avaliaÇÃo ecotoxicolÓgica e identificaÇÃo da...

i

Régis Fernando Spadotim

AVALIAÇÃO ECOTOXICOLÓGICA E IDENTIFICAÇÃO DA

TOXICIDADE NO RIBEIRÃO PIRES, LIMEIRA – SP

Limeira

2015

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Tecnologia

Régis Fernando Spadotim

AVALIAÇÃO ECOTOXICOLÓGICA E IDENTIFICAÇÃO DA

TOXICIDADE NO RIBEIRÃO PIRES, LIMEIRA – SP

Dissertação apresentada à Faculdade de Tecnologia da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em

Tecnologia, na área de Tecnologia e Inovação.

Orientadora: Profa. Dra. Cassiana Maria Reganhan Coneglian

Co-orientadora: Profa. Dra. Gisela de Aragão Umbuzeiro

Este exemplar corresponde à versão final da

dissertação defendida pelo aluno Régis

Fernando Spadotim, e orientado pela Profa.

Dra. Cassiana Maria Reganhan Coneglian

Limeira

2015

vii

Resumo

O ribeirão Pires é o principal afluente do ribeirão Pinhal, manancial utilizado na captação de águas

para distribuição à população de Limeira, SP. Estudos anteriores realizados na micro bacia do

ribeirão Pinhal apontaram toxicidade aguda apenas nas águas do ribeirão Pires, para o organismo-

teste Ceriodaphnia dubia. Desta forma torna-se importante conhecer as fontes de contaminação,

bem como seus contaminantes para assegurar água de qualidade para o município. No presente

trabalho realizou-se a avaliação ecotoxicológica mediante testes de toxicidade aguda e crônica de

amostras de água superficial coletadas no ribeirão Pires, e identificação da toxidade utilizando o

estudo de Avaliação e Identificação da Toxicidade (AIT). O princípio desse método baseia-se no

fracionamento das amostras por meio de uma série de processos físicos e químicos, objetivando

eliminar ou separar grupos de compostos para verificação de seu potencial tóxico. Para realização

do AIT utilizou-se os organismos-testes Ceriodaphnia dubia e Daphnia similis, mediante testes de

toxicidade aguda, após a manipulação das amostras verificou-se a redução significativa da

toxicidade com tratamento em coluna C18 em pH 9 e quelação com EDTA. Estes tratamentos de

AIT (Fase I) apontaram respectivamente, compostos orgânicos não polares, além de metais

catiônicos como responsáveis pela toxicidade aguda. Manipulações da Fase II utilizando

espectrofotometria ICP-MS permitiram identificar o zinco em concentrações entre 270-1330 µg L-

1. A caracterização e confirmação de compostos orgânicos nem sempre é necessária, visto que em

alguns casos somente a classe dos compostos tóxicos pode fornecer informações suficientes para

determinar o tratamento apropriado ou opções de controle da fonte da toxicidade. De acordo com

os resultados obtidos nas análises, pode-se concluir que o zinco foi o principal agente responsável

pela toxicidade das amostras coletadas no ribeirão Pires, para os organismos testados e a provável

ocorrência de outros contaminantes.

Palavras-chave: AIT; Toxicologia ambiental; ribeirão Pires; Ceriodaphnia dubia e Daphnia

similis.

ix

Abstract

The stream Pires is the main tributary of the stream Pinhal, source used in water catchment for

distribution to the population of Limeira, SP. Previous studies in micro basin stream Pinhal pointed

acute toxicity only in stream Pires of water to the organism Ceriodaphnia dubia. Thus it is

important to know the sources of contamination and its contaminants to ensure quality water for

the city. In the present work to review ecotoxicological by acute and chronic toxicity tests of surface

water samples collected in the stream Pires and identification of toxicity study using the Toxicity

Identification and Evaluation (TIE). The principle of this method is based on the fractionation of

the samples through a series of physical and chemical processes in order to eliminate or separate

groups of compounds to check their toxic potential. To perform the TIE was used the organism

Ceriodaphnia dubia and Daphnia similis by acute toxicity tests after handling the samples there

was a significant reduction in toxicity with treatment C18 column at pH 9 and chelation with

EDTA. These treatments TIE (Phase I) indicated respectively nonpolar organic compounds, and

cationic metal responsible for acute toxicity. Manipulations of Phase II using spectrometry ICP-

MS permitted the identification zinc at concentrations of 270-1330 μg L-1. The characterization

and confirmation of organic compounds is not always necessary because in some cases only the

class of toxic compounds can provide sufficient information to determine the appropriate treatment

or control options of the toxicity source. According to the analysis results, it can be concluded that

zinc is the primary agent responsible for the toxicity of the samples collected in stream Pires for

the tested organisms and the likely occurrence of other contaminants.

Keywords: TIE; Environmental toxicology; stream Pires; Ceriodaphnia dubia and Daphnia

similis.

xi

SUMÁRIO

1 Introdução ................................................................................................................................. 01

2 Objetivos .................................................................................................................................... 03

3 Revisão de literatura ................................................................................................................ 05

3.1 Ribeirão Pires ....................................................................................................................... 05

3.2 Contaminação da Água ........................................................................................................ 07

3.3 Ensaios Ecotoxicológicos .................................................................................................... 08

3.3.1 Testes de toxicidade aguda............................................................................................ 11

3.3.2 Testes de toxicidade crônica ......................................................................................... 12

3.4 Avaliação e identificação da Toxicidade ............................................................................. 12

3.4.1 Avaliação e identificação da Toxicidade – Fase I ......................................................... 13

3.4.2 Avaliação e identificação da Toxicidade – Fase II ....................................................... 16

3.4.3 Avaliação e identificação da Toxicidade – Fase III ...................................................... 17

3.4.4 Estudos relacionados a AIT .......................................................................................... 18

4 Material e métodos ................................................................................................................... 21

4.1 Material ................................................................................................................................ 21

4.1.1 Local de coleta .............................................................................................................. 21

4.1.2 Caracterização da área de estudo .................................................................................. 22

4.1.3 Equipamentos, reagentes e vidrarias ............................................................................. 24

4.2 Métodos ................................................................................................................................ 24

4.2.1 Métodos de coleta e preservação das amostras ............................................................. 24

4.2.2 Métodos para análises físico-químicas.......................................................................... 24

4.2.3. Métodos dos testes ecotoxicológicos ........................................................................... 24

4.2.4 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase I) ............................................. 26

4.2.5 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase II) ............................................ 35

4.2.6 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase III) .......................................... 35

5 Resultados e discussões ............................................................................................................ 37

5.1 Testes de Sensibilidade ........................................................................................................ 37

5.2 Avaliação dos parâmetros físico-químicos .......................................................................... 39

5.3 Testes de Toxicidade ............................................................................................................ 41

xii

5.3.1 Testes de Toxicidade aguda .......................................................................................... 41

5.3.2 Testes de Toxicidade crônica ........................................................................................ 43

5.4 Avaliação e Identificação da Toxicidade (Fase I) ............................................................... 44

5.4.1 Recuperação da toxicidade da coluna C18 em pH 9 (Fase I) ...................................... 47

5.5 Avaliação e Identificação da Toxicidade (Fase II) ............................................................. 49

5.6 Avaliação e Identificação da Toxicidade (Fase III) ............................................................ 52

Conclusões .................................................................................................................................... 55

Referências bibliográficas ........................................................................................................... 57

Apêndices ...................................................................................................................................... 69

Anexos ........................................................................................................................................... 81

xiii

Agradecimentos

Agradeço, primeiramente a Deus, que tem sido minha fortaleza.

A Orientadora Cassiana Maria Reganhan Coneglian pela amizade e apoio que me ajudou muito a

atingir mais esse objetivo acadêmico.

A Co-orientadora Gisela de Aragão Umbuzeiro pelo apoio.

Ao amigo e técnico do laboratório de microbiologia, Gilberto de Almeida.

Aos amigos do laboratório Laboratório de Ecotoxicologia e Microbiologia Ambiental Profº Dr.

Abílio Lopes – LEAL que me apoiaram.

Ao técnico do laboratório Físico-químico, Geraldo Dragoni Sobrinho.

Aos membros da banca, Regina Teresa Rosim Monteiro e Clarice Maria Rispoli Botta.

Agradeço à Capes pela bolsa concedida.

xv

Ele fortalece ao cansado e dá grande vigor ao que está sem forças.

Até os jovens se cansam e ficam exaustos, e os moços tropeçam e caem;

mas aqueles que esperam no Senhor renovam as suas forças. Voam bem alto como águias;

correm e não ficam exaustos, andam e não se cansam.

