avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM HIGIENE VETERINÁRIA E PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BACTERIOLÓCICA DE PEIXES ANCHOVADOS CECÍLIA RISCADO POMBO NITERÓI/RJ 2007

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Page 1: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM HIGIENE VETERINÁRIA E PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BACTERIOLÓCICA DE PEIXES ANCHOVADOS

CECÍLIA RISCADO POMBO

NNIITTEERRÓÓII//RRJJ

22000077

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CCEECCÍÍLLIIAA RRIISSCCAADDOO PPOOMMBBOO

AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BACTERIOLÓCICA DE PEIXES ANCHOVADOS

DDiisssseerrttaaççããoo aapprreesseennttaaddaa aaoo PPrrooggrraammaa ddee PPóóss--GGrraadduuaaççããoo eemm MMeeddiicciinnaa VVeetteerriinnáárriiaa ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee,, ccoommoo rreeqquuiissiittoo ppaarrcciiaall ppaarraa oobbtteennççããoo ddee GGrraauu ddee MMeessttrree.. ÁÁrreeaa ddee CCoonncceennttrraaççããoo:: HHiiggiieennee VVeetteerriinnáárriiaa ee PPrroocceessssaammeennttoo TTeeccnnoollóóggiiccoo ddee PPrroodduuttooss ddee OOrriiggeemm AAnniimmaall,, SSuubb--ÁÁrreeaa ddee HHiiggiieennee VVeetteerriinnáárriiaa ee PPrroocceessssaammeennttoo TTeeccnnoollóóggiiccoo ddee PPeessccaaddoo ee DDeerriivvaaddooss..

OOrriieennttaaddoorr:: PPrrooffªª.. DDrraa.. EElliiaannee TTeeiixxeeiirraa MMáárrssiiccoo CCoo--oorriieennttaaddoorr:: PPrrooff.. DDrr.. RRoobbssoonn MMaaiiaa FFrraannccoo

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22000077

Page 3: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

CCEECCÍÍLLIIAA RRIISSCCAADDOO PPOOMMBBOO

DDiisssseerrttaaççããoo aapprreesseennttaaddaa aaoo PPrrooggrraammaa ddee PPóóss--GGrraadduuaaççããoo eemm MMeeddiicciinnaa VVeetteerriinnáárriiaa ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee,, ccoommoo rreeqquuiissiittoo ppaarrcciiaall ppaarraa oobbtteennççããoo ddee GGrraauu ddee MMeessttrree.. ÁÁrreeaa ddee CCoonncceennttrraaççããoo:: HHiiggiieennee VVeetteerriinnáárriiaa ee PPrroocceessssaammeennttoo TTeeccnnoollóóggiiccoo ddee PPrroodduuttooss ddee OOrriiggeemm AAnniimmaall,, SSuubb--ÁÁrreeaa ddee HHiiggiieennee VVeetteerriinnáárriiaa ee PPrroocceessssaammeennttoo TTeeccnnoollóóggiiccoo ddee PPeessccaaddoo ee DDeerriivvaaddooss..

AApprroovvaaddaa eemm NNoovveemmbbrroo ddee 22000077..

BBAANNCCAA EEXXAAMMIINNAADDOORRAA

PPrrooffª.. DDrraa.. EElliiaannee TTeeiixxeeiirraa MMáárrssiiccoo UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee –– UUFFFF

PPrrooff.. DDrr.. SSéérrggiioo CCaarrmmoonnaa ddee SSããoo CClleemmeennttee UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee -- UUFFFF

PPrrooff.. DDrr.. PPeeddrroo PPaauulloo ddee OOlliivveeiirraa SSiillvvaa IInnssttiittuuttoo ddee TTeeccnnoollooggiiaa -- UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall RRuurraall ddoo RRiioo ddee JJaanneeiirroo --

UUFFRRRRJJ

PPrrooff.. MMSScc GGeerraallddoo AAbbrreeuu ddee OOlliivveeiirraa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee -- UUFFFF

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Page 4: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

AAGGRRAADDEECCIIMMEENNTTOOSS

ÀÀ mmiinnhhaa ffaammíílliiaa ppoorr sseemmpprree eessttaarr mmee aappooiiaannddoo ee iinncceennttiivvaannddoo.. SSeemmpprree ssee

ffiizzeerraamm pprreesseenntteess nnooss mmoommeennttooss eemm qquuee mmaaiiss pprreecciisseeii..

AAoo RReennaattoo CChhaaggaass,, mmeeuu ccoommppaannhheeiirroo,, aammiiggoo,, ccúúmmpplliiccee ee ppoorr qquueemm tteennhhoo

ggrraannddee aaddmmiirraaççããoo.. DDeessccuullppee--mmee ppeellooss mmoommeennttooss eemm qquuee ffuuii ppééssssiimmaa

ccoommppaannhheeiirraa..

ÀÀ mmiinnhhaa oorriieennttaaddoorraa,, EElliiaannee TTeeiixxeeiirraa MMáárrssiiccoo,, ppeelloo eessttíímmuulloo ccoonnssttaannttee,, aappooiioo,,

ccaarriinnhhoo ee aatteennççããoo.. OObbrriiggaaddaa ppoorr ttooddaass aass ooppoorrttuunniiddaaddeess qquuee mmee ffoorraamm ooffeerreecciiddaass

ddee ccrreesscceerr ee aammaadduurreecceerr.. UUmm bbeeiijjoo nnoo ccoorraaççããoo..

AAoo mmeeuu ccoo--oorriieennttaaddoorr,, RRoobbssoonn MMaaiiaa FFrraannccoo,, ppeelloo aappooiioo ccoonnssttaannttee ee ppaallaavvrraass

ddee ccaarriinnhhoo ee ddeessccoonnttrraaççããoo.. AAggrraaddeeççoo ttaammbbéémm ppeellooss ““ppuuxxõõeess ddee oorreellhhaa”” qquuee ffoorraamm

mmuuiittoo iimmppoorrttaanntteess ppaarraa mmiinnhhaa ffoorrmmaaççããoo..

AAoo SSrr.. GGiillbbeerrttoo DD’’EElliiaa ee aa DDrraa AAnnaa MMaarriiaa PPaasscchhooaall ppeelloo aappooiioo,, ffuunnddaammeennttaall,,

nnaa rreeaalliizzaaççããoo ddeessttaa ppeessqquuiissaa..

AAooss ccoommppaannhheeiirrooss ddee llaabboorraattóórriioo ee nnoovvooss aammiiggooss,, NNúúbbiiaa ddee AAgguuiiaarr ee CCaarrllooss

FFrreeddeerriiccoo,, sseemm vvooccêêss ttooddaa eessttaa ccaammiinnhhaaddaa tteerriiaa ssiiddoo mmuuiittoo mmaaiiss ddiiffíícciill.. VVooccêêss

ffoorraamm,, mmuuiittaass vveezzeess,, mmeeuuss bbrraaççooss ee ppeerrnnaass..

ÀÀ FFaaccuullddaaddee ddee VVeetteerriinnáárriiaa ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee ppeelloo aappooiioo

mmaatteerriiaall ee hhuummaannoo,,

ÀÀ CCAAPPEESS ee PPRROOPPPP ppeelloo aappooiioo ffiinnaanncceeiirroo..

Page 5: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

BBIIOOGGRRAAFFIIAA

CCeeccíílliiaa RRiissccaaddoo PPoommbboo,, ffiillhhaa ddee RRoonnaallddoo PPeessssaannhhaa PPoommbboo ee VViirrggíínniiaa RRiissccaaddoo

PPoommbboo,, nnaasscciiddaa eemm NNiitteerróóii –– RRJJ,, eemm 0033 ddee aabbrriill ddee 11997799,, ccuurrssoouu oo pprriimmeeiirroo ggrraauu nnoo

CCuurrssoo MMaarrllyy CCuurryy ee oo sseegguunnddoo ggrraauu nnoo CCoollééggiioo SSaalleessiiaannooss SSaannttaa RRoossaa,, aammbbooss eemm

NNiitteerróóii..

IInnggrreessssoouu nnaa FFaaccuullddaaddee ddee BBiioollooggiiaa ddaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall ddoo RRiioo ddee

JJaanneeiirroo eemm mmaarrççoo ddee 11999999,, ttrraannccaannddoo ssuuaa mmaattrrííccuullaa ppaarraa ddaarr iinníícciioo aaoo ccuurrssoo ddee

MMeeddiicciinnaa VVeetteerriinnáárriiaa,, ssoonnhhoo ddee ccrriiaannççaa,, nnaa UUnniivveerrssiiddaaddee FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee eemm

aaggoossttoo ddoo mmeessmmoo aannoo.. DDuurraannttee aa ggrraadduuaaççããoo ffooii eessttaaggiiáárriiaa ee bboollssiissttaa PPIIBBIICC ––

FFEENNOORRTTEE,, eennttrree ooss aannooss ddee 22000033 ee 22000055,, eexxeerrcceennddoo ssuuaass aattiivviiddaaddeess nnaa áárreeaa ddee

bbaacctteerriioollooggiiaa ddoo LLaabboorraattóórriioo ddee BBiioollooggiiaa AAnniimmaall ddaa PPEESSAAGGRROO--RRJJ..

OObbtteevvee oo ggrraauu ddee MMééddiiccaa VVeetteerriinnáárriiaa eemm jjaanneeiirroo ddee 22000066,, mmeessmmoo aannoo qquuee

iinnggrreessssoouu nnoo PPrrooggrraammaa ddee PPóóss--GGrraadduuaaççããoo eemm MMeeddiicciinnaa VVeetteerriinnáárriiaa nnaa UUnniivveerrssiiddaaddee

FFeeddeerraall FFlluummiinneennssee..

Page 6: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO, p. 20

2 OBJETIVOS, p. 23 2.1 OBJETIVO GERAL, p. 23

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 23

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA, p. 24 3.1 CONSERVAÇÃO DO PESCADO, p. 24

3.1.1 Sal, p. 25

3.2 SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella bralisiensis), p. 28

3.3 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE SARDINHA ANCHOVADA, p. 30

3.3.1 Salga, p. 31 3.3.2 Processo de fermentação, p. 32

3.3.3 Indústria do anchovado, p. 33 3.4 HISTAMINA, p. 33

3.4.1 Mecanismos de formação, p. 35

Page 7: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

3.4.2 Atuação da histamina e sintomatologia da intoxicação, p. 37 3.4.3 Padrões nacionais e internacionais, p. 39 3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO, p. 39

3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado, p. 40 3.5.2 Bactérias halófílicas e halotolerantes, p. 41 3.5.3 Bactérias acidoláticas, p. 41 3.5.4 Salmonella spp., p. 42 3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli), p. 43 3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva, p. 44 3.5.7 Enterococcus spp., p. 45

4 MATERIAL E MÉTODOS, p. 47 4.1AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 47

4.1.1 Análises bacteriológicas, p. 48 4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura, p. 49

4.1.1.2 Enumeração de coliformes totais e fecal (Escherichia coli), p. 49

4.1.1.3 Enumeração de Enterococcus sp., p. 51

4.1.1.4 Contagem e Identificação de Staphylococcus coagulase positiva, p. 51

4.1.1.5 Isolamento e identificação de Salmonella sp., p. 52

4.1.2 Análises físico-químicas, p. 54 4.1.2.1 Avaliação de histamina, p. 54

4.1.2.1.1 Método de Cromatografia em Camada Delgada, p. 54

4.1.2.1.2 Método Fluorimétrico, p. 56 4.1.2.2 Análise da produção de Bases Voláteis Totais, p.61

4.1.2.3 Percentual de cloretos, p. 63

4.1.2.4 Atividade de água, p. 65

4.1.2.5 pH, p. 65

4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 65

4.2.1 Processamento usual da empresa, p. 66 4.2.2 Processamento com peixe inteiro, p. 68 4.2.3 Processamento com peixe eviscerado, p. 68 4.2.4 Delineamento experimental, p. 68 4.2.4.1 Matéria-prima, p.69

4.2.4.1.1 Sal, p. 69

Page 8: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

4.2.4.1.2 Sardinha fresca, p. 69

4.2.4.2 Produto em fermentação, p. 70

4.2.4.2.1 Análises bacteriológicas, p. 70

4.2.4.2.2 Análises físico-químicas, p. 70

4.2.5 Tratamento estatístico dos resultados, p. 71

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO, p. 72 5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA, p. 72

5.1.1 Análises bacteriológicas, p. 72 5.1.2 Análises físico-químicas, p. 74 5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS, p. 76

5.2.1 Matérias-primas, p. 77 5.2.2 Processamentos tecnológicos A, B e C, p. 77 5.2.2.1 Resultados das análises bacteriológicas, p. 77

5.2.2.2 Resultados das análises físico-químicas, p. 80

6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES, p. 87

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 88

8 APÊNDICES, p. 96 8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS, p. 96

8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATÉRIA PRIMA, p. 98

8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAÇÃO, p. 99

9 ANEXOS, p. 100 9.1 FLUXOGRAMA DE PROCESSAMENTO, p. 100

9.1.1 Fluxograma do processamento usual da empresa (A), p. 101 9.1.2 Fluxograma do processamento com fermentação do peixe inteiro (B), p. 102 9.1.3 Fluxograma do processamento com fermentação do peixe eviscerado (C), p. 103

Page 9: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Fig 1 Representação gráfica do Processo de produção do sal, p 27.

Quadro 1 Composição do sal de acordo com as especificações do sal

tipo II da NBR 10888 de dezembro de 1989 (ABNT), p. 27

Quadro 2 Composição química de filés de sardinha (Sardinella

brasiliensis) in natura., p. 29

Fig 2 Figura esquemática da formação de aminas biogênicas a partir

dos respectivos aminoácidos precursores, p. 34

Fig 3 Esquema ilustrativo da detoxificação da histamina e seus

respectivos metabólitos, p. 37

Fig 4 Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no

mercado varejista, p. 48

Fig 5 (A e B) Microtubos tipo “eppendorf” contendo os meios de cultura

Fluorocult ® (A) e Chromocult ® (B), agrupados por amostras,

p. 50

Fig 6 Tubo de ensaio contendo caldo Salmocyst ® suplemento antes

de semeado (A) e após a adição de 10 ml do caldo Salmocyst®

base (B), p. 52

Fig 7 (A, B, C e D) Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach ® a partir

Page 10: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

de repique realizado do caldo Salmocyst® suplemento onde,

(A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D)

apresentam crescimento suspeito de Escherichia. spp e

Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de

Proteus spp., p. 53

Fig 8 Placa de sílica (Sigma ®) após revelação com solução de

ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presença de histamina em

todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas, p. 56

Fig 9 Fluorímetro (Sequoia–Turner® Modelo 450) registrando a

leitura de uma das amostras analisadas, p. 57

Fig 10 (A, B e C) Preparação da coluna de filtração, colocando-se primeiro o

papel de filtro (Whaltman nº 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adição de pequena quantidade de lã de vidro

(B) posteriormente adicionando a resina de troca iônica (Dowex

®) previamente convertida a forma alcalina (C), p. 58

Fig 11 Plano cartesiano contendo a “Curva Padrão” da quantificação

de histamina utilizada no método Fluorimétrico, p. 61

Fig 12 (A, B e C) Titulometria de neutralização das bases presentes no

compartimento interno da placa de microdifusão de Conway (A)

onde a adição de solução de ácido clorídrico 0,1 N, com

auxílio de microbureta, vai alterando a cor do conteúdo (B) até

completa viragem do mesmo (C), p. 62

Fig 13 Barricas contendo as sardinhas no período de fermentação do

produto, p. 66

Fig 14 (A, B e C)

Salão com temperatura controlada onde é realizada a

fermentação do produto (A). Destaque para os sensores de

aferição da temperatura (B e C), p. 67

Fig 15 Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura, p. 67

Page 11: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

Fig 16

Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores

médios da concentração de histamina dos três lotes de cada

processamento tecnológico trabalhado, p. 86

Page 12: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Resultados referentes à contagem de coliformes totais e fecal

(NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella

spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados

provenientes do mercado interno e externo, p. 73

Tabela 2 Resultados obtidos nas análises de Bases Voláteis Totais - BVT

(mg N/100g), histamina (mg / 100g), outras aminas biogênicas,

pH, Atividade de água – Aa e cloretos (%) em peixes anchovados

provenientes do mercado interno e externo, p. 75

Tabela 3 Teor de Bases Voláteis Totais (mg de N/100g) e histamina

(mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e

Fluorimetria (F) em amostras de sardinha (S. brasiliensis)

utilizadas no processamento tecnológico de anchovagem, p. 77

Tabela 4 Resultados das análises bacteriológicas realizadas nas amostras

coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do período de

90 dias de fermentação do produto, p. 78

Tabela 5 Resultados das provas bioquímicas realizadas em colônias

suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird

Page 13: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

Parker para o Caldo BHI, p. 80

Tabela 6 Valores médios de N-BVT (mg N/100 g) obtidos nos

processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis)

anchovada através do método de microdifusão em placa de

Conway, por 90 dias, p. 81

Tabela 7 Valores médios de pH obtidos nos processamentos tecnológicos

de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias, p. 82

Tabela 8 Valores médios de Aa obtidos nos processamentos tecnológicos

de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do aparelho

PawKit ®, por 90 dias, p. 83

Tabela 9 Valores médios de cloreto (%) obtidos nos processamentos

tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias,

p. 83

Tabela 10

Ordenação média das concentrações de histamina (ppm) nos

processamentos tecnológicos A, B e C testados e seus

respectivos valores mínimos e máximos, sendo a DMS = 4,58, p.

84

Tabela 11 Concentrações médias de histamina (ppm) dos três lotes de cada

processamento tecnológico estudado, ao longo do período de

fermentação da sardinha (S. brasiliensis), p. 85

Page 14: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

® marca registrada °Bé grau Baumé °C grau Celsius a. C. antes de Cristo Aa Atividade de água AOAC Association of Official Analitical Chemists ATCC American Type Culture Collection CE Comunidade Européia DAO Diamino Oxidase FAO Food and Agricultura Organization FDA Food and Drug Administration G+ Gram positivo IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente LANARA Laboratório Nacional de Referência Animal M Molaridade MAO Mono Amino Oxidase N Normalidade N-HMT Histamina N-Metiltransferase NMP Número Mais Provável OTMA Óxido de Trimetilamina pH potencial Hidrogeniônico ppm parte por milhão

Page 15: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

RDC Resolução da Diretoria Colegiada R.I.I.S.P.O.A. Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos

de Origem Animal RJ Rio de Janeiro rpm rotações por minuto SC Santa Catarina UFC Unidade Formadora de Colônia µg micrograma µL microlitro

Page 16: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

RESUMO

A anchovagem do pescado consiste em um processo de fermentação na qual

enzimas tissulares e microbianas agem sobre os hidratos de carbono e proteínas.

