avaliação da comunidade microbiana impactada pela...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
Avaliação da comunidade microbiana impactada pela enxurrada de rejeitos de mineração no Rio Doce em
Mariana - MG
Luciano Takeshi Kishi
Supervisora: Prof.ª. Drª. Eliana G. de Macedo Lemos
JABOTICABAL
2015
Resumo
No dia 5 de novembro de 2015, uma barragem de rejeito de minério de
ferro de uma empresa mineradora se rompeu, extravasando cerca de 55
milhões de metros cúbicos de lama, devastando as cidades próximas como
Bento Rodrigues e Mariana, causando mortes e sérios problemas ambientais.
Os resíduos desta barragem percorreu pelo rio Doce da cidade de Mariana
até Linhares, desembocando no mar, tornando a água imprópria para
consumo humano e dificultando sobrevivência dos organismos vivos. Assim
para avaliar o real impacto na microbiota presente nas águas do rio Doce e
suas margens, um Grupo Independente de Avaliação do Impacto Ambiental
(GIAIA) reuniu pesquisadores para organizar através da internet, para fazer
uma análise colaborativa do impacto ambiental resultante do rompimento da
barragem de rejeitos em Mariana - Minas Gerais. Neste sentido, o presente
trabalho apresenta uma proposta para avaliar a diversidade microbiana,
utilizando sequenciadores de Nova Geração para a região 16S do gene rRNA
e também avaliar o perfil metabólico nas amostras de água e solo ao longo
do rio Doce, realizando ensaios com microrganimos possíveis de serem
utilizados para a biorremediação de metais.
Palavras-chave: Diversidade bacteriana; gene 16S rRNA; regiões
hipervariáveis, impacto ambiental, biorremediação
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVAS O grande crescimento industrial e com o aumento populacional, tem
aumentado também a liberação e à acumulação de metais pesados no solo
dos diversos biomas, como consequência das atividades de mineração, do
processamento industrial, e da utilização de pesticidas e fertilizantes
químicos (Liu et al., 2013).
A presença de metais pesados, mesmo em quantidades mínimas,
pode ser tóxica e prejudicial para a flora e fauna, tornando-se um grande
problema ambiental (Gadd, 2000a). Técnicas como precipitação,
oxidação/redução, adsorção, complexação e cimentação, redução eletrolítica,
troca iônica e osmose reversa vêm sendo utilizados para remoção de metais
pesados de ambientes aquáticos e solos (Bai et al., 2014), sendo que, no
entanto, existem processos naturais, como biososorção por células
bacterianas mortas vem sendo utilizadas como alternativa mais naturais
(Gadd, 2000a). Um outra abordagem biotecnológica tem sido a utilização de
plantas na biorremoção de metais, uma vez que a mesma absorve os metais
pela raiz ou em associação com microrganismos, não transferindo os
mesmos para cadeia alimentar (Margesin et al., 2011).
Além de plantas e dos processos convencionais, os microrganismos
relacionados com a solubilidade de minerais, biomineralização,
biorremediação, corrosão microbiana (Li et al., 2014) é de peculiar interesse
para a biorremediação de ambientes, devido ao baixo custo de sua
implementação, despertando assim um grande interesse na indústria (Chen
et al., 2014; Uchiyama and Miyazaki, 2009).
Muitos gêneros bacterianos encontrados no solo atuam nos processos
de biomineração e biorremediação, principalmente os acidófilos com
potencial oxirredutor, como Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus sp. e
Acidithiobacillus caldus. Além destes, gêneros outros como Pseudomonas,
Burkholderia, Bacillus e Rhizobium (Wani and Ayoola, 2015) apresentam
potencial para biorremediação considerando que esses microrganismos
apresentam metabolismo oxidativo de minerais atuando de maneira
importante na biorremediação de cobre, crômio, níquel e zinco (Silver, 1996).
Os processos biológicos relacionados a ambientes tem sido bastante
explorado uma vez que os mesmos exercem papel importante na
manutenção dos ecossistemas, uma série de tecnologias e esforços ao
longo do mundo todo tem sido aplicada para descoberta da diversidade e
acesso as informações funcionais em nível de genes (Mendez-Garcia et al.,
2015). Estudos de diversidade funcional em áreas de extração de metal
possibilitam identificar genes que conferem resistência a microorganismos
para metais pesados e envolvidos no metabolismo destes (Costa et al., 2015;
Hunter et al., 2014; Panicker, 2014).
