avaliaÇÃo in vitro da eficÁcia de plantas do bioma

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

ANNE CAROLINE DOS SANTOS DANTAS

AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO

BIOMA CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS

Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)

PETROLINA 2014

ANNE CAROLINE DOS SANTOS DANTAS

AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO

BIOMA CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS

Rhipicephalus (Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)

PETROLINA 2014

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Petrolina, como requisito da obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.

Orientador: Prof. Dr. Mauricio Claudio Horta

Dantas, Anne C. S.

D192a Avaliação in vitro da eficácia de plantas do bioma Caatinga no controle de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus Cannestrini,1887) / Anne Caroline dos Santos Dantas. -- Petrolina, 2014.

100 f.: il. ; 29cm.

Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Centro, Petrolina - PE, 2014.

Orientador: Prof. Dr. Mauricio Claudio Horta.

Referência

1. Plantas da Caatinga – extrato. 2. Carrapatos - controle. 3. Boophilus microplus. 4. Matéria Médica Vegetal. I.Título. II. Horta, Mauricio Claudio. III. Universidade Federal do Vale do São Francisco.

CDD 615.537

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

Anne Caroline dos Santos Dantas

AVALIAÇÃO IN VITRO DA EFICÁCIA DE PLANTAS DO BIOMA

CAATINGA NO CONTROLE DE CARRAPATOS Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (CANESTRINI,1887)

Aprovada em: ___ de _______________ de _____.

Banca Examinadora:

__________________________________________ Prof. Dr. Mauricio Claudio Horta

__________________________________________ Profª. Drª. Xirley Nunes Pereira

__________________________________________ Prof. Dr. Luís Antônio Sangioni

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido, pela Universidade Federal do Vale do São Francisco.

À Deus por ter colocado as pessoas certas no meu caminho.

Aos meus sábios e queridos pais Magnólia Augusta dos Santos Freitas e Francisco Etizel Alves Dantas

Aos meus irmãos André Luciano Dantas, Ricardo Alessandro Dantas e Simone Cristine Dantas Campos, pela paciência e compreensão.

Ao meu companheiro e grande amigo Domingos Ramos Brandão, que com seu amor me apoiou diariamente, iluminando toda essa caminhada.

Dedico este trabalho.

Agradecimentos

Ao professor Mauricio Claudio Horta, um grande profissional e amigo, por seu

exemplo, por todos os ensinamentos e oportunidades e principalmente por ter

acreditado em meu trabalho.

Aos professores Dra. Edigênia Cavalcante, Dr. Wagner Félix, Dra. Xirley Nunes, pela

amizade, apoio e valoroso conhecimento que me transmitiram e em especial Dr.

Luciano Ribeiro por ter me prestado indispensável auxílio na análise estatística dos

meus experimentos, pela disposição em ajudar e apoiar meu trabalho desde o

primeiro momento.

Ao Prof. Dr. Jackson Roberto da Silva Guedes Almeida, pela grande dedicação,

presteza e seriedade que me ajudou.

Aos meus colegas de Mestrado, Edemir, Eliatânia, Igor, Leandra, Rafael, Suzana e

em especial Martapoliana, pela amizade, aceitação e parceria nos trabalhos.

Aos alunos e ex-alunos do NEZOON, Davi, Denise, Eline, Grace, Larissa, Maíra,

Thalita, Whitara, e em especial a Dália, pela colaboração e dedicação nos trabalhos

de laboratório e de campo.

Aos alunos do NEPLAME, em especial Graziella, Francisco Junior e Pedro Henrique

pela inestimável ajuda na confecção dos extratos.

Aos técnicos e companheiros de trabalho: Amanda, Ana Paula, Sílvio Alan, Roniere

Alencar e Leonardo Torres, pela ajuda e amizade.

A Sarah Raquel e Alessandra Pacheco, pela ajuda na realização deste trabalho,

pelas maravilhosas palavras de apoio em momentos tão difíceis e por toda

demonstração de carinho e amizade, vocês foram os “anjos” que Deus enviou para

me guiar nessa dura caminhada.

Ao meu amigo e grande amor Domingos Brandão, sem você esse trabalho nem teria

começado, obrigado pela determinação em procurar os professores, por lutar pelo

meu mestrado como se fosse seu. Pelas palavras de incentivo e apoio e

principalmente por toda a compreensão. Obrigada também por dedicar vários fins de

semanas e feriados, para ajudar na contenção das vacas e nos experimentos, para

você minha eterna gratidão.

A minha sobrinha Bruna Carolina, pelos fins de semanas que me ajudou a lavar as

vidrarias, os meus dias foram mais alegres com a sua presença.

A minha amiga do mestrado e companheira de viagens, Larissa Macêdo, que

possamos continuar vários anos procurando juntas à “cura”. Você foi a surpresa

doce e maravilhosa desse período de tantos conhecimentos.

Aos meus amigos Ana Lucila, Indira Brito, Juçara dos Santos, Mércia Fabiana,

Rafaella Cerqueira, Rafael de França que mesmo distantes, se fizeram presentes

durante todo esse processo, desde a minha aprovação até o momento da minha

defesa, me incentivando e torcendo por mim, o meu sincero obrigado!

Aos funcionários, Seu João e Seu Tonho e em especial ao Seu Reginaldo, por não

medir esforços e estar sempre disponível, mesmo nos domingos e feriados, para a

árdua tarefa de conter os animais.

A terceira das trigêmeas, Andryelly, pela presença, principalmente paciência (muita

paciência), por modificar a sua rotina em prol do meu trabalho, por me permitir dividir

os seus momentos e principalmente por me fazer lembrar que pessoas iluminadas

existem.

E em especial, a minha grande amiga e aluna do mestrado de Ciências Veterinárias,

Andreina, pela ajuda fundamental, incondicional (dia, noite, finais de semana e

feriados) e, acima de tudo, por me ajudar a ter forças e continuar em frente, levarei

você para sempre no meu coração, obrigada pela sua amizade.

E a todos que me apoiaram, estiveram ao meu lado nas minhas conquistas e

derrotas e que não foi possível mencionar devido ao espaço restrito.

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o

melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus,

não sou o que era antes”. (Martin Luther King)

RESUMO

O controle do carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é feito quase

que exclusivamente com produtos químicos. Esses produtos e seus resíduos podem

trazer sérios problemas à saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. Além

disso, existem relatos de resistência dos carrapatos a quase todos os produtos

químicos comercializados. As pesquisas no âmbito da fitoterapia vêm buscando a

possibilidade de descoberta de novos produtos para o controle do parasitismo,

representando fundamental importância na legitimação de extratos vegetais. O

objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade acaricida in vitro de extratos de plantas

do bioma Caatinga no controle de R. B. microplus. Os extratos de Amburana

cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta; e frações (5,

10 e 25 mg/mL), tiveram o perfil fitoquímico realizado por cromatografia líquida de

alta eficiência (CLAD) e foram submetidos ao teste de imersão de adultos, para

verificação da porcentagem de eclosão dos ovos, inibição da oviposição, índice de

reprodução estimada e a eficácia dos extratos. Das quatro plantas avaliadas, as

cascas de A. cearensis e as folhas de N. variegata apresentaram as melhores

eficácias na fase hexânica (2,5%), obtendo 66,8% e 99,8%, respectivamente. M.

nigra obteve o melhor resultado na fase clorofórmica (2,5%), com 65,4% e o extrato

etanólico bruto de S. convoluta apresentou eficácia de 54,6%. Embora nem todas as

plantas tenham apresentado uma eficácia satisfatória, os resultados encontrados

podem sugerir um efeito auxiliar no controle de carrapatos. Novos estudos devem

ser realizados, a fim de detectar os componentes dessas plantas que possuem

atividade acaricida.

Palavras-chaves: Biocarrapaticidograma; Plantas; R. (B.) microplus

ABSTRACT

The control of the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is done almost

exclusively with chemicals products and their residues, which can cause serious

health problems for humans, animals and the environment. In addition, there are

reports of resistance of ticks to almost all chemicals products. Researches in this

area have seeking the possibility of discover new products for the control of

parasitism, representing fundamental importance in legitimizing plant extracts. The

aim of this study was to evaluate the acaricidal activity in vitro of plant extracts from

the Caatinga biome in the control of R. B. microplus. The extracts of Amburana

cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata and Selaginella convoluta; and

fractions (5,10 e 25 mg/mL), had the phytochemical profile realized for high

performaced liquid chromatography (HPLC) and were tested in females by adult

immersion test for evaluation of hatching eggs percentage, oviposition inhibition,

estimated reproduction and efficacy of the extracts. The barks of A. cearensis and

leaves of N. variegata showed the best efficiencies in the hexane fraction (2.5%),

with 66.8% and 99.8%, respectively. M. nigra had the best result in the chloroform

phase (2.5%), with 65.4%; and the crude ethanol extract of S. convoluta showed

54.6% of efficacy. Although the great number of extracts have not showed

satisfactory efficacy, the results can be suggested an auxiliary effect of control of

ticks. New studies must be performed, to detect the components of these plants have

acaricidal activity.

Key words: adult immersion test; plants; R. (B.) microplus

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Amburana cearensis 35

Figura 2 Morus nigra 36

Figura 3 Neoglaziovia variegata 37

Figura 4 Selaginella convoluta 38

Figura 5 Cromatograma do extrato etanólico de Amburana cearensis 52

Figura 6 Cromatograma do extrato etanólico de obtido Morus nigra 53

Figura 7 Cromatograma do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata 54

Figura 8 Cromatograma do extrato etanólico de Selaginella convoluta 55

Figura 9 Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL.

56

Figura 10 Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

57

Figura 11 Eficácia do extrato das folhas de A. cearensis no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

59

Figura 12 Efeito do extrato de M. nigra sobre a ovipostura do carrapato R.

(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL 60

Figura 13 Efeito do extrato das folhas de M.nigra sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

61

Figura 14 Eficácia do extrato das folhas de M. nigra no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

63

Figura 15 Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

64

Figura 16 Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10

e 25 mg/mL 65

Figura 17 Eficácia do extrato das folhas de N. variegata no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

67

Figura 18 Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

68

Figura 19 Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a eclosão dos ovos do carrapato R.(B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

69

Figura 20 Eficácia do extrato das partes aéreas de N. variegata no controle

do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

71

Figura 21 Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

72

Figura 22 Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

73

Figura 23 Eficácia do extrato das folhas de S. convoluta no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL

75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários dos extratos das 4 espécies da caatinga por cromatografia em camada delgada

43

Tabela 2 Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas de Amburana cearensis

48

Tabela 3 Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Morus

nigra 49

Tabela 4 Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Neoglaziovia variegata

50

Tabela 5 Caracterização fitoquímica dos extratos das partes aéreas de

Neoglaziovia variegata

51

Tabela 6 Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Selaginella

convoluta 51

Tabela 7 Efeito do extrato das cascas de Amburana cearensis sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

58

Tabela 8 Efeito do extrato das folhas de M. nigra sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

62

Tabela 9 Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

66

Tabela 10 Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

70

Tabela 11 Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

74

Tabela 12 Eficácia comparativa entre as espécies A. cearensis, M. nigra, N.

variegata, e S. convoluta 76

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOEt Acetato de etila

ANOVA Análise de variância

BOD Demanda Bioquímica de Oxigênio

CHCl3 Clorofórmio

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjo de Diodo

CRAD Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga

DAD Detector de Arranjo de Diodo

EEB Extrato Etanólico Bruto

EtOH Etanol

H2SO4 Ácido Sulfúrico

H3PO4 Ácido Fosfórico

HVASF Herbário Vale do São Francisco

IUCN Conservação da Natureza dos Recursos Naturais

KI- HCI Ácido clorídrico com iodeto de potássio

KOH Hidróxido de Potássio

MEOH Metanol

NCBI National Center for Biotechnology Information Taxonomy

Ac- EEB Extrato etanólico bruto de Amburana cearensis

Ac- AcOEt Fase acetato de Amburana cearensis

Ac- CHCl3 Fase clorofórmica de Amburana cearensis

Ac- Hex Fase hexânica de Amburana cearensis

Mn- EEB Extrato etanólico bruto de Morus nigra

Mn- AcOEt Fase acetato de Morus nigra

Mn- CHCl3 Fase clorofórmica de Morus nigra

Mn- HEX Fase hexânica de Morus nigra

Nv-AcOEt Fase acetato de Neoglaziovia variegata

Nv- Hex Fase hexânica de Neoglaziovia variegata

Nv-CHCl3 Fase clorofórmica de Neoglaziovia variegata

Nv-EEB Fase etanólica de Neoglaziovia variegata

Sc- EEB Extrato etanólico bruto de Selaginella convoluta

Sc- AcOEt Fase acetato de Selaginella convoluta

Sc- CHCl3 Fase clorofórmica de Selaginella convoluta

Sc- HEX Fase hexânico de Selaginella convoluta

UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana

UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco

UV Ultra Violeta

UV-Vis Ultra Violeta visível

LISTA DE SÍMBOLOS

ºC Graus Celsius

cm Centímetros

% Por cento

Kg Quilograma

US$ Dólar dos Estados Unidos

‘ Minutos

S Sul

Km2 Quilômetros quadrados

m Metros

g Gramas

mm Milímetros

mL Mililitro

µL Microlitro

nm Nanômetro

= Igual

x Vezes

± Mais ou menos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 19

2. OBJETIVOS ........................................................................................... 22 2.1 Objetivo geral ..................................................................................... 23 2.2 Objetivos específicos ........................................................................ 23 3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................. 24 3.1 Rhipicephalus (Boophilus) microplus .............................................. 25 3.1.1 Organização taxonômica ................................................................... 25 3.1.2 Distribuição geográfica ...................................................................... 26 3.1.3 Ciclo evolutivo ................................................................................... 27 3.1.4 Mecanismo de sobrevivência dos carrapatos ao clima árido e semiárido ....................................................................................................

