Avaliação e identificação da toxicidade aguda com bactéria ... ?· investigação da toxicidade…

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Cincias Farmacuticas

Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri

nas guas superficiais da cidade de So Paulo

BRUNO DE SOUZA

Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre

Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth Souza

Nascimento

So Paulo

2018

22

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Cincias Farmacuticas

Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas

Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri

nas guas superficiais da cidade de So Paulo

BRUNO DE SOUZA

Verso corrigida da Dissertao conforme resoluo CoPGr 6018

Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre

Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth Souza

Nascimento

So Paulo

2018

23

24

BRUNO DE SOUZA

Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri nas guas

superficiais da cidade de So Paulo

Comisso Julgadora da Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre

Profa. Dra. Elizabeth Souza Nascimento

Orientadora/presidente

So Paulo, 18 de maio de 2018

Rbia Kuno

1o. examinador

Fbio Kummrow

2o. examinador

Fabiane Drr

3o. examinador

25

SOUZA, B. Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri

nas guas superficiais da cidade de So Paulo. 2018. 143 f. Dissertao (Mestrado em

Toxicologia e Anlise Toxicolgica) - Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de

So Paulo, So Paulo, 2018.

RESUMO

A poluio dos rios brasileiros , atualmente, um grande problema para as autoridades

governamentais j que a demanda dos recursos hdricos vem crescendo nos ltimos anos. Os

rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate foram de grande importncia para a cidade de So Paulo

em seu perodo de industrializao, contudo o prprio desenvolvimento industrial impactou

permanentemente os mesmos. Preocupados com a sade ambiental, rgos fiscalizadores

estaduais iniciaram forte fiscalizao para coibir e responsabilizar os principais culpados. Esta

poltica pblica resultou em uma diminuio das concentraes de poluentes orgnicos e

inorgnicos, porm muito pouco foi efetivamente feito com relao ao esgoto domstico, e,

como consequncia, a toxicidade das guas dos rios permanece elevada. Os estudos de

Avaliao e identificao da toxicidade englobam diversas metodologias reunidas em trs

documentos pela USEPA - Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos, onde mtodo

fsico-qumico e testes toxicolgicos so usados para identificar substncias txicas, ou grupo

de substncias txicas que contribuem efetivamente para a toxicidade total de uma amostra. A

abordagem rotineiramente utilizada baseia-se no fracionamento da amostra de acordo com

suas propriedades fsico-qumicas: volatilidade, solubilidade e capacidade de formar

complexos, ou de ser reduzida, oxidada, ionizada, entre outras. Em conjunto com os ensaios

qumicos, os ensaios toxicolgicos, em especial o Sistema Microtox, contribuem na

investigao da toxicidade para os rios metropolitanos Tiet, Pinheiros e Tamanduate, que se

mostrou eficaz na determinao dos grupos de compostos, sendo os compostos orgnicos

apolares, orgnicos volteis, tensoativos e as partculas, as principais fontes da toxicidade para

esses rios. Embora muitas informaes sobre a toxicidade tenham sido descobertas, a

identificao dos compostos s pode ser realizada por anlises qumicas mais robustas uma

vez que um grande nmero de substncias, metablitos e subprodutos de degradao so

facilmente encontrados neste tipo de amostra. Mesmo sofrendo algumas modificaes, deve-

se incentivar o uso desta metodologia para outros rios a fim de determinar os principais

toxicantes responsveis pela toxicidade.

Palavra-chave: fracionamento qumico, toxicidade, Sistema Microtox, Vibrio fischeri,

tensoativos.

26

SOUZA, B. Evaluation and identification of acute toxicity with bacteria Aliivibrio

fischeri in surface waters of the city of So Paulo 2018. 143 f. Dissertao (Mestrado em

Toxicologia e Anlise Toxicolgica) - Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de

So Paulo, So Paulo, 2018.

ABSTRACT

Pollution of Brazilian rivers is currently a major problem for government authorities as

demand for water resources has been increasing in recent years. Tiet, Pinheiros and

Tamanduate rivers were of great importance for the city of So Paulo during its

industrialization period, however, the industrial development itself permanently impacted

them. Concerned about environmental health, state supervisory bodies have begun strong

enforcement to curb and hold the main culprits accountable. This public policy has resulted in

a decrease in concentrations of organic and inorganic chemicals, but very little has been done

in relation to domestic sewage, and as a consequence, the toxicity of the rivers remains high.

The Toxicology Assessment and Identification studies encompass various methodologies

gathered in three documents by the USEPA, where physico-chemical method and

toxicological tests are used to identify toxic substances, or group of toxic substances that

effectively contribute to the total toxicity of a sample. The routinely used approach is based

on fractionation of the sample according to its physicochemical properties: volatility,

solubility and chemical properties such as the ability to form complexes, or to be reduced,

oxidized, ionized, among others. In conjunction with the chemical tests, the toxicological tests

in particular the Microtox System contribute to the investigation of the toxicity to the

metropolitan rivers, Tiet, Pinheiros and Tamanduate, which proved to be effective in the

determination of the groups of compounds, the organic compounds being apolar, organic

volatiles, surfactants and particulates, the main sources of toxicity for the studied rivers.

Although much information on toxicity has been discovered, the identification of compounds

can only be performed by more robust chemical analyzes since a large number of substances,

metabolites, degradation byproducts are readily found in this type of sample. Even with some

modifications, it is necessary to encourage the use of this methodology for other rivers in

order to determine the main xenobiotics responsible for toxicity.

Key words: chemical fractionation, toxicity, Microtox System, Vibrio fischeri,surfactants.

27

Aos meus avs,

Valdenice e Vivaldo.

E in memorian, Vitor Martins e

Teresa Maria de Jesus, que sempre

estiveram presentes na minha vida,

sentirei muito a sua falta.

28

AGRADECIMENTOS

Agradeo ao Dr. Gilson Alves Quinglia pela confiana e amizade. Muito obrigado por

todos os ensinamentos e acima de tudo pela oportunidade de desenvolver esse projeto, uma

experincia nica na minha vida.

Prof. Dra. Elizabeth Nascimento, querida orientadora. Muito obrigado pela confiana,

ensinamentos, pacincia. Uma tima pessoa, orientadora, professora, muito orgulho de ser seu

orientado.

Aos funcionrios da CETESB que me ajudaram nesta jornada. Em especial, Wlace

Soares, Ivo de Freitas no qual devo muito. Ao Jos Francisco Viana, que dividiu

pacientemente o Microtox comigo, meu muito obrigado. Meu muito obrigado, tambm, ao

Genival e Coimbro pela amizade. Dani que sempre esteve a disposio para me ajudar e

pela amizade. Barbara que considero muito, meu muito obrigado. Levarei a amizade de

todos do ELTA para sempre comigo.

s ps-graduandas da rea, Gisela Martini e Suellen Coutinho, obrigado pela amizade,

por me aturar nos momentos difceis. Lembrarei com carinho dos perrengues que passamos

juntos, dessa vida de ps-graduando.

Agradeo ao setor de coleta e amostragem da CETESB e a todo da CETESB, em geral,

pelo apoio, cedendo toda a infraestrutura e recursos, em especial a Sandra do Setor de

Ecotoxicologia Aqutica.

minha famlia, minha me Selma, meu paiSrgio, e minha irm Jssica que do todo

apoio para mim, apoio esse que muito importante para seguir em frente e buscar meus

sonhos. s meus tios e tias com muito carinho, meus muito obrigado.

Aos meus amigos, Raphael, Rubens, Natlia e Vinicius.

Aos colegas da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP, Aline, Laura. E Samantha

pela ajuda na burocracia. Meu agradecimento aos professores da ps-graduaopelos

ensinamentos.

CNPq e CAPES pela bolsa concedida.

s pessoas que contriburam de alguma forma para esse trabalho...

...MUITO OBRIGADO

29

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1. Imagem da poluio do rio Tiet na regio de Pirapora do Bom Jesus, causada

principalmente pelo excesso de esgoto no tratado. .............................................................................. 47

Figura 2: Classificao das UGRHIs de acordo com suas vocaes. (1) UGRHI Mantiqueira, (2)

UGRHI Paraba do Sul, (3) UGRHI Litoral Norte, (4) UGRHI Pardo, (5) UGRHI Piracicaba, Capivari

e Jundia, (6) UGRHI Alto Tiet, (7) UGRHI Baixada Santista, (8) UGRHI Sapuca/Grande, (9)

UGRHI Mogi-Guau, (10) UGRHI Sorocaba/Mdio Tiet, (11) UGRHI Ribeira de Iguape/Litoral Sul,

(12) UGRHI Baixo Pardo/Grande, (13) UGRHI Tiet/Jacar, (14) UGRHI Alto Paranapanema, (15)

UGRHI Turvo/Grande, (16) UGRHI Tiet/Batalha, (17) UGRHI Mdio Paranapanema, (18) UGRHI

So Jos dos Dourados, (19) UGRHI Baixo Tiet, (20) UGRHI Aguape, (21) UGRHI Peixe, (22)

UGRHI Pontal do Paranapanema. ......................................................................................................... 49

Figura 3. Consumo de gua na URGHI 6 - Alto Tiet, comparando as porcentagens de vazo de gua

utilizadas em cada setor......................................................................................................................... 50

Figura 4. Mapa da UGRHI 6, alto Tiet contendo todos os pontos de coleta nesta regio. .................. 52

Figura 5. (a) Foto da nascente do rio Tiet; (b) rio Tiet na regio de Salto/SP; (c) Imagens do rio

Tiet em Pereira Barreto/SP; (d) rio Tiet em So Paulo. ..................................................................... 53

Figura 6. Trajetria do rio Tiet pelo Estado de So Paulo. ................................................................. 54

Figura 7. Fotos da foz do rio Pinheiros (a) em 1929 (b) em 2015. ....................................................... 56

Figura 8. Localizao da Bacia Hidrogrfica do Tamanduate. ............................................................ 57

Figura 9. Bactria luminescente Aliivibrio fischeri, organismo-teste. .................................................. 60

Figura 10. Mononucleotdeo de flavina ou FMN(uma flavina que funciona como grupo prosttico em

diversas reaes de oxirreduo em bioqumica). Sua forma oxidada FMN e sua forma reduzida

FMNH2. ................................................................................................................................................. 61

30

Figura 11. Imagem tpico de porcentagem de efeito por concentrao do Microtox, em escala

logartmica. ............................................................................................................................................ 63

Figura 12. Imagem do fator Gamma por concentrao para determinao da CE50 e CE20. ................. 64

Figura 13. Equipamento para realizar os testes de toxicidade............................................................... 65

Figura 14. Fluxograma para a Fase 1 do TIE. ....................................................................................... 67

Figura 15. Ilustrao das etapas que compem a extrao em fase slida, que compreendem:

condicionamento, adio da amostra, lavagem para remoo de interferentes e eluio dos analitos de

interesse. ................................................................................................................................................ 73

Figura 16. Estruturas qumicas da resina de preenchimento do cartucho de SPE. MCX (cartuchos

misto de troca inica de fase reversa) HLB (cartuchos de equilbrio hidroflico-lipoflico de fase

reversa) e MAX (cartuchos mistos de troca aninica de fase reversa) .................................................. 74

Figura 17. Regio de interface de uma partcula de slica funcionalizada com uma cadeia de octadecil

(18 carbonos), uma estrutura extremamente apolar. ............................................................................. 75

Figura 18. Concentrador de amostras utilizado na evaporao de solventes. ....................................... 80

Figura 19. Sistema montado para extrao em fase slida (SPE). ........................................................ 81

Figura 20. Sistema montado para aerao da amostra, que consiste na ligao de 7 divisores de ar,

ligados entre si. Uma mangueira adaptada com um filtro ligada diretamente linha de ar comprimido

e em cada sada do divisor conectado uma mangueira que por sua vez colocada na amostra. ........ 82

Figura 21. Sistema de filtrao a vcuo utilizado para filtrar a amostra dos rios Tiet, Pinheiros e

Tamanduate. ......................................................................................................................................... 87

Figura 22. Esquema de eluio utilizando 10 mL de metanol aps a eluio da amostra em pH cido.

............................................................................................................................................................... 88

Figura 23. Ilustrao da etapa de eluio dos composto retidos na coluna HLB. ................................. 89

31

Figura 24. Esquema das misturas de solvente utilizadas para a eluio dos compostos retidos na coluna

C18, onde a frao A composta por 10 mL de hexano, a frao B composta por 10 mL de

diclorometano/hexano na proporo de 4:1 (v v-1) e a frao C corresponde a uma mistura de

metanol/diclorometano (DCM) na proporo de 9:1 (v v-1). ................................................................ 90

Figura 25. Fluxograma da execuo do condicionamento da coluna SPE, C18 e HLB e a retirada do

branco da coluna.Este procedimento antecede a extrao em fase slida e na etapa 2 o pH da gua ultra

purificada o mesmo pH em que se encontra a amostra. ..................................................................... 93

Figura 26. Fluxograma de extrao em fase slida (SPE) e filtrao referente ao branco. A coluna deve

ser condicionada conforme indicado a segura anterior. ........................................................................ 94

Figura 27. Fluxograma de extrao da amostra e da eluio da coluna e filtrao nas trs faixas de pH

trabalhados. ........................................................................................................................................... 95

Figura 28. Fluxograma da adio de tiossulfato de sdio na amostra e no branco executados no mesmo

instante. A adio de tiossulfato crescente em cada frao. ............................................................... 96

Figura 29. Fluxogramas de execuo da adio do EDTA na amostra e no branco que foram

executadas no mesmo instante. A adio do EDTA crescente em cada frao. ................................. 97

Figura 30. Carta controle para a soluo aquosa de (a) fenol, (b) dicromato de potssio e (c) sulfato de

zinco ...................................................................................................................................................... 99

Figura 31. Toxicidade expressa em CE20 no sistema Microtox em funo do tempo, (a) rio Pinheiros,

(b) rio Tiet e (c) rio Tamanduate. ..................................................................................................... 102

Figura 32. Grfico pluviomtrico da mdia mensal da UGHRI 6 Alto Tiet do ano de 2016. ........ 104

Figura 33. Teste de toxicidade aguda em 5 e 15 minutos para as guas do rio Jaguar. ..................... 104

Figura 34. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Tiet usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distancias euclidianas. ................. 106

32

Figura 35. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Tamanduate usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distncias euclidianas. ..... 106

Figura 36. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Pinheiros usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distncias euclidianas. .......... 107

Figura 37. Teste de toxicidade aguda do reagente EDTA usado para complexar metais ................... 109

Figura 38. Resultado de toxicidade da gua do rio Jaguar fortificada com chumbo na concentrao de

10 mg L-1. ............................................................................................................................................ 110

Figura 39. Teste de toxicidade aguda para o branco fortificado com chumbo 10 mg L-1 e EDTA

adicionado em diferentes concentraes. ............................................................................................ 111

Figura 40. Teste de toxicidade aguda com EDTA na amostra do rio Pinheiros.................................. 112

Figura 41. Teste de toxicidade aguda com EDTA na amostra txica do rio Tiet. ............................. 113

Figura 44. Teste de toxicidade do tiossulfato de sdio em trs concentraes diferentes. ................. 115

Figura 43. Teste de toxicidade para determinar a CE20 do branco fortificado com prata 10 mg L-1 aps

5 e 15 minutos de exposio. .............................................................................................................. 116

Figura 44. Teste de toxicidade aguda com branco fortificado com prata em diferentes concentraes de

tiossulfato de sdio. ............................................................................................................................. 117

Figura 45. Teste de toxicidade aguda com amostras do (a) rio Pinheiros e (b) Tiet em dirferentes

concentraes de tiossulfato de sdio ................................................................................................. 117

Figura 46. Resultados de gradao de pH do rio Tiet para os limites da faixa de trabalho do

organismo-teste e os respectivos brancos. ........................................................................................... 119

Figura 47. Resultados de gradao de pH do rio Pinheiros para os limites da faixa de trabalho do

organismo-teste e os seus respectivos brancos. ................................................................................... 120

33

Figura 48.Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Tiet e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade, pH da amostra e

a data da execuo da manipulao. .................................................................................................... 122

Figura 49. Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Tamanduate e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade. ......... 123

Figura 50. Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Pinheiros e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade. ............... 124

Figura 51. Curva terica de fator de reteno em funo do pH da amostra e as faixas recomendveis

de trabalho das duas fases estacionrias, C18 e Oasis HLB. ........................................................... 127

Figura 52. Resultados de toxicidade obtidos aps realizar a extrao em fase slida para a amostra dos

rios(a) Tiet, (b) Pinheiros e (c) Tamanduate. ................................................................................... 128

Figura 53. Efeito txico dos brancos da coluna realizando no incio, aps o condicionamento da

coluna. ................................................................................................................................................. 131

Figura 54. Valores de CE20 em porcentagem das amostras dos trs rios estudados. ........................... 132

Figura 55. Curva dose-resposta para o metanol puro obtida pelo sistema Microtox em 15 minutos de

exposio. ............................................................................................................................................ 133

Figura 56. Teste toxicolgico para a soluo de fenol em metanol na concentrao de 47,5 mg L-1. A

CE20 calculada de 28,32% com intervalo de confiana de 25,94-30,91. .......................................... 134

Figura 57. Resultados de toxicidade apresentados anteriormente, porm convertidos em unidades

txica, UT20. ........................................................................................................................................ 136

Figura 58. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15 minutos de

exposio para o rio Pinheiros. ........................................................................................................... 138

34

Figura 59. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Pinheiros, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH

trabalhadas. .......................................................................................................................................... 139

Figura 61. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15 minutos de

exposio para o rio Tamanduate. ...................................................................................................... 140

Figura 61. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Tamanduate, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH.

............................................................................................................................................................. 141

Figura 62. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15 minutos de

exposio. Somente as manipulaes que reduziram a toxicidade da amostra do rio Tiet foram

colocadas. ............................................................................................................................................ 143

Figura 63. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Tiet, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH. ........ 144

35

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Grupo de variveis da qualidade da gua monitoradas pela CETESB. ................................. 51

Tabela 2.Exemplos de possvel interpretao para os testes da Fase1 .................................................. 68

Tabela 3. Localizao geogrfica dos pontos de coleta para os trs rios, Tiet, Pinheiros e Tamanduate

utilizados neste trabalho. ....................................................................................................................... 78

Tabela 4.Cronograma de coleta realizado. ............................................................................................ 78

Tabela 5.Volumes da soluo de EDTA 15,0 g L-1 utilizados no teste de quelao com agente

complexante, juntamente com a concentrao final de EDTA adicionados ......................................... 85

Tabela 6. Volumes de soluo de tiossulfato de sdio (Na2S2O3)1,62 g L-1adicionado s amostras eaos

brancos com as concentraes. .............................................................................................................. 86

Tabela 7. Solventes usados na extrao em fase slida, com as repectivas propores em cada fase

estacionria. ........................................................................................................................................... 91

Tabela 8. Valores de CE20 em porcentagem para os rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate. ............... 100

Tabela 9. Cronograma com a informaes pluviais nas ltimas 24 horas .......................................... 103

Tabela 10. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Studentpara o rio Pinheiros. ................................................................................................................ 113

Tabela 11. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Student para o rio Tiet ....................................................................................................................... 114

Tabela 12. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Student. ................................................................................................................................................ 118

36

Tabela 13. Resultados estatsticos referente ao teste t de Student para amostras emparelhadas,

comparando os valores mdios de efeito txico (5 e 15 minutos) dos pares: amostra e gradao em

diferentes valores de pH. ..................................................................................................................... 120

Tabela 14. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com as

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Tiet. ........................................................... 123

Tabela 15. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com as

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Tamanduate. .............................................. 124

Tabela 16. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Pinheiros. .................................................... 125

Tabela 17. Efeito txico dos brancos aps a filtrao em pH cido, bsico e inicial na concentrao

mxima permitida pelo Sistema Microtox, 81,9%. ........................................................................... 126

Tabela 18. Resultado dos valores de toxicidade, efeito txico, no tempo de exposio de 5 e 15

minutos. Utilizando o protocolo com uma serie de nove diluies visando determinar a CE20. ......... 134

Tabela 19. Resultados de toxicidade (CE20 em 15 minutos) do metanol de lavagem usado aps o

procedimento de aerao. .................................................................................................................... 135

Tabela 20. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Pinheiros o valor do

intervalo de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%. ............. 137

Tabela 21. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Tamanduate o valor do

intervalo de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%. ............. 140

Tabela 22. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Tiet o valor do intervalo

de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%. ............................ 142

Tabela 23. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Tiet. ................................................................................. 158

37

Tabela 24. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Tamanduate ..................................................................... 159

Tabela 25. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Pinheiros ........................................................................... 161

38

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

USEPA Agncia de proteo ambiental dos Estados Unidos

TIE/AIT Avaliao e identificao da toxicidade

CETESB Companhia ambiental do Estado de So Paulo

ONU Organizao da Naes Unidas

PAH Hidrocarboneto policclico aromtico

PCB Bifenila policlorada

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

UGRHI Unidade de Gerenciamento de Recursos hdricos

PIB Produto Interno Bruto

DBO Demanda bioqumica de oxignio

DAEE Departamento de gua e energia eltrica do Estado de So Paulo

CPTM Companhia Paulista de Trens Metropolitanos

FMNH2 Riboflavina 5-fosfato

FMN Mononucleotdeo de flavina

CE20 Concentrao efetiva capaz de reduzir a luminescncia em 20%

EDTA Etilenodiaminotetractico

SPE Extrao em fase slida

SAX Cartucho de troca aninica

SCX Cartucho de troca catinica

HPLC Cromatografia Lquida de Alta eficincia

GC Cromatografia gasosa

ICP-OES Espectrometria de Emisso ptica por Plasma Acoplado Indutivamente

ICP-MS Espectrometria de massa por plasma acoplado indutivamente

GFAAS Espectrometria de absoro atmica em forno de grafite

FAAS Espectrometria de absoro atmica de chama

MCX Coluna misto de troca catinica de fase reversa

HLB Coluna balanceada hidroflico-lipoflico de fase reversa

MAX Coluna misto de troca aninica de fase reversa

SAO Soluo de Ajuste Osmtico

39

DCM Diclorometano

IC Intervalo de confiana

Und Unidade

Unt Unidade de turbidez

NIST Instituto Nacional de Padres e Tecnologia

LAS Sulfonato de alquilbenzeno linear

UT Unidade txica

AEO lcoois polietoxilados

NPEO Nonilfenol polietoxilado

TIET Rio Tiet

PINH Rio Pinheiros

TAMT Rio Tamanduate

40

LISTA DE SMBOLOS

R Cadeia carbnica longa (alcano)

I0 Luminescncia do controle em tempo inicial

t Tempo

Fc Fator de correlao

f(t) Fator de correlao em um determinado tempo

Io(t) Leitura da luminescncia inicial do branco em um determinado tempo

I(t) Leitura da luminescncia inicial da cubeta do teste em um determinado tempo

%E(t) Porcentagem de efeito em um determinado tempo

c Concentrao

Gamma

a Coeficiente linear

b Coeficiente angular

A80 Frao da amostra correspondente aos 80 mL iniciais

A170 Frao da amostra correspondente aos 170 mL iniciais

B70 Frao do branco correspondente aos 70 mL iniciais

H1 Hiptese alternativa

H0 Hiptese nula

p Probabilidade associada/significncia

41

SUMRIO

1 INTRODUO ..................................................................................................................................... 43

2 REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................................. 45

2.1 A questo da gua ......................................................................................................................... 45

2.1.1 No Brasil .............................................................................................................................. 45

2.1.2 Poluio Hdrica ................................................................................................................... 46

2.2 Hidrografia do Estado de So Paulo .............................................................................................. 48

2.2.1 URGHI 6: Alto Tiet ............................................................................................................ 49

2.2.2 Rio Tiet ............................................................................................................................... 53

2.2.3 Rio Pinheiros ........................................................................................................................ 55

2.2.4 Rio Tamanduate .................................................................................................................. 57

2.3 Toxicologia Ambiental .................................................................................................................. 58

2.3.1 Aspectos gerais .................................................................................................................... 58

2.3.2 Toxicologia ambiental e a Sade humana ............................................................................ 59

2.3.3 Sistema Microtox ............................................................................................................... 60

2.4 Avaliao e identificao da toxicidade ........................................................................................ 66

2.4.1 Fase 1: Fase da Caracterizao ............................................................................................ 66

2.4.2 Fase 2: Fase de Identificao ............................................................................................... 69

2.4.3 Fase 3: Fase da Confirmao ............................................................................................... 70

2.5 Fracionamento Qumico ................................................................................................................ 71

2.5.1 Extrao em fase slida ........................................................................................................ 72

2.5.2 Filtrao, mudana no pH e outras manipulaes ................................................................ 75

3 OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 77

3.1 Gerais ............................................................................................................................................. 77

3.2 Especficos ..................................................................................................................................... 77

4 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................................. 78

4.1 Amostragem e Coleta .................................................................................................................... 78

4.2 Materiais ........................................................................................................................................ 79

4.2.1 Reagentes ............................................................................................................................. 79

4.2.2 Equipamentos ....................................................................................................................... 80

4.2.3 Softwares .............................................................................................................................. 83

4.3 Procedimentos Experimentais ....................................................................................................... 83

4.3.1 Protocolo de execuo do ensaio de toxicidade aguda sistema Microtox ............................... 83

4.3.1.1 Reconstituio da bactria liofilizada ............................................................................................. 83

4.3.1.2 Ensaio de toxicidade aguda com substncia de referncia .............................................................. 83

4.3.1.3 Ensaio de toxicidade aguda seriada da amostra .............................................................................. 84

4.3.1.4 Ensaio de toxicidade aguda em dose nica ..................................................................................... 84

42

4.3.2 Protocolos para avaliao e identificao da toxicidade ...................................................... 85

4.3.2.1 Adio de EDTA ............................................................................................................................ 85

4.3.2.2 Adio de tiossulfato de sdio ........................................................................................................ 85

4.3.2.3 Gradao do pH .............................................................................................................................. 86

4.3.2.4 Ajuste de pH e Filtrao a vcuo .................................................................................................... 86

4.3.2.5 Extrao em fase slida................................................................................................................... 88

4.3.2.6 Aerao ........................................................................................................................................... 90

4.3.2.7 Recuperao da toxicidade a partir do eluato .................................................................................. 91

4.4 Fluxograma Experimental ............................................................................................................. 92

5 RESULTADOS E DISCUSSO .......................................................................................................... 98

5.1 Qualidade sistema Microtox ........................................................................................................ 98

5.2 Toxicidade inicial dos rios e outros parmetros .......................................................................... 100

5.3 Avaliao e identificao da toxicidade ...................................................................................... 108

5.3.1 EDTA ................................................................................................................................. 108

5.3.2 Tiossulfato de sdio ........................................................................................................... 114

5.3.3 Gradao do pH ................................................................................................................. 119

5.3.4 Ajuste de pH e Filtrao vcuo ....................................................................................... 121

5.3.5 Extrao em fase slida ...................................................................................................... 126

5.3.6 Aerao .............................................................................................................................. 131

5.3.7 Recuperao da toxicidade a partir do eluato ..................................................................... 136

6 CONCLUSES ................................................................................................................................... 145

7 RECOMENDAES ......................................................................................................................... 147

REFERNCIAS ......................................................................................................................................... 148

ANEXOS ..................................................................................................................................................... 158

43

1 INTRODUO

O meio ambiente umas das grandes preocupaes governamentais e de sade do ltimo

sculo, sendo que muitos problemas decorrentes das suas alteraes esto sendo detectados

em diferentes nveis. Em termos de sade humana, h um grande aumento de casos de

problemas respiratrios provocados pela poluio (ARBEX et al., 2012). Na biota, um caso

que vem chamando a ateno mundial so os interferentes endcrinos (WHO, 2012) que

causam alteraes fisiolgicas ou morfolgicas em baixas concentraes, tais como alterao

na proporo de machos e fmeas de determinados grupos ecolgicos, desenvolvimento de

caractersticas femininas em peixes machos (WHO, 2012), entre outras.

