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Page 1: AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE UM NOVO … · estiramento da ligação OH do grupo fenol, bandas alargadas associadas aos modos ν(NH), bandas de estiramento referentes à ligação

Departamento de Química

AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE UM NOVO COMPOSTO

COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTI-ALZHEIMER SINTETIZADO E

PATENTEADO PELA PUC-Rio

Aluna: Daphne Schneider Cukierman

Orientador: Dr. Nicolás A. Rey

Co-orientadora: Dra. Rachel Ann Hauser-Davis

Introdução

Pessoas acometidas pela Doença de Alzheimer apresentam depósitos do peptídeo Aβ

aliados a altas quantidades de metais fisiológicos, como Zn2+

, Cu2+

e Fe3+

, além de estresse

oxidativo generalizado devido à presença de metais redox-ativos (ferro, cobre). Compostos

atenuadores da interação metal-proteína (MPACs) são agentes terapêuticos emergentes neste

contexto. Eles restauram a homeostase metálica, competindo com o peptídeo Aβ pela ligação

com biometais, evitando sua oligomerização e a produção de radicais livres. Peptídeos como a

glutationa reduzida (GSH) e proteínas como as metalotioneínas (MTs) são biomarcadores de

estresse oxidativo, e sua avaliação em cobaias injetadas com compostos bioativos permite a

avaliação toxicológica e do potencial farmacológico dos mesmos.

Objetivos

Avaliar efeitos biológicos do composto com potencial atividade anti-Alzheimer

sintetizado na PUC-Rio, 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoíl hidrazona

(INHHQ) em cobaias, determinando biomarcadores de estresse oxidativo (GSH, MT) e

biometais (Zn, Cu e Fe).

Metodologia

A síntese foi realizada de acordo com De Freitas e colaboradores (De Freitas, Da Silva

et al., 2013). O sólido obtido foi analisado por espectrofotometria de absorção na região do

infravermelho (IV) médio, de 4000 a 450 cm-1

. Carbono, hidrogênio e nitrogênio foram

determinados em um analisador elementar modelo EA112. A estabilidade hidrolítica do

INHHQ foi verificada por espectroscopia UV-Vis. O composto foi avaliado nas condições de

injeção nas cobaias, DMSO 10%, ao longo de 12-30 h.

Todos os experimentos envolvendo o uso de cobaias foram aprovados por uma Comissão de

Ética e estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados no

Brasil e nos EUA. Os efeitos biológicos do composto foram analisados após injeção em ratos

Wistar machos (~120 dias). As cobaias foram divididas em três grupos: controles (não-

injetados, n=4), um grupo injetado apenas com o veículo (DMSO 10% em solução salina,

n=4) e um grupo injetado com o INHHQ a 200 mg kg-1

(n=8). Os animais foram mantidos em

observação por 72 h e então sacrificados. O cérebro, fígado, coração e rins foram removidos,

aliquotados e congelados a –20o C. Para as análises de GSH, as amostras foram preparadas de

acordo com Beutler (Beutler, 1975), com incorporação das modificações sugeridas por

Wilhelm-Filho (Wilhelm, Torres et al., 2005). A quantificação de GSH foi feita após reação

de Ellman (Ellman, 1959) por espectrofotometria a 412 nm. Para as análises de MT, as

amostras foram preparadas de acordo com Erk (Erk, Ivankovi et al., 2002) e filtradas usando

filtros Vivaspin com corte de 3 kDa para remover interferentes. As MTs foram quantificadas

pelo método de Ellman (Ellman, 1959), usando GSH como padrão externo. A determinação

de metais foi realizada por ICP-MS. A exatidão do método foi garantida por uso de material

de referência (DORM-4). As amostras foram decompostas em meio ácido sob aquecimento a

100 °C por 5 h. Após resfriamento, estas foram apropriadamente diluídas e analisadas em um

ICP ELAN DRC II (Perkin Elmer-Sciex, USA). Os dados, não-normais, foram analisados por

testes não-paramétricos. O nível de significância foi considerado quando p < 0,05.

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Departamento de Química

Resultados e discussão

A síntese do ligante apresentou rendimento relativamente elevado, de 56%. Fórmula

proposta: C16H12N4O2 (292,28 g mol-1

). Análise elementar - %Experimental (Teórica): C 66,3

(65,7); H 4,1 (4,1); N 19,4 (19,2). No espectro IV, foi observada uma banda atribuída ao

estiramento da ligação OH do grupo fenol, bandas alargadas associadas aos modos ν(NH),

bandas de estiramento referentes à ligação C-OH, de absorção de estiramento do grupo

carbonílico, v(C=O) e de estiramentos C=N do grupo azometina, corroborando a identidade

do produto. O ligante se mostrou estável nas condições do estudo espectrofotométrico,

apresentando-se 96% disponível após 12 h de teste.

Não houve mortalidade / alteração comportamental durante o experimento com as cobaias,

nem foram observadas anomalias macroscópicas nos órgãos após dissecção. A GSH não foi

alterada estatisticamente significativamente no cérebro em nenhum grupo, enquanto houve

diminuição estatisticamente significativa nos rins e coração e um leve aumento,

estatisticamente não-significativo, no fígado dos animais injetados. Já para as MTs, foi

observado um decréscimo estatisticamente significativo no coração do grupo injetado em

relação ao grupo controle. No cérebro e no fígado foram observados aumentos

estatisticamente significativos para o grupo veículo apenas. Não houve diferença

estatisticamente significativa para nenhum grupo nos rins. Para os biometais, não foram

observadas variações estatisticamente significativas para o cérebro e para o coração em

nenhum grupo, com uma diminuição estatisticamente significativa apenas para o grupo

injetado com o veículo nas concentrações de zinco no fígado e aumento estatisticamente

significativo nas concentrações de cobre nos rins do grupo injetado em comparação com o

controle.

Conclusões

O INHHQ é estável na solução de trabalho e atóxico em altas concentrações. O

composto restaura os níveis de MT àqueles dos ratos controle quando comparados com o leve

aumento verificado nos animais injetados com DMSO. Os níveis de biometais sugerem que o

INHHQ não age como um agente quelante, eliminando metais fisiológicos do organismo, mas

sim os redistribuindo, levando à homeostase. Leve estresse oxidativo é esperado no fígado,

pois a dose injetada foi aguda e este é o principal órgão de detoxificação do corpo. No

cérebro, porém, os níveis de GSH não foram alterados, propondo que o composto não causa

estresse oxidativo, sugerindo ser o INHHQ um ótimo candidato para futuros estudos

farmacológicos.

Referências

1 - Beutler, E. Red Cell Metabolism: a Manual of Biochemical Methods, 2nd ed. New York.:

Grune and Stratton. 1975. 546 p.

2 - De Freitas, L. V., C. C. P. Da Silva, et al. Structural and vibrational study of 8-

hydroxyquinoline-2-carboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone - A potential metal-protein

attenuating compound (MPAC) for the treatment of Alzheimer's disease. Spectrochimica Acta

Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v.116, Dec, p.41-48. 2013.

3 - Ellman, G. L. Tissue Sulfhydryl Groups. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.82,

n.1, p.70-77. 1959.

4 - Erk, M., D. Ivankovi, et al. Evaluation of different purification procedures for the

electrochemical quantification of mussel metallothioneins. Talanta, v.57, p.1211-1218. 2002.

5 - Wilhelm, D., M. A. Torres, et al. Effect of different oxygen tensions on weight gain, feed

conversion, and antioxidant status in piapara, Leporinus elongatus (Valenciennes, 1847).

Aquaculture, v.244, n.1-4, Feb 28, p.349-357. 2005.

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