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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA
PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA
Avaliao de derivados sintticos da testosterona pelo teste de mutao e recombinao somtica (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
Orientador: Prof. Dr. Mrio Antnio Span
Uberlndia MG 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA
PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA
Avaliao de derivados sintticos da testosterona pelo teste de mutao e recombinao somtica (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
Orientador: Prof. Dr. Mrio Antnio Span
Tese apresentada Universidade Federal de Uberlndia, como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Doutor em Gentica e Bioqumica (rea: Gentica).
Uberlndia MG 2007
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
V136a
Valadares, Bruno Lassmar Bueno, 1977-
Avaliao de derivados sintticos da testosterona pelo teste de muta-
o e recombinao somtica (SMART) em Drosophila melanogaster /
Bruno Lassmar Bueno Valadares. - 2007.
113 f. : il.
Orientador: Mrio Antnio Span.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Uberlndia, Programa de
Ps-Graduao em Gentica e Bioqumica.
Inclui bibliografia.
1. Mutagnese - Teses. I. Span, Mrio Antnio. II. Universidade
Federal de Uberlndia. Programa de Ps-Graduao em Gentica e
Bioqumica. II. Ttulo.
CDU: 575.224.4
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogao e Classificao
Palavras chave: Teste de Mutao e Recombinao Somtica (SMART); esterides
andrognicos anablicos; derivados sintticos de testosterona; Deca Durabolin;
Durateston; Hemogenin; Winstrol Depot; citocromo P450; Uretano.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA INSTITUTO DE GENTICA E BIOQUMICA
PS-GRADUAO EM GENTICA E BIOQUMICA
Avaliao de derivados sintticos da testosterona pelo teste de mutao e recombinao somtica (SMART) em
Drosophila melanogaster
Aluno: Bruno Lassmar Bueno Valadares
COMISSO EXAMINADORA
Presidente: Prof. Dr. Mrio Antnio Span (Orientador)
Examinadores: Prof. Dr. Lusnia Maria Greggi Antunes
Prof. Dr. Sandra Morelli
Prof. Dr. Edson Jos Fragiorge
Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes
Data da Defesa: 23 de outubro de 2007
As sugestes da Comisso Examinadora e as Normas da PGGB para o formato da Tese foram contempladas
______________________________ Prof. Dr. Mrio Antnio Span
Orientador
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Aos meus pais, Geraldo Antnio Valadares e Emilia Maria Lassmar Bueno Valadares, dedico este trabalho e
meu empenho em concluir mais esta etapa.
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Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Mrio Antnio Span, pelos ensinamentos, conselhos, pacincia, compreenso, dedicao e ateno nesses mais de dez anos de orientao (desde maro de 1997, quando vim pedir meu primeiro estgio na graduao, a outubro 2007, quando encerro meu curso de doutorado); pelo exemplo de pessoa e profissional que pretendo seguir, e com quem espero manter os laos na carreira cientfica.
Ao Prof. Dr. Ulrich Graf, do Physiology and Animal Husbandry, Institute of Animal Sciences, ETH Zrich, Switzerland, pelo fornecimento das linhagens de Drosophila melanogaster e material necessrio para a realizao do Teste de Mutao e Recombinao Somtica.
Aos membros da Comisso Examinadora, Profa. Dra. Lusnia Maria Greggi Antunes, Prof. Dr. Edson Jos Fragiorge, Profa. Dra. Sandra Morelli e Prof. Dr. Francis de Morais Franco Nunes, pela disponibilidade e ateno para oferecer suas valiosas sugestes a este trabalho.
Aos companheiros de trabalho do Laboratrio de Mutagnese: Prof. Dr. Edson Jos Fragiorge; Profa Dra Silma Maria Alves de Melo; Profa Dra Silmara de Moraes Pantaleo; Profa Dra Wanderlene Blanco Nunes; MSc. Denise Gonalves Pereira; MSc. Zaira da Rosa Guterres e Alexandre Azenha Alves de Rezende, pelo convvio, amizade e cooperao. Em especial MSc Neila Coelho de Sousa, pela importante colaborao em momentos decisivos para a concluso deste trabalho.
Ao Sr. Paulo Roberto Moderno e Sr. Maria Aparecida Vilela, auxiliares tcnicos do Laboratrio de Mutagnese (INGEB-UFU), pela dedicao e colaborao na realizao dos nossos trabalhos, alm da amizade e grande carinho com todos do laboratrio.
Prof Dra. Nora Ney Santos Barcelos, Prof MSc. Eleusa Gallo Rosenburg e ao Sr. Anselmo de Oliveira (Instituto de Biologia UFU), pela amizade, incentivo, exemplo profissional e humano.
Aos coordenadores de cursos do Centro Universitrio de Caratinga (UNEC): MSc. Lamara Laguardia Valente Rocha (Cincias Biolgicas), MSc. Paulo Czar Tostes Jnior (Farmcia), MSc. Thelma Regina Alexandre Sales Ferreira (Nutrio), MSc. Marco Antnio Gomes (Psicologia) e MSc. Daniela Fonseca Genelhu (Medicina) pelo apoio e credibilidade.
Ao Sr. Joo Batista de Andrade, gerente administrativo da Unidade II da UNEC, pela confiana e permisso de utilizao de equipamentos de microscopia, em momentos necessrios, fora das dependncias da UNEC e ao
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tcnico, Sr. Jesus Ferreira de Sousa pela constante presteza no Centro de Estudos de Biologia (CEB UNEC), que muito colaboraram para a concluso da anlise do material deste trabalho.
Aos colegas de trabalho, professores do Centro Universitrio de Caratinga, MSc. Claudinelli Galvo, MSc. Patrcia Silva Santos, MSc. Mrcio Luiz da Gama Lisboa, Dra Marciane Oliveira e Dr. Slvio Dolabella, pelo incentivo, amizade e apoio.
Aos meus ex-alunos, Thiago Mafra Batista e Gleidson Teixeira, hoje mestrandos (UFOP e UNICAMP, respectivamente), pelo auxilio com material bibliogrfico on-line, pela considerao e amizade.
Aos meus alunos e orientados do Centro Universitrio de Caratinga (UNEC), pelo especial carinho e incentivo.
Aos personal-trainers Prof. Felipe Zago (Uberlndia) e Prof. Diego Andrade (Caratinga) pela amizade, incentivo, pacincia e importantes informaes sobre o objeto de estudo deste trabalho.
Ao grande companheiro, Danilo Cunha Nascimento, pela compreenso e pacincia exercitadas nesse perodo e pelas incontveis vezes que colaborou de forma simples, mas com ajudas decisivas para que este trabalho acontecesse.
Aos amigos: Rone Cardoso, Alessandra Cristina da Silveira, Hlica Macedo, Marley Garcia Silva, Daniel Maziero, Wilson Ru Jnior, Bruno Pueyo do Amaral, Fabiana Loureiro Pueyo do Amaral, Jupyracyara Jandira Carvalho Barros, Graziela Ribeiro de Oliveira e Paolla Barcelar Cardoso e minha prima, Anna Elisa Saad Campos, que estiveram presente e me acompanharam nessa trajetria, colaborando com grande incentivo.
minha tia Therezinha Lassmar, que sempre me incentivou o gosto pelo estudo e acompanhou, de perto ou de longe, toda minha trajetria.
Aos meus pais, Geraldo Antnio Valadares e Emlia Maria Lassmar Bueno Valadares, pelo empenho em me amparar em todos os momentos de dificuldades desse perodo, ao meu irmo, Victor Saad Bueno Valadares; aos meus avs, tios e primos, pelo grande apoio e incentivo, sem o qual no alcanaria meus objetivos.
A todos que, de forma direta ou indireta, contriburam com a realizao deste trabalho e com minha formao.
MMuuiittoo OObbrriiggaaddoo..
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Apoio Financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Mutagnese do Instituto de
Gentica e Bioqumica da Universidade Federal de Uberlndia (Uberlndia-
MG) com apoio financeiro das seguintes Agncias de Fomento e Instituies:
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES);
Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq);
Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG);
Universidade Federal de Uberlndia (UFU);
Centro Universitrio de Caratinga (UNEC).
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Eu no vou me importar com a maldade de quem nada sabe
E se algum interessa saber
Sou bem feliz assim
Muito mais do que quem j falou ou vai falar de mim.
(Maysa)
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Lista de Figuras
Figura 1.1 Estrutura comum maioria dos esterides derivados sintticos da testosterona, com indicao das posies na molcula onde se encontram os tipos de variaes (A, B e C) das diferentes classes de esterides anabolizantes (adaptado de Mottram e George, 2000).
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Figura 1.2 Estruturas qumicas dos esterides anablico-andrognicos (EAA) Estanozolol (Winstrol Depot WIN) (A); Oximetolona (Hemogenin HEM) (B); Decanoato de nandrolona (Deca Durabolin DEC) (C).
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Figura 1.3 Estruturas qumicas dos esterides anablico-andrognicos (EAA) constituintes do Durateston (DUR): Propionato de testosterona (A); Fenilpropionato de testosterona (B); Isocaproato de testosterona (C); Decanoato de testosterona (D).