“Isaías 40:29-31”

xvii

Lista de Ilustrações

FIGURA 1 - Mapa das bacias hidrográficas de Limeira – SP, com destaque para o ribeirão

Pires ..................................................................................................................................... 05

FIGURA 2 - Microcrustáceos (a) Daphnia similis e (b) Ceriodaphnia dubia, organismos-

teste utilizados nos ensaios de toxicidade ........................................................................... 11

FIGURA 3 - Etapas para caracterização de substâncias tóxicas na Fase I - AIT ............... 13

FIGURA 4 - Resultados de toxicidade encontrados em AIT, em diversas matrizes através de

(n) artigos pesquisados nos EUA e Europa ......................................................................... 20

FIGURA 5 - Fotografia aérea das estações de coleta de agua no ribeirão Pires ................ 22

FIGURA 6 - Fotografias dos pontos de amostragem no ribeirão Pires .............................. 22

FIGURA 7 - Mapeamento do entorno do ribeirão Pires baseado em possiveis fontes de

contaminação das águas....................................................................................................... 23

FIGURA 8 - (a) Fotografia da manipulação de graduação de pH, (b) Ilustração dos

procedimentos aplicados...................................................................................................... 27

FIGURA 9 - (a) Fotografia da manipulação de aeração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos

procedimentos aplicados...................................................................................................... 28

FIGURA 10 - (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração

dos procedimentos aplicados ............................................................................................... 29

FIGURA 11 - (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração

dos procedimentos aplicados ............................................................................................... 31

FIGURA 12 - (a) Fotografia da manipulação de adição de EDTA e tiossulfato de sódio, (b)

Ilustração dos procedimentos aplicados para a adição de EDTA, (c) Ilustração dos

procedimentos aplicados para a adição de Tiossulfato de sódio ......................................... 34

FIGURA 13 - Procedimento adotado em Fase II para as amostras do ribeirão Pires, baseado

nos resultados de Fase I ....................................................................................................... 35

FIGURA 14 - Procedimento adotado em Fase III para as amostras do ribeirão Pires, baseado

nos resultados de Fase II ...................................................................................................... 35

FIGURA 15 - Carta controle provisória referente à sensibilidade do organismo-teste

Ceriodaphnia dubia ao cloreto de sódio (NaCl), em 7 dias de exposição .......................... 37

FIGURA 16 - Carta controle provisória referente à sensibilidade do organismo-teste

Daphnia similis ao cloreto de sódio (NaCl), em 48 horas de exposição ............................. 38

xviii

FIGURA 17 - Resultados dos testes de toxicidade aguda (48 horas) realizados com as

amostras de agua superficiais do ribeirão Pires ................................................................... 43

FIGURA 18 - Média de neonatas de Ceriodaphnia dubia por fêmea adulta nos ensaios de

toxicidade crônica (7 dias), realizados com as amostras de água superficial do ribeirão Pires

............................................................................................................................................. 44

FIGURA 19 - Resultados de toxicidade aguda mediante o organismo-teste Daphnia similis

obtidos na Fase I de AIT, realizados com amostras de água superficial do ribeirão Pires (E2)

............................................................................................................................................. 45

FIGURA 20 - Resultados de toxicidade aguda mediante o organismo-teste Ceriodaphnia

dubia obtidos na Fase I de AIT, realizados com amostras de água superficial do ribeirão Pires

(E2) ..................................................................................................................................... 46

FIGURA 21 - Resultados do ensaio de recuperação da toxicidade da coluna C18 em pH 9,

referente a coleta do mês de Julho de 2014 ......................................................................... 48

FIGURA 22 - Redução da toxicidade de metais para o organismos-teste Ceriodaphnia dubia

quando tratados com Tiossulfato de Sódio e EDTA, com destaque aos resultados obtidos na

Fase I ................................................................................................................................... 50

FIGURA 23 - Fórmula estrutural do Zinco complexado pelo EDTA ................................ 51

FIGURA 24 - Resultados de correlação de toxicidade relativa do zinco presente na amostra

............................................................................................................................................. 53

xix

Lista de Tabelas

TABELA 1 - Manipulações da Fase I e seus respectivos agentes alvo .............................. 16

TABELA 2 - Resumo de trabalhos de AIT realizados no Brasil ........................................ 19

TABELA 3 - Resumo dos requisitos para os ensaios de toxicidade crônica, mediante o

organismo-teste Ceriodaphnia dubia .................................................................................. 25

TABELA 4 - Resumo dos requisitos para os ensaios de toxicidade aguda, mediante os

organismos-testes Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia .................................................. 26

TABELA 5 – Resultados de testes de sensibilidade (Toxicidade aguda) ao EDTA e

Tiossulfato de Sódio em agosto de 2013 ............................................................................. 39

TABELA 6 – Resultados dos parâmetros físico-químicos das amostras de água superficiais

do ribeirão Pires coletadas de setembro de 2013 a julho de 2014 ....................................... 40

TABELA 7 – Resultados dos testes de toxicidade aguda (48 horas) realizados com as

amostras de agua superficiais do ribeirão Pires ................................................................... 42

TABELA 8 – Análises dos elementos químicos realizadas por empresa terceirizada com as

amostras de água superficial do ribeirão Pires .................................................................... 49

1

1 Introdução

A degradação dos recursos hídricos nunca foi tão evidente, é notável o uso abusivo e

irresponsável do mesmo, se medidas extremas não forem tomadas esse recurso que já é escasso,

pode em curto prazo se tornar um dos maiores problemas a ser enfrentado pela humanidade.

Os ambientes aquáticos são extremamente complexos, devido a diversos fatores físicos,

químicos e biológicos que se interagem, podendo tornar esse ambiente mais vulnerável a

substâncias tóxicas. Por outro lado os contaminantes possuem características que variam em

relação a sua capacidade de dispersão de pluma, adsorção na matéria orgânica, solubilidade,

biotransformação, etc. Além disso, dependendo da sua toxicidade e persistência no ambiente

aquático, essas substâncias podem interferir em processos básicos dos ecossistemas, como a

disponibilidade de oxigênio dissolvido, a ciclagem de nutrientes, alterações em níveis tróficos, bem

como redução de sua biodiversidade, além de outros efeitos adversos, como a dificuldade de

tratamento com qualidade da água para o abastecimento público.

Portanto, avaliar o potencial tóxico dos contaminantes lançados nos corpos d’água

mediante testes de toxicidade se faz importante e identificar o composto ou grupo de compostos

responsáveis pela toxicidade se faz necessário para tomada de medidas de controle, para tanto foi

desenvolvido o método conhecido como Avaliação e Identificação da Toxicidade (AIT). Este

método compreende três fases distintas: identificação, caracterização e confirmação da toxidade;

Nessas etapas as análises químicas e os testes de toxicidade se complementam, possibilitando a

implantação de medidas mitigadoras e efetiva redução da toxidade.

Apesar da importância do AIT, no Brasil é pouco utilizado, sendo poucas as publicações

utilizando essa metodologia, com isso pouco se conhece sobre a presença de contaminantes

específicos, em ambientes aquáticos no cenário brasileiro, seu potencial tóxico voltado para a

preservação da vida aquática, bem como a eficiência de sua remoção nas estações de tratamento de

água, destinadas ao consumo humano.

Sendo o ribeirão Pires o principal afluente do ribeirão Pinhal, que é utilizado como fonte

de abastecimento para a população de Limeira – SP, a proposta deste trabalho foi avaliar e

identificar a toxicidade no ribeirão Pires por meio de testes de toxicidade aguda e crônica,

empregando a metodologia de Avaliação e Identificação da Toxicidade (AIT).

3

2 Objetivos

2.1 Objetivo Geral

Realizar a avaliação e identificação da toxicidade de amostras de águas do ribeirão Pires,

na micro bacia do ribeirão Pinhal, utilizando a metodologia de Avaliação e Identificação da

Toxicidade (AIT) – Fase I e II.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a toxicidade de amostras de água superficial em três pontos do ribeirão Pires

utilizando testes de toxicidade aguda e crônica, mediante os organismos-testes

Ceriodaphnia dubia e Daphnia similis;

Caracterizar as amostras de água superficial em relação às variáveis físico-químicas (pH,

oxigênio dissolvido e condutividade);

Identificar os compostos ou classes de compostos responsáveis pela toxicidade aguda das amostras de água superficial do ribeirão Pires.

5

3 Revisão de Literatura

3.1 Ribeirão Pires

A cidade de Limeira - SP, tem aproximadamente 294 mil habitantes (IBGE, 2014) e o

município de Limeira localiza-se na bacia hidrográfica do rio Piracicaba, cuja área total é de 12.400

km2, dos quais 11.020 km2 estão no estado de São Paulo e o restante em Minas Gerais (MANSOR,

2005).

O município abrange duas micro bacias, sendo: micro bacia do ribeirão Pinhal (uma das

fontes de captação de água) que acolhe as águas dos ribeirões Tabajara e Pires e a do Tatu que

acolhe as águas do ribeirão Barroca Funda e ribeirão Duas Barras. A micro bacia do ribeirão Pinhal

desemboca no rio Jaguari, enquanto as micro bacias dos ribeirões Tatu, Graminha e Águas da Serra

desembocam no rio Piracicaba (Figura 1).

FIGURA 1 - Mapa das bacias hidrográficas de Limeira – SP, com destaque para o ribeirão Pires

Fonte: Adaptado de LIMEIRA (2013).

6 Capítulo 3. Revisão de Literatura

A Sub-bacia do ribeirão dos Pires pertencente à Unidade de Gerenciamento de Recursos

Hídricos Integrada nº 5 - Piracicaba, Capivari, Jundiaí (UGRHI n º 5 - PCJ) e enquadra-se nas

classes II e III do Conama 357/2005, encontra-se localizada na área de abrangência das bacias do

ribeirão Pinhal, afluente direto do rio Jaguari (LIMEIRA, 2008).

