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AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO Avaliação in vivo do potencial regenerativo na degeneração Walleriana de nervos periféricos - com a utilização de laser de baixa potência e composto polivitamínico -NERVE® Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Mestre em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Materiais Orientadora: Profa. Dra. Ana Helena de A. Bressiani São Paulo 2015

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AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Avaliao in vivo do potencial regenerativo na degenerao Walleriana de nervos

perifricos - com a utilizao de laser de baixa potncia e composto

polivitamnico -NERVE

Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini

Dissertao apresentada como parte dos

requisitos para obteno do Grau de Mestre em

Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -

Materiais

Orientadora:

Profa. Dra. Ana Helena de A. Bressiani

So Paulo

2015

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES

Autarquia associada Universidade de So Paulo

Avaliao in vivo do potencial regenerativo na degenerao Walleriana de nervos

perifricos - com a utilizao de laser de baixa potncia e composto

polivitamnico -NERVE

Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini

Dissertao apresentada como parte dos

requisitos para obteno do Grau de Mestre em

Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -

Materiais

Orientadora:

Profa. Dra. Ana Helena de A. Bressiani

Verso Corrigida

Verso original disponvel no IPEN

So Paulo

2015

AGRADECIMENTOS

Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN) pela

oportunidade que me foi dada para o desenvolvimento deste estudo.

minha orientadora Professora e Doutora Ana Helena de Almeida

Bressiani pelo profissionalismo que sempre ofereceu durante toda essa jornada. A

disciplina e o carinho da sua pessoa sempre estiveram presentes durante esses

anos. O dilogo, a pacincia e a orientao foram lapidando o trabalho para que o

resultado final apresentasse um contedo cientfico e enriquecedor.

Ao Professor e Doutor Marcelo Yoshimoto por oferecer a oportunidade

de desenvolver o estudo no IPEN. Pela pacincia de guiar detalhes deste

trabalho, de nunca poupar esforos para estar presente em vrios momentos,

inclusive na parte experimental.

Ao Professor e Doutor Marcos Barbosa Salles pela orientao cientfica

e conversas para guiar propostas do trabalho. Sempre disposto a ajudar e com

imensa pacincia para expor seu grande conhecimento.

Ao Professor e Doutor Srgio Allegrini Junior por oferecer fundamentos

cientficos e criteriosos ao trabalho, proporcionando perspectivas para estudos

futuros.

equipe do Biotrio do IPEN que disponibilizou a infraestrutura e

orientou sobre os cuidados dirios com os animais utilizados no experimento.

tcnica Elisa e sua equipe do Departamento de Patologia da

Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo pela orientao na

confeco das lminas histolgicas para as anlises em microscopia.

Aos amigos que no cotidiano dividem experincias que sempre nos

ajudam, especialmente, ao Mrcio Mendes que sempre disponibilizou sua

ateno e orientao com grande boa vontade quando eu pedia qualquer ajuda.

Entretanto, agradeo a DEUS pela fora imensa que ilumina a minha

vida a cada dia. Pela sabedoria e discernimento que Ele me oferece em todos os

momentos presentes, sejam eles de alegrias, decises ou at de aceitaes de

situaes que no so da nossa vontade.

minha famlia meu imenso agradecimento, pois sem ela no

conseguiria alcanar as conquistas que tive at aqui, no s do estudo mas na

vida tambm.

Aos meus pais Elizena e Yoschio que sempre me ensinaram a ser uma

pessoa digna e batalhadora. Eles sempre, sempre me deram a fora, a coragem e

a estrutura para chegar at aqui. So eles que iluminam meu caminho.

Agradeo a minha irm Eliana, meu cunhado Aldy e minhas sobrinhas

Anna Letcia e Mariana que sempre estiveram presentes no meu dia a dia,

estimulando e vibrando com as minhas conquistas.

Ao meu esposo Henrique pela pacincia, pelo carinho e pela

cumplicidade durante todo o perodo do trabalho, sem esquecer o quanto esteve

presente com nossos filhos durante os momentos em que estive ausente.

Aos meus filhos: Paulo Henrique, Marcos Paulo e Arthur, presentes de

Deus. A eles dedico todas as minhas conquistas. Os sorrisos que eles oferecem,

as ingenuidades e as brincadeiras de criana do o brilho e fortalecem cada dia.

EPGRAFE

Senhor, d-me serenidade para aceitar as coisas que no posso mudar,

coragem para mudar as que posso e

sabedoria para distinguir entre elas.

(Reinhold Niebuhr)

AVALIAO IN VIVO DO POTENCIAL REGENERATIVO NA DEGENERAO

WALLERIANA DE NERVOS PERIFRICOS - COM A UTILIZAO DE LASER

DE BAIXA POTNCIA E COMPOSTO POLIVITAMNICO -NERVE

Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini

RESUMO

Nas reas mdica e odontolgica existem situaes clnicas e

cirrgicas que podem ter, como consequncia, um dano ao tecido conjuntivo

nervoso, chamado de neuropatia. O objetivo deste trabalho avaliar terapias para

tratamento das neuropatias causadas por manipulao do feixe nervoso

perifrico, minimizando ou eliminando sintomas causados pela leso. O estudo foi

feito em 60 ratos machos Wistar, com a avaliao morfolgica da degenerao

Walleriana e da regenerao do tecido nervoso no 15 e 30 dia aps o trauma. A

leso consistiu na exposio e compresso do nervo isquitico da pata direita do

animal, atravs de trs ns consecutivos com fio de sutura e distncia entre eles

de ~ 2mm. Trs tratamentos sobre a leso foram comparados: o uso do

biomaterial - NERVE, a laserterapia de baixa potncia e a associao dos

dois. Os resultados histolgicos revelaram que o biomaterial aumentou o

processo inflamatrio, mas modulou a degenerao inicial, atravs do surgimento

de clulas de neoformao, favorecendo a regenerao nervosa no decorrer dos

trinta dias. A laserterapia foi um tratamento favorvel para a parestesia porque

modulou os danos do processo de degenerao inicial e estimulou o reparo do

tecido desde os 15 primeiros dias. Ao atingir os 30 dias o tecido se apresentou

organizado e com uma quantidade menor de tecido neoformado quando

comparado com o uso do biomaterial. A associao das terapias associou as

propriedades das duas terapias, pois modulou a inflamao inicial, propiciou o

aumento do nmero de clulas de neoformao do tecido nervoso e favoreceu a

regenerao dos feixes nervosos nas amostras de 15 e 30 dias. Conclui-se que o

no tratamento dificulta ou impede a regenerao nervosa, pois qualquer uma das

terapias citadas modula os eventos desencadeados pela leso. A associao do

uso da laserterapia com o -NERVE mostrou melhores resultados.

EVALUATION IN POTENTIAL OF LIVE IN REGENERATIVE WALLERIANA

DEGENERATION PERIPHERAL NERVE - WITH LASER USE LOW POWER

AND COMPOUND MULTIVITAMIN -NERVE

Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini

ABSTRACT

In medical and dental areas are clinical and surgical situations that may

have, as a result, damage to the nervous tissue. This is called a neuropathy. The

objective is to support therapies for treatment of neuropathies caused by

manipulation of the peripheral nervous bundle, minimizing or eliminating

symptoms caused by injury. The study was conducted in 60 male Wistar rats by

morphological analysis of Wallerian degeneration and regeneration of nerve tissue

in the 15th and 30th day after the trauma. The lesion consisted of exposure and

sciatic nerve compression of the right paw of the animal through three consecutive

nodes with suture and the distance between them of ~ 2mm. Three treatments on

the injury were compared: the use of -NERVE biomaterial, the low level laser

therapy and their association. Histological findings revealed in samples 15 and 30

days the biomaterial increased inflammation and degeneration of the initial

modulated through the cell neogenesis emergence favored nerve regeneration in

the course of 30 days. Laser therapy was a favorable treatment for paresthesia

because modulates the damage of the initial degeneration process and stimulates

tissue repair since the first 15 days. When reaching the 30 days the tissue was

organized and presented with a smaller amount of neoformed tissue when

compared with the use of the biomaterial. The combination therapies of the

modulated the initial inflammation, led to an increase in the number of cells

neogenesis and promoted nerve tissue regeneration of nerve bundles in the

samples 15 and 30 days. We conclude that no treatment hinders or prevents

nerve regeneration, for any of the therapies mentioned modulate the events

triggered by the injury. The association between the use of laser therapy with

Nerve proved with better results.

SUMRIO

Pgina

1) INTRODUO __________________________________________ 1

2) REVISO DE LITERATURA _______________________________ 4

2.1) Estrutura de uma fibra nervosa normal_______________________ 5

2.2) Definio de clulas de Schwann___________________________ 8

2.3 )Tecido nervoso e trauma _________________________________ 9

2.4) Processo fisiolgico da degenerao Walleriana _______________ 9

2.5) Fisiopatologia da leso ___________________________________ 13

2.6) Caractersticas histolgicas de regenerao de nervos perifricos_ 13

2.7) Terapias que modulam a regenerao nervosa ________________ 14

2.7.1) Laser - definio______________________________________ 14

2.7.1.1) Radiao ionizante e no ionizante_______________________ 14

2.7.1.2) Fundamentos sobre o laser ____________________________ 15

2.7.1.3) Tipos de laser: de baixa e alta potncia ___________________ 15

2.7.1.4) Fotobiologia do tecido ________________________________ 16

2.7.2) Biomaterial __________________________________________ 17

2.7.2.1) O biomaterial utilizado no estudo: composto polivitamnico -

NERVE_________________________________________________ 20

2.7.3) Microscopia eletrnica de varredura (MEV)__________________ 22

3) OBJETIVO_ ____________________________________________ 23

4) MATERIAIS E MTODOS _________________________________ 25

4.1) Grupos experimentais ___________________________________ 26

4.2) Procedimento cirrgico___________________________________ 28

4.3) Terapias ______________________________________________ 30

4.3.1) Composto polivitamnico -NERVE ______________________ 31

4.3.2) Laserterapia __________________________________________ 31

4.3.3) Uso do Composto polivitamnico -NERVE associado a laser __ 33

4.4) Avaliao Morfolgica ___________________________________ 33

5) RESULTADOS E DISCUSSO _____________________________ 36

5.1) Os animais ____________________________________________ 37

5.1.1) Locomoo dos animais_________________________________ 38

5.2) Anlise Morfolgica _____________________________________ 40

5.2.1) Histologia do grupo G1 controle_________________________ 41

5.2.2) Histologia do grupo G2 Sham___________________________ 42

5.2.3) Histologia do grupo G3 Neuropraxia______________________ 43

5.2.4) Histologia do grupo G4 Composto Polivitamnico -NERVE__ 46

5.2.5) Histologia do grupo G5 Laser___________________________ 50

5.2.6) Histologia do grupo G6 Laser e composto polivitamnico -

NERVE associados________________________________________ 54

5.3) Dimenso da rea da degenerao ou regenerao____________ 59

6) CONCLUSES __________________________________________ 62

ANEXOS__________________________________________________ 65

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ____________________________ 66

