1

Desenvolvimento de um método alternativo ao uso de animais de laboratório para

avaliação da toxicidade de extratos vegetais

WILLIAN BRÁULIO LOPES1,2, FÁBIO TONISSI MORONI1, MARIA INÊS HOMSI

BRANDEBURGO1, AMÉLIA HAMAGUCHI1.

As normas éticas internacionais recomendam o uso criterioso de animais de

laboratório e o desenvolvimento de métodos experimentais alternativos. Artemia salina é

utilizada como indicador de toxicidade de substâncias químicas, pesticidas, poluentes e

outros. Utilizando-se a concentração letal média (CL50) é possível determinar e avaliar a

atividade biológica (toxicidade) de um certo composto ou extrato natural. O presente trabalho

visa padronizar e implementar um método de avaliação da toxicidade de extratos vegetais,

utilizando-se larvas de Artemia salina Leach. Os cistos de Artemia salina foram incubados em

salina sintética (35ppm) a temperatura de 28oC e estado de saturação de O2. após 24 horas, os

náuplios foram separados e incubados em salina sintética por 24 horas nas mesmas condições.

Em uma placa multidisch nunc, as larvas metanáuplio (n=10), foram incubadas na presença

dos extratos, em volume final de 5ml (triplicata) e mantidas por 24hr no escuro. As plantas

coletadas na região de Uberlândia-MG, foram trituradas em água destilada, e os extratos

liofilizados e ressuspendidos em água deionizada (20mg/ml). A CL50 dos extratos de Ginkgo

biloba, Casearia mariquitensis, Tabebuia ocracea, Moringa oleifera, Mandevilla velutina e

Casearia grandiflora foi determinada: >5,0; >4,0; >4,0; 4,0; 3,6 e 0,4mg/ml respectivamente.

Dentre os solventes testados, na concentração de 5% (v/v), tween 80=água <DMSO< etanol <

metanol. A.salina se apresentou como excelente indicador de toxicidade além de constituir um

teste simples de baixo custo. Apoio Finance iro : UFU, CAPES, FAPEMIG

Palavra chave: Artemia salina, brine shrimp, extratos naturais.

1Instituto de Genética e Bioquímica/Universidade Federal de Uberlândia/Av. Pará,1720, Umuarama, Uberlândia-MG, CEP:38400-662/ 2Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/UFU, a quem as correspondências devem ser enviadas: wlopes@hotmail.com

2

ABSTRACT Development of a alternative method to uso laboratory animals for avaliation of toxicity

of natural extracts.

The international ethics law recommend the criterious use of laboratory animals and

development of alternative experimental methods. Artemia salina is a biological indicator of

toxicity of chemical substances, pesticides and poluents. Lethal median concentration (LC50)

is indicate to determine and evaluate toxicity of natural extracts. This work aim to standard

and implant a method of toxicity evaluation of natural extracts, using Artemia salina larvae

Leach. Artemia salina cysts were incubated in synthetic seawater (35ppm) for about 24hr, at

28oC, with continuous side ilumination (40W lamp) and low aeration. The nauplii produced

were separated and transferred to becker containing 100ml of synthetic seawater, and

maintained for another 24hr. For toxicity testing, samples of 10 larvae (metanauplii) each

were added to 5ml of synthetic seawater in plastic 3,5cm nunc multidish containing the

appropriate concentration on extract and maintained for 24hr in the dark (triplicate). The

plants colected from Uberlândia - Minas Gerais, were triturated in distille d water, liofilizated

and solubilized in water (20mg/ml). The LC50 of Ginkgo biloba, Casearia mariquitensis,

Tabebuia ocracea, Moringa oleifera, Mandevilla velutina e Casearia grandiflora extract is as

follow: > 5,0; > 4,0; 4,0; 3,6; and 0,4 mg/ml, respectively. The values of LC50 reflect the

toxicant effects these extracts in Artemia salina. The increasing order of solvents toxicity is as

follow: tween 80 = water < DMSO < ethanol < methanol. Financial Support: UFU, CAPES,

FAPEMIG, CNPq

Key words : Artemia salina , brine shrimp, natural extracts

3

INTRODUÇÃO

As normas éticas internacionais

com relação ao uso de animais de

laboratório recomendam o uso criterioso

destes animais, e o desenvolvimento de

métodos alternativos tem ganhado

evidência nestes últimos anos, Com este

propósito, a padronização e implantação do

bioensaio com Artemia salina foi objeto

deste trabalho, para posterior determinação

da toxicidade de extratos naturais

manipulados nos laboratórios de pesquisa

da Universidade Federal de Uberlândia.

