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Departamento de Química

AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE UM NOVO COMPOSTO

COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTI-ALZHEIMER

Aluna: Daphne Schneider Cukierman

Orientador: Nicolás A. Rey

1. Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que representa,

atualmente, a forma mais comum de demência em idosos. O alemão Alois Alzheimer publicou

o primeiro estudo descrevendo esta doença há mais de um século, relatando sintomas de

falhas na memória, paranóia, problemas comportamentais e de linguagem, cérebro atrófico e

sinais de deposições protéicas anômalas no cérebro, denominadas placas senis e emaranhados

neurofibrilares [1]. Os emaranhados neurofibrilares são agregados anormais de fibras

citoplasmáticas que ocorrem nos corpos celulares neuronais, enquanto as placas são formadas

principalmente pelo peptídeo Aβ, considerado fundamental no desenvolvimento da patologia

e representando o conceito fundamental da hipótese da cascata amiloide, que descreve o

acúmulo desse peptídeo como sendo causal na etiologia da doença [2-5]. A observação de

ambas as placas amilóides extracelulares e os emaranhados neurofibrilares no interior das

células serve como um diagnóstico patológico definitivo da DA [6].

O peptídeo Aβ é encontrado em diferentes formas no cérebro de pacientes com DA,

cada uma com funções e propriedades específicas. A agregação dos monômeros de Aβ gera

oligômeros fibrilares que são a forma de aglomeração de maior toxicidade [7,8]. As principais

formas de Aβ presentes no sistema nervoso central são Aβ1-40 e Aβ1-42, sendo a última a forma

responsável pela formação dos oligômeros e, portanto, das placas senis, devido à sua maior

tendência de agregação [9-12]. Uma vez formados os agregados extracelulares, uma resposta

inflamatória é induzida e há danos nas células do sistema colinérgico, que é relacionado com

os processos de aprendizagem e memória [13].

Já os emaranhados neurofibrilares intracelulares são formados por outra proteína,

denominada tau, associada aos microtúbulos [14]. Esta proteína se torna hiperfosforilada no

cenário da DA, passando a ser insolúvel e agregando-se em fibrilas e emaranhados que podem

eventualmente levar à morte dos neurônios [4,15-18]. Diversos estudos apontam para uma

relação entre o acúmulo de Aβ e a hiperfosforilação da proteína tau [4,19-24]. Entretanto, este

desequilíbrio ainda é pouco compreendido.


Alguns estudos apresentam evidências de que íons metálicos endógenos, tais como

zinco(II) e cobre(II), podem contribuir para a agregação do peptídeo Aβ, facilitando, assim, o

acúmulo das placas amilóides [17,25-30]. Por exemplo, estudos in vitro indicam que o zinco e

o cobre induzem a agregação rápida de Aβ sintético em ambiente aquoso [31,32], enquanto

estudos de quelação de metais demonstraram a dissolução dos agregados Aβ em extratos de

cérebros de pacientes acometidos pela doença e a inibição do acúmulo de placas amilóides em

ratos transgênicos modelos de DA [33,34]. Além disto, os metais que possuem atividade

redox induzem também o aumento de estresse oxidativo no cérebro através da formação de

espécies reativas de oxigênio, que são tóxicas e podem causar graves disfunções celulares

[35,36]. Existem também relatos que pacientes com DA apresentam concentrações elevadas

de cobre no cérebro, estando este associado tanto ao Aβ quanto aos emaranhados

neurofibrilares [37,38]. Diversos estudos também revelam que o Cu e o Zn competem pelos

mesmos resíduos de Aβ, tendo o Zn uma ligação mais rápida e favorecida [39,40].

Assim, a desregulação dos níveis normais de metais pode ser responsável pela

agregação e depósito de Aβ, assim como o acúmulo de ferro dentro dos neurônios, causando

danos oxidativos e neurodegeneração [31,35,41-46]. Desta maneira, procura-se investigar as

interações entre os metais e o peptídeo.