Neste cenrio, a gua um importante veculo a ser contemplado em discusses e estudos

cientficos. Sua importncia incontestvel para o desenvolvimento humano e, acima de tudo,

para a manuteno da vida no planeta. A gua doce (gua de rios, lagos, lenis subterrneos

com uma salinidade prxima de zero) representa apenas 2,5% do total de gua existente no

planeta, sendo que 0,3% so facilmente disponveis para o consumo, ou seja, guas de rios,

riachos, crregos, lagoas, lagos e represas (CAMPOS, 2012). Esta facilidade em obter este

recurso tambm faz destes veculos um dos mais impactados por ao antropognica,

principalmente nos grandes centros urbanos.

Outro ponto importante na dinmica dos recursos hdricos que existe um grande

desperdcio de gua potvel, tanto em processos industriais e agrcolas, quanto pela

populao. A gesto dos recursos hdricos torna-se necessria no contexto empresarial e

governamental para tornar o uso da gua mais consciente.

O rio Tiet e seus afluentes vm sendo, h tempos, utilizados como corpos receptores do

esgoto, no somente da cidade de So Paulo, como de toda a regio metropolitana. Com o

aumento populacional e a falta de polticas pblicas sanitrias o rio se deteriorou perdendo

suas caractersticas, tais como cachoeiras e corredeiras em seu percurso e se adequando

nova realidade. Outras mudanas na paisagem do rio Tiet e seus principais afluentes foram

implantadas visando minimizar problemas de enchentes na grande So Paulo. Todas estas

modificaes fsicas ao longo de anos e toda a carga de esgoto lanada modificaram

profundamente o rio Tiet na regio metropolitana (PAGANINI, 2008).

A contaminao por poluentes, urbanos, industriais e agrcolas, vem sendo monitorada

constantemente pelas agncias ambientais responsveis. A crescente demanda dos recursos

hdricos, tanto pelos processos industriais quanto pela populao, uma questo

44

importantssima, uma vez que, atualmente, a poluio presente altera a dinmica

socioeconmica local, alm da diminuio da biodiversidade.

A expresso da toxicidade caracterizada pela exposio (magnitude, durao,

frequncia) e pelas propriedades fsico-qumicas e suas interaes com a biota, ou seja,

suscetibilidade dos sistemas biolgicos quele poluente. O dano que essas substncias txicas

podem causar na populao vai depender da extenso da contaminao, do contato com o

toxicantes, de sua toxicidade e persistncia (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008).

Os ensaios ecotoxicolgicos tm sido uma ferramenta muito importante na avaliao da

toxicidade em amostras ambientais e no monitoramento da qualidade da gua. Ensaios de

bioluminescncia (Sistema MICROTOX), ensaios com algas Selenastrum capricornutum,

microcrustceos Ceriodaphnia dubia e peixes Pimephales promelas so amplamente

utilizados em rotinas para se avaliar e monitorar a qualidade das guas e o impacto da

poluio sobre a flora e fauna. Todos estes dados, levantados a partir de estudos

ecotoxicolgicos so usados para definir limites de exposio para proteger a biota.

Em 1991 a Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) publicou um

protocolo visando no somente a avaliao da toxicidade, mas tambm na sua identificao,

conhecido como Toxicity Identification Evaluation (TIE) ou Avaliao e Identificao da

Toxicidade (AIT). Este documento baseia-se em obter informaes sobre o composto, ou

grupo de compostos, que causam toxicidade, alterando alguma propriedade qumica inerente

quele. Desta forma, ensaios toxicolgicos podem ser feitos nas fraes obtidas a fim de

determinar os compostos que causam efeito.

O TIE, usado por entidades ambientais como a Companhia Ambiental do Estado de So

Paulo (CETESB), torna-se uma ferramenta importantssima no combate poluio e aponta

caminhos para polticas de gesto dos recursos, no somente hdricos (foco do trabalho), mas

tambm em qualquer compartimento ambiental: solo, sedimento e ar. Trabalhos vm sendo

feitos neste sentido e o laboratrio de ecotoxicologia dentro da CETESB tem protocolos de

avaliao e identificao da toxicidade para Ceriodaphnia dubia, e j realizou alguns

trabalhos sobre o tema, tais como: Avaliao e Identificao da Toxicidade Crnica no Canal

de Fuga II(BURATINI; ARAGO, 2007), Avaliao e Identificao da Toxicidade no Rio

Baquirivu-Guau"(BURATINI, 2005).

Expandir esta metodologia para outros organismos como a bactria Aliivibrio fischeri e

aplic-la ao ensaio MICROTOX, que um ensaio toxicolgico rpido e muito eficiente para

amostras ambientais impactadas, faz-se necessrio como uma forma de aprofundar o trabalho

45

j realizado e aprimor-lo com tcnicas mais modernas de fracionamento qumico e

separaes qumicas.

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 A questo da gua

O planeta Terra comporta imensa variedade de organismos vivos, e a gua o elemento

base para todos eles. No existiria vida em nosso planeta se no houvesse gua. Aspectos

econmicos tambm esto envolvidos neste recurso e, hoje em dia, muitos processos

industriais e agrcolas implicam no consumo direto de gua. Atividades humanas como

turismo, lazer e gerao de energia so tambm exemplos de seu uso.

2.1.1 No Brasil

Como previsto na legislao brasileira e na Agenda 21, a gua um bem a que todos

devem ter direito, todos devem ter gua potvel em quantidades suficientes, com custo

acessvel e facilmente disponvel para uso domstico ou pessoal. Em mbito mundial, cada

sociedade possui uma relao peculiar com a gua, que reflete a diversidade de valores e de

experincias acumuladas. Como referncia cultural e social, a gua encontra grande expresso

nas artes, nas religies, na mitologia, no folclore, na cincia e na poltica. E muitas vezes

utilizada como instrumento de dominao em sociedades (BRASIL, 2006).

Da gua doce existente em nosso planeta, 68,9% encontra-se nas geleiras nos polos do

planeta, e regies montanhosas, 30% so guas subterrneas, 0,9% contempla umidade de

solo e pntanos e 0,3% constitui a poro superficial da gua doce presente em rios e lagos

(SHIKLOMANOV; RODDA, 2003). Esses 0,3% no esto distribudos uniformemente pelo

planeta. A distribuio est relacionada com a presena de ecossistemas que compe os

diversos territrios, sendo que uns podem apresentar uma maior abundncia em relao a

outros (BRASIL, 2006).

De acordo com a Organizao das Naes Unidas ONU (2010), uma pessoa precisa de

50 a 100 litros de gua por dia, uma mdia de 27.375 litros hab-1 ano-1, para suas necessidades

mais bsicas: beber, cozinhar, tomar banho, lavar roupas e utenslios. Pases como Kuwait,

Emirados rabes, Ilhas Bahamas e Faixa de Gaza possuem uma disponibilidade hdrica de 10

46

a 66 litros hab-1 ano-1, enquanto que pases como Canad, Rssia, Guianas e Gabo possuem

uma mdia superior a 100.000 litros hab-1 ano-1 (SOUZA, 2010).

O aumento populacional, e a consequente a poluio provocada, o consumo excessivo e o

alto desperdcio contribuem para reduo da disponibilidade da gua. A populao mundial

triplicou no sculo XX, e o volume de gua utilizada aumentou aproximadamente nove vezes

neste mesmo perodo. Desta forma, o crescimento populacional e o consumo de gua

apresentaram um crescimento incompatvel com a quantidade total de gua presente no

planeta (BRASIL, 2006).

2.1.2 Poluio Hdrica

Nas ltimas dcadas, a poluio das guas vem se tornando cada vez mais considervel,

chegando a ponto de comprometer parte deste recurso. As caractersticas que fazem da gua

um meio ideal para o surgimento da vida tambm responsvel por deix-la vulnervel

poluio. A poluio pode vir de duas fontes: naturais e antropognicas, e caracterizada

quando a gua adquire substncias, partculas e microrganismos que a tornam imprprias para

o consumo humano, ou para a produo de alimentos, ou impacta o meio ambiente (RAND,

1995).

Os poluentes podem vir de diversos compartimentos ambientais e atingirem o corpo

dgua. A poluio atmosfrica introduz uma grande quantidade de poluentes gasosos como o

dixido de carbono, dixido de enxofre ou amnia, o que acaba por interferir no equilbrio

qumico de espcies naturalmente presentes. Outra fonte de poluio das guas so os rejeitos

industriais que so lanados diretamente nos rios. Este tipo de poluio pode alterar

propriedades fsico-qumicas da gua, ou pode conter alguma espcie inorgnica, ou orgnica

muito txica para a vida, causando um desequilbrio ecolgico (RAND, 1995). O esgoto

domstico caracterizado pela presena de substncias provenientes de residncias, edifcios

comerciais, compondo-se essencialmente de gua de banho, urina, fezes, detergentes e guas

de lavagem (PAGANINI, 2008). uma importante fonte poluidora dos rios nas regies

urbanizadas, por conter uma grande quantidade de produtos qumicos e matria orgnica que

causa um desequilbrio no ecossistema, dentre outros problemas. A figura 1 ilustra a poluio

por esgoto domstico sem tratamento, onde se observa uma camada espessa de espuma

cobrindo o rio Tiet na regio de Pirapora do Bom Jesus (54 km de So Paulo)(SCHIAVONI,

2015).

47

Figura 1. Imagem da poluio do rio Tiet na regio de Pirapora do Bom Jesus, causada

principalmente pelo excesso de esgoto no tratado.

Fonte: WHITAKER (2015).

A contaminao direta ou indireta dos poluentes orgnicos presentes nos produtos

industrializados ou nos processos industriais contribuem fortemente para a toxicidade da gua

(RAND, 1995).

Os praguicidas so substncias especficas usadas para exterminar ou controlar uma

determinada praga, e com isso podem atingir comunidades presentes no ecossistema, e

quimicamente podem ser complexas molculas orgnicas, ou uma simples substncia

inorgnica (RAND, 1995). Estas substncias, muitas vezes, so lixiviadas pela gua da chuva,

e carregadas para os rios e lagos prximos, causando uma poluio regional, ou tambm

podem percolar o solo, atingindo as guas subterrneas. Vale ressaltar que o solo e

sedimentos podem ser depsitos de poluentes, e que estes compartimentos esto em equilbrio

entre si.

No meio ambiente, um composto pode persistir um determinado tempo sem sofrer

qualquer transformao, e este perodo expresso em termos de meia-vida, definida como o

tempo para diminuir pela metade a concentrao inicial do poluente. As transformaes

sofridas pelos poluentes podem ser abiticas ou biticas. As reaes de transformao

abiticas predominantes na gua so a hidrlise (reao com molculas de gua), oxirreduo

(reaes onde ocorrem transferncia de eltrons) e fotlise (reaes mediadas pela presena

48

de ftons de luz). J as transformaes biticas so mediadas por organismos vivos presentes

no solo ou na gua, que por mecanismos bioqumicos transformam estes poluentes em

substncias mais solveis em gua o que possibilita uma fcil degradao (RAND, 1995;

OGA; CAMARGO BATISTUZZO, 2008)

Os ecossistemas so muitos adaptveis, mesmo uma substncia exgena pode ser

depurada e o sistema atingir um novo equilbrio sem acarretar grandes danos biota. Porm,

essa capacidade no infinita, podendo afetar a sobrevivncia dos organismos presentes e

causar um desequilbrio para o sistema. Espcies de ecossistemas diferentes podem ser

afetadas se tiverem uma ligao com o ambiente poludo, como, por exemplo, pela cadeia

alimentar, expondo outros organismos substncia txica (MANAHAN, 2013).

2.2 Hidrografia do Estado de So Paulo

O Estado de So Paulo possui em rea de aproximadamente 248.000 km2 e est localizado

na regio Sudeste no Brasil, representando 3% do territrio nacional e faz divisas com os

Estados de Minas Gerais ao Norte, Paran ao Sul, Mato Grosso do Sul ao oeste e Rio de

Janeiro ao leste. O Estado possui 645 municpios, divididos em 4 Regies Metropolitanas: (1)

Regio Metropolitana de So Paulo, (2) Regio Metropolitana da Baixada Santista, (3) Regio

Metropolitana de Campinas, (4) Regio Metropolitana do Vale do Paraba e Litoral Norte.

Hoje, (Estimativa populacional referente ao 15/09/2015 do Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatstica - IBGE) residem no estado de So Paulo, 44,3 milhes de habitantes, cerca de 22%

de toda a populao brasileira. Na cidade de So Paulo so 12 milhes de habitantes (IBGE,

2015).

Em termos hidrolgicos, a regio de So Paulo est localizada na Bacia Hidrogrfica do

Rio Paran, tendo como limites naturais os rios: Grande, Canoas, Pardo, da Ribeira do Iguape,

Itapirapu, Itarar, Paranapanema e Paran, alm do Oceano Atlntico. Outros rios

importantes no Estado de So Paulo, incluem; Tiet, Turvo, Pardo, do Peixe, Paraba do Sul e

Piracicaba.(BIBLIOTECA VIRTUAL, 2016)

A Lei n 9.034/1994 estabeleceu a diviso por vocao em 22 Unidades de

Gerenciamento de Recursos Hdricos (UGRHI) (Figura 2), no plano estatual de recursos

hdricos. Entende-se por vocao o uso predominante das guas que so destinadas

agropecuria, de conservao, em processo de industrializao e industrial (CETESB, 2014).

49

Figura 2: Classificao das UGRHIs de acordo com suas vocaes. (1) UGRHI Mantiqueira, (2)

UGRHI Paraba do Sul, (3) UGRHI Litoral Norte, (4) UGRHI Pardo, (5) UGRHI Piracicaba, Capivari

e Jundia, (6) UGRHI Alto Tiet, (7) UGRHI Baixada Santista, (8) UGRHI Sapuca/Grande, (9)

UGRHI Mogi-Guau, (10) UGRHI Sorocaba/Mdio Tiet, (11) UGRHI Ribeira de Iguape/Litoral Sul,

(12) UGRHI Baixo Pardo/Grande, (13) UGRHI Tiet/Jacar, (14) UGRHI Alto Paranapanema, (15)

UGRHI Turvo/Grande, (16) UGRHI Tiet/Batalha, (17) UGRHI Mdio Paranapanema, (18) UGRHI

So Jos dos Dourados, (19) UGRHI Baixo Tiet, (20) UGRHI Aguape, (21) UGRHI Peixe, (22)

UGRHI Pontal do Paranapanema.

Fonte: CETESB (2014).

As principais UGRHIs do Estado de So Paulo encontram-se impactadas. Grande parte da

populao paulista no tem seu esgoto atendido pelo sistema de tratamento. Por se tratar de

uma regio altamente industrializada, muitos efluentes industriais tambm no apresentam um

tratamento devidamente adequado, gerando mais impacto nas bacias hidrogrficas do Estado.

Alm das atividades industriais, a agricultura tambm representa uma parcela importante na

contaminao, com a utilizao de praguicidas e fertilizantes (CETESB, 2014).

2.2.1 URGHI 6: Alto Tiet

A URGHI 6 Alto Tiet inclui mais da metade da populao do Estado de So Paulo

compreende a regio metropolitana de So Paulo, e composta por 34 municpios. Seu

principal rio o Tiet, que, abrangendo sua nascente at a barragem do Reservatrio de

50

Pirapora, apresenta cerca de 133 km de extenso. So constituintes da URGHI 6 os seguintes

corpos hdricos: rios Tiet, Claro, Paraitinga, Biritiba-Mirim, Jundia, Taiaupeba-Mirim,

Embu-Guau, Embu-Mirim, Cotia, Baquirivu-Guau, Tamanduate, Pinheiros, Juqueri,

Grande, das Pedras, Ribeiro do Campo, Ponte Nova, Biritiba, Taiaupeba, Pedro Beicht,

Cachoeira da Graa, Juqueri, Edgard de Souza, Pirapora, guas Claras, e crregos

Aricanduva e Cabuu, Reservatrios Billings e Guarapiranga (CAMPOS, 2012; CETESB,

2014).

Nesta regio concentra-se grande parte da riqueza do pas, cerca de 15% do Produto

Interno Bruto (PIB) brasileiro, pois nela esto instaladas grandes multinacionais do ramo

farmacutico, automotivo, qumico, setores de telecomunicaes, transportes, servios,

centros universitrios de grande porte, e centros financeiros. A distribuio dos recursos

hdricos no Estado ilustrada na figura 3. Grande parte dos recursos hdricos nesta URGHI

est destinada aos processos industriais com 79%, uma vazo de 68,5 m3 s-1. Os outros usos,

como o urbano que se resume praticamente ao uso domstico e a irrigao, correspondem a

17% e 4% com vazes de 14,33 m3 s-1 e 3,59 m3 s-1, respectivamente (CETESB, 2014).

Figura 3. Consumo de gua na URGHI 6 - Alto Tiet, comparando as porcentagens de vazo de gua

utilizadas em cada setor.

Fonte: Adaptado de CETESB (2014).

Os corpos hdricos da UGRHI 6 Alto Tiet, perderam suas vazes ao longo do tempo,

devido a intenso processo de urbanizao (CAMPOS, 2012), implementao do sistema

Tiet-Billings, impermeabilizao do solo, s reverses de bacias circunvizinhas e o

lanamento do esgoto diretamente no corpo hdrico, que levaram perda das caractersticas

naturais.

Industrial

79%

Urbano

17%

Irrigao

4%

51

Considerada como alta vulnerabilidade presso antrpica pelo rgo de monitoramento

ambiental (CETESB, 2014), esta unidade tem preocupado as entidades ambientais no Brasil.

A CETESB monitora a qualidade das guas por meio dos ensaios observados na tabela 1.

Tabela 1. Grupo de variveis da qualidade da gua monitoradas pela CETESB.

Grupo Principais Variveis Outras Variveis

Qumico Alumnio Dissolvido, Alumnio Total,

Carbono Orgnico Total, Chumbo Total,

Cloreto Total, Cobre Dissolvido, Cobre

Total, Cromo Total, DBO (5, 20)

demanda bioqumica de oxignio, Ferro

Dissolvido, Ferro Total, Fsforo Total,

Mangans Total, Mercrio Total, Niquel

Total, Nitrognio Amoniacal, Nitrognio

de Kjeldahl, Nitrognio-Nitrato,

Nitrognio-Nitrito, Oxignio Dissolvido,

pH, Potssio, Sdio, Sdio Dissolvido

Total, Sdio Total, Substncias tensoat.

Reagem c/ Azul de Metileno, Turbidez,

Zinco Total

Alcalinidade Total, Arsnio

Total, Boro Total, Carbono

Orgnico Dissolvido, Compostos

Orgnicos Volteis, Cor

Verdadeira, DQO, Dureza,

Fenis Totais, Fluoreto Total,

Herbicidas, Hidrocarbonetos

Aromticos Polinucleares, leos

e Graxas, Praguicidas

Organofosforados, Potencial de

Formao de THM

Hidrobiolgicos Clorofila a e Feofitina a Comunidades Fitoplanctnicas e

Zooplanctnica

Ecotoxicolgicos Ensaios de Toxicidade crnica com o

microcrustceo Ceriodaphnia dbia

Ensaios de Toxicidade aguda

com bactria luminescente A.

fisheri (Sistema Microtox),

Microcistinas, Ensaios de

Mutao Reversa (Teste de

Ames)

Fonte: Adaptadode CETESB (2014).

A figura 4 ilustra o mapa da URGHI 6 Alto Tiet, onde se observa tambm os pontos da

rede bsica de monitoramento da CETESB.

52

Figura 4. Mapa da UGRHI 6, alto Tiet contendo todos os pontos de coleta nesta regio.

Fonte: SIGRH (2018)

53

2.2.2 Rio Tiet

O Rio Tiet, do tupi, gua (ti) verdadeira (et), o principal corpo hdrico do Estado de

So Paulo. Sua nascente se localiza no municpio de Salespolis, ao leste do Estado e a 96 km

da capital estadual, em uma altura de 850 m do nvel do mar. A mata ciliar ainda est

preservada, o que proporciona uma proteo do assoreamento e da eroso. As guas da

nascente so lmpidas e transparentes, com altos nveis de qualidade (FABHAT, 2015).

Segundo o Departamento de gua e Energia Eltrica do Estado de So Paulo (DAEE) o rio

Tiet possui em toda sua extenso 25 afluentes, sendo os principais os rios: Pinheiros,

Tamanduate, Aricanduva, Baquirivu-Guau, Batalha, Bauru, Baritiba-Mirim, Capivara,

Capivari, Cotia, Dourado, Jacar-Guau, Rio Jacar-Pepira, Ja, Jundia, Juqueri, Piracicaba,

So Loureno e Sorocaba. A figura 5 ilustra quatro imagens de diferentes pontos do rio Tiet.

Figura 5. (a) Foto da nascente do rio Tiet; (b) rio Tiet na regio de Salto/SP; (c) Imagens do rio

Tiet em Pereira Barreto/SP; (d) rio Tiet em So Paulo.

(a) (b)

(c) (d)

Fonte: SABESP(2011), CUNHA(2010) e ARQUIVO/AE(2011).

So 1.136 km percorridos pelo rio em todo Estado, no sentido interior, banhando cerca de

62 municpios que fazem parte de 5 UGRHI: Alto Tiet, Sorocaba/Mdio Tiet, Tiet/Jacar,

Tiet/Batalha e Baixo Tiet. O rio desgua no rio Paran na Cidade de Itapura, divisa com o

54

Estado de Mato Grosso do Sul (FABHAT, 2015). A figura 6, apresenta o mapa hidrolgico do

rio Tiet e seus afluentes, da nascente at a foz no rio Paran.

Figura 6. Trajetria do rio Tiet pelo Estado de So Paulo.

Fonte: BIBLIOTECA VIRTUAL(2016).

A importncia do rio Tiet no exclusivamente ligada a aspectos econmicos. A histria

do rio Tiet est atrelada a do Estado de So Paulo, pois muitas cidades foram fundadas em

suas margens, em pocas de colonizao portuguesa, onde suas guas eram utilizadas para

lazer, desenvolvimento agrcola e gerao de energia. Importantes historiadores ligam a

colonizao do interior paulista ao rio Tiet. O rio passou por grandes mudanas ao longo

destes anos, possua quedas dgua e corredeiras em seu percurso. Todavia, com o

desenvolvimento urbano, suas caractersticas foram alteradas, perdendo grande parte das suas

particularidades. O represamento de suas guas, a reduo da vazo das correntezas e o

nivelamento das suas margens na regio urbana da cidade de So Paulo foram algumas das

modificaes estruturais que alteraram a dinmica hidrolgica do rio Tiet (PAGANINI,

2008).

Em termos de qualidade, as alteraes iniciam logo aps a nascente, no municpio de

Biritiba Mirim onde grande quantidade de resduo da agricultura lixiviado para o rio. No

55

municpio de Mogi das Cruzes, que utiliza gua do rio para abastecimento, recebe efluentes

domsticos e industriais sem qualquer tratamento (PAGANINI, 2008). Na cidade de So

Paulo, o rio Tiet no possui vida aqutica, principalmente por receber carga de esgoto

domstico dos seus afluentes, e mesmo com iniciativas de desassoreamento do leito do rio e a

limpeza mecnica, o rio Tiet no consegue manter-se livre da poluio, isso porque a

quantidade de entrada de esgoto no rio muito maior que a depurao do mesmo. Com a

carga hdrica recebida dos rios Sorocaba, Piracicaba, Capivari e Jundia no interior do estado

tm-se uma melhora gradual da qualidade das guas. Esta melhora relacionada a iniciativas

municipais no tratamento do esgoto urbano, s caractersticas estruturais do rio que ajudam a

autodepurao dos poluentes como corredeiras, quedas dgua imediatamente jusante da

Regio Metropolitana de So Paulo e dos ambientes formados pelas represas de Barra Bonita,

Bariri, Ibitinga, Promisso, Nova Avanhandava e Trs Irmos(PAGANINI, 2008; CAMPOS,

2012).

280 km da capital, no muncipio de Barra Bonita, as guas do Tiet ficam mais

lmpidas. Um aspecto importante a presena de vida no rio, peixes entre outras formas de

vida. As atividades econmicas como a pesca voltam a ter relevncia, e tambm as atividades

recreativas.

2.2.3 Rio Pinheiros

O rio Pinheiros nasce do encontro dos rios Grande com o Guarapiranga e sua foz localiza-

se no rio Tiet, possui um comprimento de 25 km e localiza-se na cidade de So Paulo. No

Brasil colonial o rio Pinheiros foi chamado de Jurubatuba, lugar com muitas palmeiras

jerivs. Passou a ser chamado de Pinheiros com a chegada dos jesutas aps a criao da

aldeia de Pinheiros, nome dado pela grande quantidade de araucrias presentes no local. Foi

no incio do sculo XX que a paisagem em torno do rio comeou a sofrer transformaes, em

funo do processo imigratrio, uma vez que a cidade passou a receber muitos estrangeiros e,

concomitantemente, pela abundncia de recursos hdricos nesta regio, muitas fbricas

passaram a se instalar nas proximidades. Em 1928, foram iniciadas as obras de retificao das

margens do Rio Pinheiros com o objetivo de acabar com as inundaes e canalizar a gua

para a Represa Billings, invertendo o sentido do rio, com a Usina Elevatria de Traio. A

Represa Billings, desta forma, passaria a ser um grande reservatrio de gua para a Usina

56

Hidreltrica Henry Borden, em Cubato para gerar energia eltrica para a capital aproveitando

o grande desnvel da Serra do mar (LUZ, 2014).

Com o passar do tempo, as transformaes na paisagem do rio Pinheiros foram

aumentando: perda da mata ciliar, implantao de linhas de transmisso de energia, oleodutos,

gasodutos, instalao de linhas frreas (Linha 9 da CPTM, Companhia Paulista de Trens

Metropolitanos) e, principalmente, porque passou a receber esgotos domsticos e efluentes

industriais. A figura 7a ilustra uma foto tirada em 1929, onde se pode ver a foz do rio

Pinheiros, e a figura 7b ilustra a atual foz do rio Pinheiros, com grande modificao da

paisagem, no decorrer de 86 anosRODRIGUES(2012).