Artemia salina, é um crustáceo da

classe Anostracea, que vive em águas

salinas e salobras de todo o mundo. Possui

4 estágios de desenvolvimento (ovo,

náuplio, metanáuplio e adulto) e alguns

mecanismos de adaptação que as tornam

cosmopolitas, como a osmorregulação, a

presença de pigmentos respiratórios como

a hemoglobina e a disponibilidade de

alternativas reprodutivas que facilitam a

dispersão e a perpetuação dessa espécie.

Essas “alternativas” ou modos de

reprodução se referem a oviparidade,

viviparidade, partenogênese e

encistamento (diapausa), quando as

condições ambientais são impróprias. Os

indivíduos adultos apresentam notável

dimorfismo sexual e, em condições

adequadas, é possível eclodir

simultaneamente as larvas em cultura. O

custo da implantação e manutenção da

cultura de Artemia salina é muito baixo, o

que faz desta, um excelente modelo

experimental, utilizado nas mais diversas

áreas da biologia. Artemia salina é

amplamente conhecida como indicador de

toxicidade em um bioensaio (Brine Shrimp

Test), utilizando-se a Concentração Letal

Média (CL50) como parâmetro de

avaliação da atividade biológica.

É crescente a utilização de produtos

naturais pela população como alternativa

no tratamento de diversas enfermidades. O

estudo das possíveis propriedades

farmacológicas e seus efeitos tóxicos

correspondentes é imprescindível. A flora

4

brasileira é composta por uma infinidade

de plantas detentoras de uma grande

variedade de princípios ativos,

responsáveis pela atividade biológica. A

Mandevilla velutina (Apocinaceae),

proveniente do cerrado, possui

componentes antiinflamatórios (Calixto et

al., 1988) e anti-Trypanosoma cruzi (Silva

& Hamaguchi, 1996). O gênero Casearia

(Flacourtiaceae), é conhecido por sua

atividade antiofídica sobre peçonhas das

serpentes Bothrops moojeni (Caiçaca) e

Bothrops neuwiedi pauloensis (jararaca

pintada) (Borges et al, 1998,

Kashiwabuchi, 1999). Ginkgo biloba

possui propriedades antagonistas de PAF

(Fator de Agregação Plaquetária), ação

antioxidante (proteção contra radicais

livres), antimicrobiana e

imunoestimulante, além de apresentar

propriedade tripanomicida promissora

( Silva et al, 2000). Moringa oleifera é

usada contra doenças de pele, sistema

digestivo e respiratório e antimalárica

(Silva & Kerr, 1999), sua ação anti-

Trypanosoma cruzi também está sendo

investigada (Oliveira et al, 2000). O

objetivo deste trabalho é padronizar e

implantar um método de avaliação da

toxicidade de extratos vegetais, utilizando-

se larvas de Artemia salina Leach.

2- MATERIAL E MÉTODOS

I- Cultura de Artemia salina

Os experimentos foram realizados

no Laboratório de Produtos Naturais do

INGEB/UFU.

Em um aquário de plástico, os

cistos de Artemia salina (10mg/100ml)

adquiridos no comércio local, foram

incubados em solução marinha sintética

(60g sal marinho/litro água destilada), sob

iluminação artificial (lâmpada de 40W),

temperatura constante de 28oC e estado de

saturação de oxigênio conseguido com o

auxílio de uma bomba de ar conectada ao

fundo da garrafa (Fig 1). Após 24 horas, a

válvula de oxigênio foi fechada e a bomba

desligada. O aquário foi recoberto por

papel alumínio deixando-se um pequeno

5

espaço no fundo, onde era iluminado.

Como as larvas (náuplio) tem afinidade

pela luz, ou seja, apresentam fototropismo

positivo, foi possível separa-las dos cistos,

abrindo-se a válvula de controle de

oxigênio. As mesmas foram colocadas em

um becker contendo solução marinha

sintética (100ml) e mantidas em incubação

por mais 24 horas, nas mesmas condições

de luz e temperatura acima mencionadas.

