Avaliação e identificação da toxicidade aguda com bactéria ... ?· investigação da toxicidade…

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<p>UNIVERSIDADE DE SO PAULO </p> <p>Faculdade de Cincias Farmacuticas </p> <p>Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas </p> <p>Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri </p> <p>nas guas superficiais da cidade de So Paulo </p> <p>BRUNO DE SOUZA </p> <p>Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre </p> <p>Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth Souza </p> <p>Nascimento </p> <p>So Paulo </p> <p>2018</p> <p>22 </p> <p>UNIVERSIDADE DE SO PAULO </p> <p>Faculdade de Cincias Farmacuticas </p> <p>Programa de Ps-Graduao em Toxicologia e Anlises Toxicolgicas </p> <p>Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri </p> <p>nas guas superficiais da cidade de So Paulo </p> <p>BRUNO DE SOUZA </p> <p>Verso corrigida da Dissertao conforme resoluo CoPGr 6018 </p> <p>Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre </p> <p>Orientadora: Profa. Dra. Elizabeth Souza </p> <p>Nascimento </p> <p>So Paulo </p> <p>2018 </p> <p>23 </p> <p>24 </p> <p>BRUNO DE SOUZA </p> <p>Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri nas guas </p> <p>superficiais da cidade de So Paulo </p> <p>Comisso Julgadora da Dissertao para obteno do Ttulo de Mestre </p> <p>Profa. Dra. Elizabeth Souza Nascimento </p> <p>Orientadora/presidente </p> <p>So Paulo, 18 de maio de 2018 </p> <p>Rbia Kuno </p> <p>1o. examinador </p> <p>Fbio Kummrow </p> <p>2o. examinador </p> <p>Fabiane Drr </p> <p>3o. examinador </p> <p>25 </p> <p>SOUZA, B. Avaliao e identificao da toxicidade aguda com bactria Aliivibrio fischeri </p> <p>nas guas superficiais da cidade de So Paulo. 2018. 143 f. Dissertao (Mestrado em </p> <p>Toxicologia e Anlise Toxicolgica) - Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de </p> <p>So Paulo, So Paulo, 2018. </p> <p>RESUMO </p> <p>A poluio dos rios brasileiros , atualmente, um grande problema para as autoridades </p> <p>governamentais j que a demanda dos recursos hdricos vem crescendo nos ltimos anos. Os </p> <p>rios Tiet, Pinheiros e Tamanduate foram de grande importncia para a cidade de So Paulo </p> <p>em seu perodo de industrializao, contudo o prprio desenvolvimento industrial impactou </p> <p>permanentemente os mesmos. Preocupados com a sade ambiental, rgos fiscalizadores </p> <p>estaduais iniciaram forte fiscalizao para coibir e responsabilizar os principais culpados. Esta </p> <p>poltica pblica resultou em uma diminuio das concentraes de poluentes orgnicos e </p> <p>inorgnicos, porm muito pouco foi efetivamente feito com relao ao esgoto domstico, e, </p> <p>como consequncia, a toxicidade das guas dos rios permanece elevada. Os estudos de </p> <p>Avaliao e identificao da toxicidade englobam diversas metodologias reunidas em trs </p> <p>documentos pela USEPA - Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos, onde mtodo </p> <p>fsico-qumico e testes toxicolgicos so usados para identificar substncias txicas, ou grupo </p> <p>de substncias txicas que contribuem efetivamente para a toxicidade total de uma amostra. A </p> <p>abordagem rotineiramente utilizada baseia-se no fracionamento da amostra de acordo com </p> <p>suas propriedades fsico-qumicas: volatilidade, solubilidade e capacidade de formar </p> <p>complexos, ou de ser reduzida, oxidada, ionizada, entre outras. Em conjunto com os ensaios </p> <p>qumicos, os ensaios toxicolgicos, em especial o Sistema Microtox, contribuem na </p> <p>investigao da toxicidade para os rios metropolitanos Tiet, Pinheiros e Tamanduate, que se </p> <p>mostrou eficaz na determinao dos grupos de compostos, sendo os compostos orgnicos </p> <p>apolares, orgnicos volteis, tensoativos e as partculas, as principais fontes da toxicidade para </p> <p>esses rios. Embora muitas informaes sobre a toxicidade tenham sido descobertas, a </p> <p>identificao dos compostos s pode ser realizada por anlises qumicas