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Figura 1.4 Representao esquemtica do cruzamento padro (ST): fmeas virgens da linhagem flr3 (+TM3,BdS/+flr3) so cruzadas com machos mwh (mwh + / mwh +), originando descendentes trans-heterozigotos marcados MH (+flr3/mwh+) e descendentes heterozigotos balanceados BH (+TM3,BdS/mwh+).
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Figura 1.5 Pares de asas de D. melanogaster: A Asas com bordas lisas; caracterstica dos indivduos da linhagem mwh, herdada pelos descendentes trans-heterozigotos marcados (MH); B Asas com bordas recortadas (serate); caracterstica dos indivduos das linhagens flr3 e ORR; flr3, herdada pelos descendentes heterozigotos balanceados (BH).
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Figura 1.6 Representao esquemtica de cromossomos de clulas dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em diviso mittica normal (adaptado de Graf et al., 1984).
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Figura 1.7 Representaes esquemticas de cromossomos de clulas dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em diviso mittica, com ocorrncia de deleo (A), e de mutao de ponto (B) levando formao de manchas mutantes simples do tipo mwh (adaptado de Graf et al., 1984).
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Figura 1.8 Representaes esquemticas de cromossomos de clulas dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em diviso mittica, com ocorrncia de recombinao entre os loci flr3 e mwh (A), com formao de mancha simples; e recombinao entre o centrmero e o locus flr3 (B), com a conseqente formao de mancha gmea (adaptado de Graf et al., 1984).
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Figura 1.9 Fotografias de plos de asa de D. melanogaster, ao microscpio ptico de luz (aumento de 400x), mostrando: A - mancha simples (contornada pela linha) com plos mltiplos (mwh) e B - mancha gmea (contornada pela linha) com plos em forma de chama (flr3), indicados pela seta branca; e plos mltiplos (mwh), indicados pela seta preta.
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Figura 2.1 Distribuio das freqncias de manchas por classes (nmero de clulas/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padro (ST) e B - de alta capacidade de bioativao metablica (HB), obtidas por meio do teste para deteco de mutao e recombinao somtica, tratadas com as diferentes concentraes de Hemogenin (HEM) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (gua destilada estril).
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Figura 2.2 Distribuio das freqncias de manchas por classes (nmero de clulas/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padro (ST) e B - de alta capacidade de bioativao metablica (HB), obtidas por meio do teste para deteco de mutao e recombinao somtica, tratadas com as diferentes concentraes de Deca Durabolin (DEC) (0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em gua).
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Figura 2.3 Distribuio das freqncias de manchas por classes (nmero de clulas/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padro (ST) e B - de alta capacidade de bioativao metablica (HB), obtidas por meio do teste para deteco de mutao e recombinao somtica, tratadas com as diferentes concentraes de Durateston (DUR) (0,195; 0,39; 0,78; 1,56 e 3,125mg/mL)e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em gua).
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Figura 3.1 Frmulas estruturais dos compostos: A Winstrol Depot (WIN), estanozolol (Disponvel on-line: http://pt.wikipedia.org/wiki/Estanozolol. Acesso em 03 outubro 2007); B Etilcarbamato (uretano URE) (Disponvel on-line: http://es.wikipedia.org/wiki/Uretano. Acesso em 03 outubro 2007).
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Figura 3.2 Regresso linear obtida pela correlao direta de dose dependncia no percentual de inibio pelas diferentes concentraes (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) de estanozolol (WIN) nas freqncias totais de manchas mutantes por indivduos, induzidas pelo uretano (URE 0,891 mg/mL) em clulas de asas de descendentes trans-heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster dos cruzamentos padro (ST) e de alta capacidade de ativao metablica (HB) em co-tratamentos de aproximadamente 48 horas.
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Figura 3.3 Distribuio das freqncias de manchas por classes (nmero de clulas/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padro (ST) e B - de alta capacidade de bioativao metablica (HB), obtidas por meio do teste para deteco de mutao e recombinao somtica, tratadas com as diferentes concentraes de Winstrol (WIN) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (gua destilada estril).
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Figura 3.4 Distribuio das freqncias de manchas por classes (nmero de clulas/mancha) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de Drosophila melanogaster dos cruzamentos: A - padro (ST) e B - de alta capacidade de bioativao metablica (HB), obtidas por meio do teste para deteco de mutao e recombinao somtica, tratadas com as diferentes concentraes de Winstrol (WIN) (0,625; 1,25 e 2,5mg/mL) associado a uretano (URE) (0,891 mg/mL) e seus respectivos controles positivo (URE 0,891 mg/mL) e negativo (gua destilada estril).
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Lista de Tabelas
Tabela 2.1 Esterides anablico-andrognicos derivados de testosterona utilizados nos tratamentos de larvas de Drosophila melanogaster para o teste de deteco de mutao e recombinao somtica
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Tabela 2.2 Freqncias de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster dos cruzamentos padro (ST) e de alta capacidade de bioativao metablica (HB), aps tratamento crnico (~ 48h) com diferentes concentraes (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante Hemogenin (HEM), e seus respectivos controles negativo (gua destilada estril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
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Tabela 2.3 Freqncias de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster dos cruzamentos padro (ST) e de alta capacidade de bioativao metablica (HB), aps tratamento crnico (~ 48h) com diferentes concentraes (0,15625; 0,3125; 0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante Deca Durabolin (DEC), e seus respectivos controles negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em gua) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
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Tabela 2.4 Freqncias de manchas mutantes observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster dos cruzamentos padro (ST) e de alta capacidade de bioativao metablica (HB), aps tratamento crnico (~ 48h) com diferentes concentraes (0,195; 0,39; 0,79; 1,56 e 3,125 mg/mL) do anabolizante Durateston (DUR), e seus respectivos controles negativo (1% Tween-80 + 3% etanol em gua) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
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Tabela 3.1 Freqncias de manchas mutantes simples pequenas (MSP), simples grandes (MSG) e gmeas (MG) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento padro (ST), obtidas por meio do teste de mutao e recombinao somtica, aps tratamento crnico (~ 48h) com diferentes concentraes (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante estanozolol (WIN), isoladamente, e associado ao uretano (URE) 10Mm, e seus respectivos controles negativo (gua destilada estril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
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Tabela 3.2 Freqncias de manchas mutantes simples pequenas (MSP), simples grandes (MSG) e gmeas (MG) observadas em asas de descendentes heterozigotos marcados (MH) de D. melanogaster do cruzamento de alta capacidade de ativao metablica (HB), obtidas por meio do teste de mutao e recombinao somtica, aps tratamento crnico (~ 48h) com diferentes concentraes (0,625; 1,25 e 2,5 mg/mL) do anabolizante estanozolol (WIN), isoladamente, e associado ao uretano (URE) 10Mm, e seus respectivos controles negativo (gua destilada estril) e positivo (URE 0,891 mg/mL)
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Lista de Abreviaturas
BH Heterozigoto balanceado
CAS Chemical Abstracts Service
DEC Decadurabolin (decanoato de nandrolona)
DUR Durateston (associao de propionato de testosterona,
fenilpropionato de testosterona, isocaproato de testosterona e
decanoato de testosterona)
EAA Esterides andrognicos anablicos
flr3 flare3
HB Cruzamento de alta bioativao
HEM Hemogenin (oximetolona)
MH Heterozigoto marcado
mwh multiple wing hairs
ORR;flr3 Oregon R, flare3
SMART Teste de Mutao e Recombinao Somtica
ST Cruzamento padro
URE Uretano (etilcarbamato)
WIN Winstrol Depot (estanozolol)
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Sumrio
Apresentao 1
Captulo I
Fundamentao terica
6
Corpo, sexualidade e o uso de esterides pelo gnero masculino 6
Testosterona e seus derivados sintticos 12
O citocromo P450 e o metabolismo de agentes xenobiticos 22
Alteraes genticas e a carcinognese 24
Teste para deteco de mutao e recombinao somtica (SMART) 26
Referncias Bibliogrficas
35
Captulo II
Avaliao genotxica de esterides andrognicos anablicos (EAA) sintticos derivados da testosterona em clulas somticas de Drosophila melanogaster
47
Resumo 50
Abstract 52
Introduo 53
Material e mtodos
Agentes qumicos
Obteno das larvas e tratamentos
Preparao das lminas e anlise do material
Tratamento estatstico dos dados
56
56
56
57
58
Resultados e discusso 59
Referncias bibliogrficas 64
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Captulo III
Efeitos inibidores do estanozolol sobre ao genotxica do etilcarbamato em clulas somticas de Drosophila melanogaster
84
Resumo 87
Abstract 89
Introduo 90
Material e mtodos
Agentes qumicos
Linhagens de moscas, cruzamentos e tratamentos
Preparao das lminas e anlise do material
Anlise estatstica
93
93
93
94
95
Resultados e discusso 96
Referncias bibliogrficas 100
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APRESENTAO
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1
Apresentao
Mais do que a simples utilizao de esterides anabolizantes, ou seus
possveis efeitos genotxicos e metablicos, as questes subjetivas
relacionadas ao gnero masculino, pouco exploradas, e muitas vezes
subestimadas pela nossa cultura, foram as razes da idealizao deste
trabalho. Os motivos pelos quais um indivduo encontra nos anabolizantes a
soluo para os anseios de atender a padres sociais de esttica e virilidade
so suficientes para tornar o universo dessa classe de substncias digno de
maior ateno no meio cientfico.
