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COLEGIADO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DE SONDAS FENAZÍNICAS FLUORESCENTES PARA INVESTIGAÇÃO DO
MECANISMO DE AÇÃO DE DROGAS COM ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA
Rodrigo Bretas Ferreira
Rio de Janeiro
2009
ii
RODRIGO BRETAS FERREIRA
Aluno do Curso de Biotecnologia Matrícula 0613800136
AVALIAÇÃO DE SONDAS FENAZÍNICAS FLUORESCENTES
PARA INVESTIGAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DROGAS
COM ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA
Trabalho de Conclusão de Curso,
TCC, apresentado ao Curso de
Graduação em Biotecnologia da
UEZO como parte dos requisitos para
a obtenção do grau em Biotecnólogo,
sob a orientação do Profo Dr o Carlos
Eduardo Martins Carvalho.
Rio de Janeiro
Julho de 2009
iii
iv
Dedico este trabalho a minha família
pelo apoio, carinho e compreensão
que me foram dedicados durante toda
a minha vida, e especialmente durante
a minha graduação. Os quais foram
fundamentais tanto para a minha
formação pessoal quanto acadêmica.
v
Agradecimentos
Ao Prof.Dr. Carlos Eduardo Martins Carvalho pela amizade e orientação
deste trabalho.
Aos meus pais e irmã pelo apoio incondicional dado em todos os
momentos de minha vida.
Ao amigo e companheiro de laboratório Caio Bruno Rocha Mendonça
pela imprescindível ajuda em todos os momentos
Ao amigo e companheiro de laboratório Tiago Teixeira Guimarães que
foi de relevante importância para a realização deste trabalho.
Aos meus amigos da turma de Biotecnologia da UEZO pelo
companheirismo.
Á Profa. Dra. Nanci do Laboratório de Fotoquímica IQ/UFRJ por conceder
acesso ao laboratório de Fotoquímica permitir que o presente trabalho pudesse
ser realizado.
Ao NPPN pelos corantes usados neste estudo.
Aos Técnicos Leonice e Claudio do Laboratório de Instrumentos e
Pesquisa IQ/UFRJ pelas pesagens.
À FAPERJ pela bolsa de estudos concedida.
A toda a comunidade de Fotoquímica IQ/UFRJ.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................vii
LISTA DE QUADROS..........................................................................................viii
LISTA DE TABELAS...........................................................................................viii
RESUMO................................................................................................................ix
Abstract..................................................................................................................x
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
1.1. SONDAS MOLECULARES ......................................................................... 2
1.2. QUINONAS ................................................................................................. 4
1.3. NAFTOQUINONAS ..................................................................................... 6
1.4. SONDAS FENAZÍNICAS ............................................................................ 8
2. OBJETIVO ........................................................................................................ 10
3. METODOLOGIA ............................................................................................... 11
3.1. SÍNTESE DOS COMPOSTOS .................................................................. 11
3.2. ESTUDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA ............................................ 13
3.2.1 ABSORÇÃO MOLECULAR DE RADIAÇÃO ............................ ............ 14
3.2.2 RENDIMENTO QUÂNTICO ................................................................. 15
3.2.3 TRANFERÊNCIA DE ENERGIA: STERN-VOLMER ............................ 16
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 17
4.1. EFEITO DO SOLVENTE NO ESPECTRO DE FLUORESCÊNCIA .......... 17
4.2. ABSORTIVIDADES MOLARES .................................................................19
4.3. RENDIMENTO QUÂNTICO ...................................................................... 21
4.4. TRANFERÊNCIA DE ENERGIA: STERN-VOLMER ................................. 23
4.5. DESEMPENHO EM MISTURAS BINÁRIAS ............................................. 28
5. CONCLUSÃO ................................................................................................... 31
6. PERSPECTIVAS ............................................................................................... 32
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 33
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.. Diagrama de Jablonski ........................................................................... 2
Figura 2. Isômeros de posição de naftoquinonas ................................................... 5
Figura 3. Estrutura planar do Lapachol e da β-Lapachona.....................................7
Figura 4. Estrutura do núcleo fenazínico e mapa da densidade total de
carga....................................................................................................................... 8
Figura 5. Estrutura dos corantes fenazínicos estudados........................................9
Figura 6. Espectros de fluorescência normalizados do corante PZ(CH3) ............. 18
Figura 7. Transferência de energia....................................................................... 24
Figura 8. Gráfico de supressão da fluorescência referente ao corante PZ6 em
2-propanol ............................................................................................................. 25
Figura 9. Gráfico de supressão de fluorescência referente ao corante PZ6 em
Dioxano ................................................................................................................. 25
Figura 10. Gráfico de supressão de fluorescência referente ao corante PZ6 em
Acetonitrila............................................................................................................. 26
viii
Figura 11. Gráfico de Stern-Volmer de PZ6 em Acetonitrila. ................................ 27
Figura 12. Gráfico de Stern-Volmer de PZr em Dioxano ...................................... 27
Figura 13. Gráfico do PZ6 em solução binária de água e 2-propanol. ................. 21
Figura 14. Corante PZr em sua forma normal e tautomérica ...................................... 21
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Esquema da síntese da β-lapachona...................................................11
Quadro 2. Esquema da síntese das sondas fenazínicas ....................................12
Quadro 3. Fator de polaridade (Δf) dos solventes estudados...............................17
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Coeficientes de absortividade molar dos corantes................................19
Tabela 2. Valor do rendimento quântico de fluorescência ....................................22
Tabela 3. Efeito da polaridade dos solventes no coeficiente de supressão (K) .... 27
ix
Resumo
O presente trabalho refere-se ao estudo de fenazinas derivadas de
naftoquinonas quanto as suas características fotofísicas para serem utilizadas
como sondas fluorescentes para investigação do mecanismo de ação de
drogas com atividade antineoplásica. Dentre os corantes estudados com essa
finalidade, o corante PZ6 que apresenta elevada sensibilidade é o que pode ser
caracterizado como mais adequado a ser utilizado como sonda durante as
avaliações de mecanismo de ação biomolecular. Essa avaliação foi feita
utilizando-se a espectrometria de fluorescência que é freqüentemente utilizada
em estudos de estruturas, de interações moleculares, na localização de
moléculas especialmente em sistemas biológicos. Os estudos focalizaram a
possibilidade dos corantes conseguirem ter fluorescência para as devidas
finalidades. De acordo com os resultados encontrados há a possibilidade
desses corantes, derivados do Lapachol, por analogia, também serem
utilizados futuramente em terapias e exames investigativos.
