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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DISSERTAÇÃO DE MESTRADO AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE Kalanchoe brasiliensis Cambess JACKELINE GOMES DA SILVA Recife-PE Fevereiro, 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE Kalanchoe brasiliensis Cambess

JACKELINE GOMES DA SILVA

Recife-PE Fevereiro, 2007

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JACKELINE GOMES DA SILVA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE Kalanchoe brasiliensis Cambess

Dissertação apresentadaGraduação em CiêncDepartamento de CiêUniversidade Federal dedos requisitos à obtençãCiências Farmacêuticas. Área de Concentração: Produtos Bioativos e Na

Orientadora: Dr.ª Ivone Antônia de Souza Co-Orientadora: Dr.ª Maria Do Socorro Vieira Per

Recife-PE Fevereiro, 2007

ao Programa de Pós-ias Farmacêuticas, do

ncias Farmacêuticas, da Pernambuco, como parte o do grau de Mestre em

Avaliação e Obtenção de turais

eira

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Silva, Jackeline Gomes da

Avaliação do potencial farmacológico de Kalanchoe brasiliensis Cambess / Jackeline Gomes da Silva. – Recife : O Autor, 2007.

72 folhas : il., tab., fig.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal dePernambuco. CSS. Ciências Farmacêuticas, 2007.

Inclui bibliografia .

1. Farmacologia – Produtos naturais. I. Título.

615 CDU (2.ed.) UFPE 615.1 CDD (22.ed.) CCS2007-19

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊMCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Reitor

AMARO HENRIQUE PESSOA LINS

Vice-Reitor

GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

CELSO PINTO DE MELO

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

JOSÉ THADEU PINHEIRO

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

MÁRCIO ANTÔNIO DE ANDRADE COELHO GUEIROS

Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas

JANE SHEILA HIGINO

Vice-Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas

SAMUEL DANIEL DE SOUZA

Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

PEDRO JOSÉ ROLIM NETO

Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

BEATE SALGESSER SANTOS

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JACKELINE GOMES DA SILVA

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO

DE Kalanchoe brasiliensis Cambess

Recife-PE Fevereiro, 2007

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Dedicatória

Este Trabalho de Dissertação é dedicado única e exclusivamente a meus Pais Pedro Marinho da Silva e Raimunda Gomes da Silva por todo amor me dado sempre e o incentivo contínuo para minha vida profissional

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AGRADECIMENTOS

Durante toda a minha vida, sempre senti um acolhimento de uma força superior para

ultrapassar meus obstáculos. DEUS, força superior, agradeço por mais uma vitória a mim concedida;

Aos meus familiares Pedro, Raimunda, Eliana, Edneide, Adriano, Joale, Joane,

Pedro (sobrinho), Ana Luísa e Davi por todo apoio e compreensão, sendo sempre uma base fiel que me permitiu acreditar que foi válida a minha ausência;

À minha Orientadora Ivone Antônia de Souza pela alegria, otimismo e satisfação

que sempre demonstrou para comigo ao longo desse trabalho, além dos importantes conhecimentos acadêmicos repassados;

A minha Co-orientadora Maria do Socorro Vieira Pereira pelos ensinamentos desde

a graduação, dentre os quais me incentivou a prosseguir na pesquisa ate o mestrado, além de sua alegria e atenção sempre;

A Telton Pedro, amigo e namorado, por compreender a minha ausência acreditando

que a mesma foi para meu engrandecimento profissional. Além de sempre prestativo e presente nos momentos que precisei;

As amigas mais próximas Angélica, Pavla, Camila, Paloma, Jordélia e Luhana por

toda amizade prestada sempre;

Aos amigos do Laboratório de Cancerologia Experimental, Rutinha (Dona Benevolência), Cynthia (Carlinha Rebola), Pavla (Pseudo CNPq), Isla, Bethy, Danielle, Justino, Renato, Sérgio, Tássia, Rômulo, pelos momentos de descontração e de aprendizagem;

A Aldo César, Elis, Laurimar, Wellington Fontes e Alex Benício pela ajuda

prestada sem restrição;

Aos Professores Haroudo Sátiro Xavier, Fálba Bernadete dos Anjos, Rosa Cristina Santiago e Diógenes pela colaboração no desenvolvimento do meu trabalho;

A Aline Lira Xavier, pela realização conjunta do experimento de Citotoxicidade;

A todos do Pensionato do Marquinhos, pelos momentos de diversão e aconchego,

tornando-se uma família temporária;

Ao corpo docente do mestrado em Ciências Farmacêuticas da UFPE, pelos ensinamentos ao longo do curso;

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Ao Agrônomo Fernando Antônio C. Viana, coordenador do Horto Medicinal do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UFPB e ao Técnico de laboratório Raimundo Nonato da Silva do LTF/UFPB;

Ao Professor Drº José Maria Barbosa Filho, por ter concedido a realização da coleta

e preparação do extrato da planta estudada no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica/UFPB;

A Rinalda de Araújo Guerra e Maria da Salete Horácio da Silva que são duas almas

ilumindas por Deus. Agradeço-lhes pelo o incentivo de pesquisa na área da Fitoterapia e pela à atenção sempre prestada quando precisei.

A Iguacy, Fátima, Ana, Jovita, Evany, Karina pela delicadeza de sua atenção, e a

Osman pela sua divertidíssima e sincera amizade;

A turma de pós-graduação do ano de 2005, pelos divertidos momentos no decorrer desses dois anos e aos momentos de seriedade nesta etapa tão importante de nossas vidas;

Enfim, a todos que estiveram presentes em algum momento no decorrer desse

trabalho. AGRADEÇO SINCERAMENTE.

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SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 01

1.1 Plantas Medicinais................................................................................ 02

1.2 Considerações Gerais sobre o processo Cancerígeno............................ 03

1.3 Produtos naturais como Antineoplásicos.............................................. 04

1.4 Toxicidade de Plantas Medicinais......................................................... 05

1.5 Multiresistência Bacteriana.................................................................... 06

2. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................... 08

2.1 Aspectos Botânicos e Etnofarmacologia............................................... 09

2.2 Estudos farmacológicos e Fitoconstituintes.......................................... 12

3. OBJETIVOS........................................................................................ 15

3.1 Geral...................................................................................................... 16

3.2 Específicos............................................................................................. 16

4. ARTIGO I: Avaliação Citotóxica e Toxicológica do Extrato

Hidroetanólico de Kalanchoe brasiliensis Cambess.......................... 17

Resumo.................................................................................................. 18

Abstract................................................................................................. 18

Introdução.............................................................................................. 19

Materiais e Métodos.............................................................................. 20

Resultados............................................................................................. 22

Discussão............................................................................................... 24

Conclusões............................................................................................. 27

Referências Bibliográficas..................................................................... 28

5. ARTIGO II: Potencial Antitumoral de Kalanchoe brasiliensis

Cambess frente às Linhagens de Carcinoma de Ehrlich e

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Sarcoma –180...................................................................................... 35

Resumo................................................................................................... 36

Abstract.................................................................................................. 36

Introdução............................................................................................... 37

Materiais e Métodos............................................................................... 38

Resultados.............................................................................................. 40

Discussão............................................................................................... 41

Conclusões............................................................................................. 43

Referências Bibliográficas..................................................................... 44

6. ARTIGO III: Atividade Inibitória das folhas e caule de Kalanchoe

brasiliensis Cambess em a amostras de diferentes perfis de

resistência à Antibióticos..................................................................... 49

Resumo................................................................................................... 50

Abstract ................................................................................................. 50

Introdução............................................................................................... 51

Materiais e Métodos............................................................................... 52

Resultados............................................................................................... 55

Discussão................................................................................................ 56

Conclusões.............................................................................................. 58

Referências Bibliográficas..................................................................... 58

7. CONCLUSÃO...................................................................................... 64

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 66

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LISTA DE FIGURAS REVISÃO DA LITERATURA Figura 1. Folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess....................................... 11 Figura 2. Inflorescência de Kalanchoe brasiliensis Cambess........................... 11 Figura 3. Flavonóides glicosilados encontrados em Kalanchoe brasiliensis Cambess.............................................................................................. 14 ARTIGO I

Figura 1. Curva dose resposta do ensaio da citotoxicidade in vitro para determinação da CL50 do extrato hidretanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess frente a Artemia salina Leach....... 32 Figura 2. Curva dose/resposta da Toxicidade aguda em camundongos Albinos Siwss por via intraperitoneal do extrato hidroetanólico das folhas Kalanchoe brasiliensis Cambess...................................................... 32 Figura 3. Fotomicrografia em filtro amarelo do rim de camundongo fêmea do grupo controle tratado com solução salina Corpúsculo Renal (1), Túbulo contorcido distal (2), Túbulo contorcido proximal (3). Coloração HE Obj 4x......................................................................... 33 Figura 4. Fotomicrografia em filtro transparente do rim de camundongo fêmea do grupo Tratado com 62,5 mg/kg K. brasiliensis (1) Aparelho Justaglomerular, (2) Túbulo Contorcido distal e proximal edemasiados (2 e 3). Coloração HE Obj.10x................................ 33 Figura 5. Fotomicrografia em filtro amarelo do pulmão de camundongo fêmea do grupo Controle tratado com solução salina (1) Alvéolos. Coloração HE Obj. 4x........................................................................ 34 Figura 6. Fotomicrografia em filtro transparente do pulmão de camundongo fêmea do grupo Tratado com 62,5 mg/kg K. brasiliensis (1) Alvéolos (2) Vasos congestos. Coloração HE Obj. 10x................... 34 ARTIGO II Figura 1. Representação da Taxa de Inibição (%) do tumor Carcinoma de Ehrlich nos grupos: Padrão, com administração do metotrexato

(10mg/kg) e Tratado com o extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis, nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg

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por peso corpóreo.............................................................................. 46 Figura 2. Representação da Taxa de Inibição (%) do tumor Sarcoma-180 nos

grupos: Padrão, com administração do metotrexato (10 mg/kg) e Tratado com o extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/Kg por peso corpóreo.. 46

Figura 3. Média dos pesos dos tumores de Carcinoma de Ehrlich para os Grupos Controle (NaCl 0,9%) e grupo Tratado com extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg por peso corpóreo. *Estatísticamente significante em relação ao controle com

p > 0,05% de confiança. Teste “t” de Student (n=5/grupo)............... 47 Figura 4. Média dos pesos dos tumores de Sarcoma-180 para os Grupos

Controle (NaCl 0,9%) e Tratado com o extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis, nas doses 250 mg/kg e 62,5

mg/kg por peso corpóreo. * Estatísticamente significante em relação ao controle com p > 0,05% de confiança. Teste “t” de Student (n=5/grupo)............................... 47

ARTIGO III Figura 1. Representação da Curva de crescimento da amostra de Staphylococcus aureus 10 cc (MRSA) tratada com o Óleo.Essencial de Kalanchoe brasiliensis Cambess a 1% (CIM) e na concentração 4% (2x CIM)...................................................................................... 62 Figura II. Representação da Curva de crescimento da amostra de Staphylococcus aureus ATCC 6538 (MRSA) tratada com o Óleo Essencial de Kalanchoe brasiliensis Cambess na concentração de 8% (2xCIM)...................................................................................... 62 Figura III. Representação dos halos de inibição sobre a amostra 19L (MRSA) de Staphylococcus aureus tratada com Óleo essencial das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess.............................. 63

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LISTA DE TABELAS

ARTIGO I Tabela 1. Representação dos parâmetros no ensaio de toxicidade aguda em

camundongos Albinos Swiss fêmeas com doses diferentes do extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess............................................................................................ 31

ARTIGO II Tabela 1. Descrição macroscópica dos tumores Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma - 180 nos grupos Controle, Padrão e Tratados com o extrato das folhas Kalanchoe brasiliensis Cambess nas doses de 250 e 62,5 mg/kg por peso corpóreo.............................................. 48 Tabela 2. Metabólitos secundários encontrados no extrato hidro etanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess, com suas respectivas fases móveis e reveladores específicos.......................... 48 ARTIGO III Tabela I. Determinação da CIM (Concentração inibitória Mínima) do

extrato hidroetanólico e Óleo essencial das folhas, e alcoolatura do caule de Kalanchoe brasiliensis frente a amostras bacterianas gram-positivas e gram-negativas......................................................................................... 61

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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection ALC Alcoolatura BHI Brain Heart Infusion CAM Metabolismo ácido Crassuláceo CL50 Concentração letal que mata 50% da populaçãoCO2 Dióxido de Carbono CIM Concentração Inibitória Mínima DL50 Dose letal que mata 50% da população DP Desvio Padrão EHF Extrato Hidroalcoólico das Folhas g Grama HE Hematoxicilina-eosina IP Intraperitoneal Kb Kalanchoe brasiliensis Kg Kilograma Log Logarítmo LTF Laboratório de tecnologia Farmacêutica mg Miligrama mL Mililitro MRSA Staphylococcus aureus Meticilina Resistente MSSA Staphylococuus aureus Meticilina Sensível NaCL 0,9% Cloreto de Sódio 0,9% ou Solução Fisiológica (Salina) NCCLS Committe National for Clinical Laboratory Standart OE Óleo Essencial OMS Organização Mundial de Saúde SNC Sistema Nervoso Central UFPE Universidade Federal de Pernambuco UFPB Universidade Federal da Paraíba UFC Unidades Formadoras de Colônia UV Ultravioleta O Orto µg Micrograma µL Microlitro

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SILVA, J.G. Avaliação do potencial farmacológico de Kalanchoe Brasiliensis Cambess. (Dissertação) Mestrado em Ciências Farmacêuticas - CCS/UFPE - Recife-PE, 2007.