Existe uma dificuldade para a normatização do produto pela falta de padrões oficiais

que regulamentem o processamento tecnológico. Assim sendo, o objetivo deste estudo

foi avaliar a qualidade de peixes anchovadas comercializados no mercado interno,

através de parâmetros físico-químicos e bacteriológicos, além de avaliar três

processamentos tecnológicos distintos para compará-los. Foram realizadas a

enumeração de Coliformes e Escherichia coli; de Enterococcus spp., contagem e

identificação de Staphylococcus aureus e isolamento e identificação de Salmonella

spp..Os parâmetros físico-químicos avaliados foram a produção de Bases Voláteis

Totais (BVT), a determinação do pH e a quantificação de cloretos, a presença de

aminas biogênicas foi determinada pelo método de Cromatografia em Camada Delgada

(CCD) e a quantificação de histamina pelo método fluorimétrico (AOAC, 2002). No

produto disponível no mercado varejista, os valores de pH variaram entre 5,08 e 5,73,

de Atividade de água (Aa) entre 0,75 e 0,70. O percentual de cloretos observado foi de

9,78 a 17,50. Bacteriologicamente, as amostras analisadas encontram-se dentro do

padrão oficial, usando como referência a RDC n° 12, em relação à Salmonella spp. e

coliformes termotolerantes. Duas amostras apresentaram maiores valores de

Staphylococcus coagulase positivo. A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista

pela legislação, entretanto os resultados sugerem uma relação entre a presença desta

Page 17: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

17

bactéria e a produção de histamina. Ao avaliar os distintos processamentos

tecnológicos, percebeu-se uma diferença significativa (p<0,05) na produção de

histamina entre os lotes acompanhados. Isolou-se Escherichia spp., Klebsiella spp,

Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. e Pseudomonas spp.. No entanto, não

houve isolamento de coliforme termotolerantes e dos gêneros Enterococcus e

Salmonella. O percentual de cloreto variou entre 15,65 e 18,87 % não havendo

diferença significativa entre os processamentos testados (p>0,05). As variáveis Aa e pH

apresentaram diferenças significativas entre os processamentos (p<0,05) e obtiveram

valores entre 0,71 e 0,75, e 5,54 e 5,93, respectivamente. Os valores de BVT variaram

entre 15,1 e 62,1 mgN/100g, apresentando diferenças significativas entre os

processamentos (p<0,05). Concluiu-se que há produção de histamina em

concentrações preocupantes para a saúde coletiva. Nas condições deste estudo, o

processamento tecnológico usual da empresa, mostrou ser o mais adequado para o

processamento do produto pelos parâmetros fisico-químicos analisados apesar de

haver produção de histamina em níveis que poderão, em alguns casos, produzir

sintomatologia de intoxicação em consumidores. No entanto, mais estudos com relação

aos pontos críticos de controle são necessários.

Palavras chaves: Anchovado; Aminas biogênicas; histamina, qualidade, padrões

bacteriológicos.

Page 18: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

ABSTRACT

The process to obtain fish anchovies consist on the fermentation of the product in

which microbiological and tissue enzimes act over proteins. There is a difficulty to

standarlizate the product because of the nonexistence of official padrons to

regulamentate the technological process. The aim of this study was avaliate the quality

of fish anchovies comercialized through phisycal-chemical and bacteriological

parameters and compare three differents technological process. The bacteriological

analisys made were: colifornms, Enterococcus spp. and Escherichia coli enumerations,

count and identification of Staphylococcus aureus and isolation ando identification of

Salmonella spp.. The physical-chemical paremeter avaliated were: production of Total

Volatile Base (N-TVB), determination of pH and salt (NaCl) quantification (%). The

presence of biogenic amines were determinated by Thin Layer Cromatography (TLC)

and the quantification of histamine was made by the fluorimetric method. In the

comercialized products the values of pH were between 5,08 and 5,73 and the values of

Activity of water (Aw) were between 0,70 and 0,75. The salt concentration (%) observed

was beteween 9,78 and 17,50 %. Bacteriological results were saticfactory, using as

reference the RDC nº12 legislation (BRASIL, 2001) to avaliatethe presence of

Salmonella spp., E. coli and coliforms. Two samples had counts of S. aureus above the

value stablished by that lagislation. The enumeration of Enterococcus spp. isn´t preview

by RDC nº 12 and the results obtained suggests a relation between the presence of this

bacteria and the formation of histamine. When the different thecnological process were

Page 19: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

19

avaliated was stablished a significant difference in the formation of histamine (p<0,05).

Eschericia spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Shiguella spp., Citrobacter spp. and

Pseudomonas spp. were isolated., but there was no isolation of Salmonella spp. and

Enterococcus spp. The salt percentual values vary between 15,65 and 18,87 % and no

significant difference was stablished (p> 0,05). Aw and pH data have shown significant

differences between the three processes (p<0,05) and obtain values between 0,71 and

0,75, and 5,54 and 5,93 respectively. The values of N- TVB vary between 15,1 and 62,1

mgN/100g. In conclusion, the formation of histamine in this product occours in concern

concentrations for public health. The usual process used by the industry present better

resoults acording to the physical-chemical analises even though had histamine

formation that might produce sintimatology of intoxication on consumer. However, more

studies are necessary.

Keywords: Anchovy, biogenic amines, histamine, quality, bacteriological standards

Page 20: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

1 INTRODUÇÃO

Desde épocas muito remotas o homem busca formas de conservar seu alimento.

Com a fumaça produzida pelo fogo, aprendeu a defumar e, com o sol e o ar, aprendeu

a secar sua comida. Também aprendeu a salgar e secar carnes e pescados (acredita-

se que a primeira salga foi realizada enterrando-se o alimento na praia, onde a água do

mar realizava a cura).

Alguns registros mostram que os fenícios, os egípcios e os gregos secavam,

defumavam e salgavam seus peixes para transportá-los na região, que é bastante

quente. Os romanos também consumiam carnes salgadas e caças provenientes de

distantes regiões, conservadas no mel.

Também na civilização oriental, 3000 anos antes de Cristo (a.C.) os chineses já

utilizavam o sal para conservar os peixes acumulados em épocas de fartura e, 1000

anos depois, já haviam desenvolvido tecnologia para a conservação de peixes

utilizando gelo.

Na salga, o produto final pode ser o pescado inteiro, em forma de pasta ou em

forma de molhos. Dentro destas três categorias estão englobados produtos comerciais

característicos de cada região de origem. Quando o produto final mantém a forma

original do pescado o processo é denominado anchovagem.

A anchovagem do pescado consiste, fundamentalmente, num processo de cura

prolongada, no qual as enzimas tissulares e microbianas compartilham suas ações

sobre os diversos subcomponentes. A ação de algumas enzimas autolíticas e de

microrganismos capazes de produzir substâncias bloqueadoras de decomposição atua

sobre os hidratos de carbono e proteínas, conferindo aos alimentos aspecto e aroma

especiais.

Page 21: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

21

Os peixes fermentados podem ser considerados uma semiconserva pelo fato de

não sofrerem nenhum tratamento térmico ao longo do processamento tecnológico e

antes de serem consumidos.

Na região sudeste da Ásia (Vietnã, Camboja, Tailândia e Indonésia) os produtos

mais populares são os “bagoongs” (pastas), o “nuoc-man” (molho), o “prahoc”, o “trassi”

(pasta de camarão da Indonésia), o “man-pla” e o “budu”. Alguns destes produtos são

consumidos em larga escala sendo, praticamente, a única fonte de proteína de boa

qualidade, obtidos com tecnologia de baixo investimento.

Na França, Alemanha e países escandinavos, são comercializados produtos com

“flavour” desenvolvido em fermentação por período longo e comercializado em

embalagens pequenas e de alto custo.

Os anchovados autênticos são feitos a partir de engraulídios (Engraulis

encrasicholus, Engraulis ringens, Engraulis mordax). Porém, a sardinha (Sardinella

brasiliensis) pode ser utilizada como matéria prima, pois possui os componentes

biológicos necessários para o desenvolvimento do aroma, do sabor, da cor e da textura

próprios dos anchovados.

A matéria prima desta tecnologia pode ser veiculadora de uma grande variedade

de microrganismos patogênicos, a maior parte deles em função da contaminação

ambiental. Outra fonte de contaminação importante é o manejo do pescado, desde o

momento da captura, ainda nos barcos pesqueiros, até sua destinação final, após

passar por inúmeras fases de processamento e transporte.

Na indústria do pescado, além de microrganismos patogênicos, é importante

lembrar que a produção de histamina é um importante ponto que deve ser avaliado,

pelo fato de ser termoestável e ter sua ação potencializada pela presença de outras

aminas biogênicas. A histamina é produzida pela descarboxilação da histidina e está

envolvida como mediadora primária de reações alérgicas, sendo tóxica em alta

concentração. Peixes da família Scombridae, como a cavala, cavalinha e os atuns, e

também da família Clupeidae, como a sardinha, são freqüentemente envolvidos em

surtos de intoxicação histamínica. O controle do alto nível de histamina presente nestas

espécies deve ser monitorizado a fim de prevenir intoxicações no consumidor.

Page 22: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

22

Observando todos os fatores acima expostos e devido a pressões do mercado

para a produção de alimentos mais seguros e de baixo custo, as empresas da área de

alimentos, assim como as de outras áreas, têm reconhecido às limitações dos

programas tradicionais de controle de qualidade e estão implementando novos

sistemas de gerenciamento que permitam produzir alimentos efetivamente seguros e

simultaneamente de melhor qualidade e com menor custo.

No Brasil, o pescado fermentado ainda não se tornou um hábito de consumo

significativo e, pela falta de padrões oficiais que regulamente seu processamento

tecnológico, existe uma dificuldade para a classificação ou normatização do produto.

A legislação em que algumas das indústrias nacionais se baseiam para a

elaboração de sardinhas anchovadas é o Regulamento C.E. n° 2073/2005 de 15 de

novembro de 2005, relativo a critérios microbiológicos aplicáveis aos gêneros

alimentícios.

Page 23: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

Avaliar a qualidade de peixes anchovados comercializados no mercado interno,

de origem nacional e internacional, além de avaliar o processamento tecnológico da

anchovagem.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

- Avaliar a produção de Bases Voláteis Totais, pH, Atividade de água, produção

de aminas biogênicas (histamina, putrescina e cadaverina) e teor de cloreto de sódio.

- Avaliar a presença de Coliformes fecais e totais, Staphylococcus coagulase

positiva, Salmonella spp. e Enterococcus spp.

- Comparar três processamentos tecnológicos: o utilizado pela indústria e outras

duas variações.

Page 24: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 CONSERVAÇÃO DO PESCADO

A conservação tem por objetivo preservar os alimentos ao longo do tempo,

evitando a deterioração para uso futuro. É importante ressaltar que o alimento a ser

conservado precisa chegar à esta etapa com boa qualidade, uma vez que o processo

de conservação não reverte o quadro de deterioração, apenas o retarda (CAMARGO,

2007).

A conservação de alimentos surgiu com a civilização. Entretanto, todos os

processos utilizados até o final do século XVIII foram desenvolvidos de forma

totalmente empírica, sem nenhum conhecimento ou embasamento teórico e,

normalmente, utilizando ou simulando processos existentes na natureza (secagem,

defumação, congelamento), Nessa época, já se sabia que as frutas e algumas

hortaliças podiam ser conservadas em açúcar e certas hortaliças toleravam o vinagre.

Porém, todos esses procedimentos conservavam os alimentos por pouco tempo e com

escassas garantias (BRANDÃO, 2007).

Os índios brasileiros, muito antes do descobrimento, costumavam assar as

carnes, secar os peixes e depois armazená-los em caldo grosso de pimenta. A

conservação por imersão na gordura também era utilizada pelos nossos índios que

deixavam os animais imersos em sua própria gordura. Os Bandeirantes salgavam as

caças para poder transportá-las durante suas expedições (GOURMAND, 2007).

A deterioração do pescado é um fenômeno decorrente da atividade metabólica

de microrganismos e de processos bioquímicos indesejáveis. Por estas razões, para a

preservação, são utilizados processos físicos de controle, como desidratação,

Page 25: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

25

armazenamento a baixas temperaturas (refrigeração, congelamento) e processos

térmicos (pasteurização e esterilização) (OGAWA; MAIA, 1999).

Uma das formas de conservação do pescado é a elaboração de semiconservas

que, segundo Huss (1997), são produtos caracterizados por possuírem teor de sal

maior que 6% de NaCl (p/p) na fase aquosa ou pH menor que 5,0.

O Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal

– R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a), não possui nenhuma definição e/ou conceituação

referentes as semiconservas.

O artigo 425 do Decreto n° 38.757, do Governo do Estado do Rio de Janeiro,

alínea I, define o “pescado anchovado” como a semiconserva de pescado obtida a partir

da cura prolongada do pescado pelo sal (cloreto de sódio), com ou sem aditivos,

substâncias aromáticas e vegetais, envasada em óleos comestíveis (GOVERNO DO

ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2006).

3.1.1 Sal

É difícil localizar o início do consumo e da utilização do sal pelo Homem. Os

primeiros testemunhos da sua utilização datam de 2000 anos a.C., sendo transportado

como mercadoria pelos fenícios, empregue na salga do peixe consumido pelos

troianos, usado na mumificação dos corpos no Egito e exigido pelo imperador chinês Yu

como tributo aos seus súditos (REIS; CHAVES, 2007).

No entanto, é bastante provável que o início da extração deste produto, pela

criação de perímetros fechados para retenção da água do mar, remonte a períodos pré-

históricos, pois o sal aparece relacionado com todas as manifestações da vida humana.

Foi a causa da riqueza de muitas civilizações a ponto de ter assumido, por vezes,

características monetárias (ibid).

O sal é conhecido, tecnicamente, como cloreto de sódio e sua fórmula química é

o NaCl. Embora a maioria das pessoas esteja familiarizada com os vários usos do sal

na culinária, há o desconhecimento de suas outras aplicações, como a manufatura de

papel e a produção de sabão e detergentes. No norte dos Estados Unidos da América e

na Europa, grandes quantidades de sal são utilizadas para limpar as rodovias do gelo

durante o inverno (WIKIPEDIA, 2007).

Page 26: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

26

Outra aplicação importante do sal é feita na conservação de alimentos desde a

antiguidade, quando foi utilizada pela primeira vez na preservação da carne, baseando-

se no fato do sal exercer o efeito de desidratação, tanto no alimento, como nos

microrganismos (JAY, 2005).

Pensando na conservação do pescado, observou-se que a composição química

do sal, o grau de pureza e a constituição microbiológica são elementos fundamentais

para a obtenção de um produto de alta qualidade (CARMO, 1991).

O sal de alta pureza é o que tem teor de cloreto de sódio (NaCl) superior a

96,5%, com menos de 3% de sais insolúveis, tendo como impurezas o cloreto de cálcio

(CaCl2) e o cloreto de magnésio (MgCl2) no sal proveniente de salinas (OETTERER,

2005).

A granulação do sal também é um fator de grande importância. Se esta for muito

fina poderá penetrar excessivamente na parte superficial da carne, havendo, como

conseqüência, rápida perda de água nos tecidos superficiais. Se for muito grossa, pode

deixar escoriações na superfície do pescado (BEIRÃO, 1976; OETTERER, 2005). Esse

ingrediente possui quatro denominações conhecidas que o classifica, quanto a suas

características granulométricas em: sal grosso, sal peneirado, sal triturado e sal

refinado (PARDI, 2001).

O processo de produção do sal inicia em um braço de mar, onde a água salgada

é captada e levada para o primeiro evaporador. Deste evaporador esta é transferida

para os demais evaporadores por gravidade, onde a evaporação natural provocada

pelo sol e vento aumenta gradativamente a concentração dos sais presentes na água,

até o ponto em que a salmoura está quase saturada de cloreto de sódio. Após essa

fase, a água é transferida para os cristalizadores, onde, após a precipitação do sal, a

água é drenada e o sal entra no processo de colheita (SALINA DIAMANTE BRANCO,

2007).

Este sal cristalizado colhido é submetido a uma lavagem com salmoura saturada

para a retirada de impurezas. Após a lavagem o sal é transferido para o pátio de

estoque. A partir da secagem, o sal está pronto para o embarque, como mostra a Figura

1 (SALINA DIAMANTE BRANCO, 2007).

Page 27: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

27

Fonte: http://www.salbrasil.com.br/produtos.php

Figura 1 – Representação gráfica do Processo de produção do sal

No quadro 1 pode-se observar a composição do sal, de acordo com as

especificações do sal tipo II da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (Cloreto de Sódio -

Sal para Alimentação Humana) (ibid).

Quadro 1 – Composição do sal de acordo com as especificações do sal tipo II

da NBR 10888 de Dezembro de 1989 (ABNT).

Parâmetro Unidade Mínimo Máximo Cloreto de Sódio (Base Seca) % NaCl 99,00 - Insolúveis em H2O % m/m - 0,1 Umidade (*) % H2O - 2,5 Cálcio % Ca - 0,1 Magnésio % Mg - 0,03 Sulfato % SO4 - 0,28

Fonte: http://www.salbrasil.com.br/prod-grossoensacado-int.htm

Para que a utilização do sal seja eficiente como matéria prima, as bactérias

putrefativas não devem estar presentes. No entanto, a presença de bactérias halófilas

produtoras de ácido lático podem ser favoráveis à produção (OETTERER; PERUJO,

2003). Oetterer (2005) ainda afirma que as bactérias halofílicas aeróbicas são

contaminantes naturais do sal, sendo a temperatura ótima de crescimento entre 40 °C e

50 °C e de inibição abaixo de 7 °C.

O sal é portador de uma microbiota contaminante, halófila ou haloresistente

considerável, salientando-se entre estes microrganismos as sarcinas, bactérias halófilas

Page 28: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

28

cromogênicas causadoras da coloração vermelha indesejável em produtos protéicos

salgados. Nem todos os microrganismos halófilos são prejudiciais aos produtos

salgados, verificando-se entre estes a ocorrência de algumas espécies que contribuem

para a fermentação desses produtos. Entre as espécies de interesse da indústria da

salga, citam-se algumas pertencentes aos gêneros Halobacterium e Micrococus. As

primeiras são halófilos obrigatórios, crescendo em meios com 16 a 32% de cloreto de

sódio, enquanto as Micrococáceas crescem em meios contendo 5 a 15% deste sal

(PINTO, 2007).

3.2. SARDINHA VERDADEIRA (Sardinella brasiliensis)

A sardinha verdadeira pertence à família Clupeidae e faz parte de um conjunto

de espécies pelágicas (do latim pelagos, que significa o "mar aberto"). São peixes que

vivem em cardumes, nadando livremente na coluna de água, estando adaptados tanto

à água fria como à água quente. São pequenos e podem medir entre 11 e 20 cm de

cumprimento (SIKORSKI, 1990).

