avaliação da vacina dna-hsp65 na indução de auto-agressão...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

ÁREA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual

Deison Soares de Lima

Ribeirão Preto 2006

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DEISON SOARES DE LIMA

Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva

Ribeirão Preto 2006

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO OU PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de

Ribeirão Preto / USP

Lima, Deison Soares de

Avaliação da Vacina DNA-hsp65 na Indução de Auto-Agressão Tecidual Ribeirão Preto, 2006. 114 pp. 28cm Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, USP, Área de Concentração em Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador: Dr. Célio Lopes Silva 1. Tuberculose 2. Vacina de DNA. 3. Proteínas de Choque Térmico

– Hsp65 4. Auto-Imunidade.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me iluminado a cada dia desta jornada e permitir que mais um sonho se concretize; Ao Prof. Dr. Célio Lopes Silva, por ter me recebido em seu laboratório, pelo belo exemplo profissional que contribuiu imensamente à minha formação, pela orientação, ensinamento, disponibilidade, atenção, paciência e amizade dispensados a mim durante estes anos; À Dra. Verônica Coelho, pela co-orientação, dedicação, paciência e fundamental contribuição para minha formação científica; À Profa. Dra. Arlete Castelo também por ter me recebido de braços abertos e pela valiosa contribuição com sugestões para realização deste trabalho; À Profa. Dra. Vânia Bonato, pelo exemplo de dedicação e compromisso profissional e pela contribuição intelectual durante a realização deste trabalho; À Profa. Dra. Alexandrina Sartori, pela contribuição intelectual durante a realização deste trabalho; Aos Profs. Drs. Benedito Fonseca e Marcelo de Franco, pela prontidão em participar da avaliação deste trabalho e pela disponibilidade, atenção e contribuição com sugestões para a correção desta dissertação; À Dra. Eloísa Bonfá, pelas sugestões e por disponibilizar a estrutura de seu laboratório para realização das dosagens de anticorpos anti-DNA; À Izaíra Tincani Brandão e Ana Paula Masson, pelo auxílio técnico durante os experimentos, pela paciência e amizade; Aos Drs. Édson Garcia Soares e Luiz Benvenuti, pelas discussões e análises dos cortes histológicos; À Ana Maria da Rocha, pela dedicação, disponibilidade, paciência e pelo belo e fundamental auxílio técnico com a confecção dos cortes histológicos; À Margareti Vendramini, pela colaboração e pelo auxílio técnico na realização das técnicas para dosagem de anticorpos anti-DNA; Aos amigos do laboratório: Ana Paula Trombone, Carolina, Cássia, Carlos Rodrigo, Daniele, Eduardo, Fábio, Fabiani, Giovanna, Luis Henrique, Juliana, Júlio, Leila, Luciana, Marina, “Marininha”, Patrícia, Pryscilla, Ricardo, Rogério, Rubens, Sandra,

Sheila, Silvia, Tatiana, Thiago, Walter, Wendy e Willian pelos conhecimentos compartilhados, pela companhia e pelos momentos de descontração; Em especial, as amigas Patrícia e Tatiana, por termos passado por tudo juntos, desde os estudos para o exame seletivo; Em especial as amigas Patrícia e Tatiana por termos passado por tudo juntos, desde os estudos para a para o exame seletivo; À amiga e para sempre professora, Adriana Malheiro, por ter orientado meus primeiros passos na vida acadêmica, desde a graduação; À Profa. Dra. Lúcia Faccioli, por ter sido a primeira a me acolher como estagiário em seu laboratório; Aos docentes da Área de Imunologia Básica e Aplicada pela contribuição para minha formação; À secretária Ana Cristine, pelo exemplo de competência e dedicação à pós-graduação, pela amizade e por se preocupar como uma mãe com nós alunos; Ao Ronaldo e a Rosângela, pela amizade e pelos serviços prestados; Aos colegas da administração do Centro de Pesquisas em Tuberculose (CPT) Ana, Carlos, Helena, Marcos e Vanessa pela prontidão e serviços prestados que foram essenciais para realização deste trabalho. E ao Rogério, pelo auxílio com a impressão deste trabalho e por sempre estar disposto em ajudar; À todos os colegas da pós-graduação e aos funcionários do departamento pelas conversas do dia-a-dia e pelo agradável convívio; Aos meus sogros, Luis Carlos e Lúcia pelos momentos de descontração e principalmente pela compreensão, apoio e amizade; Aos familiares e amigos: Dener, Marisa, Mayara, Bruno L., Alysson, Deila, Giovane, Caíque, Caio, Maria, Rocha, Iolanda, Matheus, Leandro, Bruno A., Bruninho, Leandro L., Marcela F., Alexandre e Marcela, pelos momentos de descontração e por estarem sempre ao meu lado; À Rede-TB e a FAEPA pelos auxílios concedidos para divulgação deste trabalho em eventos científicos, e à CNPq pela concessão da bolsa de mestrado.

A todos...

Muito Obrigado!!!

SUMÁRIO

ABREVIATURAS.........................................................................................................i

RESUMO....................................................................................................................iv

ABSTRACT...............................................................................................................vii

1- INTRODUÇÃO........................................................................................................1

1.1 – Tuberculose............................................................................................................ 2

1.2 - Imunidade a Tuberculose ...................................................................................... 3

1.3 - Vacina contra Tuberculose .................................................................................... 5

1.4 - Proteínas de Choque Térmico .............................................................................. 9

1.5 - Proteínas de Choque Térmico e Auto-Imunidade ............................................. 10

2 - OBJETIVOS.........................................................................................................15

2.1 - Objetivo Geral: ...................................................................................................... 15

2.2 - Objetivos Específicos: .......................................................................................... 15

3 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL....................................................................17

3.1 - Protocolo experimental A..................................................................................... 17

3.2 - Protocolo experimental B..................................................................................... 19

4 - MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................22

4.1 – Animais ................................................................................................................. 22

4.2 - Vacina de DNA-hsp65.......................................................................................... 22

4.3 - Obtenção dos plasmídeos recombinantes pVAX-Hsp65 e pVAX ................... 23

4.4 - Avaliação da integridade dos plasmídeos ......................................................... 24

4.5 - Análise da pureza das vacinas gênicas ............................................................. 25

4.6 – Imunizações ......................................................................................................... 26

4.8 - Desafio dos animais com Mycobacterium tuberculosis .................................... 27

4.9 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-Hsp65 e

anti-Hsp60...................................................................................................................... 27

4.10 - Ensaio de Imunofluorescência Indireta (IFI) para determinação de

anticorpos anti-DNA ...................................................................................................... 28

4.11- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-DNA.... 28

4.12 - Análise histopatológica ...................................................................................... 29

4.13 - Análise estatística .............................................................................................. 30

5 – RESULTADOS....................................................................................................32

5.1 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 ............. 32

Protocolo A ............................................................................................................. 32

5.2 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 ...................... 34

Protocolo A ............................................................................................................. 34

5.3 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 ............. 36

Protocolo B ............................................................................................................. 36

5.4 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 ...................... 38

Protocolo B ............................................................................................................. 38

5.5- Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por IFI ............................. 40

5.6 - Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por ELISA ...................... 42

5.7 - Avaliação Histopatológica.................................................................................... 44

6 – DISCUSSÃO.......................................................................................................77

7 – CONCLUSÕES ...................................................................................................89

8 -- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................91

9 – ANEXO..............................................................................................................105

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Mapa esquemático do vetor plasmideal pVAX1....................................22 Figura 2: Perfil eletroforérico do DNA plasmideal purificado – pVAX e pVAX-

hsp65.................................................................................................................24 Figura 3: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 -

Protocolo A.........................................................................................................33 Figura 4: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60 -

Protocolo A........................................................................................................35 Figura 5: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 -

Protocolo B.. ......................................................................................................37 Figura 6: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60.............39 Figura 7: Determinação de anticorpos anti-DNA (Imunofluorescência)................41 Figura 8: Determinação da produção de anticorpos anti-DNA (ELISA).................43 Figura 9: Avaliação histológica do Pâncreas - Protocolo A...................................47 Figura 10: Avaliação histológica do Pâncreas - Protocolo B.................................48 Figura 11: Avaliação histológica da Articulação - Protocolo A..............................49 Figura 12: Avaliação histológica da Articulação - Protocolo B..............................50 Figura 13: Avaliação histológica do Tecido Encefálico - Protocolo A....................51 Figura 14: Avaliação histológica do Tecido Encefálico - Protocolo B....................52 Figura 15: Avaliação histológica da Tireóide - Protocolo A...................................53 Figura 16: Avaliação histológica da Tireóide - Protocolo B...................................54 Figura 17: Avaliação histológica do Fígado - Protocolo A.....................................55 Figura 18: Avaliação histológica do Fígado - Protocolo B.....................................56 Figura 19: Avaliação histológica do Rim - Protocolo A.........................................57 Figura 20: Avaliação histológica do Rim - Protocolo B..........................................58

Figura 21: Avaliação histológica da Adrenal - Protocolo A....................................59 Figura 22: Avaliação histológica da Adrenal - Protocolo B....................................60 Figura 23: Avaliação histológica do Coração - Protocolo A...................................61 Figura 24: Avaliação histológica do Coração - Protocolo B...................................62 Figura 25: Avaliação histológica do Músculo Esquelético - Protocolo A...............63 Figura 26: Avaliação histológica do Músculo Esquelético - Protocolo B...............64 Figura 27: Avaliação histológica do Globo Ocular - Protocolo A...........................65 Figura 28: Avaliação histológica do Globo Ocular - Protocolo B...........................66 Figura 29: Avaliação histológica da Pele - Protocolo A.........................................67 Figura 30: Avaliação histológica da Pele - Protocolo B.........................................68 Figura 31: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso - Protocolo A.......69 Figura 32: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso - Protocolo B.......70 Figura 33: Avaliação histológica do Pulmão - Protocolo A........................................71 Figura 34: Avaliação histológica do Baço - Protocolo A........................................72 Figura 35: Avaliação histológica do Timo - Protocolo A........................................73 Figura 36: Avaliação histológica do Linfonodo Poplíteo - Protocolo A..................74 Figura 37: Avaliação histológica do Linfonodo Inguinal - Protocolo A...................75

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ABREVIATURAS

ACF: Freund's Complete Adjuvant - Adjuvante Completo de Freund

Ag85B: Antigen 85B - Antígeno 85B

AIDS: Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

APC: Antigen Presenting Cell – Célula Apresentadora de Antígeno

BAAR: Bacilo Álcool Ácido Resistente

BCG: Bacilo de Calmette-Guérin

CpG: Dinucleotídeos citosina-guanina, seqüências CG imunomodulatórias.

CR: Complement Receptor - Receptor de Complemento

DMT: Dimicolato de trealose

DNA: Deoxyribonucleic Ácid - Ácido Desoxiribonucléico

dsDNA: Fita dupla de DNA

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – Ensaio Immunoenzimático de Adsorção

ESAT-6: 6-kDa Early Secreated Antigen Target

GAD: Descarboxilase do Ácido Glutâmico

H. pylori: Helicobacter pylori

HIV: Human Immunodeficincy Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana

HSP: Heat Shock Proteins – Proteínas de Choque Térmico

Hsp65: Proteínas de Choque Térmico de 65 kilodaltons

IFI: Imunofluorescência Indireta

IFN-γγγγ : Interferon-gama

IgG: Immunoglobulin G – Imunoglobulina G

IL: Interleukin – Interleucina

LAL: Lisado de amebócito de Limulus sp

LAM: Liporabinomanan – Liporabinomanana

LES: Lupus Eritematoso Sistêmico

LPS: Lipopolissacarídeo

iii

M. leprae: Mycobacterium leprae

M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis

MALT: Tecido Linfóide Associado a Mucosa

MHC: Major Histocompatibility Complex – Complexo Principal de Histocompatibilidade

NK: Natural Killer

NO: Nitric Oxide – Óxido Nítrico

NOD: Nonobese Diabetic – Diabético não obeso

NTN: Nefrite Nefrotóxica

OMS: Organização Mundial da Saúde

PBM: Proteína Básica Mielínica

PBS: Phosphate Buffered Salin – Salina Tamponada com Fosfato

PPD: Derivado protéico purificado da tuberculina

RNA: Ribonucleic Acid – Ácido Ribonucleico

SFB: Soro Fetal Bovino

SPF: Specific Pathogen Free – Livre de Patógenos Específicos

ssDNA: Fita simples de DNA

STZ: Streptozotocin – Streptozotocina

TAO: Oftalmopatologia Associada a Tireóide

TB: Tuberculose

TCR: T Cell Receptor – Receptor da Célula T

TGF: Tumoral Growth Factor – Fator de Crescimento Tumoral

Th: T helper – linfócito T auxiliar

TLR: Toll Like Receptors – Receptor do Tipo Toll

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RESUMO

Nos últimos anos nosso grupo vem estudando uma vacina gênica que codifica

a proteína de choque térmico de 65kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae. Esta

vacina (DNA-hsp65) tem apresentado eficácia tanto em modelos de profilaxia quanto

de terapia contra a Tuberculose (TB) experimental.

No entanto, existe grande preocupação quanto ao risco de desenvolvimento

de doenças auto-imunes decorrente do uso dessa vacina gênica em humanos. Tal

preocupação se justifica pelo fato de que o próprio DNA bacteriano do vetor

plasmideal age como fator imunoestimulatório, e principalmente porque as HSPs são

filogeneticamente conservadas durante a evolução e estão presentes em células

procarióticas e eucarióticas, mostrando alta homologia entre as espécies. Em razão

disso, há diversos trabalhos na literatura sugerindo que as HSPs podem ter um

papel na patogênese de doenças auto-imunes.

Desse modo, a possibilidade da vacina induzir auto-imunidade patológica

baseia-se na hipótese do mimetismo molecular, sendo possível que a vacinação

com DNA-hsp65 induza a ativação de linfócitos capazes de reconhecer, por

reatividade cruzada, a Hsp60 do próprio organismo, levando ao desenvolvimento de

doenças auto-imunes. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar se a vacina

DNA-hsp65 induz ou não auto-agressão tecidual. Para isto, analisamos parâmetros

imunológicos como produção de anticorpos anti-DNA, anti-Hsp65 e anti-Hsp60 além

de analisarmos histologicamente 18 órgãos de animais vacinados com DNA-hsp65 e

também de animais vacinados e infectados com M. tuberculosis.

Os resultados obtidos neste trabalho não evidenciaram a indução de qualquer

quadro patológico auto-imune até 6 meses depois da última imunização. Não houve

detecção de anticorpos anti-DNA, e embora tenha sido observada a produção de

anticorpos anti-Hsp65 e anti-Hsp60, estes anticorpos não provocaram alterações

teciduais, como observado nas análises histológicas dos órgãos estudados. Sendo

assim, estes resultados nos permitem afirmar que, apesar da alta homologia

interespécie das proteínas HSPs, a vacina DNA-hsp65 não induziu auto-agressão

tecidual em camundongos sadios ou infectados nos períodos de tempo analisados,

sugerindo que ela possa ser segura para utilização em mamíferos superiores.

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vii

ABSTRACT

In the last years our group was studying a genic vaccine that codifies the heat

shock protein of 65kDa (Hsp65) of Mycobacterium leprae. This vaccine (DNA-hsp65),

has presented efficacy in prophylactic and therapeutic models against Tuberculosis

(TB).

However, there is a great concern about the risk of autoimmune diseases

development due to the use of this DNA vaccine in humans. Such concern is justified

by the fact that the bacterial DNA of plasmideal vector act as an immunoestimulatory

factor and mainly because the HSPs are philogenetically conserved during evolution

and are present in procariotic and eucariotic cells, showing high homology between

the species. In this sense, there are many reports in literature suggesting that HSPs

can have a role in the pathogenesis of autoimmune diseases.

The possibility of the vaccine to induce pathological autoimmunity is based on

the hypothesis of molecular mimicry, because the vaccination with DNA-hsp65 could

induce the activation of lymphocytes able to recognize the self-Hsp60 protein by

cross reactivity, leading to development of autoimmune diseases. In this context, the

objective of this project was to evaluate if the DNA-hsp65 vaccine induces or not

tissue auto-aggression. We analyzed immunologic parameters including production

of anti-DNA, anti-Hsp65 and anti-Hsp60 antibodies, besides the histological analysis

of 18 organs of DNA-hsp65 vaccinated mice as well as vaccinated and M.

tuberculosis infected animals.

The results did not show any alteration of autoimmune disorder until 6 months

after last immunization. There was not anti-DNA antibodies detection and although

anti-Hsp65 and anti-Hsp60 antibodies were observed, these antibodies did not

induce tissue alterations as observed in the histological analyses of the studied

organs. Thus, these results allow us to affirm that, despite the high homology inter-

specie of HSP proteins, the DNA-HSP65 did not induce tissue auto-aggression in

healthy or infected mice during the analyzed periods of time, suggesting that it could

be safe to use in superior mammals.