mais robustas uma </p> <p>vez que um grande nmero de substncias, metablitos e subprodutos de degradao so </p> <p>facilmente encontrados neste tipo de amostra. Mesmo sofrendo algumas modificaes, deve-</p> <p>se incentivar o uso desta metodologia para outros rios a fim de determinar os principais </p> <p>toxicantes responsveis pela toxicidade. </p> <p>Palavra-chave: fracionamento qumico, toxicidade, Sistema Microtox, Vibrio fischeri, </p> <p>tensoativos. </p> <p>26 </p> <p>SOUZA, B. Evaluation and identification of acute toxicity with bacteria Aliivibrio </p> <p>fischeri in surface waters of the city of So Paulo 2018. 143 f. Dissertao (Mestrado em </p> <p>Toxicologia e Anlise Toxicolgica) - Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de </p> <p>So Paulo, So Paulo, 2018. </p> <p>ABSTRACT </p> <p>Pollution of Brazilian rivers is currently a major problem for government authorities as </p> <p>demand for water resources has been increasing in recent years. Tiet, Pinheiros and </p> <p>Tamanduate rivers were of great importance for the city of So Paulo during its </p> <p>industrialization period, however, the industrial development itself permanently impacted </p> <p>them. Concerned about environmental health, state supervisory bodies have begun strong </p> <p>enforcement to curb and hold the main culprits accountable. This public policy has resulted in </p> <p>a decrease in concentrations of organic and inorganic chemicals, but very little has been done </p> <p>in relation to domestic sewage, and as a consequence, the toxicity of the rivers remains high. </p> <p>The Toxicology Assessment and Identification studies encompass various methodologies </p> <p>gathered in three documents by the USEPA, where physico-chemical method and </p> <p>toxicological tests are used to identify toxic substances, or group of toxic substances that </p> <p>effectively contribute to the total toxicity of a sample. The routinely used approach is based </p> <p>on fractionation of the sample according to its physicochemical properties: volatility, </p> <p>solubility and chemical properties such as the ability to form complexes, or to be reduced, </p> <p>oxidized, ionized, among others. In conjunction with the chemical tests, the toxicological tests </p> <p>in particular the Microtox System contribute to the investigation of the toxicity to the </p> <p>metropolitan rivers, Tiet, Pinheiros and Tamanduate, which proved to be effective in the </p> <p>determination of the groups of compounds, the organic compounds being apolar, organic </p> <p>volatiles, surfactants and particulates, the main sources of toxicity for the studied rivers. </p> <p>Although much information on toxicity has been discovered, the identification of compounds </p> <p>can only be performed by more robust chemical analyzes since a large number of substances, </p> <p>metabolites, degradation byproducts are readily found in this type of sample. Even with some </p> <p>modifications, it is necessary to encourage the use of this methodology for other rivers in </p> <p>order to determine the main xenobiotics responsible for toxicity. </p> <p>Key words: chemical fractionation, toxicity, Microtox System, Vibrio fischeri,surfactants. </p> <p>27 </p> <p>Aos meus avs, </p> <p>Valdenice e Vivaldo. </p> <p>E in memorian, Vitor Martins e </p> <p>Teresa Maria de Jesus, que sempre </p> <p>estiveram presentes na minha vida, </p> <p>sentirei muito a sua falta. </p> <p>28 </p> <p>AGRADECIMENTOS </p> <p>Agradeo ao Dr. Gilson Alves Quinglia pela confiana e amizade. Muito obrigado por </p> <p>todos os ensinamentos e acima de tudo pela oportunidade de desenvolver esse projeto, uma </p> <p>experincia nica na minha vida. </p> <p> Prof. Dra. Elizabeth Nascimento, querida orientadora. Muito obrigado pela confiana, </p> <p>ensinamentos, pacincia. Uma tima pessoa, orientadora, professora, muito orgulho de ser seu </p> <p>orientado. </p> <p>Aos funcionrios da CETESB que me ajudaram nesta jornada. Em