Figura 7. Fotos da foz do rio Pinheiros (a) em 1929 (b) em 2015.

(a)

(b)

Fonte: RODRIGUES(2012) e DONASCI(2015).

57

O rio Pinheiros recebe gua dos seus rios afluentes e crregos, muitos destes esto

canalizados, porm alguns so receptores direto do esgoto domstico da populao instalada

s margens dos crregos. (RIO... 2015)

2.2.4 Rio Tamanduate

Sua nascente localizada no Parque Ecolgico Gruta Santa Luiza no municpio de Mau e

sua foz no rio Tiet, na cidade de So Paulo. O rio Tamanduate significa, na lngua

indgena tupi, rio dos tamandus verdadeiros. Possui um comprimento de 35 km passando

pelas principais cidades do Estado de So Paulo, Mau, Santo Andr e So Caetano do Sul.

Seus principais afluentes so Ribeiro dos Meninos, Ribeiro da Moca, Crrego do Oratrio,

Crrego Guarar, Ribeiro Apia, Crrego Ipiranga, Ribeiro dos Couros, entre outros. A

Bacia Hidrogrfica do Tamanduate tem uma rea de 320 km2. A figura 8 apresenta o mapa

da Bacia Hidrogrfica do Tamanduate (RAMALHO, 2007).

Figura 8. Localizao da Bacia Hidrogrfica do Tamanduate.

Fonte: GOUVEIA(2010).

Assim como no rio Pinheiros, a ocupao irregular dos crregos afluentes, o envio do

esgoto direto para o corpo hdrico, a impermeabilizao das margens, canalizao e

diminuio das reas verdes so os principais problemas do rio Tamanduate. A poluio

58

oriunda do esgoto domstico e principalmente do efluentes industriais, por ser um rio muito

importante, e cruzar principais cidades da Regio do ABC, cidades estas muito

industrializadas. Enchentes so registradas, fruto dos mesmos problemas acima citados

(RAMALHO, 2007).

2.3 Toxicologia Ambiental

2.3.1 Aspectos gerais

Uma imensa quantidade de substncias qumicas chega aos corpos hdricos, como

compostos metlicos, substncias orgnicas cloradas, no cloradas, policclicas aromticas,

surfactantes, entre outras e, provocam modificaes negativas nos estados biolgicos,

qumicos e fsicos destes rios. Os efeitos txicos das substncias qumicas vo depender de

sua concentrao. Outro ponto contemplado pela toxicologia, a estrutura qumica do

contaminante, as interaes e o movimento entre os contaminantes da biosfera, pois so

propriedades que determinam a exposio, a biodisponibilidade e a dose efetiva (DIGIULIO;

NEWMAN, 2012).

Rand (1995) descreve o objetivo da toxicologia como sendo: proteger as populaes e

comunidades. A toxicologia ambiental uma cincia multidisciplinar que envolve diversas

reas de estudo como biologia, qumica (orgnica, analtica e bioqumica), gentica,

fisiologia, microbiologia, ecologia, geologia, gua e atmosfera, epidemiologia, estatstica,

legislao e a ecotoxicologia (HODGSON, 2010; YU, 2011).

Boudou e Ribeyre (1989) baseiam a anlise dos processos de transferncias de

contaminantes nos ecossistemas e nos efeitos sobre as estruturas e funcionamento dos

mesmos. Ecossistemas, por definio, so unidades funcionais da ecologia, limitados pelo

tempo e espao e que contemplam a comunidade de organismos vivos e seu hbitat abitico

(BOUDOU; RIBEYRE, 1989).

A toxicologia e toxicologia ambiental ajudam a avaliar o risco e sua extenso, definindo

limites e padres de qualidade nos principais compartimentos ambientais. Assim,

importante propor metodologias de rastreabilidade e monitoramento de contaminantes,

prevendo a mobilidade, acumulao e biomagnificao, por meio de estudos toxicocinticos.

E finalmente, sugerir prticas de remediao ambiental orientando quanto a sua eficincia,

59

pertinncia e eficcia (FERNICOLA; BOHRER-MOREL; BAINY, 2003) e auxiliar na

elaborao de polticas pblicas voltadas para a manuteno do meio ambiente.

2.3.2 Toxicologia ambiental e a Sade humana

As interconexes entre a sade humana, a integridade do meio ambiente, e a sade

ecolgica so aspectos importantes a serem avaliados, principalmente devido ao nmero

crescente de substncias qumicas e aumento da demanda e consumo. A compreenso do

funcionamento do processo de degradao do ecossistema pelas substncias qumicas de

origem antrpica ou no, fornece informaes quanto ao impacto sade humana e sade

ecolgica.

Di Giulio e Newman (2012) descrevem um modelo que tenta elucidar esta questo, onde

enfatizam que o meio ambiente produz para a sociedade benefcios (recursos naturais e

matria-prima) e desvantagens (furaces, vetores de doenas). A sociedade, por meio das

indstrias, transforma estes benefcios em bens de consumo, esforo de conservao, poluio

e desmatamento. Esses desfechos alteram a qualidade de vida dos seres (humanos ou no), e o

fluxo circular dos recursos naturais cria continuamente um ambiente que altera o bem-estar de

indivduos, sociedades e ecossistemas. Ou seja, as intervenes humanas nos ecossistemas

aquticos estimulam a propagao de vetores de doenas entre outros malefcios, que alteram

a sade do ser humano.

A colaborao da comunidade cientfica de diferentes segmentos em parceria com os

responsveis pelas diretrizes polticas, so a chave para garantir a sade humana e ambiental.

Hoje, h agncias ambientais, programas de segurana qumica, entre outras instituies, que

esto preocupadas em garantir a sade humana e do meio ambiente, diante do risco da

comercializao, uso, armazenamento, transporte, manuseio e descarte dos produtos qumico,

efluentes industriais e esgoto domstico. As instituies, por sua vez, contam com um

conjunto de estratgias para o controle, avaliao, preveno e gesto dos mais diversos

efeitos sade humana e ambiental, vindas dos riscos potenciais que representam as

substncias qumicas (HACON, 2004).

A qualidade das guas superficiais vistoriada por duas maneiras, uma complementar

outra, pelas anlises qumicas, que identificam e quantificam as substncias qumicas

presentes, e anlises biolgicas, que avaliam os efeitos causados por estas substncias. Nas

anlises biolgicas so avaliados os seguintes aspectos: microbiolgico, que avalia a presena

60

de microrganismos patognicos, e a ecotoxicologia, que avalia por meio de de ensaios com

organismos-teste, os efeitos agudos ou crnicos produzidos pelas substncias qumicas

(KNIE; LOPES, 2004). Cada vez mais os testes ecotoxicolgicos e estudos de monitoramento

ambiental vm sendo utilizados para avaliar e conhecer os efeitos que os contaminantes tm

ao serem introduzidos no meio ambiente.

2.3.3 Sistema Microtox

O teste de toxicidade aguda com a bactria bioluminescente Aliivibrio fischeri (

Figura 9), sistema MICROTOX, utilizado mundialmente para a determinao de toxicidade em

amostras ambientais e como parmetro regulatrio do lanamento de efluentes.

Figura 9. Bactria luminescente Aliivibrio fischeri, organismo-teste.

Fonte:HWANG et al.(2009).

Aliivibrio fischeri uma enterobactria marinha, Gram negativa (POLEZAet al., 2008),

que vive no intestino e em rgos luminosos de lulas (Euprymna scolopes), peixes e outros

animais aquticos, estabelecendo uma relao de simbiose com seus hospedeiros (NETO,

2009).

A reao de biolumenescncia oriunda da oxidao de uma riboflavina 5-fosfato

(FMNH2) e um aldedo com cadeia carbnica longa (R-) na presena de oxignio molecular e

catalisada pela luciferina (BARRETO, 1995), como pode ser visto na equao qumica 1

abaixo:

61

(1)

As estruturas qumicas das molculas 2 e 3 envolvidas na reao 1 esto ilustradass

nafigura 10:

Figura 10. Mononucleotdeo de flavina ou FMN(uma flavina que funciona como grupo

prosttico em diversas reaes de oxirreduo em bioqumica). Sua forma oxidada FMN e sua

forma reduzida FMNH2.

FMN FMNH2

Fonte: Autoria prpria

A reao de obteno da molcula FMNH2 catalisada pela FMN redutase e a espcie

formada extremamente reativa, sendo oxidada, formando perxido de hidrognio e FMN.

Como dito anteriormente, em presena de um aldedo de cadeia longa e oxignio, a luciferina

catalisa a reao de bioluminescncia, como dito anteriormente (INOUYE, 1994).

62

A reao qumica descrita acima, que ocorre em condies ambientais de sobrevivncia

adequadas. Portanto, a luminescncia reflete a atividade metablica. Parmetros fsicos como

a temperatura e qumicos como o pH, a salinidade e fora inica so muito relevantes para a

execuo do teste e garantia da reprodutibilidade dos ensaios, sendo necessrio o

monitoramento destes parmetros, e, principalmente, as alteraes dos mesmos quando estes

estiverem muito diferentes das condies ideais.

O ensaio consiste em quantificar a intensidade luminosa oriunda da bactria na presena

ou ausncia da amostra. Assim, a intensidade luminosa varia, de forma inversamente

proporcional, com a quantidade de substncia txica presente na amostra, j que h uma

interferncia no metabolismo da bactria decorrente da intoxicao. Deste modo, pode-se

quantificar a toxicidade relativa da amostra com o parmetro concentrao efetiva da amostra

capaz de diminuir em 50% ou 20% da intensidade luminosa (CE50), ou CE20, numensaio que

tem 15 minutos de durao (BARRETO, 1995). comum observar uma tendncia gradual na

diminuio da intensidade luminosa, pois as bactrias liofilizadas so reconstitudas em um

ambiente salino, mas sem os nutrientes necessrios para sua manuteno metablica e

crescimento. O aumento da luminescncia tambm observado em condies onde no h um

controle adequado da temperatura. Deste modo, o grupo controle (I0) deve ser corrigido por

um fator de correo (Fc)(ABNT NBR 15411-1, 2012).

O fator de correo utilizado para controlar os valores iniciais de emisso de luz (0) de

todas as cubetas e calculado de acordo com a seguinte expresso matemtica (Equao

01)(ABNT NBR 15411-1, 2012):

() =()

(0)

Equao 01

onde, () o fator de correo em um determinado tempo (t), (0) a leitura da

luminescncia inicial para a cubeta do branco para t=0.()a luminescncia final para a cubeta

do branco, em um determinado tempo (t).

A correo da emisso luminosa dada pela seguinte expresso (Equao 02):

(0) = () . (0) Equao 02

onde, (0) a emisso luminosa inicial para a cubeta de teste no tempo 0.(0) a

luminescncia inicial para a cubeta do teste no tempo 0.

63

Essa correo necessria para normalizar as leituras de luminescncia para todas as

cubetas (ABNT NBR 15411-1, 2012).

A porcentagem de inibio luminosa (porcentagem de efeito, %()) da amostra, ou de

suas diluies, so determinadas pela seguinte expresso (Equao 03)(ABNT NBR 15411-1,

2012).

%() =(0) ()

(0). 100 Equao 03

A partir desses valores possvel construir um grfico dose-resposta, onde no eixo das

abscissas tem-se o %() e no eixo das ordenadas a concentrao, (ABNT NBR 15411-1,

2012). A curva tpica de dose-resposta para o teste Microtox ilustrada na figura 11.

Figura 11. Imagem tpico de porcentagem de efeito por concentrao do Microtox, em escala

logartmica.

Grfico tpico encontrado em teste de Toxicidade Aguda usando o MICROTOX

15 min

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Concentrao (%)

1

2

3

4

56789

10

20

30

40

5060708090

100

%E

(t)

Fonte: Autoria prpria.

A figura 11 ilustra uma tendncia dos pontos a uma funo logartmica em funo da

concentrao. A modelagem deste tipo de funo muito difcil, envolvendo muitos clculos.

Em contrapartida, possvel transformar essa tendncia logartmica em uma funo linear e,

desta forma, facilitar possveis determinaes de parmetros relevantes atravs do fator

64

Gamma (), que a razo dentre o decrscimo na intensidade de luz emitida pelo organismo-

teste e a intensidade remanescente em um determinado perodo, ou seja, em termos

matemticos (Equao 04) (ABNT NBR 15411-1, 2012):

() =

=

().(0)

()

()

Equao 04a

() =()(0)

() 1 Equao 04b

A transformao em uma funo linear (Equao 05a) feita atravs do logaritmo da

funo clssica da reta, da seguinte forma (Equao 05b)(ABNT NBR 15411-1, 2012):

() = + Equao 05a

log () = . log + log Equao 05b

onde o coeficiente linear e o coeficiente angular da reta. Aps a converso para uma

funo linear o grfico tpico produzido ilustrado na figura 12.

Figura 12. Imagem do fator Gamma por concentrao para determinao da CE50 e CE20.

Curv a tpica de Gamma pela concentrao

15 min

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Concentrao (%)

-1

0

1

2

3

4

5

6

Gam

ma

Fonte: Autoria prpria.

65

Quando a perda da atividade se iguala atividade remanescente, na Equao 04b,

observa-se que = 1, o que significa que houve um decrscimo de 50% na luminescncia,

logo este valor representa CE50(ADEME, 2014). A quantidade aproximada de bactrias na

cubeta assim que ela adicionada a amostra 106 clulas. Este valor de organismos-teste

elevado comparado a outros testes de toxicidade clssicos, o que possibilita o clculo da CE20

com maior relevncia estatstica. Assim sendo, a CETESB, como rgo estadual responsvel

pelo meio ambiente, utiliza a CE20 como unidade de medida da toxicidade nos ensaios de

toxicidade aguda envolvendo a Aliivibrio fischeri (Sistema MICROTOX).

O analisador de toxicidade ilustrado na figura 13 constitudo por um fotmetro de

preciso, cmara de incubao e reao que permanece a 15C e uma cmara de pr-

resfriamento a 3C. O ensaio ocorre em cubetas de borossilicato, permitindo a medidas da

luminescncia. O ensaio normatizado pelas Normas ISO 11348, ABNT NRB 15411,

CETESB L5.227, DIN, entre outras.

Figura 13. Equipamento para realizar os testes de toxicidade.

Fonte: MODERN(2015).

As vantagens do ensaio so: baixo custo, rapidez na sua realizao (15 minutos a 30

minutos), pequena quantidade de amostra, fcil execuo e a sensibilidade do organismo a

vrias substncias qumicas. A bactria Aliivibrio fischeri, dentre os organismos-testes

disponveis para ensaio de toxicidade agudo, destaca-se pela resistncia a baixa quantidade de

oxignio presente na amostra. Possibilitando que amostras de rios altamente poludos,

impactados, como os rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate possam ter sua toxicidade aguda

determinadaA variabilidade gentica e a necessidade do recondicionamento da bactria

liofilizada so as principais desvantagens do mtodo, alm da falta de sensibilidade em

66

presena de amnia, encontrada frequentemente em amostras de sedimento (GOODFELLOW

et al., 2005).

2.4 Avaliao e identificao da toxicidade

A abordagem da Avaliao e Identificao da Toxicidade (Toxicity Identification

Evaluation, TIE) baseada na remoo sequencial de vrias fraes qumicas juntamente com

o teste de toxicidade das fraes obtidas (GUZZELLA et al., 1996). TIE foi desenvolvido pela

United States Environmental Protection Agency USEPA no incio de 1980, com a

publicao de uma srie de manuais que posteriormente foram reunidos e reeditado com o

ttulo de A avaliao e identificao da toxicidade de guas residuais(USEPA, 1991). O TIE

foi dividido em trs fases. A primeira fase do TIE envolve a caracterizao da toxicidade da

amostra. Esta caracterizao acumula informaes para direcionar a identificao dos agentes

txicos realizada na fase 2. Para remover ou alterar a toxicidade da amostra so realizadas

manipulaes simples, assim como para se determinar as caractersticas fsicas ou qumicas

dos agentes txicos presentes na amostra, so realizados testes de toxicidade aguda. Alguns

resultados obtidos na fase 1 so indicativos de agentes txicos especficos, porm esta fase

apenas fornece evidncias das caractersticas de grupos de substncias qumicas que podem

causar efeitos txicos. Estas informaes devem ser usadas na fase 2 para a identificao dos

agentes txicos. A fase 3 descrita como confirmao, ou seja, confirmar se a hiptese

levantada est correta.

2.4.1 Fase 1: Fase da Caracterizao

Como j dito anteriormente, a fase 1 baseia-se na caracterizao do agente txico em

funo das suas propriedades fsico-qumicas. Segundo o mtodo da USEPA (1991), os testes

realizados na fase 1 tm por finalidade tornar no disponvel um grupo de agentes txicos

(oxidantes, metais catinicos, compostos volteis, compostos orgnicos apolares e metais

quelveis). Testes de toxicidade realizados antes e depois das manipulaes indicam quais

grupos de constituintes foram alterados (USEPA, 1991). Cada uma das manipulaes

descritas realizada com o objetivo de alterar a toxicidade de um grupo de constituintes

especficos. A figura 14ilustra um fluxograma que exemplifica as manipulaes que

envolvem a fase 1.

67

Figura 14. Fluxograma para a Fase 1 do TIE.

Fonte: Adaptado de MAXXAM(2010).

A etapa relacionada ao teste de ajuste de pH realizada com duas alquotas da amostra,

alterando o pH de uma para 3 e da outra para 11, que devero ser divididas novamente em

quatro partes, destinadas a teste de toxicidade para ajuste de pH e demais procedimentos

correspondentes como filtrao, aerao e extrao em fase slida (USEPA, 1991). O pH tem

efeito significativo na toxicidade da amostra porque as propriedades fsico-qumicas como

solubilidade, polaridade, volatilidade, e estabilidade, afetam a biodisponibilidade da

substncia. cidos e bases no ionizados possuem uma polaridade diferente das suas formas

ionizadas, uma vez que estas possuem maior afinidade pelas molculas da gua por serem

mais polares. Em contrapartida, as formas no ionizadas de cidos e bases podem ser mais

facilmente removidas da amostra utilizando aerao ou extrao com solventes apolares, ou

em extrao em fase slida. A mudana na solubilidade tambm pode ocorrer com a

modificao do pH, sendo os compostos relacionados facilmente removidos por filtrao

(USEPA, 1991).

As condies de aerobiose e anaerobiose so essenciais para as espcies metlicas na

definio de suas caractersticas em termos de especiao, e como este metal se encontra no

meio ambiente. O teste de quelao por cido etilenodiaminotetractico (EDTA) corresponde

adio do mesmo na amostra para que metais dissolvidos e txicos sejam convertidos a sua

forma complexo-metlico (BURATINI, 2011). O teste dos agentes oxidantes com tiossulfato

de sdio (Na2S2O3), agente redutor, reage com substncias como cloro, iodo, bromo entre

68

outras, podendo complexar com metais catinicos como cobre, mangans, prata e selnio

(USEPA, 1991). Quando as substncias oxidantes causam efeito txico, este efeito alterado

aps a adio do tiossulfato de sdio, onde se espera observar uma reduo na toxicidade.

O teste com aerao tem por finalidade identificar se a toxicidade oriunda de compostos

volteis ou por tensoativos pelo processo de flotao. O teste simples, injeta-se na amostra

em fluxo constante ar filtrado. Neste procedimento o oxignio presente no ar atmosfrico

pode oxidar compostos metlicos presentes na amostra, bem como favorecer a volatilizao

de compostos orgnicos com baixo ponto de ebulio e formar com os tensoativos sistemas

coloidais de interface ar-lquido.

O teste de extrao por fase slida, SPE (solid phase extraction) utilizado para

determinar a toxicidade de amostras com compostos orgnicos apolares ou complexos

metlicos, relativamente apolares. O mtodo da USEPA indica o uso de cartuchos C18, mas

sugere que tambm podem ser utilizadas outros cartuchos existentes no mercado. Atualmente,

existem diversos tipos de fase para cartuchos: trocadores de nions (SAX) (MAXXAM,

2010), trocadores de ctions (SCX), ideais para compostos polares (LC-NH2), antibiticos,

frmacos, surfactantes e nucleotdeos (WCX) entre outros (SIGMA-ALDRICH, 1998).Este

mtodo em especial receber maior ateno para melhor compreenso de seus fundamentos.

O guia da USEPA (1991) contm uma tabela com alguns exemplos de interpretao para

os dados obtidos na fase 1 do TIE, tabela 2:

Tabela 2.Exemplos de possvel interpretao para os testes da Fase1

Classe a que pode

pertencer o agente txico Resultado da Fase 1

Compostos apolares

Remoo total da toxicidade da amostra pela extrao em fase slida, geralmente acompanhada da recuperao da toxicidade

pela eluio com metanol.

Slidos totais dissolvidos

A toxicidade no se altera com nenhum dos ajustes de pH, exceto quando h formao de um precipitado com ajuste de

pH, ajuste de pH e filtrao ou ajuste de pH e aerao.

No h reduo de toxicidade pela extrao em fase slida, ou apenas parcial sem alterao na condutividade.

No h alterao na toxicidade com as adies de EDTA e tiossulfato ou no teste de gradao do pH.

Surfactantes

Remoo ou reduo da Toxicidade: Por filtrao Por aerao (em alguns casos, a toxicidade pode ser recuperada

a partir das paredes do recipiente utilizado na aerao).

Pela extrao em fase slida (coluna C18) A toxicidade diminui ao longo do tempo quando a amostra

mantida sob refrigerao e a degradao mais lenta se a

Continua na pgina seguinte

69

amostra armazenada em frasco de vidro, em vez de frasco de

plstico.

Metais catinicos

A toxicidade removida ou reduzida: Pela adio de EDTA ou tiossulfato de sdio Pela extrao em fase slida Por filtrao, especialmente quando combinada com ajuste de

pH.

Oxidantes

Reduo da toxicidade com a adio de tiossulfato de sdio Pela aerao sem ajuste de pH Quando a amostra se torna menos txica ao longo do tempo,

independentemente do frasco de armazenagem.

Fonte: Adaptado de BURATINI(2005) e USEPA(1991).

2.4.2 Fase 2: Fase de Identificao

Com as informaes obtidas na fase 1, pode-se iniciar a fase 2 de modo a identificar os

agentes txicos presentes. Nesta etapa a instrumentao analtica, como tcnicas de

cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC, high performance cromatography) e gasosa

(GC, gas cromatography), so fundamentais para a identificao de compostos orgnicos

extrados e devidamente fracionados.

Para determinao de metais so muito empregadas tcnicas multielementares como

espectrometria de emisso ptica por plasma acoplado indutivamente (ICP-OES, Inductively

Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry) e espectrometria de massas com plasma

acoplado indutivamente (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry).

Tambm, podem ser usadas tcnicas como a espectrometria de absoro atmica em forno de

grafite (GFAAS, Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry), espectrometria de

absoro atmica de chama (FAAS, Flame Atomic Absorption Spectrometry)(LEUSCH et al.,

2012), mas sempre lembrando que o direcionamento analtico deve ser feito com base nos

resultados obtidos da fase 1.

Vale ressaltar que algumas dificuldades podem ser encontradas nesta etapa,

principalmente para compostos orgnicos polares como polmeros, surfactantes, produtos de

degradao, entre outros, exigindo uma abordagem mais sofisticada e procedimentos no

validados (MELO, 2012). Identificaes da classe dos compostos (fase 1) so frequentemente

alcanadas, porm a confirmao do composto txico, Fase 2 propriamente dita, se torna mais

difcil. As informaes coletadas na fase 1 j podem ser suficientes para se tomar decises a

respeito do tratamento ou poltica de gesto ambiental apropriada (HEWITT; MARVIN,

2005).

Continuao da pgina anterior

70

2.4.3 Fase 3: Fase da Confirmao

Na fase 3, a amostra devidamente caracterizada e identificada deve passar pela

confirmao, que consiste em testes qumicos e toxicolgicos adicionais a fim de validar a

hiptese. So descritos quatro mtodos no documento da USEPA: anlise de correlao,

observao de sintomas, sensibilidade comparada de espcies e adio de contaminantes

(spiking).

A anlise de correlao envolve testes de toxicidade de diferentes amostras com a

concentrao medida do composto txico suspeito. Uma correlao significativa

evidenciada quando o composto identificado for realmente o agente txico da amostra

(MELO, 2012). Os problemas decorrentes desta anlise esto na presena de mais de um

agente txico, alm do efeito matriz, desta forma, deve-se usar uma segunda abordagem que

permita a confirmao do analito suspeito (BURATINI, 2011).

O mtodo de observao de sintomas consiste em testar a toxicidade das substncias

qumicas suspeitas e avaliar os sintomas aps um determinado tempo de exposio e

comparar com os sinais gerados quando se utiliza as amostras em estudo. A confirmao se d

quando os sinais observados so semelhantes. Este mtodo no pode ser aplicado ao sistema

Microtox, uma vez que as bactrias no vo desenvolver indicadores clssicos de exposio.

A sensibilidade das espcies um mtodo baseado nas reaes diferenciadas que o mesmo

agente txico pode produzir em outras espcies. Testes com a amostra so realizados em duas

espcies, e a hiptese ser considerada verdadeira se o teste com a substncia pura produzir o

mesmo efeito que as espcies apresentaram quando se aplicou a amostra.

Por ltimo, o mtodo de adio de contaminante (spiking) refere-se justamente adio

do composto suspeito na amostra e em concentraes crescentes para determinar se a

toxicidade aumenta de forma proporcional quantidade do composto adicionado. Se a causa

da toxicidade for uma mistura de agentes txicos, deve-se considerar os efeitos de adio e

sinergismos e as quantidades adicionadas devem ser bem estabelecidas e previamente

estudadas (USEPA, 1993).

Os guias da USEPA que descrevem as fases do TIE, no precisam ser seguidos nesta

ordem e at recomenda-se que alteraes sejam feitas para atender as necessidades tcnicas e

econmicas de cada situao. Vale lembrar que estes guias foram elaborados em 1991 e ao

longo de 24 anos, muitos procedimentos mudaram ou foram atualizados, alm de avanos

71

tecnolgicos nas anlises qumicas e toxicolgicas, assim incorporar essas mudanas tambm

parte integrante do processo.

2.5 Fracionamento Qumico

Fracionamento processo, segundo Templeton (2000), de classificao de um analito

ou um grupo de analitos de uma certa amostra de acordo com suas propriedades fsicas

(tamanho, solubilidade) e qumicas (ligao, reatividade).As fraes podem se basear em

muitas propriedades qumicas, tais como afinidade, carga e hidrofilicidade, ou serem obtidas

por separao fsica (por exemplo, filtrao, centrifugao, cromatografia de excluso de

tamanho). H diversos protocolos hoje na literatura cientfica para situaes especficas de

fracionamento para diversas matrizes. A frao no somente definida pelo solvente

utilizado, mas sim por todos os fatores possveis.