Palavras-chave: sonda molecular, fluorescência, fenazínas, quinonas,
β-Lapachona
x
Abstract
This work concerns the study of phenazines-derived from naphthoquinones on
the photophysical characteristics to be used as fluorescent probes to investigate
the mechanism of action of anticancer drugs with activity. Among the dyes
studied for this purpose, the dye PZ6 which shows high sensitivity which can be
characterized as more suitable be used as probes for the evaluation of
biomolecular mechanism of action. This evaluation was performed using a
fluorescence spectrometer that is often used in studies of structures of
molecular interactions, especially the location of molecules in biological
systems. The studies focused on the possibility of fluorescent dyes to get the
necessary goals. According to the results there is the possibility of these colors,
derived from lapachol, by analogy, also be used in future treatments and
investigative tests.
Keywords: molecular probes, fluorescence, phenazines, quinones,
β-lapachone
xi
‘O único homem que está isento de erros, é aquele que não arrisca acertar.’
Albert Einstein (1879 - 1955)
1
1. INTRODUÇÃO
A importância de produtos naturais na terapêutica é conhecida desde a
antiguidade. O conhecimento de plantas alucinógenas pelos ameríndios que as
empregavam em seus rituais, bem como das propriedades afrodisíacas de diversas
porções preparadas a partir de distintas espécies vegetais, acompanha o homem há
muitos milênios (BARREIRO et al., 2001).
A avaliação da estrutura química dos constituintes das plantas medicinais abre
novos horizontes à quimioterapia. Os compostos naturais extraídos dessas plantas e seus
derivados sintéticos constituem novas armas na luta contra as doenças. Dessa forma,
podemos planejar novas moléculas que irão enriquecer o catalogo atual de
medicamentos ou, no mínimo, fornecer bases para novas pesquisas químicas e
farmacêuticas. Como matéria-prima, as plantas medicinais são fontes importantes de
substâncias que, em caso de não possuírem ação biológica, podem ser usados para
síntese de derivados farmacologicamente ativos. Por serem dotadas de componentes
ativos estas plantas são também ideais para a pesquisa farmacêutica (MULLER, J.M,
1964).
Nas últimas décadas, pesquisas relacionadas com as áreas de farmacologia vêm
se desenvolvendo consideravelmente, uma vez que a humanidade vem padecendo de
inúmeras doenças, provocadas por diversos fatores, como: microbiológicos,
contaminações provocadas pelo homem e mutações genéticas. A pesquisa com
fármacos é muito extensa, tendo varias linhas distintas a serem seguidas. Hoje a
pesquisa em fármacos é fundamentada em estudos da funcionalidade de proteínas,
buscando seus inibidores, utilizando-se do conhecimento popular para isolarem
compostos que tenham princípios ativos contra algum mal, extraindo estes princípios
ativos de plantas e animais e ainda explora toda a potencialidade na síntese de
compostos de interesse farmacológicos (SOARES, J.G, 2006).
A grande porção dos fármacos comercializados hoje é sintetizada em
laboratório. Atualmente, tem se procurado desenvolver fármacos que ao mesmo tempo
em que promovem o efeito, permitam acompanhar visualmente o que está ocorrendo.
2
1.1 SONDAS MOLECULARES
Sondas moleculares oferecem uma variada gama de corantes celulares
fluorescentes permeáveis que se associam seletivamente com mitocôndrias, lisossomos,
retículo endoplasmático e Golgi, entre outras organelas em células vivas. Estas sondas
são moléculas orgânicas fluorescentes as quais têm recebido há tempos, certa atenção,
devido seu potencial de uso em química analítica, em estudos do comportamento
celulares e em química forense, entre outros.
Sondas fluorescentes podem ser utilizadas na maioria de técnicas de
espectroscopia de emissão, possibilitando a detecção de complexos componentes do
conjunto celular com requintes de sensibilidade e seletividade. Além disso, as sondas
fluorescentes podem ser usadas para investigar a estrutura e atividade de organelas em
células vivas com o mínimo de perturbação da função celular.
A fluorescência é um processo de emissão no qual as moléculas são excitadas
pela absorção de luz. As espécies excitadas relaxam a um estado metaestável que ao
retornar ao estado fundamental, liberam seu excesso de energia na forma de fóton. O
fóton emitido por fluorescência tem menos energia que o absorvido. Por tanto, possui
uma frequência menor e emite num comprimento de onda maior (Figura 1).
3
Figura 1. Diagrama de Jablonski ilustrando o processo envolvido na criação do estado eletrônico
excitado singlet por absorção (1), relaxamento de molécula Para um estado vibracional de menor energia
do estado excitado (2) e subseqüente emissão de fluorescência (3). Figura modificada do Handbook of
Fluorescent Probes and Research Products
No presente trabalho foram utilizados derivados quinonoídicos para o
desenvolvimento de sondas/fármacos que dentro da atual estratégia sejam utilizados
para reportar o efeito do fármaco na célula.