O Grupo Independente de Avaliação do Impacto Ambiental (GIAIA)
veio até nós propor pesquisas para o levantamento do impacto sobre a
microbiota na área afetada. No entanto, nosso interesse não é de inflar o
conflito já existente e sim trabalhar em prol da sanitização do sistemas
impactados auxiliando as, populações e os ecossistemas envolvidos de
maneira geral, dentro que nossa área de conhecimento. Como cientistas e
cidadãos nossa função é a de preservar o meio ambiente para a nossa e
gerações futuras. Nossa pesquisa até o momento é a ponta de um “iceberg”
cujos resultados obtidos podem ser aplicados para minimizar os efeitos desta
tragédia ambiental.
Tanto o solo quanto a água são biomas que apresentam grande
diversidade de microrganismos interagindo entre si e com todo o
ecossistema, sendo responsáveis pela manutenção das relações ecológica e
da ciclagem de nutrientes. Muito se tem investido no isolamento de
microrganismos e em análises metagenômicas para prospecção de genes
envolvidos em processos importantes para o equilíbrio metabólico e
ecológico pois, tanto de maneira isolada, quanto em interações entre si, estes
microrganismos desempenham papel importante no que diz respeito à
produção de enzimas e em processos de biorremoção de metais e
contaminantes do solo e água.
Em águas residuais de áreas de mineração encontra-se uma
diversidade enorme de microrganismos com muitos sistemas biológicos
complexos. O estudo dos genes que atuam na biorremediação é de suma
importância para o desenvolvimento tecnológico tanto no sentido de
preservação do ambiente como no aproveitamento destes sistemas
biológicos para atividades que possibilitem a melhoria da vida. O projeto
“Diversidade de plantas e de organismos dos solos com potencial
biotecnológico e indicadores de impacto ambiental” (Proc. no 2010/51316-0)
que tem como coordenadora a Profa. Dra. Eliana G. M. Lemos, propôs
estudos através de técnicas moleculares, como a metagenômica, a
determinação da diversidade bacteriana presente em amostras de solo e
água coletadas na área da mineradora e do seu entorno do Centro de
Biodiversidade (CEBIO) da empresa VALE/SA; além disso também é objetivo
desse projeto prospectar e isolar genes codificadores de enzimas envolvidas
em processos de biorremediação ou com aplicação biotecnológica.
No subprojeto “Prospecção de genes envolvidos na biorremediação
em DNA metagenômico de amostras de água da Cava de mineração e lagoa
de dejetos de uma região mineradora desativada” (Proc. n° 2014/07592-3),
amostras da água da Lagoa de dejetos e da Cava de mineração foram
coletadas de uma região utilizada para extração de minério no Centro de
Biodiversidade (CEBIO) da empresa VALE/SA. As amostras foram utilizadas
para o isolamento de bactérias por métodos tradicionais de cultivo e realizado
testes bioquímicos para a avaliação da produção de enzimas de interesse
biotecnológico, a identificação taxonômica dos isolados foi realizada através
do sequenciamento parcial do gene rRNA e a capacidade metabólica do
ecossistema foi avaliada pela técnica da Biolog Ecoplate, mostrando que os
microrganismos presentes na Lagoa de dejetos e na água da Cava de
mineração possuem um excelente desempenho quanto a degradação de
diferentes compostos. Recentemente realizou-se o sequenciamento do DNA
metagenomico da Região V4-V5 do Gene 16S rRNA para o estudo da
diversidade dos ambientes estudados.
Em outro subprojeto financiado pela FAPESP/VALE intitulado,
“Microbioma do solo em diferentes ambientes em áreas protegidas, com
remanescentes de Mata Atlântica e Cerrado, analisado por metagenômica”
(Proc.n° 2014/14234-6) está se analisando a diversidade bacteriana nos
solos estudados, através do sequenciamento do gene 16S rRNA dos
ecossistemas Mata Floresta, Mata Eucalipto, Canga, Cerrado e Solo de
Capim da cidade de Sabará MG. Os filos Proteobacteria, Actinobacteria,
Acidobacteria, Bacterioidetes e Plantomycetes, encontrados nas amostras de
solos foram os mais abundantes resultantes das análises de diversidade e,
representam bem a microbiota característica para cada ecossistema,
comparados com outros trabalhos de diversidade (Youssef and Elshahed,
2009). Com a utilização da técnica metagenômica, utilizando o
sequenciamento total do DNA dos ecossistemas estudados foi possível
comprovar as análises de diversidade, apresentando os mesmos filos
presentes em ambas as técnicas. Um resultado interessante das análises de
diversidade (gene 16S rRNA) e Metagenoma total foi a verificação da
similaridade dos microrganismos entre os ecossistemas, sendo Solo de
Capim sempre mais próximo a Canga, formando um grupo diferente aos
ecossistemas Mata Eucalipto, Mata Floresta e Cerrado. Através do
sequenciamento do Metagenoma total, da montagem e predição de ORFs
(Open Reading Frames) foi possível identificar mais de 2,8 milhões de ORFs.
