Avaliao de Toxicidade de Extratos Vegetais

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1 Desenvolvimento de um mtodo alternativo ao uso de animais de laboratrio para avaliao da toxicidade de extratos vegetais WILLIAN BRULIO LOPES1,2, FBIO TONISSI MORONI1 , MARIA INS HOMSI BRANDEBURGO1 , AMLIA HAMAGUCHI1. As normas ticas internacionais recomendam o uso criterioso de animais de laboratrio e o desenvolvimento de mtodos experimentais alternativos. Artemia salina utilizada como indicador de toxicidade de substncias qumicas, pesticidas, poluentes e outros. Utilizando-se a concentrao letal mdia (CL 50) possvel determinar e avaliar a atividade biolgica (toxicidade) de um certo composto ou extrato natural. O presente trabalho visa padronizar e implementar um mtodo de avaliao da toxicidade de extratos vegetais, utilizando-se larvas de Artemia salina Leach. Os cistos de Artemia salina foram incubados em salina sinttica (35ppm) a temperatura de 28oC e estado de saturao de O2. aps 24 horas, os nuplios foram separados e incubados em salina sinttica por 24 horas nas mesmas condies. Em uma placa multidisch nunc, as larvas metanuplio (n=10), foram incubadas na presena dos extratos, em volume final de 5ml (triplicata) e mantidas por 24hr no escuro. As plantas coletadas na regio de Uberlndia-MG, foram trituradas em gua destilada, e os extratos liofilizados e ressuspendidos em gua deionizada (20mg/ml). A CL 50 dos extratos de Ginkgo biloba, Casearia mariquitensis, Tabebuia ocracea, Moringa oleifera, Mandevilla velutina e Casearia grandiflora foi determinada: >5,0; >4,0; >4,0; 4,0; 3,6 e 0,4mg/ml respectivamente. Dentre os solventes testados, na concentrao de 5% (v/v), tween 80=gua 5,0; > 4,0; 4,0; 3,6; and 0,4 mg/ml, respectively. The values of LC50 reflect the toxicant effects these extracts in Artemia salina. The increasing order of solvents toxicity is as follow: tween 80 = water < DMSO < ethanol < methanol. Financial Support: UFU, CAPES, FAPEMIG, CNPq Key words : Artemia salina , brine shrimp, natural extracts

3 INTRODUO As normas ticas internacionais com relao ao uso de animais de laboratrio recomendam o uso criterioso destes animais, e o desenvolvimento de mtodos alternativos tem ganhado Essas alternativas ou modos de

reproduo se referem a oviparidade, viviparidade, encistamento partenognese (diapausa), quando e as

condies ambientais so imprprias. Os indivduos adultos apresentam notvel dimorfismo adequadas, sexual e, em condies eclodir

evidncia nestes ltimos anos, Com este propsito, a padronizao e implantao do bioensaio com Artemia salina foi objeto deste trabalho, para posterior determinao da toxicidade de extratos naturais

possvel

simultaneamente as larvas em cultura. O custo da implantao e manuteno da cultura de Artemia salina muito baixo, o que faz desta, um excelente modelo experimental, utilizado nas mais diversas reas da biologia. Artemia salina amplamente conhecida como indicador de toxicidade em um bioensaio (Brine Shrimp Test), utilizando-se a Concentrao Letal Mdia (CL50) como parmetro de

manipulados nos laboratrios de pesquisa da Universidade Federal de Uberlndia. Artemia salina, um crustceo da classe Anostracea, que vive em guas salinas e salobras de todo o mundo. Possui 4 estgios de desenvolvimento (ovo, nuplio, metanuplio e adulto) e alguns mecanismos de adaptao que as tornam cosmopolitas, como a osmorregulao, a presena de pigmentos respiratrios como a hemoglobina e a disponibilidade de alternativas reprodutivas que facilitam a disperso e a perpetuao dessa espcie.

avaliao da atividade biolgica. crescente a utilizao de produtos naturais pela populao como alternativa no tratamento de diversas enfermidades. O estudo das possveis propriedades

farmacolgicas e seus efeitos txicos correspondentes imprescindvel. A flora

4 brasileira composta por uma infinidade de plantas detentoras de uma grande variedade de princpios ativos, Trypanosoma cruzi tambm est sendo investigada (Oliveira et al, 2000). O objetivo deste trabalho padronizar e implantar um mtodo de avaliao da toxicidade de extratos vegetais, utilizandose larvas de Artemia salina Leach.