O rio Jaguari por sua vez constitui-se importante tributário do rio Piracicaba, localizado

no centro-leste do Estado de São Paulo (MANSOR, 2005).

A sub-bacia do ribeirão dos Pires está totalmente inserida no município de Limeira e

localiza-se na porção leste, limítrofe à área urbana. O ribeirão dos Pires abrange uma porção dentro

do perímetro urbano de Limeira, onde localiza-se sua nascente nas proximidades do bairro Egisto

Ragazzo, as margens da rodovia Anhanguera, passando posteriormente pelo bairro Nova Limeira

e por fim sua maior parte encontra-se além do perímetro urbano, percorrendo o bairro dos Pires,

área rural do município (MANSOR, 2005).

O uso e ocupação das terras ao redor do ribeirão Pires próximos a nascente são

tipicamente industriais, já a jusante predomina atividades agrícolas, caracterizados

respectivamente por citrus, pastagens e outras culturas em pequena escala como cana-de-açúcar,

restando pouca mata ciliar (BRANDÃO, 2001).

O ribeirão Pires é o principal afluente do ribeirão do Pinhal e possui aproximadamente 18

km de extensão, já a área total da sua sub-bacia é de aproximadamente 49 km² (MANSOR, 2005).

A captação de água da cidade de Limeira é realizada junto à foz do ribeirão Pinhal com o

rio Jaguari, podendo o recurso ser captado tanto de um, como de outro manancial. A bacia do

ribeirão Pinhal é importante e essencial para o abastecimento de água do município de Limeira –

SP, sendo o principal curso d´água da área rural a leste do município (LIMEIRA, 2008).

O ribeirão Tabajara está localizado em uma região de grande ocupação de chácaras de

recreio, sendo esta uma preocupação para garantia de preservação deste manancial que apesar de

ser o menor dos mananciais também compõe a bacia do ribeirão Pinhal (MANSOR, 2005).

O ribeirão Tabajara possui água de melhor qualidade na bacia do Pinhal, suas nascentes

estão localizadas nas divisas com os municípios de Limeira, Araras e Cordeirópolis, afastadas de

aglomerados urbanos, livres de lançamentos de esgotos domésticos e com poucas habitações na

área agrícola ocupada com cana de açúcar e pomares cítricos (BRANDÃO, 2001).

Estudos anteriores realizados na bacia do ribeirão Pinhal apontam as águas do ribeirão

Pires como sendo a mais tóxica para o organismo-teste Ceriodaphnia dubia. Foram realizados


ensaios com amostras de água superficial do ribeirão Pires, Pinhal e Tabajara entre o período de

2008 à 2009 e 2011 à 2012 e as amostras do ribeirão Pires coletadas próximo a Igreja Luterana no

Bairro dos Pires, apresentaram toxicidade aguda para o organismo em questão em todos os ensaios

(CRUZ e REGANHAN-CONEGLIAN, 2012; RUIZ et al., 2008).

3.2 Contaminação da Água

À medida que a humanidade aumenta seu potencial tecnológico de intervir na natureza,

para satisfazer suas necessidades e desejos crescentes, surgem os conflitos de interesse quanto ao

uso do espaço, dos recursos hídricos e da disposição dos resíduos no ambiente (ZAGATTO e

BERTOLETTI, 2008).

As principais fontes de contaminação dos recursos hídricos são os defensivos agrícolas

que escoam com a chuva, sendo arrastados para os rios e lagos, lançamentos de esgotos sem

tratamento, aterros sanitários que afetam os lençóis freáticos e as indústrias que utilizam os rios

como corpos receptores de seus efluentes (YU, 2005).

A qualidade final nos corpos d’água reflete as atividades que são desenvolvidas em toda

a bacia e cada um dos usos do seu espaço físico produz efeito específico e característico, ou seja,

as características dos compostos determinam a sua capacidade de percolação no solo, solubilidade,

bioacumulação, adsorção na matéria orgânica, etc (PLAA, 1982).

Nas últimas décadas, para atender o crescimento populacional, aumentou-se a produção

agrícola para atender o mercado interno e externo. Este aumento agrícola contribuiu de forma

efetiva para a contaminação das águas superficial e subterrânea, essa contaminação pode ocorrer

através do despejo de nutrientes, como os fertilizantes a base de fósforo e nitrogênio, detritos de

animais, que através da chuva são carreados para os recursos hídricos, e que em excesso podem

levar ao processo de eutrofização (MACÊDO, 2002).

De acordo com o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Renováveis

(IBAMA) o Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, devido ao amplo uso em áreas

agrícolas e urbanas. Estes apresentam diferentes graus de toxicidade, tanto para os seres humanos

como para a biota e dependendo das características dos mesmos, como solubilidade em água,

persistência e mobilidade no solo, podem alcançar o lençol freático por lixiviação ou os rios

diretamente por escoamento superficial. As principais culturas da produção agrícola nacional em


2008 foram: cana-de-açúcar, soja, milho, mandioca, laranja e arroz, onde cada cultura emprega

diferentes ingredientes ativos, sendo assim a ocorrência de um praguicida no ambiente é decorrente

da atividade agrícola existente em determinada região (IBAMA, 2010).

Armas et al. (2007) detectaram resíduos de atrazina, ametrina, simazina, hexazinona,

clomazona e glifosato nas águas superficiais do rio Corumbataí, afluente do rio Piracicaba - SP, no

período entre 2004 e 2005. As concentrações de ametrina e atrazina excederam em alguns períodos

os valores máximos permitidos, descritos nas Portaria MS 2.914/2011 (BRASIL, 2011) e na

Resolução CONAMA 396/2008 (BRASIL, 2008).

As atividades industrias também contribuem drasticamente, impactando os ambientes

aquáticos, devido ao lançamento de efluentes líquidos nos corpos receptores. Esses efluentes além

de tóxicos, são de difícil caracterização, podendo variar de acordo com a atividade industrial,

qualidade de matéria-prima e ciclo produtivo. Assim, os efluentes gerados são formados por

misturas complexas de substâncias químicas, muitas delas tóxicas aos organismos aquáticos e

também aos seres humanos (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2008).

Através de estudos realizados com amostras de água superficial e sedimento do ribeirão

Graminha e ribeirão Águas da Serra no município de Limeira-SP, verificou-se a presença de metais

como ferro, cromo, níquel, cobre, zinco e paládio. As concentrações de cromo, níquel e zinco em

algumas amostras de sedimento atingiram valores superiores ao Valor de Referência de Qualidade

(VRQ) estabelecido como valor orientado pela Companhia Ambiental do Estado de São Paulo

(CETESB, 2001). Estes resultados podem indicar a interferência da indústria de produção de jóias,

uma vez que esses metais são amplamente utilizados no setor citado (FAZZA, 2007).

Segundo a legislação brasileira CONAMA 357/2005, a qualidade da água em seus

parâmetros físicos, químicos, microbiológicos e ecotoxicológicos deve ser monitorada, de modo a

assegurar seus usos múltiplos que inclui a proteção das comunidades aquáticas (BRASIL, 2005).

3.3 Ensaios Ecotoxicológicos

A ecotoxicologia foi reconhecida mundialmente a partir dos anos 60. O Dr. Rene Truhaut,

membro da Academia de Ciências da França criou o termo “Ecotoxicologia” em 1969 e o definiu

como “o estudo dos efeitos adversos de substâncias químicas com o objetivo de proteger espécies

naturais e populações” (TRUHAUT, 1977).


Atualmente a ecotoxicologia é reconhecida como a ciência que estuda os efeitos tóxicos

de agentes químicos e físicos, sejam eles naturais ou sintéticos nos organismos vivos, populações

e comunidades, animais ou vegetais, terrestres ou aquáticos, que constituem a biosfera; esses

estudos incluem as vias de entrada e transporte dos agentes tóxicos, bem como a sua interação e

respostas sobre a biota (PLAA, 1982; BERTOLETTI, 1990; YU, 2005). É uma ciência

multidisciplinar que engloba várias áreas de conhecimento, tais como biologia, ecologia, química

(orgânica, analítica e bioquímica), anatomia, genética, fisiologia, epidemiologia, estatística entre

outras (YU, 2005).

Os estudos ecotoxicológicos possibilitam uma visão mais ampla dos efeitos tóxicos não

apenas de uma substância isolada, mas também da interação e magnitude de vários agentes

presentes em determinado ambiente. Assim, a avaliação ecotoxicológica de determinado ambiente

passa pelo conhecimento das fontes de emissão dos poluentes, bem como de suas transformações,

difusões e destinos no ambiente (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2008).

Os testes de toxicidade são ensaios laboratoriais realizados em condições experimentais

específicas e controladas, utilizados para estimar a toxidade de substâncias, efluentes e amostras

ambientais. Consiste em expor os organismos-teste a diferentes concentrações de uma ou mais

substâncias durante determinado período de tempo de exposição, analisando os efeitos adversos

observados (COSTA et al., 2008). Mediante estes ensaios é possível, por exemplo, estabelecer

limites permissíveis para diversas substâncias químicas através de critérios de derivação. Ou seja

valores máximos toleráveis que garantem os usos pretendidos da água definidos para condições

genéricas de exposição, no caso de organismos aquáticos os dados podem ser usados para definir

critérios para proteção da vida aquática (MOURA, 2009).

