Fechado (seg) 2750plusmn217 2815plusmn243 2775plusmn226
Braccedilo Aberto (seg) 00plusmn00 07plusmn12 42plusmn102
Braccedilo Fechado (nordm) 20plusmn10 25plusmn18 37plusmn30
Braccedilo Aberto (nordm) 00plusmn00 05plusmn08 03plusmn08
No 14ordm dia da administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
submetidos agrave necropsia e avaliados quanto a alteraccedilotildees macroscoacutepicas de diversos
oacutergatildeos Nenhuma alteraccedilatildeo foi encontrada nos animais testados no estudo Brito et al
(2001) reportou que a administraccedilatildeo de 063 mLkg pc em ratos por 14 dias
consecutivos estaacute relacionada a alteraccedilotildees gaacutestricas como diminuiccedilatildeo das pregas da
mucosa e diminuiccedilatildeo de vasos congestos
Conclusotildees
Os resultados de toxicidade aguda demonstraram que a administraccedilatildeo do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) natildeo causou mortalidade
eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi categorizada como
―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg pc O oacuteleo-resina
natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada pela atividade
motora sensorial e comportamental Desta maneira o oacuteleo-resina de Copaifera
reticulata apresenta uma relativa margem de seguranccedila para a utilizaccedilatildeo como
agente terapecircutico embora outros estudos sejam necessaacuterios para o estabelecimento
da sua eficaacutecia terapecircutica sem o acometimento de efeitos colaterais principalmente
apoacutes a exposiccedilatildeo repetida a baixas doses
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CAPIacuteTULO II
AVALIACcedilAtildeO HISTOPATOLOacuteGICA DE OacuteRGAtildeOS MATERNOS DE RATOS
EXPOSTOS AO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA)
Introduccedilatildeo
A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais eacute uma terapecircutica milenar As observaccedilotildees
tradicionais sobre o uso e a eficaacutecia de plantas medicinais contribuem de forma
relevante para a divulgaccedilatildeo das suas virtudes terapecircuticas e pelos efeitos medicinais
que produzem apesar de muitas vezes natildeo terem seus constituintes quiacutemicos
conhecidos bem como a avaliaccedilatildeo da toxicidade
A copaiacuteba eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no
Brasil (Veiga Jr et al 2002) Satildeo aacutervores nativas da regiatildeo tropical da Ameacuterica Latina
e Aacutefrica Ocidental popularmente conhecida como copaibeiras ou pau dlsquooacuteleo-resina
No Brasil satildeo encontradas facilmente nas regiotildees Amazocircnica e Centro-oeste O
gecircnero Copaifera L pertence agrave famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae
Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-resina utilizado nas preparaccedilotildees medicinais eacute
um exsudado do tronco destas aacutervores e apresenta-se como um liacutequido transparente
cuja coloraccedilatildeo varia do amarelo ao marrom Satildeo constituiacutedos principalmente por
misturas de sesquiterpenos e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002)
O uso do oacuteleo-resina de copaiacuteba tem sido indicado entre outros pela sua accedilatildeo
antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Jr et al 2007) antitumoral (Lima et al
2003) antimicrobiana (Santos et al 2008 Tincusi et al 2002) e atividade
antinociceptiva (Gomes et al 2007) Embora haja estudos mostrando algumas das
atividades terapecircuticas do oacuteleo-resina natildeo existem trabalhos que avaliem seu
potencial toacutexico nos oacutergatildeos maternos durante o periacuteodo gestacional Nesse periacuteodo
os mecanismos metaboacutelicos de alguns oacutergatildeos os tornam mais susceptiacuteveis a lesotildees
Desta forma o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos histopatoloacutegicos da
toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) no fiacutegado rins e ceacuterebro
de ratas Wistar durante o periacuteodo gestacional
Materiais e Meacutetodos
O experimento foi realizado com 40 fecircmeas Wistar com idade entre 90 e 120
dias e peso de 2511 plusmn 193 g (meacutediaplusmnDP) provenientes do Bioteacuterio Central da
Universidade de Brasiacutelia (UnB) estando aparentemente todos saudaacuteveis
Anteriormente agrave administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba os animais foram
aclimatados no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo
de 15 dias Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno
em condiccedilotildees controladas de luminosidade (12h12h claroescuro) temperatura (23 plusmn
2degC) e umidade relativa (70) Os animais receberam aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo comercial
Purinareg Grupo Evialis SP Brasil ad libitum O protocolo experimental foi
previamente aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso Animal da UnB (protocolo
aprovado ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs ratas foram transferidas para a gaiola de um macho
durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
cruzamento somente foi confirmado apoacutes verificaccedilatildeo da presenccedila de ceacutelulas
corneificadas e espermatozoacuteides no esfregaccedilo vaginal e esse foi considerado o dia
zero de gestaccedilatildeo
Apoacutes a confirmaccedilatildeo da prenhes as fecircmeas foram pesadas alojadas em caixas
individuais e distribuiacutedas aleatoriamente em 4 grupos de 10 animais cada Controle
500 mgkg 1000 mgkg e 1250 mgkg O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo em
soluccedilatildeo Tween 80 agrave 2 e o volume final administrado foi fixado em 10 mLkg peso
corpoacutereo Aos animais do grupo controle foi administrado 10 mLkg de Tween 80 2
O oacuteleo-resina de copaiacuteba foi administrado diariamente a partir do 6deg dia de gestaccedilatildeo
cobrindo o periacuteodo de implantaccedilatildeo do embriatildeo organogecircnese e o crescimento dos
oacutergatildeos fetais (19deg dia de gestaccedilatildeo)
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20 m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β cariofileno e β
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade incluindo mas natildeo se limitando a estresse
hipoatividade respiraccedilatildeo acelerada irritaccedilatildeo tremores musculares piloereccedilatildeo
cromodacriorreacuteia convulsotildees respiraccedilatildeo abdominal salivaccedilatildeo lacrimejamento
diarreacuteia perda de pecirclo e hemorragia vaginal O peso corporal e o consumo de raccedilatildeo
foram registrados a cada 3 dias
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas prenhes foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de
CO2 As cavidades abdominais foram abertas por incisatildeo longitudinal e o fiacutegado rins
direito e esquerdo e ceacuterebro foram examinados macroscopicamente e posteriormente
pesados Fragmentos dos oacutergatildeos foram fixados em formol 10 tamponado
diafinizados e submetidos a inclusatildeo em parafina Cortes de 5 μm de espessura
obtidos em microacutetomo (marca Leica modelo RM2125 RT) foram corados pela
Hematoxicilina-Eosina (HE) e avaliados em microscopia de luz
Os dados de peso e raccedilatildeo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis
seguido de Mann-Whitney com niacutevel de significacircncia plt005
Resultados e Discussatildeo
A Tabela 1 mostra os sinais cliacutenicos de toxicidade observados nos animais
durante o periacuteodo do estudo tanto no grupo controle quanto nos grupos expostos Os
sinais cliacutenicos observados natildeo apresentaram relaccedilatildeo com a dose de copaiacuteba
administrada A piloereccedilatildeo diarreacuteia e cromodacriorreacuteia (Figura 1) foram
provavelmente resultado do stress imposto aos animais durante a manipulaccedilatildeo
Ribeiro et al (2007) tambeacutem natildeo observou nenhum sinal cliacutenico adverso em ratos
machos e fecircmeas expostos a dose uacutenica de oacuteleo-resina de copaiacuteba (espeacutecie natildeo