Diversos estudos clínicos têm sido realizados ao longo dos anos com o objetivo de

buscar um tratamento para a patologia, porém, atualmente, ainda não existe uma cura para a

DA. Entretanto, conta-se com medicamentos que ajudam a controlar parcialmente alguns de

seus sintomas. Por exemplo, a memantina, um fármaco aprovado pelo FDA (do inglês, Food

and Drug Administration), órgão de Administração de Comidas e Remédios dos Estados

Unidos, é usada para tratar sintomas de DA moderada e severa, e regula a atividade do

glutamato, um neurotransmissor envolvido na aprendizagem e memória que é danificado

durante os processos da DA. Além disto, busca-se também limitar o acúmulo de Aβ nos

tecidos através da diminuição de sua produção, porém esta abordagem tem se mostrado

complicada na prática. Além dos medicamentos que tratam os sintomas atualmente

disponíveis, é também comum a prescrição de fármacos para o controle da depressão e a

vitamina E, um antioxidante que pode proteger as células do cérebro e outros tecidos do corpo

de desgaste químico e estresse oxidativo.

Visando evitar o acúmulo de Aβ nos tecidos a partir de uma abordagem baseada em

uma das hipóteses mais atuais referentes à DA, a hipótese metálica, onde é investigada a

importância de metais fisiológicos na patologia, diversos estudos analisaram a possibilidade

de agentes quelantes de metais para a remoção dos mesmos e a consequente solubilização do


peptídeo Aβ [47,48]. Os resultados, porém, mostram graves efeitos adversos devido ao uso

prolongado desses quelantes. Portanto, os agentes quelantes não são ideais, pois, em sua

maioria, não possuem as propriedades necessárias para atravessar a barreira hematoencefálica

e não são específicos para os íons metálicos complexados com o Aβ, levando a uma quelação

indiferenciada de metais fisiológicos essenciais [49,50].

Uma classe emergente de agentes terapêuticos que podem vir a retardar ou prevenir o

progresso da demência na DA são os MPACs, compostos atenuadores da interação metal-

proteína (do inglês, Metal Protein Attenuating Compounds), que diferem conceitualmente de

agentes quelantes tradicionais por possuírem afinidade moderada por íons metálicos. Desta

maneira, ao invés de se ligarem e removerem sistematicamente os íons dos tecidos, os MPACs

restauram a homeostase dos metais fisiológicos, reduzindo o estresse oxidativo ao competir

com o peptídeo Aβ pela ligação com biometais, prevenindo a sua oligomerização induzida por

Zn2+

e Cu2+

e a produção de radicais livres [34,35,51,52].

Neste contexto, podemos citar o clioquinol, um quelante pequeno e lipofílico, que se

mostrou um possível fármaco para a terapia da DA devido à sua alta afinidade por íons Zn2+

e

Cu2+

[53-56]. Esta molécula apresentou resultados positivos em um estudo que adotou um

modelo transgênico da doença para a redução da formação de placas amilóides do cérebro

[57]. Seu mecanismo de ação foi atribuído à remoção de metais a partir das placas. Entretanto,

foram observados efeitos colaterais severos, o que estimulou a busca de análogos para a

continuação das pesquisas [55,58-60]. O ligante PBT2, parte de uma nova geração de

compostos derivados do clioquinol, reduziu a agregação de Aβ, limitou a toxicidade dos

oligômeros e redistribuiu íons metálicos nos neurônios, sendo utilizado em ratos modelos da

doença e fase 2 de estudos clínicos [58,61-63].

À medida que a hipótese metálica ganha cada vez mais fundamento com a evolução da

compreensão da doença, novas abordagens para o tratamento da DA são propostos neste

campo de pesquisa, buscando-se um tratamento que atinja as causas da doença, e não somente

seus sintomas.

2. Objetivo

Este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos biológicos, em termos de toxicidade

e segurança de uso, de um composto com potencial anti-Alzheimer em modelos biológicos

sadios (ratos Wistar). Os efeitos do composto, denominado PCIH, nos animais foram

investigados através de diversas técnicas analíticas, bioquímicas e proteômicas, que permitem

a avaliação do potencial farmacológico do mesmo.


3. Material e métodos

3.1. Síntese do ligante

A síntese foi realizada em um balão de reação de 50,0 mL, onde foram diluídos 10,0

mmol de 2-piridinacarboxaldeído em 10,0 mL de uma solução 50 % (V/V) etanol / água.

Gotejou-se a esta solução 10,0 mmol de isoniazida, solubilizada em 20,0 mL da mesma

solução. O sistema foi mantido sob agitação constante e refluxo por 30 min. Em seguida, a

mistura reacional foi resfriada para a formação de precipitado. O precipitado formado

apresentou cor branca cristalina, e foi filtrado e lavado com éter dietílico, e seco à temperatura

ambiente.