Considerando a grande importância em relação à estrutura química e a atividade
biológica, a química das quinonas, já há muito, vem sendo descrita em publicações,
estando assim bem documentada sua evolução ao longo do tempo (SILVA, M.N, 2003).
Atualmente, há um grande interesse pelo conhecimento da farmacologia e do
modo de atuação das quinonas. O progresso quanto aos conhecimentos da bioquímica
das atividades enzimáticas, além dos recentes avanços da química computacional, em
muito pode contribuir para o esclarecimento em maior profundidade dos mecanismos de
atividade de fármacos e em conseqüência, para o planejamento de novas drogas
comerciais. A perspectiva de previsibilidade que estes estudos trazem, auxiliam na
busca de agentes antineoplásticos baseados em planejamentos racionais, resultando na
obtenção de substâncias com maior seletividade e eficiência antineoplásica.
4
1.2 QUINONAS
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de
distribuição natural. Ultimamente, intensificou-se o interesse nestas substâncias, não só
devido à sua importância nos processos bioquímicos vitais, como também o destaque
cada vez maior que apresentam em variados estudos farmacológicos. Na natureza estão
relacionadas com etapas importantes do ciclo de vida de seres vivos, principalmente nos
níveis da cadeia respiratória e da fotossíntese (SILVA, M.N, 2003).
Genericamente, as quinonas naturais mais representativas são de vital
importância para vegetais superiores, artrópodes, fungos, liquens, bactérias, algas e
vírus. A distribuição dessas substâncias nos variados organismos implica,
possivelmente, em funções biológicas múltiplas, agindo de forma notável em seus
diversos ciclos bioquímicos (THORNSON e BURNETT, 1967).
Em análises farmacológicas, as quinonas mostram variadas biodinamicidades,
destacando-se dentre muitas, as propriedades microbicidas, tripanossomicidas,
viruscidas, antitumorais e inibidoras de sistemas celulares reparadores, processos nos
quais atuam de diferentes formas. A interferência das quinonas na apoptose constitui-se
hoje em pesquisas interdisciplinar de fronteira na química medicinal, existindo grande
expectativa quanto à delineação de estratégicas racionais visando o combate de
neoplasia, principalmente as relacionadas ao câncer de próstata (SILVA, M.N, 2003).
Com base na sua estrutura molecular, as quinonas são divididas em diferentes
grupos, utilizando-se como critério o modelo de sistema aromático que sustenta o anel
quinonoídico, podem ser classificadas como: Benzoquinonas – um anel benzênico;
Naftoquinonas - um anel naftalêmico; Antraquinonas - um anel antracênico linear ou
angular.
5
De modo muito peculiar, em decorrência de diferentes isômeros, com um
mesmo modelo de anel, pode-se ter, dependendo das disposições relativas das
carbonilas, diferentes quinonas. Por exemplo, no arranjo de base naftalêmico tem-se a
forma isomérica 1,2 ou orto-quinonoídica, quando as carbonilas são vizinhas ou a 1,4
ou para-quinonoídica, com as carbonilas tendo entre si dois carbonos (Figura 2).
Estas formas isoméricas divergem muito em suas propriedades físicas, químicas
e quanto à sua atuação biológica. Um exemplo típico é a orto-naftoquinona, β-
lapachopna, do grupo das tabebuias, que é muito mais ativa contra o Trypanosoma
Cruzi que o seu isômero natural, α-lapachona (SILVA, 2003).
O
O
O
O
Figura 2. Isômeros de posição de naftoquinonas:(A) Estrutura da orto-naftoquinona (1,2-
naftoquinona); (B)Estrutura da para-naftoquinona (1,4-naftoquinona).
Numa observação mais apurada sobre a importância das quinonas,
especialmente de naftoquinonas, pode-se citar o grande número de drogas neste grupo
que possuem aplicações práticas reconhecidas. Algumas, inclusive, chegaram à
produção industrial, como por exemplo, as vitaminas K, as mitomicinas e as
antraciclinas.
A B
6
1.3 NAFTOQUINONAS
Dentre as naftoquinonas naturais destaca-se o lapachol que pode ser considerado
um dos principais representantes do grupo de quinonas das tabebuias. É conhecido
desde 1858 e desde então através dos séculos tem sido encontrado como constituinte da
várias plantas das famílias Bignoniácea, particularmente no gênero Tabebuia (Tecoma),
juntamente com outras quinonas heterocíclicas não menos importantes do grupo. O
lapachol é de fácil extração da serragem de madeira de várias espécies de Ipê, plantas do
Brasil e da fronteira com a Argentina. Há no Brasil cerca de 46 tipos de maneiras
comerciais conhecidas como “ipês” (Tabebuia sp). Antigamente, o lapachol foi
comercializado para utilização como auxiliar no tratamento de certos tipos de câncer,
sendo o medicamento fabricado pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de
Pernambuco (LAFEP), não mais disponível no mercado.
Foram atribuídas muitas atividades farmacológicas ao lapachol e aos seus
derivados semi-sintéticos, tais como atividade antimicrobiana e antifúngica;
tripanossomicidas Antimalárico; uso contra enteroviroses; antiinflamatórias;
antiulcerantes, antineoplásica, entre outras (SILVA, M.N., 2003).
Este ativo tem sido bastante estudado visando sua utilização terapêutica em
virtude de suas propriedades farmacológicas. O lapachol é matéria prima para as
sínteses de muitas outras substâncias de distintas biodinamicidades. As mais ativas são
os derivados naftoquinônicos como a β-lapachônicos e muitos outros (SILVA, M.N.,
2003).