responsveis pela atividade biolgica. A Mandevilla proveniente velutina do (Apocinaceae), cerrado, possui

componentes antiinflamatrios (Calixto et al., 1988) e anti-Trypanosoma cruzi (Silva & Hamaguchi, 1996). O gnero Casearia (Flacourtiaceae), conhecido por sua atividade antiofdica sobre peonhas das serpentes Bothrops moojeni (Caiaca) e Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca pintada) (Borges 1999). et al, Ginkgo 1998, biloba 2- MATERIAL E MTODOS I- Cultura de Artemia salina Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Produtos Naturais do INGEB/UFU. Em um aqurio de plstico, os cistos de Artemia salina (10mg/100ml) adquiridos no comrcio local, foram incubados em soluo marinha sinttica (60g sal marinho/litro gua destilada), sob iluminao artificial (lmpada de 40W), temperatura constante de 28oC e estado de saturao de oxignio conseguido com o auxlio de uma bomba de ar conectada ao fundo da garrafa (Fig 1). Aps 24 horas, a vlvula de oxignio foi fechada e a bomba desligada. O aqurio foi recoberto por papel alumnio deixando-se um pequeno

Kashiwabuchi,

possui propriedades antagonistas de PAF (Fator de Agregao Plaquetria), ao antioxidante livres), (proteo contra radicais e apresentar promissora

antimicrobiana alm de

imunoestimulante, propriedade

tripanomicida

( Silva et al, 2000). Moringa oleifera usada contra doenas de pele, sistema digestivo e respiratrio e antimalrica (Silva & Kerr, 1999), sua ao anti-

5 espao no fundo, onde era iluminado. Como as larvas (nuplio) tem afinidade pela luz, ou seja, apresentam fototropismo positivo, foi possvel separa-las dos cistos, abrindo-se a vlvula de controle de oxignio. As mesmas foram colocadas em um becker contendo soluo marinha sinttica (100ml) e mantidas em incubao por mais 24 horas, nas mesmas condies de luz e temperatura acima mencionadas. Aps este procedimento tm-se apenas o estgio de metanuplio (cultura pura) (Vinatea, 1994). O teste foi realizado apenas em cultura pura devido a maior sensibilidade aos tratamentos. II- Extratos vegetais Foram utilizados extratos de plantas coletadas na regio de Uberlndia -MG, sendo o representante herborizado e as excicatas armazenadas no Herbarium gua destilada, dimetilsulfxido (DMSO). Tween 80, metanol, etanol, concentrao de 5% (v/v). III- Bioensaio (BST) O bioensaio envolvendo Artemia salina consiste em avaliar a exposio de um determinado composto frente a esse crustceo. A anlise feita mediante o clculo da Concentrao Letal Mdia (CL50), ou seja, a concentrao que dizima metade de uma populao (Dolabela, 1997). O efeito txico dos extratos

naturais foi testado pelo mtodo de Meyer (1982) modificado para se adequar s condies de nosso laboratrio. Consistiu em dissolver as amostras em determinado solvente concentrao e aplica -las desejada nas conforme placas de

tratamento onde tambm foram colocadas 10 larvas de Artemia salina , em volume final de 5ml. O controle continha somente o solvente e as larvas. As placas contendo os grupos contr ole e tratamento, foram incubados no escuro a 25o C, sendo feita

Uberlandensis- UFU. As plantas foram trituradas, maceradas em gua destilada e, o extrato obtido, liofilizado e

ressuspendido em gua concentrao de 20mg/ml. Os solventes testados foram:

6 aps 24 horas a leitura do nmero de indivduos sobreviventes. Os valores de CL50- 24hr, cm limite de confiana de 95%, foram calculados de acordo com o mtodo de Litchifield e Wilcoxon (1949). dentre outras a soluo descrita por Dolabela (1997), composta por Cloreto de Sdio, Bicarbonato de Sdio, Sulfato de Magnsio em gua destilada. Nesta

soluo, a taxa de ecloso dos cistos foi muito baixa (em torno de 10%), os melhores resultados foram obtidos com a soluo descrita por Meyer (1982), que consiste em utilizar sal marinho sinttico (35ppm) e cistos e alta ecloso (adquiridos da empresa Maramar). Com iluminao, temperatura e oxigenao adequadas, foi possvel reproduzir as condies

Fig 1: Esquema do aqurio utilizado para ecloso dos cistos de Artemia salina (Reproduzido de Lindefelser, 1999).

ambientais timas para Artemia salina obtendo-se altos ndices de ecloso e sobrevivncia. Uma vez padronizado o mtodo de cultivo da Artemia salina , a