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 descreve o agrupamento dos animais de acordo com a diviso dos

grupos experimentais, seu nome e procedimento executado, poca da

eutansia................................................................................................................27

TABELA 2 Nmero de animais por grupo de acordo com a evoluo cronolgica do experimento......................................................................................................37

TABELA 3 valores obtidos de trs distncias, em m, entre as extremidades de

uma mesma amostra de cada grupo tratado.........................................................60

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 esquema da diviso do sistema nervoso central e perifrico, com

nfase aos componentes do sistema nervoso perifrico ........................................ 5

FIGURA 2 desenho de um neurnio composto por corpo celular, axnio,

dendritos e terminaes .......................................................................................... 6

FIGURA 3 Microscopia ptica de um corte transversal de nervo isquitico de

rato pertencente ao grupo controle G1. As estruturas, coradas com hematoxilina

e eosina, foram: perineuro, endoneuro e epineuro. ................................................ 7

FIGURA 4- esquema para ilustrar o sentido da degenerao do nervo e a

presena de organelas setas vermelhas - aps uma leso no tecido nervoso

perifrico ............................................................................................................... 10

FIGURA 5 - animais acomodados na gaiola ......................................................... 26

FIGURA 6 - gaiolas organizadas nas prateleiras .................................................. 26

FIGURA 7 Assepsia com gaze e clorexidina 2% na regio a ser incisada ........ 28

FIGURA 8 animal pronto para inciso e posicionado na mesa cirrgica ........... 28

FIGURA 9 foto da lmina de bisturi n 15 da marca Solidor utilizada no

experimento para fazer a inciso no tecido externo do animal. ............................ 28

FIGURA 10 foto da exposio do nervo isquitico da pata direita do animal aps

inciso e separao do tecido muscular. .............................................................. 29

FIGURA 11 - foto ilustrando a exposio e individualizao do nervo isquitico da

pata direita do animal ............................................................................................ 29

FIGURA 12 - nervo isquitico individualizado dos tecidos adjacentes .................. 30

FIGURA 13 foto da execuo do segundo n cirrgico 2x2 no nervo dissecado

.............................................................................................................................. 30

FIGURA 14 foto A ilustra a execuo do terceiro n cirrgico no nervo isquitico

do animal; a foto B o maior aumento dos trs ns sequenciados com distncia

de aproximadamente 2mm entre eles. .................................................................. 30

FIGURA 15 nervo submetido a neuropraxia e o biomaterial sendo adaptado ao

redor do nervo na regio onde foi causada a leso .............................................. 31

FIGURA 16 - recobrimento total dos ns com -NERVE ............................... 31

FIGURA 17 representao da rea irradiada na pata do animal que recebeu a

terapia com laser. A linha vermelha se refere inciso e A, B, C e D a localizao

da ponta do equipamento para a aplicao e entrega da radiao. ...................... 32

FIGURA 18 realizando a aplicao do laser na regio operada nos animais do

grupo G6 aps sutura final do tecido externo....................................................... 33

FIGURA 19 dissecao para remoo do fragmento do nervo isquitico do

animal envolvendo uma distncia de 1 cm a mais tanto do coto proximal e distal 34

FIGURA 20 micrtomo da marca JUNG pertencente ao Instituto de Patologia da

Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo ................................... 35

FIGURA 21 imagens das amostras do grupo G3 preparadas para microscopia

de varredura. A imagem A representa a amostra desidratada e a B representa as

amostras recobertas com ouro. ............................................................................. 35

FIGURA 22 foto de animal do grupo G3 com comprometimento motor da pata

direita logo aps o ato cirrgico ............................................................................ 38

FIGURA 23 esquema para ilustrar o fragmento removido para a anlise

histolgica ............................................................................................................. 40

FIGURA 24 - imagem de microscopia ptica de um corte longitudinal do grupo G1

revelando feixe ntegro, onde se observa a continuidade das fibras e feixes com a

presena de vasos sanguneos ntegros no mesmo sentido. ............................... 41

FIGURA 25 Imagem A - fragmento do nervo isquitico de rato como parmetro

de normalidade, com perineuro ntegro, sob MEV. Imagem B mostra a parte

interna com viso longitudinal dos fascculos do nervo isquitico do grupo de

animais preservados. Os fascculos possuem um envoltrio de tecido conjuntivo

rico em vasos denominado de epineuro. .............................................................. 42

FIGURA 26 Imagem da amostra do grupo G2 aps 15 dias do procedimento

cirrgico. H tecido muscular (TM) e tecido adiposo (TA) ao redor do feixe ntegro

.............................................................................................................................. 43

FIGURA 27 Imagens obtidas por microscopia ptica de uma amostra do grupo

G3 na eutansia de 15 dias. As imagens A, B, C revelam a descontinuidade do

feixe devido a leso causada pelos trs ns consecutivos (indicados pelas setas).

O coto proximal (A) se apresenta com espaos entre os fascculos, o distal (C)

apresenta espaos vazios de degenerao. ......................................................... 44

FIGURA 28 Imagens de microscopia ptica das amostras do grupo G3 com

eutansia de trinta dias. A imagem A um corte longitudinal da rea da leso

(seta preta) demonstrando a destruio e a descontinuidade das fibras nervosas,

a imagem B um corte transversal do coto distal com desorganizao dos

fascculos e infiltrado inflamatrio. O perineuro est desorganizado em ambas as

imagens. ............................................................................................................... 45

FIGURA 29 imagens obtidas por microscopia eletrnica de varredura de

amostra do grupo G3 revelando nas imagens A e B a destruio da camada

externa (seta) do coto proximal e distal respectivamente, em animal eutanasiado

aps quinze dias; sendo as imagens C e D a destruio da camada externa (seta)

tambm dos cotos proximal e distal em animais eutanasiados aps trinta dias. .. 46

FIGURA 30 grfico da citotoxidade do composto polivitamnico -NERVE ... 47

Figura 31 Microscopia ptica da amostra do grupo G4. A imagem A ilustra o

coto proximal e a seta indica a rea do primeiro n, a imagem B indica com a seta

a rea do segundo n e, a imagem C a desorganizao do coto distal. O infiltrado

inflamatrio (I) est presente em todos os cortes. ................................................ 47

FIGURA 32 Imagem em microscopia ptica do grupo G4 da regio da leso

causada pelo primeiro n, referente ao coto proximal. H espaos vazios (VAZIO)

caracterizando a degenerao, presena de vasos sanguneos (V), rea de

neoformao (NEO) iniciando uma organizao das fibras ( setas vermelhas) e,

com colorao rosada o tecido conjuntivo (TC) .................................................... 48

FIGURA 33 microscopia ptica de amostra do grupo G4 com eutansia de 30

dias, A imagem A representa o coto proximal e a imagem B o coto distal. .......... 49

FIGURA 34 imagens das amostras em microscopia eletrnica de varredura do

grupo G4. As setas brancas indicam a regio dos ns, as setas pretas os cotos.

Imagens A e B so imagens de eutansia de quinze dias sendo que o coto distal

apresenta desorganizao da camada externa; as imagens C e D so das

amostras com eutansia de trinta dias, com destruio do epineuro no coto

proximal na imagem C e caractersticas de regenerao do coto distal em D, pois

a camada externa da estrutura apresenta-se com continuidade........................... 49

FIGURA 35 corte histolgico do grupo G5. A imagem A representa o coto

proximal e a regio do primeiro n, a imagem B representa a regio do segundo

n e, a imagem C representa o coto distal com maior desorganizao do feixe.

Em todas as imagens A, B e C um tecido inflamatrio abundante circunscreve as

trs regies da leso. ............................................................................................ 50

FIGURA 36 - imagem de microscopia ptica do grupo G5. Em maior aumento a

histologia desta amostra demonstra a neoformao na regio intermediria da

leso referente ao segundo n. ............................................................................ 51

FIGURA 37 imagem de microscopia de luz de um corte longitudinal do grupo G5

aps 30 dias do procedimento onde os feixes revelam uma organizao e

direcionamento das fibras revelando a sua neoformao. A regio onde foi dado o

n se apresenta com fechamento total. ................................................................ 51

FIGURA 38 Imagens de microscopia eletrnica de varredura de uma estrutura

do grupo G5. A imagem A e B so fotos sequenciadas envolvendo o coto proximal

em A, o segmento intermedirio e o segundo n. Na figura B temos o coto distal.

As imagens C e D se referem a microscopia eletrnica de varredura de um

segmento do grupoG5 aps 30 dias da cirurgia. A imagem C apresenta a

continuidade da camada externa exibindo apenas uma rea marcada pela regio

do n. J a imagem D demonstra uma pequena rea de rompimento do

perineuro, mas uma integridade da estrutura........................................................ 52

FIGURA 39 - Imagem de microscopia ptica de cortes referentes amostra do

grupo G6 que sofreram eutansia com 15 dias. As imagens A, B e C so

sequenciadas e se referem aos ns (seta preta) do coto proximal para distal, o

tecido inflamatrio (TI) presente na regio das leses, ilhas de neoformao

indicadas pela seta vermelha ................................................................................ 55

FIGURA 40 - Imagem de microscopia ptica de uma amostra do grupo G6, com a

presena de inmeros vasos sanguneos e tecido conjuntivo espesso corado em

rosa ....................................................................................................................... 55

FIGURA 41 Cortes referentes a eutansia de 30 dias. Imagens A e B revelam

ilhas de neoformao, onde em A a leso j se apresenta com as fibras

organizadas fechando a rea vazia da degenerao e a imagem B as ilhas de

neoformao se apresentam bem definidas. ........................................................ 56

FIGURA 42 imagens de microscopia eletrnica de varredura com amostras do

grupo G6. As setas brancas indicam a regio dos ns, sendo que a imagem A

representa a integridade do epineuro do coto proximal de uma amostra que sofreu

eutansia com quinze dias; a imagem B referente ao coto distal da mesma

amostra que apresenta o epineuro com reas de descontinuidade; a imagem C

representa o coto proximal da amostra deste grupo, com reas de integridade e

descontinuidade do epineuro na eutansia de trinta dias; a imagem D desta

amostra apresenta o epineuro com caractersticas de reas de descontinuidade e

reparo do coto distal na eutansia de trinta dias. .................................................. 57

FIGURA 43 imagem de microscopia ptica da amostra do grupo G6 aps trinta

dias do procedimento cirrgico. A imagem um corte transversal prximo ao coto

proximal com a presena de vasos sanguneos e fascculos em reorganizao.