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Introdução

2

1- INTRODUÇÃO

1.1 – Tuberculose

A tuberculose, doença principalmente respiratória causada pelo bacilo

Mycobacterium tuberculosis, é responsável por 2 milhões de mortes ao ano

permanecendo como uma das maiores causas de mortalidade por doenças

infecciosas no mundo, ao lado da AIDS (do inglês, Acquired Immunodeficiency

Syndrome) e da malária (WHO 2005; VON REYN & VUOLA, 2002; ANDERSEN,

2001). Dados da Organização Mundial da Saúde indicam que ocorrem de 8 a 9

milhões de novos casos de tuberculose anualmente e, cerca de um terço da

população mundial encontra-se infectada pelo bacilo. O Brasil ocupa o 15º lugar

entre os 22 países nos quais se estima que ocorram 80% dos casos de tuberculose

no mundo (WHO 2005; ROOK et al., 2005a e 2005b; VON REYN & VUOLA, 2002;

ANDERSEN, 2001; DYE et al., 1999).

M. tuberculosis é um patógeno intracelular facultativo de crescimento lento

(NOLTE & METCHOCK, 1995; HOLT et al., 1994). A transmissão da tuberculose

ocorre através da inalação de partículas contendo a bactéria, que são expelidas em

forma de aerossol por indivíduos com a doença ativa (RILEY et al., 1959).

Apesar das estatísticas mostrarem um grande número de indivíduos

infectados, uma parcela relativamente pequena dos indivíduos desenvolve a doença.

Noventa por cento das pessoas infectadas desenvolvem uma forma latente e

assintomática. Uma pequena porcentagem desses indivíduos (aproximadamente

10%) pode apresentar reativação da infecção, que poderia ser decorrente de um

processo infeccioso secundário, de um quadro de imunossupressão, desnutrição,

elevado grau de exposição ao bacilo, entre outros fatores. Essas situações podem

resultar em tuberculose ativa. Por outro lado, 5 a 10% dos indivíduos infectados

desenvolvem a doença progressiva logo após a infecção primária (ROOK et al.,

2005b; FLYNN & CHAN, 2005; BOOM et al., 2003).

A profilaxia da tuberculose é realizada pela administração da vacina BCG

(Bacilo de Calmette-Guérin) que foi desenvolvida pelos pesquisadores Albert

Calmette e Camille Guérin no Instituto Pasteur, em 1921 (CHUNG & BIGGERS,

2001; BANNON, 1999; BLOOM et al., 1989). Essa vacina é constituída por uma

Introdução

3

cepa virulenta de Mycobacterium bovis que foi atenuada através da realização de

várias subculturas in vitro do bacilo.

Apesar disso, a reemergência da tuberculose nos últimos tempos pode ser

atribuída a fatores relacionados a problemas sócio econômicos e de saúde pública

como, por exemplo, o declínio nas condições de vida da população mundial, declínio

de recursos destinados às ações de controle da doença e problemas de ordem

política e organizacional, enfrentados pelos sistemas de saúde pública em todo o

mundo. Em países desenvolvidos, a incidência de tuberculose tem aumentado em

função do elevado número de casos de co-infecção com HIV.

Além destes fatores, existem os problemas ligados à dificuldade de adesão

de grande parcela dos pacientes aos esquemas terapêuticos. O tratamento da

tuberculose é realizado por meio de quimioterapia, que combina o uso de diferentes

antibióticos e tem duração de no mínimo seis meses. Por isso, é muito alto o número

de casos de abandono do tratamento e, em razão disto, nos últimos anos, tem

aumentado número de pacientes portadores de cepas resistentes a múltiplas drogas

(WHO 2005; ZHU et al., 2005).

1.2 - Imunidade a Tuberculose

Como comentado anteriormente, a infecção por M. tuberculosis ocorre

através das vias aéreas superiores, por meio da inalação de gotículas contendo o

bacilo, suspensas no ar, dispersas por um indivíduo infectado (bacilífero). Com a

chegada dos bacilos nos pulmões, é desencadeada uma resposta imune baseada

principalmente em mecanismos inatos, inicialmente com a ativação de macrófagos

alveolares e de componentes do sistema complemento (via alternativa e das

lectinas). Após a interação com macrófagos, os bacilos são rapidamente

fagocitados.

Entretanto, durante o processo evolutivo da interação parasita-hospedeiro, o

M. tuberculosis desenvolveu estratégias para escapar dos mecanismos microbicidas

dos macrófagos. As próprias micobactérias induzem a ativação do sistema

complemento gerando componentes que as opsonizam, facilitando, dessa forma, a

sua fagocitose através da sua interação com os receptores Mac1 (CR3)

(SCHLESINGER et al., 1990), CR1 e CR4 (HIRSCH et al., 1994) nos macrófagos.

Introdução

4

Esse processo impede o mecanismo oxidativo, ou seja, a liberação de ROIs

(Reagente Intermediário do Oxigênio), que são tóxicos para M. tuberculosis

(WRIGHT et al., 1983). Além disso, as micobactérias também produzem as enzimas

catalase e superóxido dismutase, que são capazes de degradar espécies reativas do

oxigênio (COLE et al., 1998).

Também tem sido descrito que o bacilo da tuberculose tem a capacidade de

escapar do fagolisossoma ou impedir a fusão do endossoma ao fagolisossoma

(RUSSEL, 1995). Esse escape pode ocorrer através da interação preferencial com

alguns dos receptores de macrófagos (ARMSTRONG et al., 1975) e pela presença

de determinados glicolipídios na superfície micobacteriana, como o dimicolato de

trealose (DMT) (CLEMENS & HORWITZ, 1995). Componentes da parede celular,

como a lipoarabinomanana (LAM) também atuam na desativação dos macrófagos

(STROHMEIER, 1999).

Através destes mecanismos de escape, a micobactéria é capaz de persistir no

indivíduo infectado e desencadear a tuberculose mais tardiamente. Assim, a

ativação de uma resposta imune adaptativa é essencial para o controle da infecção.

Macrófagos e células dendriticas desempenham importantes funções na ativação de

uma resposta específica constituída por células T (FLYNN et al. 2004).

Está bem estabelecido que a resposta protetora na tuberculose está

relacionada ao desenvolvimento da resposta de perfil Th1, com secreção de

citocinas IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 e TNF-α (COOPER, 1997; FLYNN, 1995). O IFN-γ,

é uma das principais citocinas associadas à resposta protetora durante a infecção

por micobactérias, sendo produzido por células T CD4+, CD8+, NK (COOPER, 1993;

FLYNN, 1993; YANG & MITSUYAMA, 1997). O principal papel atribuído ao IFN-γ e

outras citocinas de padrão Th1 citadas acima, na resposta do hospedeiro contra a

tuberculose consiste na ativação e recrutamento de macrófagos capazes de

controlar a infecção por micobactérias (BONECINI ALMEIDA et al., 1998, SATO et

al., 1998). Além disso, ZHANG et al. (1994) mostraram que a secreção de IL-12 por

macrófagos pleurais humanos é também importante. Essa citocina induz a ativação

de células NK, estimulando-as a produzir IFN-γ (D’ ANDREA et al., 1992) ou

aumentando sua capacidade citotóxica diretamente sobre as células infectadas e,

além disso, estimula a diferenciação de linfócitos T CD4+ para o padrão Th1

(SERBINA et al., 2000; SILVA et al., 2001).

Introdução

5

Além das células CD4+ e macrófagos, um importante papel na resposta

protetora contra tuberculose tem sido atribuído às células T CD8+ citotóxicas. Esses

linfócitos medeiam a lise de células infectadas por meio da formação de poros pela

perforina e pela ação das moléculas efetoras granulisinas e granzimas, ou, ainda,

por mecanismo de Fas-FasL (Revisado por SILVA et al., 2001). Células T CD8+ de

camundongos infectados produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de

antígenos de M. tuberculosis apresentados por células dendríticas ou macrófagos

(SERBINA & FLYNN, 1999). Além disso, cultura de linfócitos, provenientes de

pulmão de animais infectados, na presença de células dendríticas também

infectadas é capaz de ativar células T CD8+ que reconhecem e lisam macrófagos

infectados por M. tuberculosis (SERBINA et al., 2000). Portanto, as principais células

envolvidas na resposta imune contra a tuberculose, consistem de células T CD4+,

CD8+ citotóxicas produtoras de IFN-γ.

Outras células T que expressam o receptor γ� também desempenham

importante papel na resposta contra tuberculose secretando citocinas tais como

TNF-� e IFN-γ, além de exercer atividade citotóxica contra macrófagos infectados

(BOOM, 1999; DEILE et al., 2001; THOMA-USZYNSKI et al., 2000; TSUKAGUCHI et

al., 1995). Finalmente, foi mostrado que células T duplo negativas (CD4-CD8-) têm

importante função no controle de infecção intracelular por M. tuberculosis e podem

contribuir para o sucesso da vacinação (SIOBHAN et al. 2005).

1.3 - Vacina contra Tuberculose

Atualmente, a imunoprofilaxia continua sendo o método mais eficaz para a

contenção da tuberculose. Esta é feita através de vacinação com BCG que foi

introduzida para o uso humano em 1921, a qual é recomendada pela OMS para

todas as crianças com menos de 1 ano de idade. Anualmente, 100 milhões de recém

nascidos recebem esta vacina e, até hoje, mais de 3 bilhões de doses já foram

administradas, o que faz dessa vacina, a mais usada no mundo (ABOLHASSANI et

al, 2000). Entretanto o efeito protetor da vacina BCG tem sido bastante controverso,

sendo que dados epidemiológicos revelaram que sua eficácia na proteção varia de 0

a 80% nos diferentes países onde a vacina é empregada (FINE, 1995). Outro fator

limitante é que a imunidade induzida pelo BCG diminui em um período de 10 a 15

Introdução

6

anos após a sua aplicação (KAUFMAN, 1990), além de prejudicar a interpretação do

teste de hipersensibilidade tardia cutânea ou teste de PPD, utilizado com fins de

diagnóstico e epidemiológicos (FINE, 1999; LOWRIE et al, 1995; LOWRIE et al,

1997).

Vale ressaltar que pelo fato da vacina BCG ser constituída por uma cepa viva

atenuada, há uma grande preocupação com relação à segurança do uso dessa

vacina em indivíduos imunocomprometidos, uma vez que a co-infecção TB-HIV

torna-se cada vez mais comum (GRANGE, 1994; PERRONNE, 1994). Assim, existe

uma grande necessidade do desenvolvimento de novas alternativas de imunização

mais seguras e eficazes contra a tuberculose.

Nas últimas décadas, principalmente após a descoberta de novas

metodologias de identificação e purificação de antígenos e da introdução da

tecnologia do DNA recombinante, surgiram novas estratégias vacinais. Estas

tecnologias têm permitido o desenvolvimento de vacinas de DNA e vacinas de

microorganismos vivos modificados.

Dentre as vacinas de microorganismos vivos em estudo, uma das estratégias

utilizadas é a modificação genética do BCG, introduzindo genes que codificam

antígenos relevantes capazes de induzir uma resposta imune contra tuberculose.

Conhecido como BCG recombinante (rBCG), estão em estudo o rBCG30, que

expressa o Ag85B de M. tuberculosis (HORWITZ et al, 2005), e o rBCG-hly, que

expressa a enzima listeriolisina de Listeria monocitogenes (HESS et al, 1998).

Também tem sido proposta a utilização de micobactérias mutantes autotróficas, que

seriam cepas de M. tuberculosis atenuadas, que não conseguem se multiplicar nos

indivíduos vacinados por apresentarem necessidades especiais de nutrientes, só

encontradas em meios de cultura artificiais (GULERIA et al, 1996, PEREZ et al,

2001, SMITH et al, 2001).

Por outro lado, as vacinas gênicas, são baseadas no uso de seqüências de

nucleotídeos que codificam antígenos imunodominantes de um determinado agente

infeccioso, clonadas em plasmídeos bacterianos.

Esta estratégia de vacinação, além de evitar muitos problemas associados às

vacinas vivas, tais como, reversão da virulência, instabilidade térmica e contra-

indicação para indivíduos imunodeprimidos, destaca-se pela possibilidade de

processamento e apresentação de antígeno por ambas as moléculas de MHC (do

inglês, Major Histocompatibility Complex / Complexo Principal de

Introdução

7

Histocompatibilidade) de classe I e classe II, ativando assim, células T CD8+

citotóxicas e células T CD4+ auxiliares, respectivamente (HAN et al., 2002).

Linfócitos B também podem ser ativados no processo de vacinação, proporcionando

assim uma resposta imune humoral e celular (GURUNATHAN et al., 2000; LIU,

2003; DONNELLY el al., 2005). Estudos realizados em nosso laboratório, usando a

vacina pcDNA3-hsp65 mostraram que após a injeção intramuscular, células B da

medula óssea e linfonodos drenantes são capazes de capturar o plasmídeo e

expressar a proteína, sugerindo um papel de APC para essas células nesse modelo

(COELHO-CASTELO et al., 2003).

Além disso, as vacinas de DNA são importantes indutoras de uma resposta

imunológica do padrão Th1, pois contêm seqüências CpGs não metiladas presentes

no DNA procariótico que agem como adjuvantes por apresentarem capacidade

imunoestimuladora (KLINMAN et al., 1999). A capacidade de imunomodulação das

vacinas de DNA está relacionada com a via de administração da mesma. Assim,

vacinas administradas por via intramuscular (i.m) estimulam uma resposta

preferencialmente Th1 enquanto vacinas administradas através do processo de

biobalística (gene-gun) por via intradérmica (i.d.) estimulam mais uma resposta de

padrão Th2. Outra forma de imunomodulação observada com a vacina de DNA-

hsp65 é decorrente da rota de administração, podendo diminuir ou aumentar a

proteção observada (ROSADA, R.S. et al., manuscrito em preparação).

Visando atingir a proteção contra a tuberculose, uma grande variedade de

antígenos tem sido estudada sob a forma de vacinas de DNA. Assim, as vacinas

baseadas em genes que codificam proteínas da família da Ag85 (HUYGEN et al,

1996), ESAT-6, Hsp70, proteína de 36 kDa e MPT83 (LOWRIE et al, 1997), Pho S

(ZHU et al, 1997), PLCa (GONSALVES et al, 2001) e Hsp65 (SILVA et al, 1994) ou

uma combinação das mesmas têm sido alvo de muitas investigações.

Estudos realizados no Centro de Pesquisas em Tuberculose (CPT) da FMRP-

USP demonstraram que a vacinação por via intramuscular (i.m.) com DNA-hsp65 foi

capaz de proteger camundongos contra subseqüente desafio com a cepa virulenta

H37Rv de M. tuberculosis (LOWRIE et al, 1994; TASCON et al, 1994). Esta proteção

foi atribuída principalmente a linfócitos T antígeno-específicos, produtores de IFN-γ,

com atividade citotóxica e resposta imune do tipo Th1 (BONATO et al, 1998; SILVA

& LOWRIE, 2000). Além disso, em estudos adicionais, utilizando camundongos

infectados com M. tuberculosis e posteriormente tratados com a vacina DNA-hsp65,

Introdução

8

foi mostrado um declínio significativo no número de bactérias no pulmão e no baço,

com predomínio de uma resposta Th1 (LOWRIE et al, 1999; BONATO et al., 2004).

Portanto, essa vacina pode ser utilizada tanto na profilaxia quanto na terapia da

tuberculose.

Apesar destes efeitos promissores, existe uma grande preocupação com

relação à capacidade desses DNAs plasmideais se incorporarem ao genoma do

hospedeiro. Isso dificultaria a liberação e uso dessas vacinas em larga escala.

Recentemente, nós demonstramos que a vacina pcDNA3-hsp65 não se incorpora no

genoma do hospedeiro, sugerindo a biossegurança da mesma (COELHO-CASTELO

et al., 2006).

No entanto, outra possibilidade e preocupação de nosso grupo, é que a

vacinação com DNA, por si só, poderia levar ao desenvolvimento de anticorpos anti-

DNA, podendo induzir doenças, como por exemplo, o Lupus Eritematoso Sistêmico.

Sendo assim, o fato de utilizarmos como vacina, uma seqüência de DNA bacteriano,

o qual expressa sequências CpG que são imunoestimuladores de células B, células

T, macrófafos e células dendríticas, possivelmente, poderia estar ativando

mecanismos importantes na indução de quadros inflamatórios ou auto-imunes

(PISETSKY et al, 1991; KRIEG et al, 1995; KRIEG, 2002).

Além disso, foi observado que a administração de vacina de DNA, conténdo

CpG, em camundongodos com encefalomielite, causou a exacerbação da doença

em uma maneira dose dependente (TSUNODA et al., 1999). Ademais, foi

demonstrado que camundongos imunizados com DNA (CpG) carreando antígeno

derivado de clamídia, que apresenta mimetismo molecular à antígenos cardíacos,

desenvolveram miocardite auto-imune (BACHMAIER et al., 1999). Outro estudo

demonstrou que camundongos primados com injeção de DNA (CpG),

desenvolveram quadros bem mais severo de artite auto-imune em resposta à

posterior imunização com colágeno, quando comparado com animais que receberam

apenas administração de colágeno (MIYATA et al., 2000).

Juntos, estes relatos demonstram que seqüências CpG de vacinas de DNA,

podem auxiliar na indução ou exacerbação de uma resposta auto-imune.