3.2. Caracterização do ligante

3.2.1 Espectroscopia Vibracional no Infravermelho Médio e Afastado

Obteve-se o espectro de IV médio do composto em um espectrômetro Perkin Elmer

2000 FT-IR, utilizando pastilhas de KBr. O espectro foi analisado na faixa de 4000 a 450 cm-

1. O espectro de IV afastado foi obtido no mesmo espectrômetro, utilizando pastilhas de

polietileno. As principais bandas características dos grupos funcionais presentes no ligante

foram comparadas com o espectro e dados disponíveis na literatura para confirmar a

identidade do produto.

3.2.2. Análise Elementar

A análise dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foi realizada em duplicata,

de forma simultânea a partir da curva de calibração obtida com padrões secos e de alta pureza,

em um analisador elementar (CHN), modelo EA112, da Thermo Electron.

3.2.3. Testes de Estabilidade

A estabilidade do PCIH foi determinada através de análise de varredura em

espectrofotômetro de absorção molecular na região do UV-Vis, modelo Perkin Elmer Lambda

35, entre os comprimentos de onda de 200 até 800 nm, em temperatura ambiente. A

estabilidade hidrolítica do ligante foi verificada por espectroscopia UV-Vis. O composto foi

avaliado nas condições de injeção nas cobaias, DMSO 10%, ao longo de 12 h.


3.2.4. Ensaios de toxicidade aguda

Todos os experimentos envolvendo o uso de cobaias foram aprovados por uma

Comissão de Ética da PUC-Rio e universidades colaboradoras (protocolo no

CEUA/036/2013), e estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal

adotados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório/Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal, em conformação com o Guia da Sociedade Norte Americana de

Neurociências e Comportamento para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório [64].

Os ratos Wistar machos adultos sadios tinham entre 180 e 240 dias de vida. Foram

utilizados apenas machos, para evitar a influência do ciclo estral das fêmeas nos parâmetros

analisados. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Psicologia da PUC-

Rio, em temperatura controlada (24 ± 1°C) e com os ciclos circadianos mantidos (12h/12h

luz-escuridão).

Utilizou-se um grupo controle (n=4), não submetido a nenhum tratamento, um grupo

veículo (n=4), injetado apenas com a solução utilizada na solubilização do ligante (solução

salina contendo 10% DMSO), e um grupo injetado com o composto de interesse (n=8). Os

ratos foram injetados intraperitonealmente com o composto em solução salina contendo 10%

DMSO mantendo a relação de 200 mg por kg de peso corpóreo das cobaias. Os animais foram

mantidos em observação, com alimentação e água fornecidas ad libitum, por 72 h. Após as 72

h os ratos foram sacrificados por guilhotinagem. Os órgãos de interesse, cérebro, fígado,

coração e rins, foram extraídos, limpos com água ultra-pura e pesados antes de serem

aliquotados para as diferentes análises e congelados a -20o C. Eventuais modificações

macroscópicas na anatomia interna das cobaias foram anotadas e levadas em consideração no

tratamento dos dados.

3.3. Avaliação do estresse oxidativo nos animais injetados

Foram realizadas a quantificação do tripeptídeo glutationa reduzida (GSH) e da

metaloproteína metalotioneína (MT), que atuam como biomarcadores de estresse oxidativo, e

reguladora de homeostase metálica, respectivamente, permitindo sua avaliação nas cobaias

injetadas com o composto em comparação com as cobaias de controle.

3.3.1. Extração e quantificação de GSH

A GSH foi extraída a partir de uma porção úmida congelada dos órgãos de interesse. A

porção foi pesada em triplicata e homogeneizada em tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1

,

contendo 0,25 mol L-1

sacarose, pH 7,0, em atmosfera parcialmente inerte (fluxo de


nitrogênio) para minimizar a oxidação da proteína. As amostras foram centrifugadas, a 11.000

x g por 30 minutos a 4 ºC, e os sobrenadantes foram separados, armazenados em microtubos

estéreis, passados novamente pelo fluxo de nitrogênio e congelados até análise.