O desenvolvimento de um estudo para avaliar os efeitos genotxicos
(mutegnicos e recombinognicos) de esterides andrognicos anablicos
(EAA), derivados sintticos da testosterona, visa preencher uma importante
lacuna existente entre as poucas informaes a respeito dessas substncias, o
indcio dos EAA terem efeitos carcinognicos, sendo que estes apresentam
resultados negativos em testes convencionais de genotoxicidade.
Questes como estas levam discusso de hipteses, como a
possibilidade de uma ao carcinognica epigentica e no-mutagnica dos
EAA; a ineficincia dos testes empregados para detectar tipos especficos de
alteraes do material gentico, como a recombinao gnica; e at mesmo de
falhas amostrais nos estudos epidemiolgicos, que relacionam a utilizao de
EAA com a incidncia de cncer nos usurios.
Os EAA Winstrol Depot, Hemogenin, Deca Durabolin e
Durateston, utilizados na realizao desse trabalho, foram escolhidos
levando-se em considerao: informaes obtidas em academias de
musculao, com profissionais da rea de educao fsica; informaes
mdicas; dados de literatura; possibilidade de aquisio de EAA em farmcias
e academias de fisiculturismo; realizao de experimentos que permitem
avaliar comparativamente o potencial genotxico dos mesmos; possibilidade de
correlacionar a estrutura qumica com a atividade genotxica.
A escolha do teste para deteco de mutao e recombinao somtica
(SMART) em clulas de asas de Drosophila melanogaster, como mtodo
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investigativo, foi devida, alm de todas as suas vantagens de baixo custo,
rapidez e confiabilidade de resultados, possibilidade da deteco de
recombinaes gnicas somticas. Testes tradicionais j empregados para
avaliao de esterides no detectaram efeitos genotxicos, mas os mesmos
tm a recombinao gnica como um ponto cego, no detectando esse tipo
especial de alterao gentica de grande importncia na carcinognese.
Assim, um efeito positivo, recombinognico, detectado pelo SMART,
responderia questo da relao de efeitos carcinognicos de uma substncia
qumica, com esse tipo especfico de alterao gentica, assim como um efeito
negativo, reforaria a idia de causas epigenticas e no-mutagnicas.
Outra razo que favoreceu a escolha do SMART, como meio de
investigao, foi a possibilidade de avaliar a ativao metablica dos esterides
pelo sistema enzimtico citocromo P450, responsvel pelo metabolismo de
agentes xenobiticos, presente na D. melanogaster.
No caso especial de uma das substncias avaliadas, o Winstrol Depot
(WIN), a informao prvia de que seu constituinte, estanozolol, apresenta
interao com o citocromo P450, motivou a realizao de um teste
complementar onde foi verificada a interferncia dessa interao na ativao
metablica do uretano (URE - etilcarbamida), um agente com propriedades
mutagnicas comprovadas, que tem sua ao potencializada pela presena do
citocromo P450. A deteco dessa interao inibitria do citocromo P450
refora a possibilidade de ao epigentica e no-mutagnica dessa
substncia qumica na carcinognese, pois, a inibio do citocromo P450,
possibilitaria a ao de eventuais xenobiticos carcinognicos, no
metabolizados.
O estudo de EAA sintticos da testosterona entra em um campo, onde
h muito a ser explorado, e que desperta interesse em diversas reas, com
relaes cientficas multidisciplinares, pois, no sero descobertas de
mecanismos de ao genotxica, ou efeitos epigenticos de alteraes
metablicas indesejveis, e at mesmo a confirmao de efeitos
carcinognicos, que faro reduzir o grande nmero de indivduos que aderem,
a cada dia, ao uso dos anabolizantes, pois as razes pelas quais essas
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substncias so utilizadas envolvem relaes complexas de auto-imagem e
questes culturais que superam o medo e o risco de sua utilizao.
Este trabalho, enquanto pesquisa bsica, espera contribuir como
alicerce para outras descobertas sobre os anabolizantes, que ofeream formas
para minimizar seus efeitos indesejveis e tornar seu uso mais seguro, ou
ento, argumentos para reforar o controle da sua comercializao e o
investimento em campanhas educativas para conscientizar usurios, efetivos
ou em potencial, sobre seus riscos, uma vez que fcil julgar o que certo ou
errado quando se olha algo apenas por um nico ngulo, cartesiano e traado
sobre verdades absolutas, inquestionveis e imutveis. Mas, a realidade que
se vive um momento de crise e mudana de paradigmas, quando chegamos
necessidade de refletir e repensar razes, atitudes e escolhas.
Para a apresentao deste trabalho, o mesmo foi dividido em trs
captulos:
Captulo 1 - Apresenta uma reviso geral da literatura, com informaes sobre:
o corpo, a sexualidade, e o uso de esterides pelo gnero masculino; as
caractersticas fsico-qumicas e efeitos biolgicos dos EAA sintticos derivados
da testosterona, Winstrol (WIN estanozolol); Hemogenin (HEM
oximetolona); Deca Durabolin (DEC decanoato de nandrolona); e
Durateston (DUR associao de propionato de testosterona, fenilpropionato
de testosterona, isocaproato de testosterona e decanoato de testosterona); os
sistemas enzimticos responsveis pelo metabolismo de agentes xenobiticos;
assim como sobre a D. melanogaster e o teste para deteco de mutao e
recombinao somtica.
Captulo 2 - Apresenta o manuscrito denominado Avaliao genotxica de
esterides andrognicos anablicos (EAA) sintticos derivados da testosterona
em clulas somticas de Drosophila melanogaster, a ser enviado para
publicao na revista cientfica Environmental and Molecular Mutagenesis, no
qual, foram avaliados os EAA Hemogenin (HEM - oximetolona); Deca
Durabolin (DEC - decanoato de nandrolona); e Durateston (DUR -
associao de propionato de testosterona, fenilppropionato de testosterona,
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isocaproato de testosterona e decanoato de testosterona), por meio do teste
para deteco de mutao e recombinao somtica (Somatic Mutation And
Recombination Test - SMART) em clulas de asas de D. melanogaster.
Captulo 3 - Apresenta o manuscrito denominado Efeitos inibidores do
estanozolol sobre ao genotxica do etilcarbamato em clulas somticas de
Drosophila melanogaster, a ser enviado para publicao na revista cientfica
Environmental and Molecular Mutagenesis, que teve como objetivo avaliar a
genotoxicidade do WIN quando administrado isoladamente, e a sua
antigenotoxicidade quando associado ao etilcarbamato (URE uretano), por
meio do SMART de asas de D. melanogaster.
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CAPTULO I
FUNDAMENTAO TERICA
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FUNDAMENTAO TERICA
Corpo, sexualidade e o uso de esterides pelo gnero masculino
A era moderna tem como uma de suas caractersticas a razo de
produtividade, observada na busca insana por uma eficincia sobre-humana
refletida na necessidade da obteno de maior quantidade de resultados, em
menor espao de tempo, que favorecida pelo desenvolvimento da tecnologia
em todas as reas da cincia (Santos, 1997).
Buscando atender as exigncias da modernidade, vivemos uma
constante busca pela superao de expectativas, pois, nos vemos submetidos
a constantes avaliaes, algumas externas, e outras (a maioria), vindas de ns
mesmos. Desta forma, o corpo e a sexualidade so tambm submetidos a
constantes provaes, enquadrando o indivduo em um padro definido por
Lowen (1988) como sofisticao da sexualidade.
De acordo com Gaiarsa (1986), tanto os adultos quanto as crianas
gostam muito de fazer pose quanto s suas virtudes e, de regra, tm
conscincia muito limitada de seus prprios defeitos, buscando acreditar em
sua plena perfeio.
O indivduo moderno, sexualmente sofisticado, busca mais atender a
uma expectativa de uma avaliao de seu corpo e de seu desempenho, a
atingir sua prpria satisfao, pois, este sim, seria seu verdadeiro sucesso.
precisamente no medo do fracasso, por no corresponder s expectativas, que
o homem sexualmente sofisticado revela a presena de culpas e aflies
bsicas quanto sexualidade (Lowen, 1988). Em funo de atender tantas
exigncias, provoca-se ansiedade e insegurana na vida humana. Para muitos
homens, a vida sexual um blefe, pois lutam desesperadamente para manter
a imagem da infalvel mquina masculina, tornando a vida sexual competitiva,
voltada mais para a aparncia e o desempenho, do que para o prprio prazer
(McCarty, 1981).
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7
O desempenho dos papis de gnero so estabelecidos pela sociedade,
existindo sempre uma linha, mais ou menos comum, a todos os homens e
mulheres, em termos de comportamento. As diferenas vo acontecer de
cultura para cultura ou de poca para poca (Costa, 1994). O mito da
masculinidade sempre existiu na histria da humanidade, em toda sociedade
patriarcal, no s relacionado auto-imagem corporal, como tambm
virilidade (Santos, 2000).