RESUMO

Kalanchoe brasiliensis Cambess é uma Crassulácea conhecida popularmente como saião, coirama-branca, folha-grossa ou folha-suculenta. Na medicina popular é utilizada contra lesões teciduais, bronquites, inflamações e úlceras em muitas partes do mundo. Contra essas afecções, a folha é a parte mais utilizada. Este estudo reporta uma avaliação do extrato hidroetanólico das folhas de K. brasiliensis quanto ao seu potencial toxicológico in vivo e in vitro e sua propriedade antitumoral. Além disso, também foi avaliada a atividade antimicrobiana do extrato hidroetanólico e do óleo essencial das folhas, bem como a alcoolatura do caule de Kalanchoe brasiliensis. A citotoxicidade in vitro da planta foi realizada em larvas de Artemia salina. A CL50 determinada em 704,8 µg/mL tornou o extrato tóxico ao microcrustáceo. Foram realizados ensaios de toxicidade aguda com camundongos fêmeas Albinos Swiss (Mus muscullus), por via intraperitoneal, para observação de parâmetros como alterações comportamentais e efeitos sobre os sistemas nervoso central e autônomo. Nas doses de 1000 mg/kg a 3000 mg/kg de peso corpóreo administradas, foram observadas ações estimulantes seguidas de efeitos depressores ao sistema nervoso central e alterações na locomoção. A DL50 determinada em 1925 mg/kg de peso corpóreo tornou o extrato nocivo por via intraperitoneal. Na análise macroscópica o fígado e os rins apresentaram-se empaledecidos nas doses 250 mg/kg e 125 mg/kg de peso corpóreo. Na dose 62,5 mg/kg foram observadas apenas alterações microscópicas. Na avaliação antitumoral foram testadas as linhagens de Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma-180 nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg de peso corpóreo do extrato hidroetanólico de K. brasiliensis. Nessas doses a inibição do Sarcoma-180 foi superior a 50%, sendo ambas estatisticamente significantes em comparação ao controle. Para Carcinoma de Ehrlich a inibição foi de 66,59% na maior dose, e apenas esta se mostrou significativa estatisticamente. Na avaliação mascroscópica a massa tumoral apresentou-se delimitada em todas as doses. Dentre os órgãos avaliados nos camundongos com neoplasias, o baço mostrou-se hipotrofiado e o fígado com coloração escurecida no grupo tratado com 250 mg/kg do extrato, no controle e no grupo padrão, para os dois tumores testados. Na menor dose não houve nenhuma alteração nos órgãos dos animais com o tumor de Ehrlich, porém ocorreu esplenomegalia nos animais com Sarcoma-180. A análise fitoquímica foi realizada através de cromatografia em camada delgada analítica utilizando diversas fases móveis e reveladores específicos, indicando os flavonóides como os fitoconstituintes predominantes. No ensaio antimicrobiano foram utilizadas amostras bacterianas gram-positivas e gram-negativas, dentre elas algumas cepas multiresistentes, além de fungos leveduriformes. Entre o óleo essencial e extrato hidroalcoólico das folhas e alcoolatura do caule, apenas o óleo mostrou-se efetivo nas concentrações de 0,25% a 8%, com halos de inibição de até 17 mm. Na concentração de 8%, foi obtido um efeito bacteriostático bem pronunciado, após a sexta hora de exposição da amostra ao óleo essencial. O efeito antimicrobiano foi observado em amostras multiresistentes de Staphylococcus aureus. Palavras-chave: Kalanchoe brasiliensis, Crassulaceae, Toxicidade Aguda, Atividade Anti-tumoral, Atividade Antimicrobiana, Saião

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SILVA, J.G. Assessment of the potential pharmacological de Kalanchoe Brasiliensis Cambess. (Dissertação) Mestrado em Ciências Farmacêuticas - CCS/UFPE - Recife-PE, 2007.

ABSTRACT Kalanchoe brasiliensis Cambess is a plant belonging to the Crassulaceae family, popularly known as saião, coirama-branca, thick-leaf or succulent-leaf. In popular medicine it is used against tissue lesions, bronchitis, inflammations and ulcers in many parts of the world. Against these injuries, the leaf is the most used part. This study reports an evaluation of the hydroethanolic extract of K. brasiliensis leaves concerning to its toxicological potential in vivo and in vitro, and its antitumoral property. Besides, it was also evaluated the antimicrobial activity of the hydroethanolic extract and essential oil of the leaves, as well as the alcoholature of the stem. The in vitro analysis of the plant citotoxicity was tested against Artemia salina larvaes. The LC50 determined in 704.8 µg/mL made the extract become toxic to the microcrustacean. Assays on acute toxicity with female Albinic Swiss mice (Mus muscullus) were carried out, through intraperitoneal way, to observe parameters such as behavioral alterations and effects on both central and autonomous nervous system. After injecting dosages which varied from 1,000 mg/kg to 3,000 mg/kg of body weight, we observed stimulant actions followed by depressive effects on central nervous system and alterations in locomotion. The LD50 determined in 1,925 mg/kg of body weight, made the extract became harmful if through intraperitoneal way. The macroscopic analysis revealed pale liver and kidneys under the 250 mg/kg and 62.5 mg/kg body weight dosages. Under the 62.5 mg/kg dosage only macroscopic alteration was verified. During the antitumoral evaluation, we tested the tumor strains of Carcinoma of Ehrlich and Sarcoma-180 with 250 mg/kg and 62.5 mg/kg dosages of body weight of the hydroethanolic extract of K. brasiliensis. The above-mentioned dosages demonstrated inhibition at a level higher than 50%, being both statistically significant when compared to the control. The inhibition level was 66.59% to Carcinoma of Ehrlich, under the highest dosage, and only this one was statistically significant. In the macroscopic evaluation the tumoral mass presented itself delimited under all dosages. Amongst the evaluated organs in the mice with cancer, the spleen revealed hypotrophy and the liver showed dark coloration in the group treated with 250 mg/kg of the extract, in the control and in the standard group, for the two tested tumors. Under the lowest dosage there was no alteration in the organs of the animals with the tumor of Erhlich, however spleenomegaly in the animals with Sarcoma-180 was observed. The phytochemical analysis was carried out through chromatography in analytical thin layer by using several mobile phases and specific revealing, showing flavonoids as the predominant phytoconstituents. In the antimicrobial assay, gram-positive and gram-negative bacterial samples were used, amongst which some strains were multiresistant, beside leveduriformes fungi. Amongst the essential oil and extract hydroethanolic of leaves and alcoholature of the stem, only the essential oil showed to be effective in the 0,25% to 8% concentrations, with growth inhibition zones up to 17 mm. Under the 8% concentration, it was obtained a sharper bacteriostatical effect, after the sixth hour of exposition of the sample to the essential oil. The antimicrobial effect was observed in multiresistant strains of Staphylococcus aureus. Key-words: Kalanchoe brasiliensis, Crassulaceae, Acute toxicity, Anti-tumor activity, Antimicrobial activity, Saião

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1-INTRODUÇÃO________________________________________________

1

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1.1-PLANTAS MEDICINAIS

Para humanidade as plantas medicinais e as substâncias de origem animal, sempre

foram utilizadas para minimizar os males que acometiam os povos antigos. Entre as

primeiras civilizações, como os sumérios e os povos babilônicos plantas como canela e

coentro, já eram utilizadas para fins medicinais na forma de decocto, infuso, vinho e

emplastro (CASTRO, 2005).

No curso da história as civilizações, Chinesa e Egípcia, deixaram registradas

centenas de receitas à base de vegetais destacando-se na cultura Egípcia o Papiro de Ebers

contendo cerca de 800 receitas preparadas com diferentes plantas ou substâncias extraídas

(CASTRO, 2005). Da cultura grega surgiu Hipócrates que junto com seus seguidores

catalogaram centenas de plantas medicinais, as quais formularam os precursores das

farmacopéias atuais (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2001).

No início do século XIX o isolamento da tubocurarina, princípio ativo do Curare,

provido da planta Strychnus guianeses e em 1817 o isolamento da morfina, princípio ativo

do ópio, extraído da Papaver somniferum marcaram o início do processo de extração de

princípios ativos de plantas (VIEGAS JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO, 2006).

Sucessivamente, outras substâncias foram isoladas como a quinina e a quinidina, obtidas da

Cinchona sp., e a atropina da Atropa belladona (SCHENKEL; GOSMAN; PETROVICK,

2001). Embora o conhecimento ao longo das civilizações estivesse presente, nas décadas

seguintes os medicamentos sintéticos começaram a dominar o mercado, com o

descobrimento das Sulfas (CASTRO, 2005).

Entretanto, na década de 80 novas tecnologias de isolamento de substâncias ativas a

partir de fontes naturais, permitiram retornar o interesse nestas substâncias para o

desenvolvimento de novos fármacos. Assim, mesmo com o desenvolvimento de fármacos

sintéticos as plantas medicinais permaneceram como alternativa terapêutica em várias

partes do mundo (TUROLLO & NASCIMENTO, 2006).

Neste sentido, a OMS destaca que 80% da população de países em desenvolvimento

utilizam práticas tradicionais com plantas medicinais para atenção a saúde primária sendo

estas práticas incentivadas pelos profissionais que atuam na rede básica de saúde dos países

2

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em desenvolvimento, assim como naqueles onde a medicina convencional é predominante

(OMS, 2000).

No Brasil, o uso de plantas medicinais também data de longos anos, desde a cultura

indígena, a qual forneceu todos os subsídios das ações benéficas de plantas (VIEGAS

JUNIOR; BOLZANI; BARREIRO, 2006; CARVALHO, 1994). Mesmo provido de longa

data, o uso popular ou mesmo tradicional é insuficiente para validar cientificamente as

plantas medicinais como fitoterápicos eficazes e seguros, pois esta prática é feita de modo

empírico sem o conhecimento do verdadeiro potencial terapêutico. Nesse aspecto, a

autorização de seu uso deve ser fundamentada em evidências experimentais (SOUSA,

1985; MATOS, 1994).

Em decorrência destes fatos a proposta lançada pelo ministério da Saúde de uma

Política Nacional de Plantas Medicinais e Medicamentos Fitoterápicos em 2001 que

preconizava: “Deverá ser continuado e expandido o apoio às pesquisas que visem o

aproveitamento do potencial terapêutico da flora e da fauna nacional, enfatizando a

certificação de suas propriedades medicamentosas” (BRASIL, 2001, p.3), foi aprovada pelo

Ministério da Saúde em 2006, estabelecendo diretrizes de estímulo à prática tradicional de

uso de plantas, garantindo o acesso seguro e racional dessas e dos fitoterápicos em nosso

país, fomentando pesquisas com base na biodiversidade brasileira e no reconhecimento de

práticas populares de remédios caseiros obtidos a partir de plantas medicinais (BRASIL,

2006).

1.2 - CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O PROCESSO CANCERÍGENO

A definição científica para o câncer refere-se ao termo neoplasia especificamente,

aos tumores malignos, sendo uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de

células transformadas, em resposta à ativação de protooncogenes que a princípio são

inativos quando em células normais (MACHADO-SANTELLI, 2003).

Estas células alteradas passam então a se comportarem de forma anormal, com

constante multiplicação celular exigindo uma alta carga metabólica para se manterem.

Seguindo este acúmulo numeroso de células, estas podem sofrer transformação e daí se

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disseminam para os tecidos vizinhos até atingir a corrente sanguínea ou linfática,

caracterizando um processo metastático (ALMEIDA et al., 2005).

Numerosas podem ser as causas de iniciação de um processo cancerígeno, a grande

maioria está relacionada com a exposição a carcinógenos ambientais como ultravioleta e

cigarro, em seguida uma dieta inadequada, e por último a influência da predisposição

genética. Todos esses fatores resultam inevitavelmente em alterações no ciclo celular em

qualquer uma das fases do mesmo (REDDY; ODHAV; BHOOLA, 2003).

Em relação às perspectivas de tratamento contra o câncer o alvo de muitos estudos

no momento é guiado para a identificação dos oncogenes assim como, o reconhecimento

dos genes supressores de tumor, visto que estão envolvidos no comando da alteração no

ciclo celular provocando a proliferação de células mutantes, caracterizando todo o processo

cancerígeno (MUKHERJEE et al., 2001).

1.3 - PRODUTOS NATURAIS COMO ANTINEOPLÁSICOS

A natureza tem fornecido muitos produtos efetivos contra o câncer, a exemplo disto

pode-se citar a grande ação dos extratos de plantas de gênero Taxus, de onde se obteve a

droga conhecida como Taxol (paclitaxel) e Docetaxel. Além dessas, compostos como a

Vincristina e Vinblastina extraídos de Cataranthus roseus são efetivos contra tumores no

fígado, rins, cérebro, mama e próstata (MUKHERJEE et al., 2001). De plantas como

Podophyllum peltatum e Camptotheca acumminata, utilizadas por povos asiáticos, foram

isolados variados compostos com atividades citotóxicas e relevante ação antitumoral

(JOHN MANN, 2002; SOUZA, 2004). A Uncaria tomentosa, Eucalyptus grandis e

Culopia intermedia são plantas que já possuem seus mecanismos de ação elucidados sob

diferentes tipos de tumores (SHENG et al., 1998; TAKASAKI et al., 2000;

MARNEWICK; GELDERBLOM; JOUBERT, 2000). Dentro deste contexto, os produtos

bioativos de plantas são estabelecidos como importantes na luta contra o câncer.

A literatura mostra também, que além de efetivos contra a carcinogênese os

produtos naturais são considerados agentes quimiopreventivos contra o câncer. Sendo o

maior grupo destes produtos naturais os flavonóides, que são reconhecidamente compostos

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antioxidantes que inibem a liberação de radicais livres, além de inibir proteínas tirosina-

quinase, as enzimas topoisomerases e induzir apoptose (KOBAYASHI; NAKATA;

KUZUMAKI, 2002). Estes compostos são facilmente encontrados nos vegetais e extratos

de plantas (REDDY; ODHAV; BHOOLA, 2003; ZHAO et al., 1999).

Quanto às perspectivas da utilização de produtos naturais como agentes

anticancerígenos, as pesquisas continuam em andamento para se elucidar a relação

estrutura-atividade destes compostos, visto que parte deles apresenta alguma toxicidade.

Além disso, os produtos naturais estão sendo reconhecidos pela comunidade médica com

maior freqüência como opção terapêutica contra o câncer (JOHN MANN, 2002). Todas

essas perspectivas tornam-se ainda mais consistentes ao saber que da produção de

medicamentos no período de 1981 a 2002, predominaram os de origem natural ou

derivados de produtos naturais, em relação aos sintéticos (NEWMAN; CRAGG; SNADER,

2003).