29

3.1.5 Prejuízos atribuídos ao carrapato ..................................................... 30 3.1.6 Resistência aos carrapaticidas .......................................................... 30 3.1.7 Plantas com atividade carrapaticida .................................................. 32 3.2 Bioma Caatinga .................................................................................. 33 3.2.1 Amburana cearensis ......................................................................... 34 3.2.2 Morus nigra ....................................................................................... 35 3.2.3 Neoglaziovia variegata ...................................................................... 36 3.2.4 Selaginella convoluta ........................................................................ 37 4. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 40 4.1 Material vegetal .................................................................................. 41 4.1.1 Amburana cearensis ......................................................................... 41 4.1.2 Morus nigra ....................................................................................... 41 4.1.3 Neoglaziovia variegata ...................................................................... 41 4.1.4 Selaginella convoluta ........................................................................ 41 4.2 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) e das frações das espécies selecionadas .............................................................................

42

4.3 Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos ...... 42 4.4 Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .......... 44 4.5 Colônia de carrapatos ........................................................................ 44 4.6 Teste de imersão de fêmeas ingurgitadas ....................................... 45 4.6.1 Parâmetros analisados ...................................................................... 45 4.7 Análise estatística .............................................................................. 46 5. RESULTADOS ....................................................................................... 47 5.1 Triagem fitoquímica ........................................................................... 48 5.1.1 Amburana cearensis ......................................................................... 48 5.1.2 Morus nigra ....................................................................................... 48 5.1.3 Neoglaziovia variegata ...................................................................... 49 5.1.3.1 Folhas ............................................................................................. 49 5.1.3.2 Partes aéreas ................................................................................. 50

5.1.4 Selaginella convoluta ................. 51 5.2 Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD) .........................

52

5.2.1 Análise em CLAE do extrato etanólico de Amburana cearensis ....... 52 5.2.2 Análise em CLAE do extrato etanólico de Morus nigra ..................... 53 5.2.3 Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata ... 54 5.2.4 Análise em CLAE do extrato etanólico de Selaginella convoluta ...... 55 5.3 Teste de imersão ................................................................................ 56 5.3.1 Amburana cearensis ......................................................................... 56 5.3.1.1 Inibição da oviposição (IO) ............................................................. 56 5.3.1.2 Porcentagem de eclosão (%E) ....................................................... 57 5.3.1.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER)............................................. 58 5.3.1.4 Eficácia (EF) ................................................................................... 59 5.3.2 Morus nigra ....................................................................................... 60 5.3.2.1 Inibição da oviposição (IO) ............................................................ 60 5.3.2.2 Porcentagem de eclosão (%E) ...................................................... 61 5.3.2.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ............................................ 62 5.3.2.4 Eficácia (EF) ................................................................................... 62 5.3.3 Neoglaziovia variegata ...................................................................... 64 5.3.3.1 Folhas ............................................................................................. 64 5.3.3.1.1 Inibição da oviposição (IO) .......................................................... 64 5.3.3.1.2 Porcentagem de eclosão (%E) .................................................... 65 5.3.3.1.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ......................................... 66 5.3.3.1.4 Eficácia (EF) ............................................................................... 66 5.3.3.2 Partes aéreas ................................................................................. 67 5.3.3.2.1 Inibição da oviposição (IO) .......................................................... 67 5.3.3.2.2 Porcentagem de eclosão (%E) .................................................... 68 5.3.3.2.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ......................................... 69 5.3.3.2.4 Eficácia (EF) ................................................................................ 70 5.3.4 Selaginella convoluta ........................................................................ 71 5.3.4.1 Inibição da oviposição (IO) ............................................................. 71 5.3.4.2 Porcentagem de eclosão (%E) ....................................................... 72 5.3.4.3 Indice de eficiência reprodutiva (IER) ............................................ 73 5.3.4.4 Eficácia (EF) .................................................................................. 74 5.3.5 Eficácia comparativa das plantas testadas ....................................... 76 6. DISCUSSÃO .......................................................................................... 77

7. CONCLUSÕES ...................................................................................... 84 8. REFERÊNCIAS ...................................................................................... 86

ANEXOS .................................................................................................... 98

1. INTRODUÇÃO

DANTAS, A.C.S. Avaliação in vitro da eficácia do extrato de plantas do bioma caatinga no controle de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887).

20

1. INTRODUÇÃO

O aumento da demanda mundial por proteínas de origem animal tem levado a

bovinocultura a usufruir de tecnologias que visem aumentar a produção em menor

tempo e espaço. Essas técnicas têm proporcionado grande desequilíbrio na interação

parasito-hospedeiro, levando a prejuízos cada vez maiores causados por parasitos,

como os carrapatos (LABRUNA; LEITE; OLIVEIRA, 1999).

Conhecido popularmente como o “carrapato do boi”, Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, além de ser um dos mais importantes transmissores de patógenos para o

gado (DE CASTRO, 1997) é o responsável por grandes prejuízos ao setor

agropecuário (GEORGE; DAVEY; POUND, 2002).

O controle do carrapato bovino é geralmente efetuado por meio de produtos

químicos sintéticos convencionais, que acarretam problemas como o desenvolvimento

acelerado da resistência ao princípio ativo (LEAL; FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003).

Uma vez instaurada a resistência, o produtor frequentemente aumenta a dose do

pesticida ou a frequência das aplicações (THULLNER, 1997). O uso intensivo desses

produtos químicos tem levado a contaminação do meio ambiente, a exposição do

trabalhador rural e a presença de resíduos químicos no leite e na carne, o que tem

provocado grande preocupação na sociedade e órgãos governamentais (LEAL;

FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003).

Devido às inúmeras dificuldades no controle e combate desse artrópode, a

utilização de plantas medicinais é uma alternativa cada vez mais viável em países em

desenvolvimento como o Brasil, devido principalmente a grande variabilidade de

espécies existentes, baixo custo, fácil disponibilidade, rápida degradação quando

comparado aos produtos químicos e consequentemente diminuindo a contaminação

do ambiente, dos animais e dos homens (AGNOLIN, 2009), sendo esses os principais

motivos para o estudo de plantas que possuam real efeito acaricida (SOARES, 2003).

A Caatinga é o único bioma brasileiro cujos limites estão inteiramente restritos

ao território nacional, e é proporcionalmente o menos estudado entre as regiões

naturais brasileiras, com grande parte do esforço científico estando concentrado em

alguns poucos pontos em torno das principais cidades da região. Além disso, a

Caatinga é a vegetação brasileira menos protegida, pois as Unidades de


21

Conservação cobrem menos de 2% do seu território, como consequência, esse bioma

continua passando por um extenso processo de alteração e deterioração ambiental

provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais, o que está levando a

rápida perda de espécies únicas, à eliminação de processos ecológicos chaves e a

formação de extensos núcleos de desertificação em vários setores da região (LEAL;

TABARELLI; SILVA, 2003).

Em virtude da pouca quantidade de espécies estudadas na Caatinga, a análise

fitoquímica de suas plantas é de grande importância e o estudo da atividade

carrapaticida desses extratos vegetais, poderá proporcionar o desenvolvimento de

métodos viáveis para reduzir a contaminação química na pecuária e minimizar um dos

grandes problemas enfrentados pelos pecuaristas: o aumento da resistência de R.

(B). microplus aos acaricidas sintéticos.


22

2. OBJETIVOS


23

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Este trabalho tem como objetivo avaliar a eficácia de plantas do Bioma

Caatinga, quanto à sua ação contra o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

2.2. Específicos

• Elaborar extratos para serem utilizados nos experimentos;

• Realizar triagem fitoquímica dos extratos vegetais, para a identificação das principais

classes de constituintes químicos;

• Detectar compostos presentes nos extratos de Amburana cearensis, Morus nigra,

Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta por cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC);

• Colher carrapatos em fase de parasitismo para a obtenção de uma colônia em

laboratório;

• Avaliar através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas se os extratos ou suas

frações causaram mortalidade ou interferiram em alguma fase de reprodução do R.

(B.) microplus;

• Realizar um estudo comparativo com os resultados das plantas avaliadas.


24

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA


25

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Rhipicephalus (Boophilus) microplus

3.1.1. Organização taxonômica

O carrapato Boophilus microplus (Canestrini, 1887) foi reclassificado como

pertencente ao gênero Rhipicephalus, subgênero Boophilus, com base em análises

moleculares (MURREL; BARKER, 2003). No entanto, apesar de filogeneticamente

próximos, Caeiro (2006) faz uma reflexão sobre a sistemática do gênero

Rhipicephalus (Koch, 1844) e Boophilus (Curtice, 1891) e considera que suas

características morfológicas e biológicas distintas não permitem que o segundo seja

considerado um subgênero do primeiro. Apesar da opinião controvérsia, neste

trabalho será utilizada a nomenclatura dada por Murrell e Barker (2003):

Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887).

Segundo o National Center for Biotechnology Information Taxonomy (NCBI)

(2011), a classificação deste carrapato é:

Filo: Arthropoda (Von Siebold e Slannius, 1845)

Subfilo: Chelicerata (Heymons, 1901)

Classe: Arachnida (Lamarck, 1802)

Subclasse: Acari (Leach, 1817)

Superordem: Parasitiformes (Renter, 1909)

Ordem: Ixodida (Leach, 1815)

Subordem: Metastigmata (Canestrini, 1891)

Superfamília: Ixodoidea (Murray, 1870)

Subfamília: Rhipicephalinae

Gênero: Rhipicephalus (Koch, 1844)

Subgênero: Boophilus (Curtice, 1891)

Espécie: Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887).


26

Existem cerca de 870 espécies de carrapatos descritas no mundo, todas

agrupadas na subordem Ixodida (Metastigmata), que se divide em três famílias.

A família Ixodidae abrange os carrapatos popularmente conhecidos como

“carrapatos duros”, com 685 espécies descritas; a família Argasidae inclui os

“carrapatos moles”, com 185 espécies; e a família Nuttalliellidae, com características

morfológicas intermediárias entre as duas primeiras, é representada por uma única

espécie, Nuttalliella namaqua (BEDFORD, 1931).

3.1.2. Distribuição geográfica

A espécie R. (B.) microplus, que seria originária da Ásia, foi introduzida na

maioria dos países tropicais e subtropicais, seguindo a migração do gado zebuíno

(LEAL; FREITAS; VAZ JÚNIOR, 2003) e distribui-se geograficamente por locais de

clima quente e úmido, condições que favorecem o desenvolvimento do seu ciclo de

vida (HOOGSTRAAL; WASSEF, 1985). Na região Neotropical, com exceção do Chile,

essa espécie está distribuída desde o norte da Argentina até o México, incluindo as

ilhas do Caribe e Antilhas. As áreas de distribuição geográfica ainda incluem a região

sul e ocidental da África, Madagascar, Índia, China, Coréia, Bornéu, Sumatra,

Filipinas, Japão, Nova Guiné, Ilha de Guam e região norte da Austrália (PEREIRA et

al., 2008). Populações estabelecidas de R. (B.) microplus foram relatadas pela

primeira vez na Costa do Marfim, África Ocidental (MADDER et al., 2007).

No Brasil, o carrapato bovino encontra condições climáticas favoráveis ao seu

desenvolvimento em regiões que vão do extremo Sul em direção ao Norte e Nordeste,

possibilitando-lhe completar de 2,5 a 3 ou de 3 a 4, e potencialmente até 5 gerações

por ano em regiões que apresentem temperaturas médias acima de 17ºC (VIDOTTO,

2002). Apesar da influência negativa do inverno, a região Sul é a mais afetada pela

ocorrência de carrapato nos bovinos. Dois fatores parecem contribuir

significantemente para isso: a predominância de animais de origem européia e a

maior densidade populacional de bovinos (HORN, 1983).


27

3.1.3.Ciclo evolutivo

R. (B.) microplus é uma espécie de carrapato que utiliza um único hospedeiro

no seu ciclo evolutivo (monoxênico), que pode ser dividido em dois tempos, ou fases

complementares: fase parasitária e fase não parasitária.

A fase parasitária pode ser sumariamente delimitada como tendo início com a

fixação das larvas em hospedeiro suscetível e término quando os adultos, incluídas as

fêmeas fecundadas e ingurgitadas, caem desse hospedeiro.