determinada) (ateacute 800 mgkg) Por outro lado a administraccedilatildeo uacutenica por meio de
enema de 05 mLkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba apoacutes colite induzida por aacutecido
aceacutetico ocasionou diarreacuteia piloereccedilatildeo e hemorragia nos animais tratados (Souza et
al 2000)
Tabela 1 Sinais cliacutenicos de toxicidade observados durante o periacuteodo gestacional em ratos Wistar expostas agrave copaiacuteba
Sinais
Cliacutenicos
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Diarreacuteia 310 (30) 210 (20) 410 (40) 410 (40)
Piloereccedilatildeo 010 (0) 010 (0) 210 (20) 010 (0)
Cromodacriorreacuteia 210 (20) 310 (30) 210 (20) 410 (40)
() percentual de animais apresentando determinado sinal cliacutenico de toxicidade
Figura 1 Rata apresentando cromodacriorreacuteia no olho direito verificado no 19deg dia de gestaccedilatildeo na dose de 500 mgkg
A evoluccedilatildeo do peso materno estaacute mostrada na Tabela 2 Diminuiccedilotildees
significativas no peso corpoacutereo materno foram observadas nos grupos 1000 mgkg e
1250 mgkg pc em relaccedilatildeo ao grupo controle ao longo do periacuteodo gestacional
(DG20-DG6 e DG20-DG0) Quando se considerou o peso corrigido materno
DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] tambeacutem foram observadas
diferenccedilas significativas entre as maiores doses do oacuteleo-resina de copaiacuteba Na dose
de 500 mgkg natildeo se verificou qualquer alteraccedilatildeo relacionada ao ganho de peso
Tabela 2 Dados de peso materno de ratas Wistar expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao
19ordm dia de gestaccedilatildeo
Grupo
controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
Tratamento 500 1000 1250
DG 0 2505 plusmn 181 2558 plusmn 183 2600 plusmn 162 2381 plusmn 196
DG 20 3618 plusmn 170 3670 plusmn 219 3433 plusmn 310 3292 plusmn 278
DG 6 ndash DG 0 187 plusmn 87 248 plusmn 107 212 plusmn 97 255 plusmn 647
DG 20 ndash DG 6 926 plusmn 141 864 plusmn 149 621 plusmn 237 656 plusmn 193
DG 20 ndash DG 0 1113 plusmn 130 1112 plusmn 230 833 plusmn 313 911 plusmn 168
DPeso 459 plusmn 109 385 plusmn 196 269 plusmn 259 290 plusmn 162
DG0 1deg dia de gestaccedilatildeo DG20 20deg dia de gestaccedilatildeo DG 6 6deg dia de gestaccedilatildeo DPeso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero] Todos os resultados foram expressos como meacutedia plusmn desvio padratildeo Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Verificou-se uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo a partir do dia 9deg de gestaccedilatildeo no grupo de maior dosagem (Figura 2)
Figura 2 Mediana do consumo de raccedilatildeo de ratas Wistar expostas a copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo (DG) Diferenccedilas estatiacutesticas em relaccedilatildeo ao grupo controle foram encontradas utilizando o teste de Kruskal-Wallis seguido de Mann-Whitney (ple005)
Gomes et al (2007) natildeo encontraram qualquer alteraccedilatildeo no consumo de aacutegua
ou raccedilatildeo por camundongos durante cinco dias apoacutes a dosagem via oral uacutenica com
500 mgkg (Copaifera multijuga Hayne e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae) Por
outro lado Souza et al (2002) verificaram nos dois primeiros dias um menor
consumo de raccedilatildeo bem como maior perda ponderal ateacute o 4ordm dia do experimento apoacutes
infusatildeo de 05 mLkg de C multijuga Hayne na cavidade peritoneal de ratos
esclarecendo ser possivelmente pela toxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba absorvido
pela superfiacutecie peritoneal Um estudo em ratos com Elephantorrhiza elephantina
tambeacutem da famiacutelia Fabaceae foi realizado para determinar a toxicidade desta planta
Machos e fecircmeas foram divididos em quatro grupos consistindo de cinco ratos cada e
administrou-se doses de 200-1600mgkg pc 200-800mgkg pc e 50-400mgkg pc
para toxicidade aguda (1 dia) sub-aguda (14 dias) e crocircnica (35 dias)
respectivamente Natildeo foram observadas mortes nos grupos nem alteraccedilotildees no
consumo de aacutegua e raccedilatildeo (Maphosa et al 2010)
A meacutedia do peso relativo ( peso relativo dos oacutergatildeos = peso absoluto do
oacutergatildeo peso materno x 100) do fiacutegado rim e ceacuterebro satildeo apresentadas na Figura 3
Diferenccedilas significativas foram encontradas no peso do fiacutegado dos animais tratados
(500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg) em relaccedilatildeo ao grupo controle Paumgartten et
al (1998) investigou os efeitos da administraccedilatildeo oral do monoterpeno β-myrcene nas
doses de 0 100 300 and 500 mgkg em ratos Metade das fecircmeas do estudo recebeu
o monoterpeno 21 dias anterior ao acasalamento durante o acasalamento e gestaccedilatildeo
e no 21deg foi realizada a cesaacuterea Natildeo foram observados sinais de toxicidade materna
durante o estudo entretanto um pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi
verificado Essa alteraccedilatildeo foi explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor
da monooxigenase hepaacutetica e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada
hipertrofia do retiacuteculo endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas
microssomais nos animais tratados
Figura 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos fiacutegado rim e ceacuterebro de ratas
Wistar expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo
Natildeo foram verificadas alteraccedilotildees macroscoacutepicas nos oacutergatildeos (fiacutegado rins e
ceacuterebro) das ratas Jaacute a anaacutelise histoloacutegica dos oacutergatildeos revelou alguns achados
microscoacutepicos no fiacutegado como demonstrados na Tabela 3 entretanto os resultados
natildeo foram estatisticamente diferentes entre o grupo controle e os grupos expostos a
copaiacuteba Essa anaacutelise eacute importante jaacute que vaacuterias doenccedilas hepaacuteticas podem ocorrer
durante a gravidez trazendo seacuterias consequumlecircncias para a matildee e o feto A alteraccedilatildeo
morfoloacutegica no fiacutegado encontrada em todos os grupos foi uma discreta degeneraccedilatildeo
hidroacutepica (Figura 4) caracterizada pelo acuacutemulo de aacutegua no citoplasma que se tornou
mais volumoso e paacutelido com nuacutecleos normalmente posicionados Esse achado natildeo eacute
evidecircncia de toxicidade para o fiacutegado visto que se a copaiacuteba fosse realmente toacutexica a
degeneraccedilatildeo seria mais intensa e aleacutem disso apoptose e necrose de hepatoacutecitos
seriam evidenciadas
Figura 4 Discreta degeneraccedilatildeo hidroacutepica (setas) no fiacutegado do rim de um animal exposto a
1000mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba (HE 100X)
Nos grupos expostos a 1000 mgkg e 1250 mgkg verificou-se uma discreta
esteatose (Figura 5) em 1 e 2 animais respectivamente caracterizado por acuacutemulo
de lipiacutedios histologicamente visiacuteveis no citoplasma dos hepatoacutecitos Todas as
alteraccedilotildees histopatoloacutegicas verificadas nos oacutergatildeos foram muito discretas Brito et al
(2000) estudaram os efeitos microscoacutepicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba no fiacutegado de
ratos machos Os animais expostos a copaiacuteba receberam doses de 063 mLkg pc
administradas via oral por 14 dias e os resultados obtidos natildeo demonstraram
alteraccedilotildees hepatocelulares poreacutem foi verificada congestatildeo vascular nas veias portais
e centrolobulares
Figura 5 Discreta esteatose (setas) no fiacutegado de rato exposto a 1250 mgkg de copaiacuteba (HE
100X)
No presente trabalho natildeo foram encontrados qualquer alteraccedilatildeo significativa no
rim dos animais expostos a copaiacuteba Brito et al (2005) avaliaram o efeito do oacuteleo-
resina de copaiacuteba (063 mLkg via oral de C multijuga Hayne) nos niacuteveis seacutericos de
ureacuteia e creatinina em ratas Wistar (n=18) submetidas agrave siacutendrome de isquemia e