Sendo assim, estes testes deveriam ser utilizados como rotina nos órgãos ambientais no

âmbito do licenciamento e da fiscalização de atividades potencialmente tóxicas, bem como no

monitoramento da qualidade das águas, sendo mais aplicado em ações preventivas por meio de

bioensaios que utilizam organismos de diversos hábitos e níveis tróficos (MOURA, 2009).

Várias espécies de organismos vêm sendo empregadas em ensaios de ecotoxicidade,

gerando subsídios importantes para melhor compreensão dos efeitos agudos e crônicos de

substâncias em diversas matrizes ambientais (BARBOSA, 2010).

São exemplos de organismos-teste bactérias (i.e. Vibrio fisheri), algas

(Pseudokirchneriella subcaptata), moluscos (Perna perna) crustáceos (Daphnia sp., Ceriodaphnia


sp., Hyallela azteca, entre outros), insetos (Chironomus sp., Hexagenia sp.), peixes (Danio rerio,

Pimephales promelas), organismos terrestres (Eisenia, sp., Folsomia sp.), além de muitas outras

espécies de diferentes hábitos e nichos ecológicos (KEDDY et al, 1995).

A utilização de cladóceros como organismo-teste em ensaios de toxicidade tem como

principais vantagens: ciclo de vida relativamente curto, o que permite avaliar respostas crônicas;

possibilidade para cultivo em laboratório; reprodução em condições normais por partenogênese,

com descendentes geneticamente idênticos, o que assegura certa uniformidade de respostas nos

ensaios; sensibilidade para a maioria das substâncias potencialmente tóxicas, além disso, são

adequados para testes estáticos, semi-estáticos ou de fluxo contínuo (BORRELY, 2001; RAND e

PETROCELLI, 1985).

Os microcrustáceos Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia (Figura 2) são da ordem

Cladocera, família Daphniidae, atingem comprimento aproximado de 3 mm e 0,8 mm,

respectivamente, em geral desempenham papel importante na cadeia alimentar, pois são

consumidores primários, alimentam-se de algas e servem de alimento para os consumidores

secundários, como peixes e outros vertebrados. Assim sendo, mudanças no comportamento destes

organismos podem interferir nos outros níveis tróficos do ecossistema aquático (ALLAN, 1976;

CETESB, 1999)

Como em todo cladócera, o ciclo de vida da Daphnia similis e da Ceriodaphnia dubia

consiste em fases alternadas de partenogênese. Neste tipo de reprodução, a população é composta

apenas por fêmeas. O desenvolvimento direto, ou seja, aquele em que os indivíduos jovens são

semelhantes aos adultos, ocorre em uma câmara incubadora dorsal. Quando o jovem deixa a

câmara, a fêmea sofre ecdise, ou troca de carapaça, e uma nova desova é liberada na nova câmara

incubadora (RUPPERT et al., 2005).

Em condições desfavoráveis esses microcrustáceos adotam estratégias de sobrevivência,

por isso no ambiente da cultura, tais como variações fora dos limites na temperatura e no

fotoperíodo, excesso ou falta de alimento e superpopulação, interferem na reprodução desses

microcrustáceos, favorecendo o aparecimento de machos e conseqüentemente de efípios

(espessamento de coloração escura contendo ovos de resistência), resultantes da reprodução

sexuada. Quando mais de um efípio surgir em um lote do cultivo, os organismos jovens produzidos

neste lote não devem ser utilizados no ensaio e o procedimento do cultivo deve ser reavaliado

imediatamente (ABNT, 2009).


FIGURA 2 - Microcrustáceos (a) Daphnia similis e (b) Ceriodaphnia dubia, organismos-teste utilizados

nos ensaios de toxicidade

(a) (b) Fonte: Sakata (2013).

3.3.1 Testes de toxicidade aguda

O teste de toxicidade aguda é utilizado com o objetivo de estabelecer a concentração de

determinando contaminante que produz efeitos danosos a um organismo, por meio de curto tempo

de exposição, geralmente em intervalo de 0 a 96 horas, resultando em danos biológicos severos ou

a morte destes. Geralmente, o efeito observado é a letalidade ou outra manifestação que a antecede,

como o estado de imobilidade em invertebrados (PANKRATZ, 2001; MAGALHÃES e FERRÃO

FILHO, 2008).

Os resultados dos testes de efeito agudo são expressos em Concentração Efetiva (CE) e/ou

Concentração Letal (CL), onde a CE e/ou CL50, são respectivamente a concentração efetiva média

ou concentração letal média, isto é, a concentração da substância em análise que causa efeito agudo

em 50% dos organismos testados (ABNT, 2009).

De forma geral, os testes agudos não apresentam custos elevados, são confiáveis e simples

de serem desenvolvidos, possuem resposta relativamente rápida, porém existem algumas


limitações, tais como: não avaliam a maneira como a mortalidade aumenta após a exposição, uma

vez que esses testes são de curta duração (MAGALHÃES e FERRÃO FILHO, 2008).

3.3.2 Testes de toxicidade crônica

Os testes de toxicidade crônica são ferramentas indispensáveis na ecotoxicologia, pois no

ambiente aquático, em geral, os organismos estão expostos a níveis subletais dos poluentes que,

embora não apresentem efeito adverso agudo, podem causar distúrbios fisiológicos e/ou

comportamentais em longo prazo. É interpretado pela resposta a um estímulo da substância em

análise que continua por longo tempo, geralmente por períodos que podem abranger parte ou todo

o ciclo de vida do organismo-teste (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2008).

Os resultados obtidos nos testes de toxicidade crônica geralmente são expressos como

Concentração de Efeito Não Observado (CENO), ou seja, a maior concentração testada que não

causa efeito adverso aos organismos-teste; e tambem como Concentração de Efeito Observado

(CEO), ou seja é a menor concentração que causa efeito estatisticamente significativo nos

organismos-teste; Concentração de Inibição 25% (CI25) (ABNT, 2010).

Em ambientes aquáticos os efeitos adversos crônicos são mais frequentes devido à

concentração ser influenciada pela diluição (toxicidade crônica na maioria dos casos), e demais

interações relacionadas diretamente a biodisponibilidade dos contaminantes presentes. Dessa

forma, os organismos são expostos às baixas concentrações de determinados poluentes durante

longos períodos de tempo, ocasionando efeitos crônicos a níveis subletais e até mesmo letais

durante seu ciclo de vida (MAGALHÃES e FERRÃO FILHO, 2008).

3.4 Avaliação e Identificação da Toxicidade

Apesar dos testes de toxicidade serem ferramentas importantes para identificar os

impactos de substâncias tóxicas no ambiente, eles não fornecem indicações diretas da causa ou

origem específica da toxicidade (MELO et al., 2013; HONGXIA et al., 2004; MAGALHÃES e

FERRÃO FILHO, 2008). Portanto, conhecer a causa da toxicidade é fundamental para o seu

eficiente controle. Por isso a USEPA em 1991 desenvolveu um método para auxiliar na


identificação de substâncias tóxicas em efluentes, esse método é conhecido como Avaliação e

Identificação da Toxicidade (AIT).

Os estudos de AIT têm sido desenvolvidos como parte integrante dos protocolos de

Avaliação e Redução da Toxicidade (ART), que apresentam como objetivo a redução da toxicidade

de efluentes ou sua manutenção em níveis aceitáveis (USEPA, 1989b). O protocolo de ART

apresenta outros componentes, como de Investigação das Fontes (IF) e Avaliação da Tratabilidade

da Toxicidade (ATT), que além de identificar a substância causadora da toxicidade, também avalia

medidas mitigadoras (BLAISE e FÉRARD, 2005; MELO, 2012).

O método de AIT compreende 3 fases distintas, sendo de caracterização (USEPA; 1991,

1992b), identificação (USEPA, 1993a) e confirmação da toxicidade (USEPA, 1993b). O princípio

do método de AIT baseia-se no fracionamento das amostras por meio de uma série de processos

físicos e químicos, objetivando eliminar ou separar grupos de compostos para verificação de seu

potencial tóxico (MELO et al., 2013).

3.4.1 Avaliação e identificação da Toxicidade – Fase I

As séries de manipulações da fase I tem como objetivo caracterizar a natureza físico-

química das substâncias tóxicas presentes na amostra, identificando classes destas substâncias, ou

seja, a amostra é dividida em diversas alíquotas que são submetidas a variadas manipulações físicas

e/ou químicas de modo a remover, alterar ou tornar biologicamente não disponível determinado

grupo de agentes tóxicos (USEPA; 1991,1992b).

A Figura 3 apresenta em forma de fluxograma as manipulações realizadas nessa etapa,

são elas: ajustes e graduação de pH, adição de EDTA, adição de tiossulfato de sódio, extração em

fase sólida (SPE) com C18, filtração e aeração (USEPA; 1991,1992b).