Embora a determinao direta da molcula no seja possvel em muitas situaes, devido

complexidade da matriz, ou dificuldades instrumentais, os mtodos disponveis ainda

podem fornecer muita informao. Uma avaliao do impacto ambiental de uma substncia

pode ser feita sem determinar o poluente responsvel (TEMPLETON et al., 2000).

Na prtica o fracionamento qumico apresenta limitaes quanto a sua seletividade. A

limitao da seletividade determinada pela escolha dos reagentes e protocolos empregados

no fracionamento comprometendo a repetibilidade, a reprodutibilidade e at mesmo

dificultando a interpretao dos resultados (SILVA, 2014). A aplicao do fracionamento

relevante quando na sua execuo so monitorados todos os fatores experimentais (PREZ-

CID; LAVILLA; BENDICHO, 1996). Desta forma, o fracionamento no definido pelos

solventes utilizados, to pouco pelo reagente e sua concentrao, mas sim pelos fatores

possveis de serem relatados no ensaio. Alguns fatores como o tempo de extrao e o tempo

de agitao so relacionados cintica das transformaes qumicas envolvendo o extrator, os

componentes da amostra e reagentes empregados. A variao da temperatura, que

normalmente executada numa faixa de 20-25C, pode causar, dependendo de sua

magnitude, pequenas variaes de resultado (PREZ-CID; LAVILLA; BENDICHO, 1996;

HLAVAY; POLYK, 2005).

O nmero de etapas no fracionamento qumico determinante. H casos de

procedimentos envolvendo oito ou mais etapas, levando dias para serem executadas devido a

sua complexidade. Um procedimento com nmero menor de etapas e uso de poucos reagentes

72

so estratgias mais viveis e fornecem informaes relevantes com maior preciso e exatido

quando comparadas com um fracionamento de muitas etapas (POTTS; ROBINSON, 2003).

As limitaes relativas ao fracionamento qumico aqui descritas no descredibiliza os

valores de sua aplicao, porm importante levarem considerao as suas limitaes afim de

contorna-las, como por exemplo: o protocolo de extrao sequencial deve focar em uma

substncia ou em um grupo de substncias bem definidos. Deve-se seguir o procedimento

minuciosamente, controlando todas as variveis experimentais e um mtodo padronizado

(POTTS; ROBINSON, 2003).

2.5.1 Extrao em fase slida

A extrao em fase slida uma tcnica de separao na qual utilizada uma coluna

aberta, denominada cartucho de extrao, que contm a fase estacionria, ou fase slida. A

amostra contendo o analito de interesse colocada na parte superior do cartucho de extrao e

levemente aspirada por vcuo e, tambm, pode ser pressionada por um mbolo ou um gs

inerte ou por gravidade. O analito, por sua vez, fica retido no cartucho e eludo com um

pequeno volume de solvente determinado.

A extrao em fase slida envolve algumas etapas que so: (1) condicionamento do

cartucho, sendo esta etapa de ativao da fase slida. Essa etapa envolve a passagem de um

solvente apropriado que depender do material constituinte da fase slida, ou do prprio

mtodo empregado. O solvente usado deve penetrar toda a fase slida de forma que ela

permanea mida. A secagem da fase slida pode criar caminhos preferenciais dificultando a

separao e comprometendo a reprodutibilidade. (2) Adio da amostra, o transporte da

amostra para o interior do cartucho pode ser realizado com auxlio de micropipetas

automticas, ou de vidro, seringas para escalas de microlitros a pequenos mililitros de

amostras. Para volumes maiores de amostra comum o uso de mangueiras do tipo cnulas

onde, com adaptadores especiais que prendem na extremidade superior do cartucho, cria-se

um sistema pressurizado capaz de conduzir a amostra para o interior do cartucho. A

velocidade de aplicao da amostra crtica nesta etapa, sendo feita majoritariamente de

forma lenta com fluxo igual ou inferior a 5 mL min-1. O controle do fluxo realizado por

ajustes na presso do vcuo. (3) A remoo dos interferentes ou lavagem com solvente, com

fora suficiente para no eluir o analito de interesse, contudo capaz de eluir os interferentes na

amostra. (4) Eluio do analito, emprega-se para este fim o uso de um solvente que possua

73

afinidade pelo analito de interesse. Assim, o analito ser eludo da fase estacionria no menor

volume possvel para que a concentrao final seja apropriada para se realizar a anlise. Para

melhorar a eficincia da extrao deve-se utilizar duas alquotas de solvente extrator em vez

de um nico volume maior e um tempo de permanncia de cada alquota no cartucho de,

aproximadamente, 1 min e 30 s (ANDRADE-EIROA et al., 2016).

A figura 15resume as etapas que envolvem a extrao em fase slida, descrita

anteriormente.

Figura 15. Ilustrao das etapas que compem a extrao em fase slida, que compreendem:

condicionamento, adio da amostra, lavagem para remoo de interferentes e eluio dos analitos de

interesse.

Fonte: ANDRADE-EIROA et al. (2016).

H no mercado uma enorme disponibilidade de fases estacionrias com diferentes

polaridades. Essa quantidade fruto do recobrimento da base de slica, ou alumina, com

grupos polares ou apolares. Atualmente, o tipo mais comum de fase estacionria C18 ligada

slica. Outra fase estacionria comum so as de base polimrica que apresentam polmeros

com substituinte polares, ou com grupos inicos que do um carter polar fase estacionria,

como por exemplo, cartuchos mistos de troca catinica de fase reversa (MCX), cartuchos de

equilbrio hidroflico-lipoflico de fase reversa (HLB) e cartuchos mistos de troca aninica de

fase reversa (MAX) (HARRIS, 2013; WATERS CORPORATION, 2014). A figura 16ilustra

a estrutura qumica de cada material e seus stios de interao hidroflico, lipoflico, aninico

e catinico.

74

Figura 16. Estruturas qumicas da resina de preenchimento do cartucho de SPE. MCX (cartuchos

misto de troca inica de fase reversa) HLB (cartuchos de equilbrio hidroflico-lipoflico de fase

reversa) e MAX (cartuchos mistos de troca aninica de fase reversa)

Fonte: Autoria prpria.

Os cartuchos do tipo C18 esto entre os mais utilizados pela comunidade cientfica e pelos

laboratrios particulares. Basicamente, trata-se de um tipo de coluna verstil para extrao de

compostos apolares, isso porque, as estruturas de octadecil (18 carbonos) ligadas superfcie

da slica do um carter apolar ao conjunto (vide figura 17). Assim que o analito apolar passar

por essa cadeia hidrofbica, foras intermoleculares agiro sobre o analito e o retm. A

eluio ocorrer quando um solvente com uma afinidade maior pelo analito passar pela

estrutura de slica-octadecil, carregando-o (HARRIS, 2013; WATERS CORPORATION,

2014).

75

Figura 17. Regio de interface de uma partcula de slica funcionalizada com uma cadeia de octadecil

(18 carbonos), uma estrutura extremamente apolar.

Fonte: Autoria prpria.

Os cartuchos do tipo HLB utilizam uma proposta diferente das C18, uma vez que a

estrutura suporte um polmero. Estruturas como anis aromticos e amida fornecem stios

de interao do tipo - e dipolo-dipolo, respectivamente. Todo o restante da cadeia

polimrica um stio para as interaes apolares o que d um carter hidroflico-lipoflico

estrutura como um todo. Os cartuchos HLB acabam tendo uma reteno maior de substncias

tanto apolares quanto polares. Uma grande variedade de solventes e suas misturas podem ser

usadas para se obter fraes especficas com grupo de substncias de interesse. H

possibilidade de adies de grupos inicos (MCX e MAX) ao polmero suporte como

grupos sulfidrilas, e aminas quartenrias e com essa adio, ctions e nions, respectivamente,

passam a sofrer interaes eletrostticas nesta regio do polmero e ficam retidas at que um

solvente com maior afinidade, um tampo, por exemplo, seja usado para elu-las (HARRIS,

2013; WATERS CORPORATION, 2014).

2.5.2 Filtrao, mudana no pH e outras manipulaes

A filtrao um processo de separao fsica onde uma amostra passa por uma membrana

com um a porosidade especfica a fim de separar a parte slida da amostra lquida, solvel. O

slido que ficou retido no filtro pode ser decomposto, ou lixiviado e analisado em seguida. H

possibilidade de utilizar um pr-filtro de fibra de vidro para amostras com um teor de slido

em suspenso (KRUG, 2008). Muitas substncias qumicas orgnicas e inorgnicas, como

76

tensoativos, chumbo, cobre, entre outros, podem ligar-se reversivelmente s partculas

suspensas presentes na gua.

Reagentes comumente utilizados no fracionamento qumico so os cidos e os

complexantes. Os agentes complexantes so capazes de ligar-se maioria dos metais ligados

a carbonatos e matria orgnica, alm dos ctions livres em soluo sendo mais empregado

uma soluo de EDTA. Os cidos clordrico ou actico simulam em certa proporo a

diminuio do pH causada por diferentes fatores como por exemplo o derramamento de cido,

ou at mesmo a chuva cida (SAHUQUILLO; RIGOL; RAURET, 2003).

A adio de qualquer espcie, cida ou bsica, no sistema provoca uma alterao profunda

nas propores dos cidos e bases no meio. A influncia do pH no meio tambm pode

provocar alteraes na solubilidade das espcies (HARRIS, 2013). Em resumo, a alterao do

pH pode causar a sada de prtons (H+) das molculas, tornando bases conjugadas, ou a

protonao de stios bsicos, levando aos cidos conjugados. Por sua vez, estas espcies

podem alterar a solubilidade, permitindo sua precipitao ou solubilizao. H uma mudana

na dinmica redox quando se altera o pH da amostra. Tambm, o potencial redox alterado

pela concentrao de ons hidrnio e consequentemente o estado de oxidao de algumas

espcies pode alterar. Essa mudana pode gerar transformaes qumicas no meio que

tambm podem ser alcanadas usando reagentes redutores ou oxidantes na amostra, uma vez

que estes reagentes alteram o estado de oxidao atravs de reaes qumicas denominadas

reaes de oxirreduo. Um tpico reagente com estas caractersticas o tiossulfato de sdio

(Na2S2O3) que reduz os halognios na amostra.

77

3 OBJETIVOS

3.1 Gerais

Adaptar a metodologia de Avaliao e Identificao de Toxicidade, referente a fase 1 do

protocolo (Toxicity Identification Evaluation) para o Sistema MICROTOX, uma vez que o

TIE foi desenvolvido para testes ecotoxicolgicos mais complexos, nas amostras dos rios

Tiet, Pinheiros e Tamanduate, visando estabelecer os compostos responsveis, ou a classe

qual pertencem, pela eventual toxicidade destes rios.

3.2 Especficos

Investigar novas metodologias na aplicao do TIE, testando diferentes fases slidas e

fracionando as amostras oriundas dos rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate que fazem

parte da rede de monitoramento da CETESB;

Identificar o agente txico ou a classe qual pertence, atravs do desenvolvimento do

TIE;

Elaborar um protocolo para investigao da toxicidade aguda dos agentes

eventualmente indicados nos ensaios anteriores

78

4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 Amostragem e Coleta

As localizaes dos trs pontos de coleta esto resumidas com as posies geogrficas

(latitude e longitude) na tabela 3:

Tabela 3. Localizao geogrfica dos pontos de coleta para os trs rios, Tiet, Pinheiros e

Tamanduate utilizados neste trabalho.

Ponto

CETESB Corpo Hdrico Local da amostragem Latitude S Longitude W

TIET 4180 Rio Tiet Ponte das Bandeiras, na Av.

Santos Dummont 23 31 18 46 37 52

PINH 4900 Rio Pinheiros Prximo sua foz no rio Tiet, na

estrutura de retiro 23 31 52 46 44 54

TAMT 4900 Rio

Tamanduate

Ponto na Av. Santos Dumont, em

frente Secretaria dos

Transportes, em So Paulo

23 31 36 46 37 56

Fonte: CETESB(2014)

Com auxlio de um balde de ao inox polido AISI 316L coletou-se 2 L de amostra

preenchendo todo o volume do frasco evitando a presena de ar. A amostra foi identificada e

acondicionada em caixas trmicas, sob refrigerao at o laboratrio.

A coleta das amostras dos rios Pinheiros, Tiet e Tamanduate foram realizadas pelo Setor de

Amostragem da CETESB, seguindo o procedimento descrito pelo Guia Nacional de Coletas e

Preservao de amostra (2011). A coleta da amostra seguiu um cronograma estabelecido

anteriormente pelos gerentes dos setores (Tabela 4). As amostras coletadas inicialmente (maro e

maio) foram usadas para os primeiros testes realizados de complexao e oxirreduo. J nos meses

seguintes, focou-se nos procedimentos de extrao em fase slida.

Tabela 4.Cronograma de coleta realizado.

Rios Maro Maio Julho Setembro Novembro

Tiet

Dia

s 09 10 20 29 24

Pinheiros 30 19 13 14 29

Tamanduate 03 18 28 21 09

Procedimento EDTA e Na2S2O3 Extrao em fase slida

Fonte: Autoria prpria

79

As amostras foram encaminhadas para o Setor de Anlise Toxicolgica, posteriormente,

os dois litros coletados foram divididos em 8 frascos de plstico descartvel, de polmero

inerte, de 250 mL cada, onde foram devidamente etiquetados com o nmero da amostra, nome

do rio e data da coleta. As 8 alquotas foram congeladas em freezers, -15C a -25C. Quando

necessrio o uso das amostras elas foram descongeladas no dia anterior ao da manipulao.

Tambm foi coletada uma gua natural que no apresentasse toxicidade ao sistema Microtox

para utilizar como branco analtico. Coletou-se a gua do rio Jaguar e esta foi utilizada em

todo o ensaio, aps comprovada a sua inocuidade.

4.2 Materiais

4.2.1 Reagentes

Soluo de sulfato de zinco 6,16 mg L-1 foi preparada a partir do sal de sulfato de zinco

heptaidratado99,0% (ZnSO4 7H2O) da Sigma-Aldrich (EUA), bem como as outras

solues: soluo de dicromato de potssio 75,8 mg L-1 preparada a partir do sal de dicromato

de potssio 99,5% (K2Cr2O7) da Sigma-Aldrich (EUA). Soluo aquosa de fenol (C5H6O)

47,52 mg L-1foi preparada usando padro NIST de fenol em gua 1000 g mL-1, soluo de

EDTA 15 g L-1 preparada atravs do sal disdio do cido etilenodiaminotetracetco diidratado

Titriplex III GR da Merck (Holanda), tambm se preparou a soluo de tiossulfato de sdio

1,62 g L-1a partir do sal pentahidratado da xodo Cientfica (Brasil). A soluo de ajuste

osmtico (SAO) de cloreto de sdio22% (mv-1) P.A. da Dinmica Qumica Contempornea

LTDA (Brasil), bem como a soluo diluente contendo NaCl 2% (m v-1) em gua. Para alterar

o pH da amostra durante o fracionamento usou-se solues de cido clordrico 1 mol L-1 e

hidrxido de sdio 1 mol L-1 usando cido clordrico (HCl) 37% (v v-1) da Carlo Erbae

hidrxido de sdio (NaOH) microprolas P.A. da Sigma-Aldrich (Brasil). Solventes de grau

analtico ou maior foram empregados neste trabalho para eluio: metanol (CH3OH) da

Merck, diclorometano (CH2Cl2) 99,9% UV/HPLC Espectroscpico da Sigma-Aldrich,

acetato de etila (CH3COOCH2CH3) da J.T. Baker, cido frmico (HCOOH) 98-100% (v v-1)

da Scharlau (Espanha) e n-hexano (C6H14) da J.T. Baker (EUA). A gua utilizada no preparo

das solues e nas demais possveis finalidades foi obtida por um sistema de osmose reversa

da Elga um PureLAB Ultra SC. Solues fortificadas com chumbo e prata 10 mg L-1 a partir

de solues NIST de nitrato de prata e nitrato de chumbo.

80

4.2.2 Equipamentos

Para determinar a toxicidade da amostra e das fraes obtidas utilizou-se um analisador de

toxicidade Sistema Microtox modelo 500 analyzer da ModerWater (fabricada no EUA em

2012). A bactria liofilizada e a soluo de reconstituio foram comercialmente adquiridas

pela ModerWater. O ensaio foi realizado em cubetas 12x50 mm de borrossilicato no txicas,

temperatura ambiente 205 C. O pH foi medido por um medidor de pH WTW modelo

1970i (Alemanha) com eletrodo de Ag0/AgCl preenchido com cloreto de potssio (KCl) 1

mol L-1 da WTW modelo pH-Eletrode Sentix81. Balanas Mettler Toledo modelo

XS400SDR DeltaRanger (2010) e Mettler AE 166 foram utilizadas para pesar reagentes.

Alguns equipamentos ou sistemas, como a filtragem a vcuo utilizando filtro da Merck

HA em steres de celulose (nitrato 75-80% e acetato), 0,45 m, dimetro de 47 mm, branca,

lisa e vidrarias de laboratrio como Kitassato, funil de vidro, rolha de borracha para vedao e

garra, quando a amostra apresentava muito material em suspenso usou-se um pr-filtro de

fibra de vidro GF/3F 1,2 m com dimetro de 47 mm da Axiva, logo acima do filtro.

As fraes eludas em solvente no apropriado para o Sistema Microtox tiveram seu

solvente evaporado em concentrador de amostra Genevac EZ-2.3 da SP Scientific, conforme

ilustra a figura 18:

Figura 18. Concentrador de amostras utilizado na evaporao de solventes.

Fonte: Autoria prpria

81

Neste trabalho foram utilizados tubos de centrfuga de 50 mL tipo Falcon, juntamente com

um agitador Multi Reax da Heidolph (Alemanha). O sistema de extrao em fase slida usado

consiste em uma linha de vcuo central, mangueiras, manifold Varian VAC ELUT

20W/TALL Glass 16x150 mm, ou Supelco visiprep 24TM DL e os cartuchos SPE: Oasis

HLB 6cc (500 mg) LP Extraction Cartridge (Irlanda) da Waters, Bond Elut-PPL, 200 mg 3

mL, 50/PK (EUA) da Agilent e Bond Elut-C18, 500 mg 6 mL, 30/PK (EUA) tambm da

Agilent. A montagem do sistema de extrao em fase slida utilizada ilustrada na figura

19onde pode-se ver a disposio de cada item descrito

Figura 19. Sistema montado para extrao em fase slida (SPE).

Fonte: Autoria prpria

Outro sistema utilizado foi o de aerao que consiste em uma linha de ar comprimido,

mangueiras, um agitador magntico multiposio, um difusor de ar, filtro de seringa

descartvel Chromafil O-45/25 0,45 m e 25 mm de dimetro. Os divisores de ar foram

colocados em srie e ligados a uma mangueira conectada na outra extremidade ao filtro 0,45

m que por sua vez conectou-se com a linha de ar comprimido central. Em cada sada do

82

divisor conectou-se mangueiras e na outra extremidade para que no entrasse em contato com

a amostra encaixou-se ponteiras de plstico de 100 L para micropipetadores automticos. O

resultado final e a imagem do sistema esto apresentados na figura 20:

Figura 20. Sistema montado para aerao da amostra, que consiste na ligao de 7 divisores de ar,

ligados entre si. Uma mangueira adaptada com um filtro ligada diretamente linha de ar comprimido

e em cada sada do divisor conectado uma mangueira que por sua vez colocada na amostra.

Fonte: Autoria prpria

Em cada um dos quatro bqueres contendo a amostra adicionou-se uma barra magntica e

passando por agitao por meio de um agitador magntico multiposio. As mangueiras

foram imersas nos bqueres e o sistema de ar comprimido foi ligado, e a soluo foi agitada

por 1 hora.

Este trabalho foi realizado em parceria com a Companhia Ambiental do Estado de So

Paulo CETESB que cedeu toda sua infraestrutura para o desenvolvimento do projeto e o

financiou. Desta forma, foram seguidas todas as normas internas da qualidade que um

laboratrio acreditado pela NBR/ISO 17025 possui, bem como todos os critrios de aceitao

estabelecidos pela companhia para validar os resultados. Soares (2017)1 ressalta que o ensaio

de toxicidade aguda, sistema Microtox, um ensaio muito bem estabelecido na companhia

1 Informao fornecida por Wlace Anderson Almeida Soares durante reunies na CETESB, So Paulo, 2017.

83

sendo utilizado desde 1988 no monitoramento das guas paulistas (informao verbal). Hoje,

o ensaio faz parte do escopo do Setor de Anlises Toxicolgicas ELTA da companhia.

4.2.3 Softwares

Os softwares utilizados no tratamento estatstico foram o IBM SPSS Statistics Verso

22 e para confeco dos grficos os softwares STATISTICA 10 (StatSoft, Inc) e Microsoft

Excel 2013. O processamento dos dados de luminescncia e os clculos para obteno da

CE20 bem como outros parmetros relevantes foram gerenciados pelo MicrotoxOmniTM

verso 1.12.

4.3 Procedimentos Experimentais

4.3.1 Protocolo de execuo do ensaio de toxicidade aguda sistema Microtox

4.3.1.1 Reconstituio da bactria liofilizada

Uma cubeta vazia foi inserida no poo de reagente e em seguida transferiu-se 1,0 mL de

soluo de reconstituio. Retirou-se a ampola contendo as bactrias liofilizadas, tambm

chamada de reagente Microtox. Segurando a ampola na parte superior, removeu-se o lacre de

alumnio e a rolha de borracha com auxlio de uma pina metlica. Em seguida, verteu-se a

soluo de reconstituio contida na cubeta para a ampola, homogeneizando levemente a

suspenso por alguns segundos. Pipetou a suspenso para a cubeta que continha a soluo de

reconstituio com um micropipetador, novamente homogeneizou-se a suspenso e retornou-

se a cubeta para posio inicial no poo de reagente no aparelho.

4.3.1.2 Ensaio de toxicidade aguda com substncia de referncia

Aps a reconstituio da bactria liofilizada fez-se necessrio verificar as condies da

bactria referente a resposta toxicolgica, sua propriedade luminescente. A verificao

realizada calculando a porcentagem de efeito txico de trs substncias de referncia Zn2+,

C5H6O e Cr6+ e plotando os valores obtidos em cartas controles. O valor deve estar entre os

limites superiores e inferiores da carta, deste modo, d-se prosseguimento aos testes.

84

O ensaio foi realizado adicionando 1 mL de cada soluo de referncia em trs cubetas

distintas mais o controle com 1 mL de diluente e 10 L da suspenso (bactria mais soluo

de reconstituio) em 500 L de SAO. Aps 15 minutos, transferiu-se 500 L das solues de

referncia para a cubeta contendo a bactria, o ensaio finalizado aps decorridos 30 minutos

(tempo de exposio) com a leitura da luminescncia. A luminescncia medida inicialmente

(I0) e aps os 30 minutos (I30) para as quatro cubetas separadamente. O software

MicrotoxOmniTM calcula a porcentagem de efeitos utilizando as equaes 1 e 3, descritas

anteriormente. O resultado obtido plotado na sua respectiva carta controle.

4.3.1.3 Ensaio de toxicidade aguda seriada da amostra

O intuito deste ensaio obter a CE20 da amostra por meio de curva dose-resposta. As

diluies foram realizadas em 9 cubetas distintas, seguindo-se a proporo de 1:2. Na

primeira cubeta adicionou-se 200 L de SAO (NaCl 22%, m v-1) e 2 mL de amostra com

posterior homogeneizao. Nas oito cubetas restantes adicionou-se 1 mL de soluo diluente.

Transferiu-se 1 mL da primeira para segunda cubeta, e assim sucessivamente, sempre com

homogeneizao prvia. Uma cubeta com 1 mL de diluente foi adicionada como controle do

ensaio. Em alguns casos houve necessidade de realizar uma diluio 3:2 para melhor

delineamento da curva dose-resposta, alterando-se, ento, os volumes de amostra, SAO e

soluo diluente de forma a obter a proporo necessria.

A suspenso bacteriana foi diluda 10x em diluente antes de entrar em contato com a

amostra. O tempo de exposio total foi de 15 minutos, sendo feito um registro em 5 minutos.

O ensaio inicia-se quando 0,9 mL da amostra diluda de cada cubeta, mais o controle, entram

em contato com 100 L da bactria diluda 10x. O software gerencia os dados e calcula o

valor de CE20 usando as equaes 1, 2, 3, 4b e 5b citadas anteriormente.

4.3.1.4 Ensaio de toxicidade aguda em dose nica

Este teste visa conhecer a porcentagem de efeito aps o contato com o agente txico. Em

uma cubeta foram adicionados 100 L de SAO e 1 mL de amostra com posterior

homogeneizao. Em uma segunda cubeta colocou-se 100 L de bactria diluda 10 vezes,

por fim, transferiu-se 0,9 mL para a cubeta contendo a bactria. O tempo de exposio foi de

15 minutos com uma leitura intermediria em 5 minutos.

85

4.3.2 Protocolos para avaliao e identificao da toxicidade

4.3.2.1 Adio de EDTA

Em 6 tubos de centrifugao do tipo Falcon colocou-se 30 mL de amostra e pipetou-se os

diferentes volumes de soluo de EDTA 15,0 g L-1(Tabela 5). Em outros 6 tubos adicionou-se

30 mL de gua do rio Jaguar, branco analtico e da mesma forma que foi feito para as

amostras, adicionou-se os mesmos volumes de soluo de EDTA 15,0 g L-1.

Tabela 5.Volumes da soluo de EDTA 15,0 g L-1 utilizados no teste de quelao com agente

complexante, juntamente com a concentrao final de EDTA adicionados

Tubos Volume (L) Concentrao (mg L-1) Amostra (mL) Volume de Branco

(mL)

1 18,8 28,2 30,0 -

2 9,42 14,1 30,0 -

3 4,71 7,05 30,0 -

4 2,35 3,52 30,0 -

5 2,00 3,00 30,0 -

6 0,00 0,00 30,0 -

7 18,8 28,2 - 30,0

8 9,42 14,1 - 30,0

9 4,71 7,05 - 30,0

10 2,35 3,52 - 30,0

11 2,00 3,00 - 30,0

12 0,00 0,00 - 30,0

Fonte: Autoria prpria

Aps a adio de EDTA na amostra e no branco, os tubos foram mantidos sob leve

agitao por 1 hora. Testes de toxicidade aguda em dose nica usando o sistema Microtox

foram feitos em cada tubo contendo a amostra e o branco.