As concentrações de GSH foram calculadas utilizando GSH (Sigma-Aldrich,

Alemanha) como padrão externo, plotando uma curva analítica de no mínimo 5 pontos. As

amostras foram quantificadas de acordo com a literatura [65]. Ácido 5,5’ – ditio-bis-(2–

nitrobenzóico) (DTNB) 0,25 mmol L-1

em tampão fosfato 0,1 mol L-1

de pH 8,0 foram

acrescentados às amostras e aos pontos da curva na proporção de 1:1. Após incubação ao

abrigo da luz por 15 min, as absorvâncias das amostras foram lidas em espectrofotômetro

(Perkin Elmer Lambda 35, EUA) a 412 nm.

3.3.2. Extração e quantificação de MT

A extração de MT foi baseada na extração térmica proposta por Erk e colaboradores

[66], com modificações. A MT foi extraída a partir de uma alíquota liofilizada dos órgãos de

interesse. Uma porção de cada órgão foi pesada em triplicata e homogeneizada em tampão de

Tris-HCl 20 mmol L-1

pH 8,6, Fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF) 0,5 mmol L-1

, como

agente antiproteolitico, e β-mercaptoetanol 0.01%, como agente redutor, para evitar a

oxidação da MT. As amostras homogeneizadas foram centrifugadas 20.000 x g por 60 min a 4

ºC, de modo que a MT se encontrasse nos sobrenadantes, que foram separados em microtubos

estéreis, e submetidos à aquecimento a 70 oC durante dez minutos em banho-maria

termostatizado (Kacil, BM-02). As alíquotas foram novamente centrifugadas, a 20.000 x g por

30 minutos a 4 ºC, de modo que a MT se encontrasse nos sobrenadantes, que foram separados

e armazenados em microtubos estéreis, sendo este volume medido. Todo o sobrenadante foi

transferido para microcolunas de separação Vivaspin® (Sartorius Stedim Biotech GmbH,

Alemanha) e centrifugadas a 15.000 x g por 30 minutos a 4 ºC. Como o tamanho de corte

molecular das colunas é menor que o tamanho da proteína de interesse (3000 Da), as MT

permaneceram na parte superior da coluna e todas as proteínas menores que este tamanho de

corte passaram pela coluna e foram então descartadas. O volume final na parte de cima da

coluna foi medido, separado em microtubos estéreis e congelado até análise [66,67].

A quantificação de MT foi realizada por espectrofotometria através da reação de

Ellman [65] utilizando GSH (Sigma-Aldrich, Alemanha) como padrão externo, plotando uma

curva analítica de no mínimo 5 pontos. As concentrações de MT nas amostras foram

calculadas utilizando a relação de 1 mol de MT sendo equivalente a 20 mols de GSH [68-70].

As amostras foram tratadas com uma solução de EDTA 4 mmol L-1

contendo 1 mol L-1

de


HCl e DTNB, 0,43 mmol L-1

em uma solução 2 mol L-1

de NaCl e tampão fosfato 0,2 mol L-1

de pH 8,0. Após incubação ao abrigo da luz por 30 min, as absorvâncias das amostras foram

lidas em espectrofotômetro (Perkin Elmer Lambda 35, EUA) a 412 nm.

3.2.3. Quantificação de biometais

A quantificação dos biometais foi realizada em alíquotas liofilizadas dos órgãos das

cobaias. Aproximadamente 100 mg de cada amostra foram acidificados com 1 mL de ácido

nítrico subdestilado (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), e mantidas em descanso overnight. O

material de referência (MRC) utilizado foi o DORM-4 (Dogfish muscle – músculo de peixe-

cão, NRC, Canadá), em duplicata. Após o descanso, as amostras foram aquecidas a 80-100 °C

durante aproximadamente 4 horas para digestão. Após o resfriamento, as amostras e os MRC

foram avolumados a 10 mL e duas diluições (de 10x e 100x) foram preparadas. Três brancos

de análise foram preparados da mesma forma. Os elementos de interesse, 57

Fe, 65

Cu e 66

Zn,

foram determinados por ICP-MS, modelo ELAN DRC II (Perkin Elmer, Sciex, Norwalk, CT,

EUA), no modo padrão, sem o uso de célula de reação. As amostras foram introduzidas

usando um nebulizador do tipo Meinhard com uma câmara ciclônica twister. Durante a

análise, 103

Rh foi utilizado como padrão interno em concentração de 20 mg L-1

. Os resultados

foram obtidos através da média das três leituras feitas para cada amostra, após calibração

externa com soluções de calibração multielementares obtidas através de diluições apropriadas

da solução padrão (Merck IV).