1.4-TOXICIDADE DE PLANTAS MEDICINAIS

Medicinas tradicionais como a Hindu e a Chinesa exercem uma forte influência

cultural para a utilização de plantas medicinais, permitindo que elas sejam comercializadas

com apoio em propagandas que prometem “benefícios seguros”, já que se trata de uma

fonte natural. Entretanto, na maioria das vezes as supostas propriedades farmacológicas

anunciadas não são pertinentes, em virtude destas ainda não terem sido comprovadas em

protocolos experimentais (JUNIOR; PINTO; MACIEL, 2005; TOLEDO et al., 2003). Isto

se reflete pelo fato de se deduzir que a toxicidade de plantas é um fato trivial, o que não

pode ser assim considerado, visto que o uso irracional de plantas medicinais, e suas

respectivas preparações tornam-se um risco de saúde pública (TORRES & SOUSA, 2002).

Os incidentes indesejáveis ocorridos em decorrência do uso indevido de plantas

medicinais estão primariamente relacionados com aquelas expostas em jardins e quintais de

residências. Por esta razão, algumas plantas expostas em locais públicos já foram

investigadas quanto a seus efeitos, a exemplo a Ricinus comunnis e espécies dos gêneros

Lillium e Kalanchoe (SMITH, 2004).

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Neste sentido, deve ser reconhecido que algumas plantas medicinais apresentam

substâncias que podem desencadear reações adversas, seja de seus próprios componentes,

seja pela presença de contaminantes, ou até mesmo, resultado das preparações caseiras

duvidosas e também os adulterantes contidos em fitoterápicos já comercializados

(TUROLLO & NASCIMENTO, 2006). Assim, torna-se necessário um controle rigoroso

desde a coleta, preparação, extração dos constituintes e finalmente a elaboração de um

fitomedicamento (FILHO & YUNES, 1998).

Considerando que a toxicidade de uma substância a um organismo vivo, seja a

capacidade de lhe causar dano grave ou morte, e que para este dano ocorrer deve haver uma

relação entre concentração e tempo de exposição (BARROS & DAVINO, 2003) é real a

preocupação no que se refere às plantas, já que se trata de medicamentos. Assim, são

necessários critérios na sua utilização para que seus benefícios sejam maiores que os riscos

(SILVA; DINIZ; OLIVEIRA, 2002).

Frente a essas questões, para a incorporação dos recursos da medicina popular na

medicina científica, é obrigatório avaliar sua segurança e eficácia, através de toxicidades

aguda ou crônica (SCHENKEL et al., 2005). A toxicidade aguda objetiva observar efeitos

frente a uma dose única da substância para se determinar à sintomatologia em curto prazo,

podendo daí estimar-se a DL50 (dose letal que mata 50% da população teste), fornecendo

margem de segurança para se estipular doses terapêuticas seguras (DALE; RANG;

RITTER, 2001; MELO, 2004). Atualmente as regras que norteiam os registros e ensaios de

toxicidade aguda, subcrônica e crônica com medicamentos fitoterápicos estão descritas na

Resolução nº 90, 16/03/2004 (BRASIL, 2004).

1.5- MULTIRESISTÊNCIA BACTERIANA

O desenvolvimento da quimioterapia antimicrobiana começou com a descoberta das

sulfanamidas em 1930. Cinco anos após, a penicilina foi descoberta como agente

quimioterápico eficaz, e daí até os próximos 25 anos correntes a pesquisa quimioterápica

foi reconhecida como a era eufórica denominada a “era antibiótica” (JAWETZ;

MELNICK; ADELBERG, 1998).

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Pouco tempo depois na década de 50 começaram a surgir os primeiros

microrganismos resistentes à penicilina. Um novo surto na década de 70 chamou a atenção

da resistência adquirida aos antimicrobianos, pois neste momento apareciam linhagens

multiresistentes a diferentes tipos de antibióticos (COUTO & PEDROSA, 1999).

A multiresistência pode ser adquirida pelos microrganismos através de mecanismos

genéticos como mutações cromossômicas ou através da transferência de genes de

resistência via componente extracromossômico como os plasmídeos. E através de

mecanismos bioquímicos com a ação de enzimas inativadoras de drogas, evitando que estas

atinjam seu sítio-alvo e também por sistema de efluxo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000;

STRATTON, 2000).

No momento, um dos microrganismos que primeiro é listado como multiresistente a

antibióticos, inclusive a alguns de última geração como Vancomicina e Linezolida é o coco

gram-positivo Staphylococcus aureus (AÑÓN et al., 2004). Staphylococcus aureus é um

patógeno oportunista que coloniza primariamente a pele, bastante temido devido a sua

capacidade de produzir várias toxinas, exotoxinas e enzimas específicas que inativam os

antibióticos a que é resistente, sendo estas características responsáveis pela sua forte

virulência (ROSSI; CECCON; KREBS, 2005).

Embora indústrias farmacêuticas tenham produzido novos antibióticos, a resistência

bacteriana está aumentando, mesmo por que é uma característica inerente ao o uso desses

medicamentos (NASCIMENTO et al., 2000). O problema da resistência atingiu um ponto

crítico, o que tornou programas educativos quanto ao uso racional dos antimicrobianos,

necessários. A automedicação tornou-se uma das maiores causas associadas a

multiresistência adquirida, e também um forte atenuante para a busca de novas alternativas

terapêuticas contra tais microrganismos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000;

GOBERNADO, 2003).

Dentre os estudos científicos, a utilização de plantas medicinais representa uma

relevante alternativa terapêutica contra infecções bacterianas, visto que apresentam

reconhecidos efeitos curativos há muito tempo para a humanidade (MICHELIN et al.,

2005; NOVAIS et al., 2003; PESSINE et al., 2003).

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2- REVISÃO DA LITERATURA_____________

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2.1 - ASPECTOS BOTÂNICOS E ETNOFARMACOLOGIA

A família Crassulaceae inclui o gênero Kalanchoe o qual compreende 125 espécies

de plantas conhecidas como “plantas CAM” (Metabolismo Ácido Crassuláceo),

metabolismo específico para plantas com adaptação a ambientes secos, e por esta razão têm

a relevante característica de possuir folhas suculentas em todo o gênero, tornando este um

caractere diagnóstico da família (GEHRIG et al., 2001). No passado, o gênero era dividido

em Kalanchoe, Bryophyllum e Kitchingia. Mas atualmente, o primeiro gênero é o

considerado (SMITH, 2004).

Algumas espécies se originaram de Madagascar, sul da África e da Austrália, e a

elas atribuí-se importância econômica por serem plantas ornamentais e importância

medicinal (GEHRIG et al., 2001).

Kalanchoe brasiliensis Cambess, é uma espécie representativa da família

Crassulaceae, com ocorrência comum em regiões tropicais como o Brasil e África, onde é

empregada na medicina tradicional (ADENIKE & ERETAN, 2004).

No Brasil esta espécie ocorre desde a Bahia até São Paulo, predominantemente na

zona litorânea. Sua sinonímia popular é vasta, sendo popularmente conhecida como saião,

folha de sapo, coirama branca, folha da costa, folha grossa e pra-tudo (CORRÊA, 1984;

LISBOA; FERREIRA; SILVA, 2006). Sua sinonímia científica é descrita como Kalanchoe

crenata (CORREA, 1984; MATOS, 2007).

Apresenta características botânicas como sendo um vegetal sublenhoso, perene, com

crescimento de até 150 centímetros de altura, presença de folhas simples, alternas, opostas

ou verticiladas, sem estípulas, carnosas e glabras (Figura 1); flores hermafroditas,

gamopétalas, com corola amarelo-laranja mais comprida que o cálice, presença de carpelos

escamosos que se tornam folículos polispermos e cálice intumescido e glabro (Figura 2) e o

fruto possui semente com endosperma (CORREA, 1984; BARROSO, 1991).

A origem da planta K. brasiliensis é considerada por alguns autores como incerta,

podendo ser oriunda da África, segundo descrição de Lisboa; Ferreira; Silva (2006). Muito

embora, Barroso (1991) considere que a mesma é de origem indígena, e de acordo com

Souza e Lorenzi (2005) a planta pode ser originária do Brasil. Seu uso na medicina popular

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se constata principalmente através das folhas, em forma de chá, xarope e decocto (SILVA;

DINIZ; OLIVEIRA, 2002).

A etnofarmacologia da Kalanchoe brasiliensis é relevante em várias partes do

mundo. Nas regiões da África, o sumo das folhas frescas é utilizado contra otite, asma,

dores de cabeça e convulsões (NGUELEFACK et al., 2006). Em território brasileiro o

vegetal é comumente utilizado contra tecidos injuriados, abscessos, processos inflamatórios

crônicos e doenças reumáticas (FERREIRA; ROSENTHAL; CARVALHO, 2000;

FONSECA-KRUEL & PEIXOTO, 2004; IBRAHIM et al., 2002), como também contra

infecções genito-urinária (ALBUQUERQUE & ANDRADE, 2002; CUNHA et al., 1995).

No Nordeste é utilizada como emoliente (para furúnculos), cicatrizante (em

queimaduras), indicada para coqueluche e demais afecções das vias respiratórias, e

conhecida também por ter ação contra úlceras e gastrites (LISBOA; FERREIRA; SILVA,

2006) ação esta já atribuída a outras espécies do Gênero em outras partes do mundo como

China e África (TREVISAN et al., 2006). No Sudeste a planta tem apreciável ação contra

bronquites (MEDEIROS; FONSECA; ANDREATA, 2004).

Em outras pesquisas de cunho etnobotânico Kalanchoe brasiliensis é uma das

plantas mais citadas em diferentes regiões do país, que fazem uso de medicina popular

contra suas enfermidades. Dentre estas citações K. brasiliensis é efetiva quando associada

com outras espécies de plantas, principalmente contra gripes e resfriados, além de ser usada

para evitar diarréia e pneumonia quando associada com a planta Chenopodium ambrisiodis

L., conhecida vulgarmente como mastruz (MEDEIROS; FONSECA; ANDREATA, 2004;

TORRES et al., 2005).

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Fig

Figura 1- Representação das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess.

ura 2- Representação da Inflorescência de Kalancho

Foto: Silva, J.G.

Foto: Silva et al, 2002

e brasiliensis Cambess.

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2.2 - ESTUDOS FARMACOLÓGICOS E FITOCONSTITUINTES

Pesquisas científicas a cerca do gênero Kalanchoe já foram realizadas com

demonstração de grande potencialidade farmacológica das espécies que o constitui. Tais

espécies como Kalanchoe pinnata, K. daigremontiana, K. tubiflora, K. gracilis já foram

bem estudadas. Muitas das atividades descritas são anti-leshimanicida, anti-tumoral,

hepatoprotetor, anti-HIV e analgésico (DA-SILVA; COSTA; ROSSI-BERGMANN, 1999;

SHIROBOKOV et al., 1981; SUPRATMAN et al., 2001; YADAV & DIXIT, 2003; WU et

al., 2006).

A eficácia das atividades biológicas de Kalanchoe brasiliensis foi demonstrada com

efeitos bacteriostáticos e contra fungos do extrato etanólico das folhas do Saião (CUNHA

et al., 1995). E ainda quanto a este efeito foi reportado que rizobactérias que vivem em

simbiose com a referida planta produzem uma substância que possui ação contra fungos

como os pertencentes ao gênero Cryptococcus, um fungo oportunista que se prolifera em

pacientes imunodeprimidos, principalmente àqueles submetidos ao tratamento de

neoplasias malignas (FORTES et al., 2006).

O estudo de Ferreira e colaboradores (2000) demonstrou que o uso crônico de

Kalanchoe brasiliensis provoca hipotireoidismo. Em relação à propriedade analgésica dos

extratos aquoso e etanólico do Saião foi comprovado experimentalmente após a indução da

dor em camundongo com formalina, a redução da dor neurogênica e da fase da dor

correlacionada com o processo inflamatório (NGUELEFACK et al., 2004). Dentro deste

contexto, estudos comprovaram a atividade antiinflamatória de K.brasiliensis,

demonstrando com sucesso uma ótima ação em vários estágios da reação inflamatória

(IBRAHIM et al., 2002; MOURÃO et al., 1999). Foi reportado recentemente, que ao

composto Kalanchosine dimalato (KMC) isolado das partes aéreas da planta, se atribui a

atividade antiinflamatória avaliada (COSTA et al., 2006). Além desses, o extrato aquoso da

planta apresentou um grande potencial contra envenenamento de serpentes, observado pela

redução induzida pelo vegetal contra o edema, hemorragia e necroses causadas por este tipo

de envenenamento (FONSECA et al., 2004).

A resposta imunomodulatória com uma diminuição linfocitária e ativação de

macrófagos provocada por Kalanchoe brasiliensis foi verificada, sendo esta ação conhecida

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em outras espécies do mesmo gênero (IBRAHIM et al., 2002). Em estudos prévios a este

foi observado que o sumo e o extrato liofilizado do Kalanchoe brasiliensis, também

apresenta efeito inibitório na resposta linfocitária (MORAES et al., 1944 apud COSTA).

Outras avaliações quanto a efeitos como: anticonvulsivante, antiulcerogênico e

avaliação toxicológica, já foram desenvolvidas com o extrato aquoso do Saião

(NGUELEFACK et al., 2006; SILVA, 2004; MOURÃO et al., 1999). Sabe-se também que

lectinas extraídas do extrato aquoso de K. brasiliensis demonstraram uma ação aglutinante

sobre eritrócitos humanos (ADENIKE & ERETAN, 2004).

Fonteles e colaboradores (1982) apud Trevisan et al., demonstraram que o extrato

hidroalcoólico de Kalanchoe brasiliensis possui atividade anticolinesterásica bloqueando o

efeito da d-tubocurarina em respostas contráteis provocadas por acetilcolina, aumentando

dessa forma o nível de Acth. Este efeito foi, segundo o autor, devido à presença de

flavonóides glicosilados isolados previamente. Estes autores confirmaram ainda um

potencial larvicida do extrato da planta, a partir do isolamento de dois flavonóides

identificados como 3,7-di-O-ά-L-raminopiranosíl 8-metoxiquercetina e 3,7-di-O-raminosil

8-metoxikanferol (TREVISAN et al., 2006).

Do gênero Kalanchoe é reportada a presença de compostos como bufadienolídeos,

ácidos graxos, triterpenóides e flavonóides (WU et al., 2006).