Introdução

9

1.4 - Proteínas de Choque Térmico

Em 1962, os genes que codificam as Proteínas de Choque Térmico (do

inglês, “Heat Shock Protein - HSPs”) foram identificadas ao acaso quando Ritossa et

al., notaram que altas temperaturas induziam a expressão de genes de um padrão

incomum em cromossomos “polytene” de glândulas salivares de Drosophila

melanogaster (RITOSSA, 1962). Porém, apenas em 1974 o produto destes genes foi

chamado de “Heat Shock Proteins” (TISSIERES et al., 1974). As HSPs são

moléculas evolutivamente conservadas e expressas em todas as formas de vida

como eucariotos, procariotos e plantas. Além disso, estas proteínas são encontradas

em vários compartimentos intracelulares como citosol de procariotos e eucariotos,

núcleo, retículo endoplasmático, mitocôndria e cloroplastos (LINDQUIST, 1998).

Sob condições fisiológicas, as HSPs constituem de 5-10% do conteúdo

protéico de uma célula normal, mas podem aumentar sua concentração intracelular

duas ou três vezes sob condições adversas. Tanto células de procariotos quanto de

eucariotos aumentam a síntese de HSPs quando submetidas a vários tipos de

estresse, tais como estresse térmico, químico, físico, hipóxia, toxinas, privação de

glicose entre outros (LINDQUIST et al., 1998). Nestes casos, a síntese de HSP é

aumentada para proteger as células de possíveis danos durante períodos de

estresse causados por infecções, inflamações ou eventos similares. Elas encontram-

se entre as proteínas mais conservadas filogeneticamente e são agrupadas em

famílias conforme seus pesos moleculares, sendo caracterizadas como: família

Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp110 e as famílias de baixo peso molecular como a Hsp14

e Hsp18 (LINDQUIST et al., 1998).

As HSPs exercem funções vitais na homeostase celular, atuando como

chaperonas, transportando peptídios, participando do dobramento, desdobramento e

montagem de proteínas, prevenindo desnaturação e agregação protéica, e

exercendo atividade ATPase (LINDQUIST et al.,1986).

Estudos sobre as funções imunológicas das HSPs começaram a surgir na

década de 80, quando foi observado que preparações homogêneas de HSPs

isoladas de células cancerígenas eram capazes de induzir imunidade contra câncer,

enquanto que preparações correspondentes de tecidos normais, não o fizeram

(SRIVASTAVA et al., 1998). Posteriormente, foi descoberto que este fenômeno era

decorrente da função de chaperonina das HSPs, que têm a capacidade de formar

Introdução

10

complexos com peptídeos tumorais ou antigênicos. Estes complexos, uma vez no

meio extracelular, podem interagir com receptores como TLR 2 ou TLR4, CD14,

LOX1 ou CD40, culminando com a ativação inespecífica da APC, ou seja,

independente do peptídeo, levando à secreção de mediadores inflamatórios. Outra

possibilidade é que estes complexos possam interagir com o receptor CD91

culminando com o processamento e apresentação do peptídeo complexado pela

HSP, tanto em contexto de apresentação cruzada por moléculas de MHC classe I

(SRIVASTAVA et al., 2001), quanto de classe II (MATSUTAKE & SRIVASTAVA,

2000). O resultado disso é a ativação de células T, tanto CD8+ quanto CD4+

específicas para o peptídeo complexado. Este mecanismo via CD91 também foi

observado em células humanas (CASTELLI et al., 2001). Esta habilidade de HSPs

extracelulares serem introduzidas em uma via de apresentação endógena,

carreando peptídeos, com conseqüente geração de resposta celular citotóxica,

atribui a elas, uma importante atividade adjuvante. Além disso, a presença de HSPs

no meio extracelular, pode agir como um sinal de perigo para APCs como

conseqüência de uma injúria mecânica ou infecciosa (SOMERSAN et al., 2001).

Como foi descrito, a vacina de DNA testada pelo nosso grupo contra a

tuberculose experimental, contém o gene da proteína de choque térmico de 65 kDa

de M. leprae usado como antígeno. Apesar de uma de suas principais funções ser a

de auxiliar no dobramento de peptídeos importados do citoplasma para a

mitocôndria, protegendo-os na sua cavidade, outras funções começam a ser

descritas, como a atividade de peptidase, atividade esta que pode ter relevância no

processamento e apresentação de antígenos endógenos e, conseqüentemente, na

resposta imunológica (PORTARO et al., 2002).

1.5 - Proteínas de Choque Térmico e Auto-Imunidade

As HSPs estão entre os antígenos imunodominantes encontrados nas

micobactérias, principalmente as proteínas de 14, 18, 65 e 70 kDa. Em

camundongos infectados com M. tuberculosis, 10 a 20% de todas as células T

respondem especificamente para o antígeno Hsp65 (KAUFMANN et al., 1987). A

proteína Hsp65 de M. leprae tem recebido maior atenção devido ao seu amplo

envolvimento com células e mediadores do sistema imune nas infecções

micobacterianas (SILVA et al., 1994b). A resposta imune humoral contra Hsp65 pode

Introdução

11

ser direcionada para epítopos comuns entre outras HSPs, como a de M. tuberculosis

bem como a da Hsp60 humana e bacteriana (ANDERSEN & HERON, 1993).

Jones et al., (1993), em um estudo de sequênciamento, identificou 86

peptídeos humanos presentes em diversas proteínas que apresentam regiões

similares a seqüências expressas pela Hsp60 humana (hHsp60). Dezenove desses

peptídeos são encontrados em proteínas que em determinadas situações,

comportam-se como auto-antígenos conhecidos, como por exemplo, a tireoglobulina,

citoqueratina, ácido glutâmico descarboxilase (GAD), proteína básica mielínica,

proteína ligante de DNA, entre vários outros. Portanto, em função dessa similaridade

entre antígenos, é sugerido a possibilidade de que, uma resposta imune dirigida

contra Hsp65 de microorganismos poderia reconhecer a hHsp60 e auto-antígenos

levando ao desenvolvimento de patologias auto-imunes. Sendo assim, em função da

imunodominância e do alto grau de homologia entre as HSPs humanas e

micobacterianas, surgiram hipóteses de que a Hsp60 poderia estar envolvida em

várias doenças inflamatórias e auto-imunes (JONES et al., 1993, COHEN et al.,

1991). Estas hipóteses basearam-se principalmente no fenômeno conhecido como

mimetismo molecular (OLDSTONE et al., 1987). Esse mimetismo entre antígenos

presentes no microambiente e as proteínas do choque térmico expressas por células

do hospedeiro, poderia desencadear doenças auto-imunes tais como: artrite

induzida por adjuvante em ratos, artrite reumatóide (RES et al., 1988; VAN EDEN et

al., 1991), diabetes tipo I (ELIAS et al., 1991; GUPTA et al., 1991), esclerose múltipla

(BIRNBAUM et al., 1993), aterosclerose (WICK & XU, 1999), entre outras.

Em humanos, existem vários relatos de reatividade contra as HSPs ou

aumento da sua expressão em doenças auto-imunes. Por exemplo, linfócitos Tγδ

reativos à Hsp65 estão presentes na sinóvia de pacientes com Doença Reumatóide

(SHEN et al., 1992) e também nas lesões neuronais de pacientes com Esclerose

Múltipla, próximos aos oligodendrócitos que expressam Hsp60 (SELMAJ et al.,

1992). Aumento nos níveis de anticorpos anti-Hsp65 micobacteriana foi observado

em pacientes com Psoríase, sendo proposto que a atividade desses anticorpos

poderia ser usada como marcador no monitoramento da doença (RAMBUKKANA et

al., 1993). Células de pacientes com Doença de Behçet proliferam contra o peptídeo

336-351 da Hsp60 humana (SAKANE et al., 1997). Na Artrite Reumatóide Juvenil é

relatado que os pacientes apresentam anticorpos anti-Hsp60 e linfócitos do líquido

sinovial são reativos às Hsp60 e Hsp65.

Introdução

12

Em estudo de camundongos com Nefrite Nefrotóxica (NTN), foi mostrado que

a Hsp60 é liberada pelo rim e excretada na urina. Segundo o autor, estes achados

indicam que a Hsp60 age como sinal de perigo e sugere que tais sinais podem estar

envolvidos no agravamento da doença renal (LANG et al., 2005). ULRICH et al.

(1999) mostraram que a transferência de células T reativas a Hsp60 em

camundongos, foi capaz de induzir inflamação intestinal. Foi mostrado também, que

a patogênese da rejeição crônica de tecido cardíaco, envolve resposta de estresse e

a participação de células T autorreativas infiltrantes que agem sob mecanismos

dependente de HSPs (DUQUESNOY et al., 1999).

Além do envolvimento das Hsp60 e Hsp65 em quadros auto-imunes, outras

HSPs também relacionam-se a essas doenças. PAGGI et al. (1995) detectaram a

presença de anticorpos anti-Hsp70 em indivíduos com doença auto-imune

tireóideana, mostrando uma associação entre a proteína e o processo auto-imune.

Foi detectado um aumento de Hsp70 em fibras do músculo ocular de pacientes com

Oftalmopatia Associada à Tireóide (TAO) principalmente na fase aguda da doença

(HYROMATSU et al., 1995).

Esses dados obtidos de pacientes portadores de diferentes doenças auto-

imunes, juntamente aos estudos em modelos experimentais (VAN EDEN, 1988 e

1989), levam-nos a refletir sobre a segurança da vacina DNA-hsp65, nesse aspecto.

Por outro lado, recentemente vários trabalhos vêm mostrando o envolvimento

das HSPs na modulação de doenças auto-imunes. Em um estudo de

imunohistoquímica, forte reatividade para Hsp72, além da presença de infiltrado

inflamatório foi detectada em folículos linfóides de pacientes com Doença de Graves

e Tireóidite de Hashimoto (HEUFELDER et al., 1992). No entanto, neste estudo os

autores concluem que o aumento da expressão de HSPs poderia representar um

fator imunomodulatório de relevância no processo auto-imune. Estudos com vacinas

codificando Hsp60 induzem a ativação de células T regulatórias anti-Hsp60 que

previnem ou tratam Artrite Adjuvante (QURESHI et al., 1999). Outros estudos têm

sugerido que células T Hsp65-específicas apresentam reatividade cruzada contra

Hsp60 própria induzindo efeitos protetores e um melhor prognóstico de Artrite

Reumatóide (ELIAS et al., 1998) e Artrite Juvenil Crônica (QUINTANA et al., 2002;

RAZ et al., 2001). Estes estudos correlacionando HSPs e regulação tem sido

descrito em outras doenças auto-imunes como diabetes tipo I, esclerose múltipla,

encéfalomielite entre outras.

Introdução

13

Embora resultados de nosso laboratório, usando modelos específicos de

doenças auto-imune, não tenham levado a um agravamento das doenças após

esquema vacinal ou terapêutico (SANTOS JR. et al., 2006; SANTOS JR et al.,

manuscrito submetido), outras abordagens se fazem necessárias no sentido de

avaliar se esta vacina poderia induzir processos inflamatórios ou auto-imunes em

hospedeiros saudáveis, não pré-dispostos à auto-imunidade, com o intuito de

mimetizar o que aconteceria com a utilização clínica da vacina.

14

77��

Objetivos

15

2 - OBJETIVOS

2.1 - Objetivo Geral:

Avaliar se a imunização com a vacina DNA-hsp65 induz resposta auto-imune

ou lesões teciduais inflamatórias em camundongos saudáveis e infectados com M.

tuberculosis através da análise histopatológica de diferentes órgãos.

2.2 - Objetivos Específicos:

1) Avaliar se a imunização com o plasmídeo pVAX-hsp65 induz a produção

de anticorpos anti-Hsp65 de M. leprae pela técnica de ELISA;


de anticorpos anti-Hsp60 humana pela técnica de ELISA;


de anticorpos anti-DNA pelas técnicas de Imunofluorescência Indireta e ELISA;

4) Avaliar através de análise histopatológica a presença de infiltrado

inflamatório e/ou lesão em diferentes órgãos de camundongos vacinados e

controles.

16

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Delineamento Experimental

17

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3 - DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Foram estudados três grupos de animais em dois protocolos experimentais

sendo:

� grupo vacina: animais imunizados com a vacina pVAX-hsp65 (DNA-hsp65);

� grupo vetor: animais imunizados apenas com pVAX (DNAv) e

� grupo controle: animais injetados apenas com PBS.

Estes três grupos foram analisados nos seguintes protocolos:

� Protocolo A: animais sadios apenas imunizados;

� Protocolo B: animais imunizados e posteriormente infectados com M.

tuberculosis.

3.1 - Protocolo experimental A

Camundongos BALB/c (6 a 8 semanas de idade) foram imunizados com

pVAX-hsp65 (grupo vacina) ou com pVAX (grupo vetor) por via intramuscular.

Como controle, um grupo recebeu apenas administração de PBS (grupo controle).

A dose administrada foi de 100 µg de DNA por animal, em uma solução de sacarose

a 25%, sendo 50 µg de DNA em cada músculo quadríceps direito e esquerdo. O

processo total de imunização envolveu 3 doses com intervalos de 2 semanas entre

as imunizações, totalizando então, 300 µg de DNA administrado por animal. Estes

experimentos foram realizados em triplicata, totalizando um número de 9

camundongos de cada grupo em cada tempo.

O sacrifício dos animais foi realizado com 15, 45 e 180 dias após a última

dose da vacina.

• 1° Sacrifício = Tempo 1 (T1): 15 dias após a última dose.




18

1ª dose 2ª dose 3ª dose 1º Sacrifício

(T1) 2º Sacrifício

(T2)

Imunização (100µg/ 100µl)

dia 0 15 30 45 75 210

15 dias 15 dias 15 dias 30 dias 135 dias

Coleta de sangue Coleta de órgãos

hsp65

Análise Histopatológica

3º Sacrifício (T3)

Dosagem de Anticorpos

Sacrifício

(coleta de soro pré-imune)


19

3.2 - Protocolo experimental B

Foi realizado o mesmo processo de imunização citado no protocolo

anterior, porém, 15 dias após a última imunização, os animais foram infectados

com 1x105 bacilos (Mycobacterium tuberculosis - H37Rv) por via intratraqueal.

O sacrifício dos animais foi realizado com 30 e 70 dias após o desafio.

• 1° Sacrifício = Tempo 1 (T1): 30 dias após a infecção.

• 2° Sacrifício = Tempo 2 (T2): 70 dias após a infecção.


20

Imunização (100µg/ 100µl)

Desafio

2ª dose 3ª dose 1º Sacrifício

(T1) 15

dias 15

dias 15

dias

Desafio 30

dias 40

dias dia 0 15 30 45 75 115

Coleta de sangue Coleta de órgãos

1x105 bacilos

2º Sacrifício (T2)

hsp65

1ª dose

Análise Histopatológica

Dosagem de Anticorpos

Sacrifício

(coleta de soro pré-imune)

21

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Materiais e Métodos

22

4 - MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 – Animais

Foram utilizados camundongos BALB/c, SPF (do inglês, Specific Patogen

Free / Livre de Patógenos Específicos), fêmeas, com 6 a 8 semanas de idade,

provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, FMRP-USP. Os animais infectados com cepa virulenta de M.

tuberculosis foram mantidos em isoladores de animais, em laboratório de

biossegurança nível III, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz claro /

escuro controlados, com livre acesso à água e ração.

4.2 - Vacina de DNA-hsp65

A vacina de DNA-hsp65 contém um inserto de 3000 pares de bases, que

codifica a proteína de choque térmico (HSP) de M. leprae, subclonado no sítio

BamHI e NotI do vetor pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A figura abaixo

esquematiza o vetor plasmideal pVAX1.

Figura 1: Mapa esquemático do vetor plasmideal pVAX1. Representação dos principais sítios funcionais como: gene de resistência a antibióticos (kanamicina), seqüência promotora (Pcmv), seqüência de origem de replicação (pUC ori), sítio de piliadenilação (BGH pa) e seus vários sítios de restrição.


23

4.3 - Obtenção dos plasmídeos recombinantes pVAX-Hsp65 e pVAX

Os plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX (vetor) foram purificados por

cromatografia de troca iônica, utilizando-se QIAGEN Giga Plasmid Purification Kit

(Qiagen Inc., Santa Clarita, CA, USA). Para a realização desse protocolo, uma

colônia de bactérias E. coli DH5α™ transformada com o plasmídeo recombinante

pVAX-hsp65 ou plasmídeo pVAX foi retirada de uma placa recém preparada

contendo meio LB Agar (SIGMA, Germany) contendo kanamicina (Cilinon� GIBCO

BRL, Scotland ) na concentração de 100 µg/ml. Esta colônia foi inoculada em 5,0 ml

de caldo LB BROTH BASE (GIBCO BRL, Scotland) com kanamicina (100 µg/ml) e

incubada durante 8 horas a 37oC sob agitação vigorosa (250 rpm), em incubadora

com agitação (Incubador shaker series 25, New Brunswick, Edison, New Jersey,

USA). A cultura inicial foi diluída 1/500 em 2,5 litros de caldo LB BROTH BASE,

contendo kanamicina (100 µg/ml), e incubada a 37°C sob agitação (250 rpm)

durante 16 horas. Após a incubação, o material foi centrifugado a 5.000 rpm por 15

minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso em 125 ml de tampão P1 (Tris-HCl 50

mM pH 8,0; EDTA 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Em seguida, foram adicionados 125

ml de tampão P2 (NaOH 200 mM; SDS 1%) e após 5 minutos foram adicionados 125

ml do tampão P3 (acetato de potássio 3,0 M pH 5,5). O material foi filtrado e mantido

no gelo por 30 minutos. O filtrado foi aplicado à resina da QIAGEN previamente

equilibrada com tampão QBT (NaCl 750 mM; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15% e

Triton X-100 0,15 %). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 ml de

tampão QC (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %) e o DNA plasmideal

eluído com 30 ml de tampão QF (NaCl 1,25 M; MOPS 50 mM pH 7,0; etanol 15 %).