Ilhas de neoformao so identificadas pelas setas vermelhas. .......................... 57

FIGURA 44 Esquema para visualizao da tomada das trs medidas

consecutivas no mesmo fragmento ....................................................................... 59

FIGURA 45 imagem de microscopia ptica de uma amostra do grupo G4. Os

traos em preto so as distncias medidas entre as duas extremidades da leso

referente a um corte longitudinal. .......................................................................... 59

FIGURA 46 Grfico da distncia mdia transversal de uma mesma amostra de

cada grupo para quantificar a regio da regenerao do tecido nervoso na regio

da leso. Os dados das medidas e desvio padro esto na TABELA 3. .............. 60

LISTA DE SIGLAS

AMPc Adenosina Monofosfato Cclico

ATP Adenosina Trifosfato

BMPb Bone Morphogenetic Bovine Protein

Protena ssea Morfogentica Bovina

CEUA Comisso de tica no Uso de Animais

FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations.

GAP Growth- associated protein

Protena associada ao crescimento

IPEN Instituto de Pesquisa Energtica e Nucleares

LASER Light Amplification By Stimulated Emission of Radiation

Amplificao de Luz por Emisso Estimulada de Radiao

MEV Microscopia Eletrnica de Varredura

NF-Kb Factor Nuclear Kappa B

Fator Nuclear Kappa B

NGF Nerve Growth Factor

Fator de Crescimento Neural

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Sistema Nervoso Perifrico

1

INTRODUO

No cotidiano da rea mdica e odontolgica situaes clnicas ou

cirrgicas podem gerar leses em nervos perifricos. Neste captulo so

apresentadas situaes que possam causar essas leses e a descrio do

processo fisiolgico presente no decorrer da degenerao do nervo. So

apresentadas opes de tratamento para regenerar o tecido ou minimizar as

consequncias dessas manipulaes.

2

1) INTRODUO

Na rea mdica em geral, ou na Odontologia especificamente, so

vivenciadas situaes clnicas e cirrgicas que envolvem a manipulao do tecido

nervoso perifrico1.

A origem do processo da degenerao nervosa pode ser um acidente

sofrido pelo paciente ou mesmo por uma manipulao necessria prxima ou

direta na estrutura desse tecido. Assim, danos podem surgir e gerar sintomas

desagradveis ao paciente. Os sintomas neurossensoriais ou neuromotores

geram desconforto, que exige do profissional, iniciativas teraputicas para

tratamento de cura ou minimizao da queixa presente2.

Com isto, terapias so elaboradas e estudadas para tratamento ou a

minimizao de sintomas consequentes desta manipulao. As leses

neurossensoriais causadas no tecido nervoso so estudadas neste experimento,

como neuropatias, especificamente a parestesia3.

Existem procedimentos cirrgicos nas diversas reas mdicas e

odontolgicas que exigem do profissional muita preciso e habilidade, pois na

execuo so manipuladas estruturas nervosas que podem levar parestesia

temporria ou permanente. Alguns exemplos: cirurgias de terceiro molar,

traumatismos da face, implantes odontolgicos prximos a nervos e, at mesmo

cirurgias especficas como a lateralizao de nervo alveolar inferior4. Esta ltima

refere-se instalao de implantes dentais quando no h estrutura ssea em

altura suficiente para a insero de implantes em mandbula posterior, sendo

necessria a manipulao do nervo, afastando-o para a colocao do implante.

Qualquer manipulao do feixe vsculo-nervoso pode levar a um dano

tecidual que comprometa a integridade das fibras nervosas e a conduo de

informaes ao longo desta estrutura. Essa manipulao classificada como

mecnica, mas causas qumicas podem levar a neuropatias, devido toxicidade

do material. Exemplos disso so os sais anestsicos quando associados a

vasoconstritores5, ou a presena de material obturador endodntico6 em contato

com estrutura tecidual nervosa. As consequncias de uma neuropatia podem ser

desde a destruio da bainha de mielina, at a ruptura total do nervo, ambas

podendo levar a parestesia.

3

A parestesia refere-se a sensaes cutneas subjetivas (ex: frio, calor,

formigamento, presso, etc.) que so vivenciadas espontaneamente na ausncia

de estimulao7. O diagnstico da parestesia crnica baseado na determinao

das sensaes de sensibilidade, formigamento, dormncia e outras, segundo

testes clnicos no paciente. O histrico mdico da pessoa, o exame fsico e testes

laboratoriais so essenciais para este diagnstico.

Para compreender essa anlise clnica no paciente de conhecimento

que no estudo histolgico haver evidncias da degenerao Walleriana, pois

dentro de 24 horas aps o trauma a degenerao dos axnios e das suas bainhas

de mielina j esto presentes. O material resultante da degenerao da mielina e

dos axnios tende a formar enovelados de membranas conhecidas como figuras

de mielina. So encontradas tanto no citoplasma das clulas de Schwann como

em macrfagos que afluem ao local para auxiliar na remoo de debris8. A

evoluo da degenerao fator determinante para propiciar ou comprometer a

regenerao que ir se desencadear. Ento, a interveno teraputica nesta

cascata de eventos da degenerao ir determinar o sucesso, ou no, da

regenerao do tecido conjuntivo nervoso.

O tratamento apropriado para a parestesia depende do diagnstico

preciso da sua causa, do tempo de exposio do nervo e do tempo que a leso se

iniciou. O prognstico tambm depende da severidade das sensaes e das

condies sistmicas do paciente. Sabendo que esta situao est presente no

cotidiano da clnica odontolgica e mdica, o estudo proposto foi feito para coletar

resultados que possam embasar terapias que proporcionem um melhor

prognstico para o paciente em menor tempo.

A proposta deste trabalho avaliar a degenerao Walleriana de

nervos perifricos e o potencial regenerativo de terapias aplicadas no tecido

nervoso de 60 ratos machos Wistar. A leso foi causada no nervo isquitico da

pata direita dos animais e grupos foram tratados com laserterapia de baixa

potncia, com o uso do composto polivitamnico -NERVE9 e com a associao

das duas terapias. As anlises utilizadas so microscopia ptica e microscopia

eletrnica de varredura (MEV), juntamente com a avaliao da capacidade de

locomoo (claudicar) dos animais. Os perodos de anlise foram de 15 e 30 dias

aps a data da leso.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Pele

4

REVISO DE LITERATURA

Neste captulo so abordados conceitos sobre o tecido nervoso

perifrico e suas caractersticas de normalidades, situaes que possam levar

a leses da estrutura e como ocorre esse processo da degenerao

Walleriana. Alternativas de tratamento so apresentadas: o uso da laserterapia

de baixa potncia, do composto polivitamnico -NERVE e a associao das

mesmas na regenerao nervosa.

5

2) REVISO DE LITERATURA

Neste captulo so abordados conceitos que definem o tecido nervoso

central e perifrico, caractersticas morfolgicas do tecido nervoso perifrico

comparadas entre a normalidade e a neuropraxia e, opes de tratamento

utilizando o laser de baixa potncia, o composto polivitamnico -NERVE e a

associao de ambos.

2.1) Estrutura de uma fibra nervosa normal

Para compreender o processo da degenerao nervosa necessrio

estabelecer conceitos de normalidade do tecido referido. Esta reviso literria

descreve o sistema nervoso e a fibra nervosa normal e, em seguida, os eventos

que sucedem uma leso.

O Sistema Nervoso anatomicamente dividido em Sistema Nervoso

Central (SNC), formado pelo encfalo e pela medula espinhal, e Sistema Nervoso

Perifrico (SNP), formado pelos nervos e gnglios nervosos, FIG.1. A clula

essencial neste sistema o neurnio.

FIGURA 1 esquema da diviso do sistema nervoso central e perifrico, com nfase aos

componentes do sistema nervoso perifrico

Os neurnios so clulas responsveis pelos impulsos nervosos,

altamente especializadas, dotadas de um corpo celular e numerosos

prolongamentos citoplasmticos denominados neurofibras ou fibras nervosas,

FIG.2. Eles tm a capacidade de serem estimulados por substncias qumicas

Nervos espinhais e

cranianos

Gnglios e terminaes

nervosas

SISTEMA NERVOSO

SNC SNP

6

(neurotransmissores) ou estmulos eltricos geralmente originados em outras

clulas, gerando um potencial de ao ("impulso nervoso").10

FIGURA 2 desenho de um neurnio composto por corpo celular, axnio, dendritos e

terminaes11

O corpo celular do neurnio contm um ncleo grande e arredondado.

As mitocndrias so numerosas e o ergastoplasma, bem desenvolvido. Os

prolongamentos do neurnio podem ser de dois tipos:

- dendritos: ramificaes que tm a funo de captar estmulos;

- axnio: o prolongamento da clula nervosa (varia de fraes de milmetro at

cerca de um metro) que transmite os impulsos nervosos.

A membrana celular do neurnio separa dois ambientes que

apresentam composies inicas prprias: o meio intracelular (citoplasma), onde

predominam ons orgnicos com cargas negativas e potssio; e o meio

extracelular, onde predominam sdio e cloro. As cargas eltricas dentro e fora das

clulas so responsveis pelo estabelecimento de um potencial eltrico na

membrana e o movimento de ons atravs da membrana permitem alteraes

deste potencial: ons s atravessam a membrana atravs de canais inicos,

segundo o gradiente de concentrao. Os axnios tipicamente possuem canais

inicos de sdio (Na) e potssio (K), enquanto o corpo celular, dendritos e

terminaes axonais possuem um grande nmero de canais qumicos. O tipo de

resposta obtido por um transmissor depende do tipo de canal associado que

ativado por ele. Os canais inicos so formados por protenas e caracterizam-se

pela seletividade e, alguns deles, pela capacidade de fechar e abrir12.