As investigações fitoquímicas a cerca de K. brasiliensis revela a presença de taninos

condensados (proantocianidinas) (STEVENS et al., 1995); lectinas (ADENIKE &

ERETAN, 2004); bufadienolídeos (glicosídeos cardiotônicos), esteróides, compostos

fenólicos, saponinas, mucilagem e uma quantidade numerosa de flavonóides (COSTA;

JOSSANG; BODO, 1994; NGUELEFACK et al., 2004). Alguns desses compostos já foram

isolados tais como, flavonóides glicosilados descritos como 3,3’,4’,5,7’-pentaidroxi-6-

metoxiflavona (patuletina) como aglicona (Figura 3). Foram encontrados 7 flavonóides

derivados de patuletina raminoside e destes, três apresentaram uma potente atividade

inibidora da proliferação de linfócitos (COSTA; JOSSANG; BODO, 1994).

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Fig(Co

ura 3. Flavonóides glicosilados encontrados em Kalanchoe brasiliensis sta; Jossang; Bodo, 1994).

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3- OBJETIVOS___________________________________________________

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3.1. Geral

Avaliar a ação do extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis

Cambess, na determinação do seu potencial toxicológico, antitumoral e a propriedade

antimicrobiana da alcoolatura do caule e do extrato hidroetanólico e óleo essencial das

folhas.

3.2. Específicos

Verificar a citotoxicidade in vitro para determinação da concentração letal

(CL50) do extrato hidroetanólico das folhas de K. brasiliensis frente ao

microcrustáceo Artemia salina;

Avaliar a toxicidade aguda in vivo observando parâmetros comportamentais

para determinação da Dose letal (DL50) em camundongos fêmea, por via

intraperitoneal, do extrato hidroetanólico das folhas de K. brasiliensis;

Efetuar uma avaliação histopatológica dos rins, fígado e pulmões de

camundongos fêmeas tratadas com o extrato hidroetanólico das folhas de K.

brasiliensis;

Verificar a atividade antineoplásica do extrato de K. brasiliensis frente aos

tumores Sarcoma-180 e Carcinoma de Ehrlich;

Avaliar macroscopicamente os Rins, Baço, Fígado e Pulmões dos animais

portadores dos tumores Sarcoma-180 e Carcinoma de Ehrlich, tratados com

o extrato hidroetanólico de K. brasiliensis,

Realizar a prospecção fitoquímica do extrato hidroetanólico das folhas de K.

brasiliensis.

Avaliar o efeito antimicrobiano da alcoolatura do caule, do extrato

hidroetanólico e óleo essencial das folhas, em amostras bacterianas gram-

positivas com marcas de resistência a vários antibióticos e em linhagens

gram-negativas de bactérias, além de fungos leveduriformes;

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4- Artigo I___________________________________________________

Artigo a ser submetido à Revista Memórias do Instituto Brasileiro Oswaldo Cruz

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TOXICIDADE DE Kalanchoe brasiliensis.

AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE E DA TOXICIDADE AGUDA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DE Kalanchoe brasiliensis Cambess

Jackeline G. da Silva1*, Aline L. Xavier2, Fálba B. R. dos Anjos 3, Rosa C. Santiago4, Alex B. Silveira5 , Aldo C. P. da Silva6 , Ivone A. de Souza7

*1, 6, 7 Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Antibióticos, UFPE, Av. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, 50740-521-Recife/PE, Brasil

2 Laboratório de Tecnologia Farmacêutica,UFPB 3, 4,Departamento de Fisiologia e Embriologia, UFPE 5Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE

RESUMO

Este estudo objetivou determinar a toxicidade aguda do extrato de Kalanchoe brasiliensis Cambess, para a obtenção da dose letal (DL50) e concentração letal (CL50). A toxicidade aguda foi realizada com camundongos Albinos Swiss (Mus muscullus), compondo um grupo controle, o qual recebeu salina e grupos testes, tratados com o extrato da planta por via intraperitoneal. O screening das doses foi de 1000 a 3000 mg/kg de peso corpóreo. A DL50 encontrada foi de 1925 mg/kg. Durante os ensaios foram observadas reações estimulantes ao Sistema Nervoso Central como agressividade, efeitos no sistema cardiovascular como taquicardia e dispnéia, além de afetar também o sistema simpático. Na avaliação macroscópica o fígado e os rins apresentaram-se empaledecidos nas doses 250 e 125 mg/kg de peso corpóreo. No grupo controle e na dose 62,5 mg/kg só houve anormalidade apenas a nível microscópico nos pulmões e rins. A CL50 de 704,8 µg/mL confirmou a toxicidade do extrato ao microcrustáceo Artemia salina. Embora Kalanchoe brasiliensis tenha reconhecidas propriedades medicinais e seja comumente utilizada na nossa região, a mesma pode causar severas intoxicações a nível de Sistema Nervoso Central. Unitermos: Kalanchoe brasiliensis, Toxicidade aguda, Concentração Letal _________________________________________________________________________

ABSTRACT

The present study aimed to determine the acute toxicity of the extract of Kalanchoe brasiliensis Cambess, for the obtention of the lethal dose (LD50) and lethal concentration (LC50). The acute toxicity was carried out with female Albinic Swiss mice, constituting a control group, which received salt solution and test groups treated with the extract of the plant by intraperitoneal injection. The dosages’ screening was from 1,000 to 3,000 mg/kg of body weight. The LD50 determined was 1,925 mg/kg. During the assays, we observed

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stimulant effects in the Nervous Central System such as convulsions, effects in the cardiovascular system such as tachycardia and dyspnoea, besides affecting the Sympatic Nervous System. In the macroscopic evaluation, liver and kidneys showed whitening under the 250 and 125 mg/kg dosages of body weight. In the control group and under the 62,5 mg/kg dosage, lungs and kidneys showed alterations only in the microscopic level. The LC50 of 704,8 µg/mL confirmed that the extract is toxic to Artemia salina. Though K. brasiliensis has recognized medicinal properties and it is commonly used in our region, it can cause hard intoxication to the central nervous system. Uniterms: Kalanchoe brasiliensis, acute toxicity, citoxicity * Correspondência com o autor: Email: [email protected] 1.INTRODUÇÃO

Kalanchoe brasiliensis é uma planta muito utilizada como tratamento alternativo na

Ásia, África e Brasil para as mais diversas enfermidades (Gehrig et al. 2001; Nguelefack et

al. 2004; Ferreira et al. 2000). Estudos científicos já comprovaram dentre alguns usos

populares, sua real eficácia. Foi demonstrado que apresenta ação antitulcerogênica,

anticonvulsivante e analgésica (Silva, 2005; Nguelefack et al. 2006).

O crescente interesse por terapias alternativas com uso terapêutico de produtos

naturais, especialmente os derivados de plantas, tem direcionado muitas pesquisas para se

poder validar o uso das mesmas (Silva et al. 2002). Isto porque estas são utilizadas com

pouca ou nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas, desconsiderando

seus efeitos tóxicos (Pinto et al. 2002; Junior et al. 2005). Kalanchoe brasiliensis está entre

as plantas correlacionadas com muitos acidentes devido a sua toxicidade principalmente em

nível de sistema cardiovascular (Smith 2004).

Ressaltando que plantas medicinais também são medicamentos, e que muitas destas

embora utilizadas não foram realmente avaliadas por completo, é preciso um estudo mais

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profundo para promover mais confiabilidade quanto a seu uso. Inerente a estes estudos de

validação da medicina tradicional está a determinação da toxicidade dessas plantas.

Nesse estudo objetivou-se avaliar o potencial citotóxico in vitro e toxicológico pré-

clínico, com ensaio in vivo de toxicidade aguda do extrato hidroalcoólico das folhas de

Kalanchoe brasiliensis Cambess em camundongos Albinos Swiss (Mus musculus), visando

as possíveis doses tóxicas e terapêuticas para determinação da DL50, com análise

histopatológica dos rins, fígado e pulmões.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção do Material Botânico

As folhas de Kalanchoe brasiliensis foram coletadas no horto medicinal do LTF

(Laboratório de Tecnologia Farmacêutica) da UFPB. A coleta foi realizada no início da

floração, com a presença de brotos florais durante o mês de setembro de 2005. A

identificação da planta foi feita por M.B. Costa e Silva (Exsicata IPA Nº 59725).

2.2 Obtenção do Extrato Hidroetanólico

As folhas frescas foram pesadas e dessecadas por 72 horas em estufa à temperatura

de 45ºC, maceradas a temperatura ambiente com álcool etílico (90%). Em seguida o extrato

foi submetido à filtração e rotaevaporação até a obtenção de uma concentração de 54,5 g do

resíduo do extrato bruto para realização dos testes.

2.3 Avaliação Citotóxica na Determinação da Cl50

20

Page 37: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE … · Aparelho Justaglomerular, (2) Túbulo Contorcido distal e proximal edemasiados (2 e 3). Coloração HE Obj.10x..... 33 Figura 5

A avaliação citotóxica de Kalanchoe brasiliensis foi realizada através do bioensaio

com Artemia salina Leach. Os cistos do microcrustáceo foram obtidos do LABETOX

(Laboratório de Ensaios Toxicológicos) do LTF (Laboratório de Tecnologia Farmacêutica)

da Universidade Federal da Paraíba.

Os cistos de Artemia salina foram incubados em água salina (pH 8,5 a 29ºC) sob

iluminação artificial por 48h, para a obtenção dos metanáuplios. O extrato foi solubilizado

em dimetilsulfóxido (DMSO) e posto em solução com água salina. A partir de uma solução

mãe de 10 mg/mL, efetuou-se diluições de 800 µg/mL a 40 µg/mL. Foi colocado 5mL

dessas soluções em tubos de ensaios contendo de 13 a 15 metanaúplios. Durante 24h as

larvas foram mantidas sob luz artificial, e após este período foram realizadas as contagens

das larvas vivas e mortas. O grupo controle continha larvas, DMSO e água salina. Cada

concentração foi testada em triplicata. A Cl50 foi determinada de acordo com o método

estatístico Probitos utilizando o programa Microcal Origin versão 4.1.9 (Parra et al. 2001;

Carvalho 2005; Branco 2005).

2.4 Avaliação da Toxicidade Aguda na Determinação da Dl50

A toxicidade aguda foi realizada segundo o método de Karber & Behrens (1964) no

qual foram utilizados camundongos albinos Swiss fêmeas (Mus musculus), provenientes do

Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco, com 60

dias de nascidos e peso entre 25 e 30 g. Formando grupos de seis, os animais foram

mantidos em gaiolas de polipropileno, em condições controladas de iluminação (ciclo 12

horas claro/escuro) e temperatura (22 + 2oC). Permaneceram sem alimento por um período

de 12 horas antes do experimento, recebendo água ad libidum. A via de administração da

substância foi intraperitoneal (i.p.).

21

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O ensaio foi dividido em duas fases: preliminar e definitiva. Na fase preliminar, foram

administradas doses em progressão geométrica de razão 2, a fim de se determinar a maior

dose que não apresentou letalidade (D1) e a menor dose que foi capaz de provocar morte em

100% dos animais do grupo (D2). Em seguida receberam doses crescentes entre D1 e D2,

para se determinar a DL50. O grupo controle recebeu o veículo (Solução Salina a 0.9%–

NaCl).

A DL50 foi calculada pela seguinte fórmula: DL50 = Df - ∑(a.b)/n

Df = dose mínima capaz de matar todos os animais a = diferença entre duas doses consecutivas b = média de animais mortos entre duas doses consecutivas n = número total de animais por lote.

2.5 Avaliação Morfológica Macro e Microscópica

Camundongos Albinos Swiss fêmeas foram divididos em dois grupos: tratados com

o extrato hidroetanólico de K.brasiliensis e controle. Após receberem anestesia profunda

pelo éter sulfúrico (P.A.), os animais foram colocados em decúbito dorsal e em seguida, os

rins, fígado e pulmões foram cuidadosamente removidos e fixados em solução de

folmaldeído 10% em solução tampão neutra. Após 24h de fixação às peças foram lavadas e

desidratadas, para inclusão em parafina líquida. Foram cortadas com 7 µm de espessura,

coradas pela técnica de Hematoxilina-Eosina e observadas em microscopia óptica

(Michalany 1980). Para o estudo específico da avaliação macroscópica dos órgãos a

estimativa da dose foi de 10% da DL50 (Dale 2001).

3. RESULTADOS

22

Page 39: AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE … · Aparelho Justaglomerular, (2) Túbulo Contorcido distal e proximal edemasiados (2 e 3). Coloração HE Obj.10x..... 33 Figura 5

3.1. Determinação da CL50

O ensaio de letalidade com organismos simples como o microcrustáceo marinho

Artemia salina Leach permitiu a avaliação da toxicidade geral, sendo este ensaio preliminar

no estudo de extratos e metabólitos com potencial atividade biológica. Este foi o primeiro

passo para a observação do potencial toxicológico de K. brasiliensis (Lopes et al. 2006).

Os resultados mostraram que o extrato de K. brasiliensis nas concentrações de 40

µg/mL a 800 µg/mL foi bioativo frente a Artemia salina, mostrando um comportamento

dose-resposta observado com o aumento da modificação na movimentação das larvas e no

número da mortalidade, proporcional ao aumento da concentração da substância (Figura 1).

A CL50 encontrada foi de 704,8 µg/mL. Observou-se também, que não houve morte no

grupo controle, logo os solventes utilizados não influenciaram na mortalidade ocorrida no

teste.

3.2.Toxicidade Aguda e Determinação da DL50

Na fase preliminar do ensaio com camundongos foram administradas doses que

variaram de 1000 a 3000 mg/kg de peso corpóreo. Ao longo dos ensaios foram observados

efeitos sobre o Sistema Nervoso Autônomo, quando apresentaram alteração do sistema

músculo-esquelético, assim como efeitos estimulantes ao Sistema Nervoso Central.

No geral as reações nos primeiros 20 minutos foram estimulantes com apresentação

de movimentos circulares, reação de fuga, piloereção e espasmos e na sequência ocorreu

perda da coordenação motora, marcha ebriosa e espasticidade. Além desses efeitos,

ocorreram sinais como taquicardia, tremores finos e grosseiros, realização de saltos e

agressividade (Tabela 1). Após o estado de euforia, ocorreram distúrbios como dispnéia e

apnéia. Contorções e refluxos também foram freqüentes.