FIGURA 3 - Etapas para caracterização de substâncias tóxicas na Fase I - AIT (Adaptado de USEPA,

1992b)

pH 3pH inicial

pH 9

Teste de toxicidade

inicialAmostra

Teste de toxicidade

Adição de tiossulfato de sódio

Adição de EDTA

pH 3pH inicial

pH 11

Aeração Filtração

Graduação de pH (6 e 9)

Ajuste para pH inicial

Extração em fase sólida

Na graduação de pH a amostra é ajustada em uma faixa fisiologicamente tolerável pelo

organismo-teste (pH 6,0 e 9,0). Geralmente, a forma não-ionizada de algumas substâncias

apresenta maior toxidade do que formas ionizadas, como no caso da amônia (NH3) que se forma

em pH elevado e apresenta toxicidade mais elevada em relação a sua forma ionizada (NH4+), o

equilíbrio iônico de sulfetos, cianetos e alguns compostos orgânicos como certos pesticidas

também tem sua toxicidade e propriedades físico‐químicas afetadas pela graduação de pH

(ERICKSON, 1985; USEPA; 1991, 1992b).

No ajuste de pH os compostos catiônicos e aniônicos têm sua toxicidade alterada em

função de sua biodisponibilidade. Pelo fato de espécies ionizadas e não-ionizadas apresentarem

propriedades influenciadas pelo pH, por isso são realizados ajustes de pH antes de outras

manipulações na amostra, como filtração, aeração e extração em fase sólida, visto que a

combinação desses tratamentos poderá detectar alterações na solubilidade, volatilidade, especiação

e estabilidade das substâncias (ERICKSON, 1985; MELO, 2012; USEPA, 1991).

A filtração da amostra pode separar compostos tóxicos associados com sólidos suspensos

ou material particulado em diferentes valores de pH. No caso de suspeita de metais pode-se usar


filtros de acetato de celulose. Caso exista a redução da toxidade e seja necessário a confirmação da

toxidade, pode-se realizar um ensaio de recuperação da toxicidade, onde o filtro pode ser

ultrassonificado utilizando-se água de cultivo (USEPA, 1991).

Na etapa de aeração substâncias oxidáveis, voláteis ou subláteis podem ser identificadas

caso esta manipulação reduza a toxicidade. Sendo assim torna-se necessário a realização de testes

complementares para diferenciação dos compostos, posteriormente pode-se aerar a amostra com

nitrogênio; se ocorrer a redução da toxidade os compostos são voláteis, caso a aeração com

nitrogênio não diminua a toxicidade os compostos presentes são oxidáveis; para detectar se os

compostos tóxicos são subláteis é necessário lavar a parede do recipiente onde a aeração foi

realizada e utiliza-la em um ensaio de recuperação da toxicidade (USEPA, 1991).

A adição do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) pode identificar a toxicidade

relacionada a metais catiônicos. Esse agente quelante complexa os metais catiônicos reduzindo a

toxicidade do alumínio, cadmio, bário, cobalto, cobre, ferro, chumbo, níquel, manganês, estrôncio

e zinco. O EDTA não complexa metais aniônicos e complexa fracamente alguns metais catiônicos

como prata, cromo e tálio. Deve- se observar que o excesso de EDTA na solução pode aumentar

sua toxicidade e levar a falsos resultados. Portanto, deve- se avaliar a sensibilidade dos organismos

testados e utilizar concentrações do agente quelante que não causem toxicidade intrínseca (USEPA,

1991, 1992b, 2007; MELO, 2012).

A adição de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) tem por finalidade detectar a toxicidade de

substâncias oxidantes como cloro, ozônio, bromo e íons de manganês, além de reduzir a

biodisponibilidade de alguns metais catiônicos, como cádmio, cobre e mercúrio. Assim como o

EDTA o tiossulfato de sódio em determinadas concentrações pode ser tóxico para o organismo

teste, portanto, testes preliminares de sensibilidade devem ser realizados e concentrações que não

produzam efeito adverso devem ser utilizadas nos testes de toxicidade (USEPA; 1991, 1992b).

A extração em fase sólida ou Solid Phase Extraction (SPE) tem por objetivo identificar a

toxicidade de compostos orgânicos apolares neutros como certos pesticidas, e em pH 3 e 9 ocorre

a remoção de compostos orgânicos moderadamente apolares ácidos ou básicos, ou seja o composto

que estiver predominantemente em sua forma não ionizada será adsorvido na coluna/cartucho de

C-18 (Paschoal, 2002). Ensaios de recuperação da toxicidade podem ser realizados, pois os

compostos retidos estão concentrados e podem ser eluídos com solventes específicos e utilizados


em testes de toxicidade; desta forma é possível identificar se a coluna funcionou como extração de

fase sólida ou apenas como filtro (DURHAN et al., 1993; BARBOSA, 2010).

A Tabela 1 expressa de forma simplificada as manipulações da amostra fracionada na

Fase I e seus respectivos grupos de agentes tóxicos que podem ser identificados em cada

manipulação realizada.

TABELA 1 - Manipulações da Fase I e seus respectivos agentes alvo (Adaptado de BURATINI et al, 2007;

BARBOSA, 2010)

Manipulação Agente alvo

Graduação de pH Amônia, sulfetos, metais, cianetos, substâncias orgânicas

ionizáveis com toxicidade influenciadas pelo pH

Ajuste de pH Compostos orgânicos e inorgânicos (sulfetos, cianetos,

amônia, metais) com propriedades influenciadas pelo pH

Filtração Sólidos orgânicos filtráveis ou com solubilidade dependente

do pH

Aeração Voláteis (solventes orgânicos), oxidáveis (cloro) e subláteis

(surfactantes)

Adição de EDTA Metais catiônicos (Cr, Al, Cd, Cu, Fe, Pb, Mn, Ni, Zn)

Adição de Tiossulfato de

Sódio

Oxidantes (cloro, peróxidos) e metais catiônicos (Cu, Cd e

Hg)

Extração em Fase Sólida Compostos orgânicos não polares (solventes, pesticidas,

fenóis)

3.4.2 Avaliação e Identificação da Toxicidade – Fase II

Corresponde à fase de identificação do agente tóxico, em que as técnicas de fracionamento

da amostra tóxica obtidas na Fase I são aplicadas em conjunto com análises químicas, voltadas à

identificação dos contaminantes suspeitos (USEPA, 1993b).

A redução na toxicidade após tratamento com EDTA orientam as metodologias de análises

para identificação e quantificação de metais, podendo estas serem realizadas por

Espectrofotometria de Absorção Atômica, Plasma Indutivamente Acoplado, Fluorescência de raio

X ou testes complementares podem ser feitos com resinas de troca iônica, fornecendo evidências


mais fortes para as análises quali‐quantitativas (BARBOSA, 2010; RESGALLA Jr, 2012;

MOREIRA e FAZZA, 2008; USEPA, 1993a); na redução após tratamento com C18 pode-se usar

diversas técnicas para detecção de substâncias orgânicas apolares como Cromatografia Gasosa ou/e

acoplada a Espectroscopia de Massa (CG-MS) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(HPLC), etc (BARBOSA, 2010; QUEIROZ et al., 2009; SILVA et al., 2011; USEPA, 1993a).

Embora existam diversas técnicas é importante ressaltar que o método analítico escolhido

na Fase II dependerá da concentração de interesse que cause toxicidade ao organismo teste utilizado

na Fase I. Mesmo sendo frequentemente identificada a classe dos compostos responsáveis pela

toxicidade da amostra, a confirmação de compostos individuais é mais difícil, como no caso dos

compostos orgânicos polares (BLAISE e FÉRARD, 2005). Porém, essa confirmação nem sempre

é necessária, visto que em alguns casos somente a classe dos compostos tóxicos pode fornecer

informações suficientes para determinar o tratamento apropriado ou opções de controle da fonte da

toxicidade (MELO, 2012).

3.4.3 Avaliação e identificação da Toxicidade – Fase III

Considerada a fase mais crítica do AIT, esta última Fase tem como finalidade confirmar

se de fato o agente tóxico caracterizado na Fase I e identificado na Fase II é realmente o responsável

pela toxicidade encontrada na amostra ambiental (USEPA, 1993b; BLAISE e FÉRARD, 2005;

LEUSCH et al., 2012; MELO, 2012).

Existem diferentes métodos para a confirmação da toxicidade: análises de correlação,

observação de sintomas, sensibilidade comparada de espécies e adição de contaminante (spiking).

A aplicação de mais de um método implica em maior confiança nos resultados finais da

confirmação da toxicidade (USEPA, 1993b; LEUSCH et al., 2012).

3.4.3.1 Análises de correlação

Resultados dos testes de toxicidade são correlacionados com a concentração medida do

composto suspeito de conferir toxicidade às amostras ambientais com a toxicidade relativa do

composto suspeito. Se o composto for de fato responsável pela toxicidade, então essa comparação

irá apresentar uma correlação significativa. A análise de correlação deve ser sempre usada com

pelo menos um dos outros métodos descritos a seguir, pois os resultados obtidos podem ser


atribuídos a um evento distinto ou a poluentes de ocorrência constante (USEPA, 1993b; LEUSCH

et al., 2012; MELO, 2012).

3.4.3.2 Observação de sintomas

Este método consiste em testar a toxicidade de presumível tóxico quer in vitro ou in vivo

para confirmar que essa exposição resulta em sintomas semelhantes a exposição para a amostra

ambiental. Se o composto suspeito é de fato a fonte de toxicidade, os sintomas devem ser

semelhantes (USEPA, 1993b; LEUSCH et al., 2012; MELO, 2012).