7

Os nervos espinhais so formados por conjuntos de axnios que

emergem do corno anterior da medula espinhal (motores) e do gnglio da raiz

dorsal (sensitivos), onde esto seus corpos celulares. O axnio a regio do

neurnio responsvel pela conduo do estmulo nervoso tanto no sentido

centrpeto (inputs sensoriais) quanto no sentido centrfugo (outputs motores). Os

conjuntos de axnios so envoltos por membranas conjuntivas que circundam

todo o nervo - epineuro; feixes de fibras - perineuro e cada fibra individualmente

endoneuro, FIG.3. As bainhas conjuntivas so essenciais para a proteo da fibra

nervosa e esto orientadas de forma a limitar o estiramento mecnico do nervo

tanto por movimentos do corpo, como por foras externas aplicadas sobre ele.

Sua integridade importante nos processos de regenerao nervosa13.

FIGURA 3 Microscopia ptica de um corte transversal de nervo isquitico de rato pertencente ao

grupo controle G1. As estruturas, coradas com hematoxilina e eosina, foram: perineuro,

endoneuro e epineuro.

Acompanhando os axnios do sistema nervoso perifrico, esto as

clulas de Schwann, que ao longo do desenvolvimento, elegem axnios de maior

calibre e se enrolam ao seu redor formando a bainha de mielina. reunio de um

axnio com uma clula de Schwann formadora de mielina d-se o nome de fibra

mielnica. Grupos de axnios de menor calibre so envolvidos por clulas de

Schwann que, neste caso no iro formar mielina, constituindo as fibras

amielnicas. A mielina um componente morfofuncional importante, pois est

diretamente relacionada velocidade de conduo do estmulo eltrico do

nervo14, axnios mais calibrosos conduzem mais rapidamente e, por sua vez, o

calibre do axnio diretamente proporcional espessura da bainha de mielina.

Epineuro

Endoneuro

Perineuro

8

Os axnios so inteiramente dependentes dos seus corpos celulares

para sobreviver; pois no sintetizam protenas; eles so constitudos de axolema

e axoplasma. Axolema: a membrana celular do neurnio constituda de vrias

protenas integrais e perifricas, como, protenas de canais, enzimas e molculas

de adeso alm de fosfolipdios. O citoplasma do axnio, denominado axoplasma,

constitudo por citosol, organelas e incluses axoplasmticas, apresenta

organelas citoplasmticas comuns a todos os tipos celulares exceo de

retculo endoplasmtico granular, ribossomos livres, complexo de Golgi

(presentes apenas no corpo celular, nos dendritos e no cone de implantao do

neurnio). A ausncia do retculo endoplasmtico rugoso torna o axnio inbil

para a sntese de protenas, indispensvel sua sobrevivncia. As protenas e

organelas produzidas no corpo celular se locomovem ao longo do eixo do axnio

atravs de um complexo sistema de transporte mediado por componentes do

citoesqueleto15.

Das estruturas axoplasmticas, a mais eminente o citoesqueleto, que

determina o calibre, padro de crescimento, estabiliza o axolema e promove a

dinmica bsica necessria ao transporte axoplasmtico tanto antergrado (do

corpo celular para a periferia) quanto retrgrado (da periferia para o corpo

celular). Ele formado de microtbulos (25 m de espessura), neurofilamentos

(10 m de espessura) e microfilamentos de actina (4 a 6 m de espessura) 16.

2.2) Definio de clulas de Schwann

As clulas de Schawnn so clulas do sistema nervoso que formam a

bainha de mielina do sistema nervoso perifrico17.

O axnio, uma vez em contato com a clula de Schwann chamado de

fibra. As clulas de Schwann no formadoras de mielina se estendem ao longo de

grupos de axnios sendo que cada axnio separado do outro por um sulco

longitudinal18. Essas fibras so conhecidas como amielnicas. Nas fibras

mielnicas, um nico axnio envolvido a cada internodo por uma clula de

Schwann que se enrola ao seu redor formando lamelas concntricas.

A mielinizao comea quando o axnio atinge o dimetro de 1 a 2 m.

Embriologicamente, o processo de mielinizao no se encerra durante a

formao intra-uterina, mas se completa at dois anos de idade em humanos.

9

Qualquer subsequente aumento no comprimento do axnio aps o trmino da

mielinizao, ocorre custa de aumento no comprimento dos internodos j

existentes e no adio de novos internodos19.

2.3)Tecido nervoso e trauma

Segundo Krogh et al20, os nervos perifricos no toleram compresso,

alongamento e angulaes bruscas. O mecanismo de injria parece ser uma

combinao de fatores, incluindo edema endoneural, dano ao sistema

microcirculatrio dentro do nervo, dano s barreiras de difuso, desenvolvimento

de uma miniatura de sndrome de compartimento nos fascculos do nervo e, em

alguns casos, desmielinizao segmental at a degenerao Walleriana.

Cicatrizes intraneurais podem se desenvolver tardiamente e impedir a

regenerao nervosa.

A degenerao do nervo perifrico caracterizada pela destruio do

coto distal quando uma injria causada no corpo da clula. O processo se

caracteriza pela destruio do axnio e da bainha de mielina21. Essa degenerao

denominada degenerao Walleriana.

2.4) Processo fisiolgico da degenerao Walleriana

A Degenerao Walleriana compreende uma srie de eventos22 que se

dividem basicamente em:

o alteraes no citoesqueleto;

o alteraes nas clulas de Schwann e na bainha de mielina;

o alteraes nas barreiras hemato-nervosas;

o respostas dos macrfagos. As alteraes comeam de forma centrpeta ou

centrfuga em relao ao local da leso, ou seja, a degenerao ocorre de

forma simultnea ao longo do axnio, sendo que fibras mielnicas, maiores, ou

menores, degeneram-se ao mesmo tempo.

Poucas horas aps a leso, a maior parte do coto distal apresenta-se

normal exceto pela regio imediatamente distal leso (zona de trauma), a qual

apresenta acmulos de organelas, FIG.4. Este acmulo se deve ao material

transportado retrogradamente.

10

coto proximal coto distal

leso

FIGURA 4- esquema para ilustrar o sentido da degenerao do nervo e a presena de organelas

setas vermelhas - aps uma leso no tecido nervoso perifrico

Outra alterao precoce na zona de trauma o edema endoneural,

refletindo quebra na barreira hemato-nervosa. No restante do coto distal, as

alteraes so sutis: h uma tendncia a acmulo de organelas sob os nodos de

Ranvier (espaamento isento de mielina, internodal), e incisuras de Schmidt-

Lantermann (incisuras do citoplasma da clula de Schwann que percorrem a

bainha de mielina desde a face externa at a face interna)23.

A durao deste estgio inicial varia entre as espcies. Nos

invertebrados a degenerao Walleriana mais lenta do que nos mamferos,

depende do comprimento do coto distal, ou seja quanto maior, mais longa a

sobrevida, e depende da temperatura, a sobrevida maior em tecidos com

temperatura mais baixa, devido a desnaturao de protenas24.

Em condies normais, a concentrao intra-axonal de ons clcio

muito baixa; em fibras amielnicas sua distribuio homognea, mas nas

mielnicas, o clcio parece confinado a domnios especficos (maior concentrao

no axoplasma nodal, menor sob as incisuras de Schmidt-Lanterman e nenhum

clcio associado ao axolema). Em fases precoces de degenerao Walleriana (30

horas aps leso) a precipitao de clcio caracteriza reas de desintegrao do

citoesqueleto, o que definitivamente coloca o clcio como protagonista do

processo25.

Fisiologicamente, a transmisso sinptica interrompida

precocemente, mesmo antes das primeiras alteraes morfolgicas detectveis,

devido degenerao do terminal sinptico. O momento exato em que h esta

falha, no entanto, difcil precisar, j que depende de onde o nervo foi lesado,

uma vez que quanto mais prxima do terminal for leso, mais rapidamente a

transmisso sinptica ser interrompida26.

11

Aps estas alteraes preliminares, segue-se a desintegrao granular

do citoesqueleto, que tem incio em torno de 24 horas aps a leso, quando se

pode observar um pequeno nmero de fibras com degenerao do citoesqueleto

axonal. 30 horas aps a leso, possvel detectar o comprometimento de

aproximadamente 25% das fibras, sendo que as 75% restantes, apresentam-se,

metade normais, e a outra metade em processo inicial de desintegrao27.

Quarenta e oito horas aps a leso restam apenas raras fibras

normais. A desintegrao do citoesqueleto axonal constitui um processo ativo de

degradao por protelise enzimtica possivelmente mediada por calpanas, que

so proteases ativadas por clcio.

Aps a instalao do processo de desintegrao granular do

citoesqueleto iniciam-se as respostas de clulas no neuronais leso, sendo

uma das primeiras, a quebra na barreira hemato-nervosa, que ocorre aps a

desintegrao do citoesqueleto, de 24 a 48 horas ps-trauma. A desintegrao de

um pequeno nmero de axnios j parece ser suficiente para deflagrao deste

evento28.

As clulas de Schwann respondem de forma intensa leso axonal.

Paulatinamente, h uma ampliao dos nodos de Ranvier em virtude da retrao

da mielina paranodal. As alas terminais de mielina separam-se do axolema,

separam-se e vacuolizam-se. O citoplasma da clula de Schwann aumenta seu

volume prximo aos nodos e emite processos que se insinuam entre as alas

terminais de mielina e o axolema, e tambm entre as lamelas, levando a uma

retrao ainda maior da mielina. As alteraes axonais precedem as da mielina,

porm, algumas fibras j as apresentam alteradas 24 horas aps a leso29.