reperfusatildeo renal Observou-se que o oacuteleo-resina de copaiacuteba diminuiu os niacuteveis
seacutericos de ureacuteia em 24 horas e 48 horas e os de creatinina nas 48 horas apoacutes o
procedimento de isquemia Tais achados demonstraram que a administraccedilatildeo preacutevia
por sete dias agrave isquemia e reperfusatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba por gavagem
protegeu a funccedilatildeo renal dos animais nas 48 horas apoacutes a isquemia e reperfusatildeo
Tabela 3 Anaacutelise histopatoloacutegica dos oacutergatildeos fiacutegado e rins de ratas expostos a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo Resultados expressos em de animais com alteraccedilatildeo (n=10)
Tratamento
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fiacutegado
Degeneraccedilatildeo Hidroacutepica 90 90 80 80
Esteatose 0 0 10 20
Rim
Infiltrado de mononucleares 10 20 0 0
Conclusatildeo
Poucos trabalhos estatildeo disponiacuteveis em relaccedilatildeo a toxicidade ao oacuteleo-resina de
copaiacuteba e nem todos trazem as informaccedilotildees necessaacuterias o que gera resultados
inconsistentes e controversos principalmente pela biodiversidade entre as espeacutecies
dessa planta O presente estudo visou contribuir com informaccedilotildees acerca do uso do
oacuteleo-resina da Copaifera reticulata durante o periacuteodo gestacional Os resultados
demonstram toxicidade materna em altas doses (1000 mgkg e 1250mgkg)
evidenciada pela diminuiccedilatildeo no ganho de peso corpoacutereo e diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo Entretanto natildeo foi encontrada qualquer alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa
no fiacutegado rim e ceacuterebro dos animais expostos a copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila
relativa do oacuteleo-resina quando utilizado durante a gestaccedilatildeo Estudos adicionais
devem ser realizados a fim de avaliar mais dados a respeito da ingestatildeo do oacuteleo-
resina visando tambeacutem a interaccedilatildeo materno-fetal
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Dr Osmar Alves Lameira da Embrapa Oriental por fornecer
o oacuteleo-resina de copaiacuteba
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CAPIacuteTULO III
EMBRIOFETOTOXICIDADE DO OacuteLEO-RESINA DE COPAIacuteBA (C RETICULATA) EM RATOS
Introduccedilatildeo
Conhecida popularmente como copaiacuteba o gecircnero Copaifera L pertence agrave
famiacutelia Fabaceae Lindl sub famiacutelia Caesalpinioideae Kunth (Veiga Jr e Pinto 2002)
e eacute uma das plantas com uso medicinal mais utilizada e conhecida no Brasil O uso
tradicional levou a uma intensa comercializaccedilatildeo da copaiacuteba como oacuteleo-resina ou em
caacutepsulas do oacuteleo-resina in nature e vem sendo exportado do Brasil principalmente
para Franccedila Alemanha Inglaterra e Estados Unidos (Veiga Jr e Pinto 2002) O oacuteleo-
resina eacute constituiacutedo principalmente por misturas de sesquiterpenos e diterpenos
(Veiga Jr e Pinto 2002) e vaacuterias de suas propriedades terapecircuticas vecircm sendo
estudadas incluindo sua accedilatildeo antiinflamatoacuteria (Carvalho et al 2005 Veiga Juacutenior et
al 2007) antitumoral (Lima et al 2003) antimicrobiana (Tincusi et al 2002)
antinociceptiva (Gomes et al 2007) antioxidante (de Lima Silva et al 2009) e
antiparasitaacuteria (Santos et al 2008)
Em mamiacuteferos a funccedilatildeo materna normal eacute indispensaacutevel para o
desenvolvimento adequado dos fetos e para a sauacutede da prole e a exposiccedilatildeo a
xenobioacuteticos durante a gestaccedilatildeo pode causar efeitos adversos no desenvolvimento
fetal (Chahoud 1999) Apesar da extensa utilizaccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba pelas
suas propriedades farmacoloacutegicas poucos estudos mostram o potencial toacutexico do
produto e natildeo haacute dados da toxicidade do desenvolvimento que comprovem a
seguranccedila da utilizaccedilatildeo desta planta por gestantes Cunha et al (2003) reportaram
propriedades de relaxamento uterino do diterpeno aacutecido caurenoacuteico da Copaifera
langsdorffii em ratos causados principalmente atraveacutes do bloqueio de caacutelcio e em
parte pela abertura dos canais de potaacutessio ATP-sensiacuteveis
O presente estudo foi realizado para investigar o potencial efeito toacutexico do oacuteleo-
resina de copaiacuteba no desenvolvimento embriofetal em ratos Wistar
Materias e Meacutetodos
O presente estudo foi desenvolvido de acordo com o OECDs Guideline for the
Testing of Chemicals ndash ndeg 414 ―Prenatal Developmental Toxicity Study (Adopted
22nd January 2001)
Animais
O experimento foi realizado com ratos machos e fecircmeas nuliacuteparas Wistar com
idade entre 90 e 120 dias provenientes do Bioteacuterio Central da Universidade de
Brasiacutelia (UnB) Anteriormente ao iniacutecio do experimento os animais foram aclimatados
no bioteacuterio na Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da UnB por um periacuteodo de 15 dias
Os animais foram alocados individualmente em caixas de polipropileno e cama de
maravalha de pinho branco esterelizada em autoclave e em condiccedilotildees de ambiente
controladas (luminosidade de 12h12h claroescuro temperatura de 23 plusmn 2degC e
umidade relativa de 70) Os animais receberam ad libitum aacutegua potaacutevel e raccedilatildeo
comercial (Labina Proteiacutena bruta 23 Extrato eteacutereo 4 Mateacuteria fibrosa 5
Mateacuteria mineral 10 Caacutelcio 13 Foacutesforo 085) registrada no Ministeacuterio da
Agricultura SP-0311730758 e fornecida pela Purinareg Grupo Evialis
PauliniaSPBrasil O manejo e cuidados com os animais seguiram os princiacutepios eacuteticos
da experimentaccedilatildeo animal segundo criteacuterios estabelecidos pelo Comitecirc de Eacutetica no
Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciecircncias Bioloacutegicas da UnB (protocolo aprovado
ndeg773332007)
Para o acasalamento trecircs fecircmeas foram transferidas para a caixa de um
macho durante as trecircs uacuteltimas horas do periacuteodo escuro (6 agraves 9 horas da manhatilde) O
dia em que as fecircmeas apresentaram espermatozoacuteides e ceacutelulas corneificadas no
esfregaccedilo vaginal foi designado como dia 0 de gestaccedilatildeo
Tratamento
O oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) foi fornecido pela Embrapa
Amazocircnia Oriental sendo um pool de amostras extraiacutedas de plantas do Campo
Experimental do Mojuacute PA entre setembro de 2003 a agosto de 2004 O Campo se
situa no km 30 da rodovia PA-150 entre as coordenadas geograacuteficas de 2o 08 14 agrave
2o 12 26 de latitude sul e 48o 47 34 agrave 48o 14 de longitude a oeste de Greenwich e
altitude de 16 m possuindo uma aacuterea total aproximada de 1095 ha (Costa et al
1998) As plantas possuiacuteam cerca de 20m de altura 260 cm de DAP (Diacircmetro na
Altura do Peito) e mais de 20 anos de idade As concentraccedilotildees de β-cariofileno e β-
bisaboleno foram de 454 e 123 respectivamente (Oliveira et al 2006)
O extrato-bruto do oacuteleo-resina de copaiacuteba foi diluiacutedo diariamente em Tween 80
2 e administrado por via oral (gavagem gaacutestrica) do 6ordm ao 19ordm dia de gestaccedilatildeo nas
seguintes concentraccedilotildees 500mgkg 1000mgkg e 1250mgkg (25 animais por grupo)
conforme definido no teste piloto descrito posteriormente O volume final administrado
foi 10 mLkg pc O grupo controle recebeu apenas o veiacuteculo (Tween 80 2)
Durante todo o tratamento as fecircmeas foram examinadas diariamente quanto
ao aparecimento de sinais de toxicidade materna Qualquer variaccedilatildeo foi devidamente
registrada e o animal foi rigorosamente acompanhado O peso corporal e o consumo
de raccedilatildeo foram registrados a cada 3 dias
Cesaacuterea
No 20ordm dia de gestaccedilatildeo as fecircmeas foram sacrificadas por inalaccedilatildeo de CO2 As
cavidades abdominais foram abertas por uma ampla incisatildeo longitudinal o uacutetero foi