3.2.7. Análises estatísticas

Utilizou-se teste estatístico ANOVA para analisar as diferenças entre os grupos nos

ensaios de avaliação do estresse oxidativo do composto nas cobaias. Diferenças foram

consideradas significativas quando p < 0,05.

4. Resultados e discussão

4.1. Síntese e caracterização do ligante

A síntese, que possui apenas uma etapa, foi realizada com 67% de rendimento. Trata-

se de um processo ambientalmente correto, gerando apenas água como subproduto. A reação

de condensação entre a 2-piridinacarboxaldeído e a isoniazida está representada na Figura 1

abaixo.


Figura 1 – Reação de síntese do PCIH.

O espectro do ligante na região média do infravermelho é mostrado na Figura 2, a

seguir. As principais bandas do espectro estão listadas após a figura.

Figura 2 – Espectro vibracional no IV médio do ligante PCIH.

Os grupos OH e NH são muito característicos e suas vibrações de estiramento são

observadas por volta de 3500 - 3300 cm-1

[71]. No espectro de infravermelho do PCIH foi

observada uma banda alargada muito intensa em 3270 cm-1

, atribuída à presença de água no

composto. A absorção ν(NH) não foi observada, uma vez que a larga e intensa banda de água

a cobre completamente no espectro.

Grupos funcionais que apresentam momento dipolo significativos, tais como o grupo

carbonílico, possuem absorções intensas no IV. A banda de absorção de estiramento do grupo

carbonílico, ν(C=O), aparece em uma região relativamente livre de outras vibrações (1800-

1600 cm-1

) [72]. Para o PCIH, ν(C=O) origina uma das bandas mais fortes do espectro de

infravermelho, atribuída em 1663 cm-1

.

As absorções dos estiramentos do grupo azometina, ν(C=N), costumam ser próximas

ao do estiramento do grupo carbonílico [71]. As bandas de estiramento C=N de bases de


Schiff alquiladas são encontradas geralmente na faixa de 1674 - 1649 cm-1

, dentro da região

comum de absorção para ν(C=O) [73,74]. Para o PCIH, é possível perceber que o sinal

assinalado em 1663 cm-1

corresponde, na verdade, à banda indicada somada à um ombro. À

este ombro atribuiu-se a absorção do estiramento do grupo azometina, ν(C=N).

No espectro é possível também observar as bandas características da presença de anel

aromático, tais como as bandas relacionadas à ligação dupla entre carbonos e à ligação dupla

entre carbono e nitrogênio da piridina. Estas diversas bandas ocorrem na região entre 1600-

1450 cm-1

.

A análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN) mostrou-se

satisfatória, apresentando resultados próximos dos valores teóricos. Análise elementar -

percentual encontrado (percentual calculado): C 55,3 (54,96); H 5,4 (5,38); N 21,8 (21,36). O

ligante sintetizado corresponde ao PCIH ∙ 2H2O e apresenta fórmula molecular C12H14N4O3 e

massa molar 262,26 g mol-1

.

O ligante mostrou estabilidade hidrolítica nas condições utilizadas para a injeção nas

cobaias, ou seja, em solução de 10% DMSO/água, onde, após 12 horas, 90% do composto

ainda estava em sua forma original, sem quebra hidrolítica. O espectro obtido está

apresentado na Figura 3 abaixo.

Figura 3 – Espectro de absorvância molecular UV-Vis do PCIH ao longo de 12 h.

4.2. Ensaios de toxicidade aguda e avaliação do estresse oxidativo

Durante as 72 h de observação entre a injeção e o sacrifício não ocorreu nenhuma

mortalidade das cobaias injetadas tanto com o veículo quanto com o PCIH. Os ratos sadios

injetados com o PCIH não apresentaram mudanças comportamentais durante este período e,

após o sacrifício, os órgãos retirados para análise não mostraram anomalias macroscópicas,

quando comparados com o grupo controle e o grupo injetado apenas com o veículo.