7
A β-lapachona tem sido encontrada como constituinte minoritário durante o
isolamento de outras naftoquinonas do cerne das árvores de ipês. Em laboratório essa
naftoquinona é preparada pela isomerização do lapachol com ácido sulfúrico (Figura 3).
A citotoxicidade dessa naftoquinona leva à especulação de que existe uma
propriedade química intrínseca na unidade quinonoídica associada com outros fatores
estruturais, que são responsáveis pela intensidade das atividades antitumorais (SILVA,
M.N., 2003).
OH
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
Figura 3. (A) Estrutura planar do Lapachol; (B) Estrutura planar da
β-lapachona.
Este trabalho estuda o comportamento de fenazinas derivadas da β-lapachona.
Espera se que estes corantes pela sua semelhança estrutural com a β-lapachona
reproduzam sua propriedade farmacologia antitumoral.
A B
8
1.4 SONDAS FENAZÍNICAS
A família das fenazinas é constituída de um grupo de heterocíclicos
nitrogenados, cuja unidade estrutural básica consiste no núcleo 9,10-diaza-antraceno. A
estrutura do mais simples representante da família coincide com o seu próprio núcleo
básico (Figura 4). O núcleo fenazínico é naturalmente fosforescente, mas em função de
modificações estruturais o núcleo fenazínico passa a ser fluorescente.
Fenazinas derivadas da β-lapachona possuem uma fotofísica bastante
interessante do ponto de vista de aplicação como sondas solvatocrômicas. Se for
considerado apenas o monitoramento a partir de espectroscopia do estado estacionário,
informações relevantes podem ser extraídas da forma (estruturada ou gaussiana), da
intensidade (rendimento quântico) e da posição do máximo da banda (energia). As
propriedades fotofísicas como rendimento quântico de fluorescência e o tempo de vida
de fluorescência são também função de suas propriedades dielétricas e aumentam com o
aumento da polaridade do solvente (CARVALHO, C.E.M, 2000).
Figura 4. (A) Estrutura planar do núcleo fenazínico (FENAZINA),
(B) Mapa da superfície da densidade total de carga (SOARES, J.G., 2006)
A
B
9
Estes corantes possuem um comportamento solvatocrômico, isto é, o
comprimento de onda máximo de absorção e fluorescência, é dependente do ambiente
de solvatação.
Atualmente as informações sobre misturas binárias de solventes e sistemas
complexos, consideram relações lineares baseadas em escalas empíricas de polaridade
* e ET(30), que fornecem apenas informações termodinâmicas do sistema. Tal
comportamento linear está longe de representar a realidade para misturas com diferentes
interações dipolares e com variações grandes da constante dielétrica. Apesar disto, tem
sido com esta sistemática que sistemas mais complexos como os biológicos vêm sendo
estudados. A dinâmica destes processos interativos, não somente pode fornecer
informações úteis para o desenvolvimento de novas técnicas para visualização de
imagem, como também do ponto de vista teórico representa um avanço, uma vez que
pouco tem sido feito nesta direção.
Estes corantes pela sua semelhança estrutural com a β-lapachona, serão
utilizados para monitorar os processos de difusão celular e afinidade com sítios
celulares específicos (Figura 5).
N
N
O
N
OM e
N
N
OH
N
PZ6 PZ(CH3) PZr
Figura 5. Estrutura dos corantes fenazínicos estudados
10
2. OBJETIVO GERAL
Avaliar corantes fenazínicos em uma mistura de solventes compatíveis com
organismos vivos, com a finalidade de compreender a dinâmica de solvatação das
sondas moleculares nestes diferentes meios e assim poder inferir sobre as interações dos
corantes com organismos vivos.
Desenvolver uma metodologia e estabelecer as bases para compreender
fenômenos complexos de solvatação preferencial e migrações em microcompartimentos
de sistemas organizados e celulares.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar os corantes fenazínicos PZ6, PZr e PZ(CH3) em soluções com Dioxano,
2-Propanol, Acetonitrila e misturas binárias destes solventes com água, com a finalidade
de analisar os processos emissivos e de transferência de energia desses corantes em
função da faixa de polaridade dos solventes empregados.
11
3. METODOLOGIA
3.1- SÍNTESES DOS COMPOSTOS
A parte experimental do projeto iniciou-se na extração da matéria prima para as
sínteses posteriores, o lapachol. Após a extração do lapachol, a β-lapachona foi
preparada pela isomerização do lapachol com ácido sulfúrico (Quadro 1). As sondas
fenazínicas PZ6, PZr e PZ(CH3) utilizadas neste estudo foram obtidas por uma parceria
com o Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais (NPPN-UFRJ). A síntese e purificação
dos corantes (Quadro 2) foram realizadas conforme o descrito na literatura
(CARVALHO, C.E.M., IQ-UFRJ, 2000).
Quadro 1. Esquema da síntese da β-lapachona
12
N H 2
N H 2
N
N
O
OH
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
N H 2
N H 2
N
OH
N
N
OM e
N
C H 2N 2
+
+
β-lapachona Orto-fenilenodiamina PZ6
Lapachol
PZ (CH3)
PZr
Quadro 2. Esquema da Síntese das sondas fenazínicas: (I) Síntese de PZ6 pela reação da β-
Lapachona com orto-fenilenodiamina; (II) Síntese de PZr pela reação do lapachol com orto-
fenilenodiamina; (III) Síntese de PZ(CH3) pela reação de PZr com diazometano(CH2N2)
(I)
(II)
(III)
13
3.2- ESTUDOS POR ESPECTROFOTOMETRIA
Soluções foram preparadas com os corantes PZ6, PZr e PZ(CH3) dissolvidos em
dioxano, 2-propanol, acetonitrila e em misturas binárias destes com água. Foram
utilizados neste trabalho solventes com grau espectroscópico para UV/HPLC
produzidos pela VETEC (Brasil).
