Avaliação da toxicidade aguda pré-clínica do extrato ... ?· permite a avaliação da toxicidade…

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  • 73 VOL. 46(1) 2016: 73 - 80

    http://dx.doi.org/10.1590/1809-4392201501746

    ACTAAMAZONICA

    Avaliao da toxicidade aguda pr-clnica do extrato metanlico das cascas do caule de Parahancornia amapa (Apocynaceae)Simoni Lobato da SILVA1*, Alessandra Azevedo do NASCIMENTO1, Edson Fbio Brito RIBEIRO1, Renata Barbosa RIBEIRO1, Cleiziane Melo ALVES1 , Andr Mendona dos SANTOS1, Aurlio Pinheiro Rodrigues BURMANN2 , Raimundo de Almeida MIRA NETO1

    1 Universidade Federal do Amap, Laboratrio de Experimentao Animal, Campus Universitrio Marco Zero do Equador, Rodovia Juscelino Kubitschek, KM-02, Jardim Marco Zero, CEP 68.903-419, Macap, AP, Brasil.

    2 Laboratrio Central de Sade Pblica do Amap, Rua Tancredo Neves, 1118, So Lzaro, 68908-530, Macap, AP, Brasil

    * Autor correspondente: simone2010_ls@hotmail.com

    RESUMOParahancornia amapa uma espcie endmica do Estado do Amap, na regio Amaznica. Este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda do extrato metanlico das cascas do caule de P. amapa. Diferentes concentraes do extrato foram adicionadas aos camares de salmoura (Artemia salina) e a concentrao letal mdia (CL50) foi avaliada. Os resultados desse ensaio indicaram que o extrato no era txico. A toxicidade aguda foi estudada em ratos Wistar (machos e fmeas) aps dose nica (2000 mg kg-1) por gavagem. Ingesto de gua e comida, peso corporal, alteraes comportamentais e mortalidade foram anotados. Amostras de sangue foram coletadas para medies de parmetros hematolgicos e bioqumicos. Os animais foram eutanasiados e seus rgos (corao, rins, fgado e pulmes) submetidos anlise macroscpica e histopatolgica. No houve mortalidade ou qualquer sinal de mudana de comportamento ou toxicidade observada aps a administrao oral do extrato. No entanto, observou-se um aumento significativo (p

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    Avaliao da toxicidade aguda pr-clnica do extrato metanlico das cascas do caule de Parahancornia amapa (Apocynaceae)

    ACTAAMAZONICA

    MATERIAL E MTODOSO estudo foi aprovado pelo Comit de tica em

    Experimentao Animal da Universidade Federal do Amap (CEP/UNIFAP), com o nmero 006A/2011 de acordo com o que preconiza a Resoluo de n 196/96 do Conselho Nacional de Sade e suas complementares.

    Coleta do material botnicoAs cascas do caule de Parahancornia amapa (Huber)

    Ducke (Apocynaceae), conhecida como amapazeiro, foram coletadas no municpio de Macap, Estado do Amap, Brasil, em novembro de 2011, durante o perodo de estiagem. Uma exsicata foi depositada no herbrio do Instituto de Pesquisa do Estado do Amap para fins de referncia sob o nmero de registro HAMAB-18350.

    Preparao do extrato metanlico das cascas do caule de P. amapa (EMPA)

    Para a obteno do EMPA as cascas do caule foram desidratadas em estufa de ar circulante (Mod. 330, FANEM, Carandiru, SP, BR) a uma temperatura de 45 C e posteriormente trituradas em moinho de facas (tipo WILLEY) at a pulverizao (1000 g). Em seguida, foi realizada a macerao do p em metanol por um perodo de 10 dias. A soluo extrativa foi filtrada sob vcuo e o concentrado foi obtido em rotavapor (Vinatoru 2001; Ferri 1996) sob presso reduzida a 78 rpm a uma temperatura mxima de 60 C, obtendo-se 190 g (19% de rendimento) de uma pasta de colorao marrom-avermelhada.