A toxicidade aguda diz respeito aos efeitos tóxicos que são produzidos por exposições

a uma substância por um curto período de tempo, na qual, em geral, as manifestações ocorrem


rapidamente. A injeção de PCIH correspondente a 200 mg do composto por quilo de peso

corpóreo das cobaias se encaixa neste contexto, sendo considerada uma superdose. O fato das

cobaias não morrerem durante o período de 72 h, seu comportamento normal e a falta de

alterações morfológicas macroscópicas nos órgãos são, quando tomados em conjunto, fortes

indicadores de que o ligante é atóxico em altas concentrações, considerando-se uma exposição

aguda.

A glutationa reduzida (GSH) corresponde à primeira defesa do corpo contra radicais

livres, ou seja, ela age como um poderoso antioxidante que protege as células dos danos

gerados por estas espécies [75]. A presença difundida de íons metálicos com atividade redox

no contexto da doença de Alzheimer induz o estresse oxidativo no cérebro do paciente, pois

certos íons metálicos como, por exemplo, Fe2+

e Cu2+

, produzem espécies reativas de

oxigênio (EROs) através de reações de Fenton. As EROs são espécies altamente reativas que

reagem com biomoléculas tais como lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos, causando danos

que podem levar até a morte celular [76]. Assim, a investigação dos níveis de GSH nas

cobaias no contexto deste trabalho teve como objetivo analisar os efeitos do PCIH com

relação a um parâmetro de estresse oxidativo. Uma vez que as cobaias utilizadas são modelos

de ratos Wistar sadios, ou seja, não apresentam sintomas da doença de Alzheimer, as cobaias

do grupo controle foram consideradas como apresentando estresse oxidativo normal ao

organismo nos tecidos estudados, e os níveis de GSH medidos para este grupo são

equivalentes aos valores normais de ratos sadios. Os resultados desta análise estão

apresentados na Figura 4.


Figura 4 – Níveis de GSH em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,

injetados com DMSO 10% e injetados com PCIH.

Não houve diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os grupos controle,

veículo e ratos injetados com PCIH para os níveis de GSH no cérebro, no fígado e nos rins,

mostrando que o ligante não gerou estresse oxidativo nestes órgãos. No coração houve

diminuição estatisticamente significativa da GSH nas cobaias injetadas com o PCIH.

As metalotioneínas (MTs) são uma família de proteínas de baixo peso molecular cuja

principal função biológica está relacionada à homeostase de elementos essenciais e a

detoxificação de elementos não essenciais, atuando também contra o estresse oxidativo [77].

Cerca de 30% dos aminoácidos da cadeia das MTs correspondem a cisteínas, que apresentam

um grupo tiol em sua cadeia lateral. Por se tratarem de ácidos macios, os grupos sulfidrila

possuem alta afinidade por metais, podendo ligar-se a íons macios tais como Zn2+

e Cu2+

, que

estão presentes em altas concentrações em determinadas áreas do cérebro, devido à

homeostase desregulada dos mesmos característica da DA [78].

No contexto do presente trabalho, avaliou-se os níveis de MTs como parâmetro

indicativo de deshomeostase metálica gerado pela injeção do PCIH. Os resultados para

cérebro, fígado, rins e coração das cobaias injetadas com o PCIH, das cobaias injetadas

apenas com o veículo e do grupo controle estão apresentados na Figura 5.

Figura 5 – Níveis de MTs em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,



Tanto para o cérebro, quanto para o fígado, observou-se que a injeção das cobaias com

o veículo causou um aumento estatisticamente significativo (p<0.05) no nível de MTs quando

comparado ao grupo controle. Resultados similares, de aumento do nível do RNA mensageiro

referente a MT em ratos expostos à DMSO foram reportados [79]. Entretanto, a presença do

ligante dissolvido no veículo parece amenizar o efeito tóxico do mesmo, uma vez que os

níveis de MTs foram mantidos à normalidade no grupo injetado com PCIH. Não houve

diferença estatisticamente significativa para nenhum dos grupos nos rins, e no coração houve

decréscimo estatisticamente significativo para o grupo injetado com o ligante em relação ao

grupo controle.

Um tratamento com um MPAC se difere daquele com agentes quelantes tradicionais,

pois não busca a eliminação dos metais envolvidos na patologia, uma vez que estes não se

apresentam em excesso, e sim a redistribuição dos mesmos promovendo a restauração da

homeostase metálica no cérebro.