A fase não parasitária, inicia com a fêmea fecundada e ingurgitada, depois que

ela se desprende do hospedeiro, caindo no chão para realizar a oviposição e termina

em uma de quatro alternativas: 1) produz ovos inférteis; 2) quando a fêmea morre

sem realizar a oviposição; 3) quando as larvas oriundas de ovos dessa fêmea

ganham acesso ao hospedeiro suscetível 4) ou suas larvas morrem sem alcançar

hospedeiro adequado.

Assim, o início e o término do ciclo realizam-se quase sempre no pasto, onde

geralmente se integram o parasito, o hospedeiro e o ambiente comum a ambos

(PEREIRA et al., 2008).

O ciclo evolutivo inicia com a cópula. O macho é pequeno, e se coloca sob a

fêmea partenógina que está fixada na pele do bovino. Este utiliza o hipóstomo (rostro)

e introduz um espermatóforo no orifício genital. A fêmea adulta, uma vez fecundada,

se desprende do bovino e cai no pasto, onde inicia a postura no terceiro dia, com

duração de aproximadamente 12 dias. Em condições adversas, como baixa

temperatura, a teleógina, embora não faça a postura, não morre, aguardando

condições favoráveis para reiniciar o processo. Dessa forma, o período de postura

pode se prolongar de vários dias, até meses, dependendo das condições climáticas

(GONZALES, 1975).

Cada fêmea põe de 2000 a 3000 ovos, de acordo com o tamanho de seu corpo

ingurgitado. A incubação dos ovos demanda calor e umidade. No verão, sob

condições ambientais normais, a incubação dura cerca de 30 dias e no inverno, até

83 dias. A larva recém - nascida necessita de três a quatro dias para que se formem

os órgãos bucais e, a seguir, procura se fixar no couro dos bovinos. Normalmente são

muito vivazes, e estimuladas pelo calor úmido (verão e sereno), sobem rapidamente


28

nas folhas e hastes do pasto, aguardando a passagem de um hospedeiro. Fixam-se

de preferência, onde a pele é mais fina: axilas, entre as pernas, região genital, sob a

cauda, na bolsa escrotal e outras partes. As ninfas aparecem mediante mudança de

pele que se processa depois de 10 a 12 dias da fixação da larva no hospedeiro. As

larvas e ninfas possuem três e quatro respectivamente e ainda são assexuadas. Após

o décimo quinto dia da infestação, aparecem as metaninfas, que produzirão

indivíduos sexuados, machos e fêmeas. Os machos são pequenos, possuem o corpo

oval quase inteiramente coberto pelo escudo dorsal e um pequeno apêndice caudal.

As fêmeas quando jovens não diferem dos machos. Quando adultas vão tomando

uma cor amarela-palha ou verde oliva e, crescem rapidamente alcançando 1 cm de

comprimento (PEREIRA et al., 2008).

Enquanto a fase parasitária evolui sem interferências climáticas, sendo

praticamente a mesma nas diversas regiões e países, a fase de vida livre é sensível a

estas, havendo alterações nos seus períodos, afetados especialmente pela

temperatura e umidade relativa do ar. Temperaturas menores que 5ºC não permitem

que se realize a oviposição e, umidade relativa do ar menor que 70% impossibilitam a

eclosão dos ovos (GONZALES, 1975). As diversas pesquisas feitas sobre a fase de

vida livre desse parasito mostram uma grande variabilidade entre os períodos de pré-

postura, postura, eclosão, neolarva e longevidade das larvas infestantes, sendo que

essa variabilidade acontece em decorrência das condições climáticas locais, incluindo

macro e microclimas (SOUZA, 1985).

A compreensão do ecossistema do carrapato é fundamental para que se

estabeleçam medidas efetivas de controle, que visem evitar a superpopulação desses

parasitos. Para Gonzales (1975), a resistência nada mais é do que a manifestação do

desequilíbrio ecológico. A situação crítica é notada de um momento para o outro, mas

o processo do desequilíbrio ecológico é bem anterior e passou despercebido. Um dos

fatores que contribuiu para esse quadro foi a concentração dos animais em áreas

cada vez menores, pela pressão de se produzir mais alimentos. Quando as áreas de

criação concentravam um menor número de animais, a maioria das larvas não

encontrava o hospedeiro e, consequentemente morriam por falta de alimento, ao

contrário do que se observa hoje, onde as larvas não sucumbem, pois há hospedeiros

por toda a parte.


29

3.1.4. Mecanismo de sobrevivência dos carrapatos ao clima árido e semiárido

Segundo Londt (1975), o sucesso do desenvolvimento embrionário é

indiretamente dependente das condições prevalentes de umidade relativa e

diretamente dependente do conteúdo de água dos ovos por ocasião da postura.

Quando esses ovos perdem mais de 35% de sua massa inicial por meio da

evaporação, o metabolismo nitrogenado, indicado pela produção de guanina, é

seriamente afetado, acarretando a morte do embrião. O autor observou que a

produção de guanina diminuiu ou cessou completamente quando os ovos foram

submetidos à umidade relativa inferior a 70-80%.

Ao contrário das larvas (LONDT; WHITEHEAD, 1972) ou dos adultos (SAUER;

HAIR, 1971), os ovos não absorvem água mesmo quando submetidos à umidade

relativa de 95% (RECHAV; MALTZAHN, 1977). Segundo estes últimos autores, a

existência de carrapatos em regiões áridas ou semiáridas depende da capacidade

dos ovos desses carrapatos reterem água em quantidade suficiente para que se

estabeleça o desenvolvimento embrionário. Afirmam que a umidade relativa crítica

para cada espécie de carrapato é provavelmente uma função da qualidade da

camada de cera que envolve os ovos, isto é, características endógenas do carrapato

que impedem ou diminuem a taxa de perda de água dos ovos.

Lees e Beament (1948), ao estudarem a função do órgão de Gene e da cera

protetora produzida por ele, concluem que essa cera é responsável pela

impermeabilidade conferida à cutícula ou casca do ovo. Quando os ovos são

submetidos a determinadas temperaturas críticas, a cera sofre reorganização

molecular, permitindo evaporação mais rápida da água. Segundo Legg (1930), se os

ovos forem submetidos a fortes correntes líquidas, a proteção impermeabilizante pode

ser retirada, com conseqüente absorção de água. Durante o desenvolvimento

embrionário, o aparelho excretor, representado pelo saco renal e os túbulos de

Malpighi, fica repleto de resíduos provenientes do crescimento embrionário, que

consiste principalmente de cristais de ácido úrico, os quais são expelidos após a

emergência larval sob a forma de pequenas gotas esbranquiçadas.

A resistência dos ovos à perda de água talvez dependa da sua capacidade de

impedir a evaporação através da superfície, ficando ressaltada a importância, no


30

desenvolvimento embrionário, das condições microclimáticas e do efeito da camada

protetora de cera que os envolve (LONDT, 1975).

3.1.5. Prejuízos atribuídos ao carrapato

Os carrapatos são ectoparasitos importantes para a Saúde Pública e sanidade

animal por transmitirem agentes infecciosos e causarem injúrias a seus hospedeiros

durante a hematofagia (PEREIRA et al., 2008). Entre essas injúrias, destaca-se a

espoliação sanguínea, com reflexos diretos nos animais relacionadas ao ganho de

peso e produção leiteira, que variam de acordo com a carga parasitária Pode ocorrer,

também, a inoculação de toxinas na corrente circulatória do hospedeiro, que

interferem na síntese protéica, resultando numa desproporção proteína-gordura, com

prevalência desta última. A transmissão de agentes infecciosos como bactérias do

gênero Anaplasma e protozoários do gênero Babesia, são responsáveis pela doença

comumente chamada de Tristeza Parasitária Bovina. Essa doença se manifesta

clinicamente por febre, anemia, hemoglobinúria, icterícia, anorexia, emagrecimento, e,

nos casos de bovinos sensíveis, até a mortalidade (KESSLER; SCHENK, 1998).

Ao realizar uma pesquisa no Brasil, Horn (1983), com base em informações

colhidas junto às Secretarias de Agricultura dos Estados, estimou que os prejuízos

causados pelo carrapato R. (B.) microplus aos bovinos, considerando aspectos

relacionados à mortalidade (1,2%), diminuição do ganho de peso (6kg /animal/ ano),

efeitos sobre o couro, gastos com carrapaticidas, diminuição na produção de leite (1,5

bilhão de litros), chegavam a US$ 968 milhões. Em função do crescimento do

rebanho bovino de 76 milhões de cabeças em 1983, para 204 milhões em 2004,

essas perdas facilmente ultrapassam os dois bilhões de dólares (PEREIRA et al.,

2008).

3.1.6. Resistência aos carrapaticidas

Com aproximadamente 400 milhões de anos, os artrópodes são organismos

bem mais antigos que o homem, genotipicamente estão totalmente evoluídos, sendo

considerados de grande longevidade (BORDIN, 1998). Sua aptidão e resistência


31

permitiram sua sobrevivência, encaixado-os devidamente no paradigma darwianiano

de mutação-evolução e, por conseguinte, com adaptação à sobrevivência do mais

forte. Segundo esse autor, apesar das inúmeras pesquisas relacionadas à biologia,

ecologia e epidemiologia do carrapato, e ao diversificado arsenal da indústria químico-

farmacêutica, ainda é muito difícil manter esse parasitismo compatível com a

produção de medicamentos. Essa situação deve-se provavelmente à mutabilidade

potencial do parasito, ao grau variável de desafio relacionado com a variabilidade

epidemiológica entre períodos favoráveis e adversos, habilidade bioquímica da

espécie, inadequação de algumas práticas terapêuticas, dosagens errôneas e outros

fatores.

Outro mecanismo de resistência é a propagação do alelo resistente, por

pressão de seleção, isto acontece quando a resistência está instalada em uma

população de carrapatos até mesmo antes de entrarem em contato com determinado

produto. Isso ocorre porque já existiam, na população, alguns indivíduos naturalmente

resistentes. A predominância do alelo resistente ou aparecimento da resistência é o

momento em que a maior parte da população descende de carrapatos resistentes,

carregando, em maior ou menor porcentagem, os genes responsáveis pela alteração

de comportamento, capaz de fazê-los sobreviver ao veneno (FURLONG; MARTINS,

2000). Os mesmos autores relatam que os principais mecanismos utilizados pelos

carrapatos resistentes para sobreviver aos acaricidas são: a redução da taxa de

penetração do produto, alterando o tegumento externo; as mudanças no metabolismo,

armazenamento e excreção do produto químico e, mudanças no local de ação do

produto.

A eficiência dos carrapaticidas, em sua grande maioria, também deixa a

desejar, permitindo que os carrapatos em contato com eles sobrevivam e dessa forma

ativem seu sistema enzimático de defesa, transmitindo às gerações seguintes todos

os caracteres de resistência adquiridos (GONZALES, 1975).

Em 1930, foram identificados os primeiros casos de resistência ao carrapato

Boophilus microplus. Desde então, diversos princípios ativos carrapaticidas têm sido

testados e utilizados comercialmente, tendo sido observado um aumento da

resistência a esses produtos (OLIVEIRA et al., 2002).


32

3.1.7. Plantas com atividade carrapaticida

O metabolismo secundário das plantas possui grande diversidade de

compostos com ação pesticida que podem ser explorados através dos extratos

vegetais. Os biopesticidas normalmente apresentam baixo custo, podem diminuir o

impacto ambiental e são de pequena toxicidade ao homem e a organismo não alvo

(MOREIRA et al., 2007; BAGAVAN et al., 2009). O metabolismo secundário de

plantas pode variar consideravelmente dependendo de vários fatores, como:

sazonalidade, índice pluviométrico, radiação UV, composição atmosférica (CO2, SO2,

NO2 e O2), herbivoria e ataque de patógenos, temperatura, ritmo circadiano, etc.

Estes fatores provocam variações fisiológicas no desenvolvimento dos órgãos,

alterações morfológicas nas flores e folhas e modificações nas estruturas secretoras

(SEPÚLVEDA-JIMENEZ et al., 2003; FIGUEIREDO et al., 2008). Métodos mais

apurados de pesquisa, de separação e quantificação de princípios ativos estão

conseguindo encontrar e medir com sucesso essas substâncias presentes em plantas

(Taylor et al., 2001). As espécies botânicas mais usadas como plantas pesticidas

pertencem às famílias Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Lamiaceae e

Canellaceae (JACOBSON, 1989). Atualmente, com relação à atividade carrapaticida,

várias espécies estão sendo pesquisadas, tais como: Azadirachta indica (MARTINEZ,

2002); Cymbopogon nardu (OLIVO et al., 2008), Lavandura angustifoli (PIRALI-

KHEIRABADI; SILVA, 2010), Tetradernia riparia (GAZIM et al., 2011), Nicotiana

tabacum (RODRIGUEZ; RODRIGUEZ; CRUZ, 2010) entre outras. Assim estas

plantas poderão ser utilizadas posteriormente em programas de controle, na tentativa

de reduzir a utilização de carrapaticidas organossintéticos. A toxicidade de uma planta

contra artrópodes não a qualifica necessariamente como um pesticida. Vários

aspectos devem ser levados em consideração, tais como: forma de extração, eficácia

em baixas concentrações, ausência de toxicidade para mamíferos e animais

superiores, (VIEGAS JUNIOR, 2003).