    AnimaisNo ensaio preliminar de toxicidade, foram utilizadas larvas

    de Artemia salina L., um microcrustceo da classe Anostracea, (Brine Shrimp Test), na forma de metanuplio, utilizando-se a Concentrao Letal Mdia (CL50) como parmetro de avaliao da atividade biolgica (Lopes et al. 2002). Para o ensaio de toxidade aguda pr-clnica foram utilizados ratos machos e fmeas Wistar (Rattus norvegicus), pesando entre 150 e 250 g, todos provenientes do Biotrio do Laboratrio de Central de Sade Pblica do Estado do Amap (LACEN-AP). Os animais foram aclimatados s condies do biotrio local por sete dias antes dos ensaios experimentais, sob temperatura de 232 C e ciclos de claro e escuro de 12 horas, sendo alimentados com rao para animais de laboratrio (PurinaNuvilab CR-1 autoclavvel; Nuvital, SP, Brasil) e com gua ad libitum.

    Bioensaio com Artemia salina L. (Brine Shrimp Test)

    Para este teste, cerca 25 mg de cistos de A. salina L. foram incubados em um recipiente que possui dois compartimentos separados por uma parede vazada, contendo gua do mar

    INTRODUOA espcie Parahancornia amapa (Huber) Ducke

    (Apocynaceae) uma planta frutfera endmica do Estado do Amap distribuda no planalto e florestas inundadas da Regio Amaznica. rvore de grande porte, com 40 a 50 metros de altura, seus frutos so grandes e comestveis servindo de alimentos aos macacos que vivem nas copas das rvores (Morais et al. 1995). Parahancornia amapa conhecida popularmente como amapa, amapazeiro ou map, possui um ltex denominado de leite de amapa empregado pelas comunidades locais para o tratamento de feridas e hematomas na forma de emplastro (cataplasma ou compressa), consumido tambm como bebida misturada ao mel de abelha em partes iguais, para o tratamento da asma, bronquites e fraqueza fsica. Tanto suas cascas como seu ltex so conhecidos ainda pelos nativos como tnico e anti-sfilis (Berg 1982). O Parahancornia amapa, tambm, possui propriedade analgsica e anti-inflamatria, potencial cicatrizante alm de ser utilizado em afeces do trato digestrio (Monteles e Pinheiro 2007).

    Estudos fitoqumicos desta espcie relatam a presena de vrios compostos nas razes, ltex, cascas. Sendo que, das razes de P. amapa foram isolados e identificados steres 3--O-acil lupeis, os esterides -sitosterol, stigmasterol e -sitosterona e os triterpenos -amirina, -amirina, lupeol e seus derivados acetilados (Carvalho et al. 2001). Do ltex de P. amapa as fraes obtidas com hexano e diclorometano forneceram misturas de 3-O-acillupeol e triterpenos, confirmando resultados de estudos j realizados. No extrato metanlico identificou-se grande quantidade de carboidratos, metilmioinositol e derivados de feniletanides tendo como principal constituinte o cornosdeo (Carvalho et al. 2008). Dos extratos diclorometano da casca e do ltex de um espcime de P.amapa foram isoladas e identificadas substncias como os triterpenos pentacclicos lupeol, -amirina e -amirina, seus derivados acetilados, cidos alifticos e outros steres 3-O-acil-lupeol (Sobrinho et al. 1991).

    Alm dos estudos fitoqumicos relatados anteriormente, verifica-se que do extrato diclorometnico dos galhos foram isolados o -sitosterol, estigmasterol, alm de triterpenides pentacclicos, -amirina, -amirina, lupeol e friedelina e do extrato metanlico das cascas foi isolado o alcaloide indlico isositsiriquina (Henrique et al. 2014). importante destacar, tambm, que o P. amapa apresentou bioatividade da frao metanlica do ltex sobre o desenvolvimento de Rhodnius nasutus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) em condies de laboratrio, sendo tais efeitos, na sua maioria txicos (Lopes et al. 2014).

    Diante do exposto e visando garantir a segurana do uso da espcie, esse estudo objetiva avaliar o efeito toxicolgico agudo do extrato bruto metanlico do Parahancornia amapa (EMPA) em modelo animal.

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    foram submetidos retirada de material biolgico (sangue), eutanasiados e necropsiados.

    Exames Laboratoriais

    No 14 dia foram retiradas amostras de sangue atravs de puno intracardica para anlise laboratorial de variveis hematolgicas e bioqumicas. Em seguida, os rgos foram retirados, analisados macroscopicamente, buscando-se possveis alteraes na estrutura, rigidez ou colorao das superfcies e, posteriormente, pesados. Como no foram identificadas alteraes macroscpicas, 30% dos rgos foram encaminhados para o exame histopatolgico para avaliao da integridade tecidual dos seguintes rgos extirpados: fgado, pulmes, corao e rins. As principais variveis investigadas foram: leses celulares reversveis (degeneraes) e irreversveis (necrose e apoptose), infiltrao de leuccitos, congesto, extravasamento de sangue e fibrose; de acordo com o protocolo da RES/ANVISA n 90 (Brasil 2004).