3.4.3.3 Sensibilidade comparada de espécies

Este método baseia-se no fato de que diferentes espécies e diferentes ensaios apresentam

sensibilidades diferentes para a mesma substância tóxica (USEPA, 1993b; LEUSCH et al., 2012;

MELO, 2012). Por exemplo, as microalgas Monoraphidium arcuatum são significativamente mais

sensíveis ao arsênio V do que as microalgas Chlorella sp. Se o arsênio V for o presumível agente

tóxico, deveria se prever que a amostra testada também seria significativamente mais tóxica para a

M. arcuatum que para a Chlorella sp (LEVY et al., 2005).

3.4.3.4 Método de adição de contaminantes (spiking)

O método consiste em adicionar o composto tóxico suspeito à amostra em concentrações

crescentes, e determinar se a toxicidade aumenta proporcionalmente à quantidade do composto

adicionado, esse método pode revelar o comportamento geralmente inerente de certas substâncias

frente a um tratamento específico (USEPA, 1993b; LEUSCH et al., 2012; MELO, 2012).

3.4.4 Estudos relacionados a AIT

Grande número de estudos científicos tem realizado o procedimento de AIT na tentativa

de identificar compostos tóxicos, incluindo pesticidas (AMATO et al., 1992; BAILEY et al., 2005;

BAILEY et al., 2000), metais (BURGESS et al., 1995), e compostos que estão relacionados a

desreguladores endócrinos (HEWITT et al., 1998; QUINN et al., 2004; THOMAS et al., 2004a;

THOMAS et al., 2004b; DESBROW et al., 1998), em uma variedade de matrizes.

Segundo Melo (2012) os EUA é o país que apresenta maior volume de trabalhos

científicos empregando o protocolo de AIT, seguido pela Inglaterra e Canadá. No Brasil o


protocolo de AIT é pouco estudado, porém alguns estudos podem ser citados, como: em efluentes

de indústria de cosméticos (MELO et al, 2013), efluentes de refinaria (TORRES et al., 2005),

efluentes de fábricas de papel e celulose (FURLEY, 2009), bem como sedimentos (ARAÚJO et

al., 2006; PASCHOAL, 2002) águas superficiais (BURATINI et al, 2007; BARBOSA, 2010).

Estes estudos apontam que a identificação de classes químicas associadas com a toxicidade é

frequentemente possível, mas a confirmação de compostos individuais tem sido mais difícil

(HEWITT e MARVIN, 2005).

A Tabela 2 apresenta de forma resumida alguns trabalhos de AIT realizados no Brasil

com diferentes amostras e suas respectivas substâncias tóxicas encontradas.

TABELA 2 – Resumo de trabalhos de AIT realizados no Brasil

Amostra Substância(s) identificada(s) Referência

Sedimento Cianobactérias MATOS et al., 2014

Sedimento Amônia ARAÚJO et al., 2006

Água superficial Orgânicos e pH BARBOSA, 2010

Água superficial Zinco e orgânicos BURATINI et al, 2007

Efluentes Orgânicos FURLEY, 2009

Efluentes Orgânicos, voláteis e suspensos MELO et al, 2013

Efluentes Surfactantes TORRES et al., 2005

Sedimento Orgânicos, amônia e metais PASCHOAL, 2002

Na Austrália os procedimentos de AIT foram utilizados com sucesso na identificação dos

pesticidas clorfenvinfos como a causa da toxicidade aguda em águas residuais oriundas de

tratamento de esgotos municipais. Medidas de controle na fonte poluidora foram implementadas

com sucesso para eliminar a toxidade associada aos clorfenvinfos lançados no corpo d’água

(BAILEY et al., 2005).

Levantamentos realizados nos EUA e Europa apontam amônia e pesticidas como

principais responsáveis pela toxicidade em efluentes, da mesma forma outras matrizes como água

doce e marinha intersticial apontam combinações de diversos contaminantes; sendo a combinação


mais frequente amônia e compostos orgânicos não polares. Na Figura 4 esse cenário é

caracterizado através de diversos artigos pesquisados (n), onde os valores de toxicidade estão

expressos em porcentagem.

FIGURA 4 – Resultados de toxicidade encontrados em AIT, em diversas matrizes através de (n) artigos

pesquisados nos EUA e Europa (Adaptado de BURGESS et al., 2013)

21

4 Material e métodos

4.1 Material

4.1.1 Local de coleta

Para o presente trabalho foram selecionados 3 pontos de coleta no ribeirão Pires localizados

nas proximidades da rodovia Limeira – 340 (Figuras 5 e 6). De acordo com estudos realizados por

Cruz e Reganhan-Coneglian (2012) e Ruiz et al. (2008) foi selecionado o ponto de coleta E2, que

nos respectivos trabalhos sempre apresentou toxicidade aguda em ensaios de toxicidade crônica

para o organismo-teste Ceriodaphnia dubia.

Esta estação de coleta E2 situa-se as proximidades da igreja Luterana do Bairro dos Pires,

existe uma rotatória no local, vestígios de mata ciliar e um bambuzeiro na margem oposta ao local

da coleta.

O ponto de coleta E1 situa-se próximo à estação elevatória - Pires, da empresa Odebrecht

Ambiental. As amostras foram coletadas sobre uma ponte de madeira existente no local, próximo

à área urbana e a montante do ponto E2.

Por fim a jusante do ponto E2 está o ponto de coleta E3 localizado em uma estrada de

cascalho paralela ao Km 9 da rodovia Limeira – 340. Situa-se sobre a ponte 36 do bairro dos Pires,

apresenta sobre o entorno grande parte de mata ciliar.

Para a realização das análises com amostras de água do ribeirão Pires foram realizadas 6

campanhas de coletas entre o período de setembro de 2013 a julho de 2014 nas 3 estações de coleta

conforme a Figuras 5 e 6.

22 Capítulo 4. Material e métodos

FIGURA 5 - Fotografia aérea das estações de coleta de agua no ribeirão Pires. E1 (22°33'22.89"S e

47°21'59.68"O), E2 (22°34'15.73"S e 47°20'32.59"O), E3 (22°35'45.62"S e 47°18'59.19"O)

Fonte: Adaptado (Google Earth)

FIGURA 6 – Fotografias dos pontos de amostragem no ribeirão Pires

E1 E2 E3

Fonte: Autoria própria


4.1.2 Caracterização da área de estudo

Para a efetivação desse projeto foram realizadas visitas periódicas ao entorno da área de

estudo, sendo possível demarcar as prováveis fontes de contaminação das águas do ribeirão Pires,

conforme ilustrado na Figura 7.

Traçou-se o trajeto da nascente até a foz do ribeirão Pires. Na nascente nota-se que a

mesma foi aterrada e canalizada para a construção de um estacionamento de Shopping Center e no

entorno do Shopping situa-se uma indústria de tanques de lavar roupas e outra de recipientes

plásticos, um grande supermercado e uma loja de materiais de construção.

Seguindo o curso d’água o ribeirão Pires ainda canalizado passa por debaixo da rodovia

Anhanguera, forma uma pequena lagoa as margens da rodovia seguindo por uma região urbana

onde passa a céu aberto pelo Jardim Nova Limeira.

Encontra-se a sua margem direita uma estação elevatória de esgoto que recebe efluentes

de várias indústrias de grande porte do ramo automotivo, e uma indústria que produz máquinas

agrícolas.

A seguir suas águas começam a percorrer a área rural da cidade pelo Bairro dos Pires,

onde a plantação de pomares de laranja é a atividade agrícola predominante, seguida em menor

proporção pelo cultivo de cana de açúcar, sendo essas as maiores responsáveis pela introdução de

possíveis agrotóxicos ao manancial.

Na margem direita existe um cemitério antigo situado próximo de uma churrascaria,

posteriormente há vestígios de mata ciliar, e por fim após percorrer cerca de 18 Km suas águas

desembocam na margem direita do ribeirão Pinhal.


FIGURA 7 - Mapeamento do entorno do ribeirão Pires baseado em possiveis fontes de contaminação das

águas


4.1.3 Equipamentos, reagentes e vidrarias

Foram utilizados os equipamentos e vidrarias usuais do laboratório de microbiologia, de

análises físico-químicas de águas e de ecotoxicologia aquática. Os reagentes utilizados foram de

grau p.a., armazenados e preparados de acordo com Apha (2012).

4.2 Métodos

4.2.1 Métodos de coleta e preservação das amostras

As amostras de água superficial foram coletadas de acordo com protocolos para coleta e

amostragem de água superficial (CETESB, 2011). No local da coleta foram realizadas as análises

de temperatura, oxigênio dissolvido e logo ao chegar ao laboratório as análises de condutividade,

dureza e pH.

As amostras de água foram coletadas com balde de inox e transferidas para frascos de 1

L de polipropileno, as mesmas foram resfriadas e/ou congeladas até o momento dos testes. Para os


testes de AIT (Fase I) as amostras foram coletadas em frascos de 5 L de polipropileno, onde

alíquotas reservadas foram refrigeradas e/ou congeladas de acordo com a norma NBR 12713

(ABNT, 2009) que recomenda a refrigeração das amostras utilizadas em até 7 dias e o

congelamento das amostras utilizadas em até 40 dias. Para os testes de AIT (Fase II) as amostras

foram coletadas em frascos de vidro âmbar de 500 mL e preservadas com 5 mL de ácido nítrico,

refrigeradas em caixa térmica e levadas no mesmo dia da coleta a um laboratório terceirizado

encarregado pelas análises.