33

3.2. Bioma Caatinga

A província das caatingas no nordeste do Brasil estende-se de 2 54’ a 17 21’ S

(estimada em cerca de 800.000 km2) e inclui os estados do Ceará, Rio Grande do

Norte, a maior parte da Paraíba e Pernambuco, sudeste do Piauí, oeste de Alagoas e

Sergipe, região norte e central da Bahia e uma faixa estendendo-se em Minas Gerais

seguindo o Rio São Francisco, juntamente com um enclave no vale seco da região

média do Rio Jequitinhonha (ANDRADE-LIMA, 1981). O nome “Caatinga” é de origem

Tupi-Guarani e significa “floresta branca”, que certamente caracteriza bem o aspecto

da vegetação na estação seca, quando as folhas caem e apenas os troncos brancos

e brilhosos das árvores e arbustos permanecem na paisagem seca (ALBUQUERQUE;

BANDEIRA, 1995).

O estudo e a conservação da diversidade biológica da Caatinga é um dos

maiores desafios da ciência brasileira. Há vários motivos para isto: A Caatinga é a

única grande região natural brasileira cujos limites estão inteiramente restritos ao

território nacional; e proporcionalmente menos estudada entre as demais regiões

naturais brasileiras, com grande parte do esforço cientifico estando concentrado em

alguns poucos pontos em torno das principais cidades da região. É a região natural

brasileira menos protegida, pois as Unidades de Conservação cobrem menos de 2%

do seu território; continua passando por um extenso processo de alteração e

deterioração ambiental provocado pelo uso insustentável dos seus recursos naturais,

o que está levando a rápida perda de espécies vegetais únicas, à eliminação de

processos ecológicos chaves e a formação de extensos núcleos de desertificação em

vários setores da região (LEAL; TABARELLI; SILVA, 2003).

Segundo Taberelli et al. (2000), 41,1% da caatinga ainda não foi amostrada e

80% da áreas está sub-amostrada, sendo as áreas menos perturbadas aquelas com

menores esforços de coleta. Mesmo assim, atualmente são conhecidas 932 espécies

de plantas (380 endêmicas); 148 espécies de mamíferos (10 endêmicas); 348

espécies de aves (15 espécies e 45 subespécies endêmicas) e entre os anfíbios e

repteis, 15% também são endêmicos.

Várias espécies de plantas da caatinga são amplamente conhecidas e

utilizadas tanto na medicina popular como para exploração comercial, entre elas: A.


34

cearensis, M. nigra, N. variegata e S. convoluta. Apesar da sua grande diversidade

cultural e biológica, poucos estudos etnobotânicos e farmacológicos são realizados no

bioma caatinga (ALBUQUERQUE et al., 2007).

3.2.1. Amburana cearensis

Amburana cearensis (Fabaceae), conhecida popularmente por “cumaru” ou

“imburana-de-cheiro”, é uma árvore de importância econômica, típica do sertão

nordestino, onde é amplamente empregada em carpintaria, perfumaria e para fins

farmacêuticos (MAIA, 2004). A casca do caule, indicada para o tratamento de

afecções respiratórias, é largamente utilizada na medicina popular no preparo de uma

formulação caseira, chamada de “lambedor”, e também na produção industrial do

fitoterápico “xarope de cumaru” (LEAL et al., 1997).

A eficácia do uso popular de A. cearensis é comprovada por estudos

farmacológicos a partir do extrato hidroalcoólico da casca do caule e de alguns dos

seus constituintes químicos, os quais demonstraram atividade analgésica,

broncodilatadora e anti-inflamatória (LEAL et al., 2003). Quimicamente, a casca do

caule é basicamente constituída de cumarina, responsável pelo seu odor peculiar, dos

flavonoides isocampferídeo, campferol e afromosina, pelos glicosídeos fenólicos

amburosideos, dos ácidos fenólicos, ácido vanílico e acido protocateuico, alem de

quantidades abundantes de sacarose (BRAVO et al., 1999). Estudos revelaram que a

cumarina, o isocamferideo e o amburosídeo A possuem efeitos anti-inflamatório,

antioxidante e broncodilatador, sendo indicados como princípios ativos da planta. Os

glicosídeos fenólicos, amburosídeo A e B, com moderada atividade biológica,

mostraram atividade antimalárica, antiprotozoária, antifúngica e antibacteriana in vitro

(LEAL et al., 2003). Estudos realizados com o extrato etanólico das cascas de A.

cearensis, sugerem ação nociceptiva (OLIVEIRA et al., 2009). Entretanto, a crescente

demanda na exploração econômica da A. cearensis, causada pelo seu uso madereiro

e medicinal, tem provocado uma séria ameaça a sua sobrevivência, já que segundo a

União Internacional para a Conservação da Natureza dos Recursos Naturais – IUCN,

esta espécie sofre risco de extinção (Ministério da saúde).


35

Figura 1 – Amburana cearensis.

Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/amburana-cearensis.html.

3.2.2. Morus nigra

Morus nigra L., Moraceae, conhecida popularmente como “amoreira” é uma

espécie vegetal que tem sua origem na Ásia, frutificando com maior intensidade e

abundância, sobretudo na Ásia Menor e estando plenamente aclimatizada no Brasil

(CRUZ, 1979). O gênero Morus é constituído de aproximadamente 24 espécies, uma

subespécie, sendo descrito pelo menos 100 variedades (MACHII et al., 2000; TUTIN

et al., 1996).

Diferentes grupos de compostos químicos têm sido investigados no gênero

Morus, tais como alcalóides, cumarinas, flavonoides, triterpenos e esteroides

(TOSHIO et al., 2005). Na medicina chinesa, as plantas do gênero Morus são usadas

como antiinflamatório, diurético, antitussígeno, analgésico e antipirético (NOMURA,

1998; JIANG, 1977). As raízes são utilizadas no tratamento de hipertensão arterial,

reumatismo, problemas oculares e espasmos infantis. Almeida et al. (2011),

realizaram um estudo sobre o potencial hipoglicêmico das folhas M. nigra, e

observaram que o extrato não produziu o efeito hipoglicemiante esperado. O fruto da

amora é utilizado para doenças hepáticas e renais e suas folhas utilizadas para o

tratamento de febre, dor de cabeça, beribéri, vômitos e dor estomacal causada pelo

agente da cólera. Os ramos jovens da árvore são usados para o tratamento de

hipertesão e paralisia de braços e pernas (JIANG, 1977). Oliveira et al. (2013),

realizaram um estudo para observar a toxicidade do chá das folhas de M. nigra,


36

concluindo que nas condições do estudo, o chá pode ser considerado de baixa

toxicidade, pois não produziu efeitos tóxicos nos animais tratados.

Na região do Vale do São Francisco-Brasil, essa espécie é conhecida

popularmente como “amora-miúra”. O chá das folhas (decocto) é bastante utilizado

pela população local para o tratamento de diabetes, dislipdemia, problemas

cardiovasculares, obesidade e gota. A planta foi trazida para a região por imigrantes

japoneses, adaptando-se bem às condições de clima e solo (OLIVEIRA et al., 2013).

Figura 2 – Morus nigra

Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/morus-nigra.html.

3.2.3. Neoglaziovia variegata

A espécie Neoglaziovia variegata Mez. é uma Bromeliaceae endêmica do

Brasil, conhecida popularmente como “caroá”, amplamente distribuída na região da

caatinga por todo o semiárido do nordeste brasileiro (RIBEIRO, 2007), e parte da

região Sudeste (Minas Gerais) (FORZZA et al., 2011). Pode ser encontrada no interior

de matas mais fechadas até as áreas mais abertas, em solos compactos e pouco

profundos. Esta planta possui folhas longas que medem de 100 a 200 cm, com

espinhos nos bordos curvados para o ápice da folha, nervuras paralelinérveas, face

adaxial esparsamente prurinosa-lepidota, face abaxial glabra, verde com manchas

irregulares cinza; inflorescência de 18 a 30 cm, racemosa, ereta, multiflora e flores

pedicelada 1 cm, com pétalas avermelhadas e anteras amarelas.


37

O caroá apresenta potencialidades econômicas centradas nas folhas, as quais

se constituem de fibras de alta resistência. Na década de 40, o extrativismo do caroá

alcançou níveis mais significativos (PEREIRA; QUIRINO, 2008). Nessa época a

espécie foi bastante importante para a economia nordestina, porém, sua exploração

foi abandonada com o surgimento das fibras sintéticas (RIBEIRO, 2007). Atualmente,

as fibras do caroá voltaram a ser uma das principais fontes de emprego e renda para

diversas famílias nordestinas, com a fabricação artesanal de chapéus, bolsas, entre

outros produtos.

Vários estudos têm demonstrado que N. variegata têm propriedades biológicas

tais como gastroprotetora (MACHADO et al., 2013), fotoprotetora (OLIVEIRA-JÚNIOR

et al., 2013), antibacteriana (OLIVEIRA-JÚNIOR et al., 2012), anti-nociceptiva (LIMA-

SARAIVA et al., 2012a) e antioxidante (LIMA-SARAIVA et al. 2012b).

Figura 3 – Neoglaziovia variegata.

Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/neoglaziovia-variegata.html.

3.2.4. Selaginella convoluta

A família Selaginellaceae possui um único gênero, Selaginella, o qual possui

aproximadamente de 700 a 750 espécies. O gênero é amplamente distribuído na

América, África e Europa (JUDD et al., 1999; TRYON; TRYON, 1982). Os membros

da família Selaginellaceae são principalmente terrestres, plantas herbáceas e perenes


38

e variam muito em tamanho, algumas pequenas espécies têm hastes de

aproximadamente 3 cm de comprimento, enquanto as espécies maiores têm hastes

50 cm a cerca de 1 m de comprimento, mas com menos de 2 cm de altura (JUDD et

al., 1999; TRYON; TRYON, 1982).

Na região Nordeste do país, principalmente na região semiárida, há a

predominância da espécie S. convoluta, conhecida popularmente como “jericó”, “mão-

fechada”, “mão-de-sapo”, sendo utilizada como planta medicinal para o tratamento de

diversas enfermidades, tais como antidepressivo (GIORGETTI; NEGRI; RODRIGUES,

2007; SANTOS et al., 1994), afrodisíaco, diurético, distúrbios da amenorréia (AGRA et

al., 2007), analgésico e anti-inflamatório (ALMEIDA et al., 2005).

Frequentemente, os espécimes de S. convoluta apresentam-se como ripícolas

e crescem sobre uma fina camada de húmus nas encostas dos morros graníticos e

paredões rochosos, mas podem ser também terrestres, ocupando barrancos.

Preferencialmente, ocorrem em locais secos e expostos ao sol (HIRAI; PRADO,

2000).

Estudos realizados recentemente com várias espécies de Selaginella,

revelaram que o gênero é rico em esteroides, biflanoides, alcalóides e lignanas (SÁ et

al., 2012).

Figura 4 – Selaginella convoluta.

Fonte: http://www.neplame.univasf.edu.br/ selaginella-convoluta.html.


39

Tendo em vista a ampla distribuição dessas espécies no bioma caatinga e os

poucos estudos químicos e da atividade biológica, esse trabalho apresenta pela

primeira vez, os resultados da avaliação da atividade carrapaticida de Amburana

cearensis, Morus nigra, Neoglaziovia variegata e Selaginella convoluta. Assim,

pretendemos fornecer informações a respeito das propriedades carrapaticidas dessas

espécies, visando á realização de novos estudos nas áreas de química e

farmacologia, bem como contribuir para a conservação e manejo sustentável das

mesmas na região do semiárido.


40

4. MATERIAIS E MÉTODOS


41

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Material vegetal


As cascas do tronco de A. cearensis foram coletadas no município de Petrolina.

Uma exsicata da planta (5545) está depositada no Herbário Vale do São Francisco

(HVASF) da Universidade Federal do Vale do São Francisco.

4.1.2. Morus nigra

As folhas de M. nigra L. foram coletadas na Fazenda Ouro Verde, município de

Casa Nova-BA, em agosto de 2011. Uma exsicata da planta (1764) está depositada

no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do Vale do São

Francisco.


As folhas e partes aéreas de N. variegata foram coletadas no município de

Petrolina, Estado de Pernambuco em janeiro de 2010. Uma exsicata da planta está

depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do

Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código 6441.


As folhas de S. convoluta foram coletadas em agosto de 2009 no Campus de

Ciências Agrárias da Universidade Federal do Vale do São Francisco, localizado na

zona rural de Petrolina - PE. Uma exsicata da planta (6440) foi depositada no herbário

Vale do São Francisco (HVASF) da Universidade Federal do Vale do São Francisco.


42

Todos os materiais botânicos foram identificados pelo biólogo André Paviotti

Fontana do Centro de Referência para Recuperação de Áreas Degradas da Caatinga

(CRAD)

4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) e das frações das espécies

selecionadas

O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração fracionada

com etanol a 95%. Foram realizadas quatro extrações com intervalos de 72 horas

entre cada extração. A solução foi filtrada e concentrada em evaporador rotatório.

Após evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico bruto das

plantas estudadas, a partir de:

- 714 g do pó seco das folhas de M. nigra foram obtidos 69 g do extrato

etanólico bruto (9,67% de rendimento em relação ao peso seco da planta).