O porqu de se comportarem assim faz parte de uma tradio muito
antiga, de uma viso de mundo como completo em si mesmo, com suas
prprias regras, cdigos, significados e respostas para todas as perguntas.
Certamente no foram os homens de hoje, como indivduos, que formularam a
idia de sexualidade masculina tal como ns conhecemos. Os homens de
hoje nasceram numa sociedade com uma carga imensa de imperativos
culturais que, por meio da censura ou do aplauso, os adaptaram a certos
padres de comportamento e pensamento. Diferenas situam um homem fora
do grupo de homens e tornam a vida difcil. Eventualmente, muitos homens
parecem perder a capacidade de distinguir entre seus prprios sentimentos e
essa ideologia violentamente reforada que impregna a cultura. Embora estas
definies culturais no tornem os homens particularmente felizes, a maioria
sente-se compelida a continuar exercendo esse papel (Hite, 1981).
No mundo atual se v uma valorizao de msculos e de fora, numa
simbologia de virilidade, competncia e de conquistas. O carro, a velocidade e
o estilo so novos smbolos de poder masculino, como tambm o dinheiro e a
casa em que ele reside. Tambm importante para a auto-estima do homem,
mostrar que ainda bastante forte seu vigor sexual (Santos, 2000).
Uma desvantagem de grande importncia na vida do homem, e que o
coloca sempre numa situao angustiante, a necessidade de esconder
sentimentos e mostrar-se forte. O que acontece, que o prprio conceito de
ser forte mal compreendido. Forte, no o indivduo que suporta a dor sem
demonstrar seus sentimentos. Essa , na verdade, a pessoa que no consegue
demonstrar suas emoes. Forte, quem reconhece que tem medo e que
precisa de muita coragem para enfrentar os seus fracassos. O homem insiste
na imagem que lhe foi transmitida desde a infncia, de que capaz de vencer
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todos os obstculos. Com isso, no consegue humanizar suas relaes com as
pessoas, perde a oportunidade de falar de si prprio e de externar sentimentos
que lhe incomodam. Essa angstia impede que trocas afetivas importantes
sejam realizadas. O isolamento dentro de si prprio constitui o perfil tpico do
indivduo que, em determinado momento da vida, comea a ter problemas de
ordem psico-somtica, como lcera duodenal, hipertenso arterial, infarto ou
impotncia sexual. O homem que no revela seus sentimentos e
preocupaes, e no descarrega suas tenses, torna-se reprimido e
enclausurado dentro de suas emoes (Costa, 1993).
Os homens da gerao atual sofrem de uma baixa auto-estima,
resultante das cobranas da sociedade e da mdia para que tenham corpos
perfeitos. Esse fenmeno denominado de Complexo de Adnis, tambm
chamado de bigorexia ou anorexia nervosa reversa. Faz com que os
homens, cada vez mais, possuam uma auto-imagem distorcida de seus corpos
e sintam-se deprimidos por isso (Pope et al., 1999).
exigido do homem um maior cuidado com a aparncia, diante da idia
de que, se estiver em melhor forma fsica e bem apresentvel, ter maior
chance no mercado de trabalho, mais disposio nas horas de lazer, maior
satisfao consigo prprio e, acima de tudo, maior sucesso na atrao sexual.
Com isso, busca atender ao padro de beleza aceito como ideal pela
sociedade. Aqueles que no conseguem se adequar a esse padro,
desenvolvem um sentimento de inferioridade, ficando inibidos nas iniciativas de
conquistas sexuais e profissionais, devido baixa auto-estima (Valadares,
2001).
Mais do que nunca, os homens esto lutando com a mesma e enorme
presso para obter a perfeio fsica, qual eram submetidas anteriormente as
mulheres. Do halterofilismo compulsivo, at o uso de esterides, dos implantes
de cabelo at a cirurgia plstica, cada vez maior nmero de homens est
procurando satisfazer as exigncias por msculos, pele e cabelos perfeitos,
ultrapassando a linha do interesse normal em direo obsesso patolgica.
Esta nova obsesso com a aparncia aflige homens de todas as idades e com
todos os tipos de vida. Em suas formas mais severas, podem criar uma
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ameaa sade to insidiosa e mortal quanto os distrbios da alimentao,
como a bulimia e anorexia, para mulheres (Pope et al., 1999).
Com os movimentos feministas, a identidade feminina est relatada,
discutida e apresentada em muitos estudos e pesquisas, em especial, desde a
dcada de 1960. No entanto, s a partir da dcada de 1990, estudos e
publicaes voltadas para questes masculinas vm ganhando ateno e
espao (Rodrigues Jr., 1995).
Goldenberg (2005) destaca o paradoxo que o culto ao corpo gera nesta
cultura das camadas mdias urbanas. Quanto mais se impe o ideal de
autonomia individual, mais aumenta a exigncia de conformidade aos modelos
sociais do corpo. Considerando verdade que o corpo tenha se emancipado de
muitas de suas antigas prises sexuais, ele se encontra, atualmente,
submetido a novas coeres estticas. A obsesso com a magreza, a
multiplicao das academias de musculao, o uso de anabolizantes, so
apenas alguns dos exemplos que testemunham o poder de normalizao (ou
padronizao) dos modelos, um desejo maior de conformidade esttica que se
choca com o ideal individualista e sua exigncia de singularizao dos sujeitos.
Com o desenvolvimento de tcnicas de treinamento, conhecimento
nutricional e administrao hormonal, o culto ao corpo passou a ser
supervalorizado e, uma de suas conseqncias, um padro esttico baseado
no desenvolvimento muscular. Sobretudo, em pases de clima tropical, como o
nosso, onde o corpo fica mais a mostra, esse culto ainda mais exacerbado,
se expressando na possibilidade de desenvolver ao mximo o potencial da
massa muscular como padro de beleza. A idia de que um indivduo forte
um indivduo saudvel, ultrapassou a esfera do bom senso e mascarou as
conseqncias do uso de esterides anabolizantes, e seu emprego passou a
ter um carter totalmente secundrio ao objetivo principal de obter msculos
(Neves et al., 2005).
Em casos mais graves de distoro da auto-imagem, temos a dismorfia
muscular, um subtipo do transtorno corporal que ocorre principalmente em
homens que, apesar da grande hipertrofia muscular, consideram-se pequenos
e fracos. um quadro ainda pouco estudado, mas que parece ser prevalente
entre indivduos do sexo masculino. Sua gnese pode ser parcialmente
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explicada por fatores ambientais como uma crescente presso exercida em
grande parte pela mdia para que os homens tenham um corpo forte e
musculoso, acarretando um aumento na incidncia do transtorno. A dismorfia
muscular est associada a sofrimento e danos em vrias reas de
funcionamento do indivduo, com prejuzos sociais, ocupacionais e recreativos,
alm de sua presena aumentar o risco de uso de esterides anabolizantes.
Apesar de seu tratamento ainda no estar definido, importante que o quadro
seja identificado e que as diretrizes teraputicas atualmente disponveis sejam
aplicadas (Assuno, 2002).
Diante dessa crescente valorizao do corpo nas sociedades de
consumo ps-industriais, exibida nos meios de comunicao de massa, um
nmero crescente de jovens e adolescentes tambm se envolve com o uso de
esterides anabolizantes, na inteno de desenvolver rapidamente massa
muscular, como uma tentativa precoce de uma identidade de destaque em
seus grupos (Coutrine, 1995).
O consumo dessas substncias, especialmente entre jovens atletas, tem
sido registrado com freqncia ascendente em vrios pases (Perry et al.,
1992; Nilson, 1995; Scott et al., 1996; Lise et al., 1999). Nos Estados Unidos,
um estudo populacional estimou em mais de um milho o nmero de usurios
de anabolizantes (Yesalis et al., 1993).
Tricker et al. (1989) estabeleceram um perfil de usurios e no-usurios
de esterides anabolizantes nos estados do Kansas e Missouri (EUA),
detectando 54% de usurios entre o pblico fisiculturista do gnero masculino
e, 10%, do feminino. Em relatrio do National Institute on Drug Abuse (NIDA)
informado um aumento de 50% entre os estudantes de cursos secundrios
(high school) que utilizam estas substncias em um tempo de quatro anos. O
aumento do uso de suplementos alimentares e anabolizantes levou o governo
norte-americano a lanar uma campanha nacional para alertar os jovens dos
perigos associados sua utilizao (Durant et al., 1993; Yesalis et al., 1997).
No Brasil, estudos que abordam o uso de anabolizantes so escassos,
no existindo dados epidemiolgicos que indiquem a extenso do consumo
dessas substncias. Alguns indcios, no entanto, sugerem que o uso de
anabolizantes crescente entre os jovens e adolescentes pertencentes s
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diferentes classes sociais, podendo representar, em breve, um importante
problema de sade pblica (Manetta e Silveira, 2000; Araujo et al., 2002; Silva
et al., 2002; Souza e Fisberg, 2002; Silva et al., 2003; De Micheli e Formigoni,
2004; Carreira Filho e Martins Filho, 2005; Neves et al., 2005; Dal Pizzol Tda et
al., 2006; Lucas et al., 2006).