4.3.2.2 Adio de tiossulfato de sdio

Uma alquota de 30 mL de amostra foi adicionada em 6 tubos tipo Falcon e em seguida,

com auxlio de um micropipetador automtico foram adicionados os volumes descritos na

tabela 5 de soluo de tiossulfato de sdio 1,62 g L-1, preparada a partir de 81 mg do sal de

tiossulfato de sdio e 50 mL de gua ultrapura sendo que esta soluo deve ser armazenada

em tubos cnicos pretos opacos para evitar a degradao. Em outros 6 tubos Falcon distintos,

86

foram adicionados 30 mL de gua do rio Jaguar e adicionados os mesmos volumes de

soluo de tiossulfato de sdio listados na tabela 6. Aps a adio dos respectivos volumes, os

tubos foram agitados durante 1 hora e testes de toxicidade aguda em dose nica do sistema

Microtox foram realizados em todos os tubos.

Tabela 6. Volumes de soluo de tiossulfato de sdio (Na2S2O3)1,62 g L-1adicionado s amostras eaos

brancos com as concentraes.

Tubos Volume (L) Concentrao (mg L-1) Amostra (mL) Volume de Branco

(mL)

1 393 20,9 30,0 -

2 196 10,5 30,0 -

3 98,4 5,24 30,0 -

4 49,2 2,62 30,0 -

5 24,6 1,31 30,0 -

6 0,00 0,00 30,0 -

7 393 20,9 - 30,0

8 196 10,5 - 30,0

9 98,4 5,24 - 30,0

10 49,2 2,62 - 30,0

11 24,6 1,31 - 30,0

12 0,00 0,00 - 30,0

Fonte: Autoria prpria.

4.3.2.3 Gradao do pH

Em dois tubos cnicos de 50 mL cada, adicionou-se 30 mL de amostra. Em outros dois

tubos adicionou-se 30 mL de gua do rio Jaguar, branco. O pH da amostra e dos brancos

foram alterados adicionando cido clordrico 1 mol L-1 ou hidrxido de sdio 1 mol L-1.

Fixou-se o pH da amostra e do branco em 6,0 e 8,0, que corresponde a faixa de trabalho do

teste toxicolgico. Aps 10 minutos, foram feitos testes de toxicidade na amostra manipulada.

4.3.2.4 Ajuste de pH e Filtrao a vcuo

Com auxlio de uma proveta graduada, 690 mL da amostra foram transferidos para trs

erlenmeyers, 230 mL cada, em seguida, em um dos erlernmeyers foi adicionada a quantidade

necessria de cido clordrico 1 mol L-1 para o pH da amostra atingir a faixa de 2-3. No

erlenmeyer seguinte adicionou-se hidrxido de sdio 1 mol L-1 at o pH da amostra atingir o

87

intervalo 10-11. A leitura do pH foi realizada usando um medidor de pH calibrado na faixa de

trabalho requerida. No terceiro erlenmeyer, por sua vez, foi medido o pH da amostra, sem

qualquer adio de reagente. Vale ressaltar que um branco analtico foi adicionado s trs

manipulaes realizadas, ou seja, foram adicionados cido clordrico utilizado na amostra,

bem como a base hidrxido de sdio em uma gua natural que no apresentava toxicidade. O

branco analtico foi levado em conjunto com a amostra em toda manipulao realizada desde

adio de reagentes at a realizao de procedimentos mais sofisticados.

Um sistema de filtragem a vcuo foi montado conforme ilustra afigura 21, em alguns

casos foram adicionados um pr-filtro de fibra de vidro na montagem do filtro para impedir a

saturao do filtro de 0,45 m. Esta deciso foi tomada observando a quantidade de material

suspenso e/ou precipitado formado. A amostra filtrada permaneceu armazenada no kitassato e

30 mL da cada amostra filtrada nas faixas de pH (cida, base e inicial) foram transferidas para

um tubo de centrifugao tipo Falcon e reservados para o teste de toxicidade.

Figura 21. Sistema de filtrao a vcuo utilizado para filtrar a amostra dos rios Tiet, Pinheiros e

Tamanduate.

Fonte: Autoria prpria

88

4.3.2.5 Extrao em fase slida

O sistema para extrao em fase slida foi montado conforme figura 19.Para cada faixa de

pH uma fase especfica foi escolhida: para faixas cidas usou-se como fase os cartuchos tipo

HLB, faixas neutras usou-se cartuchos tipo C18 e finalmente faixas alcalinas utilizou-se

cartuchos tipo HLB. Utilizou-se dois mtodos padres para extrao: um para HLB, mtodo

1694 da USEPA (2007) para determinao por HPLC/MS/MS de frmacos, e produtos de

higiene pessoal em gua, solo, sedimento e um para C18, de acordo com o artigo cientfico

publicado por Castillo e Barcel (1999) que prope a extrao por SPE de compostos

orgnicos de diferentes classes com um foco maior em tensoativos, para explicar a toxicidade

de um efluente industrial espanhol.

HLB

Inicialmente condicionou a coluna HLB passando 10 mL de metanol e 10 mL de gua

ultrapura com pH ajustado para faixa cida (pH 3-2). Em seguida, 1 mL de metanol foi

adicionado ao cartucho e recolhido em vial de 1,5 mL e este corresponde ao branco da coluna.

Recondicionou-se novamente a coluna e 100 mL do branco acidificado foram passados pelo

cartucho, onde foram recolhidos os 30 mL finais (B70) que passou pelo cartucho. Em seguida,

sem deixar secar a coluna com os 200 mL filtrados da amostra restante filtradas iniciou-se a

extrao em fase slida da amostra acidificada, retirou-se duas alquotas de aproximadamente

30 mL da amostra que passou pela coluna em dois momentos distintos: o primeiro no incio

do procedimento aps passado 80 mL (A80) e em um segundo momento, no final do

procedimento, aps 170 mL (A170) passados do volume total da amostra. A eluio ocorreu

usando 2x 5 mL de metanol puro iniciado aps a secagem da coluna em fluxo de N2 por

alguns minutos. A figura 22 representa, simplificadamente, o procedimento realizado na

extrao dos compostos orgnicos.

Figura 22. Esquema de eluio utilizando 10 mL de metanol aps a eluio da amostra em pH cido.

89

Obs: Foram utilizados duas pores de 5 mL de metanol, recolhidos em tubos de ensaio com tampas e

vedados com parafilme e armazenados sob refrigerao.

Fonte: Adaptado CASTILLO; BARCEL(1999).

Em pH alcalino o procedimento foi semelhante com pequenas modificaes, as solues

usadas no condicionamento devem estar na faixa de pH 10-11. Tambm se recolheu as

fraes A80 e A170 da amostra passada pela coluna, bem como a B70 referente ao branco

analtico. No final da extrao, eluiu-se a coluna com 6 mL de metanol seguidos de 2x 4,5

mL de cido frmico 2% (v v-1) em metanol, aps a secagem da coluna. A figura 23

exemplifica de forma simples o procedimento realizado na extrao em fase slida na faixa

dos pH alcalino.

Figura 23. Ilustrao da etapa de eluio dos composto retidos na coluna HLB.

Obs: Foram eludos 2 pores de 3 mL de metanol e sem seguida 2 pores de 4,5 mL cada de cido

frmico 2% (v v-1) em metanol. Os eluatos so armazenados em recipientes de vidros devidamente

etiquetados e armazenados sob refrigerao.

Fonte: (CASTILLO; BARCEL, 1999) adaptado.

C18

A ativao da fase estacionria iniciou-se com a adio de 10 mL de metanol e 10 mL de

gua ultra purificada em pH neutro (pH 7). 1 mL de metanol foi adicionado ao cartucho e

recolhido posteriormente em vial de 1,5 mL, branco da coluna. Em seguida, reativou-se o

cartucho de C18 conforme descrito anteriormente e sem deixar a coluna secar iniciou-se a

extrao passando 100 mL do branco j filtrado e recolhendo os 30 mL finais (B70) em tubos

cnicos para centrifugao tipo Falcon, rapidamente, iniciou-se a extrao de 200 mL da

amostra, recolhendo alquotas em duas situaes: uma aps passados 80 mL (A80) e uma

seguinte passados 170 mL (A170) do volume total da amostra e deixou-se o cartucho secar

sob um fluxo de nitrognio. A eluio do cartucho foi feita com adio de 2x 5 mL de hexano

puro, em seguida 2x 5 mL de hexano/diclorometano (4:1, v v-1) e 2x 5 mL de

90

metanol/diclorometano (9:1, v v-1). A eluio da coluna C18 est esquematizada de forma

simples na Figura 24 bem como as fraes recolhidas.

Figura 24. Esquema das misturas de solvente utilizadas para a eluio dos compostos retidos na coluna

C18, onde a frao A composta por 10 mL de hexano, a frao B composta por 10 mL de

diclorometano/hexano na proporo de 4:1 (v v-1) e a frao C corresponde a uma mistura de

metanol/diclorometano (DCM) na proporo de 9:1 (v v-1).

Fonte: (CASTILLO; BARCEL, 1999) adaptado.

O procedimento realizado neste trabalho foi feito nas trs amostras estudadas e

anteriormente ao teste com amostra real, no caso as amostras com rio Tamanduate, Pinheiros

e Tiet, e tambm foram testadas amostras fortificadas com substncias txicas para o

Aliivibrio fischeri. Este teste inclui desde as manipulaes com EDTA e tiossulfato de sdio

at a extrao. As substncias escolhidas para fortificar a amostra foram: AgNO3, nitrato de

prata para EDTA e tiossulfato, e fenol para a extrao em fase slida. Nestes ensaios foram

utilizados padres de referncias qumicos.

4.3.2.6 Aerao

Em 4 bqueres adicionou-se 30 mL das trs amostras e em seguida montou-se o sistema

de aerao. No bquer sobressalente adicionou-se 30 mL do branco, sem filtrao. Para evitar

o contato direto das mangueiras com a amostra conectou-se ponteiras nas extremidades.

Tentou-se manter o fluxo de ar constante, regulando as vlvulas quando necessrio, o mesmo

ocorrendo com a agitao. Fechou-se os bqueres com folhas de alumnio para se evitar

contaminao com gotculas que ocasionalmente poderiam ser lanadas de um bquer para

outro. Ao final de 1 hora, desligou-se o fluxo de ar e com auxlio de uma pipeta graduada

transferiu-se o contedo do bquer para um tubo de centrfuga tipo Falcon, sendo que nesta

etapa, evitou-se entrar em contato com a parede do bquer, pois aps a transferncia lavou-se

91

duas vezes as paredes da vidraria com metanol puro. Este metanol, por sua vez, foi

armazenado para testes toxicolgicos, posteriores, usando o sistema Microtox.

O teste de aerao foi repetido algumas vezes e em todas elas trocou-se o filtro de ar 0,45

m usado para impedir que contaminantes no ar ou eventualmente algum vestgio de leo de

bomba entrassem em contamine a amostra.

4.3.2.7 Recuperao da toxicidade a partir do eluato

Os eluatos coletados a partir da SPE, tabela 7, independentemente da coluna utilizada,

foram secos em um concentrador de amostras e solubilizados em 10 mL de metanol puro.

Assim, iniciou-se os testes de toxicidade utilizando os eluatos obtidos pela extrao. Em um

tudo de centrfuga tipo Falcon adicionou-se 20 mL da gua do rio Jaguar e pipetou-se 1,2 mL

do eluato a ser analisado, completando o volume para 30 mL com a gua do rio Jaguar. Por

fim, mediu-se o pH da amostra preparada, e, quando necessrio o pH foi corrigido para faixa

de trabalho do ensaio (6,5-8,5) com solues de NaOH, ou HCl 1 mol L-1. Em geral, Como o

volume adicionado de cido e base no deve ser muito grande, pois h risco de perda da

informao toxicolgica por diluio dos poluentes, optou-se por no ultrapassar 10% do

volume total. Este procedimento foi realizado no mesmo dia do ensaio de toxicidade para se

evitar perda de informao devido a degradao das substncias.

Tabela 7. Solventes usados na extrao em fase slida, com as repectivas propores em cada fase

estacionria.

Frao Solvente Proporo

(v v-1)

Fase

Estacionria pH

A Hexano - C18 Neutro

B Diclorometano/Hexano 4:1 C18 Neutro

C Metanol/Diclorometano 9:1 C18 Neutro

D Metanol - HLB cido

E Metanol - HLB Bsico

F Metanol/cido Frmico 1:50 HLB Bsico

Fonte: Autoria prpria

92

Como no teste acima, pipetou-se 1,2 mL do metanol da lavagem obtido no final do

procedimento da aerao em 20 mL de gua de diluio, e completou-se o volume para 30

mL. O pH da amostra foi medido e, quando necessrio, corrigido para a faixa de ideal do

organismo-teste.

Os brancos, assim como os eluatos, foram secos no concentrador de amostras e

solubilizados em 1 mL de metanol em vials. Em seguida, em tubos tipo Falcon de 15 mL,

adicionou-se 1 mL de gua de diluio e pipetou-se 120 L do branco, completando o volume

para 3 mL. O pH da amostra foi medido e corrigido, quando necessrio.

4.4 Fluxograma Experimental

Os testes toxicolgicos usando o sistema Microtox foram realizados em menos de 24

horas aps a manipulao. Apenas o eluatos obtidos da extrao em fase slida que foram

armazenados por maior perodo de tempo, por estarem em solventes orgnicos e em baixa

temperatura apresentam uma maior estabilidade qumica. O procedimento utilizado

preconizava um teste de toxicidade aguda inicial realizado na amostra recm descongelada,

iniciando-se assim as manipulaes pertinentes ao TIE e, em menos de 24 horas aps a

abertura da amostra, eram realizados ensaios de toxicidade aguda nas fraes e junto com as

fraes fazia-se novamente o teste de toxicidade aguda inicial nas amostras.

Os testes de toxicidade nos brancos foram feitos usando o protocolo de dose nica, sendo

que no deveria ultrapassar o valor de 20% de efeito na concentrao mxima trabalhada de

89,1%, quando necessrio, o teste foi refeito utilizando-se o protocolo de 9 diluies.

Para melhor visualizar todo o procedimento realizado neste trabalho, cinco fluxogramas

esto organizados abaixo: A figura 25 trata do condicionamento do cartucho SPE, tanto C18

quanto HLB. A figura 26 ilustra a extrao em fase slida usando o branco, aps o

condicionamento. Na figura 27ilustra a extrao da fase slida para a amostra e as figuras 28 e

29 tratam das adies de tiossulfato de sdio e EDTA, respectivamente.

93

Figura 25. Fluxograma da execuo do condicionamento da coluna SPE, C18 e HLB e a retirada do branco da coluna.Este procedimento antecede a extrao

em fase slida e na etapa 2 o pH da gua ultra purificada o mesmo pH em que se encontra a amostra.

Fonte: Autoria prpria.

94

Figura 26. Fluxograma de extrao em fase slida (SPE) e filtrao referente ao branco. A coluna deve ser condicionada conforme indicado a segura anterior.

Fonte: Autoria prpria.

95

Figura 27. Fluxograma de extrao da amostra e da eluio da coluna e filtrao nas trs faixas de pH trabalhados.

Fonte: Autoria prpria. (*mesma coluna utilizada na extrao do branco)

96

Figura 28. Fluxograma da adio de tiossulfato de sdio na amostra e no branco executados no mesmo instante. A adio de tiossulfato crescente em cada

frao.

Fonte: Autoria prpria.

97

Figura 29. Fluxogramas de execuo da adio do EDTA na amostra e no branco que foram executadas no mesmo instante. A adio do EDTA crescente em

cada frao.

Fonte: Autoria prpria.

98

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Qualidade sistema Microtox

Antes do incio dos testes de toxicidade aguda, foram realizados testes para verificar o

desempenho do ensaio. Para isso, foram usadas solues de referncia e avaliada a diminuio

da luminescncia (efeito) decorrente da adio das solues, aps 30 minutos, em

porcentagem de inibio. Alm do desempenho como um todo, os ensaios com as solues de

referncia foram decisivos para validar os resultados obtidos. Dentro do sistema da qualidade

estabelecido pela CETESB, o resultado do teste das solues de referncia vlido quando se

encontra dentro do limite superior e inferior das cartas controle. Cada soluo tem sua carta

controle feita com o resultado de 100 anlises anteriores. Caso os critrios no sejam

atendidos, todo o procedimento refeito com um lote diferente de bactria. Posteriormente,

so refeitas as solues de referncia e as novas solues de dicromato de potssio (75,8 mgL-

1), sulfato de zinco (6,16 mgL-1) e fenol (47,52 mgL-1) so testadas e avaliadas frente a sua

toxicidade.

As solues de referncia so muito txicas para o organismo-teste, Aliivibrio fischeri, e

so comumente usadas em outros laboratrios, j que seu uso est bem estabelecido na Norma

NBR 15411-3:2012, Ecotoxicologia aqutica Determinao de efeito inibitrio de amostras

aquosas sobre a emisso da bioluminescncia de Vibrio fischeri (ensaio de bactria

luminescente) Parte 3: Mtodo utilizando bactria liofilizadas (ABNT NBR 15411-1, 2012).

Este ensaio que antecede os testes com a amostra de extrema relevncia para assegurar a

qualidade dos resultados analticos. Os resultados obtidos e as cartas controles das solues de

referncia so apresentados na figura 30:

99

Figura 30. Carta controle para a soluo aquosa de (a) fenol, (b) dicromato de potssio e (c) sulfato de

zinco

(a)

(b)

(c)

Obs: Os valores obtidos de porcentagem de inibio das 20 anlises realizadas foram plotados ao

longo do tempo aps 30 minutos de exposio no sistema Microtox. Os limites superior e inferior so

Carta controle para soluo aquosa de fenol 47,51 mg L-1

Mdia: 47,84; Desvio-padro: 4,31; n= 28

5 10 15 20 2530

35

40

45

50

55

60

65

Ob

serv

v

eis

34,914

47,839

60,763

Carta controle para soluo de dicromaro de potssio 75,8 mg L-1

Mdia: 38,2; Desvio-padro: 8,06; n= 28,

5 10 15 20 255

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

Ob

serv

v

eis

14,022

38,212

62,402

Carta controle para soluo de sulfato de zinco 6,16 mg L-1

Mdia: 70,95; Desvio-padro: 5,11; n= 29,

5 10 15 20 2550

55

60

65

70

75

80

85

90

95

Ob

serv

v

eis

55,614

70,954

86,295

100

calculados multiplicando o desvio-padro por 3 e somando o valor da mdia para o limite superior e

subtraindo da mdia para o limite inferior.

Os limites foram estabelecidos usando clculos estatsticos descritivos, o limite superior

estabelecido ao multiplicar por 3 o desvio-padro e somar o resultado obtido com a mdia.

Em paralelo, o limite inferior obtido multiplicando por 3 o desvio-padro e subtraindo o

resultado da mdia

Na figura 30c observam-se os resultados obtidos para a soluo de sulfato de zinco em

todo andamento do trabalho. H apenas um ponto, segundo ensaio realizado, fora dos limites

estabelecidos pela carta controle. Como medida corretiva, o ensaio foi refeito no mesmo dia

com um lote diferente de bactria usando as mesmas solues. O resultado obtido foi plotado

- terceiro ponto -, e se apresentou dentro dos limites considerados adequados. Desta forma,

deu-se prosseguimento nos testes. Os demais resultados das cartas controles, figura 30 a e

b, no apresentaram um comportamento atpico, estando todos dentro dos limites e no foi

observada tendncias em nenhumas das cartas confeccionadas.

5.2 Toxicidade inicial dos rios e outros parmetros

A primeira abordagem realizada foi medir a toxicidade inicial das amostras assim que

recebidas. O valor de CE20 para todas as amostras coletadas esto organizados na tabela 8.Os

testes foram feitos no dia em que as amostras sofreram manipulao e no dia seguinte a

manipulao, armazenadas em refrigerao por aproximadamente 24 h.

Tabela 8. Valores de CE20 em porcentagem para os rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate.

Data Rio CE 20 em 15

minutos I.C. (%)

Porcentagem efeito na

concentrao de 81,9%

05/10/2016 Pinheiros 6,885% 5,672-8,56 67,01%

06/10/2016 Pinheiros 4,533% 2,985-6,885 72,50%

18/10/2016 Pinheiros 12,42% 8,412-18,34 65,94%

20/10/2016 Pinheiros 3,031% 2,349-3,912 77,61%

25/10/2016 Pinheiros 4,126% 2,966-5,739 80,51%

26/10/2016 Pinheiros 4,837% 4,090-5,721 76,42%

11/11/2016 Pinheiros 3,677% 3,017-4,481 81,89%

01/12/2016 Pinheiros 2,820% 1,468-5,425 66,51%

09/12/2016 Pinheiros 6,491% 4,304-9,787 76,09%

23/12/2016 Pinheiros 20,83% 17,02-25,50 49,65%

Continua na pgina seguinte

101

13/01/2017 Pinheiros 15,42% 12,85-18,49 59,75%

01/09/2016 Tamanduate 3,019% 1,757-5,188 57,33%

02/09/2016 Tamanduate 8,369% 6,685-10,48 69,54%

22/09/2016 Tamanduate 4,699% 4,178-5,284 58,48%

23/09/2016 Tamanduate 9,610% 4,688-19,70 49,07%

01/12/2016 Tamanduate 5,656% 4,714-6,785 53,03%

09/12/2016 Tamanduate 26,50% 16,33-43,01 51,58%

09/12/2016 Tamanduate 4,271% 2,828-6,452 60,18%

23/12/2016 Tamanduate 23,30% 20,04-27,09 43,49%

11/10/2016 Tiet 16,79% 12,32-22,89 52,91%

14/10/2016 Tiet 5,251% 4,381-6,293 75,67%

18/10/2016 Tiet 10,29% 8,362-12,66 67,43%

20/10/2016 Tiet 5,409% 3,819-7,662 64,49%

25/10/2016 Tiet 6,227% 4,991-7,768 69,85%

26/10/2016 Tiet 5,741% 4,526-7,281 70,73%

11/11/2016 Tiet 2,790% 2,063-3,775 76,16%

01/12/2016 Tiet 25,56% 21,92-29,81 43,17%

23/12/2016 Tiet 46,73% 36,78-59,38 36,91%

Obs: Teste de toxicidade inicial em 15 minutos do sistema Microtox. Os dados em parntese

evidenciam o intervalo de confiana (I.C.) determinado pelo prprio software. O CE20 calculado a

partir de uma srie de 9 diluies da amostra.

Fonte: Autoria prpria.

Verificou-se que todas as amostras coletadas no segundo semestre de 2016 apresentaram

alta toxicidade, uma vez que os valores obtidos de CE20 esto abaixo de 20% com exceo da

amostra do rio Tiet, que teve toxicidade de 46,73%. Entretanto, mesmo assim a amostra foi

considerada para realizao de manipulaes, muito embora sua toxicidade estivesse acima de

20%. A toxicidade ao longo deste semestre permaneceu relativamente constante, abaixo de

20%. Algumas flutuaes foram observadas, porm trata-se de alteraes da mesma amostra

devido degradao dos compostos.

Uma preocupao, explorada no documento da USEPA para o TIE (USEPA, 1991) a

estabilidade da amostra frente forma de armazenamento usada. Optou-se em usar o

congelamento da amostra, mtodo esse j utilizado para outras amostras de rotina do ensaio e

avaliou-se o tempo de estabilizao (toxicidade) da amostra. Afigura 31 a, b e c

apresenta os resultados confeccionados para estudar tal comportamento.

Continuao da pgina anterior

102

Figura 31. Toxicidade expressa em CE20 no sistema Microtox em funo do tempo, (a) rio Pinheiros,

(b) rio Tiet e (c) rio Tamanduate.

(a)

(b)

(c)

Obs: Aps serem coletadas as amostras dos rios, estas foram particionadas em 8 frascos de 250 mL

cada. A quantidade necessria para as manipulaes era descongelada e o restante da amostra era

Variao da toxicidade aguda da gua do rio Pinheiros em funo do tempo

15 minutos06/10/2016

20/10/201626/10/2016

11/11/201601/12/2016

09/12/201623/12/2016

13/01/2017

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

CE

20

(%

)

Variao da toxicidade aguda da gua do rio Tamanduate em funo do tempo

15 minutos23/09/2016 01/12/2016 09/12/2016 09/12/2016 23/12/20160

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

CE

20

(%

)

Variao da toxicidade aguda da gua do rio Tiet em funo do tempo

15 minutos14/10/201620/10/2016

26/10/201611/11/2016

01/12/201623/12/2016

0

10

20

30

40

50

CE

20

(%

)

103

mantida no freezer e quando necessrio novamente descongelada. O ensaio avaliou a estabilidade da

amostra mantida congelada ao longo do tempo.

Observou-se que as amostras so estveis quando mantidas congeladas por um perodo de

um a dois meses. Aps esse perodo, h um aumento na CE20 que inviabiliza o uso da mesma,

pois os compostos presentes na amostra provavelmente degradaram, mesmo armazenados em

temperaturas negativas. Estabeleceu-se o prazo de 2 meses por amostra como validade, sendo

ainda necessrio a comprovao da toxicidade da amostra por um teste de toxicidade aguda

usando o sistema Microtox.

As amostras coletadas segundo Tabela 4 no so txicas para o A. fischeri. Neste caso, a

baixa toxicidade pode estar associada s condies pluviomtricas, j que, as amostras foram

coletadas em uma semana chuvosa, ou aps chuva no dia anterior, e no apresentaram

toxicidade. No momento da coleta foi anotado se houve chuva nas ltimas 24 horas, as

informaes foram organizadas na Tabela 9.

Tabela 9. Cronograma com a informaes pluviais nas ltimas 24 horas

Rios Maro Maio Julho Setembro Novembro

Tiet

Dia

s

9 chuva

10 chuva

20 sem chuva

29 sem chuva

24 chuva

Pinheiros 30

sem chuva

19 chuva

13 sem chuva

14 sem chuva

29 chuva

Tamanduate 3

chuva

18 chuva

28 sem chuva

21 chuva

9 sem chuva

Procedimento

EDTA e Na2S2O3 Extrao em fase slida

Aerao

O grfico pluviomtrico mdio mensal referente ao ano do estudo indica que os meses de

fevereiro, maro, maio e junho apresentaram chuva muito acima da mdia. Nos demais meses,

o ndice ficou dentro do esperado, com exceo do ms de abril, julho e setembro que tiveram

pouca chuva, mesmo comparando a mdia mensal (figura 32).

104

Figura 32. Grfico pluviomtrico da mdia mensal da UGHRI 6 Alto Tiet do ano de 2016.

Fonte: (CETESB, 2016)

Os dados so mdias de intensidade ao longo da regio metropolitana com pontos de

monitoramento prximos aos rios estudados, entretanto para as amostras que no dia anterior

da coleta era reportado chuva, esta no apresentava toxicidade. Portanto, nem todas as

amostras coletadas foram utilizadas para o desenvolvimento do trabalho. O rio que mais

sofreu efeito de diluio foi o Tamanduate.

Foram feitos testes na gua natural coletada no rio Jaguar, no sendo observada

toxicidade para o sistema Microtox. A figura 33 apresenta os valores de porcentagem de

efeito para diferentes concentraes da gua natural do rio Jaguar.