O DNA eluído foi precipitado em 52,5 ml de isopropanol e, em seguida, centrifugado

a 14000 rpm por 45 minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso em 0,5 - 1,0 ml de

água.

A quantificação dos plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX foi realizada por

espectrofotometria no aparelho GeneQuant IITM (Amershan-Pharmacia, BioSciences,

USA), nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm.


24

4.4 - Avaliação da integridade dos plasmídeos

Como o plasmídeo pVAX e o inserto do gene Hsp65 têm tamanhos

semelhantes (�3000 pb) foi utilizada a enzima de restrição BamHI (Invitrogen), que

nesse caso, digere os plasmídeos (pVAX-hsp65 e pVAX) em apenas um único sítio

de restrição, não removendo o inserto (hsp65). Isso lineariza os plasmídeos, o que

permite a confirmação das amostras que possuem o plasmídeo pVAX-hsp65 (�6000

pb) ou pVAX (�3000 pb). Para tanto, um micrograma de cada plasmídeo foi

incubado com BamHI (1 unidade/µg de DNA) a 37oC por 3 horas. Em seguida, os

produtos da digestão de cada amostra, e também os plasmídeos não digeridos,

foram submetidos a eletroforese em gel de agarose (GIBCO BRL) a 1%. No preparo

deste gel, as amostras foram ressuspendidas em tampão de eletroforese 6 vezes

concentrado (0,25 % azul de bromofenol; 40 % de sacarose em água) e o material

submetido à eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato 40 mM; EDTA 1 mM pH 8,3).

A corrida foi realizada a 76 V por 1 hora utilizando o aparelho da Life Tecnologies

Inc., Modelo 250 (BRL). O padrão de 1Kb Plus DNA Ladder (GIBCO BRL, Scotland)

foi utilizado como marcador de peso molecular. O gel foi corado com 0,5 µg/ml de

brometo de etídio (Gibco BRL) e a visualização das bandas foi feita em luz

ultravioleta no ImageMaster VDS (Pharmacia Biotech).

s.

Figura 2: Perfil eletroforérico do DNA plasmideal purificado – pVAX e pVAX-hsp65. Os plasmídeos foram purificados com kit comercial QIAGENTM, de acordo com as instruções do fabricante, digeridos ou não com a enzima BamHI e submetidos a eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Canaleta 1: padrão de peso molecular 1kb PLUS DNA Ladder (GIBCO); Canaleta 2: pVAX íntegro; Canaleta 3: pVAX digerido; Canaleta 4: pVAX-hsp65 íntegro e Canaleta 5: pVAX-hsp65 digerido. Pb = pares de bases.

pb

6000

3000 2000 1650

1 2 3 4 5


25

4.5 - Análise da pureza das vacinas gênicas

Foi realizada a determinação da presença de endotoxinas bacterianas nas

vacinas obtidas por “maxiprep”. O teste empregado foi o teste cromogênico do lisado

de amebócito de Limulus polyphemus (LAL) que é um teste quantitativo para

mensuração de endotoxinas de bactérias gram-negativas utilizando o “QCL-100 LAL

kit” (Cambrex). Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1

ml de água fornecida pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e

homogeneização em vórtex, por 15 min continuamente antes do uso. Utilizando uma

seringa de 10 ml, foi reconstituído o substrato cromogênico com a adição de 6,5 ml

de água do kit. O frasco foi protegido da luz com papel alumínio e posteriormente foi

incubado, junto com uma placa de 96 poços, em estufa a 37ºC até o momento do

uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de 1,4 ml de água com ajuda de

uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos, retirou-se a placa de 96

poços da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da

endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por ml (UE/ml)

até 0,1 UE/ml, utilizando sempre a água fornecida pelo kit. Posteriormente foram

depositadas as amostras em poços diferentes da placa. A seguir foram adicionados

a todos os poços 50 µl do LAL e a placa incubada a 37ºC por 10 min.

Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100�L do substrato

cromogênico em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e

incubação a 37ºC por 6 min. Posteriormente, foram acrescentados em todos os

poços 100 �L de uma solução de ácido acético 25% para interromper a reação.

Finalmente, foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em

espectrofotômetro a 405nm e os resultados determinados, correlacionando a curva

padrão com a diluição das amostras, tendo em consideração a absorbância e a

concentração de endotoxina para esse ponto de cada uma das amostras, em

relação à curva padrão. A fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por

micrograma de DNA foi:

UE/ml X diluição UE/µg DNA = ________________________

amostra µg/ml


26

Foram consideradas amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentam

valores menores que 0,1 UE/µg DNA.

4.6 – Imunizações

Os plasmídeos pVAX-hsp65 e pVAX tiveram suas concentrações acertadas

para 2 µg/µL em PBS. A estas preparações, foi acrescida uma solução de sacarose

(concentração final de 25%), visando promover um influxo celular para o local da

imunização. Os animais foram imunizados no músculo quadríceps femural (i.m), em

intervalos de 15 dias entre uma dose e outra. Cada animal recebeu 3 doses de 100

µg de DNA, sendo 50 µg em cada músculo (totalizando 300 µg ao final das três

doses).

4.7 - Preparo do inóculo de Mycobacterium tuberculosis

A suspensão de M. tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294), foi obtida a

partir de uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi verificada viabilidade superior

a 85% (incubação de uma amostra com diacetato de fluoresceína e brometo de

etídio) (McDonough & Kress, 1995). Uma alíquota de 50 µL foi semeada em meio

Lowenstein-Jensen (DIFCO) seguindo-se incubação de 20 a 30 dias, a 37º C. Uma

alça da cultura em meio Lowenstein-Jensen foi adicionada a 10 ml de meio 7H9

enriquecido com Middlebrook ADCTM (BD Biosciences, Spark, USA) sendo incubada

por 7 a 10 dias, a 37º C. A viabilidade foi novamente verificada com auxílio de

microscópio de fluorescência (Leica), onde as bactérias viáveis apresentam

coloração verde enquanto que as bactérias mortas coram-se com a solução de

brometo, apresentando-se com uma coloração avermelhada. O número de bacilos

da suspensão foi determinado através da densidade óptica da cultura a 540 nm. A

suspensão foi centrifugada a 3500 rpm por 20 minutos, o sedimento foi ressuspenso

em 1 ml de salina estéril e agitado vigorosamente em tubo cônico com pérolas de

vidro estéreis por 2 minutos. Acertou-se a concentração de bacilos (1x106 bacilos/ml)

presentes no volume de cultura centrifugado por diluição com salina. Todos os

procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais

foram realizados em laboratório de nível de biossegurança III.


27

4.8 - Desafio dos animais com Mycobacterium tuberculosis

Cada animal foi desafiado com 100µL de suspensão contendo 1x105 bacilos

de M. tuberculosis H37Rv por via intratraqueal (i.t), 15 dias após a última

imunização. Para esse procedimento, os animais foram previamente anestesiados

com uma solução de tribromoetanol (ACROS ORGANICS) a 2,5% em PBS por via

intraperitoneal (i.p). Após a anestesia, realizou-se o procedimento cirúrgico para

exposição da traquéia dos animais e inoculação da bactéria.

4.9 - Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-Hsp65

e anti-Hsp60

Placas de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, Rochester, NY, USA)

de 96 poços, foram recobertas com 0,1 ml das proteínas Hsp65 (produzida em

nosso laboratório) ou Hsp60 (Lionex - Alemanha) recombinantes (5 µg/ml) diluídas

em tampão de ligação (Na2CO3 14,3 mM e NaHCO3 10,3 mM pH 9,6), e incubadas

durante a noite a 4ºC. Posteriormente, as placas foram lavadas (0,05% de Tween 20

em PBS pH 7,2-7,4) e bloqueadas por 1 hora a 37ºC (200 µL por poço de PBS com

1% de gelatina, pH 7,2-7,4). Após lavagem, foram adicionadas as amostras (soros

diluídos seriadamente 1:100, 1:500 e 1:1000) e incubadas por 2 horas a 37°C. As

placas foram novamente lavadas e incubadas com anti-IgG1 (A85-1, Sigma) ou anti-

IgG2a biotinilados (R19-15, Sigma) para a determinação de isotipos de anticorpos

anti-Hsp65 e incubadas com anti-IgG total biotinilado para detecção de anti-Hsp60

(PharMingen, San Diego, CA, USA). A revelação foi feita pela incubação à

temperatura ambiente por 30 minutos com StreptAB kitTM (Dako, Carpinteria, CA,

USA), seguida da adição do substrato OPD (Sigma, St. Louis, MO, USA). A reação

foi finalizada pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico a 16% (Merck &.Co. Inc.) A

Densidade óptica foi obtida em leitor de microplacas com filtro de 490 nm (Quant

Bio-Tek Instruments Inc.). Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos da

PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante.


28

4.10 - Ensaio de Imunofluorescência Indireta (IFI) para determinação de

anticorpos anti-DNA

A realização desta técnica ocorreu na Faculdade de Medicina de São Paulo,

na Disciplina de Reumatologia, com a colaboração da técnica Margareti Vendramini

e coordenação da Dra. Eloísa Bonfa. Neste ensaio foi utilizada cultura de Crithidia

luciliae, um hemoflagelado que possui o cinetoplasto, estrutura rica em DNA, o qual

é exposto como substrato, para reação com possíveis anticorpos anti-DNA

presentes na amostra. A manutenção da cultura de Crithidia foi feita pela suspensão

de hemoflagelados em meio estéril de Fyts. Após incubação por 48 horas a 28ºC, os

microorganismos foram centrifugados a 700 rpm por 10 minutos, lavados 3 vezes

com solução salina 0,5 M tamponada com fosfato e pH ajustado para 7,2 e

ressuspendidos em água contendo albumina sérica bovina a 0,1%. Transcorridos 10

minutos, aplicaram-se 10 µl da suspensão contendo os microorganismos. As

lâminas foram sucessivamente expostas ao ar para secarem, sendo fixadas com

etanol absoluto 10 minutos e estocadas a -20ºC.

A produção de anticorpos anti-DNA foi avaliada por IFI em amostras de soro

diluídas a 1/10 e 1/20 em PBS-azida (NaN3 MERCK 6688 A 100 65). Após a

diluição, as amostras foram colocadas em lâminas previamente preparadas com o

substrato de Crithidia luciliae e incubadas a 37ºC por 45 minutos. Feita a incubação,

as lâminas foram lavadas para a retirada do excesso da amostra e, posteriormente,

foram mergulhadas em cuba com PBS-azida por 10 minutos. Logo após a secagem

das mesmas, foram aplicados 20 µl do anticorpo conjugado (Sigma 102K9150) anti-

mouse e feita a incubação por 40 minutos a 37ºC. Posteriormente, as lâminas

foram lavadas e preparadas para observação ao microscópio de fluorescência. Na

análise, a positividade da reação se caracteriza pela intensa cor verde fluorescente

destacando o cinetoplasto, enquanto que a reação negativa apresenta-se verde ou

vermelha fosca não destacando o material cromossômico.

4.11- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para dosagem de anticorpos anti-DNA

Placas de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, Rochester, NY, USA)

de 96 poços, foram pré-tratadas com 50 µl de poli-L-lisina (Sigma, Sto. Louis-USA) a

50 µg/ml em PBS a 37ºC por 2 horas. Após a lavagem das placas por 2 vezes com


29

PBS, os orifícios das placas foram recobertos com 50 µl de DNA nativo de timo de

bezerro (nDNA) (Sigma, Sto. Louis-USA) a 0,125 µg/µl em PBS por 16 horas a 4ºC.

As placas foram, então, lavadas e bloqueadas com uma solução contendo BGG

(gamaglobulina bovina fetal 2%) em PBS (75 µl por orifício) por 2 horas à

temperatura ambiente. As amostras de soro foram diluídas a 1:50 em PBS com

tween 20 a 0,1% e gamaglobulina fetal (2%) e foram adicionadas aos orifícios e

incubadas por 2 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram

lavadas e incubadas com IgG de cabra anti-IgG de camundongo marcada com

fosfatase alcalina, diluída em PBS/tween e soro bovino fetal 20% e incubado por 1

hora. A lavagem foi repetida e a reação foi revelada com a adição do substrato p-

nitrofenilfosfato (Sigma, St. Louis, MO, USA) 1mg/ml de tampão glicina (pH-10,5). A

reação foi interrompida com a adição de 50 µl de NaOH 3 M. A Densidade óptica foi

obtida em leitor de microplacas com filtro de 405 nm (Quant Bio-Tek Instruments

Inc.).

4.12 - Análise histopatológica

Para esta análise, foram obtidas amostras de 18 tipos de órgãos como

pâncreas, articulação, coração, músculo esquelético, cérebro, tireóide, fígado,

pulmão, rim, supra-renal, baço, timo, linfonodo poplíteo e linfonodo inguinal, intestino

delgado e intestino grosso, pele, e globo ocular. Estes órgãos, removidos por

ocasião do sacrifício dos animais (em cuba com éter), foram fixados em tampão

fosfato contendo 10% de formalina durante 6 horas e, em seguida, foram

submetidos ao processo de desidratação em álcool 70% e clarificação em xilol. Os

tecidos foram inclusos em blocos de parafina e, em seguida, foram realizados cortes

histológicos de 5 µm de espessura com auxílio de um micrótomo. Os cortes foram

dispostos em lâminas e incubados a 58-60oC para fixação e, em seguida, lavados

em xilol para retirar o excesso de parafina e re-hidratados com concentrações

decrescentes de álcool (do absoluto ao 80%). Os cortes re-hidratados foram corados

com hematoxilina-eosina (HE), desidratados em concentrações crescentes de álcool

(80% ao absoluto), lavados com xilol e cobertos com lamínulas para análise dos

componentes celulares presentes. As lâminas foram examinadas em microscópio

óptico (Leica, Germany) e as imagens adquiridas através de câmera digital (Sony

DXC-107A) acoplada ao microscópio. A confecção destas lâminas histológicas foi


30

realizada pela técnica Ana Maria da Rocha e analisadas cegamente pelos

patologistas Prof. Dr. Edson G. Soares (FMRP-USP) e Dr. Luiz Benvenuti (Instituto

do Coração-InCor / HC-FMUSP). As lâminas que apresentaram leituras discordantes

foram reavaliadas, sendo definido um consenso entre os patologistas. Em cada

tecido analisado foram avaliadas: (I) presença de comprometimento tecidual (II)

presença de infiltrado inflamatório, (III) presença de focos hemorrágicos e edemas,

entre outros.

4.13 - Análise estatística

A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada pelo teste “one way

ANOVA”, seguida do teste Bonferroni, o qual permite a comparação de três ou mais

grupos experimentais independentes, onde foram consideradas estatisticamente

significantes as diferenças com p<0,05. O software utilizado, foi GraphPad Prism

versão 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

31

++��

Resultados

32

5 – RESULTADOS 5.1 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65

� Protocolo A

A produção de anticorpos foi avaliada pela técnica de ELISA em soros pré-

imunes (dia 0 ) e em soros coletados 15, 45 e 180 dias após a última imunização de

camundongos que receberam injeções com PBS, DNAv (pVAX-vetor) ou DNA-hsp65

(pVAX-hsp65). A resposta imune humoral foi determinada através da produção de

anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 (Figuras 3A e 3B, respectivamente).

Inicialmente, observamos que a vacina de DNA-hsp65 induziu a produção de

altos títulos de anticorpos anti-Hsp65, tanto do isotipo IgG1 quanto IgG2a, sendo

estatisticamente significativo em relação aos demais grupos experimentais, como

PBS, vetor e amostras do momento pré-imune. Entretanto, observamos que 180 dias

após a imunização, os títulos de anticorpo IgG1 diminuíram de maneira significativa

nos animais imunizados com DNA-hsp65, quando comparados aos títulos de

anticorpos produzidos 15 e 45 dias após a imunização (Figura 3A). Por outro lado,

foi observado que animais injetados com DNA-hsp65 produziram altos títulos de

IgG2a nos três tempos avaliados (Figura 3B).

Resultados

33

A

B

Figura 3: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas entre uma dose e outra. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Os níveis de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-Hsp65 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) no momento pré-imune e nos tempos de 15, 45 e 180 dias depois da última imunização. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo.