Buscando avaliar o perfil do ligante como um MPAC, quantificou-se os metais

fisiológicos Fe, Cu e Zn nos diferentes órgãos dos 3 grupos de ratos e os resultados estão

dispostos na Figura 6 a seguir.


Figura 6 – Níveis de Zn, Fe e Cu em cérebro, fígado, rins e coração de ratos Wistar saudáveis,


Os pequenos decréscimos na concentração de ferro observados no cérebro e no fígado

eram esperados, uma vez que o PCIH é uma molécula quelante de ferro utilizada no

tratamento de doenças que apresentam excesso de ferro no organismo. Não foi observada

nenhuma alteração estatisticamente significativa na quantidade de ferro nos rins e no coração.

Em todos os órgãos houve aumento estatisticamente significativa (p<0.05) nos níveis de zinco

apenas para o grupo injetado com o PCIH, não havendo diferenças entre o grupo controle e o

grupo injetado com o veículo. Houve também um pequeno aumento estatisticamente

significativo (p<0.05) nos níveis de Cu nos rins dos ratos injetados com o PCIH em

comparação com os ratos controle.

O grupo de pesquisa do LABSO-Bio também vem conduzindo, em parceria com o

Instituto Max Planck da Argentina, experimentos in vitro de RMN uni-(1H) e bidimensionais

(1H-15N HSQC) envolvendo Cu(II)-Aβ e Zn(II)-Aβ na presença de PCIH, que demonstraram

que o ligante inibe a interação de Aβ com os biometais por um mecanismo que parece


envolver o seu sequestro, evitando seu depósito ligados ao peptídeo, ressolubilizando o

mesmo.

5. Conclusões

Neste trabalho estudou-se uma hidrazona derivada do agente anti-tuberculose

isoniazida e seu potencial para atuar como um MPAC no tratamento da doença de Alzheimer.

A síntese do ligante PCIH envolve uma única etapa, ambientalmente correta, apresentando

alto rendimento e elevada eficiência atômica. A confirmação da sua identidade molecular e

estrutural foi possível através de técnicas analíticas. A análise elementar do PCIH confirma

que o produto obtido apresenta teores dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio

similares ao valor teórico proposto. A espectroscopia vibracional de absorção no

infravermelho médio permitiu o estudo de particularidades da molécula, tais como o

estiramento do grupo funcional formado, C=N. O ligante mostrou-se estável nas condições

utilizadas para a injeção nas cobaias, onde, após 12 horas, apresentou 90% da sua forma

original.

Por sua vez, os testes in vivo com ratos sadios injetados com 200 mg kg-1

de PCIH

mostraram que não houve mortalidade ou mudanças comportamentais das cobaias durante as

72 h de observação entre a injeção e o sacrifício. Os níveis dos biomarcadores de estresse

oxidativo e homeostase metálica estudados não apresentaram diferenças estatisticamente

significativas entre os grupos controle e ratos injetados com o PCIH, tanto no cérebro, quanto

no fígado e nos rins, indicando que o composto é atóxico. A diminuição dos níveis destes

parâmetros no coração deve ser estudada a fim de se compreender melhor o significado destes

resultados.

A avaliação dos níveis de biometais, em conjunto com os dados obtidos com os

experimentos realizados in vitro indicam o grande potencial do PCIH para atuar como um

MPAC no tratamento da doença de Alzheimer sem causar deshomeostase metálica ou estresse

oxidativo.

O principal objetivo que deseja-se atingir ao se propor compostos que possam agir

como MPACs no tratamento da DA é a desagregação do peptídeo Aβ através da captura de Cu

e Zn, e a conseguinte redistribuição destes metais no cérebro. Pequenos efeitos colaterais tais

como a diminuição dos níveis de GSH e MT no coração e o aumento de Cu nos rins podem

ser eventualmente considerados aceitáveis, ou até mesmo não estarem presentes em dosagem

clínica do possível fármaco. Deve-se estudar o significado e as consequências destes

resultados para que seja possível traçar um melhor perfil farmacológico do composto. Os


resultados deste trabalho, juntamente com outros resultados publicados sobre o composto pela

linha de pesquisa do grupo LABSO-Bio mostram que, de forma geral, as hidrazonas são

excelentes candidatas para futuros testes e estudos bioquímicos no contexto de sua utilização

como um potencial MPAC no tratamento da doença de Alzheimer.

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