- 1.174 g do pó seco das folhas de N. variegata foram obtidos 45 g do extrato

etanólico bruto (3,83% de rendimento em relação ao peso seco da planta).

- 361 g do pó seco das folhas de S. convoluta foram obtidos 27 g do extrato

etanólico bruto (7,48% de rendimento em relação ao peso seco da planta)

Parte do EEB das espécies selecionadas foram reservadas para os testes

posteriores e outra parte foi submetida à partição por solventes orgânicos (hexano,

clorofórmio e acetato de etila) em ordem crescente de polaridade.

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos

Os extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com

suporte de alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de


43

solventes, conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar os

principais grupos de metabólitos secundários (Tabela 1).

Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar as principais

classes de metabólitos secundários das 4 espécies da caatinga por cromatografia em

camada delgada (WAGNER; BLADT, 1996).

Classe química Sistema eluente Padrão Revelador

Alcalóides gerais Tolueno:acetato de etila:dietilamina (70:20:10)

Yoimbina Quinina Dragendorff

Flavanóides

Acetato de etila:ácido fórmico:ácido acético glacial:água (100:11:11:26)

Rutina Quercetina

NEU

Cumarinas Tolueno:éter etílico (1:1 saturado com ácido acético 10%)

Escopoletina KOH etanólico 10%

Derivados antracênicos

Acetato de etila:metanol:água (100:13,5:10)

Aloína KOH etanólico 10%

Lignanas Clorofórmio:metanol:água (70:30:4)

Estrato de linhaça Vanilina fosfórica

Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico (99:1)

Biflorina Lapachol KOH etanólico 10%

Saponinas Clorofórmio:ácido acético:metanol:água (64:32:12:8)

Saponina Anisaldeído sulfúrico

Taninos condensados

Acetato de etila:ácido acético glacial:ácido fórmico:água (100:11:11:26)

Catequina Epicatequina Vanilina clorídrica

Taninos hidrolisáveis

n-Butanol:acetona:tampão fosfato (40:50:10)

Ácido gálico Ácido tânico

Sulfato de ferro amoniacal( 1%)

Triterpenos e esteroides

Tolueno:clorofórmio:etanol (40:40:10)

Lupeol Sitosterol

Lieberman-Burchard


44

4.4. Análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A análise do perfil de compostos foi realizada em CLAE, modelo Lachrom Elite,

coluna de fase reversa LiCospher RP18 (5mm) com dimensões (150 mm x 4 mm)

Merck, equipado com detector de arranjo de diodo (DAD). A fase móvel utilizada foi

uma solução de H20/H3PO4 0,1% (A) e MeOH (B), inicialmente 75% de A e 25% de B,

por 25 minutos. A temperatura da coluna foi mantida constante em 30ºC, com fluxo de

1,0 mL/ min. Para o extrato foi utilizado um volume de injeção de 20 µL. Os dados

espectrais foram registrados em 320-322 nm durante a corrida inteira. A análise em

CLAE-DAD foi realizada no Laboratório de Fitoquímica da Universidade Estadual de

Feira de Santana (UEFS), Bahia.

4.5. Colônia de carrapatos

Foram coletadas fêmeas ingurgitadas (entre 4 e 8 mm) de vida parasitária, em

bovinos naturalmente infestados por R. (B.) microplus isentos de carrapaticida

químico, acondicionadas em recipiente plástico fechado, e levados ao laboratório de

parasitologia da UNIVASF em caixa térmica com gelo, para diminuir a mobilidade e

evitar a oviposição prematura das fêmeas (BROGLIO-MICHELLETI et al., 2009).

Para a criação dos R. (B). microplus foram utilizados dois bovinos (Bos taurus),

adultos, pesando entre 200-250 Kg, provenientes do Centro de Ciências Agrárias da

UNIVASF, que foram mantidos em baias individuais com alimentação e água ad

libitum. Aproximadamente 200 larvas foram infestadas na região dorsal dos animais,

para a realização do seu ciclo de vida. Após 21 dias, foram obtidas teleóginas, que

foram coletadas, acondicionadas e levadas ao laboratório de Parasitologia, e

incubadas em estufa B.O.D, a temperatura de aproximadamente 27ºC e umidade

relativa maior que 90%. Após a postura dos ovos e eclosão dos mesmos, o

procedimento foi repetido, para obtenção de mais carrapatos com o objetivo de serem

testados com os extratos das plantas, nos testes de imersão de fêmeas ingurgitadas,

também conhecido como biocarrapaticidograma.


45

4.6. Teste de imersão de fêmeas ingurgitadas

Os carrapatos coletados e levados ao laboratório de Parasitologia da UNIVASF

foram submetidos ao teste de imersão, segundo Drummond et al. (1973), ao chegar

no laboratório, os mesmo foram lavados em água corrente, secos em papel

absorvente e selecionados por tamanho em grupos de tratamentos homogêneos

quanto a aparência, motilidade, integridade física e ingurgitamento (ARANTES, 1995).

Foram divididos em grupos de 10 teleóginas por tratamento, sendo os testes

realizados em triplicatas.

Os grupos foram pesados em balança analítica e submetidos ao banho de

imersão por cinco minutos em soluções de 20 mL dos extratos diluídos em

percentuais de 0,5%, 1,0% e 2,5%. No grupo controle, o líquido de imersão utilizado

foi água destilada e, quando necessário, realizou-se o controle com o surfactante

Cremophor. Após a imersão, foram secos e transferidos para placas de petri

devidamente identificadas e mantidas em estufa B.O.D, a temperatura de

aproximadamente 27ºC e umidade relativa maior que 90%. Ao fim da oviposição, as

posturas foram removidas, pesadas em balança analítica e transferidas para tubos de

ensaio vedados com tampo de algodão hidrófilo e mantidos nas mesmas condições.

4.6.1. Parâmetros analisados

Os dados como peso das teleóginas (PT), peso dos ovos (PO) e percentual de

eclosão (%E), foram avaliados e posteriormente calculados a inibição da oviposição

(%IO), índice reprodução estimada (IRE) e a eficácia (EF) (DRUMMOND et al., 1973).

• Inibição de oviposição (%IO) = {(IO (controle) – IO (tratamento)/ IO (controle)) * 100};

• Índice de Reprodução Estimada (IRE) = (PO/ PT) * (%Ex 0,01) x 20000;

• Eficácia (EF) = {(EF (controle)-EF (tratamento)/EF (controle) * 100}.


46

4.7 Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism,

versão 5.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças

estatísticas significantes entre os grupos foram calculadas pela aplicação de uma

análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey e confirmado pelo teste t de

Student (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).


47

5. RESULTADOS


48

5. RESULTADOS

5.1 Triagem fitoquímica

5.1.1 Amburana cearensis

A análise preliminar da fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas de A.

cearensis (Ac-EEB) apresentou reação positiva para derivados antracênicos,

cumarinas, flavonoides, taninos, lignanas, monoterpenos e diterpenos, naftoquinonas,

triterpenos e esteroides e reação negativa para alcalóides.

Tabela 2 - Caracterização fitoquímica do extrato etanólico bruto das cascas de Amburana cearensis.

Grupo Metabólico EEB

Alcaloides -

Derivados Antracênicos +

Cumarina +

Flavonoides e Taninos +

Lignanas +

Mono e diterpenos +

Naftoquinonas +

Triterpenos e esteroides +

EEB (Extrato Etanólico Bruto); (-): não detectado; (+): presença.

5.1.2 Morus nigra

A triagem fitoquimica do extrato etanólico bruto das folhas de M. nigra (Mn-

EEB) apresentou reação positiva para alcaloides. Cumarinas, flavonoides, triterpenos

e esteroides foram positivos para todas as frações. Apenas na fração acetato (Mn-

AcOEt) está presente os derivados antracênicos. Em contrapartida apenas essa

fração, mostrou-se negativa para a presença de mono e diterpenos e naftoquinonas.

Lignanas foram identificadas nas frações etanólicas e acetato.


49

Tabela 3 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Morus nigra. Grupo Metabólico EEB Hexano CHCl3 AcOEt

Alcaloídes + - - -

Derivados Antracênicos - - - +++

Cumarina ++ + +++ ++

Flavonoides e taninos ++ ++ ++ +++

Lignanas + - - +++

Mono e diterpenos + +++ + -

Naftoquinonas + +++ + -

Triterpenos e esteroides ++ +++ +++ ++

EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila); (-): não detectado;

(+):pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.

5.1.3 Neoglaziovia variegata

5.1.3.1 Folhas

A análise preliminar demonstrou que todos os extratos foram positivos para a

presença de flavonoides e taninos. A exceção da fração clorofórmica (Nvf-CHCl3),

todas as frações deram reação positiva para a presença de derivados antracênicos,

monoterpeno, diterpenos, triterpenos e esteroides. Nvf-CHCl3 e fração acetato de N.

variegata (Nvf-AcOEt) foram positivos para a presença de cumarina e naftoquinonas.

Todos os extratos foram negativos para a presença de alcalóides e lignanas (Tabela

4).


50

Tabela 4 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Neoglaziovia variegata.

Grupo Metabólico EEB Hexano CHCl3 AcOEt

Alcaloide - - - -

Derivados Antracênico ++ ++ + -

Cumarina - - ++ ++

Flavonoide e tanino ++ ++ ++ ++

Lignana - - - -

Mono e diterpeno +++ +++ ++ -

Naftoquinona - - + +

Triterpeno e esteroide ++ ++ +++ -

EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila). (-): não detectado; (+):

pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.

5.1.3.2 Partes aéreas

A análise preliminar demonstrou que o extrato etanólico (Nvpa-EEB) e hexânico

(Nvpa-HEX), foram positivos para a presença de derivados antracênicos, flavonoide,

tanino, monoterpeno e diterpeno. O extrato hexânico também apresentou reação

positiva para triterpenos e esteroides. O extrato clorofórmico (Nvpa-CHCl3) foi positivo

para a presença de derivados antracênicos, cumarinas, flavonoides e taninos, mono e

diterpenos e naftoquinonas. O extrato de acetato de etila (Nvpa-AcOEt) foi positivo

para a presença de cumarinas, flavonoides e taninos, lignanas e naftoquinonas.

Todos os extratos foram negativos para a presença de alcalóides (Tabela 5).


51

Tabela 5 - Caracterização fitoquímica dos extratos das partes aéreas de Neoglaziovia variegata. Grupo Metabólico EtOH Hexano CHCl3 AcOEt Alcaloides - - - -

Derivados Antracênicos ++ ++ + -

Cumarina - - ++ ++

Flavonoides e Taninos ++ ++ ++ +++

Lignanas - - - ++

Mono e diterpenos + +++ ++ -

Naftoquinonas - - + +

Triterpenos e esteroides - ++ - -

EEB (Extrato Etanólico Bruto); CHCl3 (Clorofórmio); AcOEt (Acetato de etila). (-): não detectado; (+):

pouca presença; (++) presença moderada; (+++): forte presença.

5.1.4 Selaginella convoluta

Na triagem fitoquímica preliminar, o extrato etanólico bruto (Sc-EEB)

apresentou reação positiva para a presença de fenóis, taninos, flavonoides,

esteroides e terpenoides. Não foi constatada para o Sc-EEB presença de alcaloides

(Tabela 6).

Tabela 6 - Caracterização fitoquímica dos extratos das folhas de Selaginella convoluta.

Grupo Metabólico EEB Alcaloides -

Derivados Antracênicos -

Cumarina -

Flavonoides e Taninos +

Lignanas -

Mono e diterpenos -

Naftoquinonas -

Triterpenos e esteroides +

EEB (Extrato Etanólico Bruto). (-): não detectado; (+): presença.


52

5.2. Análise dos extratos em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a

detector de arranjo de diodo (CLAE-DAD)

5.2.1. Análise em CLAE do extrato etanólico de Amburana cearensis

O perfil cromatográfico em 322 nm para Ac-EEB é apresentado na Figura 5. O

cromatograma mostra a presença de quatro picos com tempos de retenção diferentes:

15,68 (1), 16,94 (2), 18,6 (3), 19,65 (4). Com base nos dados espectrais de UV-Vis e

nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV para

flavonoides.

Figura 5 – Cromatograma do extrato etanólico de Amburana cearensis obtido por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em 220 nm.


53

5.2.2. Análise em CLAE do extrato etanólico de Morus nigra

O perfil cromatográfico avaliado em 320 nm para o Mn- EEB é apresentado na

Figura 6. O cromatograma mostra a presença de quatro picos com tempo de retenção

entre 5 e 20 minutos. Com base nos dados espectrais de UV-Vis e nos tempos de

retenção, os compostos têm características de banda de UV para compostos

fenólicos, ácido cinâmico ou possivelmente derivados da flavanona.

Figura 6 – Cromatograma do extrato etanólico de Morus nigra obtido por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em 320 nm.