Estes resultados foram organizados em um banco local que foi denominado
como Metagenoma Vale (MVDB) no Laboratório de Bioquímica de
Microrganimos e Planta (LBMP), contendo resultados da montagem,
anotação e filiação taxonômica. Com os resultados do banco local (MVDB)
também foi possível identificar ORFs para enzimas tais como Catalase,
Superóxido dismutase, Glutationa redutase, Glutationa-S-transferase e
Tiorredxoina, além de outros genes de interesse biotecnológico, para os
ecossistemas Mata Eucalipto, Mata Floresta, Canga, Cerrado e Solo de
Capim. Uma diversidade interessante de microrganismos que podem estar
envolvidos no processo de recuperação natural da flora e fauna local foram
identificados e isolados
O subprojeto “Prospecção de genes envolvidos na oxidação de ferro
em bibliotecas metagenômicas” (Proc FAPESP 2012/20022-6) cujo o objetivo
foi isolar microrganismos, caracterizar e avaliar uma aplicação em
bioacumulção e biorremoção de metais como cobre, cromo e níquel.
Adicionalmente foram realizadas análises de atividade metabólica e funcional
combinada com o objetivo de prospectar genes que conferem resistência a
cromo (crhA), cobre (copA, copB, cueO) e níquel (nixA). Dentre os isolados
obtidos, 11 deles apresentaram capacidade de crescer em metais, no
entanto, seis deles apresentaram resistência a quantidades elevadas de
metais (500 mg/L sendo que os isolados CP15 e CR11 apresentaram
potencial para aplicação em biorremoção e bioacumulação de metais. Na
caracterização a partir do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA, foram
identificados gêneros como, Burkholderia, Serratia, Bacillus,
Stenotrophomonas e Arthrobacter, que apresentam potencial para
biorremediação de metais do solo e água (Wani and Ayoola, 2015; Malaviya
and Singh, 2014; Gadd, 2000b). Os resultados de análises de diversidade
metabólica, mostraram que os solos dos biomas existem microroganismos
aptos a degradação de fontes de carbono, importantes nos ciclos
biogeoquímico e biorremediação. Nas análises de anotação do
metagenoma, os genes com maior número de ORFs foram encontrados nos
ecossistemas Canga e Floresta principalmente os envolvidos no processos
de resistência, influxo e efluxo de metais, como os genes de resistência a
cobre, Multicooper Oxidase ATPase, Multicopper ATPase Like, Cromium
Oxidase e Níquel Oxidase. Sendo assim os solos do quadrilátero ferrífero tem
bom potencial para biorremediação de metais tanto pela microbiota quanto
pelos genes funcionais.
O Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas (LBMP) têm
outros trabalhos desenvolvidos abordando a utilização de microrganismos
para a remoção de metais pesados. O projeto intitulado “Potencial
biotecnológico de rizóbios como bioemulsificante e biossorvente de cobre e
cromo” estudou a ação dos íons Cu2+ e Cr6+ no crescimento celular e
produção de EPS de quatro isolados de rizóbios [Rhizobium sp. (SEMIA
4064); Sinorhizobium meliloti (LMG 6125); Sinorhizobium arboris (LMG
11892) e Rhizobium tropici (JAB6)]. Com relação aos resultados da análise
de Concentração Mínima Inibitória (CMI), além de avaliar o potencial de
células não-vivas de rizóbios como bissorventes dos íons Cu2+ e Cr6+, em
solução aquosa de células mortas (Teng et al., 2015). O projeto
“Exopolissacarídeos de rizóbios aplicados como biossorventes de metais
pesados” é outra alternativa para o processo de biorremediação de água
contaminada por metais pesados. Neste trabalho utilizou-se
exopolissacarídeos (EPSs) produzidos por rizóbios como biossorventes dos
íons Cu2+ e Cr6+, em solução aquosa. Para isso quatro isolados do gênero
Mesorhizobium foram estudados: LBMP-T01 (Mesorhizobium huakuii),
LBMP-T02 (Mesorhizobium ciceri); LBMB-T03 (Mesorhizobium
mediterraneum) e LBMP-T04 (Mesorhizobium tianshanense). O potencial de
remoção dos íons cobre e cromo demonstraram estar diretamente
relacionado à concentração dos íons presentes na solução.