Outra questo importante dentro do gnero masculino a necessidade
de manter-se jovem, alm da aparncia forte e saudvel, ainda com as
atividades mentais, fsicas e sexuais inalteradas. O processo de
envelhecimento do homem associado com o declnio progressivo na
produo andrognica. S recentemente, no entanto, um significativo interesse
foi desenvolvido em torno da importncia do problema, que conhecido como
climatrio masculino, andropausa, declnio andrognico no homem que
envelhece, ou, mais apropriadamente, deficincia andrognica no
envelhecimento masculino (Cairoli, 2004).
O termo andropausa, embora biologicamente inoportuno e no muito
bem definido, representa transformaes fsicas e emocionais que, mesmo
relacionadas ao envelhecimento em geral, esto associadas principalmente a
uma significante alterao hormonal (Morales et al., 2004).
Diante de uma condio controversa e pouco conhecida, diversos
estudos procuram por dados contundentes na busca de uma base slida para a
discusso de questes relacionadas andropausa. Conseqncias da
deficincia de testosterona parecem ser mais salientes em termos fsicos que
psicolgicos, quando testadas cientificamente. Tratando-se especificamente de
terapia de reposio hormonal, ainda se procura o andrognio ideal, especfico
para rgos alvo e sem efeitos direcionados a outras funes fisiolgicas. O
papel dos nveis de testosterona primordialmente importante na
caracterizao do quadro de andropausa, porm, os sinais e sintomas do
envelhecimento so de origem multifatorial (Molle et al., 2004).
Na maioria das vezes, no se verifica no sexo masculino um declnio
abrupto das funes gonadais, como ocorre no sexo feminino. No homem, com
o passar do tempo, ocorre progressiva reduo da atividade sexual, diminuio
da libido, diminuio da fora e massa muscular. No se afigura como
completamente benfica a teraputica com suplementao andrognica em
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homens idosos, ainda mais na eminncia de possveis relaes entre os
andrognios e o cncer de prstata (Silva, 2006).
A testosterona h muito conhecida pelos seus efeitos anabolizantes,
no entanto, no se sabe se o declnio da fora e massa muscular est
relacionado queda paralela de testosterona no envelhecimento. Por outro
lado, sabe-se que a reposio hormonal com testosterona provocar uma
melhora tanto na fora muscular e na massa ssea (Cairoli, 2004).
A utilizao de esterides derivados de testosterona pode resolver
tambm o problema da diminuio da libido, mas, no h comprovaes de
que solucione problemas de disfuno ou impotncia ertil, devido justamente
s mltiplas origens das disfunes da ereo (Molle et al., 2004).
Distrbios endcrinos correspondem a cerca de 3% a 5% dos casos de
disfuno ertil. Na maioria dos casos, o distrbio hormonal guarda relao
com a baixa dosagem de testosterona no sangue (hipogonadismo), ocasionada
geralmente por condies mrbidas. Um tema muito controverso atualmente
a diminuio dos nveis sangneos da testosterona em homens acima de 50
anos, sem doena endcrina detectvel, sendo um fenmeno que se manifesta
em aproximadamente 15% dos indivduos do gnero masculino. A Indicao do
tratamento com reposio hormonal tem sido motivo de discusso e
controvrsias em congressos e publicaes mdicas (Gromatzky, 2000).
Testosterona e seus derivados sintticos
Nos humanos, a testosterona constitui o andrognio mais importante
secretado pelo testculo. No homem so produzidos diariamente 8,0 mg de
testosterona, sendo aproximadamente 95% sintetizada pelas clulas de Leydig,
nos testculos, e 5% pelas supra-renais. Os nveis plasmticos de testosterona
no homem so em torno de 0,6 g/dL aps a puberdade e, geralmente,
declinando depois dos 50 anos de idade do indivduo (Katzung, 2006).
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No perodo embrionrio, a partir da oitava ou nona semana, as clulas
de Leydig fetais produzem testosterona, que estabiliza os ductos de Wolff,
permitindo sua diferenciao em epiddimos, canais deferentes, vesculas
seminais e ductos ejaculatrios. A testosterona convertida pela enzima 5-
reductase tipo 2 em diidrotestosterona, que viriliza os rudimentos genitais
externos entre a nona e a dcima segunda semana de gestao (Maciel-
Guerra e Guerra Jnior, 2002).
Nos tecidos, a diidrotestosterona constitui o principal andrognio ativo. A
converso da testosterona em estradiol pela aromatase P450 tambm ocorre
em alguns tecidos, incluindo o tecido adiposo, o fgado e o hipotlamo, onde
pode ser importante na regulao gonadal (Katzung, 2006).
Os hormnios so, em vrios casos, substncias que ativam a
transcrio de genes especficos. No caso dos esterides, devido sua
natureza lipdica, podem penetrar na clula por lipossolubilidade e se
associarem aos receptores no ncleo. Estas molculas podem se ligar ao DNA
em regies promotoras e acentuadoras de transcrio (Mottran e George,
2000).
A partir do progressivo entendimento da regulao da biossntese e da
secreo dos andrgenos, bem como de seus efeitos, teve lugar a aplicao
teraputica destas substncias. Incialmente, nos tratamentos de diferentes
estados hipogonadais masculinos, e, por extenso, na oligospermia. Em
seguida, surgiu sua utilizao como anabolizante para o sexo masculino e, com
uma procura no to expressiva, pelo pblico feminino. Mais recentemente,
como conseqncia do melhor conhecimento das modificaes na
espermatognese sob ao andrognica, admite-se a especulao e a
pesquisa em torno da hiptese de sua utilizao como anticoncepcional
masculino (Silva, 2006).
Em 1888, foram realizados experimentos onde extratos de testculos de
animais eram injetados em ces e humanos, promovendo um aumento de fora
muscular, apetite e funcionamento do trato intestinal, mas s em 1920
intensificou-se a pesquisa com hormnios e os mecanismos de ao e
regulao do sistema endcrino. Os esterides anabolizantes foram
desenvolvidos primeiramente da dcada de 1930, onde cientistas alemes
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14
utilizavam em ces e em seus prprios soldados na segunda guerra mundial,
sendo acusados de desenvolver pesquisas com humanos prisioneiros para o
desenvolvimento dos anabolizantes. Muitos resultados destes experimentos se
perderam por nunca terem sido publicados, havendo relatos de que
anabolizantes eram administrados aos soldados para aumentar a
agressividade das tropas. Na dcada de 1950, atletas russos e europeus
passaram a fazer uso de esterides, considerando os benefcios que estes
proporcionavam em competies e, uma dcada mais tarde, os esterides
estavam disponveis no mercado (Santos, 2003).
Os esterides anablico-andrognicos, comumente chamados de
anabolizantes, so substncias derivadas sintticas do hormnio masculino
testosterona, geralmente extrado de testculos de bovinos e modificadas em
laboratrio. Esta substncia promove o anabolismo protico, um aumento da
sntese de protenas no organismo, que associada a exerccios fsicos,
aumenta a fora e a massa muscular, mudando a aparncia do corpo sem
grandes esforos. Em doses altas, os anabolizantes aumentam o metabolismo
basal, o nmero de hemcias e a capacidade respiratria. Estas alteraes
provocam ainda uma reduo da taxa de gordura corporal (Muniz et al., 1997;
Iriart e Andrade, 2002).
Os esterides anablico-andrognicos so originados de trs tipos de
alteraes na molcula de testosterona para minimizar ou excluir o
metabolismo heptico destas substncias qumicas, sendo que estas
alteraes tambm definem as classes de anabolizantes (Mottran e George,
2000). A estrutura bsica da testosterona com os tipos de modificaes que a
mesma pode sofrer na sntese dos diferentes tipos de esterides est
representada na Figura 1.1.
As modificaes na molcula objetivam alterar suas propriedades,
aumentando a ao anablica (sntese protica) em relao aos efeitos
andrognicos (acentuao dos caracteres sexuais masculinos secundrios)
deste hormnio (Muniz et al., 1997; Kimtz et al., 1999; Mottram e George, 2000;
Santos, 2003; Neves et al., 2005).
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15
Figura 1.1 Estrutura comum maioria dos esterides derivados sintticos da
testosterona, com indicao das posies na molcula onde se encontram os
tipos de variaes (A, B e C) das diferentes classes de esterides
anabolizantes (adaptado de Mottram e George, 2000).
As modificaes na molcula de testosterona podem ser diferenciadas
em grupos:
Classe A esterides produzidos via esterificao do grupo 17-
hidroxil, como o propionato, fenilpropionato, cipionato e enantato de
testosterona. Estes derivados andrognicos so mais solveis em
veculo lipdico, utilizado para injees. A testosterona, quando injetada
em uma soluo de leo, rapidamente absorvida, metabolizada e
excretada.
Classe B anlogos alquilados na posio 17, como a
metiltestosterona.