pesado com todo seu conteuacutedo e os oacutergatildeos foram examinados macroscopicamente
O nuacutemero de fetos vivos e mortos reabsorccedilotildees e os corpos luacuteteos foram registrados
O nuacutemero de siacutetios de implantaccedilatildeo foi determinado pelo meacutetodo de Salewski (1964)
que consiste na imersatildeo do uacutetero (sem os fetos) em soluccedilatildeo de sulfeto de amocircmio a
10 durante 10 minutos em seguida o uacutetero eacute lavado em aacutegua corrente e
mergulhado por 10 minutos em soluccedilatildeo formada por partes iguais de ferrocioneto de
potaacutessio a 20 e aacutecido cloriacutedrico a 1 Os siacutetios de implantaccedilatildeo que aparecem
escuros na parede uterina satildeo localizados e contados Todos os fetos vivos e suas
respectivas placentas foram imediatamente pesados e examinados quanto a
presenccedila de anomalias externamente visiacuteveis Metade de cada ninhada escolhidos
aleatoriamente foi fixada em soluccedilatildeo de Bodian (5 de aacutecido aceacutetico glacial 2 de
formaldeiacutedo 37 72 de etanol 95 21 de aacutegua destilada) e avaliado para
anomalias viscerais usando a teacutecnica de microdissecccedilatildeo descrita em Miranda et al
(2006) Os oacutergatildeos dos fetos coraccedilatildeo timo pulmatildeo baccedilo rins e pulmotildees tambeacutem
foram pesados A outra metade da ninhada foi fixada em 5 soluccedilatildeo formol
macerados em hidroacutexido de potaacutessio clarificados com soluccedilatildeo de
glicerinaetanolaacutelcool benziacutelico e corados com Alizarina Red S para avaliaccedilatildeo do
esqueleto (Dawson 1926)
Teste Piloto
Para definiccedilatildeo das dosagens do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizadas no presente
estudo realizou-se inicialmente um estudo de toxicidade aguda seguindo o OECDs
Guideline for the Testing of Chemicals ndash ndeg 423 ―Acute Oral Toxicity ndash Acute Toxic
Class Method (orientaccedilotildees atualizadas adotadas em 17 de dezembro de 2001) A
dose letal aguda foi estimada como maior que 2000 mgkg pc (Sachetti et al 2009)
Realizou-se um estudo piloto para determinar as dosagens para a realizaccedilatildeo
do estudo de toxicidade no desenvolvimento preacute-natal seguindo o ―Pilot Study for
Prenatal Developmental Toxicity in Rats (OECD 414) Para a realizaccedilatildeo do piloto
foram utilizados 4 grupos (N = 5 animaisgrupo) Controle (Tween 80 2) 500 1000
1500mgkg de peso corporal diluiacuteda em Tween 80 2 O volume administrado de 10
mLkg pc para todos os grupos
Anaacutelise estatiacutestica
Os dados reprodutivos bem como peso materno e consumo de raccedilatildeo foram
analisados pelo teste natildeo-parameacutetrico de KruskalndashWallis seguido de MannndashWhitney
As alteraccedilotildees esqueleacuteticas e viscerais foram analisadas pelo teste do Qui-quadrado
todos com niacutevel de significacircncia de plt005
Resultados
Teste piloto
Devido a inconsistecircncia de dados encontrados em estudos jaacute realizados no que
tange a dosagem da copaiacuteba aleacutem da diversidade entre espeacutecies bem como a
variabilidade das espeacutecies animais (roedores e natildeo roedores) foi necessaacuterio realizar
um teste piloto para estabelecer as doses a serem empregadas no experimento As
diretrizes preconizam que o limite superior do intervalo de doses seja suficientemente
alto para produzir alguma toxicidade materna (natildeo mais que 10 de mortalidade) ou
toxicidade para o embriatildeo e o limite inferior deste intervalo seja uma dose proacutexima da
dose terapecircutica e que natildeo cause efeitos embriotoacutexicos (OECD ndeg 414 2001) No
teste piloto 3 animais morreram no grupo que recebeu a dosagem de 1500mgkg pc
do oacuteleo-resina de copaiacuteba no 14deg 14deg e 18deg dia de gestaccedilatildeo sendo necessaacuterio
repetir o estudo com uma dosagem intermediaacuteria de 1250mgkg Nessa dose os
animais apresentaram alguma toxicidade mas natildeo mortalidade (dados natildeo
mostrados) Desta forma o grupo de maior dose foi definido em 1250mgkg
Toxicidade Materna
O percentual de fecircmeas prenhestratadas eacute apresentado na Tabela 1
apresentando semelhanccedila entre os grupos quanto ao nuacutemero de animais Todos os
animais sobreviveram tanto no grupo controle quanto no grupo exposto ao oacuteleo-
resina de copaiacuteba e nenhuma alteraccedilatildeo comportamental durante o estudo foi
evidenciada Os sinais cliacutenicos de toxicidade materna encontrados nos animais estatildeo
mostrados na Tabela 1 natildeo se observando qualquer diferenccedila entre o grupo controle
e expostos a copaiacuteba A avaliaccedilatildeo dos oacutergatildeos maternos durante a cesaacuterea natildeo
apresentou nenhuma alteraccedilatildeo patoloacutegica externamente visiacutevel nos animais controle
e expostos a copaiacuteba
Houve uma diminuiccedilatildeo significativa no consumo de raccedilatildeo pelos animais a partir
do 9deg dia de gestaccedilatildeo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg em relaccedilatildeo ao grupo
controle (Figura 1) Esta diminuiccedilatildeo induziu uma perda significativa no ganho de peso
corpoacutereo durante a gravidez (DG20 ndash DG0) e no periacuteodo de tratamento (DG20-DG6)
nas duas maiores doses Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas no peso do
uacutetero graviacutedico entre os grupos Uma reduccedilatildeo estatisticamente significativa no ganho
de peso [(Peso Final menos Peso Inicial) menos Peso do Uacutetero] foi observada nas
doses de 1000mgkg e 1250mgkg
Verificou-se um aumento no peso relativo (peso do oacutergatildeo em relaccedilatildeo ao peso
corpoacutereo) do fiacutegado em todos os grupos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba (Tabela
1) Houve tambeacutem um aumento no peso relativo dos rins direito e esquerdo nas doses
de 500mgkg e 1000mgkg O ceacuterebro tambeacutem apresentou um aumento no peso
relativo nos grupos 1000mgkg e 1250mgkg
Tabela 1 Resultados das avaliaccedilotildees maternas do grupo controle e expostas a copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mkg pc)
500 1000 1250
Fecircmeas Tratadas 25 25 25 25
Fecircmeas Prenhes 22 23 22 24
Fecircmeas PrenhesTratadas
88 92 88 96
Sinais Cliacutenicos de Toxicidade
b
Cromodacriorreacuteia 3 5 3 7
Hemorragia Vaginal 0 0 1 0
Diarreacuteia 7 7 9 10
Piloereccedilatildeo 0 0 3 1
Peso Materno (g)
Dia 0 2507plusmn219 2579plusmn156 2547plusmn186 2378plusmn200
Dia 20 3626plusmn202 3753plusmn226 3333plusmn318 3270plusmn314
Ganho Peso Materno (g)
Dia 6 - Dia 0 209plusmn92 227plusmn84 226plusmn82 236plusmn62
Dia 20 - Dia 0 910plusmn123 947plusmn194 560plusmn262 655plusmn206
Dia 20 - Dia 6 1119plusmn151 1174plusmn216 786plusmn306 891plusmn198
Peso Uacutetero Graviacutedico (g) 671plusmn97 758plusmn118 605plusmn123 604plusmn126
D Pesoa
447plusmn134 407plusmn174 196plusmn249 287plusmn157
Peso Relativo dos oacutergatildeos (g)
Fiacutegado 403plusmn029 464plusmn033 521plusmn060 519plusmn045
Ceacuterebro 049plusmn003 047plusmn004 055plusmn006 054plusmn005
Rim Direito 027plusmn002 029plusmn005 030plusmn002 029plusmn003
Rim Esquerdo 025plusmn002 027plusmn003 029plusmn003 027plusmn002
aD Peso=[(Peso Final ndash Peso Inicial) ndash Peso do Uacutetero]
b Nuacutemero de fecircmeas apresentando algum sinal cliacutenico de toxicidade ao menos uma vez durante o
tratamento Os dados foram apresentados como Meacutedia plusmn Desvio Padratildeo O ganho de peso materno foi analisado pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest Os outros paracircmetros foram analisados por ANOVA e Dunnett t (2-sided)
a
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt001
Figura 1 Mediana do consumo de raccedilatildeo das fecircmeas expostas ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo DG Dia de gestaccedilatildeo Os valores foram analisados pelo teste Kruskal-Wallis seguido de Mann- Whitney Utest significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005
Embriofetotoxicidade
A Tabela 2 mostra os paracircmetros de toxicidade reprodutiva e embriotoxicidade