23

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O parâmetro de estimulação, seguido de depressão do SNC foi mantido em todos os

ensaios. Os efeitos foram acentuados proporcionalmente às doses administradas, como

pode ser verificada com a curva dose/resposta (Figura 2). Porém nas maiores doses os

sinais estimulantes foram mais exacerbados em comparação aos sinais depressores.

A partir dos óbitos em algumas doses (1650 mg/kg a 2500 mg/kg) foi determinada a

DL50 em 1925 mg/kg de peso corpóreo. No decorrer dos ensaios conferimos a diminuição

da micção e excreção fecal e no caso de algumas doses (1850 a 2500 mg/kg) ausência total.

3.3. Avaliação Anatomo e Histopatológico

Macroscopicamente foi verificada nas doses de 250 e 125 mg/kg discreta alteração na

coloração no fígado e rins, além de ativa turgescência vascular cerebral. Na microscopia foi

revelada alteração no sistema renal ao nível do glomérulo e a presença de vasos congestos.

Na dose 62,5 mg/kg não ocorreu nenhuma alteração macroscópica, assim como no grupo

controle. Porém, a histologia dos rins nesta dose apresentou as células dos túbulos

contorcidos, proximais e distais discretamente edemaciados (Figura 3 e 4). Nos pulmões

dos animais tratados com a dose referida foram observados vasos pulmonares congestos

com alvéolos conservados (Figuras 5 e 6).

4. DISCUSSÃO

Diante dos resultados de toxicidade in vitro, com o índice da CL50 menor que 1000

µg/mL o extrato foi considerado tóxico ou bioativo, frente a Artemia salina (Parra et al.

2001). Em acordo com a citotoxicidade previamente estudada por Trevisan et al. (2006) ao

avaliarem o referido extrato frente a larvas de mosquitos.

24

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A determinação da DL50 é um pré-requisito a ser atendido na avaliação tóxica de

novos fármacos, pois a partir desse valor pode ser estabelecido doses terapêuticas que

poderão ser utilizadas na forma farmacêutica acabada (Melo 2004). O valor da Dl50 aqui

encontrado de 1925 mg/kg de peso corpóreo tornou o extrato moderadamente tóxico, pois

segundo Schuartsman (1980) pertencem a esta categoria as substâncias com dose letal para

50% de uma dada população entre 0,5 a 5 g.

Ensaios de toxicidade aguda de algumas espécies do gênero de Kalanchoe já foram

descritos. Ensaios como os de Williams & Smith (1984) realizados em pintos e o estudo de

Smith (2004) com bezerros e gados, estão de acordo com o presente estudo ao terem sido

verificadas reações tóxicas semelhantes às descritas. Nestes animais os sinais mais comuns

de toxicidade foram transtornos gastrintestinais, dores abdominais, assim como efeitos

cardíacos com severas arritmias com bloqueio átrio-ventricular, taquicardia, dispnéia,

desmaio e morte súbita.

Smith, 2004 reportou que estes efeitos foram promovidos devido à presença dos

compostos bufadienolídeos pertencentes ao grupo dos glicosídios cardiotônicos, os quais

são comumente distribuídos nas plantas do gênero Kalanchoe, e estes são conhecidos por

ter ação sobre o sistema nervoso central, além de evidentes efeitos sobre o sistema

cardiovascular (Supratman et al. 2001). Esta afirmação também foi sugerida por Mckenzie

et al. (1987), quando avaliou a toxicidade de seis plantas pertencentes ao gênero Kalanchoe

e constatou efeitos tóxicos semelhantes aos já citados. De acordo com a literatura citada,

pode–se sugerir que os efeitos tóxicos aqui observados podem ser devidos à presença dos

bufadienólideos tão predominantes no Gênero de K. brasiliensis.

Além dos efeitos já descritos no presente trabalho, os camundongos apresentaram

convulsões sob altas doses, sendo esse um sinal tóxico comumente correlacionado com os

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heterosídeos cardiotônicos discutidos (Rates & Bridi 1999). As convulsões apresentadas

foram do tipo generalizada tônico-clônica e por vezes parciais do tipo focal representando

mais um efeito estimulante ao SNC (Rall & Schleifer 1990). Nguefelack et al. (2006)

notificaram que em baixas doses o extrato do saião apresenta-se anticonvulsivante,

concordando com os resultados aqui encontrados. Sugerimos ainda, em concordância com

o trabalho anterior, que altas doses do extrato inibem a síntese do GABA (ácido gama-

aminobutírico) provocando convulsão e que o neurotransmissor é acentuado em baixas

doses do mesmo.

A fase excitatória aqui observada sugere que o extrato possui compostos

estimulantes ao sistema nervoso central, e após esta fase os sinais depressores foram talvez

devido a uma fadiga neuronal que ocorre normalmente após uma intensa fase excitatória

(Bloom 1990), ou até mesmo, a metabolização do ou dos princípios tóxicos da planta ter

resultado em algum composto que aja deprimindo o Sistema Nervoso Central.

O único trabalho que avaliou a toxicidade de Kalanchoe brasiliensis reporta

resultados discordantes aos aqui apresentados, no qual foi demonstrada ausência de

toxicidade para o extrato aquoso das folhas (Mourão et al. 1999). Porém, este dado

contrário implica em considerar que mudanças ecofisiológicas são freqüentes, quando a

planta se encontra em regiões diferentes com modificação de suas propriedades genotípicas

e conseqüentemente suas propriedades farmacológicas (Gehrig et al. 2001). Além disso,

embora haja diferentes níveis de toxicidade dentro do gênero da planta estudada, todas as

espécies são consideradas tóxicas (Lynn M. Milewski & Khan 2006).

A apresentação do fígado e rins empaledecidos na macroscopia nas doses 250 e 125

mg/kg de peso copóreo corrobora com os achados de Mckenzie et al. (1987) em avaliação

de plantas do mesmo gênero. Os achados histológicos de alteração ao nível do glomérulo

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renal nas doses acima, parecem estar correlacionados com os sinais de toxicidade aqui

observados ao ter ocorrido retenção de excretas. Isto pode ser justificado ao se saber que

efeitos farmacológicos tendem a desaparecer quando a concentração química tecidual decai

por excreção corporal, e que as excretas da urina são eliminadas pela filtração glomerular

(Berne & Levi 1998; Costanzo 1999).

Vale ressaltar que embora os animais tratados na menor dose 62,5 mg/kg não

apresentaram modificação na macroscopia de seus órgãos, houve constatação de algumas

alterações na microscopia (Figuras 4 e 5). A apresentação nessa referida dose, dos túbulos

contorcidos distais e proximais edemaciados nos sugere que o EH das folhas de K.

brasiliensis modifique a intensidade da filtração glomerular, comprometendo talvez a

dinâmica renal. Além da demonstração dos vasos congestionados no pulmão implicitando

talvez o desequilíbrio da homeostasia no sistema respiratório.

Os dados presentes condicionam a atentarmos a respeito da toxicidade de K.

brasiliensis, além do fornecimento de subsídios que representam uma margem de segurança

para o uso do extrato avaliado.

5. CONCLUSÃO

Conclui-se que o extrato hidroetanólico de Kalanchoe brasiliensis Cambess foi

tóxico em ensaios in vitro frente a Artemia salina Leach como também em testes pré-

clínicos, por via intraperitoneal, apresentando em camundongos reações estimulantes e

depressoras ao nível do Sistema Nervoso Central, assim como efeitos no Sistema Nervoso

Autônomo, além de promover desequilíbrio a homeostasia dos Sistemas renal e

respiratório.

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6. REFERÊNCIAS

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Smith G 2004. Kalanchoe species poisonimg in pets. Vet Medic p 933-936. Supratman U, Fujita T, Akiyama K, Hayashi H, Murakami A, Sakai H, Koshimizu K, Ohigashi H 2001. Anti-tumor promoting activity of bufadienolides from Kalanchoe pinnata and K. daigremontiana x tubiflora. Biosci Biotechnol Biochem 65:947-949. Trevisan TMS, Bezerra MZB, Santiago GMP, Feitosa CM 2006. Atividades Larvicida e Anticolinesterásica de plantas de gênero Kalanchoe. Química Nova 29: 415-418. Williams MC & Smith MC 1984. Toxicity of Kalanchoe spp to chicks. Am J Vet Res 45:543-6.

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Tabela 1. Representação dos parâmetros no ensaio de toxicidade agudo em camundongos Albinos Swiss fêmeas com doses diferentes do extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess

Dose do extrato de Kalanchoe brasiliensis (mg/kg) Ações/Parâmetros 1000 150 0

(D1) 1650 1800 1850 2000 2250 225 0

(D2) 3000

ESTIMULANTES

Aumento da Freqüência Respiratória + + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Taquicardia + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Movimento de Vibrissas + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Piloereção + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++

Exoftalmia + + + + + + + ++ +++

Movimento esteriotipado + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Movimento Circular + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Agitação + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Tremores Finos + ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++

Tremores Grosseiros + + ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++

Convulsão Focal + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++

Convulsão Tônica Clônica + + ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Ereção de cauda + ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++

Postura de ataque + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++

Agressividade - - ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Saltos + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++

Reação de Fuga + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

DEPRESSORES

Abaixamento dos membros posteriores + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

Dispnéia + + ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++

Diminuição da Freqüência Respiratória + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

Postura Estática + + + + + ++ ++ ++ ++

Outros comportamentos

Alteração de Marcha + + + + + ++ ++ +++ +++

Contorções Abdominais + + + ++ ++ ++ ++ +++ +++

Levantamento dos membros anteriores + + + + + + + + +

SN AUTÔNOMO

Excreção fecal - - + + + - - - -

Espasmos ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Refluxo ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Palidez + + + + +++ +++ +++ +++ +++

Contorção abdominal + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

Diurese - + + + - - - - -

Espasticidade + + + ++ ++ +++ +++ +++ +++

Cianose - - - - - - - + +

+++ Acentuadas reações; ++ Moderadas reações; + Suaves reações; - Ausência de reação

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FiguCL5Arte

Figuvia i

ra 1. Curva dose resposta do ensaio da citotoxicidade in vitro para determinação da 0 do extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess frente a mia salina Leach.

Curva dose-resposta na toxicidade aguda de Kalanchoe brasiliensis Cambess

0

20

40

60

80

100

2,9 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6

LOG DA DOSE

PER

CEN

TUA

L D

E Ó

BIT

O

0 100 200 300 400 500 600

40

50

60

70

80

90

100

% d

e vi

vos

concentração ug/mL

B Linear Fit of Data1_B

ra 2. Curva dose/resposta da Toxicidade aguda em camundongos Albinos Swiss por ntraperitoneal do extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess.

32

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2

3

1

Figura 3. Fotomicrografia em filtro amarelo do rim de camundongo fêmea do grupo controle tratado com solução salina. Corpúsculo Renal (1), Túbulo contorcido distal (2), Túbulo contorcido proximal (3). Coloração HE. Obj. 4x

1

3

2

Figura 4. Fotomicrografia em filtro transparente do rim de camundongo fêmea do grupo Tratado com 62,5 mg/kg do extrato hidroetanólico de K.brasiliensis. (1) Aparelho Justaglomerular (2) Túbulo contorcidos distal e proximais edemaciados (2 e 3). Coloração HE. Obj. 10x

33

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1

Figura 5. Fotomicrografia em filtro amarelo do pulmão de camundongo fêmea do grupo Controle tratado com solução salina (1)

2

1

Figura 6. Fotomicrografia em filtro transparente do pulmão de camundongo fêmea do grupo Tratado com 62,5 mg/kg do extrato hidroetanólico de K. brasiliensis. (1) Alvéolos (2) Vasos congestos. Coloração HE. Obj. 10x

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5- Artigo II___________________________

Artigo a ser submetido à Revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz

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Kalanchoe brasiliensis como Anticancerígeno

POTENCIAL ANTI-NEOPLÁSICO DE Kalanchoe brasiliensis CAMBESS FRENTE A CARCINOMA DE ERLICH E SARCOMA –180

Jackeline G. da Silva1*, Haroudo S. Xavier2, Ana Pavla A.D.Gurgel3, Ana Ruth S.

Grangeiro4, Cynthia Maria Pontes5 , Aldo C.P. da Silva6, Ivone A. de Souza7

1*,2, 3, 4, 5,6 Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Antibióticos, UFPE, Av. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, 50740-521-Recife/PE, Brasil

Resumo O presente estudo objetivou avaliar o extrato das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess em duas linhagens tumorais: Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma-180. Após implante de células tumorais, camundongos Albinos Swiss fêmeas foram divididos em três grupos: controle, padrão e tratado, os quais receberam, respectivamente, salina 0,9%, metotrexato (10 mg/kg), 250 e 62,5 mg/kg por peso corpóreo do extrato hidroetanólico de K. brasiliensis. As doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg apresentaram uma inibição superor a 50%, e ambas as doses foram em relação ao controle. Para carcinoma de Ehrlich o nível de inibição foi de 66, 59%, na maior dose, e apenas esta foi estatisticamente significativa. Na avaliação macroscópica os tumores dos grupos tratados apresentaram-se delimitados em todas a doses. Dentre os órgãos avaliados nos camundongos com neoplasia o baço mostrou-se hipotrofiado e o fígado com coloração escurecida, no grupo tratado com 250mg/kg do extrato, no controle e no grupo padrão para os dois tumores. Na menor dose não ocorreu alteração nos órgãos dos animais com tumor de Ehrlich, porém houve esplenomegalia nos animais com Sarcoma. Diante dos resultados pode–se considerar que houve uma relevante ação antitumoral do extrato de K. brasiliensis nas doses avaliadas Unitermos: atividade antineoplásica, Kalanchoe brasiliensis, câncer. _________________________________________________________________________

Abstract

The present study aimed to evaluate the extract of leaves of Kalanchoe brasiliensis in two kinds of tumours strains: Ehrlich carcinoma and Sarcoma 180. After implantation of tumour cells, female Albinic Swiss mice were divided in three groups: control, standard and treated, which received, respectively, 0,9% salt, metrotexato (10 mg/kg), 250 mg/kg and 62,5 mg/kg per body weight of the K. brasiliensis’ hydroethanolic extract. The 250 mg/kg and 62,5 mg/kg dosages demonstrated inhibition at a level higher than 50%, being both statistically significant when compared to the control. The inhibition level was 66.59% to Carcinoma of Ehrlich, under the highest dosage, and only this one was statistically significant. In the macroscopic evaluation the tumoral mass presented itself delimited under all dosages. Amongst the evaluated organs in the mice with cancer, the spleen revealed hypotrophy and the liver showed dark coloration in the group treated with 250 mg/kg of the

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extract, in the control and in the standard group, for the two tested tumors. Under the lowest dosage there was no alteration in the organs of the animals with the tumor of Erhlich, however spleenomegaly in the animals with Sarcoma-180 was observed. Before the results, it can be considered that there was an excellent anticancer action of the Kalanchoe brasiliensis’ extract. Uniterms: activity antineoplasic, Kalanchoe brasiliensis, cancer * Correspondência com o autor: Email: [email protected] 1.INTRODUÇÃO

O câncer é uma das doenças que mais causam temor à sociedade, por ter se tornado

um estigma de mortalidade e dor. Sendo a terceira maior causa de óbitos no mundo inteiro

(Almeida et al. 2005).