O R1 (tipo A)
(tipo C em qualquer um destas posies)
R2 (tipo B)
1
2
3
4
8
5 6
7
11
10
9
12
16 19
18
17
14
13
15
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Classe C so anabolizantes produzidos por diferentes alteraes em
qualquer posio nos anis de sua estrutura (ex. estanozolol e
oximetolona).
As classes B e C so mais utilizadas em preparaes via oral.
Apresentam boa absoro e excreo rpida, porm, maior toxicidade heptica
que os injetveis (Lise et al., 1999; Mottran e George, 2000; Santos, 2003).
Winstrol Depot (WIN), apresentado como soluo injetvel, em
ampolas de 1 mL contendo 50 mg de estanozolol (CAS 10418-03-8), distribudo
pelo Laboratrio Zambon S.A. (Barcelona, Espanha). um derivado sinttico
do hormnio testosterona, indicado no tratamento de angioedema hereditrio,
para diminuir a freqncia e a severidade das crises (Sanofi-Synthelabo, 1999)
e tambm para o tratamento de anemias (Reynolds e Prasad apud Rendic e
Ruf, 1988), asma, artrite reumatide, anorexia, fraturas de lenta consolidao,
queimaduras extensas e perodos pr e ps-operatrio. considerado um
esteride de efeito andrognico e efeitos colaterais relativamente baixos. Em
doses altas, pode causar danos ao fgado (Santos, 2003). Sua frmula
estrutural apresentada na Figura 1.2A.
Hemogenin (HEM), apresentado na forma de comprimidos contendo
50 mg de oximetolona (CAS 434-07-1), distribudo pela Aventis Pharma Ltda.
(Suzano SP, Brasil). um esteride de uso oral, indicado para o tratamento
de anemias causadas pela produo deficiente de eritrcitos e mielofibrose
(Lima, 2004). um forte anabolizante, mas com ao andrognica alta,
comparada testosterona. Proporciona rpido ganho de fora e massa
muscular, mas, txico ao fgado, causa reteno de lquidos, aumento de
presso arterial, acne, ginecomastia, problemas estomacais e calvcie, devido
elevao dos nveis de diidrotestosterona (Santos, 2003). Sua frmula
estrutural apresentada na Figura 1.2B.
Deca Durabolin (DEC), apresentado como soluo injetvel, em
ampolas de 1 mL contendo 50 mg de decanoato de nandrolona (CAS 360-70-
03), distribudo pelo Laboratrio Organon (So Paulo SP, Brasil). indicado
como coadjuvante para terapias especficas e medidas dietticas, em
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17
condies patolgicas caracterizadas por balano de nitrognio negativo, como
doenas debilitantes crnicas, terapias prolongadas com glicocorticides e
aps grandes cirurgias, traumas e osteoporose. Em mulheres, apresenta
efeitos de virilizao, aumento da libido, aumento de plos pubianos, hipertrofia
clitoriana e amenoria; para pr-puberes do sexo masculino, aumento flico e
da freqncia de erees, inibio da espermatognese; fechamento epifisrio
prematuro e reteno de gua e sais (Lima, 2004). o esteride mais utilizado,
com efeitos andrognicos e anablicos, muitas vezes administrado em
associao com outras substncias qumicas (Santos, 2003). Sua frmula
estrutural apresentada na Figura 1.2C.
Durateston (DUR), apresentado como soluo injetvel, em ampolas
de 1 mL, distribudo pelo Laboratrio Organon (So Paulo SP, Brasil).
Combina a ao de quatro compostos derivados por esterificao do grupo
17-hidroxil da testosterona: propionato de testosterona, 30 mg (CAS 57-85-2);
fenilpropionato de testosterona, 60 mg (CAS 1255-49-8); isocaproato de
testosterona, 60mg (CAS 15262-86-9); e decanoato de testosterona, 100 mg
(CAS 5721-91-5). utilizado para reposio da testosterona em distrbios
hipogonadais no homem, como aps castrao, eunucoidismo,
hipopituitarismo, impotncia endcrina, sintomas do climatrio masculino
(diminuio da libido e decrscimo da atividade mental e fsica), infertilidade
devido a distrbios da espermatognese e osteoporose por origem deficitria
de andrgenos (Lima, 2004). Apresenta ao imediata e por tempo prolongado
em ganho de massa muscular e fora (Santos, 2004). As frmulas estruturais
dos quatro compostos presentes nesta substncia so apresentadas na Figura
1.3.
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18
(A) Estanozolol (CAS: 10418-03-8)
(B) Oximetolona (CAS: 434-07-1)
(C) Decanoato de nandrolona (CAS: 360-70-03)
Figura 1.2. Estruturas qumicas dos esterides anablico-andrognicos (EAA)
Estanozolol (Winstrol Depot WIN) (A); Oximetolona (Hemogenin HEM)
(B); Decanoato de nandrolona (Deca Durabolin DEC) (C).
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19
(A) Propionato de testosterona
(CAS: 57-85-2)
(B) Fenilpropionato de testosterona
(CAS: 1255-49-8)
(C) Isocaproato de testosterona
(CAS: 15262-86-9)
(D) Decanoato de testosterona
(CAS: 5721-91-5)
Figura 1.3. Estruturas qumicas dos esterides anablico-andrognicos (EAA)
constituintes do Durateston (DUR): Propionato de testosterona (A);
Fenilpropionato de testosterona (B); Isocaproato de testosterona (C);
Decanoato de testosterona (D).
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20
A Comisso Mdica do Comit Olmpico Internacional considera os
esterides anabolizantes como agentes de doping e probe seu uso dentro do
atletismo, havendo controle e punio severa de atletas que fazem uso de
qualquer anabolizante para melhorar sua performance (Rendic e Ruf, 1988;
Huenerbein et al., 2003).
De acordo com o National Institute on Drug Abuse (NIDA, 2007), so
desenvolvidos nos Estados Unidos da Amrica do Norte (USA) mais de 100
tipos de esterides anabolizantes, que requerem prescrio mdica para serem
usados legalmente, mas no h estimativas de quantidade e controle de uso e
produo, quando estes so sintetizados ilegalmente em laboratrios
clandestinos.
Entre os fisiculturistas, a principal razo do uso de esterides
anabolizantes est relacionada ao fato de que estas substncias so
importantes para vencerem competies e, ainda, motivada por dados
consistentes de relatrios de ganhos significativos de fora e musculatura pelos
usurios (Tricker et al.,1989).
Estudos indicam que o aumento mais significativo da massa muscular e
da fora, durante a administrao de esterides anabolizantes so observadas
apenas em atletas que realizam trabalho de treinamento intensivo, com
continuidade, e mantendo ainda uma dieta hiper-calrica e rica em protenas e
aminocidos (Kibble e Ross, 1987).
O uso inadequado de anabolizantes pode causar srios prejuzos
sade, como problemas cardacos, hipertenso arterial, distrbios psicolgicos
provocados pelo aumento da agressividade, complicaes hepticas e reduo
dos hormnios sexuais. No homem, pode haver diminuio da produo de
espermatozides, alm da atrofia dos testculos e aumento das mamas
(ginecomastia). As mulheres podem apresentar aumento do clitris e
crescimento excessivo de plos (Mottran e George, 2000; Katzung, 2006; Silva,
2006).
Iigo et al. (2000) descrevem diversas formas de utilizao dos
esterides anabolizantes por esportistas e, ainda, efeitos colaterais relatados
ou apresentados pelos atletas usurios. As formas de administrao combinam
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21
diversos tipos de substncias em doses elevadas, ocorrendo em perodos
denominados como ciclos.
A lista dos prejuzos extensa e incompleta, porque, como no h
controle, os jovens e atletas, no anonimato, usam doses excessivas e com
diversas associaes de anabolizantes, assim, dificultando a identificao de
efeitos colaterais que podem ainda surgir com o tempo de uso (Muniz et al.,
1997).
Iriart e Andrade (2002) descrevem a falta de informaes sobre a
extenso dos danos sade, decorrentes do uso de anabolizantes por parte
dos usurios, mostrando que, para muitos, o desejo de desenvolver massa
muscular e alcanar o corpo ideal se sobrepe ao risco de efeitos colaterais.
De modo geral, a pouca informao desses usurios sobre esses produtos,
suas propriedades farmacolgicas e efeitos colaterais, so oriundas da
experincia pessoal, da observao dos usurios das academias e dos relatos
de casos vivenciados por amigos ou conhecidos. Sintomas menores e
temporrios, tais como, cefalia, nuseas, tonturas, irritabilidade, acne, febre e
aumento dos plos corporais, com o tempo, so considerados normais pelos
usurios de anabolizantes, no transparecendo preocupaes com os
possveis efeitos em longo prazo que o uso contnuo dessas substncias possa
produzir.