avaliados no estudo A meacutedia do nuacutemero de corpos luacuteteos e os siacutetios de implantaccedilatildeo
por fecircmea para todos os grupos expostos a copaiacuteba natildeo apresentaram diferenccedila
significativa em relaccedilatildeo ao grupo controle Tambeacutem natildeo houve diferenccedila no nuacutemero
de reabsorccedilotildees entre grupo controle e expostos ao oacuteleo-resina Natildeo houve reduccedilatildeo
no nuacutemero de fetos vivos (Figura 2) das fecircmeas tratadas e a meacutedia do peso da
placenta por ninhada apresentou valores semelhantes entre todos os grupos
Entretanto a meacutedia do peso corpoacutereo fetal por ninhada foi reduzida nos grupos
tratados com 1000mgkg e 1250mgkg sugerindo-se um retardo no crescimento fetal
nas maiores doses A razatildeo entre o nuacutemero de fetos fecircmeas e machos (Tabela 2) dos
grupos tratados foi similar agravequela do grupo controle indicando que ambos os sexos
respondem com igual susceptibilidade agrave exposiccedilatildeo preacute-natal ao copaiacuteba
Figura 2 Fetos vivos apoacutes realizaccedilatildeo da cesaacuterea no 19deg dia de gestaccedilatildeo
Tabela 2 Embriofetotoxicidade das fecircmeas expostas oralmente ao oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg
dia de gestaccedilatildeo
Copaiacuteba (mgkg pc)
TRATAMENTO Grupo Controle 500 1000 1250
Corpos Luacuteteos (meacutediaplusmnSD) 1414plusmn125 1541plusmn174 1448plusmn169 1443plusmn183
Siacutetios de Implantaccedilatildeo
Total (N) 282 308 268 286
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1282plusmn153 1395plusmn170 1276plusmn234 1243plusmn306
Reabsorccedilotildees
Total (N) 16 7 16 20
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 073plusmn098 032plusmn078 071plusmn084 078plusmn099
Precoce (N) 16 7 15 19
Tardia (N) 0 0 1 1
Fetos Mortos (N) 0 1 0 0
Fetos Vivos
Total (N) 266 300 252 266
N por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 1209plusmn174 1364plusmn167 1200plusmn241 1156plusmn273
Peso Corpoacutereo Fetal (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 375plusmn025 378plusmn047 335plusmn05 348plusmn034
Peso Placenta (g)
Por Ninhada (meacutediaplusmnSD) 049plusmn003 049plusmn004 047plusmn006 048plusmn006
FecircmeasMachos 136130 156144 134118 137129
Razatildeo 105 108 113 106
N (nuacutemero) foram comparados pelo teste Chi-Square Os dados apresentados como meacutedia plusmn Desvio Padratildeo foram analisado pelo teste ANOVA seguido do teste de Dunnett t (2-sided)
a ()
significativamente diferente em relaccedilatildeo ao Grupo Controle plt005 Reabsorccedilotildees foram classificadas como Precoce siacutetios de implantaccedilatildeo detectados aonde natildeo haacute nenhum feto ou fetoplacenta remanescente Tardia eacute possiacutevel a discriminaccedilatildeo entre os resiacuteduos do feto e placenta
Ao se considerar a meacutedia do peso relativo dos oacutergatildeos fetais por ninhada
(Tabela 3) natildeo se constatou qualquer alteraccedilatildeo estatisticamente significativa quando
comparados todos os grupos
Tabela 3 Meacutedia do peso relativo () dos oacutergatildeos dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
(500 1000 e 1250 mgkg) do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Peso Fetal (g)
39192plusmn03648 39342plusmn05178 35160plusmn05515 35417plusmn03748
Rim Direito ()
02530plusmn00250 02543plusmn00231 02529plusmn00243 02460plusmn00224
Rim Esquerdo ()
02394plusmn00202 02411plusmn00305 02408plusmn00238 02308plusmn00236
Fiacutegado ()
88409plusmn07056 86787plusmn10281 86614plusmn08984 86347plusmn11248
Baccedilo ()
01123plusmn00171 01229plusmn00250 01120plusmn00205 01143plusmn00175
Timo ()
01212plusmn00149 01218plusmn00276 01112plusmn00219 01089plusmn00145
Coraccedilatildeo ()
04751plusmn00528 04942plusmn00473 04641plusmn00549 04658plusmn00540
Pulmatildeo () 23062plusmn02274 23724plusmn02098 24146plusmn02217 23378plusmn02641
Os valores satildeo meacutedia plusmn desvio padratildeo () Peso Relativo dos oacutergatildeos (peso absoluto do oacutergatildeo (x 100) peso fetal) Para a anaacutelise dos pesos relativos foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste U de Mann-Whitney A diferenccedila foi considerada como estatisticamente significativa quando plt005 Em toda a anaacutelise utilizou-se a ninhada como unidade de medida Natildeo foram observadas diferenccedilas significativas em nenhum dos oacutergatildeos quando considerado grupo controle em relaccedilatildeo aos expostos ao oacuteleo-resina de copaiacuteba
Natildeo foi encontrada diferenccedila significativa entre o grupo controle e os fetos
expostos a copaiacuteba quanto a frequecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis
(Tabela 4) Entretanto as avaliaccedilotildees viscerais demonstraram diferenccedila significativa
mas natildeo dose dependente na dilataccedilatildeo do ureter direito e esquerdo nas doses de
500 e 1250mgkg (Figura 3 e 4) Uma significativa diferenccedila tambeacutem foi encontrada
no ureter direito que apresentou-se tortuoso na dose de 500mgkg do oacuteleo-resina de
copaiacuteba (Tabela 4)
Tabela 4 Ocorrecircncia de anormalidades externamente visiacuteveis e viscerais dos fetos expostos in utero
ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Anormalidades externamente visiacuteveis
Fetos analisados (N) 266 300 252 266
Ninhadas analisadas (N) 22 22 21 23
Hematomas
Fetos () 075 0 040 075
Ninhadas () 909 0 476 869
Atresia anal
Fetos () 037 0 0 0
Ninhadas () 454 0 0 0
Cauda curta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Pata Traseira torta
Fetos () 0 0 040 0
Ninhadas () 0 0 476 0
Anomalias Viscerais
Fetos analisados (N) 128 141 115 121
Ninhadas analisadas (N) 21 21 20 21
Rim Esquerdo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 0 0 261 165
Ninhadas () 0 0 15 952
Ventriacuteculo cerebral (dilatado)
Fetos () 078 0 0 0
Ninhadas () 476 0 0 0
Fiacutegado (Loacutebulo Extra)
Fetos () 625 355 696 826
Ninhadas () 238 190 350 286
Testiacuteculo (Posiccedilatildeo Irregular)
Fetos () 156 213 348 248
Ninhadas () 952 143 150 143
Ureter Esquerdo (Dilatado)
Fetos () 0 284 087 330
Ninhadas () 0 1428 50 1428
Ureter Esquerdo (Tortuoso)
Fetos () 0 213 087 248
Ninhadas () 0 1428 50 952
TRATAMENTO
Grupo Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ureter Direito (Dilatado)
Fetos () 0 567 087 413
Ninhadas () 0 238 50 1904
Ureter Direito (Tortuoso)
Fetos () 0 496 087 165
Ninhadas () 0 1904 50 476
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Figura 3 a) Morfologia normal de rins e ureter b) Ureter direito e esquerdo dilatados proacuteximo a pelve renal (setas) de fetos expostos in utero a 500mgkg do oacuteleo-resina de copaiacuteba do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo
A ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos a copaiacuteba in
utero do 6deg ao 19deg dia de gestaccedilatildeo eacute demonstrado na Tabela 5 Avaliaccedilotildees no
esqueleto fetal revelaram que o oacuteleo-resina de copaiacuteba causou um aumento
significativo mas natildeo dose dependente no aumento da ocorrecircncia de ossos
incompletos (Figura 5) (osso frontal nas doses de 1000 e 1250mgkg e osso
supraocipital na dose de 500 mgkg) que eacute apresentado como uma reduccedilatildeo no
tamanho da aacuterea corada no cracircnio (Solecki et al 2001) Como verificado na Tabela 5
evidenciou-se nas maiores doses um aumento de ossos natildeo-ossificados em relaccedilatildeo
a b
ao grupo controle (ossos supraocipital hioacuteide metacarpo metarso e iacutesqueo) Poreacutem
com exceccedilatildeo do metarcapo todos os outros ossos natildeo-ossificados apresentaram-se
alterados em apenas 1 ou 2 ninhadas ou seja um nuacutemero limitado de fecircmeas
apresentando essa alteraccedilatildeo e que natildeo estavam distribuiacutedas homogeneamente entre
essas fecircmeas que receberam o oacuteleo-resina O produto tambeacutem causou aumento
significativo de fetos com o centro toraacutecico pobremente calcificado verificado em