2. DESCRIÇÃO DOS PRINCIPAIS PROBLEMAS A SEREM ABORDADOS
Devido a grande quantidade de lama contendo rejeitos de mineração
que desceu pelo rio Doce, a biodiversidade local foi afetada, assim com o uso
de técnicas de biologia molecular, através do sequenciamento da região do
gene 16S rRNA, será possível elaborar uma análise da diversidade
microbiana independente de técnicas tradicionais de cultivo, baseado no
estudo do conjunto de genomas do ambiente em estudo.
Em ambientes que sofreram uma ação antropogênica, técnicas para
avaliar o perfil metabólico microbiano, como o Biolog Ecoplate possibilitam
hoje analisar não só a atividade metabólica, mas também avaliar a sua
diversidade, sendo uma técnica rápida e barata.
Solos com a presença de diferentes metais exercem uma pressão
adaptativa para bactérias resistentes ao metal, através do isolamento dessas
bactérias, será possível selecionar microrganismos para biorremediação e
recuperação dos ambientes impactados.
Neste contexto, um trabalho como objetivo de avaliar a diversidade
microbiana, isolar microrganismos, caracterizar e formular uma aplicação em
bioacumulção e biorremoção de metais como cobre, crômio e níquel é de
fundamental importância para estudos de biorremediação.
3. OBJETIVOS
Esta proposta tem como objetivo geral avaliar a diversidade
microbiana nas áreas ao longo do rio Doce, após o rompimento de uma
barragem de rejeito de mineração. Neste contexto, os seguintes objetivos
específicos são definidos
! Isolar culturas bacterianas das amostras de água e solo coletadas ao
longo do rio Doce;
! Isolar o DNA Metagenômico dos solos e águas residuais de áreas
coletadas pelo GIAIA;
! Avaliar a população bacteriana das áreas estudadas através de
sequenciamento em larga escala da região V4/V5 do gene 16S rRNA;
! Avaliar o perfil metabólico microbiano através do uso da ferramenta
Biolog Ecoplate;
! Prospectar genes codificadores de enzimas importantes em estudos
ambientais (biorremediação) e em diversos setores da indústria
biotecnológica e comparar os dados obtidos com aqueles observados
nos estudos proteômicos.
! Análise por meio de ferramentas de bioinformática das sequências de
DNA obtidas;
! Organizar todas as informações em um banco local para a realização
de outros trabalhos de pesquisa.
4. PLANO DE TRABALHO 4.1. Área de Estudo
Com o rompimento de uma barragem de rejeitos de mineração de
mineradora em Mariana – MG, um desastre ecológico devastou a cidade de
Mariana pela inundação de cerca de 55 milhões de metros cúbicos de lama,
onde essa lama desceu pelo rio Doce causando um desastre e matando toda
flora e fauna ao arredores do rio. Essa lama percorreu cerca de 500 km até
chegar ao mar, impedindo que várias cidades que usufruía da coleta de água
do rio fosse usado para abastecimento populacional.
Um grupo denominado GIAIA (http://giaia.eco.br) reuniu diversos
pesquisadores para elaborar um relatório dos problemas causados pelo
desastre, e assim coletas foram realizadas em determinados pontos da
barreira de Bento Gonçalves, do rio Doce até sua chegada ao mar.
4.2. Análise de diversidade bacteriana
A partir de estudos metagenômicos, é possível analisar a diversidade
de comunidades bacterianas de solos de mineração e de águas
residuárias com potencial biotecnológico e indicadores de impacto
ambiental e relacionar com a dinâmica dos ciclos biogeoquímicos. As
amostras de solo e água serão coletadas na área da mineradora, e será
feita extração de DNA Metagenômico de cada ponto coletado. Após esta
etapa bibliotecas com amplicons do gene 16S rRNA compreendendo as
regiões V4/V5 (Quince et al., 2011) serão construídas e sequenciadas.