Alguns estudos discutem uma possvel relao causa-conseqncia da
utilizao de hormnios sexuais (estradiol, testosterona e seus derivados) com
a ocorrncia de alguns tipos de tumores, especialmente de fgado e prstata
em humanos, e em experimentos com animais (Carrasco et al., 1985; Taylor,
1987; Anthony, 1988; Froehner et al., 1999; Socas et al., 2005; Bosland, 2006;
Giannitrapani et al., 2006; Ricke et al., 2006; Gorayski, et al., 2007), ao mesmo
tempo em que estes hormnios no apresentaram potencial mutagnico em
testes com Salmonella/microssoma e linhagens de clulas V79 de hamster
chins (Lang e Redmann, 1979; Lang e Reimann, 1993) e testes de aberraes
cromossmicas em linfcitos humanos e microncleo em medula ssea de
camundongos (Reimann et al., 1996), sugerindo um efeito carcinognico
destas substncias qumicas por ao epigentica e no-genotxica.
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22
Resultados no genotxicos tambm foram encontrados para o
anabolizante Hemogenin (HEM), oximetolona, por meio do teste de troca
entre cromtides irms em linfcitos humanos (Ahmad et al., 2003); e por
Holden et al. (1999) em ensaios com microrganismos e com clulas de
mamferos (aberraes cromossmicas em linfcitos humanos in vitro, teste de
microncleo em eritrcitos de sangue perifrico de roedores).
Citocromo P450 e o metabolismo de agentes xenobiticos
A exposio diria a uma grande variedade de agentes xenobiticos
(compostos estranhos ao organismo) pode ser inadvertida, acidental, e s
vezes inevitvel, levando absoro no intencional e inconsciente destes,
atravs dos pulmes e pele, ou ingesto, como o que acontece com
contaminantes presentes nos alimentos e na gua. Por outro lado, a exposio
pode ser deliberada e consciente, como acontece, por exemplo, na forma de
medicamentos, com fins teraputicos ou no. Alguns agentes xenobiticos so
inofensivos, outros, porm, podem provocar respostas biolgicas de natureza
farmacolgica ou txica. Essas respostas biolgicas geralmente dependem da
converso da substncia absorvida em um metablito ativo ou no, com a
finalidade principal de ser eliminada (Oshima-Franco e Franco, 2003).
A biotransformao de agentes xenobiticos ocorre no interior das
clulas, promovida por enzimas que modificam estas substncias, geralmente
lipossolveis, em estruturas polares, solveis em gua e de fcil eliminao
(Meyer, 1996). As reaes de biotransformao ocorrem por meio de enzimas
em vrios tecidos do organismo (sangue, rins, pulmes, pele, tecido nervoso,
intestino delgado e fgado), mas, principalmente no fgado, que encontramos
a maior expresso dessas enzimas (Watkins, 1992).
A maioria dos xenobiticos atinge o organismo atravs da via
gastrointestinal e, neste sentido, o fgado o principal rgo de
biotransformao devido a sua posio, suprimento de sangue e funo. As
-
23
enzimas envolvidas na biotransformao esto localizadas principalmente no
retculo endoplasmtico liso e no citosol das clulas hepticas, em nmero
menor, esto presentes ainda nas mitocndrias e em outras organelas
(Oshima-Franco e Franco, 2003).
As enzimas citocromo P450 formam uma grande famlia de
hemoprotenas envolvidas especialmente no metabolismo de substncias
qumicas (agentes xenobiticos), como tambm na biossntese de lipdeos,
esterides, vitaminas e outros metablitos naturais das clulas (Chefson e
Auclair, 2006), sendo essenciais para todo organismo vivo, tanto procarioto
quanto eucarioto (Nebert e Gonzalez, 1987; Nebert et al., 1989).
A famlia de genes do citocromo P450 diversificou-se desde sua origem,
h mais 3,5 bilhes de anos, para adaptar-se ao metabolismo de um nmero
crescente de substncias qumicas ambientais, toxinas alimentares e
substncias qumicas ingeridas diariamente (Benet e Scheiner, 1987).
O componente primordial desse complexo enzimtico o citocromo
P450, monoxigenase que apresenta um ncleo pirrlico com tomo de ferro,
semelhante hemoglobina, sendo, por esse motivo, considerada uma
hemoprotena. Os outros componentes do sistema microssomal heptico so
trs flavoprotenas (NADPH-citocromo P450 redutase, NADH-citocromo b5-
redutase e N-oxidade), responsveis pela transferncia de eltrons, e outra
hemoprotena, o citocromo b5 (Oga, 2003).
O sistema enzimtico citocromo P450 pode ser isolado a partir de
seqncias de homogeneizao e ultracentrifugao de tecido heptico, que
levam fragmentao e re-selamento do retculo endoplasmtico liso, em
vesculas que mantm suas caractersticas, denominadas microssomas.
Enzimas desidrogenases, esterases, amidases e transferases so encontratas
na frao solvel (citoplasmtica) e monoamino oxidases, na frao
mitocondrial (Oshima-Franco e Franco, 2003).
Algumas substncias so capazes de se ligar ao o P450, como o caso
do estanozolol, derivado sinttico de testosterona, que tem a propriedade de
interagir com o citocromo P450 formando um complexo com alta afinidade de
ligao (Rendic e Ruf, 1988), sendo que essa interao inibe a ao
metablica do citocromo P450 (Nakajin et al., 1989).
-
24
As conseqncias da inibio correspondem menor velocidade de
biotransformao, aumento dos nveis do agente xenobitico no organismo,
aumento dos efeitos farmacolgicos, e maior toxicidade da substncia qumica
(Benet e Scheiner, 1987).
Os agentes xenobiticos podem, na biotransformao, tanto ser
inativados, quanto gerar metablitos com atividade aumentada, ou com efeitos
txicos, mutagnicos, teratognicos e carcinognicos (Oshima-Franco e
Franco, 2003), como o caso do uretano (URE etilcarbamato), um agente
genotxico que tem sua ao potencializada pelo metabolismo do P450
(Frlich e Wrgler, 1990; Graf e van Scheik, 1992; Abraham e Graf, 1996;
Dogan et al., 2005).
Alteraes genticas e a carcinognese
No decorrer da vida, o material gentico sofre alteraes denominadas
de mutaes, que podem ser causadas por erros durante a duplicao do DNA.
As mutaes ocorrem em todo ser vivo, sendo um processo fundamental para
a evoluo e diversidade das espcies, mas, na maioria dos casos, as
mutaes podem no ser percebidas, ou por no causarem modificaes
detectveis na atividade metablica, ou por determinar a morte celular. Desta
forma, apenas um pequeno nmero de mutaes que ocorrem em genes
especficos pode ser detectado, determinando assim, vantagens para o
organismo ou ento um crescimento desordenado de clulas (Ribeiro e
Marques, 2003).
As alteraes genticas e a carcinognese esto estreitamente
associadas, porque ambas representam alteraes em uma nica clula,
permanentes e herdveis pelas clulas filhas. Por isso, os testes de
mutagenicidade so recomendados para pr-seleo de agentes qumicos a
serem avaliados quanto ao seu potencial carcinognico (Rabelo-Gay et al.,
1991).
-
25
Os agentes mutagnicos aceleram o aparecimento de mutaes e esto
relacionados ao aparecimento das neoplasias. Aps passar por vrias divises,
uma clula pode acumular mutaes que, se em nmero elevado, podero
determinar o aparecimento do cncer (Ribeiro e Marques, 2003).
Os tumores surgem atravs de um processo de mltiplas etapas no qual
ocorrem as mutaes herdadas (derivadas de clulas germinativas) e
mutaes somticas de genes celulares, seguidas de uma seleo clonal da
prognie variante com propriedades de crescimento mais robustas e
agressivas. A grande maioria das mutaes que contribuem para o
desenvolvimento e comportamento das clulas tumorais so mutaes
somticas que surgem durante o desenvolvimento do tumor e esto presentes
apenas nas clulas neoplsicas do paciente. Uma pequena frao de todas as
mutaes que ocorrem no cncer pode ser constitucional, estando, dessa
forma, presentes em todas as clulas somticas dos indivduos afetados; tais
mutaes podem no apenas predispor o indivduo ao cncer, como tambm
ser passadas para as geraes futuras (Ojopi e Dias Neto, 2002).
As causas de um tumor so variadas, podendo ser endgenas ou
exgenas, estando, no entanto, inter-relacionadas. As causas exgenas
relacionam-se ao ambiente, so agentes normalmente presentes no meio (luz
solar, radiaes ionizantes ou agentes qumicos) e aos hbitos ou costumes
scio-culturais associados ao estilo de vida e qualidade da dieta, enquanto, as
causas endgenas, so geneticamente pr-determinadas e esto ligadas
capacidade do organismo se defender das agresses externas ou a pr-
disposio ao desenvolvimento da neoplasia. Esses fatores podem se interagir
de vrias formas, aumentando a probabilidade de transformaes malignas nas
clulas normais (Setlow, 2001; Ribeiro e Marques, 2003).
A maioria das alteraes genticas mais importantes no cncer ocorrem
nos genes que controlam a proliferao celular (proto-oncogenes e genes
supressores tumorais), resultando em um crescimento descontrolado
caracterstico da clula maligna. Alm disso, h ainda o envolvimento de genes
associados ao processo de reparo de danos no DNA, os quais, quando
inativos, podem elevar a taxa de mutao das clulas, causando,
-
26
eventualmente, a alterao de genes importantes na carcinognese (Ojopi e
Dias Neto, 2002).