A propriedade de polarização dos solventes é um parâmetro importante nos
estudos por espectrofotometria, pois exercem influência sobre as propriedades
fotofísicas das sondas. Esse parâmetro foi calculado pelo fator de polaridade (Δf), pois
este fator advém da relação entre o este índice de refração (η) e constante dielétrica (ε)
dos solventes estabelecida pela equação de Lippert-Mataga:
Δƒ = (η2-1 / 2η2 +1)
Conhecida a escala de polaridade dos solventes, iniciaram-se as análises
espectroscópicas. Os espectros de absorção e fluorescência foram medidos pelos
Espectrofotômetro-UV-visível e Espectrofluorímetro Hitachi F4500, respectivamente
(IQ-UFRJ). Todos os cálculos referentes à fotofísica dos corantes puderam ser
realizados (transferência de energia, Stern-Volmer, Rendimento quântico de
fluorescência, análise de parâmetros solvatocrômicos). No entanto, é importante
ressaltar que os resultados referentes à fotofísica dos corantes são provenientes de
analises simples.
14
3.2.1 Absorção Molecular de radiação
O processo de absorção ocorre ao nível molecular. Assim, como acontece num
átomo, cada molécula caracteriza-se por possuir níveis de energia moleculares
quantizados, os quais podem ser ocupados pelos elétrons das moléculas. Por outro lado,
a radiação eletromagnética (luz) carrega energia, sendo que o valor dessa energia
depende do comprimento de onda da radiação.
A absorção da radiação se dá quando a energia que ela transporta é igual à
diferença entre dois níveis de energia da molécula nessa situação, a energia da radiação
é transferida para a molécula e ocorre a chamada absorção de radiação. Rotineiramente,
a magnitude das absortividades molares que variam da ordem de zero até um máximo
de 105 é observada. Valores de absortividade menores do que 10
3 são de baixa
intensidade.
Os valores das absortividades das moléculas foram calculados com base na lei
de Lambert-Beer.
Ac.l
A lei de Lambert –Beer estabelece relação entre a absorvância a um λ fixo (Aλ),
a absortividade (), a concentração molar (C) do analito e a distância em centímetros
(cm) percorrida pelo feixe luminoso através da amostra(l).
15
3.2.2 Rendimento Quântico de Fluorescência (Ф)
O rendimento quântico é a relação entre o número de fótons emitidos, e o
número total de fótons absorbvidos. As soluções foram preparadas de modo que a
absorvância dos compostos ficasse em torno de 0.08 no comprimento de onda onde
seria excitado. Após esta etapa, analisou-se a emissão no comprimento de onda
determinado e, usando difenilantraceno como referencia (EATON, D.F; 1998.), o
rendimento quântico foi determinado segundo a fórmula:
Onde: O Ф da amostra é expresso pela razão entre a absorvância (A), a área
sobre a curva (F) e índice de refração do solvente (η) para solução com a amostra (u)
pelos respectivos dados do padrão (s), multiplicados pelo rendimento quântico do
padrão(Фs).
16
3.2.3 Transferência de energia: Stern-Volmer
A Transferência de Energia foi estudada acrescentando-se alíquotas do composto
aceptor (β-lapachona) na solução do composto doador (sondas). Os espectros de
fluorescência foram medidos para cada alíquota acrescentada. As constantes de
supressão foram calculadas com base nos dados referentes aos máximos das bandas de
fluorescência do agente doador (sondas) sem o aceptor (β-lapachona) e após o
acréscimo das alíquotas do supressor pela equação de Stern-Volmer:
Onde: IF é a intensidade de fluorescência sem o supressor; IF(Q) é a intensidade da
fluorescência após a primeira alíquota; [Q] é a concentração do supressor; KQ é a
constante de supressão de Stern-Volmer (YUAN, 2008).
17
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- EFEITO DO SOLVENTE NO ESPECTRO DE FLUORESCÊNCIA
Os valores do fator de polaridade (Δf) dos solventes utilizados no presente
estudo foram calculados segundo a equação de Lippert-Mataga. Esses valores são
apresentados, conforme escala crescente de polaridade, no quadro 3:
Quadro 3: Fator de polaridade (Δf) dos solventes estudados
Solventes η ε f
Dioxano 1,4165 2,209 0,022
2-Propanol 1,3776 18,3 0,273
Acetonitrila 1,34423 37,5 0,305
O efeito do aumento de polaridade dos solventes sobre a posição dos máximos
de fluorescência dos corantes fanazínicos PZ6, PZ(CH3) e PZr é evidenciado, de modo
peculiar, na figura 6. Esses corantes tendem a deslocar seu máximo de fluorescência
para regiões de maior comprimento de onda, tendendo para a região do vermelho.
18
450 500 550 600 650 700
0
500
1000
1500
2000
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
(nm
Dioxano
Isopropanol
Acetonitrila
Figura 6. Espectros de fluorescência normalizados do corante PZ(CH3) ilustrando o efeito do
Solvente no Espectro de Fluorescência
Esses dados revelam que existe um grande potencial desses compostos. Visto
que o comprimento de onda é inversamente proporcional a energia, é necessário o
fornecimento pouca energia para produzir a excitação desses corantes em sistema
orgânicos. Favorecendo a utilização deles como sondas em estudos por microscopia de
fluorescência.