Avanços relacionados à prevenção e tratamento do câncer requerem o

desenvolvimento continuado de novos agentes quimiopreventivos e quimioterapêuticos.

Alguns estudos já estão sendo guiados neste sentido, principalmente com a utilização de

produtos naturais como antineoplásicos e exclusivamente frente a tumores sólidos, os quais

são pouco estudados (Reddy et al. 2003; Newman et al. 2000). É descrito que grande parte

dos agentes antitumorais utilizados na prática clínica são oriundos de produtos naturais ou

até mesmo de seus derivados (Newman et al. 2003). Produtos ricos em polifenóis são

utilizados nestes estudos, pois estes possuem inúmeros mecanismos efetivos contra o

câncer (Mejía et al. 1999). Por estas razões torna-se relevante o incentivo ao uso de plantas

medicinais como opção terapêutica contra o câncer.

A planta Kalanchoe brasiliensis é utilizada para muitos fins medicinais, e dentro do

seu gênero há relatos da atividade antineoplásica (Wu et al. 2006).

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O objetivo do presente trabalho foi realizar a prospecção fitoquímica do extrato

hidroalcoólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis e avaliar o potencial antitumoral do

extrato frente aos tumores Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma –180 em camundongos fêmeas.

2.MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Obtenção do Material Botânico

As folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess, foram coletadas no horto medicinal

do LTF (Laboratório de Tecnologia Farmacêutica) da UFPB. A coleta foi realizada no

início da floração com a presença de brotos durante o mês de setembro de 2005. A

identificação da planta foi feita por M.B. Costa e Silva (Exsicata IPA Nº 59725).

2.2 Obtenção do Extrato Hidroetanólico

As folhas frescas foram pesadas e dessecadas por 72 horas em estufa à temperatura

de 45ºC, maceradas a temperatura ambiente com álcool etílico (90%). Em seguida o extrato

foi submetido à filtração e rotaevaporação até obter-se de uma concentração de 54,5 g do

resíduo do extrato bruto para realização dos testes.

2.3. Prospecção Fitoquímica

A investigação fitoquímica colocou em evidências os seguintes metabólitos

secundários: alcalóides, terpenóides (monoterpenóides, sesquiterpenóides diterpenóides,

triterpenóides, esteróides, iridóides, saponósidos), polifenóis (derivados cinâmicos,

fenilpropanoglicosídeos, flavonóides, proantocianidinas). Cerca de 50 mg do extrato bruto

foi submetido à infusão metanólica. Alíquotas de 10 µL foram submetidas a cromatografia

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em camada delgada analítica (CCDA), empregando-se como fase estacionária placas

cromatográficas prontas de gel de sílica (Merck-Alemanha, art. 105554) e diversas fases

móveis e reveladores para as respectivas classes de compostos.

2.4 Transplante dos Tumores

Para este experimento foram utilizadas duas linhagens de células tumorais:

Carcinoma de Ehrlich e Sarcoma-180, ambos na forma sólida. Foi realizado a transferência

de um fragmento de cerca de 3 mm de diâmetro o qual foi introduzido subcutanemente na

região axilar do animal receptor (Stock et al. 1955).

O grupo teste foi tratado com o extrato de Kalanchoe brasiliensis durante 8 dias. A

quimioterapia experimental foi iniciada 48 horas após o transplante dos tumores. Após o

término do tratamento todos os animais foram pesados e sacrificados, e os tumores

retirados, dissecados e pesados. Foi realizada uma avaliação macroscópica dos tumores

(Dagli 1989).

O grupo controle foi tratado com o veículo empregado na diluição do extrato

(solução salina 0,9%), enquanto o grupo padrão recebeu o fármaco de referência

metotrexato (2,5 mg/kg) para o tratamento das respectivas linhagens tumorais.

A inibição tumoral foi calculada segundo a fórmula: TWI% = C – T/C x 100

TWI% = % de inibição tumoral C = média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle T = média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste

2.5 Avaliação Anatomo-Patológica

Camundongos Albinos Swiss fêmeas (Mus muscullus) pesando entre 25 a 30 g

foram divididos em dois grupos de 6 animais: tratado, onde receberam o extrato

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hidroalcóolico da planta e controle, onde receberam NaCl 0,9%. Após receberem anestesia

com éter sulfúrico (P.A.), os animais tratados com as doses 250, 125 e 62,5 mg/kg do

extrato hidroalcoólico das folhas de K.brasiliensis foram eutanasiados para a retirada dos

seguintes órgãos: rins, fígado, baço e pulmão. Foi realizada uma avaliação macroscópica

dos mesmos, onde foram observados aspectos quanto ao tamanho, coloração e consistência

(Dagli 1989).

2.6 Análises Estatísticas

Nas análises foi aplicado o teste t-student, análise Two-One, através do programa

Microcal Origin. O nível de significância para rejeição da hipótese foi p ≥ a 0,05. Os

valores foram expressos como média ± erro padrão da média (epm).

4. RESULTADOS

Na investigação fitoquímica pôde-se observar que foram revelados os flavonóides

em maior concentração. À presença de terpenos como ß-sitosterol foram constatados,

porém menos incidente que os primeiros (Tabela 1).

A taxa de inibição frente ao tumor Carcinoma de Ehrlich na maior dose (250 mg/kg)

apresentou aproximadamente 70% de inibição tumoral, enquanto que a menor (62,5 mg/kg)

apresentou 55,4% de inibição (Figura 1). Em relação ao tumor Sarcoma–180, as doses de

250 mg/kg e 62,5 mg/kg apresentaram ação antitumoral semelhante à linhagem acima, com

uma percentagem de 66,1% e 59,35%, respectivamente (Figura 2). O fármaco padrão,

metotrexato apresentou inibição superior a 90%.

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Apesar de ter havido uma relevante taxa de inibição nas doses do tratado, dos dados

referentes às médias dos pesos das duas linhagens de tumores estudadas, somente o grupo

tratado que recebeu a dose de 250 mg/kg do extrato da planta nos animais portadores do

tumor de Ehrlich é que foi diferente estatisticamente em relação ao grupo controle, como

mostra a Figura 3. Mas ambas as doses foram estatisticamente significante nos animais com

Sarcoma-180, como pode ser visto na Figura 4.

O percentual das taxas de inibição podem está correlacionados com avaliação

macroscópica quando percebemos que em Sarcoma-180 e Carcinoma de Ehrlich, as

respectivas doses de 250 e 62,5 mg/kg suscetibilizaram os tumores, com reduzidas

infiltrações, pontos hemorrágicos e delimitação na massa tumoral. Não foi observada

metástase nos órgãos avaliados para os dois tipos de tumores. Enquanto que no grupo

controle os tumores apresentaram-se invasivos e sem delimitação. Dados mostrados na

Tabela 2.

Em relação aos órgãos avaliados, o baço demonstrou hipotrofia enquanto que o

fígado apresentou coloração escurecida na maior dose e nos grupos controle e padrão, para

os dois tumores testados. Na menor dose não houve nenhuma alteração nos animais com o

tumor de Ehrlich, porém ocorreu esplenomegalia nos animais com Sarcoma.

5. DISCUSSÃO

Referente à espécie Kalanchoe brasiliensis não foram encontrados na literatura

estudos com avaliação de ação antitumoral. Porém, em outras espécies do gênero

verificaram-se inibição de células cancerígenas oriundas de tumores como carcinoma de

nasofaringe, inclusive em variantes de linhagens tumorais resistentes a drogas, além de

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cânceres de pulmão, ovário, próstata, íleo-cecal e de origem epidermoídes (Wu et al. 2006).

Estudos com outras espécies do gênero da planta em estudo, também demonstraram ação

inibitória sobre o vírus Epstein-barr que está fortemente relacionado com alguns tipos de

câncer (Supratman et al. 2001).

Dentre estes estudos de avaliação antitumoral supracitados foi observada uma forte

correlação de estrutura e atividade de heterosídeos cardiotônicos do tipo bufadienolideos,

com uma inibição in vitro de células tumorais de carcinoma de pulmão e carcinosarcoma de

Walker (Supratman et al. 2001). Kamano e colaboradores (2002) isolaram 74

bufadienolideos e derivados, e testaram os mesmos contra linhagens de carcinoma de

fígado em cultura in vitro, em que encontrou atividade antitumoral relevante.

De acordo com Costa e colaboradores, 1994, os bufadienólideos são característicos

da família Crassulaceae e também do gênero Kalanchoe (Wu et al. 2006), sugerindo

também serem encontrados em Kalanchoe brasiliensis. Em outro estudo de atividade

antineoplásica ficou comprovado que os mesmos compostos discutidos, isolados de

Kalanchoe pinnata, são potencialmente citotóxicos contra muitas linhagens tumorais

(Yamagishi et al. 1989).

Pesquisas têm descrito que um crescimento tumoral causa distúrbios em sistemas

antioxidantes, como uma inibição de enzimas chaves envolvidas neste processo (El-Din

2004). Corroborando com os resultados do perfil fitoquímico aqui realizado, compostos

fenólicos como os flavonóides são encontrados no gênero Kalanchoe (Costa et al. 1994;

Trevisan et al. 2006). Os flavonóides são reconhecidos por apresentar ação antioxidante e

promover uma estabilização genômica, com efeito, no reparo do DNA, inibindo a ação das

enzimas topoisomerases, as quais exercem papel primordial na transcrição e replicação do

DNA (Fergunson, 2001). Isto corrobora com a sua reconhecida propriedade

42

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anticarcinogênica, sugestivo de que estes compostos influenciaram na inibição tumoral

observada no atual estudo. Embora, os estudos anteriormente citados tenham sido

realizados in vitro, nossos resultados in vivo demonstraram uma positiva correlação com os

reportados na literatura ao descreverem atividade antitumoral referente a outras espécies do

Gênero de K. brasiliensis.

A diferença da ação do extrato frente às duas linhagens tumorais pode dever-se ao

fato de possuírem origem e fisiologia diferentes. Vale ressaltar que tumores do tipo

sarcomatosos são mais difíceis de tratar, isto por que ele afeta regiões como tecidos ósseos

e músculos (Almeida et al. 2005) e foi frente a este tipo tumoral que obtivemos uma melhor

ação do extrato, confirmando uma ação eficaz do extrato de K. brasiliensis como

anticarcinogênico.

Embora tenha havido um crescimento no baço dos animais portadores de Sarcoma-

180 tratados com o extrato, esse dado nos conduz a estudos histopatológicos para analisar a

origem da alteração, se foi devido ao tratamento com o extrato da planta ou devido ao

processo neoplásico, uma vez que ocorreram alterações nos órgãos dos animais do grupo

controle.

6. CONCLUSÃO

Os dados demonstraram que além da presença dos Flavonóides, o extrato

hidroetanólico de Kalanchoe brasiliensis possui propriedade antineoplásica em modelos

experimentais de Carcinoma de Erlich e Sarcoma-180, exclusivamente frente à linhagem

Sarcomatosa. Sugerindo uma relevante opção terapêutica contra neoplasias malignas.

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7. REFERÊNCIAS

Almeida VL, Reina LDCB, Montari CA 2005. Câncer e Agentes Antineoplásicos Ciclo-Celular específicos e Ciclo-celular não específicos que interagem com o DNA: Uma Introdução. Quím. Nova 28:118-129. Costa SS, Jossang A, Bodo B 1994. Patuletin acetylrhamnosides from Kalanchoe brasiliensis as inhibitors of human lymmphocyte proliferative activity. J Nat Prod, 57:1503-1510. Dagli MLZ 1989. Disseminação Linfática do Tumor de Ehrlich: Estudo Experimental. (Dissertação de Mestrado-Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia) USP. São Paulo. 148 p.

El-Din NKB 2004. Protective role of sanumgerman against y-irradiation-induced oxidative stress in Ehrlich Carcinoma-bearing mice. Nuttrit Res 24:271-291 Fergunson LR 2001. Role of plant polyphenols in genomic stability. Mutat Res 475:89-111 Harbone JB 1998. Phytochemical Methods. 3ªed., Chapman & Hall, London.

Kamano Y, Yamashita A, Nogawa T, Morita H, Takeya K, Itokawa H, Segava T, Yukita a, saito K, Katsuyama M, Pettit GR 2002. QSAR evalaution of the Ch’n Su and related Bufadienolides against the colchicine-resistant primary liver carcinoma cell line PLC/PRF/51. J Med chem. 45:5440-5447. Markham KR 1982. Techiniques of flavonoid identification. Academic Press, London.

Méjia EG, Castaño-Tostado E, Loarca-Piña G 1999. Antimutagenics effects of natural phenolic compounds in beans. Mut Research 41: 1-9. Neu R 1956. A New reagent for differentiating and determining flavones of paper chromatograms. Naturswissenschaften 43: 82 Newman DJ, Cragg GM, Snader KM 2000. The influence of natural upon drug discovery. Nat Prod Rep. 17:215-234. Newman DJ, Cragg GM, Snader KM 2003. Natural products as sources of New drugs over the period 1981-2002. J Nat Prod 66:1022-1037. Reddy L, Odhav B, Bhoola KD 2003. Natural products for cancer prevention: a global perspective. Pharmacol & Therap 99:1-13. Robertson EH, Cartwright RA, Wood J 1956.J Science Fodd Agr. 7:637-640. Sharma OP, Dawra RK 1991. Thin-layerchromagraphyc separations of lantadens, the pentacyclic triterpenoids from (Lantana câmara) plant. J Chrom 587: 351-354.