4.2.2 Métodos para análises físico-químicas

Foram realizadas análises de temperatura, pH, Oxigênio Dissolvido (OD), condutividade e

dureza de acordo com Apha (2012).

4.2.3 Métodos dos testes ecotoxicológicos

4.2.3.1 Testes de sensibilidade

Os testes de sensibilidade foram realizados quando possível mensalmente de acordo com

as recomendações da norma técnica (ABNT, 2009; ABNT, 2010), com a substância de referência

cloreto de sódio (NaCl) para Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia, para avaliar as condições

fisiológicas do lote de organismos-teste. Os resultados devem estar compreendidos entre os dois

desvios ‐ padrão (superior e inferior) da média acumulada de uma série de testes mensais que

compõem a carta‐controle (USEPA, 1992a; ABNT, 2009).

4.2.3.2. Ceriodaphnia dubia e Daphnia similis

Os testes de toxicidade crônica utilizando-se o organismo-teste Ceriodaphnia dubia foram

realizados de acordo com o protocolo padronizado (ABNT, 2010), o mesmo ocorreu para

toxicidade aguda com Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia (ABNT, 2009).

Os resultados obtidos para toxicidade aguda foram calculados e reportados como CE50,

acrescidos de seus respectivos intervalos de confiança com o auxílio do software Trimmed

Spearman-Karber Method (HAMILTON, 1977).


Para a metodologia de AIT (Fase I) após calculado a CE50 da amostra bruta (teste

preliminar), as amostras fracionadas foram testadas em dose única (100%) e os resultados foram

expressos em não tóxico ou tóxico e presença de toxicidade aguda quando foi o caso.

As Tabelas 3 e 4 apresentam de forma resumidas os requisitos para os ensaios de toxicidade

crônica, com o organismo-teste Ceriodaphnia dubia e toxicidade aguda, com os organismos-testes

Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia, respectivamente.

TABELA 3 - Resumo dos requisitos para os ensaios de toxicidade crônica, mediante o organismo-teste

Ceriodaphnia dubia

Requisitos Condições

Duração Aprox. 7 dias (~ 168h)

Neonatas ≤ 24 horas

Agua de diluição Agua deionizada reconstituída

Volume da solução (teste) 50 mL

Número de réplicas por diluição 10

Número de indivíduos por replica 1

Reposição da solução teste A cada 48h

Alimentação A cada 48h

Temperatura 23oC ± 2 oC

Fotoperíodo 16 horas com luz/8 horas sem luz

Endpoint Reprodução e sobrevivência

Expressão dos Resultados Toxico ou não toxico


TABELA 4 - Resumo dos requisitos para os ensaios de toxicidade aguda, mediante os organismos-testes

Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia

Requisitos Condições

Duração 48 horas

Neonatas ≤ 24 horas

Agua de diluição Agua deionizada ou natural reconstituída

Volume da solução (teste) 10 mL

Número de réplicas por diluição 4

Número de indivíduos por replica 5

Reposição da solução teste Sem reposição

Alimentação Sem alimento

Temperatura 21oC ± 2 oC

Fotoperíodo Sem luz

Endpoint Morte e imobilidade

Expressão dos Resultados Toxico ou não toxico

Realizou-se os testes de toxicidade aguda com os organismos-teste Daphnia similis e

Ceriodaphnia dubia e toxicidade crônica com Ceriodaphnia dubia, nas amostras de água

superficial do ribeirão Pires e nas amostras manipuladas de acordo com protocolo de AIT.

4.2.4 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase I)

Os procedimentos descritos a seguir foram realizados na FT-UNICAMP, onde as

manipulações foram aplicados às amostras e brancos (água de cultivo), de acordo

com o protocolo da USEPA (1992b).

4.2.4.1 Graduação de pH

O pH das amostras e seus respectivos brancos foram ajustados a faixa fisiologicamente

tolerável aos organismos teste (6 e 9) com a adição de ácido clorídrico (HCl) 1N e/ou 0,1N

(ECIBRA) e hidróxido de sódio (NaOH) 1N e/ou 0,1N (SIGMA - ALDRICH), não permitindo

que os reagentes adicionados ultrapassassem 10% do volume inicial da amostra. O ajuste foi

realizado com o auxílio de um pHmetro (Marte modelo MB-10) devidamente calibrado, onde a


amostra permaneceu sob agitação magnética até a estabilização da leitura conforme Figura 8 (a)

e (b). Após esse processo as amostras foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade

conforme protocolos da CETESB (2011).

FIGURA 8 – (a) Fotografia da manipulação de graduação de pH, (b) Ilustração dos procedimentos

aplicados

(a)

pHmetro Marte modelo

MB-10

Agitador

magnético

NaOH e/ou HCl

(1N e/ou 0,1N)

Amostra

armazenadaTeste de

toxicidade

aguda

pH 6 e 9

(b)



4.2.4.2 Aeração com ajuste de pH

As amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) (Figura 9 a) foram dispostas em

frascos Erlenmeyers de 500 mL. Em seguida foram posicionadas ao centro de cada recipiente com

o auxílio de uma rolha de borracha, com diâmetro de furo aproximadamente 3 vezes maior que da

pipeta de vidro de 5 mL, para a retirada de possíveis voláteis. O sistema foi conectado por meio

de mangueiras de silicone a uma bomba de aquário e mantidos por 2 horas sob aeração moderada.

Ao final do processo, as amostras foram retiradas com as mesmas pipetas utilizadas no processo

de aeração, para que não houvesse contato com a parede interna do recipiente. Em seguida o pH

das amostras foi ajustado ao pH inicial e as amostras foram armazenadas para realização dos testes

de toxicidade conforme protocolos da CETESB (2011) conforme ilustrado na Figura 9 (a) e (b).


FIGURA 9 – (a) Fotografia da manipulação de aeração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos procedimentos

aplicados

(a)

bomba

de

aquário

amostras em

diferentes valores de

pH (3, inicial e 11)

2 horas sob aeração

moderada

ajustado

ao

pH inicial

Amostra

armazenada

Teste de

toxicidade

aguda

pipeta de

vidro de 5

mL

Folga na

rolha

(b)


4.2.4.3 Filtração com ajuste de pH

Alíquotas das amostras em diferentes valores de pH (3, inicial e 11) (Figura 8 a) foram

filtradas a vácuo com membranas esterilizadas de 0,45 µm de porosidade (SeS – ME25/21ST),


previamente lavadas com água ultra pura. Em seguida o pH das amostras foi ajustado ao pH inicial

e as amostras foram armazenadas para realização dos testes de toxicidade conforme protocolos da

CETESB (2011) conforme ilustrado na Figura 10 (a) e (b)

FIGURA 10 – (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos

procedimentos aplicados

(a)

amostras em

diferentes valores de

pH (3, inicial e 11)

Bomba a

vácuo

membrana

esterilizada de

0,45 μm de porosidade

(SeS – ME25/21ST)

ajustado

ao

pH inicial

Amostra

armazenada Teste de

toxicidade

aguda

Amostra

filtrada

válvula

(b)



4.2.4.4 Extração em fase sólida

Para a extração em fase sólida foram empregados cartuchos de fase-reversa C18, modelo

C18- 55µm, 70A (Strata) com dimensões de 1000 mg X 6mL adaptados em sistema Manifold

conectado a uma bomba de vácuo. Os cartuchos empregados foram ativados passando-se 10 mL

de metanol 100%, seguidos de 30 mL de água ultra pura (“Mili Q”). O metanol e a água foram

descartados e seguiu-se à extração de aproximadamente 200 mL, volume necessário para

realização de teste de toxicidade aguda em diferentes valores de pH (3, inicial e 9) das amostras

pela sua passagem através dos cartuchos por gotejamento contínuo e lento, para não provocar a

perda de substâncias por carreamento.

Para que não ocorresse sobrecarga dos cartuchos, as amostras foram filtradas em papel

filtro modelo Qualy - maioria dos poros de 14 µm (JProlab) antes do processo de extração

conforme a descrito anteriormente conforme ilustrado na Figura 11 (a) e (b).


FIGURA 11 – (a) Fotografia da manipulação de filtração com ajuste de pH, (b) Ilustração dos

procedimentos aplicados

(a)

amostras em diferentes valores de

pH (3, inicial e 9) e filtradas em

papel filtro modelo Qualy com

maioria dos poros de 14 μm (JProlab)

Bomba a

vácuo

Cartucho de fase

reversa C18, modelo C18- 55μm, 70A

(Strata)

ajustado

ao

pH inicial

Amostra

Armazenada

50 mL

Teste de

toxicidade

aguda

Amostra

filtrada

válvula

ativado com 10 mL de metanol

100%, seguidos de 30 mL de

água ultra pura (“Mili Q”)

(b)



4.2.4.4.1 Recuperação da toxicidade (metais)

No ensaio de recuperação da toxidade dos possíveis metais retidos nos cartuchos foram

utilizados cartuchos de fase-reversa C18, modelo C18/18% (Spe-ed SPE) com dimensões de 1000

mg X 6mL adaptados em sistema Manifold, conectado a uma bomba de vácuo. Os cartuchos

empregados foram ativados passando-se 10 mL de metanol 100%, seguidos de 200 mL da amostra

de agua em pH 9, logo em seguida o metanol e a água foram descartados e seguiu-se à recuperação

de possíveis metais utilizando 50 mL de água de cultivo (meio MS) em pH 3 com passagem através

dos cartuchos por gotejamento contínuo e lento.