1

2 3 4


54

5.2.3. Análise em CLAE do extrato etanólico de Neoglaziovia variegata

O perfil cromatográfico avaliado em 322 nm para as folhas do extrato de N.

variegata (Nvf-EEB) é apresentado na Figura 7. O cromatograma mostra a presença

de oito picos com tempos de retenção diferentes: 9,6 (1), 10,89 (2), 11,80 (3), 14,44

(4), 15,16 (5), 15,58 (6), 16,69 (7) e 17,62 (8). Com base nos dados espectrais de UV-

Vis e nos tempos de retenção, os compostos têm características da banda de UV

para derivados do ácido cinâmico, cumarinas ou flavonoides.

Figura 7 – Cromatograma do extrato etanólico de obtido por Neoglaziovia variegata de obtido por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em 322 nm.

1

35

7

82

46

1

35

7

82

46


55

5.2.4. Análise em CLAE do extrato etanólico de Selaginella convoluta

O perfil cromatográfico e espectral do extrato etanólico de S. convoluta (Sc-

EEB), obtido pela técnica CLAE-DAD e registrado em 320 nm é mostrado na Figura 8.

O cromatograma mostra a presença de um único pico, com tempo de retenção de

19,41 minutos. O composto tem banda de UV característica de um flavonoide.

Figura 8 – Cromatograma do extrato etanólico de Selaginella convoluta obtido por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodo (CLAE- DAD) em 320 nm.


56

5.3. Teste de imersão


5.3.1.1. Inibição da oviposição (IO)

Através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas foi possível observar que o

extrato hexânico de A. cearensis (Ac-HEX) inibiu a oviposição das fêmeas em todas

as doses do extrato (5, 10 e 25 mg/mL), apresentando percentuais de inibição de

13,25%, 20,83% e 52,73%, quando comparado ao grupo controle (Figura 9). Nas

mesmas concentrações, o grupo tratado com o extrato clorofórmico de A. cearensis

(Ac-CHCl3) obteve percentual de inibição menores 5,26%, 24,10% e 28,08% . O

grupo tratado com extrato acetato de etila (Ac-AcOEt) obteve percentuais de 6,84%,

13,85% e 11,79%, enquanto o grupo tratado com Ac-EEB obteve 8,49%, 6,91% e

31,91%, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL. Não houve diferença significativa

em nenhuma das fases.

Figura 9 – Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a ovipostura do carrapato R.

(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de A.

cearensis B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de A. cearensis D) Extrato Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05. Anova one way.


57

5.3.1.2. Porcentagem de eclosão (%E)

A porcentagem de eclosão, foi o segundo parâmetro avaliado, o melhor

resultado para a A. cearensis foi Ac-HEX na concentração de 25 mg/mL,

apresentando 39% de eclosão, essa mesma fase a eclosão foi de 81,67% e 76,33%

nas concentrações de 5 e 10 mg/mL, respectivamente. Para Ac-CHCl3, observou-se

uma eclosão de 94,67%, 91,27% e 75,83% e Ac-AcOEt a eclosão em 83%, 82,83% e

58,67%. O extrato etanólico bruto apresentou inibição de 52% para a concentração

mais alta, 2,5% e 84,67% e 83,67% para as concentrações de 0,5% e 1%,

respectivamente. Não houve diferença estatística entre o controle 1 (água) que

apresentou 99% de eclosão e o controle 2 (água/ cremophor). Houve diferença

estatística entre todas as frações (2,5%) e o controle (Figura 10).

Figura 10 – Efeito do extrato das cascas de A. cearensis sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de A. cearensis B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de A. cearensis D) Extrato Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05 significativamente diferente do grupo controle. Anova one way.

Con

trole

Cre

mop

hor

Ac-EE

B 0,5 %

Ac- E

EB 1%

Ac-EE

B 2,5%

0

20

40

60

80

100

*

A. cearensis - EEB

A

Ecl

osã

o (%

)

Controle

Cre

mop

hor

Ac-Ac

OEt

0,5%

Ac- A

cOEt

1,0%

Ac-Ac

OEt

2,5%

0

20

40

60

80

100

*

A. cearensis - AcOEt

B

Ecl

osã

o (%

)

Con

trole

Cre

mop

hor

0,5%

3

Ac-CH

Cl 1,0%

3

Ac-CH

Cl 2,5%

3

Ac-

CHCl

0

20

40

60

80

100 *

A. cearensis - CHCl3

C

Ecl

osã

o (%

)

Contro

le

Crem

opho

r

Ac-HEX 0

,5%

Ac-HEX 1

,0%

Ac-HEX 2

,5%

0

20

40

60

80

100

*

A.cearensis - HEX

D

Ecl

osã

o (%

)


58

5.3.1.3. Índice de eficiência reprodutiva (IER)

A. cearensis foi capaz de inibir em todas as fases a reprodução estimada das

fêmeas ingurgitadas, sendo esse efeito mais evidente em Ac-HEX, apresentando

7664, 6594 e 3271, para as concentrações de 0,5, 1 e 2,5%, respectivamente. Ac-

CHCl3 nas mesmas concentrações, apresentou o menor efeito com 8864, 6838 e

6235. O grupo tratado com Ac-AcOEt não inibiu significativamente a reprodução

estimada, apresentando o melhor efeito para a concentração de 25 mg/mL com

inibição de 5621 e os grupos tratados com Ac-EEB apresentaram uma reprodução

estimada de 8021 para a concentração de 0,5% e 4910 para a concentração de 2,5%.

Os grupos controle 1 (água) com RE em 10050 e o grupo controle 2 (água e

cremophor) com RE de 10089 não apresentaram diferença estatística (Tabela 7).

Tabela 7 – Efeito do extrato das cascas de Amburana cearensis sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus.

FRAÇÃO

EXTRATO

REPRODUÇÃO ESTIMADA

5 7664 ± 1435 10 6594 ± 2231 HEXANO 25 3271 ± 3783

5 8864 ± 745,1 10 6838 ± 895,2 CLOROFÓRMIO 25 6235 ± 984

5 7999 ± 2310 10 7257 ± 1851

ACETATO DE ETILA

25 5621 ± 2074

5 8021 ± 2187 10 7753 ± 1555 ETANOL 25 4910 ± 2637

CONTROLE 1 10050 ± 139,1

CONTROLE 2 10089 ± 458,6

Controle 1(Apenas água); Controle 2 (Água+cremophor)


59

5.3.1.4 Eficácia (EF)

Através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas foi possível comprovar que

A. cearensis possui atividade carrapaticida. Ac-HEX, apresentou eficácia de 66,68%

para a concentração de 2,5%, sendo que para as concentrações de 0,5% e 1%, esses

resultados foram 22,67% e 66,68%, respectivamente (Figura 11). Para Ac-EEB foi

evidenciado uma redução gradual da eficácia, obtendo-se 20%, 21,78% e 52,03%

para as mesmas concentrações descritas acima. As menores eficiências foram

obtidas por Ac-AcOEt e Ac-CHCl3, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL,

apresentaram eficácia 20,21%, 27, 66% e 43,98% e 6,5%, 27,5% e 35,78%,

respectivamente. Houve diferença significativa entre Ac-AcOEt 0,5% e 2,5%.

Figura 11 – Eficácia do extrato das folhas de A. cearensis no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de A. cearensis B) Extrato Acetato de Etila de A. cearensis C) Extrato Clorofórmico de A. cearensis D) Extrato Hexânico de A. cearensis. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


60

5.3.2. Morus nigra


Para a inibição de postura o extrato clorfórmico de M. nigra (Mn-CHCl3) obteve

a melhor resposta na concentração de 25 mg/mL, apresentando inibição de 62,61%

quando comparado ao controle (Figura 12), em menores concentrações a inibição foi

de 4,2% e 6,65% para 5 e 10 mg/mL. Extrato hexânico de M.nigra (Mn-HEX), Mn-

AcOEt e Mn-EEB, não apresentaram efeito gradual com o aumento da concentração,

obtendo 12,10%, 10,24 % e 11,00% de inibição para Mn-HEX, 9,52%, 11,53% e

3,66% para Mn-AcOEt e 12,47%, 8,62% e 19,03% para Mn-EEB, nas concentrações

de 5, 10 e 25 mg/mL. Não houve diferença estatística em nenhuma das fases.

Figura 12 – Efeito do extrato de M. nigra sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M. nigra B) Extrato Acetato de Etila de M. nigra C) Extrato Clorofórmico de M. nigra D) Extrato Hexânico de M. nigra. Valores são média ± E.P.M (n=10). P< 0,05. Anova one way.


61


Para a eclosão dos ovos, o extrato de M. nigra não apresentou diferença

estatística em nenhuma das suas fases quando comparada ao controle. Ac-CHCl3

apresentou a maior inibição da eclosão dos ovos para esse extrato, obtendo 39,33%

de eclosão na concentração de 25 mg/mL, em menores concentrações (5 e 10

mg/mL) apresentou 91,17% e 81,17% de eclosão. Logo em seguida, Ac-HEX também

na concentração de 25 mg/mL, obteve 71,5% de eclosão, Ac-AcOEt e Ac-EEB a 2,5%

eclodiram 73,17% e 86,37% dos seus ovos respectivamente. Não houve diferença

estatística entre os extratos e os controles (Figura 13).

Figura 13 – Efeito do extrato das folhas de M.nigra sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M.nigra B) Extrato Acetato de Etila de M.nigra C) Extrato Clorofórmico de M.nigra D) Extrato Hexânico de M.nigra. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


62


O extrato de M. nigra apresentou efeito sobre a reprodução estimada das

fêmeas ingurgitadas, principalmente Mn-CHCl3, apresentando diminuição da

reprodução estimada em 3334 na concentração de 25 mg/mL, quando comparado ao

grupo controle que apresentou RE de 9457, para as concentrações de 5 e 10 mg/mL

alcançou RE de 6608 e 6069, respectivamente. Nas mesmas concentrações, Mn-

HEX apresentou 8268, 6608 e 6069, Mn-AcOEt 8012, 7130 e 7378 e Mn-EEB 7430,

8557 e 7479, respectivamente (Tabela 8).

Tabela 8 – Efeito do extrato das folhas de M. nigra sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus.

FRAÇÃO

EXTRATO


5 8268 ± 1662 10 6608 ± 2058 HEXANO 25 6069 ± 1633

5 8712 ± 571,4 10 6293 ± 1539 CLOROFÓRMIO 25 3334 ± 4130

5 8012 ± 815,4 10 7130 ± 906,5

ACETATO DE ETILA

25 7378 ± 2456

5 7430 ± 1553 10 8557 ± 719 ETANOL 25 7479 ± 1016

CONTROLE 1 9457 ± 817,7

CONTROLE 2 9273 ± 1402


5.3.2.4. Eficácia (EF)

A atividade carrapaticida do extrato de Morus nigra, foi mais evidente na fase

clorofórmica, alcançando 65,44% de eficácia na concentração de 25 mg/mL, em

menores concentrações (5 e 10 mg/mL) obteve 9,15% e 35,57%. O extrato hexânico

também apresentou carrapaticida quando comparado ao grupo controle, obtendo


63

20,55%, 37,09% e 42,10% para as concentrações de 5, 10, e 25 mg/mL. O extrato

etanólico bruto e acetato não apresentaram resposta gradual com o aumento da

concentração (5, 10 e 25 mg/mL) com 22,68%, 31,10% e 28,37% para Mn-AcOEt e

23,55%, 11,12% e 22,57 % para Mn-EEB.

Figura 14 – Eficácia do extrato das folhas de M. nigra no controle do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de M. nigra B) Extrato Acetato de Etila de M. nigra C) Extrato Clorofórmico de M. nigra D) Extrato Hexânico de M. nigra. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


64


5.3.3.1. Folhas

5.3.3.1.1. Inibição da oviposição (IO)

As folhas de N. variegata apresentaram forte inibição da ovipostura. Extrato

hexânico das folhas de N. variegata (Nvf-HEX) 2,5% apresentou inibição máxima de

94,14% quando comparado ao controle, em menores concentrações observou-se

inibição da ovipostura de 18,59% e 61,22% para as concentrações de 0,5% e 1%,

respectivamente. Houve diferença estatística entre Nvf-HEX 1% e 2,5% quando

comparados com Nvf-HEX 0,5%. Nvf-EEB também obteve forte inibição, apresentando

diferença estatística entre os extratos de 0,5 e 2,5%, com percentuais de 21,65%,

41,3% e 84,56% para as doses de 5, 10 e 25 mg/ml. Nv-CHCl3 e Nvf-AcOEt

apresentaram respectivamente, 13,04%, 31,04% e 33,22% e 18,8%, 22,52% e

28,56%, para as concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL (Figura 15).

Figura 15 – Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N. variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


65

5.3.3.1.2. Porcentagem de eclosão (%E)

Nvf-HEX apresentou a maior inibição da eclosão dos ovos para o extrato de N.

variegata, obtendo 0,33% de eclosão na concentração de 25 mg/mL e em menores

concentrações (5 e 10 mg/mL) apresentou 70,17% e 26,67%, houve diferença

estatística entre todas as concentrações de Nvf- HEX quando comparados ao

controle. Nvf-EEB também apresentou boa atividade contra a eclosão dos ovos de

R.B. microplus, obtendo 78,83%, 58,83% e 10% nas concentrações de 5, 10 e 25

mg/mL, respectivamente. Houve diferença estatística entre Nvf- EEB 1% e 2,5%

quando comparados ao controle. Nvf-CHCl3 e Nv-AcOEt obtiveram 66,50%, 50,00% e

45,67% e 68,67%, 72,33% e 74% de eclosão, respectivamente (Figura 16).