0 50 100 150 200 2500

1

2

3controlevetorvacina

*

*

*

�

�

Tempo (dias)

� ��

IgG

1 an

ti-H

sp65

(DO

490

nm

)

0 50 100 150 200 2500

1

2

3controlevetorvacina

***

Tempo (dias)

��

IgG

2a a

nti-

Hsp

65(D

O 4

90 n

m)

Resultados

34

5.2 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60

� Protocolo A

Assim como descrito no Protocolo A para determinação de anticorpos anti-

Hsp65, seguimos o mesmo delineamento de imunizações e tempos analisados para

determinação de anticorpos IgG total anti-Hsp60 humana.

Como podemos observar na figura 4, nos dias 15 e 45 após a última dose da

vacina (tempos 1 e 2, respectivamente), somente os camundongos que foram

imunizados com DNA-hsp65 produziram níveis significativos de anticorpos anti-

Hsp60 quando comparados aos níveis de anticorpos detectados em amostras de

soros pré-imunes (dia 0). Também podemos observar que ao comparar os diferentes

grupos dentro do mesmo tempo, apenas animais que foram imunizados com DNA-

hsp65 apresentaram um aumento significativo de anticorpos anti-Hsp60, somente

nos tempos de 15 e 45 dias após a última dose, quando comparados aos grupos

controle e vetor. Entretanto, os títulos destes anticorpos diminuíram após 180 dias

da última dose da vacina (Figura 4).

Resultados

35

Figura 4: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Os níveis de anticorpos IgG total anti-Hsp60 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) no momento pré-imune e nos tempos de 15, 45 e 180 dias depois da última imunização. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo.

0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50 controlevetorvacina

* *��

Tempo (dias)

IgG

Tot

al a

nti-

Hsp

60(D

.O 4

90 n

m)

Resultados

36

5.3 - Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65

� Protocolo B

Neste protocolo, a produção de anticorpos foi avaliada pela técnica de ELISA

a partir de soros pré-imunes (dia 0) e também em soros de camundongos que

receberam injeções com PBS, DNAv ou DNA-hsp65 sendo posteriormente

infectados com M. tuberculosis por via intra-traqueal. No dia da infecção (momento

pré-infecção) e passados 30 e 70 dias após a infecção, foram coletadas amostras de

soro dos animais. A resposta imune humoral foi determinada através da produção de

anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 (Figuras 5A e 5B, respectivamente).

Inicialmente, podemos observar que camundongos imunizados com DNA-

hsp65 apresentaram um aumento significativo tanto de IgG1 quanto de IgG2a nos

três tempos avaliados, quando comparados com os níveis de anticorpos em

amostras pré-imunes. Além disso, amostras de animais do grupo controle e grupo

vetor também foram significativamente maiores 70 dias após o desafio (dia 115),

quando comparadas às amostras pré-imunes (Figuras 5A e 5B).

Foi observado também, que 15 dias após a última dose da vacina (momento

pré-infecção) e 30 dias após a infecção, animais que foram vacinados apresentaram

níveis significativamente maiores dos dois isotipos anti-Hsp65, quando comparado

àqueles dos grupos controle e vetor. No entanto, no isotipo IgG2a de camundongos

vacinados, foi observada uma significativa queda 30 dias após a infecção em

relação ao momento pré-infecção (15 dias após a vacinação) (Figura 5).

Os animais que receberam PBS e vetor plasmideal nas imunizações

mostraram um significante e abrupto aumento de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-

Hsp65 no segundo tempo avaliado de 70 dias após a infecção, em relação ao tempo

de 30 dias após a infecção de seus respectivos grupos, chegando a equiparar-se

aos níveis de anticorpos detectados no grupo vacina (Figura 5).

Resultados

37

Figura 5: Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Quinze dias após a última dose, os animais foram desafiados com 5 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intra-traqueal. Os níveis de anticorpos IgG1 (A) e IgG2a (B) anti-Hsp65 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) nos tempos 0 (pré-imune), 45 (pós-imune), 75 (30 dias pós infecção) e 115 (70 dias pós infecção) dias. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos e tempos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo. A seta indica o dia da infecção.

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

vetorvacina

controle

Tempo (dias)

***

**

��

�

�Ig

G1

anti

-Hsp

65(D

O 4

90 n

m)

B

A

0 20 40 60 80 100 1200

1

2

3

4

vetorvacina

controle

Tempo (dias)

*�

�

*

***

� �

�

IgG

2a a

nti-

Hsp

65(D

O 4

90 n

m)

Resultados

38

5.4 - Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60

� Protocolo B

Como descrito no Protocolo B para determinação de anticorpos anti-Hsp65,

seguimos o mesmo delineamento de imunizações e tempos analisados para a

determinação de anticorpos IgG total anti-Hsp60 (Figura 6).

Como podemos observar na figura 6, houve um aumento significante nos

níveis de anticorpo IgG anti-Hsp60 no soro proveniente de animais que foram

imunizados com DNA-hsp65 no tempo de 70 dias após a infecção (dia 115) em

relação ao soro pré-imune (dia 0). Além disso, apesar de não haver diferença

estatística, a produção de anticorpo anti-Hsp60 no soro de animais que receberam

PBS e DNAv apresentou-se aumentada em relação ao soro pré-imune 70 dias após

a infecção (dia 115). No entanto, esses títulos de anticorpos foram significativamente

menores do que aqueles encontrados no soro de animais que foram imunizados com

DNA-hsp65.

Resultados

39

Figura 6: Determinação da produção de anticorpos IgG total anti-Hsp60. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100µg de DNA-hsp65 ou DNAv em 3 doses com intervalos de 2 semanas entre uma dose e outra. O grupo controle recebeu PBS nas imunizações. Quinze dias após a última dose, os animais foram desafiados com 5 x 105 bacilos de M. tuberculosis por via intra-traquel. Os níveis de anticorpos IgG total anti-Hsp60 foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 100 vezes) nos tempos 0 (pré-imune), 45 (pós-imune), 75 (30 dias pós infecção) e 115 (70 dias pós infecção) dias. Os resultados estão representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (490 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,05 de todos os grupos em relação ao pré-imune, � p < 0,05 comparando-se os tempos dentro do mesmo grupo e � p < 0,05 comparando-se os grupos dentro do mesmo tempo. A seta indica o dia da infecção.

0 20 40 60 80 100 1200.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5controle

vacinavetor

*��

Tempo (dias)

IgG

Tot

al a

nti-

Hsp

60(D

.O 4

90 n

m)

Resultados

40

5.5- Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por

Imunofluorescência Indireta

A análise da produção de anticorpos anti-DNA foi realizada pela técnica de

Imunofluorescência Indireta (IFI) pela reação com DNA de Crithidia luciliae, a qual,

quando positiva, apresenta-se sob uma coloração verde fluorescente intensa,

destacada por um ponto fluorescente, que é o cinetoplasto (material rico em DNA)

da Crithidia luciliae. Como controle positivo, utilizamos soro de animais NZB/NZW F1

que é uma linhagem de camundongos que desenvolvem lupus eritematoso

sistêmico, doença esta que tem como característica a produção de anticorpos anti-

DNA (Figura 7A). Por outro lado, quando a reação é negativa, a mesma se encontra

sob uma coloração verde ou vermelha fosca, a qual não destaca a estrutura com

DNA. Como controle negativo utilizamos amostras de soros pré-imunes de

camundongos BALB/c (Figura 7B).

Todas as amostras experimentais, tanto do protocolo A quanto do B deste

projeto, não apresentaram positividade para a reação, ficando claro que a

imunização com o DNA-hsp65 não foi capaz de induzir a produção destes auto-

anticorpos (Figura 7C).

Resultados

41

C

Figura 7: Determinação de anticorpos anti-DNA por IFI. Controle positivo para anticorpos anti-DNA em amostras de soros de camundongos NZB/NZW (A); controle negativo para anticorpo anti-DNA em amostras de soros pré-imunes de camundongos BALB/c (B); e amostra de um dos resultados negativos representativo das amostras experimentais para anticorpo anti-DNA (C). Na figura A, a seta aponta um exemplo de cinetoplato corado positivamente.

A

B

Resultados

42

5.6 - Determinação da produção de anticorpos anti-DNA por ELISA

Após obtermos os resultados de anticorpos anti-DNA pela técnica de IFI,

decidimos realizar a técnica de ELISA para o mesmo fim, por ser um ensaio mais

sensível além de permitir resultados quantitativos.

Observamos, mais uma vez, que todas as amostras analisadas tanto do

Protocolo A (Figura 8A) quanto do Protocolo B (Figura 8B) não mostraram presença

destes anticorpos. Isto fica claro ao compararmos os resultados das amostras

experimentais com as amostras de soro pré-imune e amostras de animais NZB/NZW

F1 usadas como controle positivo, que foram significativamente maiores em relação

a todos grupos e tempos analisados (Figuras 8A e B). Podemos observar que no

Protocolo B, as análises realizadas em amostras referentes ao tempo de 70 dias

após a infecção (T2) dos três grupos avaliados, mostraram um discreto aumento em

comparação ao tempo anterior e amostras pré-imunes, porém, não significativo.

Resultados

43

NZB/W

pré-im

.T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

controle vetor vacina

***

Ant

icor

pos

anti

-DN

A(D

O 4

05 n

m)

NZB/W

pré-im

. T1 T2 T1 T2 T1 T20.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

controle vetor vacina

***

Ant

icor

pos

anti

-DN

A(D

O 4

05 n

m)

Figura 8: Determinação da produção de anticorpos anti-DNA. A análise foi realizada pela técnica de ELISA no soro dos animais (diluído 50 vezes) referentes ao Protocolo A (A) e Protocolo (B). Soros de animais NZB/NZW foram utilizados como controle positivo. Os resultados são representados pela média ± erro padrão da média da densidade óptica (405 nm) das amostras de três experimentos independentes com o n total de 9 animais em cada grupo. * p < 0,001 do controle positivo em relação a todos os outros tempos e grupos analisados.

A

B

Resultados

44

5.7 - Avaliação Histopatológica

A avaliação histopatológica foi realizada pela coloração de Hematoxilina e

Eosina (HE) em diferentes órgãos de camundongos tanto do Protocolo A quanto do

Protocolo B. Foram analisados 18 órgãos que se encontram listados na tabela 1.

Nos órgãos obtidos de animais submetidos ao Protocolo A foi observado que,

de maneira geral, em vários animais, independentemente de grupo ou tempo

avaliado, foi freqüente a presença de discretas alterações pulmonares. Essas

alterações foram caracterizadas por raros, mínimos ou discretos focos inflamatórios

com presença de macrófagos, linfócitos e, às vezes neutrófilos, além de focos

hemorrágicos e congestos. Em outros poucos casos, observaram-se mínimas

alterações no fígado, rim, articulação e músculo esquelético, porém, alterações

estas, não significativas e não sugestivas de quadro patológico.

Assim como foi observado nos resultados referentes às amostras do

Protocolo experimental A, amostras provenientes de animais do Protocolo B também

apresentaram alterações independentemente de grupo ou tempo analisados.

Obviamente, um intenso comprometimento pulmonar foi observado em todos

animais, salvo algumas exceções, em que o procedimento de infecção não foi bem

sucedido. Observaram-se também, raros casos de amostras de músculo esquelético

e freqüentes casos de fígado, que apresentaram discretos e mínimos focos de

infiltrado celular, porém, não sugestivos de alterações patológicas. Além disso, fica

claro o não envolvimento da vacina DNA-hsp65 na indução destas alterações, uma

vez que estas foram também observadas nos grupos controle e vetor.

Imagens representativas de todos os órgãos; nos grupos, tempos e protocolos

analisados estão representadas nas fotos a seguir (Figuras 9 - 37). Além disso, em

anexo (página 105), esta representada uma tabela com a descrição completa das

leituras (cegas) realizadas pelos patologistas Dr. Édson Soares (FMRP-USP) e Dr.

Luiz Benvenuti (InCor). Nestes resultados, podemos observar que os órgãos

provenientes de animais que foram imunizados encontram-se nas mesmas

condições dos órgãos de animais dos grupos controle e vetor, não apresentando

alterações indicativas de auto-imunidade.

As amostras de pulmões e órgãos linfóides como baço, timo, linfonodo

poplíteo e linfonodo inguinal, provenientes de animais do protocolo experimental B,

Resultados

45

os quais foram submetidos à infecção, não foram representadas, pois, segundo

conversa com o patologista Dr. Édson Soares, as alterações encontradas nestes

órgãos são, obviamente, decorrentes da infecção, não se correlacionando com

alterações sugestivas de auto-imunidade.

Resultados

46

Tabela 1: Lista dos 18 órgãos analisados histologicamente

Pâncreas Articulação Cérebro

Tireóide Fígado Rim

Adrenal Coração Músculo esquelético

Globo ocular Pele Intestino delgado

Intestino grosso Pulmão Baço

Timo Linfonodo poplíteo Linfono ingnal

Tabela 2: Quantidade de animais avaliados na histopatologia em cada tempo e grupo dos protocolos experimentais.

Tempos

Grupos

T1 T2 T3

PBS

n = 9 n = 9 n = 9

Vetor

n = 8 n = 9 n = 9 Protocolo A

Vacina

n = 9 n = 9 n = 9

PBS

n = 9 n = 9 ----

Vetor

n = 9 n = 9 ---- Protocolo B

Vacina

n = 9 n = 9 ----

Resultados

47

Figura 9: Avaliação histológica do Pâncreas. Representação das estruturas pancreáticas em perfeitas condições, apresentando tanto a parte exócrina quanto a endócrina intactas, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x. IL (ilhotas de langerhans), AP (ácinos pancreáticos).

controle T1 controle T2 controle T3

vetor T1 vetor T2

vetor T3

vacina T1 vacina T2 vacina T3

IL

AP

Resultados

48

Figura 10: Avaliação histológica do Pâncreas. Representação das estruturas pancreáticas em perfeitas condições, apresentando tanto a parte exócrina quanto a endócrina intactas, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x. IL (ilhotas de langerhans), AP (ácinos pancreáticos).

controle T1 controle T2

vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

IL

AP

Resultados

49

Figura 11: Avaliação histológica da Articulação. Representação das cartilagens articulares (CA) e espaços articulares (EA) apresentando-se íntegros, sem a presença de infiltrados celulares nem a formação de tecido conjuntivo de reparo. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. (MO) medula óssea.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


MO

EA

CA

Resultados

50

Figura 12: Avaliação histológica da Articulação. Representação das cartilagens articulares (CA) e espaços articulares (EA) apresentando-se íntegros, sem a presença de infiltrados celulares nem a formação de tecido conjuntivo de reparo. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. (MO) medula óssea.


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

MO EA

CA

Resultados

51

Figura 13: Avaliação histológica do Tecido Encefálico. Representação das camadas constituintes do tecido cerebral e cerebelar em prefeitas condições, bem delimitadas e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada granulosa), SB (substância branca) e SC (substância cinzenta).


vetor T1 vetor T2

vetor T3


SB

CG

SC

Resultados

52

Figura 14: Avaliação histológica do Tecido Encefálico. Representação das camadas constituintes do tecido cerebral e cerebelar em prefeitas condições, bem delimitadas e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada granulosa), SB (substância branca) e SC (substância cinzenta).


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

SB

CG

SC

Resultados

53

Figura 15: Avaliação histológica da Tireóide. Representação das estruturas tireóideanas em prefeitas condições, apresentando os folículos tireóideanos (FT) contendo substância coloidal (C) sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


FT C

Resultados

54


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 16: Avaliação histológica da Tireóide. Representação das estruturas tireóideanas em prefeitas condições, apresentando os folículos tireóideanos (FT) contendo substância coloidal (C) sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.

FT

C

Resultados

55

Figura 17: Avaliação histológica do Fígado. Representação do parênquima hepático preservado. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


Resultados

56


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 18: Avaliação histológica do Fígado. Representação do parênquima hepático preservado. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.

Resultados

57

Figura 19: Avaliação histológica do Rim. Representação da camada cortical renal (CC) com a presença de glomérulos renais (GR) e túbulos renais (TR) em condições estruturais normais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


GR CC

TR

Res

ulta

dos

58

cont

role

T1

co

ntro

le T

2

veto

r T

1

veto

r T

2

vaci

na T

1

vaci

na T

2

Figu

ra 2

0: A

valia

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C)

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R)

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R)

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E) e

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imag

ens

obtid

as c

om a

obj

etiv

a de

20x

.

GR

CC

TR

Resultados

59

Figura 21: Avaliação histológica da Adrenal. Representação das camadas adrenais em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada glomerulosa), CF (camada fasciculada), CR (camada reticulada) e CM (camada medular).


vetor T1 vetor T2

vetor T3

vacina T1 vacina T2 vacina T3 CG

CF

CR

CM

Resultados

60


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 22: Avaliação histológica da Adrenal. Representação das camadas adrenais em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CG (camada glomerulosa), CF (camada fasciculada), CR (camada reticulada) e CM (camada medular).

CG

CF

CR

CM

Resultados

61

Figura 23: Avaliação histológica do Coração. Representação do parênquima cardíaco apresentando fibras musculares cardíacas em cortes longitudinais e transversais sem alterações estruturais nem presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


Resultados

62


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 24: Avaliação histológica do Coração. Representação do parênquima cardíaco apresentando fibras musculares cardíacas em cortes longitudinais e transversais sem alterações estruturais nem presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.