Para provocar o maior carreamento possível de metais retidos no cartucho, logo a seguir

a agua de cultivo extraída teve seu pH ajustado ao pH inicial da amostra, que foram armazenadas

para realização dos testes de toxicidade aguda conforme protocolos da CETESB (2011).

4.2.4.4.2 Recuperação da toxicidade (orgânicos)

Neste ensaio de recuperação da toxicidade dos possíveis compostos orgânicos retidos nos

cartuchos foram utilizados cartuchos de fase-reversa C18, modelo C18/18% (Spe-ed SPE) com

dimensões de 1000 mg X 6mL adaptados em sistema Manifold conectado a uma bomba de vácuo.

Os cartuchos empregados foram ativados passando-se 10 mL de metanol 100%, seguidos de 200

mL da amostra de água em pH 9, logo em seguida o metanol e a água foram descartados e seguiu-

se à recuperação de possíveis compostos orgânicos passando-se apenas 2 mL de metanol 100% no

cartucho, onde este foi armazenado e posteriormente foram adicionados 150 µL deste metanol

utilizado como solvente dos possíveis contaminantes orgânicos para cada 10 mL de água de cutivo

(meio MS) e em seguida foram realizados os testes de toxicidade aguda.

4.2.4.5 Adição de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA)

A escolha da concentração de EDTA adicionada na amostra foi baseada em testes

preliminares de sensibilidade do organismo-teste ao EDTA (Dinâmica – Limite máximo de

impurezas: insolúveis 0,005%, Ácido Nitriloacetico 0,1%, Metais pesados - Max. 50 ppm), onde

utilizou-se apenas a maior concentração que não apresentou efeito em testes preliminares.

Preparou-se a solução a partir de uma solução estoque de 2 g L-1 preparada em água destilada. A

amostra permaneceu em contato com o EDTA sob agitação por cerca de 1 hora para possibilitar as

reações do agente quelante, em seguida foram realizados os testes de toxicidade conforme Figura

12 (a) e (b).


4.2.5.6 Adição de Tiossulfato de Sódio

De forma similar ao procedimento anterior, após testes preliminares de sensibilidade do

organismo-teste ao tiossulfato de sódio (ECIBRA – Limite máximo de impurezas: insolúveis

0,005%, compostos nitrogenados como N - 0,002%, sulfato e sulfito como SO4 - 0,1%, sulfite (S)

- Passa o teste), utilizou-se apenas a maior concentração que não apresentou efeito em testes

preliminares. A solução foi preparada a partir de uma solução estoque de 10 g L-1 preparada em

água destilada. A amostra permaneceu em contato com o tiossulfato sob agitação por cerca de 1

hora para que ocorresse as reações entre o reagente oxidante e a amostra, em seguida foram

realizados os testes de toxicidade conforme Figura 12 (a) e (c).


FIGURA 12 – (a) Fotografia da manipulação de adição de EDTA e tiossulfato de sódio, (b) Ilustração dos

procedimentos aplicados para a adição de EDTA, (C) Ilustração dos procedimentos aplicados para a adição

de Tiossulfato de sódio

(a)

maior

concentração que

não apresentou

efeito em testes

preliminares

Agitador

magnético

Teste de

toxicidade

aguda

Após 1 horaAmostra bruta + EDTA

solução

estoque

de 2 g/L

preparada

em água

destilada

maior

concentração que

não apresentou

efeito em testes

preliminares

Agitador

magnético

Teste de

toxicidade

aguda

Após 1 horaAmostra bruta + Tiossulfato

solução

estoque

de 10 g/L

preparada

em água

destilada

(b)

(c)



4.2.5 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase II)

As análises químicas de identificação da toxicidade referentes a fase II foram realizadas

por empresa terceirizada, de acordo com os resultados de fase I optou-se pelo método de

espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (Figura 13). Dados da metodologia

utilizada encontram-se no Anexos A.

FIGURA 13 – Procedimento adotado em Fase II para as amostras do ribeirão Pires, baseado nos resultados

de Fase I

CompostoTóxico

MetalICP-MS

(APHA,2012)


4.2.6 Avaliação e Identificação da Toxicidade – AIT (Fase III)

Para a confirmação dos resultados foi utilizado o método de análise de correlação,

utilizando o cálculo de toxicidade relativa do composto suspeito pela toxidade da amostra analisada

conforme ilustra a Figura 14, onde as Unidades Tóxicas (UT) da amostra pura são comparadas

com os resultados de UT do composto suspeito quantificado na Fase II.

FIGURA 14 – Procedimento adotado em Fase III para as amostras do ribeirão Pires, baseado nos resultados

de Fase II

100CE50 da amostra

UT da amostra

bruta

[Zn] amostra

CE50 do zinco

UT do zinco na amostra


39

5 Resultados e discussões

5.1 Testes de Sensibilidade

As cartas-controles provisórias obtidas nos testes de sensibilidade com os organismos-

testes Ceriodaphnia dubia e Daphnia similis estão apresentadas nas Figuras 15 e 16. Conforme a

norma ABNT (2010) na inexistência de 20 resultados de ensaio, deve ser calculada a média

provisória com no mínimo cinco resultados com lotes diferentes. A carta controle de ambas as

culturas foi elaborada a partir de testes de sensibilidade realizados entre Julho de 2013 a Novembro

de 2014, período que todos os testes desta pesquisa foram realizados.

Para o organismo-teste Ceriodaphnia dubia obteve-se média acumulada de CI50=0,19 g

L-1 de NaCl expostos por de 7 dias e limites superiores e inferiores de 0,31 e 0,08 g L-1 (Figura

15), respectivamente; para 16 testes de sensibilidade nota-se que o cultivo apresenta qualidade

aceitável para a utilização em testes, pois os mesmos apresentaram-se dentro do limite estabelecido

pela norma ABNT (2010).

FIGURA 15 – Carta controle provisória referente à sensibilidade do organismo-teste Ceriodaphnia dubia

ao cloreto de sódio (NaCl), em 7 dias de exposição

Fonte: LEAL-UNICAMP (participação do autor)

40 Capítulo 5. Resultados e discussões

Para a Daphnia similis obteve-se média acumulada de CE50 =2,74 g L-1 de NaCl (48

horas) e limites superiores e inferiores de 3,33 e 2,15 g L-1, respectivamente. Os valores de

toxicidade aguda referentes a testes de sensibilidade apresentam-se próximos aos resultados de

outros trabalhos, como o de Melo (2012) que obteve média acumulada de CE50= 2,41 g L-1 de

NaCl. Os resultados mostram que os organismos-testes mantiveram a sensibilidade aceitável frente

à substância de referência (NaCl), uma vez que os valores de CE50 ou CI50 permaneceram entre

os limites estabelecidos, com exceção do teste 9 referente ao mês de março de 2014 que apresentou

CE50 de 2,12 g L-1, resultado extremamente próximo ao limite aceitável de 2,15 g L-1 conforme

apresentado na Figura 16.

FIGURA 16 – Carta controle provisória referente à sensibilidade do organismo-teste Daphnia similis ao

cloreto de sódio (NaCl), em 48 horas de exposição

Fonte: LEAL-UNICAMP (participação do autor)

No presente estudo, utilizou-se o teste de toxicidade aguda para avaliar as condições

fisiológicas dos organismos-testes Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia para o EDTA e

tiossulfato de sódio (Tabela 5), como testes preliminares do AIT (Fase I). As concentrações foram

testadas até encontrar a maior concentração que não apresentasse efeito de imobilidade aos

organismos em questão, utilizando-se posteriormente a mesma concentração na amostra de água

bruta.

41 Capítulo 5. Resultados e discussões

TABELA 5 – Resultados de testes de sensibilidade (Toxicidade aguda) ao EDTA e Tiossulfato de Sódio

em agosto de 2013

Organismo-teste EDTA (mg L-1) Tiossulfato de Sódio (mg L-1)

CE50; 48h CE50; 48h

Daphnia similis 50* 80 (70 - 90) 400* 1000 (610 – 1630)

Ceriodaphnia dubia 40* 60 (50 – 60) 400* 760 (650 -870)

Nota: * Maior concentração testada que não apresentou efeito de imobilidade no teste de toxicidade aguda.

5.2 Avaliação dos parâmetros físico-químicos

As análises físico-químicas das amostras de água superficial do ribeirão Pires, cujos

resultados estão reportados na Tabela 6, mostraram durante todo período de coletas valores de

temperatura médio de 22,6 oC. Os valores de pH se apresentaram dentro da faixa de tolerância para

os organismos-testes, resultado importante já que o pH é fator limitante para manutenção da vida

aquática. O Oxigênio Dissolvido (OD), apresentou-se em todas as coletas realizadas result

avaliaÇÃo ecotoxicolÓgica e identificaÇÃo da...

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