Dessa forma pretende-se avaliar a diversidade microbiana destas áreas
por meio de técnicas de biologia molecular, além de compreender como
estas comunidades respondem aos diversos fatores ambientais em
diversos biomas, buscando assim não apenas entender a α diversidade
mais também a β diversidade.
4.3. Perfil Metabólico Microbiano
Devido a grande diversidade encontrada no solo e sua
microbiologia interagindo entre si, sendo responsáveis pela manutenção das
relações ecológica e da ciclagem de nutrientes, muito tem se investido na
utilização de microrganismos para aplicação biotecnológica bem como na
manutenção de ambientes e até mesmo na redução de compostos tóxicos
liberados, sendo assim os métodos biológicos surgem como uma alternativa
aos métodos convencionais sendo possível aproveitar a diversidade
microbiana e as interações desta comunidade, assim o Biolog® Ecoplate,
uma técnica que permite analisar a avaliação metabólica, diversidade e perfil
de atividade da comunidade microbiana em amostras de ecossistemas
ambientais, refletindo o estado da sua atividade pela utilização de diversas
fontes de carbono. Sendo esta, considerado como uma tecnologia que vem
complementar, através de propriedades biológicas, permitindo a
caracterização rápida do estado ecológico de amostras ambientais, como
solos ou água, avaliando assim o potencial de sua aplicação dos
microrganismos no processo de biorremediação.
4.4. Isolamento e caracterização de culturas bacterianas Para as amostras coletadas será realizado isolamento de
microrganismos visando a busca de isolados com potencial para
biorremediação de metais.
Com o objetivo de selecionar microrganismos que apresentassem
resistência a metais como cobre (Cu2+), cromo (Cr6+) e níquel (Ni+2) será
realizado um screening dos isolados. Os isolados que apresentarem colônias
após 48 h serão considerados positivos. Os dados serão plotados em tabelas
sendo positivo para presença de colônia e negativo para ausência.
4.5. Biorremoção e Biossorção de Metais Serão realizadas análises de biorremoção e biossorção, com os isolados
selecionados como resistente a maior concentração de metal dos testes de
concentrações mínima inibitória, sendo acrescidos em meio PGE
suplementado com metais por uma concentração inicial de Cu2+ , Cr6+ e Ni 2+
de 500 mg L-1. Os íons residuais de Cu2+ , Cr6+ e Ni 2+ no sobrenadante será
medido por um espectrofotômetro de absorção atômica-AAS. Testes
estatísticos serão aplicados para os valores das análises de biossorção e
biorremoção de metais.
5. CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO DO PROJETO
Pretende-se desenvolver o projeto segundo o cronograma abaixo, que
foi elaborado para um período de 12 meses.
ETAPAS 2016 2017 A M J J A S O N D J F M
Estudos das amostras de solo e água X X
Processamento das amostras X X X
Sequenciamento das amostras X X X X Análise dos dados do
sequenciamento das amostras X X X X X X X
Elaboração de artigos X X X
Elaboração do relatório X X X
6. MATERIAL E MÉTODOS 6.1. Áreas de estudo As amostras para a obtenção do DNA Metagenômico para estudo da
comunidade bacteriana e isolamento de genes de interesse biotecnológico
serão coletadas na área do Rio Doce e do seu entorno. Dez pontos foram
amostrados e coletados nos locais definidos de acordo com o grupo GIAIA,
figura 1.
Figura 1: Mapa representando o rio Doce e dos pontos sugeridos para coleta de amostras. Fonte: Mapa cedido pelo grupo GIAIA (http://giaia.eco.br).
Solos:
As amostragens serão realizadas em quadruplicata com auxílio de
trado de 10 polegadas de diâmetro e 20 centímetros de comprimento, o qual
será esterilizado para o início das coletas nos diferentes solos. Para cada
réplica de solo, serão realizadas 4 extrações de 0-20 cm.
Amostras de água do rio Doce:
Um ponto da região do rio Doce já foi coletado antes da passagem das
águas oriundas do rompimento da barragem de Fundão.