Cerca de 70 horas aps o incio da desintegrao do citoesqueleto (3

dia aps a leso), as clulas de Schwann entram em diviso celular (fase

proliferativa) e atingem o mximo de atividade em quatro dias. As clulas de

Schwann resultantes das divises celulares formam cadeias de clulas que se

sobrepem formando as bandas de Bngner (condutos longitudinais formados

pelas clulas de Schwann em proliferao). Nas fibras amielnicas degeneradas,

tambm ocorre mitose nas clulas de Schwann, juntamente com a replicao das

clulas endoneurais, como por exemplo: fibroblastos, mastcitos e clulas

endoteliais. A diviso celular das clulas de Schwann corresponde a importantes

12

modificaes na sntese protica destas clulas, que incluem sub-regulao da

maior parte das protenas de mielina e associadas mielina30. Esta sub-regulao

dependente da perda axonal. A sntese de fatores neurotrficos, como o fator de

crescimento neural (NGF), protena associada ao crescimento 43 (GAP-43) e

seus receptores, esto sobre-regulados devido sub-regulao dos

neurofilamentos e protenas na regio lesada, em consequncia do aumento dos

nveis de adenosina monofosfato cclico (AMPc)31.

A GAP-43 est associada ao crescimento e mobilidade do cone do

tecido nervoso. Inicialmente foi observada apenas nos axnios, posteriormente

notou-se que as clulas de Schwann tambm liberam esta protena, isto

observado em cones distais de crescimento nervoso32. O papel desta protena

est relacionado notificao do citoesqueleto e adeso entre os cotos de

axnios lesados33.

Os eventos celulares e moleculares envolvidos no processo de

degenerao nervosa aparentemente visam proporcionar caminhos para que

ocorra a regenerao. No sistema nervoso perifrico, diferentemente do sistema

nervoso central, isto muitas vezes possvel e acredita-se que o sucesso da

regenerao aps leso do sistema nervoso perifrico, se deva ao meio ambiente

propcio, especialmente presena das clulas de Schwann34,35.

As leses nervosas so classificadas em trs grupos36 de acordo com a

gravidade do dano:

Neuropraxia: leso onde ocorre alterao da bainha de mielina, sem perda da

continuidade do nervo, no ocorrendo a degenerao deste, onde seu

mecanismo de leso pode ocorrer por contuso ou compresso.

Axoniotmese: mais grave que a neuropraxia, apresenta interrupes tanto na

bainha de mielina quanto no axnio. Basicamente, ocorre a interrupo dos

axnios, permanecendo intacto o tecido conectivo que o rodeia e, portanto,

sem perda da continuidade no nervo. Clinicamente, existe uma perda

completa da funo nervosa, tanto motora como sensitiva.

Neurotmese: caracteriza-se pela perda da continuidade anatmica do nervo

produzida geralmente por seco do mesmo, com a manuteno parcial ou

no do perineuro, sendo a mais frequente e a mais grave das leses nervosas.

13

2.5) Fisiopatologia da leso

A neuropraxia resulta da compresso, promovendo uma anxia local

dos axnios por compresso dos vasos sanguneos. Ocorre um fenmeno de

adelgaamento da fibra nervosa com desmielinizao focal (diminuio

axoplasmtica intensa e localizada)37. A conduo nervosa se mantm

preservada acima e abaixo do local de leso, no ocorrendo degenerao

Walleriana (decomposio qumica da bainha de mielina em material lipdico e

fragmentao das neurofibrilas).

Uma vez removido o processo compressivo, ocorre remielinizao,

reaparecendo a conduo em dias ou semanas, com funo nervosa condutiva

normal.

Na neuropraxia a alterao patolgica presente a desmielinizao

das fibras nervosas. Este fenmeno leva perda da condutividade, mas sem

qualquer degenerao de axnios38.

2.6) Caractersticas histolgicas da regenerao de nervos perifricos

Os nervos perifricos podem se regenerar de trs diferentes maneiras,

dependendo do mecanismo da injria:

Na desmielinizao segmentar, a camada de mielina lesada se recompe num

processo chamado de remielinizao. Esta a forma mais rpida de

recuperao, ocorrendo entre 2 e 12 semanas aps a leso. Nas leses

nervosas onde a continuidade dos axnios interrompida, parcial ou

totalmente, ocorre degenerao axonal distal leso, pois a comunicao com

o corpo celular interrompida. Isto inicia nos primeiros minutos aps a leso.

Aps as primeiras 24 horas, esta degenerao j evidente e a destruio

das bainhas de mielina se inicia. Aps o terceiro dia inicia-se a quebra da

bainha de mielina que se torna mais evidente a partir do quinto dia.

Histologicamente, esse fenmeno conhecido como cmaras de digesto de

mielina. Aps trs semanas da leso axonal ter ocorrido, inicia-se o processo

de regenerao do nervo39.

Nas leses axonais parciais ocorre um processo conhecido como brotamento

axonal, onde axnios vizinhos intactos passam a inervar a rea desnervada

pela injria. Este fenmeno demora de dois a seis meses para ocorrer40.

14

Aps uma leso completa de um nervo perifrico, a regenerao das fibras

proximais somente ocorre se houver preservao do corpo celular, presente

no corno anterior da medula para os axnios motores e no gnglio da raiz

dorsal para os axnios sensoriais.

2.7) Terapias que modulam a regenerao nervosa

2.7.1) Laser - definio

LASER significa Light Amplification By Stimulated Emission of Radiation,

ou seja, dispositivo que gera intenso feixe de luz monocromtico, coerente e

colimado, podendo ter como meio ativo gs, slido ou lquido41.

A radiao laser pode ser refletida, transmitida, absorvida e espalhada por

um sistema biolgico e, depende das micro e macroestruturas do meio42.

2.7.1.1) Radiaes ionizantes e no ionizantes

Radiao ionizante a radiao que possui energia suficiente para

ionizar tomos e molculas, podendo danificar clulas e afetar o material gentico

de seres vivos, causando doenas graves ou at levando a morte. Exemplos de

radiao ionizante: a radiao eletromagntica ultravioleta e partculas como os

eltrons e os prtons que possuem altas energias. As partculas podem ser: alfa,

beta (eltrons e psitrons), os raios gama, raios-x e nutrons.

Esse tipo de radiao pode ser usada para pesquisa, diagnstico e

tratamento na medicina estando todos esses usos sujeitos s regulaes

governamentais. Nas aplicaes das radiaes ionizantes, o planejamento da

dosimetria nos tratamentos que usam feixes de radiao envolve a estimativa da

densidade de energia no tecido, que usada para determinar no apenas a

profundidade de penetrao da radiao, mas o valor e a posio de mxima

energia dentro do tecido.

J para a radiao no-ionizante, como o caso dos lasers, mesmo

conhecendo as propriedades pticas do tecido-alvo, no possvel prever com

preciso quo longe o fton se propagar antes de causar algum tipo de

interao. O motivo que na radiao no-ionizante, o mecanismo de interao

com o tecido varia de acordo com o comprimento de onda incidente e com as

caractersticas pticas do tecido-alvo, que heterogneo e complexo, tornando

http://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Energiahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ionhttp://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81tomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3o_eletromagn%C3%A9ticahttp://pt.wikipedia.org/wiki/El%C3%A9tronhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Pr%C3%B3tonhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADculas_alfahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADcula_betahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADcula_betahttp://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%B3sitronhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Raios_gamahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Raios-xhttp://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%AAutrons

15

extremamente difcil modelar todas as possveis interaes e, portanto, a trajetria

dos ftons e o valor mximo da densidade de energia dentro do tecido41

2.7.1.2) Fundamentos sobre o laser

O laser a amplificao de luz e sua emisso depende do meio ativo

utilizado. O meio ativo uma coleo de tomos, molculas ou ons que emitem

radiao eletromagntica. gerado um processo de excitao, chamado

bombeamento, e o meio ativo amplifica a radiao. Praticamente, no existe

disperso ou espalhamento neste feixe. O laser quando acionado pode ser

contnuo ou pulstil. Para atingir o alvo, o laser pode ser entregue por fibra ptica,

que permite contato com o tecido e pode consistir em fibroscpio com sistema de

visualizao; guia de onda oco, que consiste em tubos flexveis com superfcie

interna refletora; brao articulado, que consiste em espelhos localizados nos

cotovelos do brao e que direcionam o feixe ao longo dele; endoscpio, que

pode ser acoplado a um microscpio.

2.7.1.3) Tipos de lasers: de baixa e alta potncia

O laser classificado em: laser de alta potncia ou cirrgicos, com

potencial efeito trmico, apresent propriedades de corte, vaporizao e

hemostasia; e laser de baixa potncia ou teraputicos, apresentando

propriedades analgsicas, anti-inflamatrias e de bioestimulao. Exemplos: o

laser de Hlio-Nenio (He-Ne), cujo comprimento de onda 632,8nm, ou seja, na

faixa de luz visvel (luz vermelha); o laser de Arseneto de Galio-Aluminio (Ga-Al-

As), cujo comprimento de onda se situa fora do espectro de luz visvel (luz

infravermelha), sendo mais comumente 630-980nm, e o laser combinado de

Hlio-Nenio diodo. Alguns dos lasers utilizados em Odontologia esto situados

na faixa de luz visvel e outros na faixa do infravermelho43.

O laser teraputico baseia-se no conceito de bioestimulao. Este

conceito surgiu em 1967 quando Endre Mester estudou a radiao laser em

camundongos. Ele acreditou que o laser poderia causar cncer44. O estudo foi

feito com um laser de rubi de baixa potncia, com comprimento de onda de

694nm em um grupo de camundongos que teve o dorso depilado. O resultado

final no foi o desenvolvimento do cncer, e sim, o crescimento mais rpido de

pelos. Este fato descrito foi precursor, mas com o passar do tempo os

16

conceitos foram se modificando e o uso da laserterapia se tornando cada vez

mais rotineiro na rea mdica. Portanto, entender como a energia de lasers

trabalha nos nveis celulares e quais os parmetros timos de irradiao para os

diferentes usos destas fontes de luz se faz necessrio para seu uso seguro.

A fototerapia utilizada e estudada h muito tempo45, mas atualmente

os estudos buscam entender como a energia de lasers teraputicos atua nos

nveis celulares, ou seja, a fotobiologia do tecido, para que se possa determinar

os parmetros timos de irradiao para os diferentes usos destas fontes de luz.