Resultados

63

Figura 25: Avaliação histológica do Músculo Esquelético. Representação de fibras de músculo esquelético em cortes longitudinais e transversais apresentando-se íntegras, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


Resultados

64


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 26: Avaliação histológica do Músculo Esquelético. Representação de fibras de músculo esquelético em cortes longitudinais e transversais apresentando-se íntegras, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.

Resultados

65

Figura 27: Avaliação histológica do Globo Ocular. Representação das camadas celulares do globo ocular em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CV (corpo vítreo).


vetor T1 vetor T2

vetor T3


CV

Resultados

66


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 28: Avaliação histológica do Globo Ocular. Representação das camadas celulares do globo ocular em perfeitas condições estruturais e sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. CV (corpo vítreo).

CV

Resultados

67

Figura 29: Avaliação histológica da Pele. Representação do tecido cutâneo em perfeitas condições, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. TM (tecido muscular), TC (tecido conjuntivo) e GS (glândulas sebáceas) envoltas às bainhas de folículos pilosos.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


GS

TC

TM

Resultados

68


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 30: Avaliação histológica da Pele. Representação do tecido cutâneo em condições normais, sem a presença de infiltrados celulares. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. TM (tecido muscular), TC (tecido conjuntivo) e GS (glândulas sebáceas) envoltas às bainhas de folículos pilosos.

GS

TM TC

Resultados

69

Figura 31: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso. Representação de estruturas intestinais como vilosidades (VL), glândulas intestinais (GI) e camada de músculo liso (ML) em condições normais, sem a presença de infiltrado celular. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


VL

GI

VL

GI

ML

Resultados

70


vetor T1 vetor T2

vacina T1 vacina T2

Figura 32: Avaliação histológica dos Intestinos delgado e grosso. Representação de estruturas intestinais como vilosidades (VL), glândulas intestinais (GI) e camada de músculo liso (ML) em condições normais, sem a presença de infiltrado celular. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo B. T1 e T2 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 20x.

VL

GI

ML

VL

Resultados

71

Figura 33: Avaliação histológica do Pulmão. Representação do parênquima pulmonar preservado e estruturas pulmonares como alvéolos (AL) e bronquíolos respiratórios (BR) com ou sem presença de pequenos e mínimos infiltrados celulares focais perialveolares, sem significância patológica (indicados pelas setas). Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3

vacina T1 vacina T3

AL

BR

Resultados

72

Figura 34: Avaliação histológica do Baço. Representação das regiões esplênicas como polpa vermelha (PV), folículo linfóide (FL) e centro germinativo (CG) pouco evidente em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


FL

CG

PV

Resultados

73

Figura 35: Avaliação histológica do Timo. Representação das camadas cortical (C) e medular (M) em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x.


vetor T1 vetor T2

vetor T3


C

M

Resultados

74

Figura 36: Avaliação histológica do Linfonodo Poplíteo. Representação do tecido linfóide em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. NC (nódulo cortical), M (camada medular).


vetor T1 vetor T2

vetor T3


NC

M

Resultados

75

Figura 37: Avaliação histológica do Linfonodo Inguinal. Representação do tecido linfóide em condições normais. Cortes correspondentes às amostras coletadas de camundongos submetidos ao Protocolo A. T1, T2 e T3 correspondem aos tempos da coleta, e os grupos experimentais estão indicados em cada imagem. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e as imagens obtidas com a objetiva de 10x. NC (nódulo cortical), M (camada medular).


vetor T1 vetor T2

vetor T3


NC

76

!!��

Discussão

77

6 – DISCUSSÃO

Nesse trabalho, mostramos que a vacinação com DNA-hsp65 não induziu

doença auto-imune nem inflamação significativa em qualquer órgão analisado e nem

a produção de anticorpos anti-DNA. Apesar da produção de anticorpos contra Hsp65

micobacteriana e Hsp60 humana, não houve lesão inflamatória nos órgãos

analisados associada à vacina, sugerindo que tais anticorpos não levaram à

formação de imuno-complexos, nem reagiram contra HSPs endógenas induzindo o

desenvolvimento de quadros inflamatórios relevantes nos tecidos avaliados. Em

conjunto, esses resultados são importantes, pois demonstram a biossegurança

dessa vacina, excluindo, que a injeção de DNA-hsp65 desencadeie a quebra de

tolerância para proteínas endógenas resultando em quadros de auto-imunidade.

As HSPs são importantes proteínas que desempenham várias funções no

meio intracelular além de agirem como chaperonas moleculares, importantes para

sobrevivência de células eucarióticas e procarióticas. As HSPs são classificadas em

diferentes famílias de acordo com seu peso molecular. Estas famílias são altamente

conservadas através da evolução e alguns membros de determinadas famílias

apresentam seqüências altamente homologas entre sua variação eucariótica e

procariótica. Isto resulta em reação imunológica cruzada entre homólogos mamíferos

e bacterianos.

As importantes e indispensáveis funções das proteínas HSPs em processos

intracelulares talvez expliquem sua notável conservação evolutiva entre as espécies.

A localização intracelular das HSPs de mamíferos em condições normais, a

típica liberação de HSPs por agentes infecciosos (RANFORD et al., 2000) e a

capacidade de ambas as HSPs (humana e microbiana) em elicitar respostas pró-

inflamatórias inata e adaptativa, indicam uma ligação destas proteínas com

respostas imunes a infecções e a tecidos necróticos que podem favorecer o

desenvolvimento de doenças auto-imunes.

Seguindo a liberação de HSPs por microorganismos em condições de

estresse ou por tecidos necrosados (reações auto-imunes), ocorre o reconhecimento

das mesmas por receptores de superfície (TLR2, TLR4, CD14, CD91, CD94, LOX1)

em células do sistema imune do hospedeiro, ou como auto-antígenos (OHASHI et

al., 2001; BASU et al., 2001; SRIVASTAVA et al., QUINTANA et al., 2005). Dessa

Discussão

78

forma, estas proteínas podem agir como sinal de perigo para o sistema imune. A

primeira evidência de uma função das HSPs como antígeno em resposta

inflamatória foi obtida na década de 1980 em um modelo de Artrite Reumatóide em

ratos, induzida por adjuvante e micobactéria morta pelo calor (VAN EDEN et al.,

1988). Neste trabalho, foram isoladas células T de ratos com a doença que

respondiam à Hsp60 em cultura. Desde então, reatividade as HSPs tem sido

descrito em modelos experimentais de doenças inflamatórias modelos e no próprio

homem. Também foi mostrado, em modelo experimental de aterosclerose, onde

coelhos normocolesterolêmicos imunizados com a proteína Hsp65 em adjuvante ou

M. tuberculosis (sabidamente rico em Hsp65), desenvolveram aterosclerose mesmo

sob uma dieta normal (XU et al., 1992).

Por outro lado, recentemente vários estudos têm demonstrado que células T

reativas as HSPs, tem um fenótipo imunorregulador. Tal fato indica que estas

proteínas, em particular Hsp60 e Hsp70 constituem um grupo de auto-antígenos com

o potencial de desencadear mecanismos imunorregulatórios, os quais podem

suprimir a resposta imune que ocorre em doenças inflamatórias em humanos, tais

como Artrite Reumatóide, Diabetes entre outras (Revisado por VAN EDEN, 2005).

Neste estudo, avaliamos se a vacina de DNA que codifica a proteína Hsp65

de M. leprae seria capaz de induzir a produção de auto-anticorpos que pudessem

implicar, mesmo que potencialmente, em auto-agressão tecidual, através de

avaliação histopatológica de diferentes órgãos simultaneamente e em diferentes

tempos de evolução. Para tanto, utilizamos linhagem de camundongos BALB/c, com

o objetivo de simular a utilização da vacina em indivíduos sadios, diferentemente de

outros trabalhos que abordam correlações entre HSPs e auto-imunidade.

Geralmente, tais trabalhos estudam modelos de auto-imunidade em linhagens de

camundongos pré-dispostos geneticamente ao desenvolvimento da doença, como

por exemplo, camundongos NOD que desenvolvem diabetes espontaneamente, ou

então, modelos de auto-imunidade induzidos quimicamente, como no caso da

utilização de STZ (estreptozotocina) que induz o desenvolvimento de diabetes.

Um aspecto que pode fornecer tendência ao aparecimento de doenças auto-

imunes é dado pelos títulos de anticorpos anti-DNA. Esses anticorpos são

marcadores sorológicos para alguns tipos de doenças auto-imunes, principalmente,

Lupus Eritematoso Sistêmico (LES). Como já se sabe, a única propriedade

imunológica do DNA é dependente de sua seqüência de nucleotídeos e seu estado

Discussão

79

de metilação, que pode ser imuno-estimulatória, ativando células como linfócitos B e

T entre outras (WAGNER, 1999; PISETSKY, 2000; YAMAMOTO et al., 2000; JUNG

et al., 2002). Em particular, o DNA bacteriano tem uma ampla atividade estimulatória

em função de seu conteúdo de motivos CpG, ao passo que, DNA de mamíferos não

tem a mesma atividade, podendo inclusive, inibir respostas direcionadas ao DNA

bacteriano (PISETSKY et al., 2000; CHEN et al., 2001; YAMADA et al., 2002). Além

disso, DNA bacteriano pode induzir uma forte resposta de anticorpos após

imunização, enquanto o DNA de mamíferos não tem esta habilidade (GILKESON et

al., 1995). Ademais, proteínas nucleares como histonas têm a capacidade de formar

complexos com DNA, sugerindo que tais complexos expõem regiões do DNA que

podem agir como epítopos para células B. Alternativamente, o DNA,

independentemente de proteínas complexadas, também pode ser reconhecido,

sendo que, em ambos os casos, a resposta é direcionada ao próprio DNA

(MESSINA et al., 1991). DEMETRIOS et al. (1992), mostraram por

imunofluorescência em cortes de tecido, depósitos intranucleares de anticorpos anti-

DNA em células de rim, baço, coração e fígado de camundongos normais, levando à

formação de infiltrados celulares no local.

Em estudos realizados em nosso laboratório, foi mostrado que a

administração in vivo de DNA nu, como no caso da vacina em questão, que é

administrada por via intramuscular, pode deixar o DNA-hsp65 plasmideal detectável

por até 6 meses pós imunização, sendo detectado em vários órgãos analisados

como pulmão, fígado, medula óssea, músculo esquelético, rim, linfonodo, baço e

timo, mostrando desse modo, uma ampla capacidade de biodistribuição do vetor

plasmideal (COELHO-CASTELO et al., 2006). Correlacionando isto ao fato de que o

DNA bacteriano e algumas HSPs, como a Hsp90, podem formar complexos imunes

que interagem com TLR9 estimulando células do sistema imune inato (KRIEG,

2002), esses complexos poderiam, hipoteticamente, ativar células B a produzir

anticorpos anti-DNA.

Sendo assim, analisamos amostras de soro de animais imunizados com DNA-

hsp65 quanto à presença de anticorpos anti-DNA, pelos métodos de

Imunofluorescência Indireta (IFI) e ELISA. No protocolo A, em que os animais

receberam apenas as imunizações, não foi detectada a presença destes auto-

anticorpos em nenhuma das técnicas empregadas (Figuras 7C e 8A). Da mesma

forma, não houve produção de tais anticorpos nos animais submetidos ao protocolo

Discussão

80

B (Figuras 7C e 8B). Neste protocolo, além de vacinados os camundongos foram

infectados com a micobactéria. Com isto, a agressão tecidual induzida pela infecção

poderia levar o DNA genômico tanto do hospedeiro quanto da micobacteria a um

contato com células imunes do hospedeiro. Assim, 70 dias após a vacinação e

infecção (Protocolo B), foi detectado um discreto, mas não significativo, aumento

desses anticorpos pela técnica de ELISA nos três grupos analisados.

Em estudo de correlação entre a infecção micobacteriana e auto-imunidade,

foi observado que anticorpos monoclonais anti-tuberculose reagiram com ssDNA,

dsDNA e outros polinucleotídeos, enquanto que anticorpos anti-DNA derivados de

pacientes e camundongos com LES reagiram com glicolipídeos expressos na parede

celular da micobactéria. Isto sugere que uma infecção micobacteriana poderia

estimular a produção de anticorpos potencialmente reativos ao DNA do hospodeiro

(SHOENFELD et al., 1986). Talvez, se analisássemos o Protocolo B em períodos de

tempo maiores, possivelmente poderíamos obter resultados pertinentes a este

estudo. No entanto, como foi descrito acima, os dados obtidos no grupo de animais

imunizados foram iguais aos obtidos nos demais grupos. Isso mostra que mesmo em

caso de infecção, que possivelmente, poderia auxiliar a produção de anticorpos anti-

DNA, a vacina não teve nenhuma ação no sentido de amplificar tal possibilidade.

Portanto, podemos concluir que tanto na imunização quanto em uma situação

de doença (após a infecção) a vacina DNA-hsp65 não induziu aumento nos títulos

de anticorpos anti-DNA, o que é um dado relevante no que diz respeito a segurança

desta construção, visando, futuramente, seu uso clínico.

Por outro lado, foi detectada significante produção de anticorpos anti-Hsp65

em animais imunizados. A avaliação da produção de anticorpos específicos anti-

Hsp65 induzida pela vacina DNA-hsp65 foi importante, primeiramente, para mostrar

que o DNA plasmideal codificando a proteína Hsp65 de M. leprae foi realmente

transfectado e/ou capturado por APCs, com conseqüente transcrição, tradução e

produção da proteína recombinante, que posteriormente levou a produção de

anticorpos anti-Hsp65 detectados nos ensaios de ELISA. Isto vai ao encontro com

estudos de expressão que mostraram que após injeção intramuscular, o DNA é

capturado por miócitos locais (STAN et al., 2001) e células dendríticas (AKBARI et

al., 1999). Nestes, o plasmídeo é mantido como um epissoma, o qual permite a

expressão do antígeno codificado (GURUNATHAM et al., 2000). O antígeno é então

secretado (TRIPATHY et al., 1996; CHASTAIN et al., 2001) e/ou apresentado por

Discussão

81

miócitos no sítio da injeção (STAN et al., 2001) ou por células dendríticas nos

linfonodos drenantes (AKBARI et al., 1999). Conseqüentemente, depois de uma ou

repetidas injeções de DNA, resposta imune humoral para a proteína codificada é

montada e linfócitos de memória são induzidos (GURUNATHAM et al., 2000).

O fato de que o título destes anticorpos esteja significativamente aumentado

apenas no grupo de animais que receberam imunização com DNA-hsp65 sugere sua

especificidade para a Hsp65 (de M. leprae) codificada pela vacina. Além disso, não

houve diferença do título de anticorpos anti-Hsp65 entre os grupos controles (que

receberam o vetor DNAv ou PBS) e amostras de soro coletados antes da

imunização (Figuras 3 e 4), reforçando a especificidade dos anticorpos produzidos

após o esquema de vacinação.

Outro ponto que podemos observar foi que os títulos de anticorpos IgG1 e

IgG2a anti-Hsp65 do grupo de animais vacinados com DNA-hsp65, mantiveram-se

aumentados até 180 dias após a última imunização, sugerindo, portanto, que a

vacina induziu um padrão misto de resposta que permaneceu por tempo prolongado.

Isto corrobora com dados anteriores do grupo que mostraram que a vacina com DNA

nu codificando a proteína Hsp65, quando administrada por via intramuscular, é

capaz de induzir este padrão misto de anticorpos IgG1/IgG2a (LIMA et al., 2003).

Considerando que a vacina em questão é estudada no combate à tuberculose, cuja

resposta protetora é preferencialmente Th1, este padrão de anticorpos é

interessante, uma vez que o “background” do camundongo BALB/c é Th2

(McCLUSKIE et al., 1999; GULER et al., 1997).

Sendo assim, a indução tão significativa desses anticorpos, poderia, pelo

menos potencialmente, levar a indução de mecanismos importantes em processos

deletérios como já foi abordado em outros estudos. Em um estudo onde foi

pesquisada a presença de anticorpos anti-HSPs em pacientes com doença auto-

imune relacionada a infecção por Helicobacter pylori, foi detectado altos níveis de

anticorpos anti-Hsp65 micobacteriana, sugerindo uma reação cruzada com HSPs

autólogas no sítio da infecção (KALABAY et al., 2002). Em outro estudo, várias

doenças de pele como Postulose Palmoplantar (PPP), Psoríase, Púrpura

Anafilactóide, Doença de Behçet, Dermatite Atópica, Urticária e Herpes Zoster,

apresentaram altos níveis de anticorpos anti-Hsp65 de Mycobacterium leprae (IZAKI

et al., 1994).