Outras amostras de água do rio Doce serão coletadas no local e de
cursos de água do rio. O número de locais a serem amostrados serão
definidos de acordo com a área em estudo. A coleta será realizada em
recipientes previamente esterilizados de 2L. As amostras serão retiradas de 5
diferentes pontos equidistantes entre si com profundidade de até 20 cm
abaixo da superfície (Gadanho et al., 2006). As amostras serão filtradas e o
resíduo utilizado para a extração de DNA Metagenômico.
6.2. Perfil de utilização de substrato em comunidades microbianas Biolog - Ecoplate®.
Alíquotas de 2,5g de solo ou amostras de água coletados serão
misturadas e posteriormente será adicionada a 190 ml de solução salina
0,85%, colocado em agitador orbital por 30 min, 200rpm 30°C.
Posteriormente será realizado uma diluição seriada e 120µl da diluição 10-3
serão adicionados às microplacas BIOLOG Ecoplates® (Biolog Inc. Harward,
California) . Para cada amostra será utilizada uma microplaca Biolog
contendo 31 fontes de carbono em triplicata, e 1 cavidade sem nenhuma
fonte de carbono, (controle negativo), além de corante indicador tetrazólio
violeta. As placas serão incubadas a 28°C por 48 horas. O crescimento
microbiano, avaliado pelo aumento da absorbância, será determinado por
espectrofotometria a 590 nm, em leitor de ELISA, por cinco dias. A
capacidade de utilizar uma fonte de C será determinada conforme Ibekwe
and Kennedy (1998), pela equação: WE = 100 (WA - W0)/W0, em que:
WE é o índice de desenvolvimento da cor, WA é a absorbância de cada
cavidade, e W0 é a absorbância do branco. A condição para que a reação
seja positiva é a de que WE seja superior a 100. Os valores normalizados
segundo a fórmula descrita, serão plotados em um gráfico Heatmap para
correlacionar as amostras e a degradação de fonte de carbono.
6.3. Extração do DNA metagenômico e amplificação do gene 16S rRNA
A extração do DNA total da comunidade microbiana presente no solo e
na água será realizada utilizando o FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101-
Quantum Biotechnologies), seguindo as instruções do fabricante. O DNA
metagenômico será usado na amplificação, por PCR, a região V4/V5 do gene
16S rRNA (Quince et al., 2011). Na reação serão utilizados os
oligonucleotídeos iniciadores com os adaptadores para tecnologia ION
(http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/) e as
condições acrescidas de modificações: Tampão PCR 1X [20 mM Tris-HCl
(pH 8,4 ), 50mM KCl], 200 µM de cada dntp, 2 mM de MgCl2, 1,25 U de Taq
Polimerase, 5 pmols de cada iniciador, 35 ng de DNA metagenômico e água
ultra pura completando o volume final de 50 µL na reação. O programa de
amplificação da reação consistirá de um passo a 94ºC por 2 min, 35 ciclos a
94°C por 30 seg, 55°C por 50 seg, 72°C por 2 min e 72°C por 5 min. As
bibliotecas para os amplicosn 16S rRNA serão preparados usando o Prepare
Amplicon Library without Fragmentation (Life technologies, USA) seguindo as
recomendações do fabricante. O sequenciamento será realizado em Ion
Torrent technology (Ion Torrent PGM Sequencer; Life Technologies,USA).
6.4. Análise de dados e Classificação taxonômica por 16S rRNA As leituras brutas geradas pelo sequenciamento serão aparadas da
presença de adaptadores, barcodes e primers usando os programas Scythe
0.991 (https://github.com/vsbuffalo/scythe) e Cutadapt 1.7.1 (Martin, 2011).
Segmentos de sequências contaminantes e regiões de baixa qualidade serão
removidos com o programa Prinseq (http://prinseq.sourceforge.net). Os
dados filtrados serão analisados com o programa Mothur v.1.35.0. O
alinhamento das sequências será realizado contra o banco de dados SILVA
rRNA database Project (Quast et al., 2013) e a matriz de distâncias será
construída usando a opção de penalidade one gap. A afiliação das
sequências será realizada usando o banco de dados Ribosomal Database
Project (RDP II) (Cole, 2004) para as distâncias de 80% (Filo), 95% (gênero)
e 97% (espécie) de similaridade entre as sequências (Upchurch et al., 2008).
Também serão realizadas análises (97% de similaridade) de dissimilaridade
do índice Jaccard/Thetayc, diagrama de Venn, libishuff, Unifrac com média
ponderada, Escalonamento Multidimensional Não-Métrico (NMDS), Análise
de Componentes Principais (PCoA) e Amova aplicando-se Mothur.