Figura 33. Teste de toxicidade aguda em 5 e 15 minutos para as guas do rio Jaguar.

Toxicidade da gua mineral usado como branco no trabalho

gua do rio Jaguar

% de Efeito (5 min)

% de Efeito (15 min)

0,31990,6398

1,282,559

5,11910,24

20,4840,95

81,9

Concentrao (%)

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

Efe

ito

(%

)

105

Obs: O teste de toxicidade foi realizado de forma anloga ao teste com as amostras. Foram testadas o

total de nove diluies na amostra e cada uma foi lida pelo luminmetro, e a luminescncia foi

transformada em porcentagem de efeito.

As amostras coletadas e os pontos escolhidos pertencem ao sistema de monitoramento da

CETESB, que engloba a determinao de muitos parmetros qumicos, como: alumnio

dissolvido, alumnio total, arsnio total, brio total, cdmio total, carbono orgnico total e

dissolvido, chumbo total, cloreto total, cobre dissolvido, cobre total, cromo total, DBO (5,20),

fenis totais, ferro dissolvido, ferro total, fsforo total, mangans total, mercrio total, nquel

total, nitrognio amoniacal, nitrognio Kjeldahl, nitrognio nitrato, nitrognio nitrito, leos e

graxas, potssio, sdio, sdio dissolvido total, sdio total, substncias tensoativas que reagem

com azul de metileno e zinco total; e os componentes orgnicos, benzeno, estireno,

etilbenzeno, m,p-xileno, o-xileno e tolueno. E por fim, os parmetros de campo, chuva nas

ltimas 24h, colorao, condutividade, oxignio dissolvido, pH, temperatura da gua e

temperatura do ar. Os resultados obtidos para cada um dos parmetros citados acima

encontram-se no Anexo A, tabelas 23, 24 e 25 para os rios Tiet, Tamanduate e Pinheiros,

respectivamente.

A srie dos metais totais e dissolvidos apresentam-se abaixo do limite de quantificao em

alguns casos, no restante os resultados apresentados esto abaixo do esperado, o mesmo vale

para os compostos orgnicos volteis nos trs rios com exceo do tolueno. Porm, os valores

obtidos de DBO, carbono orgnico total e dissolvido, a srie dos nitrognios so elevados e

denunciam que se tratam de rios altamente impactados pela poluio urbana, mais

especificamente pelo esgoto no tratado.

Os dados podem ser agrupados utilizando um mtodo estatstico chamado anlise de

agrupamento, que mede as distncias entre os conjuntos de dados e com base nesse esquema

de aglomerao, pode-se construir um grfico em formato de rvore chamado de dendrograma

que facilita a visualizao das medidas de dissimilaridade (FVERO, 2017). As variveis

escolhidas para a anlise de agrupamento foram nitrognio nitrito, nitrognio amoniacal,

CE20, tensoativos, leos e graxas, carbono orgnico total e dissolvido. Estes parmetros foram

escolhidos, pois esto relacionados poluio por esgoto urbano. O dendrograma gerado para

os trs rios esto apresentados nas figuras 34, 35 e 36:

106

Figura 34. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Tiet usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distancias euclidianas.

Figura 35. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Tamanduate usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distncias euclidianas.

107

Figura 36. Dendrograma para os parmetros caractersticos de contaminao por esgoto urbano para o

rio Pinheiros usando anlise de agrupamento pelo mtodo de Ward e distncias euclidianas.

Os dendrogramas mostrados acima so muito parecidos, indicando uma semelhana no

comportamento destas substncias nos trs rios. Na figura 34, um grupo composto por CE20,

nitrito e tensoativos formado por serem prximos. Este comportamento indica que as

variveis esto, de certa forma, prximas em termos numricos, construindo um cluster. Um

segundo grupo pode ser formado pelas variveis, leos e graxas, nitrognio amoniacal e

carbono orgnico dissolvido e para esta figura, exclusivamente, o carbono orgnico total, uma

vez que, as linhas horizontais de ligao entre as variveis criam uma unio com o cluster

(leo e graxa-amoniacal-carbono orgnico dissolvido) mais prximas em um nvel mais

elevado. J nas figuras 35 e 36, a principal diferena est na existncia de um cluster a mais,

formado exclusivamente pelo carbono orgnico total, que se liga aos demais clusters no final,

indicando uma proximidade com todas as outras variveis.

O fato que mais chama a ateno a constante do cluster (tensoativo-CE20-nitrito) nas trs

figuras e a ligao das trs variveis no mesmo nvel, ou seja, as trs contribuem da mesma

forma no seu cluster. A CE20 uma varivel correlacionada positivamente com a

108

concentrao de carbono orgnico total, uma vez que os metais no apresentam ter influncia

sobre a toxicidade (CETESB, 2017).

5.3 Avaliao e identificao da toxicidade

5.3.1 EDTA

Iniciou-se os testes com o EDTA medindo a toxicidade deste reagente ao sistema

Microtox. A determinao das concentraes de reagente utilizadas uma etapa muito

importante no desenvolvimento do TIE. Os reagentes ao serem utilizados no podem

apresentar uma toxicidade maior que a da amostra, pois compromete a interpretao do

resultado. Os resultados obtidos no foram conclusivos, j que no foi possvel calcular o

CE20 para este reagente. Um grfico de barras com os valores de porcentagem de efeito pela

concentrao de EDTA utilizada foi plotado para avaliar a toxicidade do reagente pela

concentrao de EDTA, (figura 37), porm a figura indica que todos os efeitos observados,

no passaram de 20%, linha tracejada vermelha, condio esta que caracteriza que a amostra

no apresenta toxicidade (a amostra considerada txica para o sistema Microtox quando o

efeito txico na concentrao mxima trabalhada, 81,9%, no ultrapassa os 20%). O efeito

no aumenta conforme a concentrao de EDTA aumenta no meio e, praticamente, o mesmo

efeito observado independente da concentrao de EDTA.

109

Figura 37. Teste de toxicidade aguda do reagente EDTA usado para complexar metais

Obs: O ensaio consiste numa srie de nove diluies de uma soluo de EDTA 15 g L-1. Aps 15

minutos feita a leitura da luminescncia e o software converte em porcentagem de efeito. A linha

tracejada marca o limite estabelecido (efeitos acima de 20% caracterizam amostras txicas e abaixo do

20% indicam amostras no txicas).

Os testes iniciais com o EDTA envolvem a fortificao do branco com um padro NIST

de chumbo. O objetivo deste teste determinar a concentrao ideal para o ensaio envolvendo

a amostra. O EDTA complexa-se com a chumbo formando um composto muito estvel e

pouco txico para o Microtox, a concentrao de chumbo na amostra de 10 mg L-1,

concentrao essa que apresentou um CE20 em 15 minutos de 0,13 mg L-1 e a porcentagem de

efeito na concentrao mxima trabalhada de prata foi 92,7% em 15 minutos de exposio. Os

dados de toxicidade foram organizados em um grfico de barras, apresentado na figura 38.

Grfico de Toxicidade do EDTA em diferentes concentrao

Teste de Toxicidade do Reagente

15 minutos

0,05 0,10 0,19 0,38 0,77 1,54 3,07 6,14 12,29

Concentrao (g L-1)

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

110

Figura 38. Resultado de toxicidade da gua do rio Jaguar fortificada com chumbo na concentrao de

10 mg L-1.

Obs: O resultado de CE20 em 15 minutos foi de 0,13 mg L-1 de prata e o teste de toxicidade foi

realizado utilizando o protocolo de nove diluies da amostra e em seguida mediu-se a luminescncia,

por fim o software converteu a luminescncia em porcentagem de efeito. A porcentagem de efeito na

concentrao de 8,19 mg L-1 foi de 92,7%.

Em seguida, foi adicionado EDTA em diferentes concentraes para avaliar a toxicidade

total das espcies de chumbo presentes frente s variaes de concentrao de EDTA. O

resultado de tal experimento ilustrado na figura 39.

Grfico de Porcentagem de Efeito da Amostra Fortificada com Chumbo

gua do Rio Jaguar fortificada com chumbo 10 mg L-1

% de Efeito (5 min)

% de Efeito (15 min)

0,063980,128

0,25590,5119

1,0242,048

4,0958,19

Concentrao (mg L-1)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Efe

ito

(%

)

111

Figura 39. Teste de toxicidade aguda para o branco fortificado com chumbo 10 mg L-1 e EDTA

adicionado em diferentes concentraes.

Obs: O protocolo utilizado para executar o teste de toxicidade foi o de dose nica onde avalia a

luminescncia na concentrao mxima permitida pelo teste, 81,9%.

Os resultados obtidos para a adio de EDTA num branco fortificado mostra que na

concentrao de 28,2 mg L-1 o chumbo no exerce mais efeito txico no organismo, indicando

que todo o chumbo se complexou com o EDTA. Alm do complexo Pb-EDTA no apresentar

toxicidade, o possvel excesso de EDTA tambm no txico, j que o valor do efeito obtido

na concentrao de 28,2 negativo (-11,05%). Nas demais concentraes o efeito observado

foi de aproximadamente 83% de chumbo, incluindo a amostra que no teve a adio do

EDTA. O resultado obtido neste teste indica que a faixa de trabalho de EDTA utilizada foi

apropriada, uma vez que no se observou a toxicidade do reagente e o mesmo foi capaz de

reagir com o metal presente reduzindo a toxicidade e uma vez que os metais presentes na

amostra esto prximos desta ordem de grandeza.

Aps determinar a faixa de concentrao de EDTA e ver o comportamento do teste de

toxicidade com EDTA, iniciou-se os testes com a amostras dos rios Tiet, Tamanduate e

Pinheiros. Os resultados obtidos para o rio Pinheiros encontram-se a seguir na figura 40.

112

Figura 40. Teste de toxicidade aguda com EDTA na amostra do rio Pinheiros

Obs: O teste consiste em adicionar gradativamente o reagente na amostra e comparar com os efeitos

obtidos na concentrao mxima de 81,9%. No dia seguinte, o teste foi repetido com concentraes

mais elevadas de EDTA.

Na figura 40, os resultados obtidos no apresentaram diferena na porcentagem de efeito,

desta forma foi realizado um outro teste com concentraes mais elevadas de EDTA (62,5;

125; 250 e 500 mg L-1), sendo que o o resultado obtido foi plotado junto com o anterior. Nele,

observa-se um leve aumento da toxicidade conforme a concentrao de EDTA aumenta, este

aumento possivelmente acarretado pela toxicidade do reagente.

Uma forma de verificar diferenas significativas a nvel estatstico utilizar o teste-t de

Student, comparando os valores de porcentagem de efeito das amostras com EDTA com o

valor de porcentagem de efeito sem o reagente. As hipteses testadas so as seguintes: (nula)

H0: = as porcentagens de efeito so todas iguais, (alternativa) H1: > as porcentagens de

efeito so diferentes, onde = 0,025 para teste unilateral, ou = 0,05 para teste bilaterial

(FVERO, 2017). Os valores de significncia, o valor de t e todas as demais variveis esto

organizados na tabela 10.

Porcentagem de efeito txico pela concentrao de EDTA adicionado

Rio Pinheiros

% efeito em 5 min

% de efeito em 15 min

AMOSTRA3,00

3,527,05

14,10AMOSTRA

62,5125

250500

Concentrao de EDTA (mg L-1)

0

20

40

60

80

100E

feit

o (

%)

Dia 1 Dia 2

113

Tabela 10. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Student para o rio Pinheiros.

t Significncia

1 extremidade Diferena

mdia

95% intervalo de confiana da

diferena Valor teste

Inferior Superior

1 dia -2,292 0,053 -2,207 -5,2731 0,8581 47,23

2 dia -0,455 0,340 -1,330 -10,635 7,9752 35,87

O teste consiste, basicamente, em comparar os valores. Para um teste unilateral,

asignificncia 0,053 para o primeiro dia, e 0,340 para o segundo dia. Como 0,053> 0,025 e

0,34 > 0,025, aceita-se a hiptese nula, conclui-se, portanto, que ao nvel de confiana de

95%, as porcentagens de efeito so iguais, logo no houve mudanas na toxicidade para

ambos os casos. O mesmo foi feito para o rio Tiet, e os resultados esto apresentados na

figura 41e na tabela 11:

Figura 41. Teste de toxicidade aguda com EDTA na amostra txica do rio Tiet.

Obs: O teste, em resumo, consiste em determinar a porcentagem de efeito txico da amostra em

diferentes concentraes de EDTA.

Porcentagem de efeito txico pela concentrao de EDTA adicionado

Rio Tiet

5 min

15 min

Amostra 3,00 3,52 7,05 14,10 28,20

Concentrao de EDTA (mg L-1)

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

114

Tabela 11. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Student para o rio Tiet

t Significncia

1 extremidade Diferena

mdia

95% intervalo de confiana da

diferena Valor teste

Inferior Superior

-0,811 0,2315 -0,810 -3,5818 1,9618 36,91

Assim como feito para o rio Pinheiros, os valores de porcentagem de efeito, referente a

concentrao de 81,9%, esto muito prximos, no entanto, h uma leve diminuio do efeito

na concentrao mais elevada de EDTA, o que pode sugerir que metais presentes em pequena

quantidade foram quelados pelo complexante. No entanto, ao se observar o teste t, observa-se

que a significncia de 0,2315, logo 0,2315 > 0,025, aceita-se a hiptese nula, portanto, no

existe diferenas entre as medidas e o valor teste, no havendo uma diminuio

estatisticamente aparente da toxicidade.

No foi possvel realizar os testes com o EDTA para o rio Tamanduate, uma vez que o rio

em questo no apresentou toxicidade frente ao sistema Microtox na concentrao de 81,9%.

Como citado anteriormente, tanto para as manipulaes com EDTA, tiossulfato e gradao de

pH no foi possvel avaliar a toxicidade com relao aos metais e agentes oxidantes.

As tabelas includas no anexo desta dissertao indicam que as concentraes de metais

txicos como chumbo, zinco, cdmio esto abaixo dos limites de quantificao estabelecidos

pelo mtodo analtico utilizado e tambm esto abaixo dos limites preconizados pela

legislao brasileira, Resoluo CONAMA 357 (BRASIL 2005), para rios de classe 4 (muito

impactado), classe onde se enquadram os rios em questo. Logo, esperado que as

manipulaes que avaliam a presena de metais apresentem os resultados aqui obtidos.

5.3.2 Tiossulfato de sdio

O tiossulfato de sdio (Na2S2O3) um reagente utilizado nas reaes de oxirreduo como

oxidante. Os principais compostos que reagem com o tiossulfato de sdio so os halognios

com exceo do flor, alguns metais tambm. Tambm pode coordenar-se com metais

representativos como a prata e formar complexos (VOGEL, 1981). A abordagem usada no

EDTA, tambm foi aplicada ao tiossulfato de sdio. Inicialmente fez-se os testes de

toxicidade do reagente para determinao da faixa de concentrao onde o tiossulfato no

115

txico, porm capaz de reagir com as espcies presentes na amostra. E em seguida, o reagente

foi adicionado s amostras nas concentraes anteriormente definidas.

O teste foi realizado em trs concentraes (3,072; 6,142 e 12,28 g L-1) a partir da soluo

me de tiossulfato de sdio de 15 g L-1. A figura 44 ilustra os resultados de efeito pelas

concentraes de tiossulfato de sdio.

Figura 42. Teste de toxicidade do tiossulfato de sdio em trs concentraes diferentes.

Obs: O teste consiste na adio de tiossulfato de sdio no diluente e em seguida foram realizadas nove

diluies seriadas. A luminescncia foi medida nas nove cubetas e foram calculados os valores de

CE20 em 15 minutos de exposio. A linha tracejada marca o valor estabelecido que considera a

amostra txica, >20%.

A figura 44 indica que o tiossulfato de sdio tem uma baixa toxicidade para o A. fischeri,

as demais diluies no apresentaram efeito txico, uma vez que a bactria no mostrou uma

diminuio da sua luminescncia natural mesmo sendo exposta s altas concentraes de

tiossulfato de sdio, embora em algumas concentraes o efeito no exceda os 20% de efeito,

o que tambm caracteriza o reagente como no txico nestas concentraes. Assim, no foi

possvel calcular o valor de CE20 para este composto.

Como as concentraes de tiossulfato de sdio testadas foram muito elevadas, decidiu-se

diminuir a concentrao desse reagente para a ordem de miligrama por litro, j que os

compostos que reagem com o tiossulfato de sdio esto em concentraes mais baixas. Assim

como no caso do EDTA, fortificou-se o branco com um padro NIST de nitrato de prata. A

Toxicidade do Tiossulfato de Sdio em diferentes concentraes

Teste de Toxicidade do Reagente

15 minutos

3,072 6,1425 12,285

Concentrao (g L-1)

0

5

10

15

20

25

30

Efe

ito

(%

)

116

prata um metal txico para a A. fischeri e as reaes que envolvem a prata com o tiossulfato

so bem conhecidas. A toxicidade do branco fortificado com prata 10 mg L-1 encontra-se

ilustrada na figura 43:

Figura 43. Teste de toxicidade para determinar a CE20 do branco fortificado com prata 10 mg L-1 aps

5 e 15 minutos de exposio.

Obs: Aps o preparo do branco fortificado, usou-se o protocolo de nove diluies para confeccionar a

curva dose-resposta e assim determinar a concentrao efetiva capaz de causar o efeito em 20%.

A CE20 calculada foi de 0,323 mg L-1aps 15 minutos de exposio. A amostra apresentou

uma elevada toxicidade para a substncia testada. Foram separadas seis pores do branco

fortificado com prata 10 mg L-1 e em cinco delas adicionou-se quantidades distintas de

tiossulfato de sdio, para avaliao do efeito em porcentagem de cada soluo. Conforme

pode ser observado na figura 44, houve uma diminuio da toxicidade a partir da

concentrao de 10,49 mg L-1 com valor negativo de efeito (-12,35%), que se manteve na

concentrao seguinte. A prata solvel em soluo reage com o tiossulfato formando um

complexo solvel de ditiossulfatoargentato [Ag(S2O3)2]3-. Paralelamente, observou-se a

formao de um precipitado preto em alguns tubos, que segundo Vogel (1981) corresponde ao

sulfeto de prata, Ag2S, oriundo da instabilidade do precipitado de tiossulfato de prata,

Ag2S2O3 (decomposio hidroltica).

Grfico de Porcentagem de Efeito da Amostra Fortificada com Prata

gua do Rio Jaguar fortificada com prata 10 mg L-1

% de Efeito (5 min)

% de Efeito (15 min)

0,128 0,2559 0,5119 1,024 2,048 4,095 8,19

Concentrao (mg L-1)

-10

0

10

20

30

40

50

60

Efe

ito (

%)

117

Figura 44. Teste de toxicidade aguda com branco fortificado com prata em diferentes concentraes de

tiossulfato de sdio.

Aps estabelecer a faixa de concentrao de tiossulfato de sdio, iniciou-se as

manipulaes com as amostras do rio Pinheiros e Tiet. A figura 45 ilustra os resultados

obtido para o rio Pinheiros (a) e Tiet (b), respectivamente:

Figura 45. Teste de toxicidade aguda com amostras do (a) rio Pinheiros e (b) Tiet em dirferentes

concentraes de tiossulfato de sdio

(a)

Grfico de Toxicidade da amostra fortificada com prata em diferentes concentraes de tiossulfatode sdio

5 minutos

15 minutos

AMOSTRA 1,31 2,62 5,24 10,49 20,98

Concentrao de tiossulfato (mg L-1)

-20

0

20

40

60

80

100E

feit

o (

%)

Grfico de Porcentagem de efeito pela concentrao de Tiossulfato de sdio adicionado.

Rio Pinheiros

5 minutos

15 minutos

Amostra 1,31 2,62 5,24 10,49 20,98

Concentrao de tiossulfato (mg L-1)

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

*

118

(b)

Obs: A amostra colocada em contato com o organimos-teste e medida sua luminosidade aps 5 e 15

minutos de exposio.

* valor estatisticamente diferente do valor teste de 50,25 no teste t de Student.

Na figura 45 (a), percebe-se que a partir da concentrao de 2,62 mg L-1 houve uma

diminuio de toxicidade gradativa conforme a concentrao aumenta de 9% sendo que o

mximo obtido foi na concentrao de 20,98 onde o efeito diminuiu 33%. Na figura 45 (b)

no se observa nenhuma alterao no efeito quando adicionado tiossulfato na amostra em

questo. Para avaliar a diminuio em nveis de significncia, usou-se o teste t de Student,

onde as hipteses so: H0: = as porcentagens de efeito so todas iguais, (alternativa) H1: >

as porcentagens de efeito so diferentes ( = 0,025 unilateral e = 0,05 bilateral). A tabela 12

apresenta os valores de probabilidade associada a significncia dos dois rios:

Tabela 12. Valores de significncia em 1 extremidade (probabilidade associada) para o teste t de

Student.

Rio t Significncia

1 extremidade Diferena

mdia

95% intervalo de confiana da

diferena Valor teste

Inferior Superior

Pinheiros -2,683 0,0027 -7,916 -16,107 0,2747 50,25 Tiet -3,026 0,047 -2,567 -6,2168 1,0834 30,15

Para o rio Tiet observa-se que o nvel de significncia apresentado para o teste unilateral

de 0,047, valor superior a 0,025, o que permite aceitar a hiptese nula dos valores de efeito

serem iguais antes e depois da adio de tiossulfato. J no rio Pinheiros, o nvel de

Porcentagem de efeito pela concentrao de tiossulfato de sdio

Rio Tiet

5 minutos

15 minutos

Amostra 5,25 10,49 20,98

Concentrao de tiossulfato (mg L-1)

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

119

significncia de 0,0027, valor inferior a 0,025, desta forma, rejeita-se a hiptese nula (H0) e

aceita-se a alternativa H1, onde considera os valores de efeito antes e depois da adio.

Em resumo, uma diminuio de 33% foi observada na concentrao de 20,98 mg L-1 para

o rio Pinheiros, e os testes estatsticos corroboram com as observaes feitas, indicando uma

diminuio do efeito causado pela adio do tiossulfato. Tal aspecto indica a presena de

oxidantes no metlicos, uma vez que o teste com EDTA no apresentou mudana na

toxicidade. No rio Tiet, no houve alterao de seu efeito txico em nenhuma das

concentraes de tiossulfato de sdio testadas.

5.3.3 Gradao do pH

Todo organismo-teste tem um faixa tima de pH. O teste de gradao de pH consiste em

trabalhar no limite desta faixa, e pegar assim os compostos qumico que so levemente

ionizados, ou que se dissociam. A faixa de pH da A. fischeri 6,5 a 8,0. Desta forma ajustou-

se o pH das amostras para aproximadamente prximo dos valores limites, os resultados

obtidos esto organizados nas figuras 46 e 47:

Figura 46. Resultados de gradao de pH do rio Tiet para os limites da faixa de trabalho do

organismo-teste e os respectivos brancos.

Gradao do pH para o limite da faixa de trabalho

Rio Tiet

5 minutos

15 minutos

Am

ost

ra

Gra

dao

pH

6,4

5

Gra

dao

pH

7,7

9

Bra

nco

Gra

dao

pH

6,0

2

Bra

nco

Gra

dao

pH

7,7

7

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

120

Figura 47. Resultados de gradao de pH do rio Pinheiros para os limites da faixa de trabalho

do organismo-teste e os seus respectivos brancos.

A tabela 13 apresenta os resultados do teste t para amostras emparelhadas comparando os

valores mdios de efeito txico.

Tabela 13. Resultados estatsticos referente ao teste t de Student para amostras emparelhadas,

comparando os valores mdios de efeito txico (5 e 15 minutos) dos pares: amostra e gradao em

diferentes valores de pH.

Rio Par Mdia Desvio

Padro Erro padro

mdio t

Significncia -

2 extremidades

Tiet Gradao pH 6,45 7,305 3,41 2,415 3,025 0,203

Gradao pH 7,79 19,28 1,07 0,760 25,37 0,025

Pinheiros Gradao pH 6,43 39,32 37,6 26,57 1,479 0,378

Gradao pH 8,06 47,67 30,6 21,66 2,201 0,270

Usou-se uma nova abordagem estatstica para comparar os valores de efeito txico, antes

e depois da manipulao. Conhecida como Teste t de Student para amostras emparelhadas, ela

usualmente utilizada para casos de comparao dos valores mdios em pares especficos,

diferente do caso anterior que comparava o valor teste para cada caso. A interpretao do

valor de significncia permanece a mesma. As hipteses so, H0: O valor de efeito entre a

amostra antes e depois da manipulao o mesmo, H1: O efeito observado antes diferente

que o observado depois da mudana do pH. Para um nvel de confiana de 95% a

significncia de 0,05.

Gradao do pH para o limite da faixa de trabalho

Rio Pinheiros

5 minutos

15 minutos

am

ost

ra

Gra

dao

pH

6,4

3

Gra

dao

pH

8,0

6

Bra

nco

Gra

dao

pH

6,7

Bra

nco

Gra

dao

pH

7,9

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

121

Observou-se que em todos os casos o valor de significncia maior que 0,05, indicando

que no houve alterao no efeito aps a manipulao. Apenas em um caso apresentado

observou-se um valor inferior 0,05 (0,025) para a o rio Tiet gradao em pH 7,79. Este

valor sugere que houve diferenas no valor de efeito da amostra antes e depois da

manipulao.

Os compostos associados gradao do pH so espcies qumicas que sofrem reaes

cido-base e de alguma forma se tornam indisponveis, seja precipitando, ou degradando-se.

Porm, nenhuma manipulao resultou em diminuio absoluta da toxicidade da amostra,

sendo observadas apenas diminuies pontuais. Uma forma mais concreta de observar o efeito

do pH na toxicidade e nos compostos alterar este parmetro e associar a filtrao removendo

material particulado, ou possveis compostos que tenham sofrido precipitao. As amostras do

rio Tamanduate comearam a apresentar toxicidade e, portanto, foi possvel realizar com elas

as manipulaes restantes.

5.3.4 Ajuste de pH e Filtrao vcuo

Muitas substncias qumicas apresentam regies em suas estruturas que reagem com on

hidrnio (H+) ou o on hidroxila (OH-) presente em abundncia em cido e bases,

respectivamente. Ao reagirem com estas espcies, as propriedades qumicas destas

substncias so alteradas, e toda dinmica da soluo se modifica. A precipitao um dos

fenmenos influenciada pelo pH da soluo, porm no a nica que ocorre, sendo tambm

observadas reaes de oxirreduo governadas pelo pH e outras propriedades qumicas. A

filtrao por sua vez um mtodo de separao fsica para slidos insolveis e lquido, muito

acessvel e barato, sendo mundialmente muito utilizada em laboratrios. Ela separa o slido

do lquido usando uma membrana com uma porosidade apropriada retendo o slido na

membrana para facilitar um vcuo pode ser aplicado no sistema, e desta forma favorecer a

passagem da mistura lquido-slido pela membrana. O lquido por sua vez transferido para

um frasco coletor, enquanto o slido permanece retido na membrana.