    Anlise estatstica

    No bioensaio frente A. salina, para obteno dos valores de CL50 foi utilizada a anlise PROBIT, atravs do software Microcal Origin, adotando-se um Intervalo de Confiana (IC) de 95%. No estudo de toxicidade aguda os resultados numricos foram expressos na forma de mdia desvio padro da mdia. Os valores obtidos e as diferenas estatsticas entre os grupos experimentais foram detectadas quando submetidos anlise de varincia de uma via (one-way ANOVA) seguida do teste de Tukey-Kramer quando o nmero de grupos era maior que 2. No caso da anlise entre grupos de ratos (machos e fmeas) tratados e no tradados com o EMPA, recorreu-se ao teste t de Student no pareado (unpaired t test). Para tal, considerou-se, a princpio, a hiptese nula de que todas as amostras seriam estatisticamente semelhantes, adotando-se IC de 95%, com nvel de significncia estatstica (p) menor que 5% (p

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    aparente fora dos parmetros comportamentais analisados, nos intervalos estabelecidos, quando comparados aos obtidos com o grupo controle (salina). No ocorreu morte seguida administrao, tambm no ocorreu morte durante o perodo de anlise (14 dias). Portanto, as observaes no mostraram sinais de toxicidade como perda de massa corporal, inibio do crescimento, alteraes comportamentais e clnicas graves quando comparado aos grupos controle. Sendo assim, no houve clculo da DL50.

    Em relao evoluo ponderal, a anlise no mostrou diferena significativa entre os grupos controle (salina) e EMPA (p>0,05, ANOVA seguido do teste de Tukey-Kramer), sendo que os dois ganharam peso relativo ao longo das duas semanas de observao. Percebeu-se ligeira reduo de ganho de massa na primeira semana nos animais que receberam EMPA, quando comparadas ao grupo controle (salina). No entanto, essa reduo foi revertida ao trmino do experimento (14 dias). Aps esse perodo, houve ganho de massa em todos os grupos e no houve diferenas significativas entre as massas mdias finais.

    Realizou-se a ANOVA de nica via seguido do teste de Tukey-Kramer entre a diferena de peso dos animais no incio da avaliao, no 8 e no 14 dias. Observou-se que no houve diferena significativa entre os grupos controle (soluo salina) e o teste (EMPA); tanto do grupo de machos como de fmeas. Confirmando assim, que aps 14 dias de avaliao, os pesos mdios dos ratos do grupo controle e teste apresentaram-se estatisticamente semelhantes.

    Quando analisados o consumo de gua (mL) e alimento (g), nenhuma alterao significativa foi detectada entre os grupos controle e teste, tanto na primeira como na segunda semana no grupo de ratos machos (ANOVA de nica via seguido do teste de Tukey-Kramer). Porm, avaliando-se o consumo de gua entre os grupos controle e teste de animais fmeas foi registrada uma diferena significativa (p

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    grupos controle e teste de ratas (F) quando avaliado o consumo de gua. Porm, como nos grupos de ratos machos no foi observada nenhuma alterao significativa quanto a este critrio, no possvel estabelecer, a princpio, uma relao entre a alterao no consumo de gua e a administrao aguda do EMPA.

    Alm disso, observou-se um aumento significativo (p0,18)

    Pulmes 0,41 0,03 0,39 0,04 (p>0,11) 0,45 0,02 0,46 0,01 (p>0,18)

    Fgado 3,69 0,20 3,81 0,17 (p>0,48) 3,40 0,02 3,32 0,06 (p>0,42)

    Rins 0,65 0,02 0,67 0,05 (p>0,60) 0,62 0,03 0,59 0,05 (p>0,11)

    TABELA 3. Nveis sricos de parmetros bioqumicos em ratos machos (M) e fmeas (F) tratados com EMPA (Extrato Metanlico de P. amapa) (2 g kg-1) e o grupo controle tratado com salina. Dados expressos pela mdia desvio padro e nvel de significncia p (teste t de Student, p

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    e moderado aumento de plaquetas, e durante o tratamento de algumas anemias (Ogston e Dawson 1969).