A sardinha verdadeira (Sardinella brasiliensis) é o mais tradicional recurso

pesqueiro da região sudeste-sul do Brasil. É uma espécie de ocorrência costeira e de

fácil captura, sendo pescada entre o Cabo de São Tomé (22ºS) /RJ e o Cabo de Santa

Marta Grande (28ºS) /SC, entre 10 e 100 m de profundidade. A espécie exibe grande

sensibilidade às variações ambientais, sendo que esta situação se agrava quando

associada ao intensivo esforço de pesca, o que pode acarretar numa grande redução

do estoque (IBAMA, 2007a).

A sardinha foi capturada acima dos níveis aceitáveis de sustentabilidade do

recurso, sendo sobreexplotada, gerando intensa exploração comercial o que levou a

redução da biomassa (número de peixes) e, conseqüentemente, comprometendo o

potencial de desova. Os estoques pesqueiros de sardinha sofreram queda substancial

e, para recuperar esta biomassa, em julho de 2004, foi implementado o “defeso de

recrutamento” objetivando aumentar a população reprodutiva ou biomassa desovante

(ibid).

Page 29: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

29

Para o ano de 2007 foram definidos três períodos de defeso: de 17 de novembro

de 2006 a 24 de fevereiro de 2007, 21 de junho a 09 de agosto de 2007 e 17 de

novembro de 2007 a 24 de fevereiro de 2008 (IBAMA, 2007b).

Existem fatores que interferem na composição química das espécies. Entre estes

fatores, citam-se a idade, estação do ano, sexo, desenvolvimento gonadal e

alimentação, os quais interferem nos teores de água, lipídeos, proteína e minerais.

Assim sendo, o pescado pode ser classificado por grupos, de acordo com a variação

destes componentes (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

A principal classificação utilizada, visto que o teor de gordura influi de forma

decisiva na reprodução, na vida útil do produto e na aceitação geral pelos

consumidores, é: gordo (mínimo de 10%), semi-gordo (entre 2,5 e 10%) e magro

(máximo 2,5 %) (JACQUOT1, 1961 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

No quadro 2, é possível observar a composição centesimal de filés de sardinha,

de acordo como trabalho realizado por Santo et al. (2003), quando avaliou a atividade

bacteriogênica do Lactobacillus sakei na fermentação da sardinha brasileira (Sardinella

brasiliensis).

Quadro 2 – Composição química de filés de sardinha (Sardinella brasiliensis) in natura.

COMPOSIÇÃO CENTESIMAL (g/100g)

A B C X Dp (+/-)

Umidade 72,9 73,5 13,7 73,4 0,39

Lipídios 2,0 3,0 4,2 3,1 0,89

Proteínas 19,7 19,6 17,7 19,0 0,88

Cinzas 2,0 1,9 1,9 1,9 0,01 Fonte: SANTO et al., 2003. A, B, C = Lotes; X = médias; Dp = Desvio padrão.

A estação do ano exerce grande influência na composição centesimal dos peixes

pelágicos, pois estes têm seu teor de gordura aumentado ou diminuído, de acordo com

a disponibilidade sazonal de alimentos. A fertilidade do mar ocorre nas áreas de

1 JACQUOT, R. Organic constituents of fish and other aquatic foods. In: Fish and Food. V. 1. Ed. G. Borgsrom, Academy Press, New York, USA. p. 146-192, 1961

Page 30: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

30

ressurgência e quando a luz diurna é maior. Portanto, na região subtropical há maior

abundância de peixes pelágicos na primavera e verão (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

O músculo esquelético do pescado é rico em proteínas e lipídios. As proteínas

são de alto valor nutritivo com um balanceamento de aminoácidos essenciais

comparáveis à proteína padrão da FAO (Food and Agricultura Organization). Os

lipídios, além de fonte energética, são ricos em ácidos graxos polinsaturados da série

ômega 3, especialmente o EPA (ácido eicosapentaenóico) e o DHA (ácido

docosacahexaenóico), que apresentam efeitos redutores sobre os teores de

triglicerídeos e colesterol sanguíneo (OGAWA; MAIA, 1999).

Em relação aos aminoácidos presentes na musculatura do pescado, a histidina

tem destaque em função da media concentração deste aminoácido livre na musculatura

e, em função da sua descarboxilação que gera a histamina, amina biogênica agente de

intoxicação alimentar. As espécies pelágicas, de carne escura e sabor intenso, como é

o caso da sardinha, e possuem valores médios de histidina livre na musculatura que

variam entre 100 – 500 mg% (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

3.3 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE SARDINHA ANCHOVADA

A matéria prima para os anchovados autênticos são os engraulidios, no entanto,

também podem ser elaborados peixes anchovados a partir de sardinhas (Sardinella

brasiliensis, Sardinella aurita), manjubas (Anchoviella sp.), lambaris (Astyanax

fasciatus), cavalas (Scombrer japonicus), peixes-agulha (Belone belone), entre outros.

Para tanto, são feitas adaptações na tecnologia de processamento (BEIRÃO, 1976;

OETTERER, 2005).

O princípio desta tecnologia consiste em um processo misto onde há um

aumento da pressão osmótica do meio fazendo uso de sal e mantendo o sistema em

anaerobiose. Conseqüentemente, ocorre diminuição da atividade de água, controlando

o crescimento microbiano e selecionando o tipo de organismo que exercerá a

fermentação do produto. A anaerobiose freia os processos bioquímicos fermentativos

que deterioram o pescado (OETTERER, 2005).

Page 31: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

31

Segundo Sikorski (1990), o cloreto de sódio é um dos componentes mais

importantes, tanto para a determinação do sabor como para os processos químicos da

fermentação ocorrer adequadamente.

No item 4.2.1 do presente trabalho está descrito o fluxograma de anchovamento

da sardinha sendo quatro os Pontos Críticos de Controle (PCC) podendo ser

observados no Anexo 9.1.1.

O primeiro é na recepção do pescado, onde são observadas a presença de

sardinhas deterioradas e a temperatura da matéria-prima, a qual deve estar menor a

4,4 °C (FDA, 2007a). O segundo PCC é no período da fermentação onde se faz o

controle da concentração de sal. Dentro deste PCC, estão inclusos o não re-

aproveitamento das salmouras e a higienização adequada das barricas. O terceiro PCC

é no momento da prensagem, onde se tem o cuidado de retirar o excesso da salmoura,

adequadamente, através do controle da pressão e do tempo. O último PCC é na fase

de embalagem do produto. Neste ponto, é feita a aferição das balanças para que não

ocorra erro na pesagem do produto. O aparelho de vácuo é aferido para que não

ocorram problemas com a vedação das embalagens. E as embalagens prontas são

inspecionadas para averiguar se a vedação esta adequada e/ou existem problemas na

embalagem.

3.3.1 Salga

A salga de pescados é um dos mais antigos meios de conservação de alimentos.

Seu princípio está baseado no emprego do sal que, em concentração adequada,

diminui ou até mesmo impede a decomposição do alimento, quer seja pela autólise,

quer seja pela ação de microorganismos (SETOR 1, 2007).

Na salga a ação do sal é dupla, desidrata o pescado por diferença de pressão

osmótica entre o meio externo e interno, e penetra na carne, baixando a atividade de

água. O tempo em que os pescados são mantidos em contato com o sal ou salmoura é

conhecido como tempo de salga ou de cura. Muitas vezes o processo de salga é

somente uma operação preliminar dos processos de defumação, secagem ou

marinagem, visando nesses casos conferir certo sabor ao produto final (ibid).

Page 32: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

32

3.3.2 Processo de fermentação

A fermentação do pescado se inicia através da ação de bactérias, inclusive as

intestinais. Alterações enzimáticas e químicas (como a oxidação das gorduras)

ocorrem mesmo em temperatura de refrigeração. Após utilizarem os compostos

solúveis como a histidina livre, a uréia e o óxido de trimetilamina, as bactérias

degradam as proteínas (OETTERER, 1999). A hidrólise da proteína também é induzida

por enzimas proteolíticas tissulares do peixe, além das enzimas proteolíticas produzidas

por bactérias halofílicas (DISSARAPHONG et al., 2007).

Na fermentação ocorre a conversão das proteínas insolúveis do pescado em

formas solúveis. Neste processo, ocorre a degradação gradual da actomiosina em

peptídeos e aminoácidos, que são solúveis em baixa concentração iônica. Esses

compostos nitrogenados solúveis constituem uma fração precipitada por ácido

tricloracético e uma fração não coagulável. As proteínas degradadas da carne do

pescado se difundem na salmoura, onde ocorre o aumento de nitrogênio amínico e de

nitrogênio não protéico no pescado, enquanto frações de nitrogênio protéico passam

para a salmoura. Ao final do processo de fermentação, estão presentes, entre outros,

os aminoácidos histidina, alanina, leucina, fenilanina, prolina, e ácido glutâmico

(OETTERER, 2005).

Bioquimicamente, a fermentação é o processo metabólico no qual carboidratos e

compostos relacionados são parcialmente oxidados, resultando na liberação de

energia, sem aceptores de elétrons externos. Os aceptores finais de elétrons, no

produto fermentado, são compostos orgânicos produzidos da quebra de carboidratos.

Conseqüentemente, ocorre a oxidação incompleta do composto original, resultando na

liberação de pequena quantidade de energia ao longo do processo (JAY, 2005).

O “flavour” característico do produto é obtido de uma mistura basicamente

constituída de aminas, ácidos orgânicos e aminoácidos. As aminas aparecem no

produto final, pois alguns microrganismos possuem a capacidade de descarboxilar os

aminoácidos. A amônia está presente durante todo o processo, com pequena variação

e, juntamente com a trimetilamina, constitui o nitrogênio volátil total. Além do mais, a

relação entre a concentração de aminas e de aminoácidos é usada como um indicador

Page 33: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

33

de qualidade em fermentados líquidos. Uma alta taxa de nitrogênio volátil total indica

deterioração de origem bacteriana e um produto de má qualidade nutricional e

sensorial. O aroma amoniacal excessivo não é desejável e, a presença de

componentes sulfurados como as metilmercaptanas ou o ácido sulfídrico, se presentes,

mesmo em pequenas quantidades, promovem um aroma característico do pescado

fermentado (OETTERER, 2005).

3.3.3 Indústria do anchovado

No Brasil, a produção de anchovados, utilizando como matéria-prima a sardinha

(Sardinella brasiliensis), ocorre em escala industrial pequena. É um produto semelhante

ao produzido em Portugal. O tempo de produção é longo devido a fermentação e a cura

necessárias para o produto atingir as características sensoriais desejáveis

(OETTERER; PERUJO, 2003).

Geralmente o consumo é restrito, pois é um produto vendido como

”delicatessen”, sendo pouco conhecido pela população, a não ser os descendentes de

europeus e orientais que ainda mantém hábitos dos países de origem. O produto em

questão é mais conhecido como “aliche”, utilizados na elaboração de pizzas e produtos

correlatos (ibid).

3.4 HISTAMINA

A histamina é uma amina biogênica formada pela descarboxilação da histidina,

aminoácido essencial para animais em crescimento, que está presente em

concentrações medianas a altas em peixes pelágicos (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

As aminas biogênicas se formam, nos alimentos, pela descarboxilação

microbiana de seus aminoácidos precursores ou se formam, nos seres vivos, como

conseqüência dos processos metabólicos celulares normais (SANCHES – CASCADO,

2005). São compostos orgânicos nitrogenados de caráter básico presentes em animais,

plantas e microrganismos (BRINK2, 1990 apud SANCHES – CASCADO, 2005).

2 BRINK, B.; DAMIRIK, C.; JOOSTEN, H. M. L. J.; HUIS IN’T VELD, J. H. J. Occurrence and formation of biologically active amines in foods. International Journal of Food Microbiology. v.11. p.73-84, 1990.

Page 34: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

34

Marinét-Font et al. (1995) classificaram as aminas biogênicas mais freqüentes

nos alimentos, de acordo com a estrutura química, como: aminas aromáticas

(histamina, β-feniletilamina, tiramina, octopamina, dopamina, serotonina e triptamina),

diaminas alifáticas (putrescina e cadaverina) e poliaminas alifáticas (agmatina,

espermina e espermidina).

Na caracterização física feita por Contreras–Guzman (1994), a histamina possui

peso molecular 111,2, a tiramina 137,18, a triptamina 160,2, a putrescina 88,15, a

cadaverina 102,18, a agmatina 130,2, a espermina 202,35 e a espermidina 145,25.

Na Figura 2, observa-se o esquema simplificado das rotas biossíntéticas,

permitindo verificar os aminoácidos precursores das diferentes aminas biogênicas.

A histamina é um componente natural e fisiológico dos mamíferos, estando

presente nos mastócitos e basófilos. Seus efeitos biológicos são observados quando é

liberada em grande concentração no organismo em conseqüência, principalmente, de

reações alérgicas (LEHANE; OLLEY, 2000; SHALABY, 1996).

Fonte: Sanches – Cascado, 2005. Figura 2 – Figura esquemática da formação de aminas biogênicas

a partir dos respectivos aminoácidos precursores.

Normalmente, a histamina está presente no corpo humano em baixos níveis de

concentração e também é encontrada em alimentos como peixes, queijos, carnes,

vinhos e produtos fermentados (ROSSANO et al., 2006).

Existe grande preocupação com a presença da histamina nos alimentos devido

as suas implicações toxicológicas para a saúde humana quando ingeridas em

Page 35: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

35

quantidades que possam causar reações adversas. Estas quantidades variam de

acordo com a sensibilidade de cada indivíduo bem como a presença de outras aminas

biogênicas que podem potencializar a ação intoxicante da histamina (LEHANE; OLLEY,

2000). Uma característica importante a ser destacada em relação a histamina é a sua

capacidade de ser termoestável (HUSS, 1997).

3.4.1 Mecanismos de formação

Aminoácidos livres no músculo e produzidos pela decomposição de proteínas

podem sofrer descarboxilação e desaminação por ação de enzimas bacterianas. A

histidina descarboxilase age sobre o aminoácido histidina transformando-a em

histamina (HUSS, 1997; OGAWA; MAIA, 1999; LEHANE; OLLEY, 2000).

As principais bactérias responsáveis pela formação de histamina pertencem à

família Enterobacteriaceae (HALÁSZ et al., 1994; LEHANE; OLLEY, 2000). No entanto,

outras bactérias também produzem enzimas descarboxilases, podendo ser citadas

algumas bactérias ácido láticas (SUZZI; GARDINI, 2003) como o Enterococcus spp.

(GARDINI et al., 2001; GIRAFFA, 2002) e o Tetragenococcus muriaticus (KUDA et al.,

2006; SATOMI et al., 1997). A histidina descarboxilase está amplamente distribuída nos

gêneros Escherichia, Salmonella, Clostridium, Bacillus e Lactobacillus (HALÁSZ et al.,

1994).

Segundo Níven et al. (1981), a responsabilidade das bactérias que contem a

histidina descarboxilase pode ser difícil de detectar, pois estas fazem parte da minoria

das microbiota do pescado fresco, além de serem facilmente destruídas subseqüentes

ao congelamento.

Contudo, existem alguns fatores que interferem na formação de histamina e de

outras aminas biogênicas como, a disponibilidade de substrato, o pH, a Atividade de

água, a concentração de sal e a temperatura considerados fatores limitantes (BOVER-

CID et al., 2001; GÖKUĜLU, 2003).

O de pH é um fator importante, pois interfere na descarboxilação dos

aminoácidos, que ocorre em maior concentração em meio ácido. O valor ótimo de pH

está entre 4,0 e 5,5, pois nesta faixa a bactéria é estimulada a produzir mais

descarboxilases como forma de defesa ao meio ácido (HALÁSZ et al., 1994). Além do

Page 36: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

36

mais, alguns microrganismos, como as bactérias ácido láticas, são favorecidas pelo

meio ácido por promoverem inibição da microbiota acompanhante (FRANCO;

LANDGRAF, 1996).

A alta concentração de cloreto de sódio (NaCl) influencia o metabolismo

bacteriano e gera progressiva alteração na membrana onde estão localizadas as

enzimas de descarboxilação. Concentrações de 3,5 a 5,5% de NaCl podem inibir a

formação de histamina (HENRY e KOEHLER3, 1986 apud SUZZI; GARDINI, 2003).

A temperatura influencia de diferentes maneiras na formação de aminas

biogênicas. São citados ainda como fatores intervenientes a curva de crescimento, o

metabolismo e a atividade enzimática bacteriana. Somado a isto, a temperatura

também influi na atividade proteolítica e de descarboxilação bacteriana, além da inter-

relação da população microbiana. Temperaturas elevadas favorecem a proteólise e a

reação de descarboxilação, resultando no aumento da concentração de aminas (SUZZI;

GARDINI, 2003).

No entanto, Huss (1997) relatou que, para os sistemas enzimáticos, a

temperatura tem dois papéis que podem exercer efeitos opostos na velocidade da

reação enzimática. Ao mesmo tempo em que o aumento da temperatura acelera a

velocidade da reação enzimática, este aumento também pode gerar a desnaturação da

enzima, diminuindo a reação.

A Atividade de água (Aa) influi na formação de aminas biogênicas em função da

diminuição do metabolismo bacteriano. As bactérias necessitam de água de forma

disponível para seu metabolismo e multiplicação (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

A adição de sais provoca a redução do valor da Atividade de água, que,

juntamente com a temperatura, influem no metabolismo bacteriano. A Aa, temperatura e

disponibilidade de nutrientes são interdependentes. Assim como o pH, a Aa

desfavoráveis provocam o aumento da fase lag de multiplicação bacteriana (FRANCO;

LANDGRAF, 1996; JAY, 2005). Contudo, quando as células bacterianas crescem em

meio com alta osmolaridade e sem osmoprotetores, esse organismo pode sintetizar

trealose, açúcar que se liga aos fosfolipídios e serve como osmoprotetor (JAY, 2005).

3 HENRY, K. D.; KOEHLER, P. E. Effects of salt concentration and incubation temperature on formation of histamine, phenethilamine, tryptamine and tyramine during miso fermentation. Journal of Food Protection. v.49. p.423-427, 1986.

Page 37: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

37

3.4.2 Atuação da histamina e sintomatologia da intoxicação

A histamina é uma amina vasoativa que pode causar alterações na pressão

sangüínea, cefaléia, hipertensão, complicações renais e, em casos mais graves, pode

causar hemorragia cerebral e morte (ANTILA, 1983; KUHN; LOVENBERG, 1982). Em

muitos casos de intoxicação por histamina após o consumo de peixes fermentados não

há comunicação e registro, pois os sintomas da intoxicação muitas vezes são

semelhantes a processos alérgicos (TSAI et al., 2006).