Discussão

82

Uma vez detectado que a vacina DNA-hsp65 induziu a produção de

anticorpos anti-Hsp65 de M. leprae e, considerando a alta homologia existente entre

as HSPs microbianas e humanas (~ 60% de homologia), foi de grande importância

avaliar se esses anticorpos reagiriam cruzadamente contra a Hsp60 humana. Vale

ressaltar, que apesar de termos avaliado a reatividade contra Hsp60 humana, pode-

se inferir que o mesmo poderia ser observado contra Hsp60 murina, uma vez que

existe uma homologia de aproximadamente 95% entre essas duas proteínas

(Revisado por QUINTANA & COHEN, 2005). Sendo assim, esta reatividade cruzada

poderia desencadear mecanismos auto-imunes, potencialmente patológicos,

também contra a Hsp60 murina. Por isso, avaliamos os níveis séricos de anticorpos

anti-Hsp60 humana e constatamos que animais vacinados com o DNA-hsp65

apresentaram aumento significativo nos níveis desses anticorpos, em relação aos

grupos controles, 15 e 45 dias após a última dose da vacina (Figura 4). No entanto,

estes níveis foram muito menores que os níveis dos dois isotipos anti-Hsp65. Com

isto, podemos levantar a hipótese de que a reação cruzada existe, mas foi

significativamente inferior à resposta contra a Hsp65 de M. leprae.

Contudo, como colocado para anticorpos anti-Hsp65, fica a dúvida se tais

anticorpos, mesmo em baixos níveis, poderiam eventualmente participar de uma

resposta auto-imune. Esta preocupação se deve ao fato de que estes anticorpos ou

mesmo a proteína Hsp60 endógena estão implicados em uma série de eventos auto-

imunes em diferentes órgãos como (I) no fígado, onde foi mostrada a existência de

imunidade humoral com reatividade cruzada entre Hsp65 micobacteriana e Hsp60

humana em pacientes com Cirrose Biliar Primária (VILAGUT et al., 1997); (II) no

intestino, em que reatividade cruzada entre HspB de H. pylori e Hsp60 humana no

epitélio gastrointestinal, pode estar envolvido no desenvolvimento de linfoma de

MALT (KAWAHARA et al., 1999); (III) na glândula supra renal, onde análise

imunocitoquímicas de amostras de pacientes com Doença de Addison, revelaram

aumento de expressão de Hsp60, comparadas com indivíduos controles (KATRIONA

et al., 1995); (IV) Yamakawa et al. (1998), sugeriram que proteínas Hsp60 podem

estar envolvidas na patogênese de inflamação intra-ocular, entre vários outros

estudos que suportam esta hipótese. No entanto, como veremos a seguir, nossos

resultados histológicos discordam destes relatos.

Então, partindo dos dados de anticorpos anti-Hsp65 e anti-Hsp60 obtidos até

então, decidimos analisar o que aconteceria com os níveis desses anticorpos sob

Discussão

83

condições de estresse provenientes de uma infecção com M. tuberculosis. Nestas

condições, tivemos o intuito de mimetizar a utilização da vacina em indivíduos

saudáveis que posteriormente entrariam em contato com o bacilo, fato que poderia

atuar como uma segunda estimulação após a “sensibilização” mediada pela vacina.

Em infecções, a habilidade das HSPs endógenas interagirem com uma ampla

variedade de arranjos peptídicos permite a elas se ligarem a peptídeos microbianos,

aumentando a imunogenicidade destes antígenos (ANDERSON et al., 2002; QIN et

al., 2003; WEITGASSER et al., 2003). Além disso, o aumento da produção e

secreção de HSPs próprias induzidas por uma infecção, associada a função

adjuvante e imunodominante das mesmas, facilita a indução de uma resposta imune

contra o patógeno invasor. Sob estas condições, as HSPs também podem participar

de um “feed back” positivo perpetuando a inflamação, ou seja, HSPs induzidas e

liberadas pela infecção podem ligar produtos microbianos e aumentar suas

atividades inflamatórias, levando a liberação de fatores pro-inflamatórios que irão

induzir a produção de mais HSPs, e assim, sucessivamente (Revisado por

Quintana, 2005). Este processo poderia conectar a infecção ao desenvolvimento de

um quadro auto-imune.

Além disso, todos os tipos de tecidos expressam altas concentrações de

HSPs endógenas em resposta a estímulos provenientes de estresse mecânico ou

químico. Agentes infecciosos podem agir contribuindo para a indução desse

estresse levando a liberação de Hsp60 solúvel (sHsp60) tanto proveniente do

patógeno quanto do hospedeiro (XU et al., 2000). Dentro disto, foi sugerido que a

etiopatogenia da Arterite de Takayasu, uma doença de origem auto-imune

(NITYANAND et al., 1997; SEKO et al., 2000); possivelmente seja induzida pela

infecção com M. tuberculosis (MORRISON et al., 1989; KOTHARI et al., 1995).

Neste contexto, CHAUHAN et al. (2004) mostraram a presença de células T reativas

à Hsp65 micobacteriana e Hsp60 humana tanto quanto a presença de anticorpos

específicos para as duas proteínas, sugerindo uma arterite auto-imune induzida pela

infecção, possivelmente pelo mimetismo molecular entre mHsp65 e hHsp60 ou

outros antígenos tecido específico. KOL et al., (1998), mostraram a existência de co-

localização entre Hsp60 clamidial e Hsp60 humana em lesões ateroscleróticas.

Com isto, o passo seguinte foi avaliarmos a produção de anticorpos anti-

Hsp65 e anti-Hsp60 em animais vacinados e posteriormente infectados, o que

revelou um perfil de produção semelhante, para os dois anticorpos (Figuras 5 e 6).

Discussão

84

No grupo de animais vacinados com DNA-hsp65 e desafiados, os níveis de

anticorpos apresentaram-se altos, entretanto, nos grupos controle (que receberam

DNAv ou PBS) os níveis desses anticorpos tiveram um súbito aumento apenas aos

70 dias após a infecção. Tal fato sugere que, possivelmente, o aumento das HSPs

oriundas do patógeno ou do próprio tecido lesionado pela infecção bacteriana, tenha

induzido um aumento nos títulos de anticorpos anti-HSPs. Assim, pode-se inferir,

que esta produção abrupta corresponda a anticorpos totais contra HSPs da

micobactéria, não sendo, porém, apenas anticorpos específicos para Hsp65, mas

sim anticorpos que reagem cruzadamente com a Hsp65 de M. leprae codificada pela

vacina.

Até aqui, descrevemos nossas análises da resposta humoral onde tentamos

detectar a presença de auto-anticorpos induzidos pela vacina. Em resumo,

observarmos nos dois protocolos analisados, que a mesma induziu a produção de

anticorpos anti-Hsp65 e um discreto, porém significativo, aumento de anti-hHsp60.

Em razão destes resultados e de indícios na literatura correlacionando tais

anticorpos em quadros inflamatórios e auto-imunes, é razoável pensar que os

mesmos poderiam implicar no desenvolvimento de alguma auto-agressão tecidual.

Sendo assim, partimos para uma ampla avaliação histopatológica no sentido de

avaliarmos se estes anticorpos poderiam, ou não, estar associados ao

desenvolvimento de alterações em diferentes órgãos.

Foram analisados 18 órgãos dentre os quais, em sua maioria, apresentam

históricos de envolvimento com doenças de fundo auto-imune, como: pâncreas

(diabetes), tireóide (tireoidite de Hashimoto), articulação (artrite), cérebro (esclerose

múltipla), pele (psoriase), coração (miocardite e aterosclerose), rim

(glomérulonefrite), olho (uveite), adrenal (doença de Addison), intestino (doença de

Crohn), fígado (hepatite), linfonodos (linfoma), assim como o músculo (miastenia),

importante também, por ser o local onde a vacina foi administrada, entre outros

órgãos. Estudos têm mostrado o envolvimento de HSPs na indução de muitas

dessas doenças. Ademais, como foi descrito na introdução, a possibilidade de

reatividade imune cruzada não se restringe apenas as HSPs, mas também a vários

outros auto-antígenos órgão específicos que apresentam similaridades com estas

proteínas (JONES et al., 1993).

Tais possibilidades justificam nosso propósito em fazer um estudo histológico

abrangente na tentativa de elucidar nossa dúvida e também da comunidade

Discussão

85

científica, sobre a hipótese de que esta vacina, que apresenta um grande potencial

para ser usada em humanos, possa desencadear efeitos colaterais indesejáveis.

Segundo a análise cega das amostras, realizada pelos patologistas Dr.

Edson G. Soares (FMRP-USP) e Dr. Luiz Benvenuti (InCor), não foi identificada

nenhuma alteração que indicasse processo auto-imune. As alterações que foram

descritas em alguns cortes (Anexo) foram provavelmente, causadas por traumas na

manipulação, infecção ambiental não correlacionada (sem significância patológica)

ou agressão química no momento do sacrifício (cuba com éter) no caso dos

pulmões. Os casos de infiltrado celular observado em alguns cortes apresentaram-

se raros, mínimos e focais, não apresentando nenhum potencial de significância

patológica. Vale ressaltar que as alterações apresentadas foram observadas

independentemente de grupo ou tempo analisado, o que ressalta a hipótese de que

tais alterações não foram induzidas pela imunização.

Para o Protocolo B, vale as mesmas observações do Protocolo A, com

exceção do alto comprometimento pulmonar em decorrência da infecção.

Sendo assim, analisando os animais que foram imunizados com a vacina,

infectados ou não, os quais mostraram altos títulos de anticorpos anti-Hsp65 e

presença de anticorpos anti-Hsp60, fica claro que estes anticorpos não estão

envolvidos em nenhum processo inflamatório que possa caracterizar uma reação

auto-imune, e principalmente, que a vacina DNA-hsp65 não e capaz de induzir o

desenvolvimento de auto-agressão tecidual.

Com isso, o fato da vacina DNA-hsp65 ter induzido anticorpos anti esta

proteína, não indica diretamente que os mesmos poderão reagir com proteínas

endógenas desencadeando mecanismos auto-imunes. Provavelmente, a ação de

células com perfil regulatório sobrepõem-se sobre a ação de clones potencialmente

auto-reativos impedindo que causem alterações. Isto possivelmente reflete os

resultados histológicos apresentados neste trabalho.

Estes resultados corroboram com dados obtidos pelo grupo em estudos com

essa vacina em modelos experimentais de auto-imunidade como Encéfalomielite

Auto-Imune, onde foi observado que esta vacina não induziu o agravamento da

doença induzida com injeção de Proteína Básica Mielínica (PBM) em Adjuvante

Completo de Freund (ACF) (trabalho em desenvolvimento). Modelos experimentais

de Artrite induzida por pristane em camundongos geneticamente pré-dispostos a

mínima e máxima Reação Inflamatória Aguda (AIR-min e AIR-max,

Discussão

86

respectivamente), demonstraram que animais que receberam a vacina DNA-hsp65

apresentaram significativamente menores níveis de IL-6 e IL-12 e maiores de IL-10

resultando em uma ação protetora contra a doença (SANTOS et al., 2005). Em

outro estudo, foi demonstrado que a vacina não teve nenhum efeito diabetogênico,

mas pelo contrário, protegeu camundongos NOD contra o desenvolvimento de

diabete severa. Neste estudo, efeito protetor da vacina foi acompanhado por

imunomodulação órgão específico, caracterizado pela diminuição do influxo de

células CD4+ e CD8+, assim como aumento da marcação para as citocinas TGF-� e

IL-10 nas ilhotas pancreáticas (SANTOS JUNIOR, artigo submetido). Além disso, a

vacina de DNA-hsp65 também conferiu proteção em modelo experimental de diabete

induzida por STZ. Neste estudo foi observada a ativação de células reguladoras,

caracterizadas pelos marcadores CD25hiCD103+ e CD25hiCTLA-4+, além do

aumento significativo nos níveis de IL-10 produzidos por células do baço de animais

vacinados (SANTOS JUNIOR, em redação). Ademais, em ensaios clínicos de fase I

com esta vacina, não foi detectado nenhum efeito tóxico da mesma, em 21 pacientes

terminais com câncer epidermóide de cabeça e pescoço (MICHALUART et al., artigo

em redação).

Alguns relatos podem ajudar a entender um pouco mais estas idéias. Foi

mostrado que Hsp65 micobacteriana expressa epítopos com diferentes funções

imunes. A reação cruzada de seu epítopo 180-188 com auto-antígenos da

cartilagem pode induzir resposta artritogênica. Por outro lado, a reação cruzada com

Hsp60 endógena pode induzir a regulação da doença. (Revisado por QUINTANA &

COHEN, 2005). Talvez uma explicação para isto, seria que HSPs microbianas,

provenientes da flora intestinal, poderiam servir como uma fonte de células T

regulatórias HSP-específicas. De fato, MOUDGIL et al., (2001) demonstraram que

micróbios ambientais podem induzir células T regulatórias Hsp65-específicas que

reagem cruzado com epítopos regulatórios da Hsp60 endógena, o que seria este,

um modelo de regulação naturalmente adquirido.

Ensaio clínico com peptídeo p277 de Hsp60 tem sido testado em pacientes

com diabetes tipo I e os resultados tem indicado que células T peptídeo específicas

trocaram sua produção de citocinas pró-iflamatórias para produção de citocinas

antinflamatórias tais como IL-4 e IL-10 (RAZ et al., 2001).

Este envolvimento das HSPs em mecanismos imunorregulatórios vem sendo

amplamente estudados e talvez possam esclarecer melhor estes relatos em um

Discussão

87

futuro próximo. De fato, os objetivos de recentes projetos em nosso laboratório, são

de tentar elucidar os mecanismos pelos quais a Hsp65 de M. leprae apresenta para

provocar efeitos de ativação e regulação da resposta imune, bem como efeitos

protetores e profiláticos na tuberculose.

Portanto, os resultados obtidos neste trabalho refletem uma análise

abrangente de uma possível indução de auto-agressão tecidual decorrente da

vacinação com DNA-hsp65. Esta abordagem foi realizada sob uma cuidadosa

análise histopatológica realizada por longos períodos de tempo, onde não foi

constatada nenhuma alteração induzida pela vacina. No entanto, futuramente,

nossos dados poderão ser complementados com avaliações da resposta imune

celular como, por exemplo, detecção de células T específicas a Hsp65, produção de

citocinas, atuação de células T regulatórias envolvidas neste processo de vacinação,

entre outras. No entanto, os resultados deste estudo contribuem de forma

significativa ao esclarecimento sobre a biossegurança da utilização da vacina DNA-

hsp65, abrindo perspectivas para seu uso clínico na profilaxia e tratamento de

pacientes com tuberculose e outras enfermidades.

88

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Conclusões

89

7 – CONCLUSÕES

Os resultados apresentados neste trabalho mostraram que:

1) A vacina DNA-hsp65 não foi capaz de induzir a produção de anticorpos anti-

DNA;

2) Camundongos apenas vacinados ou vacinados e infectados apresentaram um

discreto, porém significativo aumento de anticorpos IgG total anti-Hsp60;

3) Camundongos apenas vacinados ou vacinados e infectados apresentaram

altos níveis de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65;

4) Não foi observada nenhuma alteração tecidual sugestiva de quadro auto-

imune induzida pela vacina.

90

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Referências Bibliográficas

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103

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YAMADA, H.I., GURSEL, F. TAKESHITA, J. CONOVER, K.J. ISHII, M. GURSEL, S.

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104

��

Anexo

105

9 – ANEXO

� Leituras histológicas:

Descrição das leituras histológicas realizadas pelos patologistas Dr. Édson

Soares (FMRP) e Dr. Luiz Benvenuti (InCor). As lâminas que apresentaram leituras

diferentes foram reavaliadas, no sentido de se definir um consenso entre as duas

análises.

As nomenclaturas a seguir referem-se aos seguintes itens:

A ou B - protocolo analisado;

PBS, VET ou VAC - grupo experimental;

T1, T2 ou T3 - tempo de sacrifício;

1 a 9 - número do animal avaliado (em um n total de 9 animais).

NA - animais em que as amostras de órgãos não apresentaram alterações

Sendo assim, B-VAC-T2-7 refere-se ao sétimo animal analisado, que foi

submetido ao protocolo B (vacinado e infectado), recebeu DNA-hsp65 (pVAX-hsp65)

nas imunizações e foi sacrificado no tempo 2 (70 dias após a infecção).

Anexo

106

Leituras Histológicas Protocolo A FMRP InCor

Tempo 1 A-PBS-T1-1: *Pulmão: Focos casuais de infiltrado linfocítico peribronquial.

A-PBS-T1-1: NA.

A-PBS-T1-2: NA. A-PBS-T1-2: NA. A-PBS-T1-3: *Pulmão: Discreta congestão -Pequenos focos de infiltrado linfocitário

-Alguns macrófagos situados no parênquima pulmonar e em regiões peribronquiais. *Intestinos degradados em decorrência de uma má fixação.

A-PBS-T1-3: NA.

A-PBS-T1-4: NA. A-PBS-T1-4: NA. A-PBS-T1-5: NA. A-PBS-T1-5: NA. A-PBS-T1-6: *Pulmão: -Raríssimos linfócitos peribronquiais - Discreta congestão com focos hemorrágicos *Intestinos delgado e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado).

A-PBS-T1-6: NA.

A-PBS-T1-7: *Fígado: Presença de um foco de infiltrado inflamatório mononuclear.

A-PBS-T1-7: *Fígado: Mínimo e focal infiltrado inflamatório mononuclear.

