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Departamento de Química
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE UM NOVO COMPOSTO
COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTI-ALZHEIMER SINTETIZADO E
PATENTEADO PELA PUC-Rio
Aluna: Daphne Schneider Cukierman
Orientador: Dr. Nicolás A. Rey
Co-orientadora: Dra. Rachel Ann Hauser-Davis
Introdução
Pessoas acometidas pela Doença de Alzheimer apresentam depósitos do peptídeo Aβ
aliados a altas quantidades de metais fisiológicos, como Zn2+
, Cu2+
e Fe3+
, além de estresse
oxidativo generalizado devido à presença de metais redox-ativos (ferro, cobre). Compostos
atenuadores da interação metal-proteína (MPACs) são agentes terapêuticos emergentes neste
contexto. Eles restauram a homeostase metálica, competindo com o peptídeo Aβ pela ligação
com biometais, evitando sua oligomerização e a produção de radicais livres. Peptídeos como a
glutationa reduzida (GSH) e proteínas como as metalotioneínas (MTs) são biomarcadores de
estresse oxidativo, e sua avaliação em cobaias injetadas com compostos bioativos permite a
avaliação toxicológica e do potencial farmacológico dos mesmos.
Objetivos
Avaliar efeitos biológicos do composto com potencial atividade anti-Alzheimer
sintetizado na PUC-Rio, 8-hidroxiquinolina-2-carboxaldeído isonicotinoíl hidrazona
(INHHQ) em cobaias, determinando biomarcadores de estresse oxidativo (GSH, MT) e
biometais (Zn, Cu e Fe).
Metodologia
A síntese foi realizada de acordo com De Freitas e colaboradores (De Freitas, Da Silva
et al., 2013). O sólido obtido foi analisado por espectrofotometria de absorção na região do
infravermelho (IV) médio, de 4000 a 450 cm-1
. Carbono, hidrogênio e nitrogênio foram
determinados em um analisador elementar modelo EA112. A estabilidade hidrolítica do
INHHQ foi verificada por espectroscopia UV-Vis. O composto foi avaliado nas condições de
injeção nas cobaias, DMSO 10%, ao longo de 12-30 h.
Todos os experimentos envolvendo o uso de cobaias foram aprovados por uma Comissão de
Ética e estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados no
Brasil e nos EUA. Os efeitos biológicos do composto foram analisados após injeção em ratos
Wistar machos (~120 dias). As cobaias foram divididas em três grupos: controles (não-
injetados, n=4), um grupo injetado apenas com o veículo (DMSO 10% em solução salina,
n=4) e um grupo injetado com o INHHQ a 200 mg kg-1
(n=8). Os animais foram mantidos em
observação por 72 h e então sacrificados. O cérebro, fígado, coração e rins foram removidos,
aliquotados e congelados a –20o C. Para as análises de GSH, as amostras foram preparadas de
acordo com Beutler (Beutler, 1975), com incorporação das modificações sugeridas por
Wilhelm-Filho (Wilhelm, Torres et al., 2005). A quantificação de GSH foi feita após reação
de Ellman (Ellman, 1959) por espectrofotometria a 412 nm. Para as análises de MT, as
amostras foram preparadas de acordo com Erk (Erk, Ivankovi et al., 2002) e filtradas usando
filtros Vivaspin com corte de 3 kDa para remover interferentes. As MTs foram quantificadas
pelo método de Ellman (Ellman, 1959), usando GSH como padrão externo. A determinação
de metais foi realizada por ICP-MS. A exatidão do método foi garantida por uso de material
de referência (DORM-4). As amostras foram decompostas em meio ácido sob aquecimento a
100 °C por 5 h. Após resfriamento, estas foram apropriadamente diluídas e analisadas em um
ICP ELAN DRC II (Perkin Elmer-Sciex, USA). Os dados, não-normais, foram analisados por
testes não-paramétricos. O nível de significância foi considerado quando p < 0,05.
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Resultados e discussão
A síntese do ligante apresentou rendimento relativamente elevado, de 56%. Fórmula
proposta: C16H12N4O2 (292,28 g mol-1
). Análise elementar - %Experimental (Teórica): C 66,3
(65,7); H 4,1 (4,1); N 19,4 (19,2). No espectro IV, foi observada uma banda atribuída ao
estiramento da ligação OH do grupo fenol, bandas alargadas associadas aos modos ν(NH),
bandas de estiramento referentes à ligação C-OH, de absorção de estiramento do grupo
carbonílico, v(C=O) e de estiramentos C=N do grupo azometina, corroborando a identidade
do produto. O ligante se mostrou estável nas condições do estudo espectrofotométrico,
apresentando-se 96% disponível após 12 h de teste.
Não houve mortalidade / alteração comportamental durante o experimento com as cobaias,
nem foram observadas anomalias macroscópicas nos órgãos após dissecção. A GSH não foi
alterada estatisticamente significativamente no cérebro em nenhum grupo, enquanto houve
diminuição estatisticamente significativa nos rins e coração e um leve aumento,
estatisticamente não-significativo, no fígado dos animais injetados. Já para as MTs, foi
observado um decréscimo estatisticamente significativo no coração do grupo injetado em
relação ao grupo controle. No cérebro e no fígado foram observados aumentos
estatisticamente significativos para o grupo veículo apenas. Não houve diferença
estatisticamente significativa para nenhum grupo nos rins. Para os biometais, não foram
observadas variações estatisticamente significativas para o cérebro e para o coração em
nenhum grupo, com uma diminuição estatisticamente significativa apenas para o grupo
injetado com o veículo nas concentrações de zinco no fígado e aumento estatisticamente
significativo nas concentrações de cobre nos rins do grupo injetado em comparação com o
controle.
Conclusões
O INHHQ é estável na solução de trabalho e atóxico em altas concentrações. O
composto restaura os níveis de MT àqueles dos ratos controle quando comparados com o leve
aumento verificado nos animais injetados com DMSO. Os níveis de biometais sugerem que o
INHHQ não age como um agente quelante, eliminando metais fisiológicos do organismo, mas
sim os redistribuindo, levando à homeostase. Leve estresse oxidativo é esperado no fígado,
pois a dose injetada foi aguda e este é o principal órgão de detoxificação do corpo. No
cérebro, porém, os níveis de GSH não foram alterados, propondo que o composto não causa
estresse oxidativo, sugerindo ser o INHHQ um ótimo candidato para futuros estudos
farmacológicos.
Referências
1 - Beutler, E. Red Cell Metabolism: a Manual of Biochemical Methods, 2nd ed. New York.:
Grune and Stratton. 1975. 546 p.
2 - De Freitas, L. V., C. C. P. Da Silva, et al. Structural and vibrational study of 8-
hydroxyquinoline-2-carboxaldehyde isonicotinoyl hydrazone - A potential metal-protein
attenuating compound (MPAC) for the treatment of Alzheimer's disease. Spectrochimica Acta
Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v.116, Dec, p.41-48. 2013.
3 - Ellman, G. L. Tissue Sulfhydryl Groups. Archives of Biochemistry and Biophysics, v.82,
n.1, p.70-77. 1959.
4 - Erk, M., D. Ivankovi, et al. Evaluation of different purification procedures for the
electrochemical quantification of mussel metallothioneins. Talanta, v.57, p.1211-1218. 2002.
5 - Wilhelm, D., M. A. Torres, et al. Effect of different oxygen tensions on weight gain, feed
conversion, and antioxidant status in piapara, Leporinus elongatus (Valenciennes, 1847).
Aquaculture, v.244, n.1-4, Feb 28, p.349-357. 2005.
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