Figura 16 – Efeito do extrato das folhas de N.variegata sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N.variegata B) Extrato Acetato de Etila de N.variegata C) Extrato Clorofórmico de N.

variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


66

5.3.3.1.3. Indice de eficiência reprodutiva (IER)

O extrato de N. variegata apresentou efeito sobre a reprodução estimada das

fêmeas ingurgitadas, principalmente Nvf-HEX, apresentando diminuição da

reprodução estimada em 19,83 na concentração de 25 mg/mL, quando comparado ao

grupo controle que apresentou RE de 10236, para as concentrações de 5 e 10 mg/mL

alcançou RE de 6139 e 2135, respectivamente. Nas mesmas concentrações, Nv- EEB

apresentou 7023, 4749 e 768,5, Nvf-AcOEt 6335, 6552 e 6333 e Nvf-CHCl3 6157,4008

e 3933, respectivamente (Tabela 9).

Tabela 9 – Efeito do extrato das folhas de N. variegata sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus

FRAÇÃO

EXTRATO


5 6139 ± 975,6 10 2135 ± 1603 HEXANO 25 19,83 ± 34,35

5 6157 ± 2450 10 4008 ± 2190 CLOROFÓRMIO 25 3933 ± 4025

5 6335 ± 1909 10 6552 ± 3171

ACETATO DE ETILA 25 6333 ± 2103

5 7023 ± 903,1 10 4749 ± 2672 ETANOL 25 768,5 ± 193,6

CONTROLE 1 10236 ± 75488

CONTROLE 2 10116 ± 586,7


5.3.3.1.4. Eficácia (EF)

As folhas de N. variegata apresentaram o melhor efeito carrapaticida quando

comparados ao grupo controle. Nvf-HEX obteve 37,63%, 78,07% e 99,81% de eficácia

para as concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL. Nas mesmas concentrações, Nvf-EEB

obteve eficácia de 33,91%, 54,83% e 92,55%. Nvf-CHCl3 e Nvf-AcOEt obtiveram


67

eficácia de 38,42%, 61,07% e 61,80 % para o primeiro e 40,30%, 38,38% e 40,38%

para o segundo.

Figura 17 – Eficácia do extrato das folhas de N. variegata no controle do carrapato R. (B.)

microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N. variegata

B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.

5.3.3.2. Partes aéreas

5.3.3.2.1. Inibição da oviposição (IO)

As partes aéreas de N. variegata obteve o melhor resultado na fração

hexânica, com inibição de 20,76%, 26,50% e 46,57% nas concentrações de 5, 10 e

25 mg/mL. Nvpa-EEB apresentou 18,73%, 30,24% e 40,34% de inibição nas mesmas

concentrações. Nvpa-AcOEt e Nvpa-CHCl3 apresentaram fraca inibição da ovipostura,

obtendo-se 13,64%, 16,30% e 17,13% e 8,82%, 22,46% e 25,84%, respectivamente

(Figura 18).


68

Figura 18 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a ovipostura do carrapato R. (B.) microlus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N. variegata B) Extrato acetato de etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N.

variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05. Anova one way.

5.3.3.2.2. Porcentagem de eclosão (%E)

Nvpa-HEX apresentou os melhores resultados, para as concentrações de 5, 10

e 25 mg/mL foi possível observar 56,17%, 52,83% e 42,50% de eclosão, houve

diferença estatística entre Nvpa-HEX 2,5% e o controle. Nvpa-CHCl3 nas mesmas

concentrações, obteve 69,67%, 58,50% e 51,67% de eclosão. Os extratos etanólico

bruto e acetato obtiveram 84,33%, 65,57% e 57,17% de eclosão para o primeiro e

85,17, 74 e 70% de eclosão para o segundo. Existiu diferença estatística entre Nvpa-

EEB 1 e 2,5% e o controle (Figura 19).


69

Figura 19 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N. variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.

5.3.3.2.3. Índice de eficiência reprodutiva (IER)

As partes aéreas de N. variegata apresentou efeito sobre a reprodução

estimada das fêmeas ingurgitadas, principalmente Nvpa-HEX, apresentando

diminuição da reprodução estimada em 3604 na concentração de 25 mg/mL, quando


70

comparado ao grupo controle que apresentou RE de, para as concentrações de 5 e

10 mg/mL alcançou RE de 4829 e 4140, respectivamente. Nas mesmas

concentrações, Nvpa-EEB apresentou 7109, 5412e 4219, Nvpa-AcOEt 6963, 6162 e

6276 e Nv-CHCl3 6315, 5461 e 4656, respectivamente (Tabela 10).

Tabela 10 – Efeito do extrato das partes aéreas de N. variegata sobre a reprodução estimada do carrapato R. (B.) microplus.

FRAÇÃO

EXTRATO


5 4829 ± 1890 10 4140 ± 1942 HEXANO 25 3604 ± 1914

5 6315 ± 2249 10 5461 ± 3254 CLOROFÓRMIO 25 4656 ± 2955

5 6963 ± 1069 10 6162 ± 365,7


5 7109 ± 722,2 10 5412 ± 1593 ETANOL 25 4219 ± 1356

CONTROLE 1 5221 ± 1,61

CONTROLE 2 4855 ± 3,25


5.3.3.2.4. Eficácia (EF)

As partes aéreas de N.variegata apresentaram efeito carrapaticida quando

comparados ao grupo controle. Nvpa-HEX apresentou os melhores resultados, sendo

que, na concentração de 5, 10 e 25 mg/mL, obteve-se 49,88%, 56,37% e 61,92% de

eficácia. Nas mesmas concentrações, observou-se 30,76%, 38,04% e 57,25 % para

Nvpa-EEB. Nvpa-CHCl3 apresentou eficácia similar as outras fases, obtendo 34,84%,

42,15% e 50,66%. Com menor eficácia Nvpa-AcOEt, obteve 27,86%, 36,19% e

34,42% para as mesmas concentrações.


71

Figura 20 – Eficácia do extrato das partes aéreas de N. variegata no controle do carrapato R.

(B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de N.

variegata B) Extrato Acetato de Etila de N. variegata C) Extrato Clorofórmico de N. variegata

D) Extrato Hexânico de N. variegata. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.



Para a inibição de ovipostura, Sc-EEB apresentou os melhores resultados entre

as fases testadas, observou-se 27,91%, 29,68% e 37,13% para as concentrações de

5, 10 e 25 mg/mL. O extrato acetato de S. convoluta (Sc-AcOEt) 0,5% também

apresentou baixa inibição, chegando a 18,97% de inibição da postura das fêmeas

ingurgitadas, ao aumentar a concentração para 1% e 2,5%, observou-se o aumento

da inibição para 20,66% e 30,94%, respectivamente. Nas doses de 50, 100 e 250

mg/mL foi possível observar uma inibição de 10,41%, 10,69% e 25,35% para extrato

hexânico de S. convoluta (Sc-HEX) e 12,03%, 16,02% e 19,03% para extrato

clorofórmico de S. convoluta (Sc-CHCl3) (Figura 21).


72

Figura 21 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a ovipostura do carrapato R.

(B.) microplus nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de S.

convoluta B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de S. convoluta D) Extrato Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). *P< 0,05. Anova one way.


Sc-EEB apresentou o maior controle na eclosão dos ovos quando comparado

ao grupo controle, chegando a apresentar uma eclosão de 50,70% na concentração

de 25 mg/mL e 63,93% e 57,97% para as concentrações de 5 e 10 mg/mL, houve

diferença significativa entre todas as concentrações de Sc-EEB e o controle.

Observou-se eclosão de 88,9%, 83,17%, 75,93% para Sc-HEX nas doses de 5, 10 e

25 mg/mL. Sc-AcOEt e Sc-CHCl3 apresentaram variação na diminuição da eclosão


73

com o aumento da concentração, demonstrando 84,93%, 86,53% e 79,43% para Sc-

CHCl3 e 79,27%, 86,30% e 65,40 % para Sc-AcOEt (Figura 22)

Figura 22 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a eclosão dos ovos do carrapato R. (B.) microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de S. convoluta B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de S. convoluta D) Extrato Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


Para a reprodução estimada, Sc-EEB apresentou melhor atividade em todas as

concentrações, tendo como resultado 4933, 4409 e 4329 para as concentrações de 5,

10 e 25 mg/ml. Sc-HEX apresentou RE de 8211, 7914 e 6963 para as mesmas

concentrações descritas acima. Sc-CHCl3 e Sc- AcOEt não apresentaram resposta


74

dose-dependente, obtendo dessa forma 7685, 7774 e 7132 e 7144, 7482 e 5425,

respectivamente.

Tabela 11 – Efeito do extrato das folhas de S. convoluta sobre a reprodução estimada do

carrapato R. (B.) microplus.

FRAÇÃO

EXTRATO


5 8211 ± 651,3 10 7914 ± 493,8 HEXANO 25 6963 ± 2414

5 7685 ± 724,2 10 7774 ± 269,4 CLOROFÓRMIO 25 7132 ± 1082

5 7144 ± 544,8 10 7482 ± 1074


5 4933 ± 936,3 10 4409 ± 1269 ETANOL 25 4329 ± 1187

CONTROLE 1 9560 ± 699,8

CONTROLE 2 9634 ± 569,3

Controle 1 (Apenas água); Controle 2 (Água + cremophor)

5.3.4.4. Eficácia (EF)

O extrato etanólico bruto de S. convoluta, apresentou o melhor efeito

carrapaticida dentre as frações dessa planta, obtendo 49,04%, 53,72% e 54,66% de

eficácia para 5, 10 e 25 mg/ml do extrato. Nas mesmas concentrações, obteve-se um

efeito 14,35%, 17,55% e 26,64% para Sc-HEX. Sc-CHCl3 e Sc-AcOEt não

apresentaram aumento da resposta com o aumento da dosagem, obtendo 19,83%,

19,04% e 25,5% de eficácia para a primeira e 25,75%, 22,10% e 43,24% para a

segunda.


75

Figura 23 – Eficácia do extrato das folhas de S. convoluta no controle do carrapato R. (B.)

microplus, nas concentrações de 5, 10 e 25 mg/mL A) Extrato Etanólico Bruto de S. convoluta

B) Extrato Acetato de Etila de S. convoluta C) Extrato Clorofórmico de S. convoluta D) Extrato Hexânico de S. convoluta. Valores são média ± E.P.M (n=10). * P< 0,05. Anova one way.


76

5.3.5. Eficácia comparativa das plantas testadas

A eficácia das plantas testadas, frações e concentrações podem ser

visualizadas comparativamente na Tabela 12.

Tabela 12 – Eficácia comparativa entre as espécies A. cearensis, M. nigra, N. variegata, e S. convoluta. Extrato (mg/mL) A. cearensis

(cascas) M. nigra (folhas)

N. variegata (folhas)

N. variegata (partes aéreas)

S. convoluta (folhas)

Hexano

5 22,7 ± 14 20,5 ± 15,21 37,63 ± 11,84 49,88 ± 21,09 14,35 ± 11,41

10 34,7 ± 22 37,09 ± 16,84 78,07 ± 16,33 56,37 ± 22,09 17,55 ± 8,72

25 66,9 ± 38,6 42,10 ± 13,02 99,81 ± 0,32 61,92 ± 21,43 26,64 ± 28,92

Clorofórmio

5 6,5 ± 6,7 9,15 ± 14,96 38,42 ± 26,47 34,84 ± 24,07 19,83 ± 11,49

10 27,5 ± 12,5 35,57 ± 10,12 61,07 ± 20,35 42,15 ± 36,03 19,04 ± 7,03

25 35,8 ± 4,5 65,44 ± 41,86 61,80 ± 37,99 50,66 ± 32,43 25,5 ± 14,29

Acetato de etila

5 20,21 ± 23,86 22,68 ± 11,33 40,30 ± 18,33 27,86 ± 14,93 25,75 ± 5,99

10 27,66 ± 18,98 31,10 ± 12,34 38,38 ± 29,80 36,19 ± 7,62 22,10 ± 13,00

25 43,98 ± 20,85 28,37 ± 27,05 40,38 ± 19,89 34,42 ± 29,28 43,24 ± 14,13

Etanol

5 20 ± 22,58, 23,55 ± 7,87 33,91 ± 8,040 30,76 ± 9,10 49,04 ± 6,69

10 21,78 ± 1505 11,12 ± 2,54 54,83 ± 23,76 38,04 ± 14,92 53,77 ± 15,44

25 52,03 ± 23,36 22,57 ± 3,49 92,55 ± 1,742 57,25 ± 13,03 54,66 ± 14,47


77

6. DISCUSSÃO


78

6. DISCUSSÃO

A partir dos dados obtidos na triagem fitoquímica foi possível identificar que os

flavonoides e taninos foram os constituintes que estavam em maior quantidade em

todas as plantas analisadas. Os flavonoides compõem uma classe de substâncias de

origem natural com extensa diversidade estrutural, e atualmente já foram identificadas

mais de nove mil substâncias pertencentes a este grupo (MARTENS; MITHOFER,

2005).