Nesta etapa do trabalho associou-se estes dois mtodos para retirar as substncias

insolveis presentes na amostra nas faixas de pH cido, bsico e inicial. Entende-se como pH

inicial, o pH em que se encontra a amostra inicialmente, sem adio de qualquer cido ou

base. Os resultados obtidos para o rio Tiet esto organizados na figura 48:

122

Figura 48.Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Tiet e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade, pH da amostra e

a data da execuo da manipulao.

Obs: Os resultados apresentados foram obtidos usando o protocolo de nove diluies em srie para

confeccionar a curva dose-resposta e desta forma obter o CE20.

Em todos os pH trabalhados o valor de CE20 calculado aps a filtrao maior que o CE20

da amostra sem sofrer qualquer alterao. Esse aumento da CE20 significa, em termos

prticos, que a toxicidade aps a filtrao em todos os pH foi reduzida. As amostras

trabalhadas nesta etapa do projeto apresentavam uma quantidade grande de material suspenso

que, aps a filtrao, ficou retido no filtro. Mesmo o resultado sendo expressivo,

qualitativamente e quantitativamente, como pode ser posteriormente observado, a toxicidade

no foi reduzida totalmente, ou seja, como j indicava as outras manipulaes, trata-se de uma

mistura muito complexa de substncias txicas presentes no rio Tiet. Para avaliar a

expressividade da diminuio da toxicidade da amostra frente filtrao realizou-se o teste t

para uma amostra. Os resultados do teste t de Student esto apresentados na tabela 14:

123

Tabela 14. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com as

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Tiet.

pH

Mdia

Filtrao D. Padro Teste

Inicial D. Padro

Filtrao n Teste

Inicial n

Filtrao Valor

t Significncia

cido 0,4629 0,0025 0,1255 3 2 -6,168 0,0086

Inicial 0,2864 0,0025 0,1111 3 2 -3,955 0,0288

Bsico 0,1554 0,0025 - 3 1 -34,88 0,0008

Em todos os casos a significncia est abaixo de 0,05 indicando que, da mesma forma que

anteriormente, a hiptese nula neste caso descartada e assume-se a hiptese alternativa dos

valores serem diferentes.

Os resultados obtidos para o rio Tamanduate esto ilustrados na figura 49 e tabela 15:

Figura 49. Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Tamanduate e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade.

Obs: Os resultados apresentados foram obtidos usando o protocolo de nove diluies em srie para

plotar a curva dose-resposta e desta forma obter o CE20.

124

Tabela 15. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com as

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Tamanduate.

pH Mdia

Filtrao D. Padro

Teste Inicial D. Padro

Filtrao n Teste

Inicial n

Filtrao valor-

t Significncia

cido 0,4174 0,0277 0,0721 3 2 -8,148 0,0039

Inicial 0,1288 0,0277 0,0144 3 2 -2,893 0,0629

Bsico 0,0810 0,0277 - 3 1 -0,496 0,6691

Os resultados aqui apresentados para o rio Tamanduate indicam que a filtrao no to

efetiva na diminuio da toxicidade, e, embora se observe uma pequena diminuio desta

toxicidade, pouco significativa, principalmente no pH inicial em que a diminuio mais

visvel. A significncia maior que 0,05 para a pH inicial e bsico (em negrito) impede que a

hiptese nula seja descartada e desta forma, os valores de CE20 antes e depois da filtrao so

estatisticamente iguais. Porm, em pH cidos h uma diferena significativa dos valores de

CE20 antes e depois da filtrao, observada tanto na figura quanto pelos clculos estatsticos.

Por fim, os resultados da CE20 para o rio Pinheiros encontram-se na figura 50 e tabela 16:

Figura 50. Valores mdios (n=2; n=1, pH Bsico) de CE20 em 15 minutos de exposio da gua bruta

do rio Pinheiros e da mesma amostra filtrada em uma membrana 0,45 m de porosidade.

125

Obs: Os resultados apresentados foram obtidos usando o protocolo de nove diluies em srie para

plotar a curva dose-resposta e desta forma obter o CE20.

Tabela 16. Comparao dos resultados de toxicidade (CE20 em 15 min.) entre amostra bruta com

fraes filtradas em meio cido, bsico e neutro do Rio Pinheiros.

pH Mdia

Filtrao D. Padro

Teste Inicial D. Padro

Filtrao n Teste

Inicial n

Filtrao valor-

t Significncia

cido 0,2729 0,0149 0,0045 5 2 -20,29 0,0001

Inicial 0,2024 0,0149 0,0578 5 2 -6,526 0,0013

Bsico 0,1374 0,0149 - 5 1 -5,742 0,0046

Na figura 50, observa-se um aumento da CE20 aps a amostra ser filtrada em todos os pH

testados, o que caracteriza uma diminuio da toxicidade como um todo, logo a filtrao se

mostrou capaz de diminuir a toxicidade nas faixas cidas e bsicas. Em nveis estatsticos, a

significncia no teste t de Student ficou abaixo de 0,05, logo a hiptese nula rejeitada em

detrimento da alternativa, que assim como nos casos anteriores, diz respeito aos valores de

CE20 serem diferentes, antes e depois da filtrao.

Os trs rios estudados tiveram sua toxicidade afetada de alguma forma pela filtrao. A

retirada do material suspenso, comumente encontrado nas amostras, responsvel por parte

da toxicidade total da gua dos rios. Este material tem origem incerta, uma vez que os rios

esto muito expostos tanto pelo lanamento de esgoto (alto teor de carbono orgnico e alto

teor de slidos, como pode ser observado nas tabelas do anexo A) e tambm pela poluio

atmosfrica na queima de combustveis e o prprio sedimento do rio. A faixa de pH

trabalhada indiferente para a toxicidade, com exceo do rio Tamanduate, uma vez que em

pH cidos ou alcalinos observou-se a diminuio desta toxicidade. O rio Tamanduate no

apresentou diminuio de toxicidade como os demais, apenas em meio cido houve uma

diminuio o que indica presena de compostos qumicos ionizveis. J nos rios Tiet e

Pinheiros a presena de compostos no-ionizveis parece mais aparente uma vez que no

foram observadas mudanas no comportamento da amostra filtrada quando alterando o pH.

Paralelamente aos testes de toxicidade com a amostra sem manipulao e a amostra

filtrada, foram realizados os testes com o branco (gua do rio Jaguar). Os mesmos

procedimentos executados na amostra foram repetidos no branco. Os resultados mostram que

no houve qualquer mudana na toxicidade do branco antes e depois da filtrao, indicando

que no h contaminao da amostra pelo filtro e de outra origem. Os resultados do branco

so apresentados na tabela 17:

126

Tabela 17. Efeito txico dos brancos aps a filtrao em pH cido, bsico e inicial na concentrao

mxima permitida pelo Sistema Microtox, 81,9%.

Efeito em 5

minutos (%)

Efeito em 15

minutos (%) Faixa de pH

3,340 3,857

cido

5,446 6,850

-4,218 -4,681

8,066 12,02

-4,128 -2,880

-5,077 -2,753

4,083 -1,692

Bsico 2,819 2,397

-1,375 2,087

3,447 2,270

Inicial

4,617 3,646

12,48 13,74

8,112 4,841

-33,47 -23,03

-6,377 -8,693

Obs: Aps a manipulao em sua respectiva faixa de pH, o pH do branco reajustado para a faixa de

trabalho do organismo-teste e desta forma o teste realizado em protocolo dose-nica.

Os dados de filtrao corroboram com os dados de monitoramento ambiental feito pela

CETESB (Anexo A). Os valores de slidos totais para os trs rios so altos, na faixa de 200 a

500 mg L-1.

5.3.5 Extrao em fase slida

A extrao em fase slida uma tcnica de extrao e pr-concentrao da amostra muito

eficiente e simples e baseada em princpios cromatogrficos. O manual da USEPA para

execuo do TIE sugere cartuchos tipo C18 que so preferveis para compostos mais apolares,

j que as longas cadeias de 18 carbonos apresentam um carter mais hidrofbico. Uma

limitao muito encontrada em cartuchos C18 disponveis o baixo rendimento em regies

cidas e alcalinas, j que nestas regies de pH h uma intensa atividade de ons que

apresentam baixa afinidade pela cadeia de octadecil, alm de amostras muito cidas ou muito

bsicas serem capazes de dissolver a slica, base da fase estacionria. Em contrapartida, hoje

em dia h um nmero muito grande de fases estacionrias disponveis no mercado, com

diferentes propriedades e com afinidade por inmeros compostos. HLB - Coluna balanceada

hidroflico-lipoflico de fase reversa so muito versteis, uma vez que possuem stios de

127

interao com molculas polares e apolares em sua estrutura. Amostras muito cidas ou muito

alcalinas no so capazes de dissolver a base polimrica da fase HLB, sendo muito

recomendada na extrao de diferentes compostos nesta faixa de pH. A figura 51 foi retirada

de um catlogo e compara a fases estacionrias C18 e HLB em termos de fator de reteno e

conclui-se que a faixa tima de operao da C18 a faixa neutra levemente cida e para a

HLB uma faixa maior de pH (0~14). No mtodo da USEPA h uma forte recomendao em

usar outros tipos de fases estacionrias. Portanto, optou-se em usar as fases HLB para as

faixas cidas e alcalinas e para a faixa neutra manteve-se o uso da C18 conforme recomenda o

protocolo da USEPA.

Figura 51. Curva terica de fator de reteno em funo do pH da amostra e as faixas recomendveis

de trabalho das duas fases estacionrias, C18 e Oasis HLB.

Fonte: (WATERS CORPORATION, 2014)

Os rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate so altamente impactados pela urbanizao e

espera-se que uma quantidade muito grande de substncias qumicas de origem diversa seja

responsvel pela toxicidade, embora hoje a maior parte da poluio destes rios tem origem no

esgoto no tratado. Os mtodos de extrao tm que refletir essa pluralidade de substncias,

deste modo, escolheu-se trabalhar com mtodos mais abrangentes, sendo que um deles

protocolo da USEPA (2007) que descreve a determinao e extrao usando cartuchos de SPE

do tipo HLB para frmacos, produtos de higiene pessoal e cosmticos em gua, e em outras

matrizes. O mtodo tambm trabalha com variao do pH da amostra na faixa cidas e

alcalinas. J os cartuchos do tipo C18 o mtodo descrito foi retirado de um artigo cientfico

publicado em 1999, onde Castillo e Barcel descrevem a identificao de compostos txicos

polares em efluente industrial usando fracionamento e cromatografia lquida acoplada

128

espectrometria de massas. Os autores avaliam por meio do fracionamento qumico a

toxicidade das fraes obtidas pela extrao sequencial usando cartuchos de C18, Iso ENV+

(uma fase estacionria com afinidade maior por compostos polares). As classes de compostos

detectados por LC/MS foram: tensoativos no inicos, compostos fenlicos, derivados de

ftalatos, naftalenos sulfonados e sulfonato de alquilbenzeno linear (LAS). Trata-se de um

mtodo muito abrangente e utilizado por outros grupos de pesquisa na extrao de gua muito

impactadas como descrito por Farr e colaboradores (2001) em seu artigo no estudo da

inibio da bioluminescncia por tensoativos no ensaio do Microtox em um equipamento

anlogo chamado Toxalert (FARR, GARCA, et al., 2001).

As amostras foram filtradas antes da extrao como medida preventiva, uma vez que as

partculas em suspenso podem obstruir a passagem da amostra pelo cartucho. Uma forma de

avaliar o andamento da reteno, que consiste na saturao do cartucho pelo excesso de

compostos, retirar alquotas em dois momentos na extrao. O mtodo da USEPA sugere a

primeira alquota na metade do volume total da amostra, no caso 100 mL e a ltima no final

do processo da extrao, os 30 mL finais. Portanto, ao se realizar os testes toxicolgicos com

o sistema Microtox, h duas fraes descritas A80 e A170 de 30 mL cada. Os resultados

obtidos foram organizados na figura 52:

Figura 52. Resultados de toxicidade obtidos aps realizar a extrao em fase slida para a amostra dos

rios (a) Tiet, (b) Pinheiros e (c) Tamanduate.

(a)

Sem manipulao

Extrao A80

Extrao A170cido bsico inicial inicial inicial-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

Inib

io

(%

)

129

(b)

(c)

Obs: As fraes A80 e A170 representam respectivamente, alquotas de 30 mL cada, recolhidas aps

80 mL da amostra passada e os ltimos 30 mL finais. Os valores de inibio so referentes a

concentrao mxima permitida pelo teste de 81,9%.

Em todas as ilustraes da figura 52 observa-se uma diminuio visvel da toxicidade da

amostra aps a extrao, independente da fase estacionaria usada, ou da faixa de pH testada.

Os valores obtidos e plotados referem-se inibio da bioluminescncia na concentrao

mxima de 81,9%. H alguns valores positivos de inibio, mas todos abaixo de 20%, que

Sem manipulao

Extrao A80

Extrao A170cido bsico inicial inicial-40

-20

0

20

40

60

80

100

Inib

io

(%

)

Sem manipulao

Extrao A80

Extrao A170inicial inicial cido cido bsico-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

Iin

ibi

o

(%

)

130

segundo ABNT NBR 15411-1 (2012) e CETESB (2016), caracteriza a amostra como no-

txica.

Embora outras manipulaes realizadas tenham diminudo a toxicidade da amostra como a

filtrao e a adio de tiossulfato de sdio, somente a SPE foi capaz de reduzir toda a

toxicidade da amostra. Os compostos orgnicos so os principais grupos de compostos a

serem retidos nos cartuchos de SPE. O tipo da fase usada sugere a polaridade das substncias

retidas, a coluna Oasis HLB retm compostos polares e apolares, j que em sua estrutura h

stios de interao para esses dois tipos de compostos. J o cartucho C18 retm compostos

apolares. A extrao usando C18 em pH inicial, teve o mesmo desempenho que o cartucho de

carter anftera, HLB, portanto, os compostos retidos so majoritariamente apolares, ou

apresentam caractersticas apolares. O pH em que a amostra foi extrada tambm indica que o

composto orgnico em questo no sofre ionizao e nem dissociao em pH alcalino, pois

independente do pH testado no houve qualquer alterao no rendimento da extrao,

indicando que se trata de uma molcula no ionizvel, ou seja, no possui, aparentemente,

stios cido-base na sua estrutura.

As fraes eludas foram armazenadas e os solventes considerados muito txicos para a

Allivibrio fischeri foram trocados por metanol para o teste de recuperao da toxicidade a

partir do eluato.

Foram tambm realizados testes toxicolgicos com o branco dos cartuchos. O objetivo de

recolher uma frao em metanol da coluna apenas condicionada garantir que nenhum

composto possa estar contaminando a amostra. Os resultados obtidos dos brancos esto

apresentados na figura 53. Cada extrao realizada gerava um branco que era nomeado de

acordo com a data de sua realizao. Os resultados apresentados indicam que nenhum

composto txico foi transferido para a amostra no momento da extrao. A frao de branco

A80, que representa o branco analtico, tambm no apresentou resultados quanto a sua

toxicidade.

131

Figura 53. Efeito txico dos brancos da coluna realizando no incio, aps o condicionamento da

coluna.

Obs: Cada extrao gerava um branco que era nominado com o dia em que a extrao foi efetuada.

5.3.6 Aerao

Muito embora a aerao seja um teste importante na avaliao e identificao da

toxicidade de uma amostra, trata-se da manipulao tecnicamente mais complexa. H um

nmero muito grande de variveis nesta manipulao e todas devem ser muito bem

controladas para que os resultados obtidos reflitam a caracterstica da amostra.

A aerao comumente utilizada em testes ecotoxicolgicos com a finalidade de manter

os nveis timos de oxignio para os organismos-teste. No TIE, ela utilizada para detectar a

presena de compostos volteis e tensoativos. E pode ser realizada em trs faixas de pH;

cida, alcalina e inicial, esta ltima corresponde ao pH em que a amostra apresentava no

momento da coleta. A presena de tensoativos confirmada neste teste j que agem na

interface, de forma que quando sofrem aerao formam bolhas que estouram e aderem-se as

paredes na vidraria utilizada. No final do processo, lavam-se as paredes da vidraria com

Efeito txico dos brancos da coluna relativo a cada extrao realizada

15 minutos30/11 25/10 8/12 25/10 22/12 5/10 19/10 11/10

Branco do dia

0

20

40

60

80

100

Efe

ito

(%

)

132

metanol, solvente comumente utilizado para se solubilizar este tipo de compostos e testes de

toxicidade so realizados no metanol coletado. Os testes toxicolgicos foram realizados nas

amostras aps serem aeradas por 1 hora. Foram testados brancos para avaliar possveis

contaminaes. A figura 54 ilustra os valores de CE20 para os trs rios.

Figura 54. Valores de CE20 em porcentagem das amostras dos trs rios estudados.

Obs: As amostras foram submetidas a aerao e agitao magntica por 1 hora em seguida foram

realizados testes de toxicidade na amostra aps aerao. O protocolo utilizado consiste na diluio das

amostras 9 vezes afim de calcular a CE20, o resultado obtido foi confeccionado no grfico juntamente

com o valor de CE20 da amostra sem manipulao.

A aerao foi capaz de diminuir a toxicidade da amostra, indicando presena de

compostos volteis, ou tensoativos. Uma forma de complementar o ensaio de aerao

realizar uma lavagem com metanol na parede da vidraria utilizada.

Primeiramente, foi determinado a curva dose-resposta para o metanol usando o Sistema

Microtox (Figura 55), sendo que esta curva indica a concentrao de metanol que no exerce

efeito sobre o organismo, e a CE20 calculada foi de 5,04%.

Toxicidade da amostra aps a aerao em 15 minutos de exposio

Aerao

Sem manipulaoPinheiros Tamanduate Tiet0

10

20

30

40

50

60

CE

20

(%

)

133

Figura 55. Curva dose-resposta para o metanol puro obtida pelo sistema Microtox em 15 minutos de

exposio.

A concentrao ideal em que o metanol no toxico para o organismo-teste corresponde a

4,0%, valor abaixo da CE20 do metanol. Nesta concentrao espera-se que apenas o soluto

possa exercer efeito txico no organismo. Desta forma, preparou-se uma soluo de fenol em

metanol na concentrao de 4% e fenol na concentrao de 47,5 mg L-1. A CE20 calculada foi

de 28,32%. O resultado toxicolgico obtido deste experimento encontra-se ilustrado na figura

56.

Curva dose-resposta do metanol em 15 minutos de exposio

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Concentrao (%)

0

20

40

60

80

100

120

Efe

ito

(%

)

134

Figura 56. Teste toxicolgico para a soluo de fenol em metanol na concentrao de 47,5 mg L-1. A

CE20 calculada de 28,32% com intervalo de confiana de 25,94-30,91.

Juntamente com a soluo de fenol, conduziu-se o mesmo teste com uma soluo de

metanol na concentrao de 4%. Os resultados obtidos esto organizados na tabela 18:

Tabela 18. Resultado dos valores de toxicidade, efeito txico, no tempo de exposio de 5 e 15

minutos. Utilizando o protocolo com uma serie de nove diluies visando determinar a CE20.

Concentrao

(%) Efeito (%) em 5

minutos Efeito (%) em 15

minutos

0,3199 -1,943 -2,07

0,6398 -1,250 -2,981

1,280 1,842 1,509

2,559 -2,307 -8,899

5,119 0,2191 -0,3898

10,24 -0,3712 -4,053

20,48 -4,364 -12,76

40,95 -7,144 -14,44

81,90 2,191 -4,315

Os valores de efeito, tanto em 5 minutos quanto em 15 minutos, foram negativos,

indicando que a soluo de metanol em gua na concentrao de 4% no txico para o

Resultado do teste toxicolgico em 5 e 15 minutos de exposio da soluo de fenol em metanol na

concentrao de 47,52 mg L-1

5 minutos

15 minutos

5,119 10,24 20,48 40,95 81,9

Concentrao (%)

0

10

20

30

40

50

60

Efe

ito

(%

)

135

sistema Microtox, logo esta srie de experimentos indica que os valores de efeito

representado na figura 56 so do soluto (fenol) apenas, e o metanol presente no exerce efeito

txico no organismo-teste.

Os resultados obtidos em termos de CE20 para o metanol recolhido da lavagem da vidraria

esto apresentados na tabela 19:

Tabela 19. Resultados de toxicidade (CE20 em 15 minutos) do metanol de lavagem usado aps o

procedimento de aerao.

Rios CE20 (%) Intervalo de Confiana (%) Porcentagem de efeito na

concentrao de 81,9% (%)

Pinheiros 48,96 43,75-54,80 34,22

Tamanduate 28,11 24,40-32,38 33,44

Tiet 71,95 24,85

No foi possvel calcular o intervalo de confiana.

Os resultados apresentados na tabela 19 indicam que h espcies solubilizadas no metanol

que esto causando toxicidade. Estas espcies, como dito anteriormente, so tensoativos que

se aderem na vidraria. Os valores encontrados foram muito diferentes nos trs rios estudados,

embora sejam rios muito impactados. Aparentemente, o rio Tamanduate apresentou uma

maior toxicidade devido a tensoativos, que os demais rios estudados.

O teste de aerao deu informaes importantes com relao ao grupo de compostos

txicos. O teste foi capaz de diminuir a toxicidade da amostra e indicou a presena de

tensoativos como um dos possveis compostos txicos. Uma outra informao que pode ser

descartada so os compostos volteis pela aerao. Observa-se na figura 57, que muito da

toxicidade devido a compostos volteis e uma pequena frao por tensoativos, com exceo

do rio Tamanduate que apresentou uma diminuio mais significativa por tensoativo. Os

valores foram convertidos em Unidade Txica (UT) que corresponde ao inverso da CE20 em

porcentagem, a unidade txica facilita a visualizao dos valores, pois estabelece uma relao

de proporcionalidade.

136

Figura 57. Resultados de toxicidade apresentados anteriormente, porm convertidos em unidades

txica, UT20.

Obs: Aqui foram organizados de forma que possa se ver o quanto se recuperou da toxicidade pelas

fraes recolhidas, no caso, o metanol de lavagem e a aerao.

5.3.7 Recuperao da toxicidade a partir do eluato

Os procedimentos descritos na fase 1 foram realizados e os resultados obtidos sugerem

que compostos orgnicos, material suspenso e espcies reativas ao tiossulfato de sdio so os

principais responsveis pela toxicidade da amostra nos trs rios. As fraes coletadas aps a

eluio do cartucho contm informaes importantes sobre a natureza do agente txico. Com

isso, foram realizadas anlises toxicolgicas nas fraes coletadas na extrao em fase slida,

mais especificamente na C18. Nesta etapa, houve necessidade de realizar algumas

manipulaes no eluato, porque os solventes usados na extrao (hexano, diclorometano) so

muito txicos para o organismo-teste. Neste sentido, evaporou-se os solventes em um

concentrador e em alguns casos usando um fluxo constante de nitrognio, em seguida,

solubilizou-se o extrato em metanol. Os extratos se foram solveis em metanol e o teste de

toxicidade foi conduzido da mesma forma que o utilizado para o metanol de lavagem.

Diluiu-se o eluato, concentrado 200 vezes aps a extrao, na proporo de 4:5. Esta

diluio deixa o metanol, solvente presente no eluato, na concentrao limite de 4%,

entretanto o ideal seria diluir 200 vezes para que se tenha a mesma concentrao antes e

0 5 10 15 20 25 30 35

Aerao Pinheiros

Pinheiros

Aerao Tamanduate

Tamanduate

Aearao Tiet

Tiet

UT20 (%)

Metanol de lavagem

Aerao

Sem manipulao

137

depois da extrao, logo se espera que os valores de CE20 sejam mais baixos. Os resultados

encontrados para o rio Pinheiros encontram-se na tabela 20:

Tabela 20. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Pinheiros o valor do

intervalo de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%.

Tipo de

cartucho

usado

Solvente pH CE20 (%) IC (%) Efeito na concentrao

mxima de 81,9%

C18 Hexano Inicial 4,147 3,389-5,074 92,54%

C18 DCM/Hexano Inicial 51,35 45,67-57,74 45,68%

C18 Metanol/DCM Inicial - - 15,27%

C18 Hexano Inicial - - -0,1196%

C18 DCM/Hexano Inicial 32,69 22,51-47,46 49,09%

C18 Metanol/DCM Inicial - - 5,047%

HLB Metanol cido 26,60 22,59-31,32 46,89%

HLB Metanol cido 29,60 16,51-53,05 34,80%

HLB Metanol Bsico 6,262 4,760-8,237 66,88%

HLB Metanol/Ac. Frmico Bsico - - 28,08% (DCM) diclorometano; (-) no foi possvel calcular a CE20 devido toxicidade baixa do composto.

Apenas os eluatos obtidos da extrao em fase slida que foram armazenados por maior

perodo de tempo, por estarem em solventes orgnicos e em baixa temperatura, apresentam

uma maior estabilidade qumica.

As fraes recolhidas na extrao em fase slida apresentaram toxicidade com nfase nas

fraes diclorometano/hexano e hexano que apresentaram toxicidade em pH inicial usando o

cartucho tipo C18. Em outros pH, as fraes em metanol apresentaram maior toxicidade. Os

solventes utilizados na extrao, hexano e diclorometano, podem confirmar a polaridade dos

compostos presentes, sendo que as fraes que apresentaram toxicidade so as mais apolares.

Castillo e Barcel (1999) indicam os tensoativos como principais compostos eludos por estes

solventes, e especificam os AEO (Alcohol polyethoxylates), os NPEO (nonylphenol

polyethoxylates) nestas fraes. Entretanto, difcil confirmar a presena destes compostos na

amostra do rio Pinheiros sem anlise qumica desta frao extrada.

A toxicidade CE50 destes tensoativos para a bactria A. fischeri entorno de 1,5 a 11,4 mg

L-1 em 5 minutos de exposio (DORN et al., 1993). Tratam-se de substncias muito txicas

para este organismo-teste. Existem estudos que avaliam o risco da exposio destas

tensoativos para a sade humana (HERA, 2009).

138

Os dados apresentados na tabela 20foram convertidos para os valores de unidade txica e

a fim de verificar a contribuio de cada frao e das outras manipulaes na toxicidade total,

construiu-se a figura 58:

Figura 58. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15 minutos de

exposio para o rio Pinheiros.

Obs: Somente as manipulaes que reduziram a toxicidade da amostra do rio Pinheiros foram

consideradas.

Na figura 58 pode-se observar os valores mdios de unidade txica para o rio Pinheiros.