    A trombocitose associada anemia ferropriva, sempre foi relatada em adultos e crianas, alm de trombocitopenia ocorrentes em estados mais severos da anemia, sendo que, em ambas as condies os valores retornam ao normal aps o tratamento com ferro. Estudos em ratos para investigar a relao do ferro com as plaquetas demonstraram que a homeostasia das plaquetas sofre influncia com a intensidade e durao da anemia (Choi e Simone 1973). O aumento na contagem de plaquetas promovido pela administrao aguda de EMPA pode sugerir que a espcie possua constituintes estimuladores da liberao de trombopoietina, que o principal regulador fisiolgico da produo de plaquetas.

    Considerando-se tal estudo e levando em considerao que no foram observadas alteraes de outras variveis hematolgicas, tampouco o registro de quadros anmicos, no possvel correlacionar tais eventos com o aumento significativo do nmero de plaquetas registrado nesta pesquisa. Alm disso, na busca de pesquisas que revelassem a atividade biolgica dos compostos farmacologicamente ativos descritos para P. amapa, no foram encontrados relatos que descrevam qualquer ligao entre a presena de tais compostos e a induo de trombocitose em modelos experimentais. Assim, fica a expectativa de novos estudos que possam elucidar tal achado hematolgico.

    A regulao de gua e eletrlitos e a eliminao dos resduos metablicos so essenciais manuteno da homeostase. O sistema renal exerce papel de extrema importncia na realizao dessas funes. No presente estudo no foram

    observadas alteraes na estrutura e funo renais, bem como no foram observadas alteraes significativas nos valores de eletrlitos pesquisados.

    Outro aspecto importante a avaliao laboratorial das dislipidemias determinadas pelas dosagens de lipdeos como colesterol total (CT) e triglicerdeos. As alteraes dessas molculas so primordiais para avaliar, juntamente com outras variveis, doenas do sistema cardiovascular e doenas pancreticas. Neste trabalho, no foram observadas alteraes significativas que permitissem indicar um possvel evento txico relacionado com a administrao aguda do EMPA. Sabe-se, tambm, que o sistema hepatobiliar apresenta centenas de funes conhecidas, entre as quais as metablicas, excretoras e secretoras, armazenamento, protetoras, circulatrias e coagulao sangunea e, segundo os dados obtidos, no houve registro de evento hepatotxico em decorrncia da administrao do EMPA.

    Deve-se considerar, tambm, que o msculo cardaco e o msculo esqueltico possuem atividade ou concentrao elevada de enzimas e protenas envolvidas na gerao de enzimas e na contrao muscular, portanto a dosagem de ndices como a creatina-fosfoquinase (CK-NAC) importante quando se busca analisar a funo cardaca e msculo esqueltico e, com base em nossos achados, o uso P. amapa, da forma como foi realizado, a princpio, no representa risco a estrutura e funo dos msculos cardaco e esqueltico. No houve tambm alteraes significativas e indicativas de intoxicao provocada pela administrao do EMPA no exame anatomopatolgico.

    TABELA 4. Variveis hematolgicas de ratos machos (M) e fmeas (F) tratados com EMPA (Extrato Metanlico de P. amapa) (2 g kg-1) e o grupo controle tratado com salina. Os valores representam a mdia desvio padro. ***p

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    Considerando-se tais resultados e levando-se em considerao que muitos destes processos patolgicos se apresentam na forma de quadro crnico, estimulando o uso tradicional de plantas medicinais em regime de uso constante e duradouro, observa-se que a avaliao da toxicidade do P. amapa de fundamental importncia para a sade pblica, levando-se em conta que tal espcie comumente usada por populaes tradicionais como antiinflamatria, antiulcerognica, antinociceptiva, entre outros atividades.

    CONCLUSOO uso das cascas do caule do P. amapa como fonte

    medicinal pode ser considerado aparentemente seguro, quando administrado por via oral. Para tal fim, fazem-se necessrios estudos mais prolongados (toxicidade sub-crnica e crnica) para averiguar o desenvolvimento de provveis danos nos sistemas fisiolgicos decorrentes da administrao crnica do P. amapa.

    AGRADECIMENTOSAo Dr. Breno Marques pela identificao do material

    vegetal, ao Programa de bolsas CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior) e CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico), ao Laboratrio Central de Macap, -LACEN-AP e a Universidade Federal do Amap.

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    Recebido em 09/05/2015Aceito em 07/07/2015

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