Segundo Huss (1997), o corpo humano pode tolerar uma determinada

quantidade de histamina sem que haja reação, pois duas enzimas (Diamina Oxidase –

DAO e Histamine N-metiltransferase - HMT) atuam sobre a histamina, sendo este o

mecanismo de detoxificação da histamina (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

Para que a histamina possa atuar no organismo humano, esta deve passar pela

barreira intestinal gerada pela enzima DAO, presente no intestino delgado. A DAO age

sobre a histamina através da desaminação oxidativa. Em seguida, esta mesma amina

biogênica tem que ultrapassar a barreira da ação da HMT, enzima presente em todos

os tecidos que possuem como mecanismo predominante a metilação, gerando

compostos como a N – Metil-histamina, o N – Metilimidazol acetoaldeído e o N – Ácido

metil – imidazolacético. (WETTERQVIST4, 1978 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

A Figura 3 demonstra a reação de detoxificação da histamina.

HISTAMINA

N – Acetil Histamina DAO N- HMT N α – Metil Histamina

Imidazol Aceto Aldeído N t – Metil Histamina

Àcido Imidazol Acético + ribose N t – Metilimidazol Acetaldeído

Àcido Ribose – Imidazolacético N t – Ácido Metil Imidazolacético Fonte: TAYLOR5, 1986.

Figura 3 – Esquema ilustrativo da detoxificação da histamina e seus respectivos metabólitos.

4 WETTERQVIST, H. Histamine metabolism and excretion. In: Handbook of Experimental Pharmacology. Vol II. Editora M. Rocha e Silva: Springer-Verlag, New York, p.131-150, 1978.

Page 38: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

38

A histamina exerce sua toxicidade interagindo com os receptores de histamina

(H1, H2 e H3) presentes nas membranas celulares. O sintoma mais comum é resultante

da ação cardiovascular da histamina, que gera dilatação dos vasos periféricos,

causando urticária, hipotensão, eritema e cefaléia. A histamina induz a contração da

musculatura intestinal promovendo dores abdominais, diarréia e vômito (TAYLOR5,

1986 apud CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

Mesmo havendo um consenso de que a histamina é o principal agente desta

intoxicação alimentar, não existe nenhuma relação “dose-resposta” estabelecida. Além

do mais, existem fatores individuais que interferem na ação intoxicante da histamina,

como o peso dos indivíduos, as diferenças no metabolismo, a ingestão de

medicamentos que podem interferir nas enzimas DAO e HMT, as reações

idiossincrásicas e as reações verdadeiramente alérgicas (LEHANE; OLLEY, 2000).

Os sinais e sintomas da intoxicação pela histamina podem aparecer minutos ou

horas após o consumo do alimento. Os sintomas normalmente duram algumas horas,

mas podem durar dias. Os primeiros sinais são cutâneos (urticária, eritema, edema),

seguidos por sinais gastrointestinais (náusea, vômito, diarréia) e hemodinâmicos

(hipotensão). Por último aparecem os sinais neurológicos: cefaléia, palpitação,

queimação, prurido, formigamento, tremor e zumbido. Em muitos casos há bronco-

espasmo e alterações respiratórias (SHALABY, 1996; WU et al., 1997)

Muitos pesquisadores relatam que a histamina poderia ter sua ação intoxicante

potencializada em função do bloqueio ou diminuição da ação enzimática sobre a

histamina.

A presença de outras aminas biogênicas como cadaverina, putrescina e tiramina

podem ser responsabilizadas pela potencialização da ação da histamina, pois estas

inibem a DAO e N-HMT aumentando sua absorção intestinal. Algumas substâncias

farmacológicas como a izoniazida (antibiótico usado no tratamento de tuberculose), o

ácido clavulânico, o verapamil (medicamento utilizado em pacientes cardíacos),

medicamentos inibidores da MAO (utilizado em tratamentos de indivíduos depressivos)

5 TAYLOR, S. L. Histamine food poisoning toxicology and clinical aspects. CRC Critical rev. in: Toxicology 17:91-117, 1986.

Page 39: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

39

e outros fármacos também podem inibir a ação da enzima DAO, aumentando a

absorção de histamina (LEHANE; OLLEY, 2000; TAYLOR, 1990).

3.4.3 Padrões nacionais e internacionais

O Brasil não possui legislação específica para normatizar a presença de

histamina em sardinhas anchovadas. Por esta razão, algumas indústrias nacionais

fazem uso de legislação européia (C.E. nº 2073/2005 da Comissão de 15 de novembro

de 2005), que estabelece o valor de 400 ppm como limite máximo de histamina

presente e produtos da pesca que tenham sido submetidos a tratamento de

fermentação enzimática em salmoura, fabricados a partir de espécies de peixes

associadas ao elevado teor de histidina.

Após extensa procura, não foi possível encontrar outras legislações

estabelecendo limites para a presença de histaminas em peixes anchovados. Acredita-

se que este fato possa ocorrer pela simples falta desta legislação ou por alguma

restrição lingüística, uma vez que este tipo de produto é muito consumido na Ásia e as

respectivas legislações estejam escritas nos idiomas da região.

O R.I.I.S.P.O.A. (BRASIL, 1997a) e a Portaria n° 185 - Regulamento Técnico de

Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL, 1997b) determinam como valor

máximo para a concentração de histamina, 100 ppm. Para o mesmo produto, o FDA

(2007a) estabelece 50 ppm, e a Comunidade Européia, 200 ppm de histamina (C.E.,

2005) como valores limítrofes máximos para produtos da pesca de espécies de peixes

associadas ao elevado teor de histidina.

3.5 MICROBIOLOGIA DO PESCADO

Segundo Vieira (2004), o peixe possui microbiota própria que sofre alterações

dependentes de fatores externos como a contaminação ambiental conseqüente do

lançamento de esgotos e cursos de águas poluídas. A biota do peixe reflete a água

onde vive (JAY, 2005).

A microbiota do peixe marinho é predominantemente halofílica. Porém, o uso de

gelo como agente refrigerador promove diminuição da salinidade e permite que a

Page 40: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

40

população euraliana (bactérias com habilidade para tolerar larga amplitude de

salinidade) se desenvolva (VIEIRA, 2004).

3.5.1 Microrganismos veiculados pelo pescado

Em trabalho realizado por Leitão et al. (1983), com pescado de origem marinha,

foi destacado que as bactérias presentes nos peixes encontram-se,

predominantemente, na superfície da pele e vísceras. Ogawa e Maia (1999) afirmam

que, além da pele e vísceras, as guelras também apresentam contaminação bacteriana

quando o pescado está vivo passando os demais tecidos a serem infectados após a

morte do animal.

Segundo Hagler e Hagler (1991), a maioria das bactérias marinhas são bacilos

Gram negativos, móveis, anaeróbios facultativos e psicrofílicos. Estes autores

afirmaram que os gêneros prevalentes na água do mar são Pseudomonas, Vibrio,

Spirillum, Alcaligenes e Flavobacterium. Outros gêneros que também fazem parte da

microbiota natural do pescado são: Moraxella, Shewanella e Micrococcus (FRANCO;

LANDGRAF, 1996).

Novotny et al. (2004) realizaram um estudo sobre o potencial de contaminação

humana por bactérias patogênicas transmitidas pelos peixes e seu ambiente aquático e

afirmaram que infecções causadas por patógenos transmitidos pelo pescado são

comuns e dependem do habitate, da localização geográfica, da forma como é realizada

a pesca, da temperatura da água, da estação do ano, da qualidade e salinidade da

água e das condições, desde a produção até a comercialização do produto, estação do

ano, além dos hábitos alimentares e do estado imunológico do consumidor.

Dentre as bactérias patógenas associadas ao consumo de peixes e seus

derivados destacam-se: Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio cholerae,

Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus spp., Salmonella spp., Shigella spp.,

Escherichia coli (NOVOTNY et al., 2004).

Observando que o ambiente marinho tem sofrido constante contaminação por

causa da emissão de esgotos ao mar, é importante ter em mente que algumas

bactérias comuns ao trato gastrintestinal dos homens e animais, com capacidade de

resistir a condições adversas, podem estar presentes neste ambiente (GIRAFFA, 2002).

Page 41: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

41

3.5.2 Bactérias halófílicas e halotolerantes

As bactérias que conseguem se desenvolver e mesmo necessitam de altas

concentrações salinas são denominados halófilos e aqueles que sobrevivem, mas não

crescem e nem se desenvolvem, são denominados halodúricos (JAY, 2005).

Os microrganismos ligeiramente halófilos, que crescem em meio contendo de 2%

a 5% de sal, são de origem marinha, principalmente dos gêneros Pseudomonas,

Moraxella, Acinetobacter e Flavobacterium. Aqueles que crescem em meios contendo

de 5% a 20% de sal são chamados de moderadamente halófilos tendo como exemplos

as bactérias das famílias Bacillacceae e Micrococcaceae. Bactérias que crescem em

meios contendo concentrações de 20% a 30% de sal são extremamente halófilas como

o Halobacterium spp. e Halococcus spp.. Já os patógenos Clostridium botulinum, C.

perfringens e Staphylococcus aureus são halotolerantes (OETTERER, 2005).

Em altas concentrações de sal a Atividade de água cai, sendo o valor 0,70 o

limite para o desenvolvimento de bactérias halofílicas em pescado. O pH ótimo para

crescimento situa-se entre 0,5 e 7,5 (ibid).

3.5.3 Bactérias acidoláticas

Neste grupo de bactérias, atualmente, estão agrupados 12 gêneros de bactérias

Gram-positivas: Carnobacterium; Enterococcus; Lactococcus; Lactobacillus;

Lactosphaera; Leuconostoc; Oenococcus; Pediococcus; Streptococcus;

Tetragenococcus; Vagococcus e Weissella . Este grupo não possui limites bem

definidos, porém todos apresentam a mesma característica de produzir ácido lático a

partir de hexoses. Este grupo de bactérias fermentadoras é caracterizado por não

possuir sistemas hemiligados funcionais de transporte de elétrons ou de citocromos

(JAY, 2005).

Segundo Vicenzi (2007), as bactérias ácidoláticas são anaeróbias facultativas e

possuem as seguintes características: melhor crescimento em baixa tensão de

oxigênio; são basicamente sacarolíticas; produzem grande quantidade de ácido láctico;

são divididas em homo e heterofermentativas em relação à fermentação da lactose;

possuem mecanismos biossintéticos pobres, sendo necessário o suprimento de

carboidratos, aminoácidos, lipídios, minerais, entre outros, para que se desenvolvam;

Page 42: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

42

não usam oxigênio (O2) no seu metabolismo e, por isto, não decompõem

completamente o alimento e seus metabólitos básicos se acumulam no meio; e sua

única forma de metabolismo energético é a fermentação.

Jay (2005) explica que as bactérias que produzem ácido lático como único ou

principal produto da fermentação da glicose são designadas como homofermentativas

e, as bactérias que produzem a mesma quantidade molar de lactato, dióxido de

carbono e etanol, são as heterofermentativas.

3.5.4 Salmonella spp.

O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae e compreende

bacilos Gram-negativos não esporulados. São anaeróbios facultativos, produzem gás a

partir de glicose e são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. Este

gênero abriga as espécies causadoras da febre tifóide (Salmonella typhi), das febres

entéricas (S. paratyphi A, B e C) e das enterocolites por Salmonella (salmoneloses)

(DOYLE; CLIVER, 1990; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

O pH ótimo para a multiplicação das salmonelas fica próximo de 7,0, sendo que

valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 são bactericidas. Dependendo da natureza do

ácido presente no meio, o pH mínimo pode subir para 5,5. O ácido acético, o ácido

propiônico e o ácido butírico são mais inibitórios que o ácido clorídrico para um mesmo

pH. As salmonelas não toleram concentrações de sal superiores a 9% (FRANCO;

LANDGRAF, 1996).

Como a Salmonella spp. pode se multiplicar facilmente em alimentos de origem

animal e sua dose infectante varia de 10 células a milhões delas, dependendo de

fatores humanos e do tipo de alimento, fatores extrínsecos e intrínsecos, sua ausência

em produtos alimentícios é exigida na maioria dos países (AMSON et al., 2007).

A salmonelose é um sério problema para a saúde coletiva. O gênero reúne mais

de 2300 sorovares diferentes, mas somente uma minoria está relacionada á ocorrência

de infecções no homem (PIGNATO et al., 1995). Os sintomas incluem diarréia, dores

abdominais, vômito, cefaléia, desidratação e febre. A severidade dos sintomas irá variar

de acordo com a imunocompetência do indivíduo intoxicado (DOYLE; CLIVER, 1990).

Page 43: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

43

O trato intestinal de animais (pássaros, répteis, animais de granja, homem e

insetos) é o habitat primário da Salmonella spp. Desta forma, os microrganismos são

excretados nas fezes, a partir das quais podem ser transmitidos por insetos e por outros

organismos vivos para variados destinos. Assim sendo, a Salmonella spp. também

pode ser encontrada na água, especialmente a poluída por esgoto. (JAY, 2005), e a

contaminação das águas torna o pescado uma fonte em potencial de bactérias

patogênicas como a Salmonella spp. (NOVOTY et al., 2004).

Existem algumas metodologias descritas, que são demoradas e complexas, para

o isolamento e identificação de Salmonella spp. dos alimentos, podendo levar até sete

dias para realizá-las. No entanto, foi desenvolvido por Rambach (1990) um meio de

cultura que facilita a diferenciação de Salmonella spp. de outros membros da família

Enterobacteriaceae. Pignato et al. (1995), observando as características do meio de

Rambach, desenvolveram metodologia que reduz o isolamento e identificação da

Salmonella spp. em até 48 horas.

3.5.5 Coliformes totais e fecais (Escherichia coli)

O grupo dos coliformes totais é composto por bactérias da família

Enterobacteriaceae caracterizados pela capacidade de fermentar a lactose produzindo

gás quando estes são incubados a 35-37 °C, por até 48 horas. São bacilos Gram-

negativos não formadores de esporos. Dentre os pertencentes a este grupo, pode-se

dizer que há predominâncias dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e

Klebsiella. São utilizados como indicadores microbiológicos para a avaliação da

qualidade dos alimentos (FRANCO; LANDGRAF, 1996; HARRIGAN, 1998; JAY, 2005).

Os coliformes podem crescer em temperaturas que variam de -2 °C a 50°C. No

entanto, nos alimentos, o crescimento deste grupo é pobre e lento em temperaturas

baixas. Podem crescem na faixa de pH entre 4,4 e 9,0. Uma característica importante

deste grupo e que favorece seu isolamento seletivo é a capacidade de crescimento em

presença de sais biliares, os quais inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas

(JAY, 2005).

Dentro do grupo dos coliformes totais está o grupo dos coliformes fecais que

possuem a capacidade de continuar fermentando a lactose com produção de gás,

Page 44: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

44

quando incubadas à temperatura de 45 °C +/- 0,5 °C. O principal representante deste

grupo é a Escherichia coli (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

A E. coli é o organismo aeróbio mais freqüente no trato digestivo do ser humano

e dos animais de sangue quente. Em geral, as estirpes de E. coli que colonizam o trato

gastrintestinal são comensais inofensivas ou desempenham um papel importante na

manutenção da fisiologia intestinal (FDA, 2007b; HUSS, 1997). No entanto, mesmo não

sendo patogênicas, podem ser oportunistas e causar infecções em indivíduos

imunocomprometidos. Deve ser registrada ainda a existência de algumas cepas de E.

coli patogênicas que, quando ingeridas, causam infecções gastrintestinais em

indivíduos saudáveis (FDA, 2007b).

Na RDC n° 12 (BRASIL, 2001), do Ministério da Saúde, foi estipulado o valor

máximo de 102 coliformes por grama de alimento, em três, das cinco amostras de

semiconservas de pescado colhidas.

3.5.6 Staphylococcus coagulase positiva

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos pertencentes à

família Micrococcaceae. São anaeróbios facultativos, tolerantes a concentrações de

10% a 20% de NaCl, produzem toxinas entre 10 °C a 46 °C, crescem na faixa de pH de

4 a 9,8 e em ambientes com Atividade de água de até 0,83 (FRANCO; LANDGRAF,

1996).

Segundo Vieira (2004) e Novotny et al. (2004), dentre as bactérias causadoras

de intoxicações ligadas ao consumo de pescado, destaca-se o Staphylococcus aureus,

o melhor representante das estirpes enterotoxigênicas de Staphylococcus coagulase

positiva.

Leitão et al. (1983) dissertam que esta última bactéria não faz parte da

microbiota natural do ambiente marinho e do pescado, sendo sua presença neste

alimento oriunda, principalmente, do manuseio ou do contato com superfícies

higienizadas inadequadamente. Nos alimentos, podem se multiplicar e produzir

enterotoxinas a partir de contagens de S. aureus em torno de 106 UFC/g. A ingestão da

enterotoxina pode gerar intoxicação alimentar, tendo como sintomas náusea, vômitos,

dores abdominais, diarréia e sudorese. Em casos mais graves também pode ocorrer

Page 45: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

45

cefaléia, calafrios, hipotensão arterial e, raramente, febre (AMSON et al., 2007;

CAMACHO et al., 2007; FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Na RDC n° 12 (BRASIL, 2001), do Ministério da Saúde, encontra-se como valor

máximo 5x102 estafilococos coagulase positiva por grama do alimento, em duas, das

cinco amostras de semiconservas colidas para análise. Para a realização desta

contagem, na Instrução Normativa n° 62 (BRASIL, 2003), da Secretaria de Defesa

Agropecuária do Ministério da Agricultura, determinou-se a utilização do meio de Baird

Parker suplementado com solução de gema de ovo.

3.5.7 Enterococcus spp.

Os Enterococcus spp. fazem parte do grupo das bactérias ácidoláticas (KLEIN,

2003; SUZZI; GARDINI, 2003). São cocos Gram positivos, anaeróbios facultativos,

dispostos aos pares ou pequenas correntes (DOMING et al., 2003; TENDOLKAR et al.,

2003). Podem tolerar elevadas concentrações de sal (HUGAS et al., 2003).

O gênero Enterococcus encontra-se dentro da família Enterococcaceae, junto

com os gêneros Melissococcus, Tetragenococcus e Vagococcus. Os membros típicos

do gênero Enterococcus (E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae e E.

mundtii) são facilmente distinguíveis, pois crescem em ambas as temperaturas, 10 e

45°C, em caldo contendo até 6,5% de NaCl, em pH 9,6 e em presença de 40% de bile.

Existem dados na literatura registrando a presença de Enterococcus spp. em pH 5,0

(FRANZ et al., 2003; HUGAS et al., 2003; TENDOLKAR et al., 2003).

Este microrganismo pode ser utilizado como indicador de higiene do alimento,

baseado na capacidade de sobreviver em condições ambientais adversas, somado à

possibilidade de estar presente no trato intestinal de homens e animais e à resistência a

temperaturas elevadas (DOMING et al., 2003; GIRAFFA, 2002).

Infecções do trato urinário, abdômen, endocárdio e vias biliares podem ser

causados pelo Enterococcus spp. Além do mais, outro ponto que vem se tornando

preocupante é a capacidade que esta bactéria vem desenvolvendo, no sentido do

aumento da sua resistência em relação aos antimicrobianos (DOMING et al., 2003).