Ao somar os valores de UT20, v-se que os valores totalizam o valor inicial da toxicidade, o

modelo usado supe interaes aditivas entre os compostos, entretanto existem outros tipos de

modelo de interao entre os xenobiticos, sinergismo, potenciao e antagonismo (OGA,

CAMARGO e BATISTUZZO, 2008). Mesmo adotando o modelo aditivo, os resultados

apresentados so satisfatrios. No pH neutro, os resultados das manipulaes so maiores que

o valor da toxicidade inicial do rio, muito embora tenham-se extrado todos os compostos

txicos da amostra conforme ilustrado na figura 52b.

De forma geral, todas as manipulaes feitas nas guas do rio Pinheiros: filtrao,

aerao, extrao em fase slida (A80 e A170), os eluatos foram reunidas em duas figuras.

No foi possvel colocar os valores de EDTA e tiossulfato pois pelo mtodo utilizado para o

teste de toxicidade, protocolo de dose-nica na concentrao de 81,9%, no se obtm o CE20,

mas sim o efeito (%) para aquela concentrao testada (figuras 59).

0

10

20

30

40

50

60

pH neutro Toxicidade

Inicial

pH cido Toxicidade

Inicial

pH bsico Toxicidade

Inicial

UT

20

(%)

Filtrao Toxicidade Inicial FA - Hexano FB - DCM/Hexano FA - Metanol

139

Figura 59. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Pinheiros, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH

trabalhadas.

(a)

(b)

Os resultados de toxicidade dos eluatos do rio Tamanduate em todas as faixas de pH e

solventes utilizados esto organizados na tabela 21:

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Pinheiros

pH inicial

pH cido

pH bsico

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

0

Ex

trao

A1

70

Aera

o

Md

ia

Hex

an

o

DC

M/H

ex

an

o

Meta

no

l/D

CM

Meta

no

l

Meta

no

l/A

c.F

rm

ico

0

10

20

30

40

50

60C

E2

0 (

%)

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Pinheiros

pH inicial

pH cido

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

0

Ex

trao

A1

70

Hex

an

o

DC

M/H

ex

an

o

Meta

no

l/D

CM

Meta

no

l0

5

10

15

20

25

30

35

CE

20

(%

)

140

Tabela 21. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Tamanduate o valor do

intervalo de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%.

Tipo de

Coluna usada Solvente pH CE20 IC (%)

Efeito na concentrao

mxima de 81,9%

C18 Hexano Inicial 34,22% 19,80-59,14 50,03%

C18 DCM/Hexano Inicial 14,62% 13,60-15,72 56,60%

C18 Metanol/DCM Inicial - - 2,911%

C18 Hexano Inicial - - -13,45%

C18 DCM/Hexano Inicial 39,73% 29,46-53,58 39,35%

C18 Metanol/DCM Inicial - - 10,16%

HLB Metanol Bsico 2,769% 2,216-3,460 70,13%

HLB Metanol cido 10,05% 7,556-13,35 58,56%

HLB Metanol cido - - 13,56% (DCM) diclorometano; (-) no foi possvel calcular a CE20 devido toxicidade baixa do composto.

Assim como no rio Pinheiros, o rio Tamanduate apresentou toxicidade nas fraes mais

apolares, hexano e diclorometano/hexano em pH incial. Em pH cido e bsico as fraes ricas

em substncias txicas so aquelas eludas em metanol. Os resultados em unidades txicas

somando os valores de UT20 de cada manipulao realizada para o rio Tamanduate esto

apresentados na figura 61.

Figura 60. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15 minutos de

exposio para o rio Tamanduate.

As somas dos valores de unidade txica esto bem prximas do valor original da

toxicidade do rio, indicando um forte indcio de que o a toxicidade foi recuperada plenamente.

Entretanto, em pH alcalinos a somatria foi muito maior do que o observado. Este fato de

0

10

20

30

40

50

60

pH neutro Toxicidade

Inicial

pH cido Toxicidade

Inicial

pH bsico Toxicidade

Inicial

UT

20 (

%)

Filtrao Toxicidade Inicial Hexano DCM/Hexano Metanol

141

difcil explicao, uma vez que no se tem conhecimento das substncias presentes e

metablitos do analito, ou at um produto de degradao pode ter gerado tal efeito, ou o

modelo escolhido de interao entre os xenobiticos no corresponde verdadeira natureza da

amostra.

Grficos com todos os valores de CE20 referentes ao rio Tamanduate em todos as faixas

de pH testados esto apresentados na figura 6. Os dados so de duas amostras distintas do rio

Tamanduate.

Figura 61. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Tamanduate, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH.

(a)

(b)

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Tamanduate

pH inicial

pH cido

pH bsico

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

0

Ex

trao

A1

70

Aera

o

Hex

an

o

DC

M/H

ex

an

o

Meta

no

l/D

CM

Meta

no

l0

5

10

15

20

25

30

35

40

CE

20

(%

)

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Tamanduate

pH cido

pH inicial

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

0

Ex

trao

A1

70

Aera

o

Hex

an

o

DC

M/H

ex

an

o

Meta

no

l/D

CM

Meta

no

l0

10

20

30

40

50

CE

20

(%

)

142

Na tabela 22 esto organizados os resultados para o valor de toxicidade dos eluatos do Rio

Tiet.

Tabela 22. Resultados de CE20 (%) em 15 minutos de exposio para o rio Tiet o valor do intervalo

de confiana (IC) e o efeito em porcentagem na concentrao mxima de 81,9%.

Tipo de Coluna

usada Solvente pH CE20 IC (%)

Efeito na concentrao

mxima de 81,9%

C18 Hexano Inicial - - 0,8653%

C18 DCM/Hexano Inicial 39,77% 36,42-43,42 42,45%

C18 Metanol/DCM Inicial 21,43% 17,29-26,57 46,00%

C18 Hexano Inicial - - -12,40%

C18 DCM/Hexano Inicial 68,88% 27,99-169,5 27,50%

C18 Metanol/DCM Inicial - - 10,49%

HLB Metanol Bsico 10,97% 9,757-12,34 61,11%

HLB Metanol/Ac. Frmico Bsico - - 26,50%

HLB Metanol cido 40,82% 24,9-66,92 33,76%

HLB Metanol cido - - 5,824% (DCM) diclorometano; (-) no foi possvel calcular a CE20 devido toxicidade baixa do composto.

A frao polar e com polaridade intermediria foram as que apresentaram maior

toxicidade para o rio Tiet em pH inicial. Nas faixas de pH restantes a frao em metanol

apresentou maior toxicidade. Como mencionado anteriormente, estas fraes, principalmente

a diclorometano/hexano, podem indicar a presena de tensoativos polietoxilados

funcionalizados com lcoois ou fenois. Para uma melhor elucidao e identificao dos

compostos txicos do analito necessrio realizar anlises qumicas, porm o mtodo aqui

empregado indica a classe de compostos que estes agentes txicos pertencem e desta forma

pode-se sugerir a melhor instrumentao analtica para se determinar o composto com

preciso. Por se tratar de compostos com uma grande cadeia hidrofbica indicam-se anlises

mais robustas como espectrmetros de massas do tipo in tandem acoplados cromatografia

lquida de alta eficincia.

Os dados de unidade txica para as fraes recolhidas na extrao em fase slida esto

apresentados na figura 62.

143

Figura 62. Resultados mdios expressos em termos de unidade txica (UT20) em 15

minutos de exposio. Somente as manipulaes que reduziram a toxicidade da amostra do

rio Tiet foram colocadas.

Os resultados apresentados na figura acima indicam que toda a toxicidade do rio Tiet est

nas fraes obtidas, ou seja, o somatrio das unidades txicas corresponde toxicidade inicial

da amostra sem sofrer nenhuma manipulao e este comportamento visto independente do

pH. Nesta figura pode-se ver a contribuio da filtrao na toxicidade que corresponde a

quase 50% do total para o rio Tiet. Os resultados apresentados das manipulaes realizadas

neste trabalho foram reunidos em duas, figuras 63, que resumem os resultados obtidos para o

rio Tiet.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

pH neutro Toxicidade

Inicial

pH cido Toxicidade

Inicial

pH bsico Toxicidade

Inicial

UT

20

(%)

Filtrao Toxicidade Inicial DCM/Hexano Metanol

144

Figura 63. Resumo com os valores de CE20 em porcentagem de todas as manipulaes realizadas na

amostra do rio Tiet, filtrao aerao, extrao em fase slida, eluatos nas trs faixas de pH.

(a)

(b)

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Tiet

pH inicial

pH cido

pH bsico

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

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Ex

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Aera

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Meta

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CM

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no

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Meta

no

l/A

c.F

rm

ico

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CE

20

(%

)

Resumo de todas as manipulaes realizadas no rio Tiet

pH cido

pH inicial

Inic

ial

Fil

trao

Ex

trao

A8

0

Ex

trao

A1

70

Aera

o

Hex

an

o

DC

M/H

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an

o

Meta

no

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CM

Meta

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l0

10

20

30

40

50

60

70

80

CE

20

(%

)

145

6 CONCLUSES

A avaliao e identificao da toxicidade so mtodos que preconizam o fracionamento da

amostra, valendo-se das propriedades fsico-qumicas do analito para identifica-lo. Rios como

o Tiet, Tamanduate e Pinheiros tiveram sua importncia histrica, mas atualmente sofrem

com os efeitos da poluio causados pelo desenvolvimento industrial e com o aumento da

densidade demogrfica. Mesmo com polticas pblicas e fiscalizao o efeito da poluio

ainda visvel na cidade de So Paulo, com elevados ndices de toxicidade. Neste contexto

faz se necessrio entender o tipo de poluio destes rios e assim criar mtodos mais eficazes

de anlise qumica, bem como, polticas pblicas para o lanamento de esgoto domstico e

efluente industriais de forma a coibir a poluio em todo o estado de So Paulo.

Neste trabalho verificou-se que a toxicidade destes rios, detectadas pela Aliivibrio

fischeri, originria de uma mistura de compostos, dentre eles destacam-se os

compostos orgnicos, apolares e volteis, tensoativos no inicos e os materiais

suspensos na amostra.

A manipulao com EDTA no teve efeito sobre a toxicidade das amostras, entretanto

observou-se uma pequena diminuio da toxicidade ao se empregar tiossulfato de

sdio, que um agente redutor e reage principalmente com halognios e outros metais.

A filtrao a vcuo tambm reduziu a toxidade da amostra, e a mudana no pH no

afetou o desempenho, em termos de toxicidade. O rio Tamanduate por sua vez teve

um comportamento diferente dos demais na filtrao, apenas a filtrao em pH cido

reduziu a toxicidade, nas demais faixas de pH a reduo da toxicidade no foi

estatisticamente significativa. A reduo da toxicidade atribuda pela filtrao

oriunda das partculas suspensas na amostra que so materiais de origem incerta, j

que os rios estudados so muito impactados pelo lanamento de esgoto e da prpria

poluio atmosfrica.

Os compostos orgnicos apolares foram identificados pela extrao em fase slida que

foi a nica das manipulaes capaz de reduzir totalmente a toxicidade das amostras.

Utilizou-se dois tipos de cartuchos, Oasis HLB e C18, que possuem caractersticas

distintas polar e apolar.

A aerao indicou a presena de compostos orgnicos volteis pela diminuio da

toxicidade. Testes toxicolgicos no metanol de lavagem confirmaram os tensoativos

146

como uma das classes de compostos txicos presentes nos rios Tiet, Pinheiros e

Tamanduate.

A eluio dos cartuchos C18 e HLB e a toxicidade das fraes podem informar

algumas caractersticas qumicas dos compostos txicos presentes, principalmente dos

cartuchos C18, onde foi realizado um fracionamento mais detalhado. As fraes em

hexano e diclorometano/hexano foram as que apresentaram maior toxicidade com

relao ao soluto solubilizado, logo espera-se que nestas fraes estejam compostos

mais apolares. O mtodo usado na eluio dos cartuchos utilizado na extrao de

tensoativos e nesta faixa de polaridade os tensoativos no inicos so mais detectados,

entretanto para identificar e confirmar os compostos mais precisamente, testes

qumicos devem ser realizados associados com os testes toxicolgicos.

A somatria da toxicidade dos eluatos e da CE20 obtida da filtrao muito prxima

da toxicidade inicial do rio sem manipulao, porm em pH inicial, o rio Pinheiros, e

em pH alcalino, o rio Tamanduate, o modelo aditivo no mostrou ser o mais indicado.

Fica como sugesto, modelos de interao entre os agentes txicos como antagonismo,

ou sinergismo.

O mtodo para avaliao e identificao da toxicidade da amostra proposto pela

USEPA em 1991 ainda mostrou ser relevante. As alteraes na metodologia feitas

para adequar ao organismo-teste, Aliivibrio fischeri, no comprometeram os

resultados. A modernizao das metodologias ainda se faz necessria principalmente

nas manipulaes relacionadas a determinar a presena de metais. Atualmente h uma

infinidade de materiais capazes de remover metais de diversos grupos, bem como para

o tiossulfato de sdio, a eletroqumica avanou muito e possvel determinar espcies

com atividade redox mais facilmente e com mais preciso.

A metodologia de extrao em fase slida proposta neste trabalho mostrou a

capacidade de remoo total da toxicidade de rios muito impactados do Estado de So

Paulo para o organismo-teste estudado e isto reflete diretamente no tipo de poluio

presente.

147

7 RECOMENDAES

Em funo dos resultados obtidos, cabe agora o melhor entendimento da dinmica dos

compostos orgnicos apolares e volteis nos rios estudados para assim, dar incio a uma

evoluo na diminuio da toxicidade, visando a recuperao da integridade destes corpos

hdricos. Alm disso, deve-se estimular um tratamento de esgoto domstico mais eficiente que

seja capaz de remover um nmero maior de substncias, em especial os tensoativos, e a

conscientizao por meio da educao ambiental da populao com relao ao uso de

produtos biodegradveis. Cabe a todos os setores da sociedade e aos polticos concentrarem

esforos em aes que visem a despoluio dos rios, pois o benefcio que estes podem trazer

para a cidade justificar todo o esforo despendido.

148

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ANEXOS

ANEXO A - Tabelas

Tabela 23. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Tiet.

Descrio do parmetro Und. 13/01 09/03 10/05 20/07 29/09 24/11

Chuvas nas ltimas 24

h - Sim Sim Sim No No Sim

Colorao - Marrom Marrom Preta Preta Preta Cinza

Condutividade S cm-1 452 412 891 691 869 611

Oxignio Dissolvido mg L-1 1,63 0,94 0,39 0,81 0,44 0,71

pH - 7,05 6,92 7,15 6,96 7,25 7,22

Temperatura da gua C 24,62 24,51 22,13 16,97 22,7 23,52

Temperatura do Ar C 25 24,6 20,4 14 24,3 23,1

Vazo m3 s-1

81,786

24,818 21,626

Tipo de Parmetros: Compostos Orgnicos Volteis (COVs)

Descrio do Parmetro Und. 13/01 09/03 10/05 20/07 29/09 24/11

Benzeno g L-1 < 2,5

< 2,5 < 2,5

< 2,5

Estireno g L-1 < 5

< 5 < 5

< 5

Etilbenzeno g L-1 < 2,5

< 2,5 < 2,5

< 2,5

m,p,-Xileno g L-1 < 5

< 5 < 5

< 5

o-Xileno g L-1 < 2,5

< 2,5 < 2,5

< 2,5

Tolueno g L-1 < 2

41,6 8,44

21,6

Tipo de Parmetro: Ecotoxicolgicos

Descrio do Parmetro Und. 13/01 09/03 10/05 20/07 29/09 24/11

Ens. Ecotoxic. c/ A.

fischeri CE20(%) 30,1 > 81,9 8,3 10,9 16,8 > 81,9

Tipo de Parmetros: Fsicos e Qumicos

Descrio do Parmetro Und. 13/01 09/03 10/05 20/07 29/09 24/11

Alumnio Dissolvido mg L-1 0,16 0,11 0,3 < 0,1 0,13 < 0,1

Alumnio Total mg L-1 1,51 1,1 1,3 2,23 1,2 1,25

Arsnio Total mg L-1 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Brio Total mg L-1 0,06 0,05 0,06 0,07 0,06 0,06

Cdmio Total mg L-1 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007

Carbono Orgnico

Total mg L-1 10,1 13,6 27,8 27,2 33,9 28,9

Chumbo Total mg L-1 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009

Cloreto Total mg L-1 34,6 36,2 101 89,5 102 57,4

Cobre Dissolvido mg L-1 < 0,009 < 0,009 0,01 0,02 0,02 < 0,009

Cobre Total mg L-1 0,02 < 0,01 0,04 0,11 0,07 0,04

Cromo Total mg L-1 < 0,02 < 0,02 0,04 0,06 0,08 < 0,02

Continuao da pgina anterior

159

DBO (5, 20) mg L-1 17 16 83 < 3 71 56

Fenois Totais mg L-1 < 0,003 0,006 0,04 0,04 0,04 < 0,003

Ferro Dissolvido mg L-1 0,43 0,39 0,64 0,82 0,55 0,98

Ferro Total mg L-1 1,81 1,56 2,21 2,66 1,58 2,27

Fsforo Total mg L-1 0,4 0,49 2,54 2,43 2,55 1,32

Mangans Total mg L-1 0,21 0,18 0,2 0,19 0,18 0,21

Mercrio Total mg L-1 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002

Nquel Total mg L-1 0,02 0,05 0,05 0,04 0,05 0,09

Nitrognio Amoniacal mg L-1 5,8 5,22 23,6 20,3 23,2 13,6

Nitrognio Kjeldahl mg L-1 7,01 6,78 31,3 25,2 27,2 15,7

Nitrognio-Nitrato mg L-1 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2

Nitrognio-Nitrito mg L-1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1

leos e Graxas mg L-1 < 10 < 10 < 10 11 < 10 < 10

Potssio mg L-1 9,23 10 20,9 18,3 18 13,2

Sdio mg L-1 36,3 39,6 108 83,9 99 61,4

Sdio Dissolvido Total mg L-1 184 228 420 364 458 344

Sdio Total mg L-1 240 228 480 470 518 368

Subst. Tensoat. Reagem

c/ Azul Metileno mg L-1 1,19 1,34 5,28 4,74 4,81 2,84

Turbidez UNT 15,5 75,4 46,9 66,5 50 41,8

Zinco Total mg L-1 0,04 0,05 0,15 0,27 0,22 0,41

Fonte: (CETESB, 2016)

Tabela 24. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Tamanduate

Descrio do parmetro Und. 20/01 03/03 18/05 28/07 21/09 09/11

Chuvas nas ltimas 24 h - No Sim Sim No Sim No

Colorao - Cinza Marrom Cinza Cinza Cinza Cinza

Condutividade S cm-1 634 468 660 654 610,6 685,4

Oxignio Dissolvido mg L-1 < 0,21 0,59 1,03 < 0,21 0,43 0,27

pH - 7,35 7,31 7,47 7,6 7,5 7,52

Temperatura da gua C 22,7 23,68 20,76 20,5 19,4 23,69

Temperatura do Ar C 21 23,9 17,2 17 22 22,3

Tipo de Parmetros: Compostos Orgnicos Volteis (COVs)

Descrio do Parmetro Und. 20/01 03/03 18/05 28/07 21/09 09/11

Benzeno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

Estireno g L-1 < 5 < 5 < 5 < 5

Etilbenzeno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

m,p,-Xileno g L-1 < 5 < 5 < 5 < 5

o-Xileno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

Continua na pgina seguinte

Continuao da pgina anterior

Continuao da pgina anterior

160

Tolueno g L-1 5,93 4,3 9,25 8,38

Tipo de Parmetro: Ecotoxicolgicos

Descrio do Parmetro Und. 20/01 03/03 18/05 28/07 21/09 09/11

Ens. Ecotoxic. c/ A. fischeri CE20(%) 12,6 > 81,9 15,8 3,02 61,9 31,5

Tipo de Parmetros: Fsicos e Qumicos

Descrio do Parmetro Und. 20/01 03/03 18/05 28/07 21/09 09/11

Alumnio Dissolvido mg L-1 < 0,1 < 0,1 0,2 0,28 < 0,1 0,12

Alumnio Total mg L-1 1,21 4,01 2,32 5,59 0,85 2,22

Arsnio Total mg L-1 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Brio Total mg L-1 0,07 0,08 0,06 0,07 0,05 0,07

Cdmio Total mg L-1 < 0,0007 0,0009 0,0008 < 0,0007 < 0,0007 0,001

Carbono Organico Total mg L-1 30,9 16,3 25,8 40,8 29,8 43,8

Chumbo Total mg L-1 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009

Cloreto Total mg L-1 64,1 40,6 67,9 61,8 79,5 74,4

Cobre Dissolvido mg L-1 0,03 < 0,009 0,03 0,02 0,03 0,03

Cobre Total mg L-1 0,1 0,04 0,09 0,08 0,1 0,07

Cromo Total mg L-1 0,02 0,04 0,03 0,05 0,03 0,04

DBO (5, 20) mg L-1 89 39 84 < 3 102 98

Fenois Totais mg L-1 0,05 0,006 0,01 0,05 0,01 0,02

Ferro Dissolvido mg L-1 0,56 0,2 0,45 0,36 0,43 0,51

Ferro Total mg L-1 2,15 4,43 2,13 2,22 2,16 2,03

Fsforo Total mg L-1 2,68 1,83 2,36 4,18 2,92 2,72

Mangans Total mg L-1 0,25 0,22 0,22 0,11 0,17 0,17

Mercrio Total mg L-1 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002

Nquel Total mg L-1 0,05 0,03 0,06 0,06 0,07 0,07

Nitrognio Amoniacal mg L-1 18,9 9,6 17,5 24,5 20 19,3

Nitrognio Kjeldahl mg L-1 25,6 13,1 25,6 35,1 25 23,3

Nitrognio-Nitrato mg L-1 < 0,2 0,53 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2

Nitrognio-Nitrito mg L-1 < 0,1 0,5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1

leos e Graxas mg L-1 15 < 10 15 22 < 10 < 10

Potssio mg L-1 13,5 12,4 16,9 13,4 14,2 14,2

Sdio mg L-1 62,7 49,2 54,8 66,9 66 73,4

Slido Dissolvido Total mg L-1 392 262 310 330 344 382

Slido Total mg L-1 434 308 384 440 402 466

Subst. Tensoat. Reagem c/

Azul Metileno mg L-1 4,68 1,74 4,75 6,2 4,1 5,41

Turbidez UNT 9,1 78,5 59,5 221 23 68,3

Zinco Total mg L-1 0,24 0,17 0,28 0,25 0,46 0,63

Fonte: (CETESB, 2016)

Continuao da pgina anterior

161

Tabela 25. Parmetros fsico-qumicos de campo, compostos orgnicos volteis, ecotoxicolgicos e

qumicos referente ao ano de 2016 do rio Pinheiros

Descrio do parmetro Und. 28/01 30/03 19/05 13/07 14/09 29/11

Chuvas nas ltimas 24 h - Sim No Sim No No Sim

Colorao - Marrom Preta Preta Preta Preta Cinza

Condutividade S cm-1 291 507 438 567 626 198

Oxignio Dissolvido mg L-1 1,84 0,56 0,66 0,31 0,24 0,7

pH - 6,93 7,15 7,06 7 6,66 7,09

Temperatura da gua C 24,07 26,6 19,4 20,15 22,7 23,23

Temperatura do Ar C 24,5 26,1 15,8 20,6 23,8 22,6

Tipo de Parmetros: Compostos Orgnicos Volteis (COVs)

Descrio do Parmetro Und. 28/01 30/03 19/05 13/07 14/09 29/11

Benzeno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

Estireno g L-1 < 5 < 5 < 5 < 5

Etilbenzeno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

m,p,-Xileno g L-1 < 5 9,11 < 5 < 5

o-Xileno g L-1 < 2,5 < 2,5 < 2,5 < 2,5

Tolueno g L-1 4,18 87,8 86,6 < 2

Tipo de Parmetro: Ecotoxicolgicos

Descrio do Parmetro Und. 28/01 30/03 19/05 13/07 14/09 29/11

Ens. Ecotoxic. c/ A. fischeri CE20(%) > 81,9 18,9 12 3,71 6,89 > 81,9

Tipo de Parmetros: Fsicos e Qumicos

Descrio do Parmetro Und. 28/01 30/03 19/05 13/07 14/09 29/11

Alumnio Dissolvido mg L-1 0,5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 0,2

Alumnio Total mg L-1 10,8 0,74 1,05 0,36 0,33 1,86

Arsnio Total mg L-1 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Brio Total mg L-1 0,07 0,07 0,06 0,07 0,06 0,03

Cdmio Total mg L-1 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007 < 0,0007

Carbono Organico Total mg L-1 13,7 29,2 25,3 33,4 73,2 12,6

Chumbo Total mg L-1 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009 < 0,009

Cloreto Total mg L-1 18,7 38,5 32,6 42,9 48,2 14,2

Cobre Dissolvido mg L-1 < 0,009 < 0,009 0,01 0,02 < 0,009 < 0,009

Cobre Total mg L-1 0,04 0,02 0,03 0,05 0,02 0,02

Cromo Total mg L-1 0,03 < 0,02 0,03 < 0,02 < 0,02 < 0,02

DBO (5, 20) mg L-1 30 78 54 79 60 18

Fenois Totais mg L-1 0,003 0,03 0,01 0,03 0,04 < 0,003

Ferro Dissolvido mg L-1 0,85 0,94 0,32 0,38 0,32 0,52

Ferro Total mg L-1 5,88 2,09 1,93 2,64 2,8 0,54

Fsforo Total mg L-1 1,05 2,73 1,93 2,64 2,8 0,54

Mangans Total mg L-1 0,16 0,2 0,18 0,17 0,17 0,09

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162

Mercrio Total mg L-1 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002 < 0,0002

Nquel Total mg L-1 < 0,02 < 0,02 < 0,02 0,03 < 0,02 < 0,02

Nitrognio Amoniacal mg L-1 7,35 17,8 15,1 18,8 25,6 4,21

Nitrognio Kjeldahl mg L-1 9,13 22,4 21,9 29,4 29,3 5,48

Nitrognio-Nitrato mg L-1 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2 < 0,2

Nitrognio-Nitrito mg L-1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1

leos e Graxas mg L-1 < 10 16 < 10 11 < 10 < 10

Potssio mg L-1 7,41 11,2 10,4 12 11,9 4,47

Sdio mg L-1 19,6 41,5 34,3 45,2 44,5 14,3

Slido Dissolvido Total mg L-1 146 256 246 278 338 136

Slido Total mg L-1 200 314 334 296 344 158

Subst. Tensoat. Reagem c/

Azul Metileno mg L-1 2,33 5,21 4,06 6,06 5,93 1,78

Turbidez UNT 62,9 37,2 72 10,2 37 38,2

Zinco Total mg L-1 0,04 0,03 0,06 0,03 0,03 0,07

Fonte: (CETESB, 2016)

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163

ANEXO B - Link para o curriculo lattes.

http://lattes.cnpq.br/4295215790828589

http://lattes.cnpq.br/4295215790828589

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ANEXO B - Ficha do aluno.

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