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Stock CC, Clarck DA, Philips FS, Barclay RK 1955. Sarcoma - 80 Inhibiton screening data. Cancer Res.2:2-3. Supratman U, Fujita T, Akiyama K, Hayashi H, Murakami A, Sakai H, Koshimizu K, Ohigashi H 2001. Anti-tumor promoting activity of bufadienolides from Kalanchoe pinnata and K.daigremontiana x K. tubiflora. Biosci Biotechnol Biochem 65:947-949. Trevisan TMS, Bezerra MZB, Santiago GMP, Feitosa CMF, Verpoort R, Filho RB 2006 Atividades Larvicida e Anticolinesterásica de plantas de gênero Kalanchoe. Quim Nova 29: 415-418. Yamagishi T, Haruna M, Yan XZ, Chang JJ, Lee KH 1989. Antitumor agents, 110. 1,2 Bryophyllin B, a novel potent cytotoxic bufadienolide from Bryophyllum pinnatum. J Nat Prod 52:1071-1079. Wu PL, Hsu YL, Wu TS, Bastow KF, Lee KH 2006. Kalanchosides A-D , New cytotoxic bufadienolides from the aerial parts of Kalanchoe gracilis. Org Lett 0: A-D. Wagner H & Bladt S 1996. Plant Drug Analysis–A thin layer chromatography atlas. Springer. 2ªed. Munich.

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97,9269,24

55,46

0

50

100 In

ibiç

ão T

umor

al

(%)

Inibição do Carcinoma de Erlich sob a ação de Kalanchoe brasiliensis Cambess

Padrão-Metrotexato

Tratado-kalanchoe brasiliensis (250mg/kg)

tratado-kalanchoe brasiliensis (62,5mg/Kg)

Figura 1. Representação da Taxa de Inibição (%) do tumor Carcinoma de Ehrlich, nos grupos: Padrão, com administração do metotrexato (10 mg/kg) e Tratado com extrato de das hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis, nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg por peso corpóreo.

100

66,14 59,35

0

50

100

Inib

ição

Tu

mor

al (%

)

Inibição do Sarcoma-180 sob a ação de Kalanchoe brasiliensis Cambess

Padrão-MetrotexatoTratado-Kalanchoe brasiliensis (250mg/Kg)Tratado-Kalanchoe brasiliensis (62,5mg/Kg)

Figura 2. Representação da Taxa de Inibição (%) do tumor Sarcoma-180, nos grupos: Padrão, com administração do metotrexato (10 mg/kg) e Tratado com o extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis nas doses 250 e 62,5 mg/kg por peso corpóreo por peso corpóreo.

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829,9

1863,66

0

500

1000

1500

2000

Méd

ia d

os p

esos

dos

Tum

ores

(m

g)

Controle Tratado 250mg/kg

Figura 3. Média dos pesos dos tumores de Carcinom(NaCl 0,9%) e grupo Tratado com extrato hidrbrasiliensis nas doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg. *Estatísticamente significante em relação ao controle com p (n=5/grupo)

1813,64

0

500

1000

1500

2000

Méd

ia d

os p

esos

dos

Tum

ores

(m

g)

Controle Tratado 250mg/k

Figura 4. Média dos pesos dos tumores de Sarcom0,9%) e Tratado com o extrato hidroetanólico das doses 250 mg/kg e 62,5 mg/kg por peso corpóreo. *Estatísticamente significante em relação ao controle com p (n=5/grupo)

*

573,1

Tratado 62,5mg/kg

a de Ehrlich para os Grupos Controle oetanólico das folhas de Kalanchoe

> 0,05% de confiança. Teste “t” de Student

5

g

af

>

*

37,64 5

Tratado

-180 para oolhas de K

0,05% de c

*

36,64

62,5mg/kg

s Grupos Controle (NaCl alanchoe brasiliensis, nas

onfiança. Teste “t” de Student

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Tabela 1 – Resultados dos metabólitos pesquisados no Extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess, com suas respectivas fases móveis e reveladores específicos.

(+) = positivo; (++) = presença moderada; (+++) = fortemente presente (-) = ausente

Metabólito Fase Móvel Revelador Resultados Referência

Alcalóides EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

Dragendorf - Wagner, 1996

Monoterpenóides, Sesquiterpenóides e Diterpenóides

Benzeno-AcOEt (97:3 v/v) Vanilina

Sulfúrica - Wagner, 1996

Triterpenóides, Esteróides

EtOAc- HCOOH- AcOH-H2O

(100:0,5:0,5:0,5 v/v)

Liebermann Burchard

(+) Sharma, 1991

Iridóides EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

Vanilina Sulfúrica - Harborne,

1998

Saponinas EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

Anisaldeído - Wagner, 1996

Derivados Cinâmicos EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

2 aminoetildifenil borinato

-

Markham, 1982 e Neu,

1956

Flavonóides EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

2 aminoetildifenil borinato

(+++)

Markham, 1982 e Neu,

1956

Proantocianidinas EtOAc-HCOOH-

AcOH-H2O (100:11:11:26 v/v

Vanilina cloridríca

- Wagner, 1996

Tabela 2. Descrição macroscópica dos tumores Carcinoma de Erlich e Sarcoma –180, nos grupos Controle, Padrão e Tratados com extrato das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess nas doses de 250 e 62,5 mg/kg de peso corpóreo de acordo com Dagli (1989) Substâncias Administradas Carcinoma de Erlich Sarcoma-180

GC- Salina (NaCl 0,9%) Tumor vascularizado, invasivo e expansivo

Tumor vascularizado, invasivo e expansivo

GP-Metrotrexato (10 mg/kg) Tumor com pontos hemorrágicos, formação de

ascite

Tumor com pontos hemorrágicos, formação de

ascite GT- Kb (250 mg/kg) Tumor esbranquiçado, sem

vascularização, e delimitado, não invasivo

Tumor não invasivo, pouco vascularizado, delimitado e

compacto GT- Kb (62,5 mg/kg) Tumor esbranquiçado, não

invasivo, pouca vascularização Tumor pálido, sem

vascularização, crescimento delimitado, não invasivo

GP=Grupo padrão; GT= Grupo tratado; Kb= Kalanchoe brasiliensis

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6-Artigo III____________________________________________________

Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia

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Atividade Inibitória das folhas e caule de Kalanchoe brasiliensis Cambess frente a microrganismos com diferentes perfis de resistência a

antibióticos

Jackeline G. da Silva1*, Maria do Socorro V. Pereira2, Ivone A. de Souza3

1,3Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Antibióticos, UFPE, Av. Arthur de Sá, S/N, Cidade Universitária, 50740-521-Recife/PE, Brasil

2Universidade Federal da Paraíba, Departamento de Biologia Molecular

RESUMO Este estudo reporta a avaliação antimicrobiana das folhas e caule de Kalanchoe brasiliensis Cambess, a qual é comumente utilizada para o tratamento de inflamações da mucosa oral, bronquites e congestão nasal. A Atividade antimicrobiana foi avaliada em discos de petri usando o método de difusão para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Cinética bactericida. Foram usadas amostras bacterianas gram-positivas e gram-negativas, e cepas de fungos leveduriformes do gênero Candida. Apenas o óleo essencial demonstrou ser efetivo apresentando halos de inibição de até 17 mm de diâmetro em amostras gram-positivas de Staphylococcus aureus meticilina resistente. Na curva bactericida houve a redução de um Log10 UFC/ml a partir da sexta hora de exposição da amostra ao óleo essencial nas concentrações de 4% e 8%. Estudos descrevem que fitoconstituintes como os compostos fenólicos, estão presentes em óleo essencial e que estes são ativos contra bactérias. Sugerimos que o efeito bacteriostático aqui observado se deve à presença desses compostos, uma vez que em Kalanchoe brasiliensis são encontrados. Por este motivo à planta Kalanchoe brasiliensis Cambess pode representar uma alternativa terapêutica para infecções provocadas por Staphylococcus aureus. Palavras-chave: antimicrobiano, Kalanchoe brasiliensis, Staphylococcus aureus.

_____________________________________________________________

Inhibitory activity the aerial parts of Kalanchoe brasiliensis Cambess

against microorganisms with variation profile antibiotic-resistant

ABSTRACT This study reports the antimicrobial evaluation of the Kalanchoe brasiliensis’ leaves and stem, which are commonly used for the treatment of inflammation of the oral mucosa, bronchitis and nasal congestion. The antimicrobial activity was assayed in Petri dishes using the diffusion method for determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) and the kill curve kinetic. Gram-positive and gram-negative strains and leveduriforms fungus strain classified in genus Candida were used. Only the essential oil showed to be

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effective in the 0,25% to 8% concentrations, with growth inhibition zones up to 17 mm in methicilin resistant Staphylococcus aureus samples. On the kill curve we observed the reduction of one Log10 CFU/mL after six hour of exposition of the sample under the 4% and 8% concentrations. There are studies reporting that polyphenols are present in essential oils and are active against bacteria. K. brasiliensis is rich in polyphenols, suggesting that this is the reason for the antimicrobial effect showed. For this reason, the plant Kalanchoe brasiliensis can represent a therapeutic alternative against infections caused for Staphylococcus aureus. Key-words: antimicrobial activity, Kalanchoe brasiliensis, Staphylococcus aureus. * Correspondência com o autor: Email: [email protected] 1.INTRODUÇÃO

A terapia antimicrobiana contra Staphylococcus aureus tem se tornado um grande

problema no tocante a infecções hospitalares, devido a freqüente resistência adquirida por

esse patógeno, desde a descoberta das penicilinas, e em seguida aos beta-lactâmicos. A

aquisição desses genes de resistência é facilitada pelo uso abusivo de drogas

antimicrobianas, e disseminados via plasmídio de resistência presentes em cepas de S.

aureus, como descrito por Stratton (2000). Isso se torna mais preocupante, porque S. aureus

tem a capacidade de desenvolver múltiplos mecanismos de resistência como: bomba de

efluxo, inativação de aminoglicosídios e modificação nas PBPs – Proteínas ligadoras de

penicilinas e uma alteração de extrema importância em PBP-2, que confere resistência a

todos os beta-lactâmicos originando cepas chamadas de S. aureus meticilina resistente

(MRSA) (Ito, 2003).

Por um longo período de tempo as plantas têm sido utilizadas como fonte de

produtos naturais em combate a várias enfermidades, e isso tem sido cada vez mais aceito

aqui no Brasil, segundo a (OMS) Organização mundial de saúde (Junior et al., 2005). A

busca de plantas com atividade antimicrobiana tem aumentado nas últimas décadas em

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muitos países devido a sua riqueza de constituintes, a exemplo, os compostos fenólicos

como os flavonóides os quais possuem potente ação antibacteriana (Cowan, 1999;

Nascimento et al., 2000).

A planta Kalanchoe brasiliensis, conhecida no nordeste brasileiro como saião e

coirama–branca, tem um largo uso na região para o tratamento de feridas, abscessos,

furúnculos e infecções genito-urinárias (Cunha et al., 1995). Outros estudos demonstram

ações farmacológicas como antiinflamatória, Imunomoduladora, larvicida e

anticolinesterásica (Mourão et al., 1999; Costa et al., 2006; Ibrahim et al., 2002; Trevisan et

al., 2006). Uma variedade de fitoconstituintes já foi revelada em K. brasiliensis como

flavonóides glicosilados e esteróides (Trevisan et al., 2006; Costa et al., 1994).

O presente trabalho objetivou avaliar a atividade antimicrobiana das partes aéreas

(folhas e caule) de Kalanchoe brasiliensis frente a amostras bacterianas gram-positivas e

gram-negativas resistentes e sensíveis a antibióticos e em amostras de fungos

leveduriformes do gênero Candida.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Obtenção do Material Botânico

Foram utilizadas as partes aéreas (folhas e caule) da planta, as quais foram

coletadas no horto medicinal do LTF (Laboratório de Tecnologia Farmacêutica) da UFPB.

A coleta foi realizada no início da floração, com a presença de brotos florais no dia 20 do

mês de setembro de 2005. A identificação da planta foi feita por M.B. Costa e Silva

(Exsicata IPA Nº 59725).

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2.2 Preparação do extrato, alcoolatura e óleo essencial

Extrato hidroalcóolico (EH): As folhas frescas foram pesadas e dessecadas por 72

horas em estufa à temperatura de 45ºC, maceradas a temperatura ambiente com álcool

etílico (90%). Em seguida o extrato foi submetido à filtração e rotaevaporação até obter-se

de uma concentração de 54,5 g do resíduo do extrato bruto para realização dos testes.

Alcoolatura (AA): foi utilizado 1 kg do caule da planta, o material foi macerado em

1 L de álcool etílico a 95% em um recipiente fechado em temperatura ambiente durante três

dias. Em seguida foi obtido um extrato fluido na proporção de 1:1 (Peso:Volume).

Óleo essencial (OE): Foi obtido a partir de 1,8 kg das folhas de K. brasiliensis e

extraído através de hidrodestilação em aparelho de Clevenger, obtendo-se um final de 0,4

mL. O óleo foi acondicionado em frasco âmbar fechado hermeticamente e mantido a

temperatura de 4ºC até a realização dos experimentos (Cunha, 2004).

2.3 Microrganismos

Foi utilizado um total de 22 microrganismos incluindo bactérias gram-positivas de

Staphylococcus aureus caracterizadas como sensíveis (MSSA) e resistentes a meticilina

(MRSA) (Freitas, 1992). Linhagens de Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,

Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Lactobacilos casei e bactérias gram-

negativas como Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Escherichia coli ATCC 25922,

Salmonela typhi ATCC 114028, Micrococcus luteus e Fungos leveduriformes do gênero

Candida, incluindo as espécies C. albicans ATCC 76645, C. tropicalis FCF-163, C.

parapsilis LM–10, Candida krusei 19, C. stellatóidea, C. guilliamondi LM-06. Os

microrganismos testados foram obtidos de pacientes internados no Hospital Universitário

Lauro Wanderley/UFPB. As linhagens ATCC 25923 e ATCC 65398 foram utilizadas como

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amostras de referência nos experimentos realizados com amostras gram-positivas (National,

1988). A linhagem ATCC 76645 de Candida albicans foi usada como referência nos

ensaios antifúngicos. As gram-negativas utilizadas foram todas amostras padrão.