Porém, Hugas et al. (2003) destacaram que o Enterococcus spp. possui um

papel importante em alimentos fermentados pois algumas espécies podem produzir

Page 46: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

46

enterocinas com atividade antimicrobiana que agem sobre a microbiota patogênica

possivelmente presente no alimento.

Em contrapartida, a capacidade de produzir descarboxilases, com conseqüente

formação de aminas biogênicas, também gera preocupação. Fatores como o pH,

temperatura e concentração de NaCl interferem na produção das aminas biogênicas

por intervirem na curva de crescimento do Enterococcus faecalis (GARDINI et al.,

2001).

Sob estes aspectos, os Enterococcus spp. tornaram-se o centro de muitas

atividades de pesquisa e preocupação em relação à saúde coletiva. De um lado,

participam de importantes funções em vários produtos fermentados e, de outro, é

utilizado como indicador de contaminação fecal, além da existência de algumas

espécies que tem algum potencial patogênico (DOMING et al., 2003).

Page 47: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

4 MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado em duas etapas. A primeira consistiu na avaliação da

qualidade de peixes anchovados disponíveis no comércio varejista, de origem nacional

e importada. Estes produtos foram avaliados através de parâmetros bacteriológicos e

físico-químicos, em um total de vinte amostras.

A segunda etapa do trabalho consistiu no acompanhamento da produção de

sardinhas anchovadas produzidas em uma indústria localizada em Ubatuba–SP,

avaliando-se, através de parâmetros físico-químicos e bacteriológicos, diversas etapas

até o produto final. Também foram elaborados, com participação da indústria, duas

alternativas tecnológicas distintas da usual da empresa as quais foram acompanhadas

pelos mesmos parâmetros anteriormente citados. O acompanhamento dos processos

foi iniciado com a avaliação da matéria prima e finalizado com a avaliação do produto

final.

As amostras foram analisadas nos Laboratório de Controle Microbiológico e

Físico-químico do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Faculdade de

Veterinária da Universidade Federal Fluminense.

4.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA

No mercado varejista, é possível encontrar diferentes marcas de produtos

anchovados de diferentes origens, tanto nacional como importados (Itália, Marrocos,

Peru e Argentina). São produtos elaborados com variadas matérias primas, tais como

sardinhas (Sardinella brasiliensis), anchovas (Engraulis spp.) e anchovetas (Engraulis

ringens).

Page 48: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

48

Figura 4 – Diferentes embalagens de peixes anchovados encontradas no mercado varejista.

As 20 (vinte) amostras foram adquiridas em supermercados e lojas de

“delicatessen” da cidade de Niterói, Estado do Rio de Janeiro e transportadas para os

Laboratório de Controle Microbiológico de Produtos de Origem Animal e para o

Laboratório de Controle Físico-Químico de Produtos de Origem Animal, nas condições

de comercialização.

Nos estabelecimentos, o produto pôde ser encontrado sob diferentes formas de

comercialização (Figura 4). Dentre estas, foram adquiridas amostras a granel,

enlatadas, embaladas em vidro (com tampa rosqueada ou tampadas a vácuo) e

embaladas em potes de plástico rígido possuindo tampas com lacre.

4.1.1 Análises bacteriológicas

As análises bacteriológicas foram baseadas na resolução RDC nº 12 (BRASIL,

2001), sendo realizadas de acordo com a Instrução Normativa nº 62 de 26 de agosto de

2003 (BRASIL, 2003).

Segundo a RDC nº 12 (BRASIL, 2001), para produtos de pesca como

semiconservas de anchovados, são previstas as seguintes análises bacteriológicas:

enumeração de coliformes, contagem e identificação de Staphylococcus coagulase

positiva e isolamento e identificação de Salmonella sp.

A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista na legislação supracitada e

foi realizada devido à resistência da bactéria a condições adversas.

Page 49: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

49

4.1.1.1 Preparo dos meios de cultura

Para a realização das análises bacteriológicas, os meios de cultura foram

preparados de 15 em 15 dias, em quantidades proporcionais a cada amostragem, com

a finalidade de manter as propriedades nutricionais e/ou bioquímicas dos meios de

cultura. Para tanto, as indicações fornecidas pelos fabricantes foram seguidas

fidedignamente.

Foram utilizados materiais esterilizados e descartáveis para a realização dos

procedimentos analíticos, tais como: “eppendorfs”, placas de Petri, ponteiras para

pipetador e sacos de “stomacher”.

Para averiguação da eficiência de esterilização em autoclave (Fabbe ®) foi

utilizado o sistema bioindicador de checagem Sterikon ® da Merck ® (nº 10284),

constituídos de caldo nutriente, glicose, indicador de pH e esporos de Bacillus

stearothermophilus DONK (ATCC 7953), atualmente denominado Geobacillus

stearothermophilus (ATCC 7953).

As ampolas foram colocadas no interior da autoclave juntamente com o material

a ser esterilizado a 121 °C por 15 minutos. Quando o material foi retirado da autoclave,

as ampolas foram incubadas por 24 a 48 horas a 60 °C. Uma ampola não esterilizada

pode ser incubada em conjunto para servir de controle.

Sendo a esterilização adequada, os esporos de Bacillus stearothermophilus

serão destruídos e o conteúdo da ampola ficará com coloração violeta clara (Figura 3).

Se a esterilização não for eficiente, o esporo passará a sua forma vegetativa e o

conteúdo da ampola apresentará coloração amarela em função da produção de ácidos

resultantes da fermentação da glicose. Há também a turvação do meio pelo

crescimento bacteriano.

4.1.1.2 Enumeração de Coliformes totais e fecal (Escherichia coli)

A metodologia utilizada para esta análise bacteriológica (MERCK, 2002

modificada por FRANCO e MANTILLA, 2004) teve por objetivo, além da Enumeração

de Coliformes e Escherichia coli, reduzir o consumo do meio de cultura utilizado, o

Fluorocult ® caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (Merck ® n° 12588), através

da técnica de miniaturização (MERCK, 2002).

Page 50: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

50

De cada amostra, foram obtidas subamostras de 25 g, pesadas assepticamente,

acondicionadas em envelope de “stomacher” e homogeneizada com solução salina

peptonada a 0,1 % (SSP 0,1%), em “stomacher” (Seward ®) por dois minutos em

velocidade normal.

A partir da diluição de 225 mL de SSP 0,1% e 25 g da amostra (diluição 10-1)

preparou-se a diluição de 10-2 retirando-se uma alíquota de 100 µL da primeira diluição

previamente homogeneizada e colocando-a em microtubos tipo “eppendorf” esterilizado

contendo 900 µL de SSP 0,1 %. Após homogeneização da segunda diluição, uma

alíquota de 100 µL desta foi retirada e colocada em um terceiro “eppendorf” esterilizado

contendo 900µL de SSP 0,1%. Assim prepararam-se três diluições de cada amostra

(10-1, 10-2 e 10-3).

Destas diluições, retiraram-se três alíquotas de 100 µL e, cada uma delas, foi

distribuída em microtubo tipo “eppendorf” contendo 1 mL de Fluorocult ® previamente

preparado, esterilizado e distribuído em ““eppendorfs” esterilizados de 1,5 mL. Assim

sendo, de cada amostra obtiveram-se três diluições em SSP 0,1%, e, de cada diluição,

três repetições na semeadura do Fluorocult ® (Figura 5), encubando-as por 24 a 48

horas a 35 – 37 °C.

B

A

Figura 5 - Microtubos tipo “eppendorf” contendo os meios de cultura Fluorocult ® (A) e Chromocult ® (B), agrupados por amostras.

O Flourocult ® caldo LMX modificado por Manafi e Ossmer (MERCK, 2002) é um

caldo de enriquecimento seletivo para a identificação simultânea de coliformes total e

Page 51: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

51

fecal (Escherichia coli). Para o crescimento de coliformes totais, o meio torna-se verde-

azulado. Se houver a presença de coliforme fecal uma fluorescência azul clara será

observada quando o cultivo é exposto à luz ultravioleta. Para a confirmação de E. coli,

umas gotas do reativo de Kovac’s são adicionadas para observar a presença de indol,

sendo esta reação positiva na ocorrência de coloração vermelho cereja.

4.1.1.3 Enumeração de Enterococcus spp.

A metodologia utilizada para esta análise bacteriológica (MERCK, 2002

modificado por FRANCO e LEITE, 2005) teve por objetivo a Enumeração de

Enterococcus sp. e redução do consumo do meio de cultura utilizado, o Chromocult ®

Enterococci Broth (Cat n° 110294) (MERCK, 2002), através da técnica de

miniaturização.

As três diluições de SSP 0,1% preparadas para a semeadura do Fluorocult®

também foram utilizadas para semear o Chromocult ®. Para tanto, foram realizadas de

cada diluição, três repetições (Figura 5) e os meios semeados foram incubados por 24 a

48 horas a 45 +/- 0,5 °C.

O Chromocult ® é um caldo de enriquecimento seletivo que se torna azul

esverdeado quando houver crescimento positivo. A turbidez do meio pode ser fraca.

4.1.1.4 Contagem e Identificação de Staphylococcus coagulase positiva

A contagem e a identificação de Staphylococcus coagulase positiva foram

realizadas de acordo com a Normativa nº 62 da Secretaria de Defesa Agropecuária do

Ministério da Agricultura (BRASIL, 2003).

As diluições iniciais, anteriormente citadas, também semeadas em placas de

Petri contendo o meio de Agar Baird Parker ® (Merck ® n° 5406).

Inoculou-se uma alíquota de 100 µL de cada diluição na superfície do meio

espalhando-as sobre a superfície de forma homogênea com o auxilio de um bastão de

Hockey. As placas semeadas foram incubadas por 24 a 48 horas a 35 – 37 °C.

O meio de Ágar “Baird Parker” permite o crescimento seletivo de estafilococos

por conter em sua formulação o cloreto de lítio e o telurito de potássio, ambos inibidores

da microbiota acompanhante. A presença de gema de ovo no meio demonstra a

Page 52: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

52

característica da produção de enzimas lipolíticas e proteolíticas através da formação de

halos transparentes ao redor das colônias suspeitas que se mostram pretas pela

redução do telurito.

As colônias suspeitas foram repicadas para o meio Ágar BHI (“Brain and Heart

Infusion”) e incubadas por 24 a 48 horas a 35 – 37 °C para a realização de provas

bioquímicas: catalase, coagulase, DNase, Termonuclease, oxidação e fermentação da

glicose e verificação das características morfotintoriais pelo método de Gram.

4.1.1.5 Isolamento e identificação de Salmonella spp.

Para as análises de isolamento e identificação de Salmonella, a metodologia

utilizada foi a proposta por Pignato et al. (1995).

De cada amostra, foram semeadas subamostras de 25g, pesadas

assepticamente, acondicionadas em envelope de “stomacher” e homogeneizada por

dois minutos em velocidade normal com caldo Salmocyst ® base em “stomacher”

(Seward ®), sendo incubado por seis a oito horas a 35 – 37 °C, para obter o

enriquecimento não seletivo.

A partir do caldo base, retirou-se 10 mL do meio crescido transferindo-os para

um tubo de ensaio contendo o caldo Salmocyst ® suplemento (Figuras 6 A e B). Esta

etapa consiste no enriquecimento seletivo. A presença de verde brilhante e sais de bile

bovina na formulação deste suplemento inibem a microbiota acompanhante Gram

positiva. Os tubos foram incubados por 18 horas a 35 - 37 °C.

B A

Figura 6 (A e B) – Tubo de eantes de semeado (A) e após(B).

nsaio contendo caldo Salmocyst® suplemento a adição de 10ml do caldo Salmocyst® base

Page 53: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

53

Após o período de incubação do caldo Salmocyst ® suplemento, foi realizado

esfregaço em lâmina de vidro, corada pelo método de Gram, para a observação

microscópica das características morfo-tintoriais dos microrganismos presentes. A partir

do mesmo caldo suplemento, foram semeadas placas de Petri contendo o meio

cromogênico Agar Rambach ® (Merck ® n° 7500) para a realização da etapa de

plaqueamento seletivo e observação das características das colônias. A semeadura foi

realizada através da técnica de esgotamento para obtenção de colônias isoladas com o

auxílio de alça de platina (0,3 mm de diâmetro) fixada em cabo de Coli. As placas foram

incubadas por 24 – 48 horas a 35-37 °C.

AAA

DDDCCC

BBB

Figuras 7 (A, B, C, e D) – Crescimento bacteriano obtido no meio de Rambach ® a partir de repique realizado do caldo Salmocyst ® suplemento onde, (A) apresenta crescimento suspeito de Citrobacter spp., (B e D) apresentam crescimento suspeito de Escherichia spp e Klebsiella spp. e (C) apresenta crescimento suspeito de Proteus spp.

A presença do desoxicolato de sódio na formulação do meio inibe o crescimento

da flora Gram positiva acompanhante. O meio utiliza a habilidade que a salmonela

possui de produzir ácido a partir do propilenoglicol para diferenciá-la das outras

Page 54: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

54

enterobacteriáceas (Figuras 7 A, B, C e D). Somado a isto, o meio possui o cromógeno

X-Gal que permite a detecção da β – galactosidase produzida pelas outras

enterobactérias.

Assim, as colônias suspeitas de Salmonella spp. mostram-se com coloração

avermelhada em função da produção de ácido apontada pelo indicador de pH.

4.1.2 Análises físico-químicas

As análises físico-químicas foram realizadas, a partir da musculatura dorsal das

amostras de cada lote. Após separação e cominuição da musculatura dorsal, pesou-se

em balança analítica, as alíquotas de acordo com os protocolos analíticos de cada

análise fisico-química. Em seguida, estas foram embaladas em papel alumínio,

identificadas (data, peso, análise e lote) e congeladas.

4.1.2.1 Avaliação de histamina

Para avaliação da produção de histamina, utilizou-se o método de Cromatografia

em Camada Delgada (CCD) segundo a metodologia proposta por Schutz, Chang e

Bjeldanes (1976). Nas amostras, onde foi constatada a produção de histamina,

realizou-se o método quantitativo fluorimétrico segundo a metodologia preconizada pela

AOAC (2002).

4.1.2.1.1 Método de Cromatografia em Camada Delgada

Pelo emprego desta metodologia, utilizou-se uma alíquota de 1g da porção

muscular transferindo-a para tubo de ensaio e adicionando-se 2mL de metanol. Com o

auxilio de uma espátula fina foram homogeneízadas as duas fases em vórtex

(Certomat ® MV) a fim de aumentar a superfície de contato entre a porção muscular e o

metanol.

O conjunto foi aquecido em banho-maria até fervura. Neste momento, transferiu-

se o tubo de ensaio para centrifuga (Hermle ® Z 360 K) para obtenção de sobrenadante

após dois minutos a 3000 rpm.

A placa de sílica gel (Sigma ®) foi cortada com cuidado para que não houvesse

desprendimento da camada de sílica (SiO2). As marcações dos pontos de aplicações

Page 55: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

55

das amostras e dos padrões foram feitas com lápis sobre a sílica a 1,5 cm da borda

inferior. O tamanho da placa variou de acordo com o número de amostras analisadas.

De cada amostra centrifugada retirou-se 10 µL do sobrenadante, com o auxílio

de pipetador automático, aplicando-as na placa de sílica. Foram aplicados, também, os

padrões de 2 µL, 5 µL e 10 µL nos respectivos pontos da placa com o auxílio de

microseringa de 10 µL (Hamilton ®). Estes padrões equivalem aos valores de 2 mg de

histamina/100 g da amostra (20 ppm), 5 mg/100 g (50 ppm)e 10 mg/100 g (100 ppm).

Para a preparação do padrão, foram utilizados 16,6 g da histamina 2 HCL

Sigma® diluídos em 100 mL de metanol, em um balão volumétrico.

As placas aplicadas com os padrões e as amostras foram colocadas em cuba

cromatográfica com tampa, contendo um eluente previamente preparado (20 mL de

Acetona P.A. e 1 mL de Hidróxido de Amônio P.A.– 20:1 v/v). O eluente deve ser o

suficiente para cobrir o fundo da cuba, com espessura de 0,5 a 1,0 cm.

A solução eluente se desloca por capilaridade sobre a placa de sílica até 2 cm da

borda superior carreando as aminas biogênicas (histamina, putrescina e cadaverina)

que, quando presentes, se ligam à sílica em diferentes deslocamentos. Ao ser retirada

da cuba, a placa foi secada com ar fluente quente por um período de 20 minutos e em

estufa à 36 °C, para a eliminação dos vapores de amônia.

Para a visualização das aminas, a placa foi revelada aspergindo-se

uniformemente sobre a mesma, solução de ninhidrina a 0,3 % em metanol. A placa foi

secada novamente com ar fluente quente, para visualização da coloração avermelhada

que aparece em função da complexação da ninhidrina com o radical NH3 das aminas

biogênicas.

A quantificação da histamina foi feita pela comparação visual entre as manchas

formadas pelos padrões e pelas amostras, de mesmo deslocamento, além da

intensidade da cor (Figura 8).

Page 56: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

56

Figura 8 – Placa de sílica (Sigma ®) após revelação com solução de ninhidrina a 0,3%. Destaque para a presença de histamina em todas a 5 amostras de sardinha anchovada analisadas.

4.1.2.1.2 Método Fluorimétrico

O método fluorimétrico baseia-se na reação da histamina com o Ortoftaldeído

(OPT), formando um composto fluorescente.

Empregando esta metodologia, utilizou-se 10 g da amostra homogeneizando-a

com 50 mL de metanol em liquidificador (Oster ®). Com o auxílio de um funil de

polipropileno, o homogeneizado foi transferido para um erlenmeyer de 125mL.

Adicionou-se mais 50 mL de metanol no copo do liquidificador com a finalidade de

remover os resíduos da amostra que também foram transferidos para o erlenmeyer,

sendo este tampado com um pequeno quadrado de folha de alumínio.

Este extrato foi submetido a banho-maria por 15 minutos a 60°C, e, decorrido

este período, o conjunto foi filtrado em papel Whatman ® n°1 para balão de 100 mL.

Assim, foi obtido um extrato que pôde ser conservado sob refrigeração até realização

do procedimento analítico.

A purificação do extrato foi feita através da filtração de 1 mL da solução em

coluna de troca iônica. O filtrado foi transferido para um balão de 50 mL contendo 5 mL

de HCl 1N. Após a penetração do extrato na coluna, foram acrescentados 5 mL de

água destilada, deixando-a fluir. Quando o nível do líquido alcançou o nível de 2 mm

acima da resina, foram acrescentados mais 5 mL de água destilada, sucessivamente,

Page 57: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

57

até o volume de 35 mL. O fluxo foi interrompido sem permitir que a resina ficasse seca.

O volume do balão foi completado com água destilada e o filtrado homogeneizado e,

em seguida, refrigerado.