6.5. Isolamento e caracterização de culturas bacterianasPara as amostras coletadas será realizada isolamento de
microrganismos visando a busca de isolados com potencial para
biorremediação de metais. Alíquotas de 2,5g de solo e água dos pontos
coletados, serão adicionadas à 190 mL de solução salina 0,85 % e colocando
em agitador orbital por 30 min, 200 xg 30 °C. Posteriormente serão
realizadas diluições seriadas até 10-4. Da diluição 10-3serão transferido 100
µL para placas de petri contendo meio sólido PGE com ciclohexamida. Após
24 h, colônias com aparência morfológica diferente serão coletadas e
adicionadas em PGE líquido. Após o mesmo tempo, de 24 h de
desenvolvimento, colônias serão coletadas e adicionadas em tubos SIGMA
contendo 5mL de meio PGE e colocadas em agitador orbital por 24 h, 200
rpm 30 °C. Posteriormente 100 µL desta cultura serão adicionados em placas
para avaliar pureza e a seguir feito solução estoque destas amostras.
Com o objetivo de selecionar microrganismos que apresentassem
resistência a metais como cobre (Cu2+), cromo (Cr6+) e níquel (Ni+2) será
realizado um screening dos isolados. Todos os isolados serão incialmente
acrescidos em 5ml de meio PGE em tubos tipo sigmaware (Sigma CAT Nº
5916) por 48 h a 28°C, posteriormente 100 µL será adicionado em 5 mL de
meio PGE suplementado com os metais a 50mg L-1 e após 48 h de cultivo
serão feitas leituras em espectrofotômetro Eppendorf (DO600nm).
Posteriormente os isolados que apresentaram DO600nm entre 0,6 e 1 serão
adicionados 10 µL em placas de petri contento meio PGE com cobre, crômio
e níquel em uma concentração de 50 mg L-1, Os isolados que apresentarem
colônias após 48 h serão considerados positivos. Os dados serão plotados
em tabelas sendo positivo para presença de colônia e negativo para
ausência.
6.6. Biorremoção e Biossorção de Metais
Para os ensaios de biorremoção, os isolados selecionados como
resistente a maior concentração de metal dos testes de concentrações
mínima inibitória, 500 mg L-1 serão acrescidos em meio PGE suplementado
com metais por uma concentração inicial de Cu2+ , Cr6+ e Ni 2+ de 500 mg L-1.
Após 48 h, 96 h, 144 h e 192 h de cultivo as amostras serão centrifugadas a
12.000 xg, e as células serão lavadas e submetidas a digestão
nitroperclórica, diluindo a digestão em 5x. Os íons residuais de Cu2+ , Cr6+ e
Ni 2+ no sobrenadante será medido por um espectrofotômetro de absorção
atômica-AAS, após centrifugação a 10.000 xg durante 10 min.
Análises de biossorção será constituídas por uma concentração inicial de
Cu2+ , Cr6+ e Ni 2+ de 500 mg L-1 com concentrações de células que variaram
0,1 g L-1 de peso seco. O pH será ajustado para 5,0 para Cu2+, 4,0 para Cr6+e
5,0 para Ni2+, as amostras serão agitadas a 150 × g a 28 °C por 48 h, 96 h,
144 h e 192 h (Lasheen et al., 2012; Xia et al., 2013). Os íons residuais de
Cu, Cr e Ni no sobrenadante, serão medidos por um espectrofotômetro de
absorção atômica-AAS, após centrifugação a 10.000 × g durante 10 min. Os
valores da capacidade de biossorção e taxa de remoção de Cu2+,Cr6+ e Ni2+
serão avaliados da seguinte forma (Chen et al., 2014).
𝑞𝑒 = 𝐶0 − 𝐶𝑒
𝑇𝑎𝑥𝑎 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑚𝑜çã𝑜 % =𝐶0 − 𝐶𝑒 ∗ 100
𝐶0
Onde qe é a capacidade de adsorção dos metais de Cu2+ e Cr6+
concentração no biossorvente (mg do metal g-1 de peso seco de
biossorvente); C0 é a concentração inicial de íon metálico (mg L-1), Ce é a
concentração residual do metal na solução em equilíbrio com o biossorvente
(mg L-1).
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