2.7.1.4) Fotobiologia do tecido

A primeira lei da fotobiologia postula que, para a luz visvel de baixa

potncia ter qualquer efeito em um sistema biolgico vivo, os ftons devem ser

absorvidos pelas bandas de absoro eletrnica ou bandas de vibraes

moleculares pertencentes a alguma molcula que age como um cromforo ou

fotorreceptor46. Um cromforo para a luz visvel uma molcula (ou parte de uma

molcula) na qual a diferena de energia entre os eltrons em dois orbitais

moleculares diferentes coincide com a energia do fton. Numerosos exemplos de

cromforos existem na natureza, tais como clorofila nas plantas, em algas

bacterioclorofila bluegreen, flavoprotenas e de hemoglobina encontrada nas

clulas vermelhas do sangue47.

Um modo de encontrar este cromforo especfico medir o espectro

de absoro. O espectro de absoro em funo do comprimento de onda

indicar quais comprimentos de onda so mais efetivos para um tipo de tecido

biolgico. Em 1989, foi sugerido que o mecanismo de ao da terapia com laser

de baixa potncia em nvel celular era baseado na absoro da radiao

monocromtica visvel e no infravermelho prximo por componentes da cadeia

respiratria celular48.

Como o efeito dessa terapia depende da energia envolvida, a

mitocndria, organela da cadeia respiratria, tem funo relevante no processo. A

mitocndria desempenha um papel importante na gerao de energia e no

metabolismo celular, e se diferenciam por possuir duas membranas e geralmente

tm formato arredondado, com dimenso da ordem de 1 a 10 m. Elas convertem

molculas de glicose em energia na forma de adenosina trifosfato (ATP) por meio

17

do processo de fosforilao oxidativa. As mitocndrias participam do processo de

catabolismo usando caminhos metablicos que incluem o ciclo de Krebs, a

oxidao de cido graxo e a oxidao de aminocidos. Segundo uma reviso

literria de 201049, as mitocndrias so consideradas os fotorreceptores

principais, e o aumento de adenosina trifosfato, o oxignio reativo, o clcio

intracelular, a liberao de xido ntrico so eventos iniciais da cadeia metablica.

Alm do conceito de cromforos, uma considerao importante no uso

da laserterapia so as propriedades pticas do tecido alvo. Tanto a absoro

quanto o espalhamento da luz so dependentes do comprimento de onda, sendo

que na regio azul do espectro maior que no vermelho. Os principais

cromforos do tecido so: gua, hemoglobina e melanina, estas ltimas possuem

alta banda de absoro em comprimentos de onda menores que 600 nm, a gua

comea a absorver significativamente em comprimentos de onda maior do que

1150 nm.. Portanto, embora as luzes azul, verde e amarela possam ter efeitos

significativos sobre clulas em crescimento em meios de cultura opticamente

transparentes, o uso da laserterapia em animais, majoritariamente envolve as

luzes vermelha e infravermelha50.

Muitas das aplicaes dessa terapia esto na neurologia, envolvendo o

sistema nervoso central e perifrico. Muitas doenas ou leses cerebrais graves

podem se tratadas com sucesso com laserterapia, sem necessitar de

procedimentos invasivos. Alm disso, no sistema nervoso perifrico, pode ser

utilizado eficazmente para a regenerao de nervos e para alvio da dor51.

A terapia com o laser modula tambm o fator nuclear transcricional

Kapa B, o NF-kB. Ele um fator de transcrio regulador de expresso gnica52

que pode governar vrias funes celulares, incluindo a resposta inflamatria

induzida por estresse e sobrevivncia53 celular. Entender os mecanismos de

ativao que governam o NF-kB pode ser importante no estudo da reparao do

tecido ou mesmo na progresso do cncer. O NF-kB um fator de transcrio

sensvel a redox54 que tem sido proposto ser o sensor para estresse oxidativo55.

2.7.2) Biomaterial

Segundo a Sociedade Europia de Biomateriais, em 1987, o termo era

definido como um material no vivo utilizado como dispositivo mdico, para

18

interagir com sistemas biolgicos (Consensus Conference on Definitions in

Biomaterials Science of the European Society for Biomaterials). Esse conceito

considerava apenas material no vivo e, foi se modificando de acordo com os

estudos que avaliavam a interao do biomaterial e do tecido receptor. Em 1992

Willians56 designou biomateriais como uma classe de substncias naturais ou

sintticas que em contato, de forma permanente ou no, com tecidos e fluidos de

seres vivos, no causam efeitos deletrios ao organismo.

Em 2007 segundo Park e Lakes57 o conceito de biomaterial pode ser

definido como qualquer material usado na fabricao de dispositivos para

substituir uma parte ou funo do corpo de forma segura, confivel, econmica e

fisiologicamente aceitvel.

Atualmente, o conceito de biomaterial se baseia em um estudo de

2009: biomaterial toda substncia projetada para assumir uma forma que, por si

s ou como parte de um sistema complexo, utilizada para direcionar, atravs do

controle das interaes com os componentes dos sistemas vivos, o percurso de

qualquer procedimento de diagnstico ou teraputico, no ser humano ou na

Medicina Veterinria58.

A origem do biomaterial pode ser de natureza biolgica ou sinttica.

Inicialmente,a procura de tais compostos se deu com a utilizao de materiais de

origem biolgica como autgenos (onde o doador o prprio receptor), algenos

(onde o doador e o receptor so da mesma espcie) e xengenos (onde o doador

de origem animal)59. Com a evoluo da Engenharia dos tecidos trabalhos

foram realizados com o objetivo de dispor de materiais de origem sinttica com

caractersticas adequadas que permitam diminuir e, em alguns casos eliminar o

uso de materiais de origem biolgica.

Para que um biomaterial possa desempenhar uma determinada funo

seja de substituir, aumentar ou suportar uma estrutura, dois princpios fisiolgicos

devem ser considerados: a biofuncionalidade e a biocompatibilidade. Esses

princpios so considerados desde a escolha do material para a sua fabricao

at a determinao da funo a que se destina. O processo de fabricao tem

incio com a seleo do material, podendo este ser metal ou liga, materiais

cermicos, polmeros de natureza variada ou compsitos; com a anlise de

quantidade dos mesmos; e por fim, com a anlise das possveis reaes no

http://pt.wikipedia.org/wiki/Metaishttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cer%C3%A2micohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero

19

organismo de acordo com critrios qumicos, fisiolgicos e mecnicos da relao

do biomaterial com o organismo receptor60.

A biocompatibilidade a capacidade do material de gerar uma

resposta, com o mnimo de reaes alrgicas, inflamatrias ou txicas, quando

em contato com os tecidos vivos ou fluidos orgnicos61. A biocompatibilidade

compreende as interaes dos tecidos in vivo, ou em fluidos, incluindo sangue,

com um implante ou biomaterial. As interaes podem ser do meio fisiolgico

sobre o material ou ao do material no tecido, sendo difcil separar estas duas

interaes.

A biofuncionabilidade caracteriza a funo a qual o biomaterial se

destina. Ela se baseia nas propriedades especficas do material sejam elas

mecnicas, qumicas, pticas, eltricas.

Todo material implantado em tecidos vivos causa uma resposta no

organismo hospedeiro. Os biomateriais podem ser classificados de acordo com o

comportamento fisiolgico gerado quando na interao com o hospedeiro..

O biomaterial pode ser bioinerte, biotolervel, biorreabsorvvel e

bioativo. O material bioinerte no libera nenhum tipo de componente ou

quantidade mnima do biomaterial, sendo considerado estvel e mantendo suas

propriedades fsicas e mecnicas. O material bioinerte utilizado para

revestimento de tecidos ou para sustentao mecnica. Exemplos: titnia,

zircnia, alumina62. O biotolervel o material que quando em contato com o

organismo apresenta a formao de tecido fibroso ao seu redor. Esta camada

induzida por meio da liberao de compostos qumicos, ons, produtos de

corroso e outros. atravs da espessura dessa camada fibrosa que a toxicidade

do material determinada. Exemplos: polmeros sintticos e metais. O material

biorreabsorvvel aquele que aps certo perodo de tempo em contato com os

tecidos degradado, solubilizado ou fagocitado pelo organismo. Exemplo: fosfato

triclcico. O material bioativo promove ligaes qumicas com o tecido receptor.

Exemplo: hidroxiapatita63.

Para que um material seja aceito como biomaterial e utilizado em seres

vivos, vrios testes so exigidos primeiramente. O teste de citotoxidade o teste

inicial para avaliar a biocompatibilidade de qualquer material para uso mdico ou

odontolgico. Esse teste pode ser uma avaliao qualitativa e/ou quantitativa. A

http://pt.wikipedia.org/wiki/Organismo

20

avaliao qualitativa observa as mudanas morfolgicas das clulas. A avaliao

quantitativa investiga os parmetros celulares como a morte celular, a inibio do

crescimento, proliferao celular ou formao de colnias64.

De acordo com o rgo Internacional de Padronizao (International

Standard Organization), ISO 1099365, aps a utilizao de testes de citotoxidade

in vitro, e comprovada a sua no toxicidade que o estudo de biocompatibilidade

do produto pode ter continuidade, sendo realizados os ensaios necessrios em

animais de laboratrio.

Vrios mtodos in vitro para avaliar a toxicidade de biomateriais foram

padronizados utilizando culturas celulares. Consistem em colocar o material direta

ou indiretamente em contato com uma cultura de clulas de mamferos,

verificando as alteraes celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a

incorporao de corantes vitais ou a inibio da formao de colnias celulares. O

parmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade a viabilidade celular, que

pode ser evidenciada com auxlio de corantes vitais como o vermelho neutro,

solvel em gua e que passa atravs da membrana celular, concentrando-se nos

lisossomos, fixando-se por ligaes eletrostticos hidrofbicas em stios aninicos

na matriz lisossomal. Muitas substncias danificam as membranas resultando no

decrscimo de captura e ligao do vermelho neutro. Portanto, possvel

distinguir entre clulas vivas e danificadas ou mortas, pela medida de intensidade

de cor da cultura celular66. O uso de culturas celulares tem como vantagem a

rapidez, o custo, a sensibilidade e so reprodutveis.

No atual trabalho o biomaterial utilizado nomeado como composto

polivitamnico -NERVE e ser descrito a seguir.