N
OM e
N
19
4.2- ABSORTIVIDADES MOLARES (ε)
Os valores de ε foram determinados de acordo com a lei de Lambert-Beer. O
comprimento da cubeta onde foram acondicionadas as amostras dos corantes durante
analise espectrofométrica é igual a 1cm, assim, o caminho óptico ou distância percorrida
pelo feixe luminoso através da amostra (L) é igual a 1. Não sendo significante no
cálculo dos épsilons os quais foram determinados em função das absorvâncias e das
concentrações dos respectivos corantes nos distintos solventes utilizados.
A concentração dos corantes foi determinada com precisão. As pesagens dos
compostos foram realizadas numa balança de ultraprecisão do Laboratório de
Instrumentos e Pesquisa no IQ/UFRJ. Isso possibilitou aferir com precisão os valores
das absortividades (tabela 1) dos corantes para o comprimento de onda igual a 410nm.
Tabela 1: Valores dos épsilons dos corantes estudados nos diferentes solventes
Corantes Solventes
Dioxano 2-propanol Acetonitrila
PZ6 9 x103 8x10
3 8 x10
3
PZr 8x103 7,6x10
3 6,6x10
3
PZ(CH3) 8,9x103 -
8x10
3
20
Isso é importante pois através da relação entre e a absorvância pode-se
quântificar substâncias que se encontrem nas soluções analisadas. Genericamente, os
valores das absortividades na ordem de 103 são aceitáveis, pois se localizam dentro da
faixa correspondente a espectroscopia de absorção molecular na região do espectro
visível.
Visto que o valor da é dependente do ambiente. Pode-se observar na tabela 1
que o corante PZr apresentou diminuição da absortividade em função do aumento da
polaridade do meio.
Nos corantes PZ6 e PZ(CH3), de maneira geral, a redução também é perceptível,
no entanto, os resultados se mostram melhores em função dos respectivos valores dos
serem maiores que os encontrados para o corante PZr. Pois, quanto maior a valor do ,
maior será a probabilidade de transição de uma molécula para o estado excitado.
De modo geral, os maiores valores de foram encontrados em ambientes nos
quais a polaridade é menor. Isto indica que os corantes avaliados tem maior
probabilidade de transição em meios pouco polares, o que não seria fovorável para a
utilização destes em estudos espectroscópicos, em função do efeito da polaridade do
meio no deslocamento dos máximos de fluorescência.
Entretanto, os corantes PZ6 e PZ(CH3), mostraram valores de absortividade
consideráveis em meios mais polares. Apesar dos solventes utilizados apresentarem
uma ampla faixa de variação de polaridade. De modo peculiar, o corante PZ6 se
destacou por não alterar o em acetonitrila, apesar desse solvente ser mais polar que o
2-propanol.
Esses dados corroboram o potencial destes corantes quanto a serem utilizados
como sondas
21
4.3- RENDIMENTO QUÂNTICO DE FLUORESCÊNCIA (Ф)
O rendimento quântico de fluorescência foi determinado usando difenilantraceno
como referência e serve para definir a eficiência de emissão de determinado fluoróforo
ou corante fluorescente pela diferença entre a quantidade de fótons emitidos pela
quantidade dos absorvidos.
O ideal nessas análises é encontrar valores de Ф próximos ou iguais ao valor
limite, que é igual a 1. Rendimentos maiores que 1 são possíveis quando ocorre reação
em cadeia fotoinduzida ou por radiação, onde um único próton pode ativar uma longa
cadeia de transformações, mas não é o caso dos corantes avaliados neste trabalho.
Na prática, entretanto, uma pequena faixa de compostos alcançam este
desempenho.
Compostos com valores de Ф elevados são desejáveis, pois são capazes de emitir
fluorescência com maior intensidade.
Assim como o valor de ε, o rendimento quântico é influenciado pela polaridade
do meio no qual se encontrem os corantes, outros fatores que também poderiam
influenciar os dados deste trabalho são a temperatura e a presença de impurezas.
Em condições fisiológicas, ainda teriam que ser considerados, entre outros,
fatores como o pH e interações intracelulares com outros compostos.
Relacionando o Ф com o ε, respeitados os limites das respectivas medidas, se
ambas as medidas fornecerem valores altos, compostos que as associem possuirão uma
emissão favorável. Visto que, quanto maior o valor do ε maior a probabilidade de
transição eletrônica e quanto maior o Ф maior será a fluorescência.
22
Isso significa que concentrações pequenas do corante serão necessárias para que
se tenha uma fluorescência maior. Em casos como o deste estudo, onde os corantes
avaliados são tóxicos, isso implica que concentrações menores sejam utilizadas. Com
isso, a célula na presença destes corantes ficará viável por um tempo maior,
favorecendo estudos pro microscopia de fluorescência.
Com relação à temperatura, esta foi mantida constante a 20ºC durante toda a
verificação do rendimento quântico dos corantes. Também com relação à presença de
impurezas, os corantes usados neste estudo possuem alto grau de pureza.
A tabela 2 expõe os valores dos rendimentos dos corantes em função do aumento
da polaridade do meio. Pode-se perceber que ocorre um aumento sutil dos rendimentos
globais em função do aumento da polaridade do meio (Dioxano<2-
propanol<Acetonitrila) apesar da ampla faixa de variação existente.
Tabela 2: O rendimento quântico de fluorescência.
Solvente Corante
PZ6 PZ(CH3) PZr
Acetonitrila 0,0025 0,00031 0,002
2-propanol 0,0023 0,00030 0,001
Dioxano 0,001 0,00025 0,001
De modo geral, os rendimentos quânticos dos corantes analisados mostram-se
baixos. Isto foi motivo de surpresa num primeiro momento, convêm, entretanto lembrar
que os dados referentes ao rendimento quântico são provenientes de analise simples.