todas as dosagens do oacuteleo-resina Entretanto houve uma diminuiccedilatildeo na ocorrecircncia
de ossos pobremente calcificados quando se tratou do arco sacral e das falanges nas
maiores dosagens (Tabela 5) Outro dado significativo foi que na maior dose testada
(1250mgkg) aumentou a incidecircncia da costela rudimentar extra (Figura 6) uma
anomalia que pode ser classificada como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) A
ocorrecircncia de buracos no osso escamoso (Figura 7) foi mais frequente nos fetos
expostos a maior dose do oacuteleo-resina de copaiacuteba do que nos fetos do grupo controle
Figura 5 Ossos parietal interparietal e supraocipital incompletos em feto exposto a 500mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 6 Costela rudimentar extra em feto exposto a 1250mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Figura 7 Buracos no osso escamoso em feto exposto a 1000mgkg pc do oacuteleo-resina de copaiacuteba
Tabela 5 Ocorrecircncia de anormalidades no esqueleto dos fetos expostos in utero ao oacuteleo-resina de copaiacuteba durante a gestaccedilatildeo
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos analisados (N) 106 104 128 115
Ninhadas analisadas (N) 20 17 21 21
Cracircnio
Frontal (Incompleto)
Fetos () 0 1 94 43
Ninhadas () 0 59 143 143
Frontal (buraco)
Fetos () 0 0 0 09
Ninhadas () 0 0 0 48
Frontal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Hioacuteide (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 39 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Interparietal (bipartido)
Fetos () 123 77 86 96
Ninhadas () 40 412 333 286
Interparietal (incompleto)
Fetos () 208 212 281 13
Ninhadas () 40 529 619 476
Interparietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Palatino (fenda)
Fetos () 0 0 08 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Parietal (incompleto)
Fetos () 66 58 125 61
Ninhadas () 200 294 238 238
Escamoso (incompleto)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 143 0
Escamoso (forma irregular)
Fetos () 38 38 78 78
Ninhadas () 10 176 286 286
Escamoso (buraco)
Fetos () 17 144 242 287
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 55 588 762 905
Escamoso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Supraocipital (bipartido)
Fetos () 0 0 16 26
Ninhadas () 0 0 95 95
Supraocipital (incompleto)
Fetos () 66 163 117 13
Ninhadas () 25 588 476 476
Supraocipital (forma irregular)
Fetos () 94 115 148 43
Ninhadas () 35 529 571 19
Supraocipital (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 09
Ninhadas () 0 0 95 48
Lacrimal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Maxilar (incompleto)
Fetos () 0 1 08 0
Ninhadas () 0 59 48 0
Nasal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Parietal (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Timpacircnico (ossificaccedilatildeo incompleta)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Zigomaacutetico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Zigomaacutetico (incompleto)
Fetos () 0 0 08 0
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Dianteiras
Metacarpo (pobremente calcificado)
Fetos () 113 87 156 157
Ninhadas () 25 412 619 429
Metacarpo (natildeo-ossificado)
Fetos () 94 269 336 609
Ninhadas () 35 765 714 762
Falange (pobremente calcificado)
Fetos () 151 183 148 209
Ninhadas () 45 588 476 476
Falange (natildeo-ossificada)
Fetos () 123 154 102 78
Ninhadas () 25 647 333 286
Tiacutebia (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Fiacutebula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Claviacutecula (natildeo-ossificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Ulna (pobremente calcificada)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Raacutedio (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Patas Traseiras
Falanges (pobremente calcificado)
Fetos () 292 346 234 174
Ninhadas () 65 824 714 667
Falanges (natildeo-ossificadas)
Fetos () 208 221 195 27
Ninhadas () 45 765 571 476
Metatarso (pobremente calcificado)
Fetos () 09 1 23 26
Ninhadas () 5 59 143 95
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Metatarso (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 63 35
Ninhadas () 0 0 95 143
Iacuteleo (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Iacuteleo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 16 09
Ninhadas () 0 0 48 48
Iacutesqueo (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 47 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Puacutebis (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 31 17
Ninhadas () 0 0 48 48
Fecircmur (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Esterno
Esternebra (bipartida)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Esternebra (pobremente calcificada)
Fetos () 245 221 297 304
Ninhadas () 75 647 857 762
Esternebra (forma irregular)
Fetos () 47 51 35 43
Ninhadas () 19 15 14 19
Esternebra (natildeo-ossificada)
Fetos () 10 10 23 11
Ninhadas () 6 7 12 7
Costela
Lombar (extra rudimentar)
Fetos () 35 44 55 75
Ninhadas () 14 14 19 21
Coluna
Centro Sacral (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Sacral (natildeo-ossificado)
TRATAMENTO
Grupo
Controle
Copaiacuteba (mgkg pc)
500 1000 1250
Fetos () 0 0 08 26
Ninhadas () 0 0 48 95
Arco Sacral (pobremente calcificado)
Fetos () 642 644 383 487
Ninhadas () 100 941 762 905
Centro Toraacutecico (DUnBbell)
Fetos () 28 1 16 17
Ninhadas () 10 59 95 48
Centro Toraacutecico (pobremente calcificado)
Fetos () 38 279 32 287
Ninhadas () 20 647 857 714
Centro Toraacutecico (bipartido)
Fetos () 0 0 0 26
Ninhadas () 0 0 0 95
Centro Toraacutecico (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Arco Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 113 67 164 139
Ninhadas () 45 176 429 476
Centro Caudal (natildeo-ossificado)
Fetos () 19 0 08 0
Ninhadas () 5 0 48 0
Arco Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 08 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Centro Lombar (pobremente calcificado)
Fetos () 0 0 16 0
Ninhadas () 0 0 48 0
Veacutertebra Lombar (supernumeraacuteria)
Fetos () 09 19 0 09
Ninhadas () 5 118 0 48
Centro Lombar (natildeo-ossificado)
Fetos () 0 0 23 0
Ninhadas () 0 0 95 0
Nuacutemero (N) As proporccedilotildees foram analisadas pelo Teste Chi-Square Diferenccedilas significativas (plt005) em relaccedilatildeo ao grupo controle
Discussatildeo e Conclusatildeo
Nesse estudo o oacuteleo-resina de copaiacuteba (C reticulata) foi administrado em
ratas prenhes durante o periacuteodo de implantaccedilatildeo embrionaacuteria ateacute o final da gestaccedilatildeo
segundo os procedimentos do Guia OECD-414 A implantaccedilatildeo eacute o processo pelo qual
o embriatildeo adquire uma posiccedilatildeo estaacutevel no endomeacutetrio de modo a tornar possiacutevel a
manutenccedilatildeo de um sistema de trocas metaboacutelicas entre o organismo materno e
embrionaacuterio Em ratos esse processo ocorre por volta do 6deg dia de gestaccedilatildeo
(Abrahamsohn 1993)
Como veiacuteculo do oacuteleo-resina de copaiacuteba utilizou-se o Tween um surfactante
natildeo-aniocircnico (Benson 1967) utilizado para solubilizar substacircncias pobremente
soluacuteveis Um estudo realizado por Ema et al (1988) demonstrou que o Tween 60 natildeo
apresenta efeitos no desenvolvimento preacute-natal de ratos Os ratas do trabalho citado
receberam Tween 60 nas doses de 0 01 1 e 10 na dieta do 7deg ao 14deg dia de
gestaccedilatildeo e os resultados natildeo relataram quaisquer evidecircncia de teratogecircnese
Sinais de toxicidade materna normalmente observados em estudos de
toxicidade do desenvolvimento satildeo diminuiccedilatildeo no ganho de peso diminuiccedilatildeo no
consumo de aacutegua e comida sinais cliacutenicos toxicidade para os oacutergatildeos e mortalidade
(Chahoud 1999) Os dados do presente estudo demonstraram que a administraccedilatildeo
oral preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba causou toxicidade materna nas maiores