Após este procedimento têm-se apenas o

estágio de metanáuplio (cultura pura)

(Vinatea, 1994). O teste foi realizado

apenas em cultura pura devido a maior

sensibilidade aos tratamentos.

II- Extratos vegetais

Foram utilizados extratos de plantas

coletadas na região de Uberlândia -MG,

sendo o representante herborizado e as

excicatas armazenadas no Herbarium

Uberlandensis- UFU. As plantas foram

trituradas, maceradas em água destilada e,

o extrato obtido, liofilizado e

ressuspendido em água à concentração de

20mg/ml. Os solventes testados foram:

água destilada, dimetilsulfóxido (DMSO).

Tween 80, metanol, etanol, à concentração

de 5% (v/v).

III- Bioensaio (BST)

O bioensaio envolvendo Artemia

salina consiste em avaliar a exposição de

um determinado composto frente a esse

crustáceo. A análise é feita mediante o

cálculo da Concentração Letal Média

(CL50), ou seja, a concentração que dizima

metade de uma população (Dolabela,

1997).

O efeito tóxico dos extratos

naturais foi testado pelo método de Meyer

(1982) modificado para se adequar às

condições de nosso laboratório. Consistiu

em dissolver as amostras em determinado

solvente e aplica -las conforme

concentração desejada nas placas de

tratamento onde também foram colocadas

10 larvas de Artemia salina , em volume

final de 5ml. O controle continha somente

o solvente e as larvas. As placas contendo

os grupos controle e tratamento, foram

incubados no escuro a 25oC, sendo feita

6

após 24 horas a leitura do número de

indivíduos sobreviventes. Os valores de

CL50- 24hr, cm limite de confiança de

95%, foram calculados de acordo com o

método de Litchifield e Wilcoxon (1949).

Fig 1: Esquema do aquário utilizado para

eclosão dos cistos de Artemia salina

(Reproduzido de Lindefelser, 1999).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A primeira etapa deste trabalho

envolveu a escolha de uma solução de

cultivo das larvas de Artemia salina que

possibilitasse maior taxa de eclosão dos

cistos e que viabilizasse a sobrevivência de

pelo menos 95% dessas larvas nas

condições do bioensio. Foram testadas

dentre outras a solução descrita por

Dolabela (1997), composta por Cloreto de

Sódio, Bicarbonato de Sódio, Sulfato de

Magnésio em água destilada. Nesta

solução, a taxa de eclosão dos cistos foi

muito baixa (em torno de 10%), os

melhores resultados foram obtidos com a

solução descrita por Meyer (1982), que

consiste em utilizar sal marinho sintético

(35ppm) e cistos e alta eclosão (adquiridos

da empresa Maramar). Com iluminação,

temperatura e oxigenação adequadas, foi

possível reproduzir as condições

ambientais ótimas para Artemia salina

obtendo-se altos índices de eclosão e

sobrevivência. Uma vez padronizado o

método de cultivo da Artemia salina , a

toxicidade de alguns extratos vegetais

utilizados em nosso laboratório, foi

determinada.

A extração de princípios ativos de

várias origens pode ser realizada

utilizando-se diferentes solvente s. Dentre

os solventes testados em Artemia salina

(Fig 2), água e tween 80 se comportaram

7

como atóxicos (100% de sobrevivência),

DMSO foi moderadamente tóxico e etanol,

seguido pelo metanol foram altamente

tóxicos, chegando a 100% de mortalidade

á concentração de 5% (v/v). Dolabela

(1997) encontrou resultados semelhantes

para toxicidade de etanol e metanol,

reforçando a credibilidade do método e de

nossas condições experimentais.

Fig 2: Toxicidade aguda de alguns

solventes em larvas (metanáuplio) de

Artemia salina.

Os solventes tween 80 e água não

causaram letalidade em larvas de A. salina

na concentração de 5% (v/v). No entanto,

em outro experimento realizado, à

concentração de 20% (v/v), água provocou

a mortalidade de cerca de 30% das larvas

de A. salina enquanto o tween 80 exibiu

100% sobrevivência.

Dolabela (1997) em seus estudos,

estabeleceu critério de classificação dos

extratos hidroetanólicos com base nos

níveis de CL50 em Artemia salina, a saber:

CL50<80µg/ml, altamente tóxicos; CL50

entre 80µg/ml e 250µg/ml,

moderadamente tóxicos; e CL50>250/ml,

com baixa toxicidade ou não tóxicos.