Assim, considera-se que os valores dos Ф dos corantes analisados são aceitáveis.
Os resultados expostos na tabela 2 indicam que os corantes PZ6 e PZr
responderão significativamente melhor à excitação que o composto PZ(CH3), o qual
demonstrou eficiência dez vezes menor que os outros corantes. Apesar destes
resultados, o corante PZ(CH3) demonstrou fluorescência considerável nas analises
realizadas.
23
4.4-TRANSFERÊNCIA DE ENERGIA: STERN -VOLMER
A transferência de energia do agente doador (os corantes estudados) para o
agente aceptor é um fator determinante para a utilização destas sondas em avaliações
futuras por microscopia de fluorescência. Pois, em função da transferência de energia
ocorrerá variação cromática pela qual se dará a produção do contraste da imagem.
Assim, inicialmente se determinou o ponto iso-absortivo de todos os corantes avaliados
em relação ao agente aceptor (β-lapachona) região do comprimento de onda de 410nm
(Figura 7).
350 400 450 500 550 600
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Abs
orçã
o- F
luor
escê
ncia
Comprimento de Onda (nm)
____ Abs. Beta-lapachona
Fluor. Fenazina
Figura 7. Transferência de energia. Sobreposição das bandas de emissão e de absorção do agente doador
(PZ6) e do agente aceptor (β-lapachona), respectivamente. Solvente: Acetonitrila
Foram registrados espectros de fluorescência das amostras das fenazinas PZ6,
PZr e PZ(CH3) em concentrações aproximadas de 30μg. Observou-se que a adição da
β-lapachona nas soluções levou a uma supressão da fluorescência e esta supressão
aumenta com o aumento de polaridade do solvente.
24
A transferência de energia é evidenciada nas figuras 8 a 10 pela supressão da
intensidade da banda referente à fluorescência dos corantes sem o supressor.
450 500 550 600 650 700
0
2000
4000
6000
8000
10000
100L- 1,5mL
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
(nm)
Figura 8. Gráfico de supressão da fluorescência referente ao corante PZ6 em 2-propanol em função do
acréscimo de alíquotas do supressor (β-Lapachona)
450 500 550 600 650
0
2000
4000
6000
8000
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
(nm)
100L- 1,5mL
Figura 9. Gráfico de supressão de fluorescência referente ao corante PZ6 em Dioxano em função do
acréscimo de alíquotas do supressor (β-Lapachona)
25
450 500 550 600 650 700
0
2000
4000
6000
8000
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
(nm)
100L - 500L
Figura 10. O gráfico mostra a diminuição da fluorescência da banda referente ao corante PZ6 em
Acetonitrila em função do acréscimo de alíquotas do supressor (β-Lapachona)
A partir dos valores referentes às intensidades de fluorescência dos corantes na
ausência ou presença do supressor, fornecidos pelos gráficos de supressão, fez-se um
tratamento matemático, Stern-Volmer, pelo qual se obteve os gráficos para os corantes
avaliados, conforme às figuras 11 e 12.
Nessas figuras é possível acompanhar a tendência linear da supressão da
fluorescência dos corantes mediante acréscimo do supressor. A mesma tendência é
observada em todas as fenazinas estudadas, independente da polaridade do solvente.
Isso implica podermos precisar a quantidade necessária de supressor (β-
Lapachona) para produção do contraste, bem como planejar e acompanhar em função
do tempo a formação da imagem. Pois, é esperado que os corantes avaliados
reproduzam as propriedades apoptogênicas do seu análogo, a β-Lapachona
(THORNSON e BURNETT, 1967). Assim, aumentando a concentração do supressor
será drasticamente reduzida a duração da imagem.
26
0,0 3,0x10-9
6,0x10-9
9,0x10-9
1,2x10-8
1,5x10-8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
I F/I
F(Q
)
[Q] (Mol/L)
Figura 11. Gráfico Stern-Volmer de PZ6 em Acetonitrila, construído segundo equação IF/IF(Q)= K[Q] + B
pela adição de 7 aliquotas de 100μL do supressor com concentração igual a 2,5x10-9 cada. K=6x10
7 ; B=
1,006 ± 0,006
3,0x10-9
6,0x10-9
9,0x10-9
1,2x10-8
1,5x10-8
1,8x10-8
2,1x10-8
1,0
1,5
2,0
2,5
I F/I
F(Q
)
[Q] (Mol/L)
Figura 12. gráfico Stern-Volmer de PZr em Dioxano, construido segundo equação IF/IF(Q)= K[Q] + B pela
adição de 15 aliquotas de 100μL do supressor com concentração igual a cada. K= 6,6x107 ; B= 1,0 ±
0,008
27
As constantes de supressão dos corantes nos diferentes solventes analisados
foram agrupadas numa tabela, visando facilitar a comparação das constantes, a qual é
mostrada abaixo:
Tabela 3: Efeito da polaridade dos solventes no coeficiente de supressão (K)
Solvente Corante
PZ6 PZr PZ(CH3)
Dioxano 5x106 6,6x10
7 3,4x10
6
2-propanol 5x107 3x10
6 2,5x10
7
Acetonitrila 6x107 6x10
7 4,1x10
7
Observa-se que com o aumento de polaridade dos solventes ocorre aumento do
coeficiente de supressão de fluorescência das fenazinas estudadas. Isso mostra que esses
corantes, quando na presença do supressor, possuem maior fluorescência em meio cuja
polaridade seja menor, contrastando com meios com maior polaridade os quais serão
evidenciados como regiões escuras.