Do filtrado refrigerado, retirou-se uma alíquota de 5 mL e transferiu-se para um

erlenmeyer. Em seguida, se adicionou 10 mL de HCl 0,1N, com a finalidade de

homogeneizar a solução. Nas etapas seguintes, foram adicionados 3 mL de hidróxido

de Sódio (NaCl) 1N, 1 mL da solução 0,1 % de OPT e 3 mL de Ácido Fosfórico (H3PO4)

1,78M. Entre uma etapa e outra, sempre se procedeu à homogeneização das soluções,

sendo que após a adição da solução de OPT, a solução foi agitada de forma constante

por 4 minutos.

Também foi elaborada uma solução “branco“ da mesma forma como citado

anteriormente, diferindo somente na não adição do filtrado resfriado. Utilizamos esta

solução para zerar o fluorímetro.

Transferida a solução obtida após a adição do ácido fosfórico para uma cubeta,

foi realizada a leitura no fluorímetro (Sequoia–Turner ® Modelo 450) e os valores

obtidos foram anotados (Figura 9). Após a aplicação destes valores à fórmula para a

obtenção do resultado em ppm, foram comparados os valores obtidos com a curva

padrão.

Figura 9 – Fluorímetro (Sequoia–Turner® Modelo 450) registrando a leitura de uma das amostras analisadas.

Page 58: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

58

Preparo da resina e da coluna de troca iônica

Na conversão da resina Dowex ® (Sigma – Aldrich ®) para sua forma alcalina

utilizou-se 15 mL de Hidróxido de Sódio 2M para cada grama de resina. A mistura foi

vagarosamente homogeneizada em béquer e submetida a descanso por 30 minutos.

Após este período, a parte líquida foi dispensada e a resina lavada duas vezes com

água destilada.

A coluna de vidro foi fixada em suporte próprio para vidrarias. Ao fundo desta,

uma pequena circunferência de filtro de papel Whatman n° 1 foi colocada e, em

seguida, uma camada muito fina de lã de vidro, com a finalidade de não permitir o

arraste da resina para o balão. Colocou-se a quantidade de resina suficiente para

formar uma coluna de 8 cm de altura, e esta foi mantida submersa em água destilada

para que não perdesse a sua propriedade de troca iônica (Figura 10 A, B e C).

A B

Figuras 10 (A, B e C) - Preparação da coluna de filtração, colocando-se primeiro o papel de filtro (Whaltman nº 1) ao fundo da coluna (A), seguindo-se da adição de pequena quantidade de lã de vidro (B) posteriormente adicionando a resina de troca iônica (Dowex ®) previamente convertida a forma alcalina (C).

C

Após o uso, a resina pode ser re-utilizada através de sua regeneração. Este

procedimento é feito da mesma forma que a ativação da resina.

Preparo das soluções

Hidróxido de sódio (NaOH) 1M e 2M

Foram pesados 41,24 g e 82,48 g de NaOH P.A., respectivamente para as

soluções de 1M e 2M, e dissolvidas em 1000 mL de água destilada.

Page 59: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

59

Ácido Clorídrico (HCl) 1N e 0,1N

Pipetou-se 93 mL de ácido clorídrico concentrado e transferiu-se para um balão

volumétrico de 1000 mL, completando-se o volume com água destilada, tendo, desta

forma, a solução 1 N.

Pipetou-se 9,3 mL de ácido clorídrico concentrado e transferiu-se para um balão

volumétrico de 1000 mL, completando-se o volume com água destilada, obtendo a

solução 0,1 N.

Ácido Fosfórico (H3PO4) 1,78M

Foram diluídos 243,6 mL de ácido fosfórico para 1 L de água destilada, e

padronizou-se 500 mL do ácido com solução de hidróxido de sódio 1M, usando

fenolftaleína como indicador. Esta concentração pode ser ajustada, se necessário.

Ortoftaldeído (OPT) 0,1%

Foram dissolvidos 25 mg de OPT em 25 mL de metanol. Esta solução foi

armazenada em frasco âmbar e sob refrigeração, com atenção para a sua validade,

que é de uma semana.

Preparo das soluções padrões de histamina

Solução Stock – 1 mg/mL em base livre

Pesou-se 42,3 mg de histamina, transferindo-se para um balão de 25 mL,

dissolvidos e diluídos com ácido clorídrico 0,1 N até completar o volume. A solução foi

mantida sob refrigeração por um período de até uma semana.

Solução intermediária – 10 µg/ mL

Foram pipetados 0,5 mL da solução stock para um balão de 50 mL, com ácido

clorídrico 0,1 N até completar o volume. A solução foi mantida sob refrigeração.

Page 60: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

60

Solução padrão de trabalho

Pipetou-se 1 mL da solução intermediária, transferindo-se para um balão de 50

mL e diluindo-se com ácido clorídrico 0,1 N até completar o volume. A partir desta

solução, foram preparadas as seguintes soluções para a curva padrão, observado o

seu preparo no dia de seu uso:

1) 0,1 µg/5 mL - Pipetou-se 0,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-

a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.

2) 0,2 µg/5 mL - Pipetou-se 1 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-a

para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 4 mL de ácido clorídrico 0,1N.

3) 0,3 µg/5 mL - Pipetou-se 1,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-

a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.

4) 0,4 µg/5 mL - Pipetou-se 2 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-a

para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 3 mL de ácido clorídrico 0,1N.

5) 0,5 µg/5 mL - Pipetou-se 2,5 mL da solução padrão de trabalho, transferindo-

a para um erlenmeyer de 50 mL, onde acrescentou-se 2,5 mL de ácido clorídrico 0,1N.

Obtenção da “Curva Padrão”

As cindo soluções de trabalho foram tratadas em erlenmeyer de 50 mL com

soluções químicas através do mesmo procedimento realizado para o extrato purificado

da coluna de troca iônica das amostras (o filtrado).

Cada solução obtida foi transferida para uma cubeta, sendo realizada a leitura

no fluorímetro e anotados os valores obtidos. Estes valores foram aplicados na fórmula

a seguir para a obtenção do resultado em mg de histamina por Kg da amostra. Os

resultados foram transferidos para um gráfico representado em plano cartesiano de dois

eixos (x e y) por uma reta denominada “Curva Padrão”, como demonstrado na Figura

11.

Page 61: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

61

y = 0,217x - 0,0061R2 = 0,9676

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 0,1 0,2 0,3 0,4

ppm

Figura11 - Plano cartesiano contendo a “Curquantificação de histamina utilizada Fluorimétrico.

Cálculo da quantidade de histamina

Histamina mg / Kg = (Is – b) x 10 P x a Is = leitura da fluorescência no aparelho b = coeficiente linear da reta obtida a partir da “Curva Padrão” P = massa da amostra em g a = coeficiente linear da reta obtida a partir da “Curva Padrão” 1000 = fator de diluição

4.1.2.2 Análise da produção de Bases Voláteis Totais

Para a análise de Bases Voláteis Totais, utilizou-se o

Placas de Conway ®, descrito no Manual do LANARA (BRA

Em liquidificador, foram homogeneizados 10 g da am

de Ácido Tricloroacético (TCA) 10%. Em seguida, foi reali

funil de “Buchner” com papel Whatman ® acoplado à um Ki

extrato.

Com pipeta volumétrica de 2 mL retirou-se uma

colocada no compartimento externo da placa de mic

compartimento interno, adicionou-se 2 mL da solução de ác

Foi colocada vaselina sólida nas bordas da placa d

uma placa de vidro deixando uma pequena área aberta

solução saturada de carbonato de potássio (K2CO3) ao c

com o extrato. Rapidamente, a placa de vidro foi desliza

µg/5 mL

0,5 0,6

va Padrão” da no método

00

método de Microdifusão em

SIL, 1981).

ostra com 10 mL de solução

zada a filtração a vácuo em

tasato, sendo assim obtido o

alíquota do extrato que foi

rodifusão de Conway. No

ido bórico de Conway.

e microdifusão e sobre esta

para a adição de 2 mL de

ompartimento externo, junto

da para tampar a placa de

Page 62: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

62

microdifusão, girando-se suavemente o conjunto, com a finalidade de homogeneizar o

conteúdo externo.

As análises foram realizadas em duplicata para cada amostra e as placas

permaneceram por 2 horas em estufa à 36 °C. A última etapa do procedimento analítico

foi a titulometria de neutralização utilizando-se solução de ácido clorídrico 0,1 N com

auxílio de microbureta de 5 mL, para neutralizar as bases migradas para o

compartimento interior da placa (Figura 12).

A B C

Figura 12 (A, B e C) – Titulometria de neutralização das bases presentes no compartimento interno da placa de microdifusão de Conway (A) onde a adição de solução de ácido clorídrico 0,1 N, com auxílio de microbureta, vai alterando a cor do conteúdo (B) até completa viragem do mesmo (C).

O cálculo de mg de N-BVT por 100 g da amostra foi feito através da fórmula:

mg de N-BVT / 100 g = V x N x 14 x 100 (T + U)

Va x P

V = volume de HCL gasto na titulação N = normalidade da solução titulante 14 = equivalente grama do nitrogênio T = volume de TCA utilizado na homogeneização (10 a 50 mL) U = umidade da amostra em gramas Va = Volume do extrato analisado (2 mL) P = peso da amostra analisada (10 a 50 mL)

Preparo das soluções

Solução de Ácido Bórico de Conway

Pesou-se 5 g de acido bórico adicionando-se a 100 mL de álcool etílico e 300 mL

de água destilada. Após dissolução total, adicionou-se 5 mL do indicador de Tashiro.

Page 63: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

63

Em seguida, adicionou-se lentamente solução de hidróxido de sódio 0,1 N até produção

de coloração rósea e completou-se o volume a 500 mL .

Indicador de Tashiro

Misturou-se volume por volume de solução de vermelho de metila a 0,2% em

álcool etílico e solução de azul de metileno a 0,1 % em água destilada.

Hidróxido de sódio 0,1N

Dissolveu-se 4 g de NaOH em água destilada, completando o volume a 1000 mL

e, para eliminar o gás carbônico, adicionou-se 1 a 2 g de clotero de bário.

Solução de Ácido Tricloroacético a 10%

Pesou-se 100g de ácido tricloroacético em béquer de 500 mL e adicionou-se

água destilada até total dissolução. Transferiu-se para balão volumétrico e completou-

se o volume com água destilada até 1000 mL.

Solução saturada de Carbonato de Potássio

Pesou-se 120 g de carbonato de potássio em béquer de 500 mL e adicionou-se

100 mL de água destilada, agitando-se até dissolução completa.

4.1.2.3 Percentual de cloretos

A quantificação do teor de cloretos foi realizada pelo método de Möhr, seguindo

os procedimentos descritos no Manual do LANARA (BRASIL, 1981).

Foram utilizados de 2 a 5 g da amostra anotando o valor numérico desta

pesagem, para ser empregado posteriormente na fórmula matemática de cálculo do

percentual de cloreto. Esta massa foi colocada em cadinho de porcelana para

carbonização em bico de Bunsen, e posteriormente em forno mufla a 550 °C para

incineração (obtenção de cinzas claras).

Objetivando facilitar a dissolução das cinzas, adicionou-se ao conteúdo do

cadinho duas a tres gotas de solução de Ácido Nítrico P.A. e água destilada quente

(1:9), preparada momentos antes de sua utilização, e 10 mL de água destilada quente.

Agitou-se com bastão de vidro o conteúdo do cadinho e filtrou-se em papel Whatman ®

para erlenmeyer de 250 mL. O cadinho e o filtro de papel foram meticulosamente

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64

lavados com água destilada aquecida. Mensurou-se pH do filtrado, corrigindo-o para 8,0

com solução de hidróxido de sódio 0,1N.

Adicionou-se à solução filtrada 1 mL da solução de Cromato de Potássio

(K2CrO4) a 5% e titulou-se com solução de Nitrato de Prata (AgNO3) 0,1N até o

aparecimento da coloração vermelho tijolo.

O cálculo do percentual de cloretos foi feito com a utilização das variáveis V

(volume de AgNO3 0,1N gasto na titulação) e P (peso inicial da amostra) na fórmula que

também utiliza o fator de correção (f) e a normalidade (N) da solução de AgNO3 0,1N,

descrito a seguir:

% Cloretos = V x f x N x 0,0585 x 100

P

Preparo das soluções

Solução de Ácido Nítrico

Em gabinete de segurança, diluiu-se 1 mL de Ácido Nítrico concentrado em 9 mL

de água destilada quente. A solução foi utilizada imediatamente após o preparo, em

função da alta volatilidade do Ácido Nítrico.

Cromato de potássio 5%

Pesou-se 25 g de Cromato de potássio e diluiu-se em 500 mL de água destilada.

Solução de Nitrato de Prata 0,1N

A solução de nitrato de prata foi preparada e utilizada no dia de realização do

procedimento analítico sendo acondicionado em frasco envolto em papel alumínio. A

solução foi preparada em água destilada de acordo com a fórmula a seguir:

N = massa de Ag NO3

P.M. x V N = normalidade da solução P. M. = peso molecular do nitrato de prata V = volume da solução a ser preparada.

Page 65: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

65

4.1.2.4 Atividade de água

Na avaliação da atividade de água fez-se uso do PawKit ® (Decagon ®) que

possui um sensor dielétrico de umidade e faz a leitura da atividade de água diretamente

da amostra.

Para este procedimento foi utilizado 5g da amostra, colocando-a cuidadosamente

no recipiente próprio do aparelho, cobrindo todo o fundo. Tivemos o cuidado para que a

amostra não passasse da metade da altura do recipiente, para evitar que o alimento

entrasse em contato com a célula dielétrica e o aparelho descalibrasse.

Depois de ligado o aparelho, a leitura foi feita automaticamente e, após tres

minutos, foi emitido um sinal sonoro que estabeleceu o fim da leitura. O resultado foi

observado no visor digital onde fica registrada a leitura da atividade de água da

amostra.

4.1.2.5 pH

A determinação do potencial hidrogeniônico foi realizada segundo a metodologia

oficial descrita no Manual do LANARA (BRASIL, 1981).

4.2. AMOSTRAS EXPERIMENTAIS

As amostras experimentais foram elaboradas por uma indústria localizada no

litoral norte do estado de São Paulo e inspecionada pelo Serviço Federal.

Nesta etapa do trabalho, foram realizados três processamentos tecnológicos de

anchovagem da sardinha (Sardinella brasiliensis), as quais foram acompanhadas

através de analises bacteriológicas e físico-químicas, desde a matéria prima até o fim

da fermentação.

Os processamentos realizados foram os seguintes:

A - Processamento tecnológico usual da empresa (Anexo 9.1.1) ;

B - Processamento tecnológico pelo qual o peixe é fermentado inteiro

(Anexo 9.1.2); e

C - Processamento tecnológico pelo qual o peixe é fermentado eviscerado

(Anexo 9.1.3).

Page 66: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

66

Foram acompanhados três lotes de cada processamento, somando um total de

nove lotes, identificados como: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3.

As matérias primas utilizadas para o processamento dos nove lotes foram as

mesmas.

4.2.1 Processamento usual da empresa

No processamento usual da empresa (processamento A), a primeira etapa após

a seleção da matéria prima consiste na lavagem do pescado com água hiperclorada

(5ppm).

Em seguida, a sardinha lavada e, inteira, é disposta em barricas de plástico

rígido com capacidade para 250 kg de peixe, em camadas alternadas de sal grosso,

dando início à etapa da pré-salga. A primeira e última camada devem ser de sal, não

sendo adicionada água. A formação de salmoura ocorre a partir da água da própria

sardinha (Figura 13). O pescado permanece nestas barricas por período que varia de

cinco a dez dias, dependendo do percentual de gordura da sardinha e da demanda da

empresa.

Figura 13 - Barricas contendo as sardinhas no período de fermentação do produto.

Ao ser retirada da pré-salga, a sardinha é descabeçada e eviscerada

manualmente, com o auxílio de uma faca, e passa para a fase de fermentação. Nesta

etapa, o produto em processamento é colocado em outra barrica limpa da mesma forma

como na pré-salga (em camadas alternadas com o sal).

Page 67: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

67

O período de fermentação do produto é de, no mínimo, 90 dias. Nesta fase, as

barricas ficam acondicionadas em salão com temperatura ambiente controlada a 25 °C

(Figura 14), e as salmouras são controladas em relação à concentração de sal (mínimo:

24 °Bé).

Figura 14 (A, B e C) - Salão com temperatura controlada onde é realizada a fermentação do produto (A). Destaque para os sensores de aferição da temperatura (B e C).

Seguindo o fluxograma de produção, após o período de fermentação, as

sardinhas são retiradas da salmoura e têm a pele extraída manualmente. Estas são

empilhadas e acondicionadas em caixas de polipropileno rígido e de paredes espessas,

especiais para a prensa. As caixas são colocadas na prensa (Figura 15) para a retirada

do excesso de salmoura e são submetidas à pressão de duas a seis toneladas por 20

minutos.

Figura 15 - Prensa utilizada para a retirada do excesso de salmoura.

A B

C

Page 68: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

68

Em seguida, é feita a filetagem do produto fermentado e os filés são

acondicionados nas embalagens. As embalagens são pesadas e recebem o óleo de

cobertura, sendo, por fim, fechadas a vácuo.

4.2.2 Processamento com peixe inteiro

O processamento tecnológico B (Anexo 9.1.2) difere do processamento usual da

empresa em relação à fase de pré-salga. Aqui a fase de pré-salga não é realizada.

Lava-se a matéria prima com água hiperclorada submetendo o produto inteiro a

fermentação e não sendo realizada a etapa de descabeçamento e evisceração. A

disposição do sal e da sardinha dentro das barricas limpas é feita da mesma forma

como descrito anteriormente, assim como o restante do processamento.

4.2.3 Processamento com peixe eviscerado

O processamento tecnológico C (Anexo 9.1.3) difere do processamento usual da

empresa (A) em relação à fase de pré-salga e do processamento B, em relação à

evisceração. Neste, a fase de pré-salga não é realizada, além da matéria prima lavada

ser colocada para fermentar totalmente eviscerada e descabeçada. A disposição do sal

e da sardinha dentro das barricas limpas é feita da mesma forma como descrito

anteriormente, assim como o restante do processamento.

4.2.4 Delineamento experimental

Os processamentos tecnológicos foram identificados com A, B e C. Em cada

processamento, foram realizadas três repetições: A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3.

As amostras coletadas aleatoriamente pesavam, no mínimo, 500g para a

realização das análises bacteriológicas e físico-químicas.

A primeira coleta foi referente à matéria prima do processamento: o sal e a

sardinha fresca. Assim, foi possível avaliar a qualidade das matérias primas utilizadas

nos processamentos.