2.7.2.1) O biomaterial utilizado no estudo: composto polivitamnico -

NERVE

O biomaterial compreende uma composio de vitaminas e sais

minerais fornecido pela JHS-Biomaterials, Sabar, Brasil. Segundo a empresa, o

biomaterial experimental aplicado diretamente na leso e, tem a capacidade de

limitar a ao dos radicais livres. Dados fornecidos pelo fabricante, segundo a

funo dos componentes: antioxidantes - -caroteno, -tocoferol, sais de selnio

e zinco; atividade metablica - complexo B, calciferol, sais de magnsio, sais de

21

fsforo, cido glutmico e lecitina de soja; agentes aglutinadores colgeno

hidrolisado, sulfato de glicosaminoglicanas e sulfato de condroitina.

O biomaterial apresenta uma consistncia de uma resina epxi que

aplicada ao redor da leso nervosa. A consistncia se d pela presena do

colgeno hidrolisado, do sulfato de glicosaminoglicanas e do sulfato de

condroitina em sua composio.

Segundo o fabricante, este biomaterial recebeu esta nomenclatura para

simbolizar a trade do processo de reparo: proteo celular, fornecimento de

nutrientes ATP e indicao do tecido. De acordo com a descrio, deve

proporcionar a reduo do dano oxidativo e melhorar a sustentao metablica

local para o tecido desejado: sseo ou nervoso. Os resultados histolgicos

realizados em animais indicaram uma preservao ou regenerao do tecido

envolvido67.

Allegrini68 avaliou o efeito da protena morfogentica ssea bovina

(BMPb), do composto polivitamnico e da hidroxiapatita quando inseridos em leito

sseo na tbia de coelho. Nesse estudo a BMPb e o composto no

desencadearam efeitos positivos no processo de deposio ssea em

comparao ao grupo da hidroxiapatita. O composto no foi absorvido pelo

organismo ficando entre o osso e a hidroxiapatita.

Em 2007, Salles69 estudou o estresse oxidativo agudo aps trauma

cirrgico, pela ativao de uma endonuclease sensvel ao estresse, o fator

nuclear kappa-beta (NF-kB), avaliada em cortical ssea de ratos Wistar. As

causas do estresse oxidativo pode ser dividido em duas classes: interna

(inflamao, reao auto-imune, problemas metablicos e isquemia) e externa

(organismos microbiolgicos, radiao eletromagntica ou mecnica, ao

trmica ou qumica), ocasionando falta de habilidade do organismo ou da clula

para se defender contra as espcies reativas do oxignio e ou nitrognio. A NF-kB

considerada um fator de estresse cuja ativao induz a produo de citocinas

pr-inflamatrias, a morte ou adaptao celular. O estresse se apresentou

reduzido indicando a influncia do composto no equilbrio da oxidao no tecido

sseo.

22

2.7.3) Microscopia eletrnica de varredura (MEV)

O microscpio eletrnico de varredura um tipo de microscpio

eletrnico capaz de produzir imagens de alta resoluo da superfcie de uma

amostra. Devido a maneira com que as imagens so criadas, imagens de MEV

tem uma aparncia tridimensional caracterstica e so teis para avaliar a

estrutura superficial de uma dada amostra.

Quando o feixe primrio interage com a amostra, os eltrons perdem

energia por disperso e absorso em um volume em forma de gota, conhecido

como volume de interao, o qual se estende de menos de 100 nm at em torno

de 5 m para dentro da superfcie da amostra. O tamanho do volume de interao

depende da energia dos eltrons, do nmero atmico dos tomos da amostra e

da densidade da amostra. A interao entre o feixe de eltrons e a amostra

resulta na emisso de eltrons secundrios, eltrons retroespalhados, eltrons

Auger, raios-x, radiao eletromagntica na regio do infravermelho, do visvel e

do ultravioleta e fnons, causando o aquecimento da amostra.

O microscpio eletrnico de varredura (MEV) um equipamento capaz

de produzir imagens de altos aumentos (at 300.000 x) e resoluo. As imagens

fornecidas pelo MEV possuem um carter virtual, pois o que visualizado no

monitor do aparelho a transcodificao da energia emitida pelos eltrons, ao

contrrio da radiao de luz. O princpio de funcionamento do MEV consiste na

emisso de feixes de eltrons por um filamento capilar de tungstnio (eletrodo

negativo), mediante a aplicao de uma diferena de potencial que pode variar de

0,5 a 30 KV. Essa variao de voltagem permite controlar a acelerao dos

eltrons. A parte positiva em relao ao filamento do microscpio (eletrodo

positivo) atrai fortemente os eltrons gerados, resultando numa acelerao em

direo ao eletrodo positivo. A correo do percurso dos feixes realizada pelas

lentes condensadoras que alinham os feixes em direo abertura da objetiva. A

objetiva ajusta o foco dos feixes de eltrons antes dos eltrons atingirem a

amostra analisada.

A preparao das amostras depende das caractersticas das mesmas:

slidos no condutivos so recobertos por material condutivo, ouro ou carbono,

ou o material pode ser embutido em resina, amostras biolgicas so desidratadas

e recobertas com material condutivo70.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_eletr%C3%B4nicohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_eletr%C3%B4nicohttp://pt.wikipedia.org/wiki/F%C3%B4non

23

OBJETIVO

O captulo a seguir apresenta as propostas da tese que

configuram o objetivo do trabalho.

24

3) OBJETIVO

O objetivo do estudo avaliar o potencial regenerativo de terapias para

tratamento de neuropatias do sistema nervoso perifrico, comparando os efeitos

de cada tratamento aplicado em uma determinada leso. O estudo consiste na

compresso do nervo isquitico de ratos Wistar com ns de fio de sutura e

aplicao de terapias para tratamento da mesma: laser de baixa potncia,

biomaterial -NERVE e a associao das duas. A anlise dos resultados da

microscopia ptica e microscopia eletrnica de varredura, juntamente com as

caractersticas de locomoo dos animais, tm como objetivos especficos:

o Identificar, nas amostras histolgicas do experimento, as

caractersticas da degenerao Walleriana;

o Avaliar os efeitos do laser, do biomaterial e da associao de ambos

no processo da degenerao e regenerao tecidual nervosa;

o Comparar grupos de animais tratados e no tratados;

o Analisar as vantagens e desvantagens de cada terapia;

o Eleger uma terapia favorvel para a regenerao do tecido nervoso

perifrico.

25

MATERIAIS E MTODOS

Neste captulo descrita a metodologia para obteno da leso

nervosa causada nos animais, as terapias utilizadas para tratamento, a

manipulao do equipamento de laser de baixa potncia, a descrio do

biomaterial utilizado e dos testes in vitro, a obteno das amostras para estudo

histolgico dos grupos de animais e a coleta dos dados obtidos com a

microscopia ptica e eletrnica de varredura.

26

4) MATERIAIS E MTODOS

Este estudo foi submetido e aprovado pela Comisso de tica no Uso de

Animais (CEUA) do Instituto de Pesquisa Energtica e Nucleares (IPEN), segundo

a numerao 110/12.

4.1) Grupos experimentais

Para este experimento foram utilizados sessenta ratos machos da linhagem

Wistar com massa corprea aproximada de 350g provenientes do prprio Biotrio

do Instituto de Pesquisa Energticas e Nucleares (IPEN).

Os animais ao atingirem a massa corprea desejada foram alojados em

gaiolas de conteno de polipropileno, agrupados em nmeros de trs, ou dois,

animais por gaiola correspondendo aos cinco animais de cada grupo em estudo,

FIG.5. As gaiolas possuem gua e rao ad libitum, mantidos em perodos

claro/escuro de 12 horas, temperatura mdia de 22 2 C, FIG.6, diminuindo o

estresse destes animais71. Estes animais seguiram regra e regulamentos da

FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations.

FIGURA 5 - animais acomodados na gaiola

FIGURA 6 - gaiolas organizadas nas prateleiras

Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos com 5

animais em cada, TAB.1:

Grupo 1 (G1) controle, no foi realizado nenhum tipo de tratamento;

Grupo 2 (G2) cirurgia Sham ou simulacro, o feixe nervoso foi exposto

atravs de uma inciso e dissecao at sua visualizao, porm no foi

realizada nenhuma manobra cirrgica;

27

Grupo 3 (G3) cirurgia com exposio e com compresso do nervo;

Grupo 4(G4) cirurgia com compresso do nervo e animais tratados com o

biomaterial -NERVE;

Grupo 5 (G5) cirurgia com compresso do nervo e animais tratados com

laserterapia;

Grupo 6 (G6) cirurgia como compresso do nervo e animais tratados,

simultaneamente, com -NERVE e laserterapia.

TABELA 1 agrupamento dos animais de acordo com a diviso dos grupos

experimentais, seu nome e procedimento executado, poca da eutansia

Nome do grupo

Procedimento cirrgico

Tratamento Eutansia (dias)

N total de animais

15 e 30 G 1 Controle Sem cirurgia Sem

tratamento

5 5 10

G 2 Sham exposio e

visualizao

do feixe

nervoso

Sem

tratamento

posterior

5 5 10

G 3 Neuropraxia

ou

Compresso

Compresso Sem

tratamento

posterior

5 5 10

G 4 Composto Compresso Colocao do

composto

polivitamnico

5 5 10

G 5 Laser Compresso Laserterapia 5 5 10

G 6 Composto e

Laser

Compresso Colocao do

Composto

polivitamnico

e aplicao de

laser

5 5 10

Total 30 30 60

28

4.2) Procedimento cirrgico

Os animais foram previamente anestesiados com ketamina (0,1ml/kg) e

xilazina (0,1ml/kg) atravs de injeo intramuscular. Assepsia com clorexidina 2%

foi realizada na regio operada (dorso e patas posteriores do animal). Seguindo-

se a tricotomia com lmina apropriada e uma segunda assepsia com clorexidina

2% para remoo de fragmentos de pelo, FIG.7 e 8.

FIGURA 7 Assepsia com gaze e clorexidina

2% na regio a ser incisada

FIGURA 8 animal pronto para inciso e

posicionado na mesa cirrgica

Para a inciso foi utilizada lmina de bisturi n15, FIG.9, da marca Solidor

sendo trocada quando o corte estava deficiente, ou de um animal para outro.

FIGURA 9 foto da lmina de bisturi n 15 da marca Solidor utilizada no experimento para fazer

a inciso no tecido externo do animal.

A inciso foi realizada paralela s fibras do msculo bceps femoral da coxa

direita do animal, expondo assim o nervo isquitico direito. A dissecao foi feita

at a exposio do feixe nervoso, FIG.10.