Esses dados permitem inferir sobre o potencial uso destes corantes como sondas
em avaliação de cultura de células por microscopia de fluorescência. Os dados indicam
de modo peculiar que, dos corantes avaliados, o corante PZ6 responderia melhor
proporcionando bom realce das estruturas celulares.
28
4.5- DESEMPENHO DOS CORANTES EM MISTURAS BINÁRIAS DE
SOLVENTES
450 500 550 600 650 700
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
(nm)
100L-700L
Figura 13. Gráfico PZ6 em solução binária de água e 2-propanol. O gráfico mostra o aumento da
fluorescência do sistema em função do acréscimo de alíquotas da sonda em 2-propanol
É possível observar pelo gráfico que mediante o acréscimo da sonda PZ6 ocorre
o aumento da fluorescência, o mesmo ocorre com os outros corantes avaliados. Isso era
esperado, uma vez que água não apresenta fluorescência, no entanto torna-se importante
observar que o desempenho do corante PZ6 foi significativamente maior que os dos
outros corantes avaliados em misturas binárias em água e um dos solventes em estudo
(Acetonitrila, 2-propanol, Dioxano).
Esse corante mostrou-se particularmente mais sensível, já a partir da primeira
Alíquota. O derivado metilado (PZ(CH3)), também produziu fluorescência significativa
já na primeira alíquota, porém a fluorescência foi bem menor que do corante PZ6.
29
O corante PZr , entretanto mostrou fluorescência significativamente em média a
partir do acréscimo da 5a alíquota. Isso pode ser explicado pelo aumento da
concentração de moléculas dos solventes (Acetonitrila, 2-propanol, Dixano), que
promovem maior solvatação das moléculas do corante fenazínico avaliado.
O corante PZr, entretanto mostrou-se interessante, pois na presença de água
alterou a cor da solução, passando de um tom avermelhado quando na presença de um
dos solventes usados para uma coloração rósea. Isso merece maiores estudos, pois
seria indicativo da formação de tautômero na solução. Tautomerismo é o caso particular
de isomeria funcional no qual dois isômeros ficam em equilíbrio químico dinâmico
(Figura 14).
N
OH
N
N
N
H
O
Figura 14. Corante PZr em sua forma normal (a esquerda) e tautomérica (a
direita).
Geralmente a excitação de uma molécula muda somente seu estado eletrônico.
Porém, existem moléculas (tautomericas) que, no estado excitado, sofrem uma
modificação não somente na estrutura eletrônica como também na estrutura molecular.
Ocorre uma transferência protônica intramolecular no estado excitado (TPIEE).
PZr
30
A energia do estado excitado da forma tautomérica é reduzida em comparação
com a energia da forma normal. Devido à redução da energia do estado excitado da
forma tautomérica, a fluorescência do tautômero é deslocada para o vermelho. Desta
forma, os espectros de absorção e emissão não se superpõem e o efeito da autoabsorção,
quer dizer, a reabsorção de um fóton emitido pela mesma espécie de molécula, é
reduzida ou suprimida.
A ausência de autoabsorção e a facilidade de conversão entre as formas, normal
e tautômera, tornam os compostos com TPIEE vantajoso para estudos espectroscópicos.
31
CONCLUSÃO
De maneira geral, os resultados indicam a potencialidade dos corantes serem
utilizados como sondas de polaridade. Isso ocorre porque eles proporcionam um realce
maior de regiões menos polares em contraste com regiões de maior polaridade em
função da transferência de energia pelo acréscimo do supressor.
De modo peculiar, destacou-se o corante PZ6, que dentre os compostos
analisados foi o que apresentou melhores resultados. O corante PZ(CH3), apesar dos
baixos rendimentos, também merece destaque pois, quando analisado em água
apresentou fluorescência consideravelmente alta, comparável a do corante PZ6. Assim,
ambos são potencialmente aplicáveis como sondas moleculares.
O corante PZr despertou atenção quando em testes preliminares com soluções
binárias indicou formação da forma tautomérica em solução. Isto o torna
particularmente mais interessante, pois à medida que a polaridade do meio muda ocorre
o deslocamento do equilíbrio e a conversão de espécies tautoméricas. Cada entidade
tautomérica possui um espectro de emissão com diferentes intensidades de
fluorescência, assim uma única sonda torna-se um instrumento analítico mais eficiente.
Testes adicionais devem ser realizados com a finalidade de se caracterizar as
propriedades fotofísicas destas entidades.
Diante destes resultados e análises é possível concluir que o corante PZ6 tem
uma melhor aplicabilidade e é o melhor corante dentre os estudados para ser utilizado
como sonda durante as avaliações de mecanismo de ação biomolecular. Porém, isso
não descarta a possibilidade de utilização dos outros.
32
5. PERSPECTIVAS
Há a perspectiva de se aprofundar melhor as análises em misturas binárias de
solventes com potencial aplicação em sistemas fisiológicos. Além disso, podem vir a ser
estudados outros fatores capazes de influenciar a eficiência dos compostos como sondas
de polaridade, tal qual o pH do meio, a temperatura e as interações intracelulares com
outros compostos.
A avaliação do efeito das interações dessas sondas com as células - como
permeabilidade e citotoxidade - e a análise das interações dos compostos com células
tumorais de Ehrlich - utilizando microscopia de fluorescência – podem também vir a ser
utilizados para analisar o mecanismo de ação de drogas com atividade antineoplásicas.
Por fim, há a perspectiva de compreensão futura dos fenômenos complexos de
solvatação preferencial e migrações em microcompartimentos de sistemas organizados e
celulares.
33
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