especial, Wlace </p> <p>Soares, Ivo de Freitas no qual devo muito. Ao Jos Francisco Viana, que dividiu </p> <p>pacientemente o Microtox comigo, meu muito obrigado. Meu muito obrigado, tambm, ao </p> <p>Genival e Coimbro pela amizade. Dani que sempre esteve a disposio para me ajudar e </p> <p>pela amizade. Barbara que considero muito, meu muito obrigado. Levarei a amizade de </p> <p>todos do ELTA para sempre comigo. </p> <p>s ps-graduandas da rea, Gisela Martini e Suellen Coutinho, obrigado pela amizade, </p> <p>por me aturar nos momentos difceis. Lembrarei com carinho dos perrengues que passamos </p> <p>juntos, dessa vida de ps-graduando. </p> <p>Agradeo ao setor de coleta e amostragem da CETESB e a todo da CETESB, em geral, </p> <p>pelo apoio, cedendo toda a infraestrutura e recursos, em especial a Sandra do Setor de </p> <p>Ecotoxicologia Aqutica. </p> <p> minha famlia, minha me Selma, meu paiSrgio, e minha irm Jssica que do todo </p> <p>apoio para mim, apoio esse que muito importante para seguir em frente e buscar meus </p> <p>sonhos. s meus tios e tias com muito carinho, meus muito obrigado. </p> <p>Aos meus amigos, Raphael, Rubens, Natlia e Vinicius. </p> <p>Aos colegas da Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP, Aline, Laura. E Samantha </p> <p>pela ajuda na burocracia. Meu agradecimento aos professores da ps-graduaopelos </p> <p>ensinamentos. </p> <p> CNPq e CAPES pela bolsa concedida. </p> <p>s pessoas que contriburam de alguma forma para esse trabalho... </p> <p>...MUITO OBRIGADO </p> <p>29 </p> <p>LISTA DE ILUSTRAES </p> <p>Figura 1. Imagem da poluio do rio Tiet na regio de Pirapora do Bom Jesus, causada </p> <p>principalmente pelo excesso de esgoto no tratado. .............................................................................. 47 </p> <p>Figura 2: Classificao das UGRHIs de acordo com suas vocaes. (1) UGRHI Mantiqueira, (2) </p> <p>UGRHI Paraba do Sul, (3) UGRHI Litoral Norte, (4) UGRHI Pardo, (5) UGRHI Piracicaba, Capivari </p> <p>e Jundia, (6) UGRHI Alto Tiet, (7) UGRHI Baixada Santista, (8) UGRHI Sapuca/Grande, (9) </p> <p>UGRHI Mogi-Guau, (10) UGRHI Sorocaba/Mdio Tiet, (11) UGRHI Ribeira de Iguape/Litoral Sul, </p> <p>(12) UGRHI Baixo Pardo/Grande, (13) UGRHI Tiet/Jacar, (14) UGRHI Alto Paranapanema, (15) </p> <p>UGRHI Turvo/Grande, (16) UGRHI Tiet/Batalha, (17) UGRHI Mdio Paranapanema, (18) UGRHI </p> <p>So Jos dos Dourados, (19) UGRHI Baixo Tiet, (20) UGRHI Aguape, (21) UGRHI Peixe, (22) </p> <p>UGRHI Pontal do Paranapanema. ......................................................................................................... 49 </p> <p>Figura 3. Consumo de gua na URGHI 6 - Alto Tiet, comparando as porcentagens de vazo de gua </p> <p>utilizadas em cada setor......................................................................................................................... 50 </p> <p>Figura 4. Mapa da UGRHI 6, alto Tiet contendo todos os pontos de coleta nesta regio. .................. 52 </p> <p>Figura 5. (a) Foto da nascente do rio Tiet; (b) rio Tiet na regio de Salto/SP; (c) Imagens do rio </p> <p>Tiet em Pereira Barreto/SP; (d) rio Tiet em So Paulo. ..................................................................... 53 </p> <p>Figura 6. Trajetria do rio Tiet pelo Estado de So Paulo. ................................................................. 54 </p> <p>Figura 7. Fotos da foz do rio Pinheiros (a) em 1929 (b) em 2015. ....................................................... 56 </p> <p>Figura 8. Localizao da Bacia Hidrogrfica do Tamanduate. ............................................................ 57 </p> <p>Figura 9. Bactria luminescente Aliivibrio fischeri, organismo-teste. .................................................. 60 </p> <p>Figura 10. Mononucleotdeo de flavina ou FMN(uma flavina que funciona como grupo prosttico em </p> <p>diversas reaes de oxirreduo em bioqumica). Sua forma oxidada FMN e sua forma reduzida </p> <p>FMNH2. ................................................................................................................................................. 