A-PBS-T1-8: NA. A-PBS-T1-8: NA. A-PBS-T1-9: NA. A-PBS-T1-9: NA.

Tempo 2 A-PBS-T2-1: NA. A-PBS-T2-1: NA. A-PBS-T2-2: *Articulação: Mínimo foco de sinovite. A-PBS-T2-2: *Articulação: Sinovite crônica focal. A-PBS-T2-3: *Pulmão: - Focos de infiltrado linfocítico com alguns macrófagos. - Formou-se um granuloma tipo “corpo estranho” em algo que o camundongo aspirou (parecendo fibra vegetal).

A-PBS-T2-3: *Pulmão: Reação gigantecelular a corpo estranho focal.

PBS

A-PBS-T2-4: *Pulmão: - Discretos focos de infiltrado linfocítico (mínimos focos no parênquima) -Esparsos focos hemorrágicos.

A-PBS-T2-4: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.

Anexo

107

A-PBS-T2-5: *Pulmão: Congestão e focos hemorrágicos discretos e difusos. *Fígado: Um foco hemorrágico (provavelmente traumático).

A-PBS-T2-5: NA.

A-PBS-T2-6: *Pulmão: Apresentou apenas uma discreta congestão. *Intestinos delg. e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado)

A-PBS-T2-6: NA.

A-PBS-T2-7: *Pulmão: - Raros focos inflamatórios linfocitários perivasculares (infecção inespecífica, porem lesão não importante).

A-PBS-T2-7: NA.

A-PBS-T2-8: NA. A-PBS-T2-8: NA. A-PBS-T2-9: *Pulmão: Raros focos linfocíticos perivasculares. A-PBS-T2-9: *Pulmão: Focos de hemorragia recente alveolar.

Tempo 3 A-PBS-T3-1: *Pulmão: - Discretos focos de hemorragia e congestão A-PBS-T3-1: NA. A-PBS-T3-2: *Pulmão: - Importante congestão e hemorragia - Poucos focos linfocitários

A-PBS-T3-2: NA.

A-PBS-T3-3: *Músculo: Discreto foco de infiltrado linfóide. A-PBS-T3-3: *Músculo: Discreto infiltrado perivascular focal A-PBS-T3-4: *Fígado com pouca congestão. A-PBS-T3-4: NA. A-PBS-T3-5: *Pulmão: - Congestão e hemorragia. Infiltrados perivasculares com macrófagos e predomínio de linfócitos (discretos e raros). Presença de um gigantócito em um dos focos inflamatórios. Presença de alguns bacilos (infecção discreta), que apresentaram negatividade para pesquisa de BAAR (provavelmente infecção ambiental não correlacionada). *Fígado: Congestão e um foco hemorrágico (mínimo).

A-PBS-T3-5: *Pulmão: Presença de focos hemorrágicos alveoloares.

A-PBS-T3-6: NA. A-PBS-T3-6: NA. A-PBS-T3-7: *Pulmão: Focos linfoplasmocitário. Infiltrados plasmocitários focais (provavelmente infecção não relacionada)

A-PBS-T3-7: NA.

A-PBS-T3-8: *Pulmão: Focos linfocitários. A-PBS-T3-8: NA.

PBS

A-PBS-T3-9: *Pulmão: Mínimos focos linfocitários. A-PBS-T3-9: NA. Tempo 1

A-VET-T1-1: NA. A-VET-T1-1: NA. A-VET-T1-2: NA. A-VET-T1-2:*Intestino delgado: Hiperplasia linfóide reacional.

Vetor A-VET-T1-3: NA. A-VET-T1-3: NA.

Anexo

108

A-VET-T1-4: *Pulmão: Infiltrado linfocítico com alguns plasmócitos e raros neutrófilos na região perivascular e peribronquiolar alargando-se entre os septos interalveoláres.

A-VET-T1-4: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.

A-VET-T1-5: *Pulmão: Discretos alargamentos septais acompanhados de congestão e infiltrado mononuclear com poucos neutrófilos.

A-VET-T1-5: NA.

A-VET-T1-6: *Pulmão: -Mínimo infiltrado perivascular e peribronquial - Raros focos hemorrágicos e congestão.

A-VET-T1-6: NA.

A-VET-T1-7: Músculo esquelético: Calcificação focal mínima. A-VET-T1-7: *Músculo esquelético: Focos de calcificação. A-VET-T1-8: *Pulmão: Congestão difusa, - Focos de hemorragia, - Focos de infiltrado inflamatório crônico, predominantemente linfocitário perivascular.

A-VET-T1-8: NA.

Tempo 2 A-VET-T2-1: *Pulmão: - Congestão discreta -Focos inflamatórios peribronquiais e perivasculares discretos com presença de linfócitos e macrófagos.

A-VET-T2-1: NA.

A-VET-T2-2: NA. A-VET-T2-2: NA. A-VET-T2-3: Pulmão: Mínimo infiltrado mononuclear perivascular.

A-VET-T2-3: *Pâncreas: Infiltrado focal sem sinal de agressão. *Fígado: +/- 3 focos com células mononucleares (não parece inflamação). * Pulmão: Infiltrado peribronquiolar, focos discretos, - esboço granulomatoso (não patológico). *Cérebro: Áreas de concentração neoronal (provavelmente devido a esquemia).

A-VET-T2-4: *Pulmão: -Focos de hemorragia e congestão. -Discretos focos de infiltrado linfóide.

A-VET-T2-4: NA.

A-VET-T2-5: *Pulmão: -Congestão com alguns focos hemorrágicos. - Discretos focos linfocitários.

A-VET-T2-5: NA.

A-VET-T2-6: *Pulmão: Apenas congesto. A-VET-T2-6: NA.

Vetor

A-VET-T2-7: NA. A-VET-T2-7: NA.

Anexo

109

A-VET-T2-8: *Coração: Focos de calcificação pericárdica. A-VET-T2-8: *Coração: Focos de calcificação do epicárdio (relacionado ao ventrículo direito).

A-VET-T2-9: *Pulmão: Raros focos linfocíticos peribrônquiais. A-VET-T2-9: *Pulmão: Discreta hiperplasia do tecido linfóide peribrônquico.

Tempo 3 A-VET-T3-1: *Pulmão: Raros e grandes focos hemorrágicos A-VET-T3-1: NA. A-VET-T3-2: *Pulmão: Pequenos focos hemorágicos e congestão - Discretos focos de infiltrado linfóide nas regiões perenquimatosa, perivascular e peribronquiolar.

A-VET-T3-2: * Pulmão: Discretos focos de infiltrado peribronquiolar.

A-VET-T3-3: *Pulmão: Hemorragia focal e mínimos focos de infiltrado linfóide.

A-VET-T3-3: NA.

A-VET-T3-4: NA. A-VET-T3-4: NA. A-VET-T3-5: *Pulmão: Foco hemorrágico (traumático). A-VET-T3-5: NA. A-VET-T3-6: NA. A-VET-T3-6: NA. A-VET-T3-7: NA. A-VET-T3-7: NA. A-VET-T3-8: NA. A-VET-T3-8: NA.

A-VET-T3-9: *Pulmão: Foco hemorrágico (provavelmente devido à manipulação) e um foco linfocitário.

A-VET-T3-9: *Pulmão: Discreto foco de hemorragia alveolar.

Tempo 1 A-VAC-T1-1: NA. A-VAC-T1-1: NA.

A-VAC-T1-2: *Pulmão: Discreto infiltrado linfocítico peribronquial acompanhado de poucos macrófagos e raros neutrófilos. *Intestinos delgado e grosso: sofreram autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado).

A-VAC-T1-2: NA.

A-VAC-T1-3: *Pulmão: Grande área hemorrágica com congestão. A-VAC-T1-3: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar. A-VAC-T1-4: *Pulmão: Congestão discreta e poucos linfócitos peribronquiais e perivasculares.

A-VAC-T1-4: NA.

Vacina

A-VAC-T1-5: *Pulmão: Discreto infiltrado linfocítico peribronquial e perivascular Apenas um foco hemorrágico.

A-VAC-T1-5: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.

Vetor

Anexo

110

A-VAC-T1-6: *Pulmão: Infiltrado linfocítico perivascular e peribronquial (predominantemente) com alguns macrófagos. - Hemorragia e congestão. *Intestino delgado: sofreu autólise (provavelmente por terem boiado e não fixado)

A-VAC-T1-6: *Pulmão: Áreas focais de hemorragia alveolar.

A-VAC-T1-7: NA. A-VAC-T1-7: NA.

A-VAC-T1-8: *Pulmão: Vários focos de infiltrado linfocítico perivascular.

A-VAC-T1-8: NA.

A-VAC-T1-9: NA. A-VAC-T1-9: NA.

Tempo 2 A-VAC-T2-1: *Pulmão: Infiltrado mononuclear discreto - Congestão pulmonar discreta - Presença de linfócitos na região peribronquial e perivascular.

A-VAC-T2-1: NA.

A-VAC-T2-2: NA. A-VAC-T2-2: NA. A-VAC-T2-3: *Pulmão: Discretos focos peribronquiais (principalmente) de infiltrado constituído principalmente de linfócitos com alguns macrófagos - Congestão. *Fígado: Dois focos (mínimos) de infiltrado linfocítico no parênquima hepático. *Rim: Um foco de infiltrado linfocítico na transição córtico-medular.

A-VAC-T2-3: NA.

A-VAC-T2-4: *Pulmão: Congestão -Mínimos focos de infiltrado linfocítico peribronquiais.

A-VAC-T2-4: NA.

A-VAC-T2-5: *Pulmão: Congestão importante com focos de hemorragia vascular. -Discreto infiltrado linfocítico peribronquial.

A-VAC-T2-5: *Cérebro: Células. piquinóticas com arcos de contração

A-VAC-T2-6: NA. A-VAC-T2-6: NA. A-VAC-T2-7: *Pulmão: Focos linfocíticos perivasculares (raros). A-VAC-T2-7: NA. A-VAC-T2-8: *Pulmão: Pouco congesto

A-VAC-T2-8: NA.

Vacina

A-VAC-T2-9: NA.

A-VAC-T2-9: NA.

Anexo

111

Tempo 3 A-VAC-T3-1: * Pulmão: Reação linfocitária e macrofágica mínima. - Congestão e focos hemorrágicos.

A-VAC-T3-1: NA.

A-VAC-T3-2: *Pulmão: Infiltrado mononuclear e linfocítico discreto. - Presença de congestão, com focos hemorrágicos.

A-VAC-T3-2: NA.

A-VAC-T3-3: NA. A-VAC-T3-3: NA. A-VAC-T3-4: NA. A-VAC-T3-4: NA. A-VAC-T3-5: NA. A-VAC-T3-5: NA. A-VAC-T3-6: *Pulmão: Pequenos focos hemorrágicos e 2 focos de infiltrado linfocítico.

A-VAC-T3-6: NA.

A-VAC-T3-7: *Pulmão: Focos linfóides isolados. A-VAC-T3-7: NA. A-VAC-T3-8: NA. A-VAC-T3-8: NA.

A-VAC-T3-9: *Músculo esquelético: Foco linfocitário com presença de neutrófilos e linfócitos (provável local da injeção).

A-VAC-T3-9: *Músculo esquelético: Miosite focal.

Protocolo B Tempo 1 B-PBS-T1-1: *Fígado: Infiltrado linfocitário mínimo (apenas um foco).

B-PBS-T1-1: NA.

B-PBS-T1-2: NA. B-PBS-T1-2: NA. B-PBS-T1-3: NA. B-PBS-T1-3: NA. B-PBS-T1-4: NA. B-PBS-T1-4: NA. B-PBS-T1-5: NA. B-PBS-T1-5: *Rim: Microcalcificação focal no córtex. B-PBS-T1-6: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância).

B-PBS-T1-6: *Fígado: Raros focos de infiltrado inflamatório misto.

B-PBS-T1-7: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).

B-PBS-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.

B-PBS-T1-8: NA.

B-PBS-T1-8: NA.

PBS

B-PBS-T1-9: NA.

B-PBS-T1-9: NA.

Vacina

Anexo

112

Tempo 2 B-PBS-T2-1: *Fígado: Processo inflamatório linfocitário perivascular discreto (raros focos). * Intestino delg. com restos alimentares

B-PBS-T2-1: NA.

B-PBS-T2-2: *Fígado: Raríssimos focos de infiltrado linfocítico perivascular .

B-PBS-T2-2: NA.

B-PBS-T2-3: *Fígado: Congestão, raros e discretos focos de infiltrado linfocítico perenquiatoso com alguns perivasculares.

B-PBS-T2-3: NA.

B-PBS-T2-4: *Fígado: Mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).


B-PBS-T2-5: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).


B-PBS-T2-6: NA. B-PBS-T2-6: NA. B-PBS-T2-7: NA. B-PBS-T2-7: NA. B-PBS-T2-8: NA. B-PBS-T2-8: NA.

B-PBS-T2-9: NA. B-PBS-T2-9: NA.

Tempo 1 B-VET-T1-1: NA. B-VET-T1-1: NA. B-VET-T1-2: NA. B-VET-T1-2: NA. B-VET-T1-3: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).

B-VET-T1-3: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto. *Coração: Microcalcificações focais no epicárdio.

B-VET-T1-4: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica). *Músculo esquelético: Infiltrado inflamatório linfocítico e macrofágico.

B-VET-T1-4: *Fígado: Focos de infiltrado inflamatório misto com esboço granulomatoso focal. *Músculo esquelético: Processo inflamatório misto com necrose de fibras (miosite).

B-VET-T1-5: NA. B-VET-T1-5: NA. B-VET-T1-6: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).

B-VET-T1-6: *Fígado: Focos de necrose e acumulo de células inflamatórias. *Músculo esquelético: Pequeno foco de processo inflamatório (miosite).

Vetor

B-VET-T1-7: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).

B-VET-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.

PBS

Anexo

113

B-VET-T1-8: NA. B-VET-T1-8: NA. B-VET-T1-9: *Fígado: Raros e mínimos focos de infiltrado (sem significância patológica).


Tempo 2 B-VET-T2-1: NA. B-VET-T2-1: NA. B-VET-T2-2: *Fígado: Infiltrado e focos perivasculares e periquimatosos discretos.

B-VET-T2-2: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto.

B-VET-T2-3: NA. B-VET-T2-3: NA. B-VET-T2-4: * Fígado: Mínimos focos linfóides perivasculares (sem significância patológica).


B-VET-T2-5: *Fígado: Raros agrupamentos linfocitários (sem significância patológica).


B-VET-T2-6: NA. B-VET-T2-6: NA. B-VET-T2-7: *Fígado: Raros focos linfocíticos (sem significância patológica).


B-VET-T2-8: NA. B-VET-T2-8: NA.

Vetor

B-VET-T2-9: NA. B-VET-T2-9: NA. Tempo 1

B-VAC-T1-1: NA. B-VAC-T1-1: NA. B-VAC-T1-2: NA B-VAC-T1-2: NA. B-VAC-T1-3: NA. B-VAC-T1-3: NA. B-VAC-T1-4: NA. B-VAC-T1-4: NA. B-VAC-T1-5: NA. B-VAC-T1-5: *Músculo esquelético: Pequenos focos de processo

inflamatório crônico (miosite). *Articulação: Pequeno processo inflamatório focal no sítio periarticular.

B-VAC-T1-6: *Músculo esquelético: Mínimos focos inflamatórios.

B-VAC-T1-6: *Músculo esquelético: Focos de processo inflamatório misto (miosite).

B-VAC-T1-7: *Fígado: Focos de infiltrado linfocítico nos espaços porta e parênquima. (foi feito o Zihel Nielsen da lâmina que deu negativo para pesquisa de BAAR).

B-VAC-T1-7: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.

Vacina

B-VAC-T1-8: NA. B-VAC-T1-8: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.

Anexo

114

B-VAC-T1-9: NA. B-VAC-T1-9: NA. Tempo 2

B-VAC-T2-1: NA. B-VAC-T2-1: NA. B-VAC-T2-2: *Fígado: Mínimos infiltrados. *Baço: Esplenite aguda focal leve.

B-VAC-T2-2: *Fígado: Raros e pequenos focos de infiltrado inflamatório misto. *Baço: Esplenite aguda focal.

B-VAC-T2-3: *Articulação: Medula óssea com infiltrado neutrofílico mínimo (sem significância patológica).

B-VAC-T2-3: * Fígado: Focos de infiltrado inflamatório mononuclear com esboço granulomatoso.

B-VAC-T2-4: *Fígado: Raros focos linfocitários portais sem significância.

B-VAC-T2-4: NA.

B-VAC-T2-5: NA. B-VAC-T2-5: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório. B-VAC-T2-6: *Músculo esquelético: Foco neutrofílico e linfocitário entre as fibras musculares (provável local da punção).

B-VAC-T2-6: *Músculo esquelético: Pequeno foco de processo inflamatório misto (miosite).

B-VAC-T2-7: NA. B-VAC-T2-7: NA. B-VAC-T2-8: NA. B-VAC-T2-8: *Fígado: Pequenos focos de infiltrado inflamatório.

B-VAC-T2-9: NA. B-VAC-T2-9: NA.

Vacina

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