dosagens utilizadas (1000 e 1250 mgkg) evidenciada pela diminuiccedilatildeo do consumo
de raccedilatildeo apoacutes o 9deg dia de gestaccedilatildeo e perda do ganho de peso durante o periacuteodo de
tratamento Embora verificada toxicidade natildeo houve mortes ou alteraccedilotildees
comportamentais durante todo o tratamento A menor dose utilizada 500mgkg natildeo
causou qualquer alteraccedilatildeo toacutexica significativa corroborando com o estudo de Gomes
et al (2007) que administrou 500 mgkg do oacuteleo-resina da Copaifera multijuga Hayne
e Copaifera reticulata Ducke Fabaceae em camundongos por via oral natildeo
observando alteraccedilatildeo na ingestatildeo de raccedilatildeo durante cinco dias apoacutes a dosagem com
as duas espeacutecies testadas
O oacuteleo-resina de copaiacuteba eacute constituiacutedo por misturas de sesquiterpenos
predominantes na maioria deles e de diterpenos (Veiga Jr e Pinto 2002) Alguns
estudos tecircm sido conduzidos para avaliar a potencial embriotoxicidade de terpenos
em animais de laboratoacuterio Num estudo conduzido com citral (37-dimetil-26-
octadieno-1-al) encontrado em oacuteleos essenciais foi administrado oralmente em ratos
Wistar do 6deg ao 15deg de gestaccedilatildeo em doses de 60 125 250 500 e 1000 mgkg Os
resultados demonstraram uma diminuiccedilatildeo no ganho de peso do 6deg ao 11deg dia de
gestaccedilatildeo nas menores doses e uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do
uacutetero] nas maiores doses indicando que o citral foi maternalmente toacutexico para todas
as dosagens testadas (Nogueira et al 1995) Araujo et al (1996) avaliaram o
potencial efeito embriofetotoacutexico do α-terpineno (1-isopropil-4-metil-13-
ciclohexadieno) um monoterpeno encontrado em oacuteleos essenciais apoacutes
administraccedilatildeo via oral (30 60 125 e 250 mgkg pc) em fecircmeas Wistar do 6deg ao 15deg
dia de gestaccedilatildeo Natildeo houve aumento na taxa de reabsorccedilotildeesimplantaccedilotildees nas doses
testadas mas foi verificada uma reduccedilatildeo no [peso corpoacutereo menos o peso do uacutetero]
nas duas maiores doses testadas evidenciando toxicidade materna Houve uma
diminuiccedilatildeo no peso corpoacutereo fetal na maior dose testada e alguns sinais de retardo na
ossificaccedilatildeo foram observados nas doses de 60 mgkg ou mais
Paumgartten et al (1998) investigaram os efeitos da administraccedilatildeo oral do
monoterpeno β-mirceno nas doses de 0 100 300 e 500 mgkg em ratos Metade das
fecircmeas do estudo receberam o monoterpeno pelo periacuteodo de 21 dias anterior ao
acasalamento durante o acasalamento e ateacute a cesaacuterea no 21deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo
foram observados sinais de toxicidade materna durante o estudo entretanto um
pequeno aumento no peso do fiacutegado e dos rins foi verificado Essa alteraccedilatildeo foi
explicada pelo fato do β-mirceno ser um provaacutevel indutor da monooxigenase hepaacutetica
e o aumento do fiacutegado ser um resultado da acentuada hipertrofia do retiacuteculo
endoplasmaacutetico devido a uma induccedilatildeo da siacutentese de enzimas microssomais nos
animais tratados No presente estudo dados similares foram relatados ao se verificar
um acentuado aumento no peso relativo do fiacutegado e rins das fecircmeas tratadas com do
oacuteleo-resina de copaiacuteba Os resultados das avaliaccedilotildees poacutes-cesaacuterea indicaram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina natildeo ocasionou efeitos adversos significativos na perda
poacutes-implantaccedilatildeo reabsorccedilotildees tamanho da ninhada e razatildeo sexual (machos e
fecircmeas) Uma pequena mas significativa reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo fetal
nas maiores dosagens de copaiacuteba foi verificada Essa reduccedilatildeo no peso fetal coincidiu
com a as dosagens de copaiacuteba que se apresentaram toacutexicas para as matildees Nos
estudos de toxicidade no desenvolvimento uma reduccedilatildeo na meacutedia do peso corpoacutereo
fetal eacute normalmene considerado um resultado no retardo do crescimento preacute-natal
induzido por uma substacircncia (Chahoud 2005) Entretanto Khera (1985) demonstrou
que algumas substacircncias induzem efeitos no desenvolvimento em niacutevel de dose que
eacute tambeacutem maternalmente toacutexico desta forma diminui a significacircncia da toxicidade
fetal na presenccedila de sinais de toxicidade materna
A reduccedilatildeo no consumo de alimento ou malnutriccedilatildeo materna pode
comprometer o crescimento fetal e a ossificaccedilatildeo (Lederman e Rosso 1980) O extrato
de Ginkgo biloba planta composta por diferentes terpenos trilactonas foi testado em
ratos Wistar para avaliar a toxicidade reprodutiva As fecircmeas prenhes receberam 0
35 7 e 14 mgkg pc do extrato do 8deg ao 20deg dia de gestaccedilatildeo Natildeo foram observadas
evidecircncias de toxicidade materna entretanto os resultados indicaram um retardo no
crescimento intra-uterino demonstrado atraveacutes da diminuiccedilatildeo da meacutedia do peso fetal
(Pinto et al 2007) Delgado et al (1993) avaliaram o efeito do β-mirceno no
desenvolvimento peri- e poacutes-natal pela administraccedilatildeo de 025 05 10 e 15 gkg via
gavagem a fecircmeas Wistar desde o 15deg dia de gestaccedilatildeo e durante a lactaccedilatildeo (ateacute o
21deg poacutes-natal) Houve diminuiccedilatildeo no peso da prole das fecircmeas tratadas com a maior
dose do estudo
As anaacutelises de anormalidades externamente visiacuteveis dos fetos natildeo
demonstraram quaisquer alteraccedilotildees significativas Jaacute a avaliaccedilatildeo das anomalias
viscerais revelou uma discreta dilataccedilatildeo no ureter direito e esquerdo significativas
mas natildeo dose dependentes nos grupos 500 e 1250 mgKg do oacuteleo-resina de copaiacuteba
A classificaccedilatildeo harmonizada da terminologia e classificaccedilatildeo de viacutesceras e avaliaccedilotildees
externas dos fetos de ratos determina que a dilataccedilatildeo verificada no ureter dos fetos
satildeo transitoacuterias e podem ser consideradas como variaccedilotildees (Solecki et al 2003) De
acordo com as definiccedilotildees atuais as variaccedilotildees satildeo mudanccedilas estruturais que ocorrem
em uma populaccedilatildeo normal e natildeo satildeo susceptiacuteveis de afetar a sobrevivecircncia ou a
sauacutede enquanto que as malformaccedilotildees satildeo mudanccedilas permanentes que afetam
adversamente a sobrevivecircncia desenvolvimento ou funccedilatildeo (Chahoud et al 1999)
A exposiccedilatildeo preacute-natal do oacuteleo-resina de copaiacuteba aumentou principalmente a
frequecircncia de ossos natildeo-ossificados e incompletos da prole Em ratos ossos natildeo-
ossificados (Khera 1985) bem como ossificaccedilatildeo incompleta e ossos pobremente
ossificados (Solecki et al 2001) tem sido um indicador de retardo de ossificaccedilatildeo do
esqueleto fetal que eacute um termo que se refere a uma diminuiccedilatildeo na quantidade de
mineralizaccedilatildeo do osso em comparaccedilatildeo com o esperado para uma determinada idade
de desenvolvimento (Carney e Kimmel 2007) Segundo Solecki et al (2001)
normalmente natildeo se pode saber exatamente as consequecircncias poacutes-natais dos ossos
incompletos e estudos avaliando as consequecircncias poacutes-natais do retardo na
ossificaccedilatildeo tecircm indicado que elas natildeo persistem (Carney e Kimmel 2007) A maioria
dos pesquisadores classifica ossos natildeo-ossificados como variaccedilotildees (ausecircncia de
ossificaccedilatildeo) sendo uma forma extrema da ossificaccedilatildeo incompleta condiccedilatildeo
considerada transitoacuteria e que se resolve com o crescimento do indiviacuteduo alcanccedilando
um estaacutegio comparaacutevel ao do grupo controle Num dia particular da gestaccedilatildeo
algumas estruturas do cracircnio podem ser bem ossificadas algumas podem ser menos
ossificadas e outras podem natildeo ser ossificadas (Solecki et al 2001) De acordo com