Dos extratos vegetais investigados

no presente trabalho, grande parte

apresentou CL50 entre 4 e 5 mg/ml (Tabela

1) portanto, de acordo com a classificação

anteriormente citada, seriam considerados

pouco tóxicos ou atóxicos.

Dolabela (1997) ainda estabeleceu

uma correlação entre o limite de toxicidade

para Artemia salina com a ação anti-

Trypanosoma cruzi, onde a maioria dos

extratos com esta ação, exibiam toxicida de

moderada. Não foram encontrados

entretanto, para Mandevilla velutina,

Ginkgo biloba e Moringa oleifera, valores

dentro deste limite. Dentre os extratos

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5

Concentração (%v/v)

% la

rvas

sob

revi

vent

es

DMSO ETANOL METANOLÁGUA TWEEN 80

8

testados, o de Moringa oleifera manifestou

menor toxicidade, enquanto o de Casearia

grandiflora foi o mais tóxico (Fig 3).

Fig 3: Perfil tóxico do extrato aquoso de

Casearia grandiflora em larvas

(metanáuplio) de Artemia salina.

GW: Controle; GA: Tratamento com

0,4mg/ml de extrato aquoso de Casearia

grandiflora; GB: Tratamento com 1,25

mg/ml de extrato aquoso de Casearia

grandiflora.

O gênero Casearia apresentou diferença de

toxicidade entre as espécies testadas,

Casearia mariquitensis (CL50: > 4,0

mg/ml) e Casearia grandiflora (CL50:

0,4mg/ml). Por sua vez, Jamal et al (1998)

determinaram a toxicidade de Casearia

sylvestris em Artemia salina (CL50 = 10,7

mg/ml). Comparando-se a toxicidade do

extrato aquoso de Tabebuia ocracea do

presente trabalho (CL50 > 4mg/ml), com o

extrato hidroetanólico de Tabebuia áurea

(CL50 = 0,012mg/ml), estabelecida pó

Dolabela (1997) reforçam-se os resultados

que sugerem variações de toxicidade

dentro de um mesmo gênero.

Tabela 1: Toxicidade aguda de extratos

vegetais em Artemia salina.

Nome

científico

Família

Nome

comum

Estágio

larval

Parte

usada

CL50

(mg/ml)

Casearia

mariquitensis

Flacourtiace

Limão

zinho

Náuplio

Folha

>4,0

Ginkgo

biloba

Ginkgoacera Ginkgo

biloba

Náuplio Folha >5,0

Mandevilla.

velutina

Apocinaceae Batata-

brava

Náuplio Raiz 3,6

Casearia

grandiflora

Flacourtiace ... Náuplio Folha > 0,4

Tabebuia

ocracea

Bignoniacea Ipê-

amarelo

Meta Folha >4,0

Moringa

oleifera

Moringaceae Moringa Meta Folha 4,0

Estes resultados refletem a

importância da utilização desse crustáceo

na detecção de substâncias bioativas.

Extratos vegetais são amplamente

utilizados pela população e, portanto, o

estudo da letalidade destes extratos sobre

0

2 5

5 0

7 5

100

% la

rvas

so

bre

vive

nte

s

GW GA GB

Tratamentos

9

bioindicadores como Artemia salina é

indiscutivelmente necessário.

CONCLUSÃO

Artemia salina se apresentou como

excelente indicador de toxicidade além de

constituir um teste simples e de baixo

custo. Os diversos extratos vegetais

testados exibiram diferente grau de

toxicidade, provavelmente relacionado à

composição química dos extratos

biologicamente ativos. A escala crescente

de toxicidade dos extratos é relacionada a

seguir: Ginkgo biloba < Casearia

mariquitensis < Moringa oleifera <

Tabebuia ocracea<Mandevilla velutina<

Casearia grandiflora. Dentre os solventes,

Tween 80 = Água < DMSO < Etanol <

Metanol, à concentração de 5%. As

propriedades farmacológicas desses

extratos devem ser compreendidas e seus

efeitos tóxicos correspondentes

determinados, a fim de se evitar a

utilização indiscriminada destas

substâncias sem rigor, nem critério

científico.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Profa Dra. Ana Angélica

Almeida Barbosa do INBIO/UFU pela

identificação e classificação da maioria das

espécies utilizadas.

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