29

FIGURA 10 foto da exposio do nervo isquitico da pata direita do animal aps inciso e

separao do tecido muscular.

Os animais do grupo G2 nomeados como Sham sofreram o

procedimento cirrgico at esta etapa, na qual ocorre apenas a exposio do

nervo. Seguiu-se a sutura do tecido muscular com fio no reabsorvvel, sem a

manipulao do feixe nervoso. Posteriormente, a sntese do tecido externo foi

realizada com fio de sutura mononylon 4.0 da marca Ethicon.

A partir do grupo G3 em diante, aps a dissecao, o nervo ao ser

encontrado foi individualizado como mostra a FIG.11.

FIGURA 11 - foto ilustrando a exposio e individualizao do nervo isquitico da pata direita do

animal

O dano ao tecido nervoso foi induzido por compresso realizada com fio de

sutura mononylon 4.0 em trs regies consecutivas, este procedimento teve como

finalidade promover um dano ao feixe nervoso (isquitico), FIG.12 e 13.

30

FIGURA 12 - nervo isquitico individualizado

dos tecidos adjacentes

FIGURA 13 foto da execuo do segundo n

cirrgico 2x2 no nervo dissecado

O procedimento cirrgico consistiu em realizar a sutura em trs

pontos consecutivos do mesmo feixe nervoso, com intervalos entre os ns de ~2

mm, FIG.14 e15. Proposta esta baseada no trabalho de B Bennett e Xie (1988),

apud Ravi & Bedi, (2004)72.

FIGURA 14 foto A ilustra a execuo do terceiro n cirrgico no nervo isquitico do animal; a

foto B o maior aumento dos trs ns sequenciados com distncia de aproximadamente 2mm

entre eles.

No grupo G3, nomeado como Neuropraxia, os animais sofreram

apenas a compresso descrita no pargrafo anterior e, o procedimento foi

concludo com a sutura do tecido externo.

4.3) Terapias

Nos prximos grupos 4, 5 e 6 (G4, G5, G6) os animais sofreram o

procedimento cirrgico descrito anteriormente e ilustrado para grupo G3, mas

receberam tratamento em seguida. As propostas teraputicas foram aplicadas

31

utilizando o biomaterial no grupo G4, a laserterapia no grupo G5 e a associao

do biomaterial e da laserterapia no grupo G6.

4.3.1) Composto Polivitamnico - NERVE

O biomaterial utilizado o -NERVE fornecido pela empresa JHS-

Biomaterials, Sabar, Brasil. Este composto polivitamnico como todo material

com potencial para uso mdico necessita do teste de citotoxidade para avaliar a

biocompatibilidade. O teste in vitro deste material foi realizado de acordo com a

norma ISO 10993-5, partes 5 e 12, no Centro de Biotecnologia IPEN.

No grupo G4, aps a exposio e compresso do nervo, o biomaterial

foi aplicado diretamente na leso, na regio do nervo comprimida pelo fio de

sutura. Para isto, o frasco foi aberto e retirada uma quantidade de ~ 0,25g do

biomaterial e, este foi inserido ao redor da regio lesada tanto por baixo do nervo,

FIG.16, como recobrindo os trs ns cirrgicos confeccionados no nervo, FIG.17;

seguindo a sutura dos tecidos profundos e superficiais.

FIGURA 15 nervo submetido a neuropraxia e

o biomaterial sendo adaptado ao redor do

nervo na regio onde foi causada a leso

FIGURA 16 - recobrimento total dos ns com

-NERVE

4.3.2) Laserterapia

O equipamento utilizado foi fornecido pela empresa DMC, Photon

Lase III, laser vermelho e infravermelho, com registro ANVISA: 80030810014.

Possui funo luz laser com comprimento de onda entre 630 690nm (laser

vermelho) e entre 790 830nm (laser infravermelho) para bioestimulao nas

reas de odontologia, medicina e fisioterapia, nas quais incluem: alvio de dor

32

(efeito de analgesia), reparao tecidual (efeito bioestimulador do trofismo celular)

e reduo de edema e de hiperemia (efeito antiinflamatrio, antiedematoso e

normalizador circulatrio). Caractersticas estas fornecidas pelo fabricante. As

especificaes tcnicas esto descritas no ANEXO A.

A irradiao laser foi realizada no ato cirrgico diretamente no nervo,

aps a compresso feita com os ns. Aps a sutura final a aplicao foi repetida

agora sobre o tecido externo.

Seguindo a proposta baseada nos estudos de Khadra et al, 200473,

neste trabalho foram utilizados dez dias consecutivos de laserterapia de baixa

potncia. O estudo foi feito para avaliar o efeito da laserterapia de baixa potncia

em implantes sseos; utilizou animais que receberam a terapia por 10 dias e

foram acompanhados por 8 semanas. O resultado foi favorvel para a

osteointegrao.

A aplicao do laser foi orientada pela linha de inciso de,

aproximadamente, 4 cm ( linha vermelha na FIG 17) na pata do animal. A ponta

do equipamento era posicionada verticalmente esta linha a uma distncia de

1cm do tecido. A linha de sutura era dividida em 2 regies ( pontos A e B),

abrangendo a regio operada. A irradiao era feita no ponto A, depois B. Em

seguida, acima e abaixo da linha (C e D).

FIGURA 17 representao da rea irradiada na pata do animal que recebeu a terapia com laser.

A linha vermelha se refere inciso e A, B, C e D a localizao da ponta do equipamento para a

aplicao e entrega da radiao.

A irradiao infravermelha foi de forma pontual em A, B, C e D

abrangendo assim a regio operada. Segundo as caractersticas do equipamento,

a fluncia de 140J/ cm e dose de 4J por ponto por 25 segundos.

Os animais seriam previamente imobilizados em um contensor, mas

no foi necessrio. Os animais foram manipulados calmamente no gerando

estresse a eles, conseguindo assim uma irradiao efetiva, FIG.18. Os grupos G5

Linha de inciso 4cm

A

C

D

B

A

33

e G6 correspondem aos grupos irradiados com laser como determinado pelo

fabricante. No prprio equipamento a opo parestesia j preconizada pela

empresa.

FIGURA 18 realizando a aplicao do laser na regio operada nos animais do grupo G6 aps

sutura final do tecido externo

4.3.3) Uso do Composto Polivitamnico -NERVE associado ao laser

No grupo G6 as terapias foram associadas, simultaneamente foi realizado

a aplicao do laser e a colocao do biomaterial. O nervo foi exposto, a

compresso com o fio de sutura foi realizada, a irradiao laser foi feita

diretamente na regio da leso, o biomaterial foi colocado envolvendo o nervo,

como descrito para o grupo G4 e, em seguida foi feita a sutura por planos. Como

as terapias foram associadas, a aplicao do laser se manteve nos dez dias

consecutivos, como no grupo G5.

4.4) Avaliao morfolgica

A eutansia dos animais foi realizada com uma sobre dosagem de

anestsicos. Foram sacrificados, nos primeiros quinze dias aps o procedimento

cirrgico, cinco animais de cada grupo. Isto se repetiu no trigsimo dia, finalizando

a eutansia dos outros trinta animais.

Conforme o tempo proposto de quinze e trinta dias, os tecidos foram

dissecados e o fragmento do feixe foi coletado. Este segmento compreendia,

aproximadamente, 15mm, sendo 5mm referente a regio comprimida pelo fio de

sutura, 5mm do segmento distal e 5mm do segmento proximal.

34

No grupo G1 a coleta do segmento do feixe obedeceu a dimenso

proposta de aproximadamente 15 mm do feixe ntegro. No grupo G2 foi feita nova

inciso na regio operada que ainda apresentava cicatriz, e o material foi

coletado. Nos grupos G3, G4, G5 e G6 a remoo do segmento do nervo foi feita

juntamente com o fio de sutura que causou dano nervoso, pois este fio de sutura

utilizado no absorvido,FIG19.

FIGURA 19 dissecao para remoo do fragmento do nervo isquitico do animal envolvendo

uma distncia de 1 cm a mais tanto do coto proximal e distal

As amostras foram ento fixadas em soluo de formol tamponado 10%

durante 24 horas, a temperatura ambiente. Posteriormente, o fio de sutura foi

removido para no interferir na confeco das lminas histolgicas. Foi feita uma

marcao no coto utilizando um n na extremidade proximal do segmento lesado,

apenas como referncia de estudos. As amostras foram ento processadas de

forma rotineira para incluso em parafina. Os cortes foram feitos no micrtomo da

marca Jung e na espessura de 5m, FIG.20. A estrutura para a confeco das

lminas histolgicas foi oferecida pelo Departamento de Patologia da Faculdade

de Odontologia da Universidade de So Paulo - FO/USP. Para complementar a

coleta de dados, cortes transversais foram realizados no Instituto de Cincias

Biomdicas da USP (ICB -3).

35

FIGURA 20 micrtomo da marca JUNG pertencente ao Instituto de Patologia da Faculdade de

Odontologia da Universidade de So Paulo

As imagens das lminas foram capturadas utilizando o microscpio e a

cmera acoplada LEICA DFC 310 FX, transmitidas ao computador da Apple

Macintosh.

Foram feitas tambm imagens das amostras dos seis grupos por

microscopia eletrnica de varredura. Foi utilizado o aparelho de microscopia de

varredura da marca Philips XL30. As amostras para a MEV foram desidratadas

em vcuo e recobertas com ouro, FIG.21, imagens A e B, respectivamente.

FIGURA 21 imagens das amostras do grupo G3 preparadas para microscopia de varredura. A

imagem A representa a amostra desidratada e a B representa as amostras recobertas com ouro.

Os parmetros analisados foram:

Quantidade de fibras nervosas;

Dimetro das fibras nervosas;

Integridade do tecido envolvido;

Destruio e neoformao do tecido nervoso.

36

RESULTADOS E DISCUSSO

Este captulo apresenta os resultados e a discusso sobre os dados

obtidos incluindo observao clnica da locomoo dos animais e a anlise

morfolgica sobre a degenerao do tecido nervoso nos seis grupos formados.

37

5) RESULTADOS E DISCUSSO

5.1) Os animais

No procedimento experimental foram utilizados sessenta ratos, sendo

que dez pertenciam ao grupo controle, no receberam nenhum procedimento, e

os outros cinquenta ratos sofreram algum tipo de manipulao. Em vinte e quatro

horas aps o procedimento cirr