A segunda coleta foi realizada no dia em que as sardinhas do processamento

usual da empresa (A) foram retiradas da pré-salga. Nesta mesma data de coleta dos

lotes A1, A2 e A3, também foram coletadas amostras dos lotes B1, B2, B3, C1, C2 e C3. A

Page 69: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

69

data desta coleta foi anotada e a partir dela foram colhidas amostras dos nove lotes de

15 em 15 dias, até completar 90 dias de fermentação (Apêndice 8.1). Junto com as

amostras foi enviada uma ficha contendo os dados de cada uma das amostras

(Apêndices 8.2 e 8.3).

4.2.4.1 Matérias-primas

As matérias primas foram coletadas e embaladas em saco plástico limpo e

lacrada em seladora á quente.

A amostra de sardinha não foi lavada antes da coleta e foi colocada em caixa de

polipropileno expandido, envolta por gelo e enviada ao Laboratório de Controle

Microbiológico no dia de chegada da sardinha à indústria. Segundo as informações

enviadas junto com as amostras, a sardinha, comprada de pescadores da região,

chegou à indústria com temperatura igual a 0,6°C.

A amostra de sal foi enviada a temperatura ambiente e tem origem em uma

salineira do Rio Grande do Norte.

4.2.4.1.1 Sal

Para avaliar a qualidade do sal foram realizadas somente análises

bacteriológicas. As análises realizadas foram: Enumeração de Coliformes totais e fecal,

isolamento e identificação de Salmonella sp., Contagem e identificação de

Staphylococcus coagulase positiva, Enumeração de Enterococcus sp. e Contagem

Total de bactérias Halófilas.

A contagem Total de bactérias Halófilas foi baseada na Instrução normativa n° 62

(BRASIL, 2003). E o meio utilizado foi o Bacto Agar Marine 22116 ® da Difco ®.

4.2.4.1.2 Sardinha fresca

A matéria prima foi avaliada, bacteriologicamente, segundo os métodos e

legislações já descritos anteriormente para os produtos adquiridos no mercado

varejista.

Page 70: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

70

As análises físico-químicas realizadas para pescado fresco foram a quantificação

de histamina (métodos de CCD e Fluorimetria) e a quantificação de Bases Voláteis

Totais, como já descritos.

Os parâmetros físico-químicos utilizados para a sardinha fresca foram

determinados pela Portaria n° 185 de 13 de maio de 1997 (BRASIL, 1997b).

4.2.4.2 Produto em fermentação

As amostras coletadas dos produtos em fermentação foram embaladas junto

com a salmoura em sacos plásticos limpos. Os sacos foram lacrados em máquina

seladora a quente e acondicionados em potes de plásticos rígidos, com tampa e lacre.

Cada pote foi identificado com os respectivos lotes (A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2 e C3)

Os potes das amostras foram envoltos por folhas plásticas com pequenas bolhas

de ar e colocadas em caixa de papelão. A caixa com as amostras foi enviada para a

Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense via SEDEX ®.

4.2.4.2.1 Análises bacteriológicas

As análises bacteriológicas realizadas para o produto em fermentação foram as

mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja,

Isolamento e identificação de Salmonella sp., Enumeração de Enterococcus sp,

Enumeração de Coliformes Totais e Fecal (Escherichia coli) e Contagem e Identificação

de Staphylococcus coagulase positiva.

4.2.4.2.2 Análises físico-químicas

As análises físico-químicas realizadas para o produto em fermentação foram as

mesmas realizadas para as amostras adquiridas no mercado varejista, ou seja,

Avaliação de Histamina (Método de Cromatografia em Camada Delgada e Método

Fluorimétrico), Análise da produção de Bases Voláteis Totais, Percentual de Cloretos,

Atividade de água e pH.

Page 71: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

71

4.2.5 Tratamento estatístico dos resultados

Para o tratamento estatístico dos resultados obtidos no experimento, realizou-se

análise de variância em arranjo fatorial de três tratamentos por sete tempos, seguido de

teste de comparação entre médias (Tukey´s Studentized Range) com 5 % de

significância. Para tal, utilizou-se o pacote estatístico SAS (SAS Institute, 1985).

Para o tratamento estatístico da variável quantitativa histamina, utilizou-se o

Teste de Kruskal-Wallis para comparação dos tratamentos por não apresentar

distribuição normal.

Page 72: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A seguir serão apresentados os resultados encontrados na presente pesquisa.

Entretanto, após longa e cuidadosa revisão bibliográfica sobre o mesmo tema, houve

grande dificuldade para discutir os resultados em função do reduzido número de

referências.

5.1 AMOSTRAS OBTIDAS NO MERCADO VAREJISTA

Os resultados bacteriológicos e físico-químicos obtidos nas 20 (vinte) amostras

de diferentes marcas, nacionais e importadas (Brasil, Itália, Marrocos, Perú e Argentina)

serão expostos e discutidos nos itens subseqüentes.

5.1.1 Análises bacteriológicas

Os resultados obtidos nas análises bacteriológicas podem ser observados na

tabela 1. Segundo a RDC n° 12 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL,

2001), no que se refere à análise qualitativa de Salmonella spp., 100% das amostras

analisadas encontram-se dentro do padrão estabelecido para as semiconservas de

pescado. Utilizando a mesma legislação como referência, os resultados das análises

para coliformes também se encontram adequados e, dentre as amostras analisadas,

somente uma apresentou resultado inadequado quando avaliada a presença de

Staphylococcus coagulase positivo.

Page 73: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

73

Tabela 1 - Resultados referentes à contagem de coliformes totais e fecal (NMP/g), Staphylococcus coagulase positivo (UFC/g), Salmonella spp. e Enterococcus spp. (NMP/g) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.

Amostra Coliforme

Total Fecal NMP/g

Staphylococcus Coagulase +

UFC/g

Salmonella spp.

Enterococcus spp. NMP/g

1 NR NR NR NR

2 Ausente 1,9 x 10 3 Ausente NR

3 Ausente Ausente Ausente NR

4 < 3 <3 Ausente Ausente 2,0 x 10

5 < 3 <3 7,0 x 10 2 Ausente 2,4 x 10 2

6 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3

7 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3

8 < 3 Aus Ausente Ausente > 1,1 x 10 3

9 Ausente Ausente Ausente > 1,1 x 10 3

10 <3 Aus Ausente Ausente Ausente

11 <3 Aus Ausente Ausente Ausente

12 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10

13 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10

14 Ausente Ausente Ausente 3,0 x 10 3

15 Ausente Ausente Ausente 7,0 x 10 4

16 Ausente Ausente Ausente Ausente

17 Ausente Ausente Ausente 7,0 x 10 4

18 <3 Aus 7,0 x 10 2 Ausente < 3

19 Ausente Ausente Ausente Ausente

20 Ausente Ausente Ausente 0,4 x 10 1

NR: Não Realizado

A enumeração de Enterococcus spp. não é prevista pela RDC n° 12 (BRASIL,

2001). Entretanto, os resultados obtidos sugerem uma relação entre a produção de

histamina e a presença desta bactéria, a qual foi isolada em 76% das amostras nas

quais foram realizadas análises bacteriológicas. Gardini et al. (2001) sugerem que a

Page 74: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

74

maior influência na formação de aminas biogênicas advem da atividade proteolítica do

Enterococcus spp. e das enzimas de descarboxilação presentes neste microrganismo.

Ao observar a tabela 1, é possível perceber que o crescimento bacteriano deste

microrganismo é bastante relevante.

5.1.2 Análises físico-químicas

Recordando o fato do produto em questão não possuir padrão de qualidade, foi

utilizada como parâmetro para avaliação das bases voláteis a portaria n° 185 (BRASIL,

1997b), que estabelece um limite de 30 mg N/100 g de amostra para o pescado fresco.

Na tabela 2, é possível observar que todos os resultados referentes às bases voláteis

estão acima do preconizado pela legislação supracitada.

A formação de níveis significativos de aminas biogênicas tem sido observada em

muitos alimentos nos quais ocorre o crescimento bacteriano de Enterococci (como

observado na tabela 1, estando presente em 76% das amostras). No entanto, existem

outros fatores que podem influenciar na formação de aminas biogênicas por estes

microrganismos tais com a temperatura, o pH e a concentração de sal (GARDINI et al;

2001).

Ao avaliar os resultados da presença de histamina obtidos através da técnica de

Cromatografia em Camada Delgada (SCHUTZ, CHANG e BJELDANES, 1976)

constatou-se a presença dessa amina biogênica em todas as amostras. Somado a este

fato, foi constatada a presença de outras aminas biogênicas em 75% das amostras,

caracterizando a possibilidade de potencialização da ação tóxica da histamina

(MÁRSICO, 2002).

Segundo a legislação européia (C.E., 2005), todos os valores determinados por

esta análise estariam dentro do preconizado, no entanto, esta legislação não faz

referências ao fato de outras aminas biogênicas potencializarem a ação intoxicante da

histamina, o que levaria à casos de intoxicação e/ou casos alérgicos em decorrência da

ingestão de menores concentrações.

Na Inglaterra, foram relatados casos com o desenvolvimento de sintomas em

indivíduos que consumiram pescados contendo concentrações pouco superiores a 50

Page 75: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

75

ppm (BARTHOLOMEW et al.6 ,1987 apud LEHANE; OLLEY, 2000). Na tabela 2

observa-se que 90 % das amostras apresentaram valores maiores ou iguais a 50 ppm.

Tabela 2 - Resultados obtidos nas análises de Bases Voláteis Totais - BVT (mg N/100g), histamina (ppm), outras aminas biogênicas, pH, Atividade de água – Aa e cloretos (%) em peixes anchovados provenientes do mercado interno e externo.

Amostra Origem BVT

(mg N/100g)

Histamina(ppm)

Putrescina e

Cadaverina pH Aa

Cloreto %

1 Brasil 52,92 ≈100 Presente 5,17 0,68 10,9

2 Desconhecida 42,8 > 100 Presente 5,73 0,67 17,5

3 Perú 203,8 >> 100 Ausente 5,64 0,68 14,5

4 Perú 63,0 >> 100 Presente 5,31 0,66 14,5

5 Itália 108,4 >> 100 Presente 5,23 0,67 14,8

6 Itália 102,1 > 50 < 100 Presente 5,08 0,67 14,7

7 Itália 124,7 ≈ 100 Presente 5,32 0,67 14,7

8 Marrocos 99,5 >> 100 Ausente 5,49 0,67 16,1

9 Argentina 107,1 >20 < 50 Presente 5,55 0,55 14,7

10 Marrocos 80,3 >100 Presente 5,67 0,70 15,1

11 Argentina 113,4 >> 100 Presente 5,35 0,70 14,7

12 Brasil 88,2 > 100 Presente 5,37 - 12,4

13 Brasil 59,2 > 100 Presente 5,30 - 9,8

14 Brasil 71,8 >> 100 Presente 5,46 - 13,9

15 Perú 71,8 > 100 Ausente 5,40 - 13,0

16 Argentina 66,8 >> 100 Presente 5,55 - 15,7

17 Brasil 56,7 ≈100 Presente - - 13,9

18 Perú 59,2 ≈ 20 Ausente 5,54 - 13,0

19 Argentina 105,8 > 100 Presente 5,68 - 9,4

20 Brasil 65,5 > > 100 Ausente 5,19 - 14,0

> = maior que; >> = muito maior que; ≈ aproximadamente;

Segundo Suzzi e Gardini (2003), o pH pode ser o fator chave que influencia na

atividade de descarboxilação das enzimas formadoras de aminas biogênicas. A mais de

6 BARTHOLOMEW, B. A.; BERRY, P. R.;RODHOUSE, J. C.; GILBERT, R. J.. Scombrotoxic fish poisoning in Britain: Features of over 250 suspect incidents from 1976 to 1986. Epidemiology and Infection. v.99, p. 775-782, 1987.

Page 76: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

76

setenta anos atrás, Koesseler et al.7 (1928), citados por Suzzi e Giardini (2003),

sugeriram que a formação de aminas biogênicas seria um mecanismo fisiológico das

bactérias em resposta ao meio ácido. Buncic et al.8 e Maijala et al.9, ambos em 1993 e

citados por Suzzi e Gardini (2003), afirmam que a alta produção de histamina pode

estar relacionada ao decréscimo inadequado do pH nos primeiros dias da fermentação

do produto.

Na tabela 2, pode-se observar que o pH apresentou-se ácido em 100% das

amostras avaliadas, com valores variando entre 5,08 e 5,73.

Os parâmetros físico-químicos citados (pH e percentual de cloretos) parecem

influenciar na formação de aminas biogênicas, fato também sugerido nos estudos

realizado por Gardini et al. (2001) com leite desnatado adicionado com diferentes

concentrações de cloreto de sódio, onde a produção de aminas biogênicas foi menor

quando a concentração de NaCl era maior. Além do mais, a produção de aminas

mostrou-se menor ainda na decorrência de menores valores de pH.

Entretanto, após analisar os valores de pH e percentual de cloreto,

demonstrados na tabela 2, não foi possível estabelecer a mesma relação sugerida por

Gardini et al. (2001) em peixes anchovados.

5.2 AMOSTRAS EXPERIMENTAIS

A seguir, serão apresentados os resultados das análises realizadas em amostras

coletadas a partir dos três processamentos tecnológicos, após tratamento estatístico

dos dados. Foi avaliado o comportamento dos dados entre os processamentos e dentro

de cada um destes.

7 KOESSELER, K. K.; HANKE,M. T.; SHEPPARD, M. S.. Production of histamine, tyramine, brochospastic and arteriospastic substance in blood broth by pure culture of microorganisms. Journal of Infectious Diseases. v.3, p. 363-377, 1928. 8 BUNCIC, S.; PAUNIVIC, L.; RADISIC, D.; VOJINOVIC, G. SMILJANIC, D.; BALTIC,M. Effects of gluconodeltalactone and Lactobacillus plantarum on the production of histamine and tyramine in fermented sausages. Intrnational Journal of Food Microbiology. v. 17, p. 303-309, 1993. 9 MAIJALA, R.; EEROLA, S.; AHO, M.; HIRN, J. The effect of GDL- induced pH degrease on the formation of biogenic amines in meat. Journal of Food Protection. v.56, p. 125-129, 1993.

Page 77: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

77

5.2.1 Matérias-primas

Ao observar os resultados apresentados na tabela 3, pôde-se classificar a

matéria prima sardinha (S. brasiliensis) como adequada para a utilização nos

processamentos tecnológicos. Para tal, foi utilizada como base a Portaria n° 185 que se

refere ao Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Peixe Fresco (BRASIL,

1997b).

Tabela 3 – Teor de Bases Voláteis Totais – BVT (mg de N/100g) e histamina (mg/100g) por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Fluorimetria (F) sardinha (S. brasiliensis) utilizados no processamento tecnológico de anchovagem.

Coleta BVT (mg de N/100g) CCD (ppm) F (ppm)

1ª 13,8 ND ND

De acordo com a RDC n° 12 (BRASIL, 2001), os resultados das análises

bacteriológicas realizadas com a sardinha (S. brasiliensis) apresentaram-se dentro do

padrão estabelecido, estando a matéria prima apta para utilização nos processamentos

tecnológicos estabelecidos.

O sal utilizado na elaboração do produto também se apresentou adequado para

uso, pois não houve crescimento bacteriano no que diz respeito à Salmonella spp.,

Staphylococcus coagulase positivo, Coliformes totais e fecal e Enterococcus spp..

5.2.2 Processamentos Tecnológicos A, B e C

A seguir serão apresentados os resultados das análises bacteriológicas e físico-

químicas realizadas nas amostras dos processamentos A, B e C.

5.2.2.1 Resultados das análises bacteriológicas

Ao longo do período de fermentação dos nove lotes, foram realizadas análises

bacteriológicas em amostras coletadas de 15 em 15 dias. Houve crescimento

bacteriano em algumas das análises. Na tabela 4 podem ser observados os resultados.

Houve o crescimento de Proteus spp., Shiguella spp., Escherichia spp.,

Klebsiella spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp..

Page 78: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

78

Tabela 4 – Resultados das análises bacteriológicas realizadas nas amostras coletadas dos nove lotes acompanhados ao longo do período de 90 dias de fermentação do produto.

Dias de Fermentação

Lote

s an

alis

ados

0 15 30 45 60 75 90

A1 - - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

- - -

A2Proteus spp.

Shiguella spp. - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

- Citrobacter spp.Crescimento

não identificado

A3Proteus spp.

Shiguella spp. - - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

-

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

B1Proteus spp.

Shiguella spp. - - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

-

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

B2 - - - - - - -

B3Proteus spp.

Shiguella spp. - - - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.-

C1Pseudomona

s spp.

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

Proteus spp.

- - - - -

C2 - -

Escherichia spp.

Klebsiella spp.

- - -

C3 - - - - - Staphylococcus spp.

Page 79: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

79

Alguns dos gêneros bacterianos citados podem estar envolvidos na formação de

histamina. Segundo trabalho realizado por Ababouch et al. (1991) foram isoladas 55

espécies bacterianas formadoras de histamina a partir de amostras de sardinha

(Sardinella pilchardus) estocadas em gelo e a temperatura ambiente. Dentre as

espécies isoladas, 51 pertenciam à família Enterobacteriaceae, estando algumas

implicadas na formação de histamina.

Fez-se o isolamento das espécies bacterianas acima citadas no meio de

Rambach ®, na fase de plaqueamento seletivo da metodologia utilizada para o

isolamento e identificação de Salmonella spp.. Sendo assim, não foi possível quantificar

estas espécies nas amostras. Rambach (1990) descreveu este meio de cultura para a

diferenciação da Salmonella spp. de outras espécies da família Enterobacteriaceae.

Alguns dos gêneros bacterianos isolados no presente trabalho são os mesmos

apresentados por Niven et al. (1981), que elaboraram um meio de cultura para a

detecção quantitativa de bactérias formadoras de histamina no qual foram isolados:

Proteus morganii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,

Enterobacter cloacae, Edwardsiella sp. e Vibrio spp.

Leitão et al. (1983), estudando a ocorrência de bactérias formadoras de

histamina em pescado de origem marinha, constataram a presença de P. morganii, P.

rettgeri, Vibrio spp. Aeromonas spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.,

Enterobacter spp. e Klebsiella spp. como algumas das espécies responsáveis pela

formação da amina em questão.

Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentação, houve crescimento no

meio de Baird Parker® suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificação

da espécie foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: catalase, coagulase,

DNase, Termonuclease e oxidação e fermentação da glicose, além da verificação das

características morfotintoriais pelo método de Gram.

Na amostra C3, coletada com 75 dias de fermentação, houve crescimento no

meio de Baird Parker® suspeito de Staphylococcus spp. e na tentativa de identificação

da espécie foram realizadas as seguintes provas bioquímicas: catalase, coagulase,

DNase, Termonuclease e oxidação e fermentação da glicose, além da verificação das

características morfotintoriais pelo método de Gram.

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Segundo o Manual Bergey (1994), o Staphylococcus coagulase positivo é

caracterizado por promover resultados positivos em todas as provas bioquímicas acima

citadas, menos a da fermentação da glicose, que pode apresentar-se negativa, e possui

característica morfotintorial de coco Gram positivo.