2.4 Screening Antimicrobiano (Determinação da CIM)

A atividade antimicrobiana em placas foi determinada pelo método de difusão em

meio sólido para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato,

alcoolatura e o óleo essencial de Kalanchoe brasiliensis Cambess. Os microrganismos

foram cultivados em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion–DIFCO) e incubados a

37ºC por 18-20 horas. Dilui-se 0,1 µL do inóculo em 10 ml de salina (10-1), tal diluição foi

vertidas nas placas sendo estas postas para secarem entreabertas na estufa a 37º C por

aproximadamente 30 min. Após a retirada das placas, foram feitas perfurações no meio de

cultura (Agar Müeller Hinton – DIFCO) de aproximadamente 6mm de diâmetro com

ponteiras estéreis. Nos orifícios foi colocado um volume de 50µl da concentração mãe do

extrato e alcoolatura variando na diluição de 1:1 a 1:1024 (National, 1988). As soluções do

óleo essencial foram de 8%, 4.0, 2.0, 1.0, 0.5 e 0.25% (Allegrini et al., 1973). As placas

foram incubadas a 37ºC por um período de 24 horas para as cepas bacterianas, e 48 horas

para as amostras de fungos. Foi considerada como CIM a menor concentração da

substância que inibiu o crescimento do microrganismo, observado pela presença do halo de

inibição. O resultado foi considerado positivo, quando o produto testado apresentou halo de

inibição ≤ a 10mm de diâmetro. As drogas padrões utilizadas foram o antibiótico

Norfloxacina (10µg)–LABORCLIN e o antifúngico Cetoconazol para fungos. Como

controle negativo o álcool etanol (70%).

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2.5 Cinética Bactericida

A curva bactericida foi avaliada pelo método de Peyret et al. (1990). A amostra

selecionada foi cultivada em caldo nutritivo (Brain Heart Infusion – DIFCO) por 18 – 24

horas a 370 C, e subcultivadas em caldo Müeller Hinton (DIFCO). O volume de 1mL dos

produtos testados foi adicionado a 9 mL do subcultivo - tubo tratado; e ao tubo controle 1

mL de água esterilizada a 9mL do subcultivo. Em seguida os tubos foram mantidos na

estufa a 370 C e a cada 2 horas foram retiradas alíquotas de 100 µL das diluições dos tubos

controle e tratados, em seguida semeadas em Agar Müeller Hinton – DIFCO. A leitura das

placas foi efetuada pelo método padrão de contagem em placas, após 24h de incubação. E o

tempo de morte das bactérias foi expresso em Log10.

3. RESULTADOS

O resultado do screennig antimicrobiano demonstrou que o extrato hidroalcoólico

inibiu apenas duas amostras, porém, o óleo essencial de Kalanchoe brasiliensis apresentou

atividade em um número maior de amostras, sendo por este motivo o escolhido para a

cinética bactericida. Tal atividade foi observada em amostras gram-positivas de S. aureus,

incluindo amostras multiresistentes e sensíveis a meticilina, e o diâmetro dos halos

variaram de 10 a 17 mm, determinando dessa forma, a CIM do óleo essencial nas amostras

sensíveis ao mesmo como mostrado na Tabela I e Figura III. As amostras bacterianas do

gênero Streptococcus, as gram-negativas e os fungos do gênero Candida, não se mostraram

sensível às substâncias testadas.

No ensaio da curva bactericida foi avaliado o óleo essencial sobre a amostra de S.

aureus 10cc (MRSA) nas concentrações de 1%, correspondente a sua CIM e na

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concentração de 4%, duas vezes sua CIM. Frente à amostra padrão ATCC 6538 (MRSA)

foi avaliada a concentração de 8%. As curvas podem ser visualizadas nas Figuras I e II,

respectivamente.

A concentração de 1% do óleo essencial de Kalanchoe brasiliensis não inibiu a

amostra, apresentando uma curva de crescimento eqüitativo a curva controle. Na

concentração de 4% o início da inibição ocorreu a partir da sexta hora de exposição ao óleo

essencial com uma diminuição de um Log10 em UFC/mL, semelhante ao comportamento da

amostra padrão ATCC 6538 tratada na maior concentração (8%). Porém nessa

concentração, o óleo essencial inibiu em até 24 horas o crescimento bacteriano (Figura 1).

4. DISCUSSÃO

O interesse em estudos de plantas medicinais com atividade antimicrobiana vem

crescendo por dois motivos: primeiro por simbolizar muitas vezes o único recurso

terapêutico de muitas comunidades (Pinto et al., 2002; Souza et al., 2003) e segundo,

devido às opções para terapias antimicrobianas terem diminuído, motivo este inerente à

resistência adquirida naturalmente pelas bactérias, ou pelo uso indiscriminado de drogas

que aumenta largamente o número de cepas resistentes, tornando a multiresistência

preocupante e o futuro de drogas antimicrobianas incerto (May et al., 2000).

A qualidade anti-séptica de óleos essenciais é geralmente devida a grande mistura

de constituintes como terpenóides e hidrocarbonos (ácido, álcool, aldeídos), dos quais

fizeram fluir grande interesse na comunidade científica com investigações frente a

diferentes microrganismos (Dorman & Deans, 2000).

Segundo reportado por Dorman & Deans (2000), compostos fenólicos podem

apresentar atividade bacteriostática ou bactericida dependendo da sua concentração. De

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acordo com Nascimento et al., (2000) estes compostos estão presentes em óleos essenciais.

Em estudo prévio de avaliação fitoquímica por Stevens e colaboradores (1995) foi revelada

a presença de taninos condensados no gênero Kalanchoe, além da presença de flavonóides

constatada por Costa et al., (1994), podendo estes efeitos observados no presente estudo

serem devido à presença desses metabólitos secundários.

O efeito bacteriostático aqui demonstrado é relevante quando comparado à ação de

uma nova classe de antibióticos, Oxalinezolida e seu antibiótico avaliado AZD, o qual

apresentou efeito bacteriostático frente a amostras de S. aureus, em que Jones e

colaboradores (2002) consideraram atividade bacteriostática quando houve redução de até

dois Log10 CFU/ml comparado ao inóculo inicial, resultado semelhante ao observado pelo

OE nas amostras multiresistentes de S. aureus, aqui avaliadas.

Vale ressaltar que, a CIM apresentada variou entre as amostras devido ao diferente

perfil de resistência nelas presente, e que o aumento no crescimento bacteriano nas

concentrações 4% e 8% durante as duas primeiras horas de exposição da amostra ao óleo

essencial, pode dever-se ao fato de que o inóculo inicial para as mesmas foi maior na curva

do tratado, em comparação ao usado no controle.

O OE de K. brasiliensis não ter sido efetivo contra amostras gram-negativas, pode

ser em razão da diferente composição bioquímica na estrutura celular dessas bactérias em

comparação as gram-positivas, assim como descrito por Tortora (2000), discordando com a

proposição de Deans & Ritchie (1987) quando ressaltam que a ação antibacteriana de óleos

essenciais independe da reação de Gram (Dorman & Deans, 2000). À ação negativa sobre

as amostras de fungos corrobora com o estudo de Akinpelu (2000) em avaliação da

Kalanchoe pinnata, espécie pertencente ao mesmo gênero da planta aqui estudada, e com o

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estudo de Cunha et al., (1995) ao demonstrar que o extrato de K. brasiliensis formou um

halo de inibição frente a amostras de fungos, inferior ao aqui considerado como efetivo.

Os resultados descritos são muito interessantes pelo fato das amostras aqui

ensaiadas serem multiresistentes e terem sido isoladas de ambiente hospitalar, onde há um

difícil controle para infecções bacterianas.

5. CONCLUSÃO

Diante do exposto, pode-se concluir que a planta Kalanchoe brasiliensis não possui

ação antifúngica nas concentrações testadas, porém demonstra uma ação bacteriostática

sobre amostras de Staphylococcus aureus multiresistentes, representando mais uma

alternativa terapêutica para infecções com microrganismos que se apresentam resistentes a

antibióticos.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akinpelu DA 2000. Antimicrobial activity of Bryophyllum pinnatum leaves. Fitoterapia 71:193-194. Allegrini J, Bouchberg MS, Mailols H 1973. Emulsions d’huiles essentielles fabrication et applications en microbiologie. Societé de Pharmacie de Montpellier 33:73-86. Costa SS, Jossang A, Bodo B 1994. Patuletin acetylrhamnosides from Kalanchoe brasiliensis as inhibitors of human lymmphocyte proliferative activity. J Nat Prod 57:1503-1510. Costa SS, Souza MLM, IbrahimT, Melo GO, Almeida AP, Guette C, Férézou JP, Koatz VL 2006. kalanchosine Dimalate, an Anti-inflamatory salt from Kalanchoe brasiliensis. J Nat Prod 69:815-818. Cowan MM 1999. Plants Products as Antimicrobial Agents. Clin Microb Revwies 12: 564-582.

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Inibição De Kalanchoe brasiliensis Cambess

Zona de Inibição Diâmetro (mm) Concentração das Substâncias (mg/mL)

EHF EHF EHF AAC OE OE OE OE OE OE Nor

AMOSTRAS BACTERIANAS

1000 500 10 1000 8% 4% 2% 1% 0,5% 0,25% 10µg*S.aureus ATCC 65398 11 - - - 11 10 10 - - - 22*S.aureus 02Hu - - - - 11 10 - - - - 23*S.aureus 06 cc - - - - 12 11 10 - - - -*S.aureus 09 cc - - - - 11 10 - - - - 25*S.aureus 10 cc - - - - 13 12 11 10 - - 24*S.aureus 19 lab - - - - 15 15 14 13 11 10 -*S.aureus 119 lab - - - - 11 10 10 - - - 27*S.aureus 149 lab - - - - 12 11 10 - - - 26*S.aureus 171 cc - - - - 17 13 10 - - - 24*S.aureus 259 I 11 - - - 12 11 - - - - 25**S.aureus ATCC 25923 - - - - 11 11 - - - - -**S.aureus 05 cc - - - - 11 10 10 - - - 26**S.aureus 173 I - - - - - - - - - - NStreptococcus mitis - - - - - - - - - - NStreptococcus mutans - - - - - - - - - - NStreptococcus sanguis - - - - - - - - - - NStreptococcus sobrinos - - - - - - - - - - NLactobacilos casei - - - - - - - - - - N*** Micrococcus luteus - - - - - - - - - - 20***Salmonela typhi ATCC 14028 - - - - - - - - - - 21***Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 - - - - - - - - - - 23

Tabela I. Determinação da CIM (Concentração Inibitória Mínima) do extrato hidroetanólico e Óleo essencial das folhas, e da alcoolatura do caule de Kalanchoe brasiliensis frente a amostras bacterianas gram-positivas e gram-negativas.

MRSA = Amostras resistentes a meticilina; MSSA = Amostras sensíveis a meticilina; ATCC= American Type Culture Collection; *S.aureus =Staphylococcus aureus multiresistentes; ** S.aureus = Amostras sensíveis a meticilina; ***Amostras Gram-negativas; EHF = Extrato Hidroalcoólico defolhas; EAF = Extrato aquoso de folhas; AAC = Alcoolatura do caule; OEF = Óleo essencial das folhas; % = porcentagem do Óleo Essencial; mg/mL =Concentração do extrato N=amostras não testadas com Norfloxacina (-) Não formou halo de inibição

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Curva bacteriostática do Óleo essencial de K.brasiliensis frente amostra (10 cc) MRSA de Staphylococus aureus

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 24

Tempo (h)

Log

UFC

/ml

Controle T 1% T 4%

Figura 1. Representação da Curva de crescimento da amostra de Staphylococcus aureus 10 cc (MRSA) tratada com o Óleo Essencial das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess a 1% (CIM) e na concentração 4% (2x CIM).

Curva bacteriostática do Óleo Essencial de Kalanchoe brasiliensis frente a amostra ATCC 6538 (MRSA) de Staphylococcus aureus

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 24

Tempo (h)

Log

UFC

/ml

Controle Tratado

Figura 2. Representação da Curva de crescimento da amostra de Staphylococcus aureus ATCC 6538 (MRSA) tratada com o Óleo Essencial das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess na concentração de 8% (2x CIM)

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8%

4%1% 2%

0,25% 0,5%

Figura 3. Representação dos halos de inibição sobre a amostra 19L (MRSA) de Staphylococcus aureus tratada com Óleo essencial das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess.

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7. Conclusões______________________________

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7. CONCLUSÕES

O extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis Cambess

possui citotoxicidade in vitro, frente a larvas do microcrustáceo Artemia

salina, confirmada com a CL50 de 704,8 цg/mL.

O extrato quando administrado pela via intraperitoneal em camundongos

provoca reações estimulantes ao Sistema Nervoso Central, assim como,

efeitos depressores. Promove também, alteração no Sistema Nervoso

Autônomo com profundas mudanças na deambulação dos animais.

A administração de dose aguda do extrato hidroetanólico de K. brasiliensis

promove alterações ao nível dos Sistemas renal e respiratório em

camundongos fêmeas Albino Swiss.

A DL50 determinada em 1925 mg/kg de peso corpóreo confirma a toxicidade

moderada do extrato pela intraperitoneal (i.p.).

O extrato mostrou-se eficaz com uma relevante inibição do desenvolvimento

tumoral do Sarcoma-180 e Carcinoma de Ehrlich nas doses 250 mg/kg e

62,5 mg/kg de peso corpóreo.

O extrato hidroetanólico das folhas de Kalanchoe brasiliensis possui os

flavonóides como metabólitos secundários majoritários.

O óleo essencial das folhas de Kalanchoe brasiliensis tem um efeito

bacteriostático frente a amostras bacterianas caracterizadas quanto ao

fenótipo e ao genótipo como resistentes a diferentes antibióticos.

A planta não apresenta propriedade antifúngica nas doses testadas do extrato

e do óleo essencial das folhas e da alcoolatura do caule.

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8. Referências Bibliográficas___________________

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