A gentica toxicolgica tem centrado suas investigaes no uso de
diferentes bioensaios capazes de detectar mutaes pontuais, aberraes
cromossmicas e eventos aneuploidognicos. Ainda que a alta correlao
entre estas leses e o desenvolvimento do processo carcinognico seja um
fato iquestionvel, permanecem as consideraes sobre a existncia de
carcingenos destitudos de atividade mutagnica, seja ela gnica ou
cromossmica (Richard, 1994 apud Andrade e Lehmann, 2003).
Novos sistemas de testes foram desenvolvidos para a deteco de um
parmetro especial de alterao gentica, a recombinao mittica. Alguns
agentes recombinognicos podem estar envolvidos diretamente com a
carcinognese (Andrade e Lehmann, 2003).
O principal argumento que refora a participao da recombinao entre
homlogos como um dos fatores preponderantes no processo carcinognico
a demonstrao de que a recombinao homloga o mecanismo que mais
contribui para a perda da heterozigoze em clulas somticas (Bishop e
Schiestl, 2000 apud Andrade e Lehmann, 2003).
A perda da heterozigose pode levar espresso de genes mutantes,
antes mascarados pelo alelo selvagem (Gusmn-Rincn e Graf, 1995). Assim
sendo, as recombinaes somticas apresentam um papel iniciador na
carcinognese envolvidas em etapas secundrias e subseqentes, onde
mutaes oncognicas recessivas so reveladas (Bishop e Schiestl, 2002).
Teste para deteco de Mutao e Recombinao Somtica (SMART)
O teste para deteco de mutao e recombinao somtica ("Somatic
Mutation And Recombination Test" - SMART) em clulas de asas de Drosophila
melanogaster foi desenvolvido por Graf et al. (1984), sendo considerado um
teste rpido, barato e que produz resultados confiveis, inequvocos e
altamente reproduzveis. A D. melanogaster apresenta, ainda, as vantagens de
ter um curto perodo de gerao, o que possibilita a rapidez do teste; um
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27
pequeno nmero de cromossomos; linhagens muito bem caracterizadas
geneticamente; e um sistema enzimtico semelhante ao dos mamferos, que
permite o metabolismo de agentes xenobiticos (Baars, 1980 apud Graf et al.,
1984).
Este teste detecta a perda da heterozigose, que pode ocorrer
espontaneamente ou ser induzida por agentes fsicos e qumicos, em clulas
primordiais dos discos imaginais de asas, no perodo de larva.
No SMART de asa so utilizadas as linhagens de D. melanogaster
"multiple wing hairs" (mwh), flare3 (flr3) e "Oregon R, flare3" (ORR; flr3). A
linhagem "mwh" (com constituio gentica y; mwh jv) possui o marcador mwh
que se localiza no cromossomo 3 (3-3,0) e que tem sua manifestao
fenotpica caracterizada por trs ou mais plos por clula da asa. A linhagem
"flr3" (de constituio gentica flr3 / ln(3LR)TM3, ri pp sep l(3)89Aa bx34e e BdS)
possui o marcador flr3, tambm no cromossomo 3, numa posio mais proximal
(3-38,8) e sua manifestao fenotpica caracterizada por um plo modificado
em forma de chama. O marcador flr3 em homozigose letal, ou seja, zigotos
homozigotos para o flr3 no conseguem se desenvolver at a fase adulta (Graf
et al., 1984; Guzmn-Rincn e Graf, 1995). Para isso, foi desenvolvido um
cromossomo balanceador TM3, BdS (Third Multiple 3, beaded-serrate) que
mantm a heterozigose da linhagem. A presena deste balanceador impede
que haja recombinao, ou seja, a troca de material gentico entre
cromossomos homlogos, devido presena de mltiplas inverses neste
cromossomo (Lindsley e Zimm, 1992 apud Graf et al., 1996).
Na linhagem "ORR; flr3" (de constituio gentica ORR; flr3 /
ln(3LR)TM3, ri pp sep l(3)89Aa bx34e e BdS) o marcador flr3 tambm encontra-se
presente. No entanto, esta linhagem difere da linhagem "flare3" por apresentar
uma alta atividade das enzimas citocromo P450 (Hllstrm e Blanck, 1985
apud Graf e van Shaik, 1992), as quais so responsveis pela metabolizao e
ativao de promutgenos e procarcingenos (Dapkus e Marell, 1977 apud
Guzmn-Rincn e Graf, 1995). Os cromossomos 1 e 2 so provenientes da
linhagem Oregon R, resistente ao DDT, construda por Frlich e Wrgler
(1989).
-
28
No teste para deteco de mutao e recombinao somtica, em
clulas de asas de D. melanogaster, so utilizados machos "mwh" (mwh + /
mwh +) cruzados com fmeas virgens das linhagens "flr3" (+ flr3 / + TM3, BdS) -
cruzamento padro (ST) - e "ORR; flr3" (ORR / ORR; + flr3 / + TM3, BdS) -
cruzamento de alta capacidade de ativao metablica (HB). Ambos
cruzamentos produzem indivduos trans-heterozigotos marcados (MH), com
constituio genotpica mwh + / + flr3; e indivduos heterozigotos balanceados
(BH), constitudos por mwh + / + TM3 BdS (Figura 1.4), que podem ser
facilmente identificados pelo aspecto fenotpico das asas (Figura 1.5).
A anlise dos indivduos MH permite detectar a ocorrncia de mutaes
de ponto, pequenas aberraes cromossmicas e recombinaes mitticas
proximais e distais. A anlise dos indivduos BH permite detectar a ocorrncia
de mutaes de ponto e pequenas aberraes cromossmicas. No entanto,
devido presena de inverses mltiplas no cromossomo balanceador, as
clulas resultantes de recombinao mittica so inviveis. A clula que sofreu
perda do alelo selvagem ir desenvolver o fentipo mutante, durante a
metamorfose no estgio de pupa, e pode ser diferenciada facilmente das
demais (Guzmn-Rincn e Graf, 1995).
Na Figura 1.6 esto representados cromossomos de clulas primordiais
dos discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster,
em diviso mittica normal (adaptado de Graf et al., 1984).
As Figuras 1.7 e 1.8 mostram os diferentes mecanismos genticos
(deleo, mutao de ponto, e recombinao) responsveis pelo aparecimento
de manchas mutantes em asas de D. melanogaster (adaptado de Graf et al.,
1984).
A Figura 1.9 mostra fotografias de asas de D. melanogaster, ao
microscpio ptico de luz (aumento 400x), com manchas mutantes simples
(mwh) e gmeas (mwh e flr).
O Teste de Mutao e Recombinao Somtica (SMART) vem se
mostrando eficiente na avaliao de efeitos genotxicos e antigenotxicos para
uma grande diversidade de compostos, como mostram os trabalhos produzidos
pelo Laboratrio de Mutagnese do Instituto de Gentica e Bioqumica da
-
29
Universidade federal de Uberlndia (Valadares et al., [in press]; Fragiorge et al.,
[in press]; Silva et al., [in press]; Fragiorge et al., 2007; Pantaleo et al., 2007;
Silva et al., 2006).
Figura 1.4 Representao esquemtica do cruzamento padro (ST): fmeas
virgens da linhagem flr3 (+TM3,BdS/+flr3) so cruzadas com machos mwh
(mwh + / mwh +), originando descendentes trans-heterozigotos marcados MH
(+flr3/mwh+) e descendentes heterozigotos balanceados BH
(+TM3,BdS/mwh+).
-
30
Figura 1.5 Pares de asas de D. melanogaster: A Asas com bordas lisas;
caracterstica dos indivduos da linhagem mwh, herdada pelos descendentes
trans-heterozigotos marcados (MH); B Asas com bordas recortadas (serate);
caracterstica dos indivduos das linhagens flr3 e ORR; flr3, herdada pelos
descendentes heterozigotos balanceados (BH).
B A
-
31
Figura 1.6 Representao esquemtica de cromossomos de clulas dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
diviso mittica normal (adaptado de Graf et al., 1984).
-
32
Figura 1.7 Representaes esquemticas de cromossomos de clulas dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
diviso mittica, com ocorrncia de deleo (A), e de mutao de ponto (B)
levando formao de manchas mutantes simples do tipo mwh (adaptado de
Graf et al., 1984).
-
33
Figura 1.8 Representaes esquemticas de cromossomos de clulas dos
discos imaginais de asas, presentes na fase de larva de D. melanogaster, em
diviso mittica, com ocorrncia de recombinao entre os loci flr3 e mwh (A),
com formao de mancha simples; e recombinao entre o centrmero e o
locus flr3 (B), com a conseqente formao de mancha gmea (adaptado de
Graf et al., 1984).
-
34
Figura 1.9 Fotografias de plos de asa de D. melanogaster, ao microscpio
ptico de luz (aumento de 400x), mostrando: A - mancha simples (contornada
pela linha) com plos mltiplos (mwh) e B - mancha gmea (contornada pela
linha) com plos em forma de chama (flr3), indicados pela seta branca; e
plos mltiplos (mwh), indicados pela seta preta.
A
B
-
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