61 </p> <p>30 </p> <p>Figura 11. Imagem tpico de porcentagem de efeito por concentrao do Microtox, em escala </p> <p>logartmica. ............................................................................................................................................ 63 </p> <p>Figura 12. Imagem do fator Gamma por concentrao para determinao da CE50 e CE20. ................. 64 </p> <p>Figura 13. Equipamento para realizar os testes de toxicidade............................................................... 65 </p> <p>Figura 14. Fluxograma para a Fase 1 do TIE. ....................................................................................... 67 </p> <p>Figura 15. Ilustrao das etapas que compem a extrao em fase slida, que compreendem: </p> <p>condicionamento, adio da amostra, lavagem para remoo de interferentes e eluio dos analitos de </p> <p>interesse. ................................................................................................................................................ 73 </p> <p>Figura 16. Estruturas qumicas da resina de preenchimento do cartucho de SPE. MCX (cartuchos </p> <p>misto de troca inica de fase reversa) HLB (cartuchos de equilbrio hidroflico-lipoflico de fase </p> <p>reversa) e MAX (cartuchos mistos de troca aninica de fase reversa) .................................................. 74 </p> <p>Figura 17. Regio de interface de uma partcula de slica funcionalizada com uma cadeia de octadecil </p> <p>(18 carbonos), uma estrutura extremamente apolar. ............................................................................. 75 </p> <p>Figura 18. Concentrador de amostras utilizado na evaporao de solventes. ....................................... 80 </p> <p>Figura 19. Sistema montado para extrao em fase slida (SPE). ........................................................ 81 </p> <p>Figura 20. Sistema montado para aerao da amostra, que consiste na ligao de 7 divisores de ar, </p> <p>ligados entre si. Uma mangueira adaptada com um filtro ligada diretamente linha de ar comprimido </p> <p>e em cada sada do divisor conectado uma mangueira que por sua vez colocada na amostra. ........ 82 </p> <p>Figura 21. Sistema de filtrao a vcuo utilizado para filtrar a amostra dos rios Tiet, Pinheiros e </p> <p>Tamanduate. ......................................................................................................................................... 87 </p> <p>Figura 22. Esquema de eluio utilizando 10 mL de metanol aps a eluio da amostra em pH cido.</p> <p> ............................................................................................................................................................... 88 </p> <p>Figura 23. Ilustrao da etapa de eluio dos composto retidos na coluna HLB. ................................. 89 </p> <p>31 </p> <p>Figura 24. Esquema das misturas de solvente utilizadas para a eluio dos compostos retidos na coluna </p> <p>C18, onde a frao A composta por 10 mL de hexano, a frao B composta por 10 mL de </p> <p>diclorometano/hexano na proporo de 4:1 (v v-1) e a frao C corresponde a uma mistura de </p> <p>metanol/diclorometano (DCM) na proporo de 9:1 (v v-1). ................................................................ 90 </p> <p>Figura 25. Fluxograma da execuo do condicionamento da coluna SPE, C18 e HLB e a retirada do </p> <p>branco da coluna.Este procedimento antecede a extrao em fase slida e na etapa 2 o pH da gua ultra </p> <p>purificada o mesmo pH em que se encontra a amostra. ..................................................................... 93 </p> <p>Figura 26. Fluxograma de extrao em fase slida (SPE) e filtrao referente ao branco. A coluna deve </p> <p>ser condicionada conforme indicado a segura anterior. ........................................................................ 94 </p> <p>Figura 27. Fluxogram...</p>