RESULTADOS E DISCUSSO A primeira etapa deste trabalho envolveu a escolha de uma soluo de cultivo das larvas de Artemia salina que possibilitasse maior taxa de ecloso dos cistos e que viabilizasse a sobrevivncia de pelo menos 95% dessas larvas nas

toxicidade de alguns extratos vegetais utilizados em nosso laboratrio, foi

determinada. A extrao de princpios ativos de vrias origens pode ser realizada

utilizando-se diferentes solvente s. Dentre os solventes testados em Artemia salina (Fig 2), gua e tween 80 se comportaram

condies do bioensio. Foram testadas

7 como atxicos (100% de sobrevivncia), DMSO foi moderadamente txico e etanol, seguido pelo metanol foram altamente txicos, chegando a 100% de mortalidade concentrao de 5% (v/v). Dolabela (1997) encontrou resultados semelhantes para toxicidade de etanol e metanol, reforando a credibilidade do mtodo e de nossas condies experimentais.% larvas sobreviventes 100 80 60 40 20 0 1 DMSO GUA 2 3 4 5 Concentrao (%v/v) ETANOL METANOL TWEEN 80

de A. salina enquanto o tween 80 exibiu 100% sobrevivncia. Dolabela (1997) em seus estudos, estabeleceu critrio de classificao dos extratos hidroetanlicos com base nos nveis de CL50 em Artemia salina, a saber: CL 50250/ml, com baixa toxicidade ou no txicos. Dos extratos vegetais investigados no presente trabalho, grande parte

apresentou CL50 entre 4 e 5 mg/ml (Tabela 1) portanto, de acordo com a classificao anteriormente citada, seriam considerados pouco txicos ou atxicos.

Fig 2: Toxicidade aguda de alguns solventes em larvas (metanuplio) de Artemia salina. Os solventes tween 80 e gua no causaram letalidade em larvas de A. salina na concentrao de 5% (v/v). No entanto, em outro experimento realizado,

Dolabela (1997) ainda estabeleceu uma correlao entre o limite de toxicidade para Artemia salina com a ao antiTrypanosoma cruzi, onde a maioria dos extratos com esta ao, exibiam toxicida de moderada. entretanto, No para foram encontrados velutina,

Mandevilla

concentrao de 20% (v/v), gua provocou a mortalidade de cerca de 30% das larvas

Ginkgo biloba e Moringa oleifera, valores dentro deste limite. Dentre os extratos

8 testados, o de Moringa oleifera manifestou menor toxicidade, enquanto o de Casearia grandiflora foi o mais txico (Fig 3). presente trabalho (CL50 > 4mg/ml), com o extrato hidroetanlico de Tabebuia urea (CL50 = 0,012mg/ml), estabelecida p Dolabela (1997) reforam-se os resultados% larvas sobreviventes 100 75 50 25 0 GW GA Tratamentos GB

que sugerem variaes de toxicidade dentro de um mesmo gnero. Tabela 1: Toxicidade aguda de extratos vegetais em Artemia salina.

Fig 3: Perfil txico do extrato aquoso deNome Famlia Nome comum Estgio larval Parte CL50

Casearia

grandiflora

em

larvas

cientfico

usada (mg/ml)

(metanuplio) de Artemia salina. GW: Controle; GA: Tratamento com 0,4mg/ml de extrato aquoso de Casearia grandiflora; GB: Tratamento com 1,25 mg/ml de extrato aquoso de Casearia grandiflora. O gnero Casearia apresentou diferena de toxicidade entre as espcies testadas, Casearia mariquitensis (CL50: > 4,0

Casearia mariquitensis Ginkgo biloba Mandevilla. velutina Casearia grandiflora Tabebuia ocracea Moringa oleifera

Flacourtiace Ginkgoacera

Limo zinho Ginkgo biloba

Nuplio Nuplio

Folha Folha

>4,0 >5,0

Apocinaceae

Batatabrava

Nuplio

Raiz

3,6

Flacourtiace Bignoniacea

... Ipamarelo

Nuplio Meta Meta

Folha Folha Folha

> 0,4 >4,0 4,0

Moringaceae Moringa

Estes

resultados

refletem

a

mg/ml) e Casearia grandiflora (CL 50: 0,4mg/ml). Por sua vez, Jamal et al (1998) determinaram a toxicidade de Casearia sylvestris em Artemia salina (CL50 = 10,7 mg/ml). Comparando-se a toxicidade do extrato aquoso de Tabebuia ocracea do

importncia da utilizao desse crustceo na deteco de substncias bioativas. Extratos vegetais so amplamente

utilizados pela populao e, portanto, o estudo da letalidade destes extratos sobre

9 bioindicadores como Artemia salina indiscutivelmente necessrio. CONCLUSO Artemia salina se apresentou como AGRADECIMENTOS Agradecemos a Profa Dra. Ana Anglica Almeida Barbosa do INBIO/UFU pela identificao e classificao da maioria das espcies utilizadas. substncias cientfico. sem rigor, nem critrio

excelente indicador de toxicidade alm de constituir um teste simples e de baixo custo. testados Os diversos extratos diferente vegetais grau de

exibiram

toxicidade, provavelmente relacionado composio qumica dos extratos REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BORGES, H.M., et al. Effects of aqueous extract of Casearia sylvestris

biologicamente ativos. A escala crescente de toxicidade dos extratos relacionada a seguir: Ginkgo < biloba Moringa < Casearia oleifera

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