Daston and Seed (2007) o retardo na ossificaccedilatildeo depende da idade na qual os
animais foram sacrificados assim alguns estudos demonstram que os fetos das
fecircmeas sacrificadas no dia 20deg de gestaccedilatildeo (DG) tem ossos muito menos ossificados
que os animais examinados no 21deg DG No presente estudo seguindo o Guia OECD-
414 as cesaacutereas foram realizadas no 20deg dia de gestaccedilatildeo
O retardo na ossificaccedilatildeo ocorre tipicamente em conjunto com outros efeitos
no crescimento fetal particularmente diminuiccedilatildeo do peso fetal como foi verificado no
presente estudo Normalmente o atraso na ossificaccedilatildeo eacute provavelmente indicativo do
mesmo problema que levou a uma diminuiccedilatildeo do peso fetal ou seja um efeito
generalizado sobre a maturaccedilatildeo fetal Isso pode ser um efeito adverso mas
provavelmente natildeo eacute um preditor de potencial teratogecircnico (Daston e Seed 2007)
Outro resultado do presente estudo foi o aumento de buracos no osso
escamoso signicativos nas doses de 1000 mgkg Pode-se classificar esses buracos
pequenos e pouco numerosos como uma variaccedilatildeo (Solecki et al 2001) Aleacutem disso
a incidecircncia do aparecimento da costela rudimentar extra aumentou com o incremento
da dose e foi significativo no grupo 1250 mgkg Mesmo no estudo de substacircncias
teratogecircnicas para ratos como eacute o caso da aspirina essa alteraccedilatildeo eacute transitoacuteria
Wickramaratne (1988) administrou aspirina em ratos prenhes resultando em
duplicaccedilatildeo da frequecircncia de costelas extras rudimentar na prole ao nascer No
entanto apoacutes 60 dias a ocorrecircncia das costelas extras na prole declinou a zero
Os resultados deste estudo indicam que o oacuteleo-resina de copaiacuteba foi toacutexico
para o organismo materno nas doses de 1000 mgkg e 1250 mgkg como pode ser
visto pela reduccedilatildeo no ganho de peso das matildees e pela diminuiccedilatildeo no consumo de
raccedilatildeo tambeacutem nas maiores doses durante o periacuteodo do tratamento Nesses niacuteveis de
dose o oacuteleo-resina tambeacutem afetou adversamente o desenvolvimento embriofetal de
ratos causando retardo no crescimento fetal evidenciada pela diminuiccedilatildeo do peso da
prole Nestas condiccedilotildees experimentais o niacutevel maacuteximo de dose em que natildeo satildeo
observados efeitos adversos (Non-Observed Adverse Level ndash NOAEL) foi de 500 mg
do oacuteleo-resina de copaiacutebakg de peso corporal ie NOAEL=500 mg do oacuteleo-resina de
copaiacutebakg pcdia
No presente estudo a administraccedilatildeo do oacuteleo-resina nos ratos ocorreu a partir
do sexto dia da gestaccedilatildeo que corresponde ao iniacutecio da implantaccedilatildeo embrionaacuteria Em
mulheres a implantaccedilatildeo ocorre no final da primeira semana de gestaccedilatildeo (Moore
2000) A partir do NOAEL estimado podemos calcular a ingestatildeo segura do oacuteleo-
resina de copaiba por mulhers graacutevidas aplicando-se o fator de seguranccedila de 100
segundo procedimentos internacionalmente aceitos (Speijers 1999 Jardim amp Caldas
2009) Este fator assume que o homem eacute 10 vezes mais sensiacutevel que o rato
(variabilidade inter-espeacutecies) e que na populaccedilatildeo humana existe uma sub-populaccedilatildeo
de indiviacuteduos que eacute 10 vezes mais sensiacutevel que a meacutedia da populaccedilatildeo (variabilidade
intra-espeacutecie) Desta maneira a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia considerando a relaccedilatildeo
pesovolume 11
Vaacuterios produtos do oacuteleo-resina de copaiba estatildeo disponiacuteveis comercialmente
no Brasil mas na grande maioria a posologia natildeo estaacute especificada no roacutetulo
Pesquisa junto agraves drogarias do DF e em sites que comercializam o produto na internet
indicam que o oacuteleo-resina deve ser usado de 3 a 5 gotas por vez ateacute 3 vezes ao dia
Considerando que 1 gota tem 005 mL a dose diaacuteria maacutexima recomendada eacute de 075
mLdia Assumindo um peso corpoacutereo meacutedio de 60 kg essa dose corresponde a
00125 mLkg pcdia isto eacute 400 vezes menor que a ingestatildeo segura estimada para
mulheres gestantes a partir do estudo com ratos Esses resultados indicam que o uso
de oacuteleo-resina de copaiba pode ser seguro para esta populaccedilatildeo o que natildeo suporta
cientificamente o alerta apresentado em vaacuterios produtos comerciais de que o oacuteleo-
resina ―natildeo deve ser usado por gestantes
Os dados aqui apresentados indicam ainda que o oacuteleo-resina de copaiacuteba natildeo
eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia de
malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da exposiccedilatildeo
in utero a este composto Algumas das referecircncias citadas no presente estudo
demonstraram que os terpenoacuteides estudados ateacute o momento natildeo foram
teratogecircnicos Eacute importante no entanto destacar que o estudo da toxicidade
reprodutiva de agentes quiacutemicos eacute uma das aacutereas mais complexas da toxicologia
preditiva (Pinto 2005) e que na presente investigaccedilatildeo somente um periacuteodo restrito
deste processo ie o desenvolvimento embriofetal foi avaliado
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CONCLUSOtildeES FINAIS
Os resultados do estudo de toxicidade aguda demonstraram que a
administraccedilatildeo do oacuteleo-resina de copaiacuteba (Copaifera reticulata) em ratas Wistar natildeo
causou mortalidade eou morbidade ateacute a dose testada de 2000 mgkg pc e foi
classificada como ―categoria 5 ou seja toxicidade letal aguda maior que 2000 mgkg
pc O oacuteleo-resina natildeo apresentou efeitos neurotoacutexicos nas doses testadas avaliada
pela atividade motora sensorial e comportamental Natildeo foi encontrada qualquer
alteraccedilatildeo histopatoloacutegica significativa no fiacutegado rim e ceacuterebro das fecircmeas prenhes
expostas do oacuteleo-resina de copaiacuteba sugerindo uma seguranccedila relativo quando
utilizado durante a gestaccedilatildeo
Os dados do estudo de embriofetotoxicidade indicam que o oacuteleo-resina de
copaiacuteba natildeo eacute teratogecircnica em ratos uma vez que natildeo houve aumento da frequumlecircncia
de malformaccedilotildees viscerais eou esqueleacuteticas grosseiras em consequumlecircncia da
exposiccedilatildeo in utero a este composto O oacuteleo-resina foi toacutexico para o organismo
materno e causou retardo no crescimento fetal nas doses de 1000 mgkg pcdia e
1250 mgkg pcdia com NOAEL estimado de 500 mgkg pcdia A partir desse
NOAEL estimou-se que a ingestatildeo segura do oacuteleo-resina de copaiba durante o
periacuteodo gestacional na espeacutecie humana eacute de 5 mgkg pcdia ou 5 mLkg pcdia Essa
dose 400 vezes maior que a dose terapecircutica indicada nos produtos comerciais e
portanto a copaiacuteba eacute segura para ser usada por mulheres em idade feacutertil
Ateacute o presente momento natildeo existiam dados na literatura avaliando a
embriofetotoxicidade do oacuteleo-resina de copaiacuteba dado importante pela sua grande
utilizaccedilatildeo tradicional e popular A continuaccedilatildeo dessa avaliaccedilatildeo se faz necessaacuteria
devido agrave grande diferenccedila intra-espeacutecies das Copaiferas bem como a diferenccedila entre
espeacutecies animais A gestaccedilatildeo eacute uma condiccedilatildeo fisioloacutegica na qual o metabolismo
materno pode ser influenciado por agentes toacutexicos que podem afetar a implantaccedilatildeo
desenvolvimento e crescimento do feto Aleacutem disso satildeo necessaacuterios estudos da
cineacutetica desta planta ausentes na literatura atual e importante para entender diversos
mecanismos Compostos quiacutemicos do oacuteleo-resina de copaiacuteba tambeacutem deveratildeo ser
isolados com o intuito de investigar os mecanismos de accedilatildeo nas suas diversas accedilotildees
farmacoloacutegicas e toacutexicas