O extrato etanólico bruto das cascas de A. cearensis apresentou reação

positiva para fenóis, flavonoides, esteroides, e reação negativa para alcalóides.

Quimicamente, a casca do caule de A. cearensis é basicamente constituída de

cumarinas, responsável pelo seu odor peculiar, e também dos flavonoides

isocampferídeo, campferol e afrormosina (BRAVO et al., 1999). Estudos recentes

revelaram que a cumarina, o isocampferídeo e o amburosídio A possuem efeitos anti-

inflamatório, antioxidante e broncodilatador, sendo indicados como princípios ativos

da planta (LEAL et al., 2005).

Nas folhas de M. nigra foi possível identificar a presença de praticamente todos

os metabólitos secundários no extrato e suas frações, havendo maior ou menor

proporção de acordo com a polaridade dos compostos. Estudos realizados por Song

et al. (2009) confirmaram a presença de flavonoides, compostos fenólicos,

antocianinas e alcaloides nas folhas e frutos de plantas do gênero Morus.

Como esperado, fenóis foram encontrados nas folhas e partes aéreas de N.

variegata. Entre os compostos fenólicos, os flavonoides e taninos estavam em maior

quantidade. Estes resultados estão de acordo com as principais classes de

metabólitos secundários encontrados na família Bromeliaceae (MANNETI et al.,

2009).

O extrato etanólico bruto de S. convoluta apresentou reação positiva para a

presença de fenóis, taninos, flavonoides e esteroides. Não foi constatada no EEB a


79

presença de alcaloides. Os flavonoides também são os principais constituintes

químicos da família Selaginellaceae. Entre eles destacam-se os biflavonoides,

dímeros de flavonoides, cuja função na planta é agir como antifúngico ou alimento

dissuasivo para insetos, além de protegerem contra os raios ultravioletas que incidem

principalmente sobre as folhas (SIMÕES et al., 2004).

Os dados da análise fitoquímica preliminar foram corroborados com os

resultados obtidos através da análise por cromatografia líquida de alta eficiência com

detecção de díodos (CLAE-DAD), que constitui uma técnica essencial e viável para a

caracterização de compostos fenólicos, devido a sua versatilidade, precisão e custo

relativamente baixo. Com base nas suas UV-Vis, dados espectrais e seu tempo de

retenção, os compostos isolados apresentaram as seguintes características de faixa:

flavonoides para Ac-EEB e Sc-EEB; compostos fenólicos, ácido cinâmico ou

derivados da flavonona para Mn-EEB; e ácido cinâmico, cumarinas ou flavonoides

para Nv-EEB. Todos esses compostos estão sob investigação, porém dados na

literatura mostram que o biflavonoide amentoflavona é o principal constituinte de

vários extratos de espécies de Selaginella (MA et al., 2001).

Esse é o primeiro trabalho que avaliou a atividade acaricida em A. cearensis,

M. nigra, N. variegata e S. convoluta. É mais provável encontrar atividade biológica

em plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas

escolhidas ao acaso (PIVOTO et al., 2010). Porém, as espécies estudadas nesse

trabalho foram selecionadas por serem abundantes no bioma caatinga e também por

possuírem classes de substâncias, que podem ser inéditas quanto ao efeito acaricida.

No sentindo de localizar os princípios ativos com ação acaricida, os

extratos brutos das plantas foram particionados (FILHO; YUNES, 1998) e avaliados

através do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas. Esse teste tem sido utilizado

para detectar a resistência dos acaricidas, e nos últimos anos têm sido amplamente

empregado para avaliar a eficácia dos fitoterápicos.

Nos testes de imersão, as cascas de Amburana cearensis (FABACEAE),

apresentou eficácia de 66,68% para a fração hexânica (2,5%), sendo essa fração

responsável pelos melhores resultados da planta em todos os parâmetros avaliados.

A. cearensis não apresentou mortalidade direta sobre as fêmeas ingurgitadas em


80

nenhuma das suas frações, porém a fração hexânica reduziu a ovipostura (52,73%) e

principalmente a eclosão dos ovos (39%), apresentando efeito acaricida parcial sobre

a fertilidade das fêmeas. Resultados semelhantes foram obtidos por Monteiro et al.

(2010) ao pesquisarem o efeito do monoterpeno timol sobre as fêmeas ingurgitadas

de R. (B.) microplus, onde observaram que o percentual de eclosão foi mais baixo que

os valores dos controles. No entanto, quando os ovos foram tratados diretamente, o

timol 2% não afetou significantemente este parâmetro, dessa forma, pode-se inferir

que o timol não tinha uma ação deletéria direta na incubação dos ovos.

Para a M. nigra, a fração clorofórmica obteve resultados semelhantes à fração

hexânica de A. cearensis, alcançando 62,61% de eficácia e apresentando ação

acaricida, tanto na fertilidade das fêmeas como na viabilidade dos ovos. A

porcentagem de eclosão foi de apenas 39,33% e a inibição da oviposição atingiu

62,61%.

Foram avaliadas as folhas e partes aéreas de N. variegata, sendo que ambas

obtiveram os seus melhores resultados na fração hexânica. O extrato hexânico de

suas partes aéreas não apresentou mortalidade direta sobre R. (B.) microplus, porém

apresentou um baixo efeito sobre a ovipostura (46,57%), e em sua maior

concentração (25 mg/mL) sobre a porcentagem de eclosão (42,5%), demonstrando

que esse extrato possui pequena ação sobre o carrapato bovino, com eficácia de

apenas 42,5%. Apesar das folhas e partes aéreas apresentarem uma triagem

fitoquímica semelhante, o efeito acaricida das folhas de N. variegata foi bem mais

acentuado, sua fração hexânica teve ação direta sobre as fêmeas ingurgitadas,

apresentando mortalidade superior a 90% e inibindo a ovipostura em 94,14%, em

comparação ao controle. Além do forte efeito na oviposição, o extrato hexânico das

folhas inviabilizou os ovos, apresentando um percentual de eclosão de apenas 0,33%

e alcançando a melhor eficácia (99,81%) entre todas as plantas avaliadas nesse

estudo. Catto, Bianchini e Satio (2009) relataram que pode existir diferentes níveis de

atividade entre as diferentes partes da planta, devido a presença ou não do composto

ativo. No caso de N. variegata, possivelmente as folhas possuem maior quantidade

das substâncias acaricidas ativas, quando comparada às partes aéreas.


81

O extrato bruto e as frações das folhas de S. convoluta não apresentaram

mortalidade direta sobre as fêmeas ingurgitadas. A ação mais evidente em todas as

frações foi sobre a ovipostura, atingindo inibição máxima (37,13%) com o extrato

etanólico bruto (2,5%). Borges et al. (2003), trabalhando com extrato de Melia

azedarach (Meliaceae) (cinamomo) a 0,25%, observaram, in vitro, a inibição total da

oviposição de fêmeas ingurgitadas imersas em extrato bruto de frutos maduros,

extraídos com diferentes solventes, sendo que o extrato não inviabilizou as fêmeas

adultas, mas inibiu total ou parcialmente a produção de ovos e a embriogênese.

O diluente utilizado na solubilização do extrato tem importância significativa,

uma vez que pode potencializar a eficácia do extrato ou não (PIVOTO et al., 2010).

Os solventes de baixo peso molecular e com pouca viscosidade são preferíveis para

os testes de imersão (CHAGAS et al., 2012). No presente trabalho, a água foi

utilizada como diluente, e para as substâncias insolúveis em água foi adicionado o

surfactante cremophor. Não existem dados na literatura que relatem o efeito do

cremophor sobre as fêmeas ingurgitadas de R. (B.) microplus, porém não houve

diferença significativa entre os grupos controle 1 (água) e controle 2 (água e

cremophor), avaliados nesse estudo.

A. cearensis e N. variegata apresentaram maior atividade acaricida nos

extratos hexânicos. Esses resultados foram semelhantes ao estudo de Rosado-

Aguilar et al. (2010), que por meio de extrato bruto geraram partições, a fim de avaliar

o perfil metabólico de Petiveria alliacea (raiz-de-guiné). A fração hexânica de P.

alliacea obteve maior eficácia contra larvas de R. (B.) microplus. Com esse resultado,

e levando-se em consideração a utilização de solventes de polaridade crescente na

coluna cromatográfica, foi possível identificar que a ação carrapaticida estava entre os

compostos apolares da planta.

Embora M. nigra tenha apresentado o melhor efeito na fase clorofórmica, seus

resultados continuam de acordo com os relatados na literatura, uma vez que essa

fase apresenta tendência a possuir compostos mais apolares.

No extrato apolar podem ser encontradas substâncias como esteroides,

terpenos, acetofenonas, agliconas, ceras, sapogeninas, iridoides e sesquiterpenos,


82

substâncias altamente lipofílicas (CECHINEL; YUNES, 1998; CANTRELL;

FRANZBLAU; FISCHER, 2001; SONAGLIO et al., 2010). Os terpenos são relatados

na literatura por possuírem ação acaricida, sendo por isso alvo de vários estudos.

Essa classe de metabólitos abrangem uma grande variedade de substâncias de

origem vegetal e sua importância ecológica como defensivos já está bem

estabelecido. Vários monoterpenos foram isolados e avaliados quanto à toxicidade

frente a diferentes insetos e artrópodes (VIEGAS JUNIOR, 2003)

Em contrapartida, os extratos de S. convoluta apresentaram os melhores

efeitos nas frações polares (EEB e acetato). As plantas podem apresentar diferentes

metabólitos secundários (CECHINEL; YUNES, 1998), que mesmo em pequenas

proporções podem impedir a atividade de outros compostos bioativos ou apresentar

sinergismo com substâncias que sozinhas não produziriam atividade, ou até mesmo

ser a fração mais eficaz (PONTES et al., 2007). Essas interações poderiam justificar

os diferentes resultados de eficácia obtidos no presente estudo.

A portaria nº 48, de 12 de maio de 1997, da Secretaria de Defesa

Agropecuária, que aprova o Regulamento Técnico para Licenciamento e/ou

Renovação de Licença de Produtos Antiparasitários de Uso Veterinário, determinou

que no Teste de Eficácia para Carrapaticidas, o produto deve apresentar uma eficácia

de no mínimo 95% para obter a aprovação (BRASIL, 1997). Os dados aqui

apresentados mostram que apenas o extrato hexânico das folhas de N. variegata

(2,5%) poderia ser utilizado no controle de R.(B.) microplus. Domingues et al., 2013,

avaliaram o efeito acaricida do abacaxi (Ananas comosus), uma bromeliaceae

amplamente cultivada em regiões tropicais e subtropicais. Além do extrato aquoso da

planta foi avaliado a bromelina isolada, obtendo eficácia máxima de 59% para o

extrato aquoso e 55% para a bromelina na concentração de 500 mg/mL. Mesmo

utilizando o dobro da concentração, os resultados foram muito inferiores quando

comparados com as folhas de Nv-HEX.

O extrato hexânico das folhas de N. variegata em baixas concentrações,

mostrou eficácia superior a uma variedade de agentes sintéticos e extratos naturais

relatados na literatura. Olivo et al. (2008) observaram que ao testar várias

concentrações do óleo de citronela (Cymbopogon nardus), obteve eficácia de 89,5%


83

para a maior concentração (100%). O mesmo atribuiu essa ação ao princípio ativo

citronelal, que possui atividade inseticida e acaricida (CHAGAS et al., 2002). Outro

metabólito muito estudado é a azadiractina, presente no “neem”, conhecido por seu

forte poder inseticida, entretanto, um estudo realizado por Broglio-Micheletti et al.

(2010), mostrou eficácia de 73,2% para o extrato hexânico (2%) das suas sementes.

Nossos resultados comprovam o potencial carrapaticida de espécies de plantas

da Caatinga, o que poderá contribuir para as políticas de conservação e manejo

adequado dessas espécies, visto que, além do potencial econômico, elas podem vir a

ser exploradas como fontes de novas substâncias biologicamente ativas.


84

7. CONCLUSÕES


85

7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:

- No estudo comparativo das plantas, as frações hexânicas, apresentaram os

melhores resultados, sugerindo que a atividade carrapaticida seja proveniente de

moléculas com características apolares.

- Todos os extratos e frações apresentaram controle parcial sobre o R.(B.)

microplus, porém apenas a fração hexânica de N. variegata (2,5%) apresentou

eficiência superior a 95%, sendo considerado um excelente carrapaticida. No entanto,

mais estudos são necessários para a melhor elucidação do mecanismo de ação e dos

bioativos que produzem esse efeito.

Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para as

espécies em estudo, dessa forma uma importante contribuição foi dada para a

farmacologia de plantas do Bioma Caatinga.


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8. REFERÊNCIAS


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8. REFERÊNCIAS

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ANEXOS


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ANEXO A – Carta de submissão do artigo


100

ANEXO B – Aprovação do comitê de ética

avaliaÇÃo in vitro da eficÁcia de plantas do bioma

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