Na tabela 5, estão expostos os resultados obtidos das referidas provas

bioquímicas sendo possível verificar que a cultura testada apresentou características

referentes ao gênero Staphylococcus, não sendo o S. aureus.

Tabela 5 – Resultados das provas bioquímicas realizadas em colônias suspeitas de Staphylococcus spp. repicadas do meio de Baird Parker para o Caldo BHI.

Provas bioquímicas

Característica Morfotintorial (método de

Gram) Catalase Dnase

Oxidação da

glicose Fermentação

da glicose Termo-

nuclease Coagulase

Resultado Cocos G+ positivo negativo positivo positivo negativo negativo

Usando como base a RDC nº 12 (BRASIL, 2001), na qual é estabelecido o valor

limítrofe máximo de 5 x 102 UFC/g da amostra para presença de estafilococos, a

amostra C3 apresentou valor inferior estando dentro do padrão estabelecido.

5.2.2.2 Resultados das análises físico-químicas

Na tabela 6, estão registrados os valores médios obtidos das análises físico-

químicas realizadas com os três processamentos tecnológicos. Pode-se observar que

no tempo 1, data de retirada do produto da pré-salga, o valor de BVT mais baixo foi de

18,6 ± 16,9 mg de N/100 g da amostra, referente ao processamento em que a

fermentação ocorreu sem a presença das vísceras, e no tempo 7, após 90 dias de

fermentação, o maio valor de BVT obtido foi de 62,1 mg de N/100 g do processamento

usual da empresa. Ao longo dos três processamentos realizados, os valores de BVT

foram sempre crescentes.

Os resultados da análise de BVT se apresentam de acordo com os resultados

obtidos por Oetterer et al. (2003) em pesquisa realizada no monitoramento do

anchovamento de sardinhas, quando o valor inicial de BVT apresentou-se em 19,32 mg

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81

de N/100 g da amostra (sardinha fresca) e o final 56,79 mg de N/ 100 g da amostra,

após 60 dias de fermentação.

Avaliando o comportamento das Bases Voláteis nos três processamentos,

percebe-se que houve variação estatística significante somente ao fim dos 90 dias de

fermentação. Neste momento, os processamentos A e B obtiveram maiores valores de

BVT, fato ocorrido em função da presença das vísceras, pois no trato digestivo há

presença de uma microbiota que influi na decomposição do pescado.

Tabela 6 – Valores médios de N-BVT (mg N/100 g) obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do método de microdifusão em placa de Conway, por 90 dias.

Processamentos A B C

0 23,1± 16,9 a 19,7 ± 16,9 a 18,6 ± 16,9 a

15 23,5 ± 12,7 a 17,6 ± 12,7 a 15,1 ± 12,7 a

30 29,0 ± 8,2 a 29,0 ± 8,2 a 23,9 ± 8,2 a

45 32,3 ± 7,7 a 33,6 ± 7,7 a 30,2 ± 7,7 a

60 39,9 ± 16,3 a 26,5 ± 16,3 a 26,9 ± 16,3 a

75 40,3 ± 15,7 a 31,1 ± 15,7a 34,4 ± 15,7 a

Dia

s de

fe

rmen

taçã

o

90 62,1 ± 17,3 a 50,8 ± 17,3 ab 39,1 ± 17,3 b

Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).

A presença do BVT é resultante do efeito de várias transformações, originando-

se da degradação do OTMA e dos aminoácidos livres por mecanismos diferentes, entre

estes a decomposição pelas bactérias (CONTRERAS-GUZMÁN, 1994).

Oetterer et al. (2003) compararam o processo de fermentação da sardinha (S.

brasiliensis) com e sem vísceras e apresentaram valores bastante semelhantes aos

demonstrados na tabela 9.

Estes resultados apresentaram comportamento análogo ao apresentado por

Dissaraphong et al. (2005), que avaliaram a formação de BVT durante a fermentação

de pescado e obtiveram maiores valores deste parâmetro em presença das vísceras.

Killine et al. (2006) apresentaram valores de BVT superiores ao exposto no

presente trabalho, chegando a 210,58 mg de N em 100 g da amostra ao fim do período

da fermentação. No entanto, o comportamento deste parâmetro foi o mesmo, obtendo

valores crescentes na medida em que o período de fermentação avançava.

Page 82: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

82

Os valores de pH, considerando todos os tratamentos, variaram entre 5,54 a

5,93. Inicialmente o valor do pH, no processamento A, foi de 5,67, sofrendo queda até

5,57 quando o produto estava com 45 dias de fermentação. Após este período o pH

aumentou, gradativamente, para 5,93 ao final dos 90 dias de fermentação. O

comportamento destes dados ocorreu da mesma forma como apresentado por Oetterer

et al. (2003).

Tabela 7 – Valores médios de pH obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias.

Processamentos A B C

0 5,67 ± 0,14 a 5,54 ± 0,14 a 5,61 ± 0,14 a

15 5,60 ± 0,17 a 5,56 ± 0,17 a 5,56 ± 0,17 a

30 5,57 ± 0,16 a 5,63 ± 0,16 a 5,56 ± 0,16 a

45 5,64 ± 0,11 b 5,86 ± 0,11 a 5,71 ± 0,11 b

60 5,76 ± 0,14 a 5,81 ± 0,14 a 5,84 ± 0,14 a

75 5,85 ± 0,21 a 5,79 ± 0,21 a 5,80 ± 0,21 a

Dia

s de

fe

rmen

taçã

o

90 5,93 ± 0,23 a 5,84 ± 0,23 a 5,92 ± 0,23 a

Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p< 0,05).

Estatisticamente, as variaões dos valores de pH foram significantes somente aos

45 dias de fermentação.

Os valores médios de pH no processamento B variaram entre 5,54 e 5,86, no

entanto, houve inversão no comportamento do pH quando comparado com o

processamento A. Inicialmente, este parâmetro apresentou valor de 5,54 e foi crescente

até 60 dias de fermentação, quando chegou ao valor máximo de 5,86. Em seguida,

houve ligeiro decréscimo do pH para 5,79 (75 dias de fermentação), chegando ao pH

final de 5,84.

No processamento C, a variação entre o pH inicial e o final foi amaior, estando

entre 5,61 e 5,92. Inicialmente, o pH foi de 5,61 caindo par 5,56 após 15 dias e

aumentando gradativamente até 5,84 aos 60 dias de fermentação. Com 75 dias de

fermentação, houve queda do pH sem significância, seguida de aumento para 5,92 ao

fim de 90 dias de fermentação.

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83

Houve variação estatística para os valores de Aa encontrados no processamento

A, como mostra a tabela 8. Alguns dos valores de Aa registrados estão abaixo do

esperado para o produto fermentado em solução saturada, como demonstra Jay (2005),

que relata valores de 0,75 para produtos nesta condição.

Tabela 8 – Valores médios de Aa obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada através do aparelho PawKit ®, por 90 dias.

Processamentos A B C

0 0,73 ± 0,01 a 0,74 ± 0,01 b 0,75 ± 0,01 c 15 0,74 ± 0,01 a 0,74 ± 0,01 a 0,75 ± 0,01 b

30 0,75 ± 0,02 a 0,75 ± 0,02 b 0,74 ± 0,02 a

45 0,72 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a

60 0,71 ± 0,02 a 0,73 ± 0,02 a 0,74 ± 0,02 a

75 0,72 ± 0,01 b 0,73 ± 0,01 ba 0,74 ± 0,01a

Dia

s de

fe

rmen

taçã

o

90 0,72 ± 0,01 b 0,73 ± 0,01 ba 0,74 ± 0,01a

Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).

O percentual de cloreto não apresentou diferença estatística (p>0,05) ao longo

de todo o período de fermentação, nos três processamentos tecnológicos, como pode

ser observado na tabela 9, a seguir:

Tabela 9 – Valores médios de cloreto (%) obtidos nos processamentos tecnológicos de sardinha (S. brasiliensis) anchovada, por 90 dias.

Processamentos A B C

0 15,80 ± 5,79 a 18,17 ± 5,19 a 16,37 ± 5,19 a

15 18,17 ± 2,67 a 17,13 ± 2,67 a 16,26 ± 2,67 a

30 15,87 ± 2,09 a 17,70 ± 2,09 a 18,10 ± 2,09 a

45 18,13 ± 3,25 a 18,73 ± 3,25 a 18,40 ± 3,25 a

60 17,78 ± 0,95 a 18,00 ± 0,95 a 17,60 ± 0,95 a

75 16,90 ± 3,07 a 18,80 ± 3,07 a 18,36 ± 3,07 a

Dia

s de

fe

rmen

taçã

o

90 15,65 ± 4,75 a 16,90 ± 4,75 a 18,87 ± 4,75 a

Médias na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste Tukey (p<0,05).

Após extensa revisão bibliográfica, não foi possível encontrar resultados de

pesquisas que avaliassem a formação de histamina ao longo da fermentação de

produtos derivados do pescado.

Page 84: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

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O Seafood Network Information Center (centro de informações criado pela

Universidade da Califórnia) apresenta parâmetros sobre fermentação e salga de peixes

e seus derivados. Entretanto, dentre os parâmetros expostos não está prevista a

quantificação de histamina como um procedimento analítico necessário (TOM, 2007).

Na tabela 10, observa-se o comportamento dos valores médios da concentração

de histamina nos diferentes processamentos tecnológicos elaborados, dando destaque

aos valores mínimos e máximos encontrados em cada processamento.

Tabela 10 - Ordenação média das concentrações de histamina (ppm) nos processamentos tecnológicos A, B e C testados e seus respectivos valores mínimos e máximos, sendo a DMS = 4,58.

Concentração de histamina (ppm) Processamentos

A B C

Mediana 11,0 a 6,4 b 1,8 c

Valor Mínimo 0,0 0,0 0,0

Valor Máximo 24,8 197,6 43,3

Medianas na mesma linha seguida de letras distintas diferem entre si no Teste de Kruskal-Wallis (p<0,05).

Os valores mínimos encontrados nos três processamentos ocorreram em função

da utilização de matéria prima de boa qualidade. Mas quando observamos os valores

máximos ocorridos, percebe-se que houve uma variação muito elevada dos valores.

Estes intervalos demonstram que a distribuição estatística dos dados da concentração

de histamina não é normal (Curva de Gauss).

Estatisticamente, houve diferença significativa entre os processamentos

tecnológicos, no que se refere à quantificação de histamina.

O processamento A, apesar de ter apresentado o valor mais elevado na mediana

(11,0 ppm), foi o que apresentou menor intervalo dos dados entre a mínima (0,0 ppm) e

a máxima (24,8 ppm). Já o processamento B apresentou o valor máximo (197 ppm)

mais elevado, e mediana (6,4 ppm) inferior ao processamento A. Este elevado valor

está relacionado com o fato deste processamento conter vísceras ao longo de todo o

período de fermentação do produto, possibilitando a presença de bactérias formadoras

Page 85: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

85

de histamina, presentes no trato intestinal, víceras e brânquias, como relatam Ogawa e

Maia (1999) e Leitão (1983).

O processamento C apresentou o menor valor da mediana (1,8 ppm), no entanto

o valor máximo encontrado foi superior ao mesmo dado encontrado no processamento

A, lembrando que foi realizada a “toillete” e evisceração da sardinha (S. brasiliensis)

antes do período de fermentação.

A tabela 11 contém os valores médios dos lotes de cada processamento onde

pode ser observado o comportamento da concentração de histamina ao longo do

período de fermentação do produto. Houve a presença de histamina em valores

crescentes ao longo de todos os períodos de fermentação.

No processamento A, a média da concentração de histamina nos lotes (A1, A2 e

A3) apresentou valor inicial médio 2,73 ppm e chegando a 21,73 ppm ao fim de 90 dias

de fermentação.

A histamina foi observada no processamento B em valores médios (B1, B2 e B3)

crescentes variando entre 2,13 ppm e 90,10 ppm. Até 60 dias de fermentação, o

produto apresentou 7,93 ppm de histamina. Em 15 dias este valor foi 2,5 vezes maior

(18,65 ppm) e nos 15 dias finais da fermentação a concentração de histamina

aumentou 4,8 vezes chegando a 90,1 ppm de histamina.

Tabela 11 – Concentrações médias de histamina (ppm) dos três lotes de cada processamento tecnológico estudado, ao longo do período de fermentação da sardinha (S. brasiliensis).

Concentração de histamina (ppm) Processamentos

A B C 0 2,73 2,13 0,00 15 4,87 4,87 0,60 30 7,93 6,40 1,20 45 9,48 7,93 1,8 60 14,07 7,93 1,80 75 14,07 18,67 11,00

Dia

s de

fe

rmen

taçã

o

90 21,73 90,10 32,50

Inicialmente, no processamento C, não foi determinada a presença de histamina

na amostra, havendo, de forma lenta, aumento pouco significativo da concentração

desta amina biogênica até a 5ª coleta. Ao fim de 60 dias de fermentação, a

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86

concentração média (C1, C2 e C3) de histamina era de 0,80 ppm, aumentando para 11

ppm aos 75 dias de fermentação. Em 15 dias, a concentração de histamina quase

triplicou, chegando ao fim de 90 dias com 32,5 ppm.

Observando os dados, no que se refere à concentração de histamina ao fim de

90 dias de fermentação, percebe-se que o produto contém concentrações desta amina

em valores que podem causar reações adversas nos indivíduos que consumirem este

produto, lembrando que a resposta fisiológica à presença da histamina é idiossincrásica

e não totalmente elucidada (LEHANE; OLLEY, 2000).

Na Figura 16 pode ser observado o comportamento da concentração média de

histamina dos diferentes processamentos elaborados durante o período de fermentação

através de um Plano Cartesiano.

Concentração de histamina durante o período de maturação em parte por

milhão (ppm)

02040

6080

100

0 15 30 45 60 75 90

Dias

ppm

ABC

Figura 16 – Plano cartesiano contendo as retas estabelecidas pelos valores médios da concentração de histamina dos três lotes de cada processamento tecnológico trabalhado.

Page 87: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES

Ao avaliar a qualidade dos peixes anchovados comercializados no mercado

varejista, despertou-se grande preocupação com relação à presença de histamina, pois

esta ocorreu em elevadas concentrações. Este fato procede para os produtos nacionais

e importados.

Ao avaliar os processamentos tecnológicos, o processamento usual da empresa

com a qual se trabalhou apresentou melhor resultado, em função da baixa

concentração de histamina ao fim do processo de fermentação, não havendo a

necessidade de adequação do processamento.

No entanto, devido ao isolamento de bactérias suspeitas de estarem envolvidas

na formação de histamina, acredita-se que possam existir outros procedimentos que

determinem a melhora do produto final, para tanto, seriam necessários mais estudos

específicos.

Mais estudos sobre este processamento tecnológico são necessários pois ao

observar os resultados da primeira etapa do presente trabalho, no que diz respeito à

concentração de histamina, confrontando-os com os resultados da mesma variável na

segunda etapa, percebe-se que há uma diferença significativa entre os valores. Em

face disto, acredita-se que o processo de produção de histamina continue no produto

pronto, sendo necessário acompanhar o produto ao longo de sua validade comercial

para avaliação, até expirar a data da validade.

Em paralelo ao acompanhamento da formação de histamina no produto pronto,

sugere-se que sejam realizadas mais análises bacteriológicas na tentativa de identificar

a presença de uma bactéria ácidolática que pode estar envolvida na formação da

histamina, o Tetragenococcus muriaticus.

Page 88: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Page 96: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

8 APÊNDICES

8.1 QUADRO DE COLETA DE AMOSTRAS

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97

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98

8.2 FICHA DE COLETA DE DADOS DA MATÉRIA PRIMA

INFORMAÇÃO SOBRE AS AMOSTRAS DE MATÉRIA PRIMA

SARDINHA: Data de coleta:

Origem da matéria prima:

Coletor da amostra (nome):

Condições de transporte até a empresa:

Temperatura da matéria prima na recepção:

Peso mínimo das amostras: 500 gramas.

Observações: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ SAL: Data de coleta:

Origem da matéria prima:

Coletor da amostra (nome):

Peso mínimo das amostras: 500 gramas.

Observações: ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Page 99: avaliação físico-química e bacteriolócica de peixes anchovados

99

8.3 FICHA DE COLETA DE DADOS DAS AMOSTRAS EM FERMENTAÇÃO

INFORMAÇÃO SOBRE AS AMOSTRAS Data de coleta:

Temperatura ambiente:

Coletor da amostra (nome):

Peso mínimo das amostras: 500 gramas. A. Processamento Tecnológico usual da empresa;

B. Processamento Tecnológico maturando peixe inteiro;

C. Processamento Tecnológico maturando peixe eviscerado.

A1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

A2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs: A

A3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

B1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

B2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs: B

B3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

C1 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

C2 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs: C

C3 Peso (g): Salinidade (° Bé): Temperatura da salmoura (°C):

Obs:

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00

9 ANEXOS

9.1 FLUXOGRAMAS DOS PROCESSAMENTOS

1

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101

9.1.1 Fluxograma do Processamento usual da empresa (A)

RECEPÇÃO Averiguação da presença de peixes deteriorados e controle da temperatura (< 4°C)

(PCC 1) →

SELEÇÃO

LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)

PRÉ-SALGA (PCC 2) →

TOILLETE (evisceração e descabe

FERMENTAÇÃ(etapa realizada em salmoura saturada por, no m

temperatura controlada

PRENSAGEM (PCC 3) →

FILETAGEM

EMBALAGEM (PCC 4) →

ESTOCAGEM

EXPEDIÇÃO

Utilização de tanques higienizados e Controle da salinidade da salmoura com o mínimo de 24° Bé.

çamento)

Retirada do excesso de salmoura com pressão de 2 a 6 T por 20 minutos.

Aferição do equipamento de formação de vácuo e recravação das embalagens.

O ínimo, 90 dias em ambiente com : 25 °C)

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102

9.1.2 Fluxograma do Processamento com fermentação de peixe inteiro (B)

RECEPÇÃO

SELEÇÃO

LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)

FERMENTAÇÃO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mínimo, 90 dias em ambiente com

temperatura controlada: 25 °C)

TOILLETE (evisceração, descabeçamento e retirada da pele)

PRENSAGEM

FILETAGEM

EMBALAGEM

ESTOCAGEM

EXPEDIÇÃO

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103

9.1.3 Fluxograma do Processamento com fermentação de peixe eviscerado (C)

RECEPÇÃO

SELEÇÃO

LAVAGEM (água + 5ppm Cloro)

TOILLETE (evisceração e descabeçamento)

FERMENTAÇÃO (etapa realizada em salmoura saturada por, no mínimo, 90 dias em ambiente com

temperatura controlada: 25 °C)

TOILLETE

(retirada da pele)

PRENSAGEM

FILETAGEM

EMBALAGEM

ESTOCAGEM

EXPEDIÇÃO