automatização do processo de extracção em fase sólida para ... · automatização do processo...

Sara Cristina Magalhes Monteiro

Automatizao do processo de extraco em

fase slida para a determinao de

compostos fenlicos em alimentos

Dissertao do 2 Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de Mestre

em Controlo de Qualidade

Orientador: Doutora Marcela Alves Segundo

Co-orientador: Professor Doutor Jos Lus Fontes da Costa Lima

Setembro de 2010

autorizada a reproduo integral desta Dissertao apenas para efeitos de

investigao, mediante declarao escrita do interessado, que a tal se compromete.

ii

Agradecimentos

instituio Faculdade de Farmcia da Universidade do Porto, por me ter admitido como

aluna do Mestrado em Controlo de Qualidade.

Ao Prof. Doutor Jos L. F. da Costa Lima, pela superviso deste trabalho, por me ter

dado a conhecer o tema do mesmo e pelo apoio pedaggico e cientfico ao longo do

Mestrado.

Doutora Marcela A. Segundo, pela oportunidade de realizar este trabalho, pela

amizade, orientao, conhecimento cientfico, disponibilidade e empenho fundamentais

na execuo e escrita deste trabalho e pela pacincia e motivao constantes.

Ao Doutor Lus M. Magalhes, pela disponibilidade, conhecimento cientfico e apoio

essenciais na concretizao experimental deste trabalho.

Ao Doutor Hugo M. Oliveira, pela disponibilidade e apoio na concretizao experimental

no incio deste trabalho.

A todos as pessoas que integram o laboratrio de Qumica-Fsica, pelo companheirismo

demonstrado e pelo bom ambiente de trabalho proporcionado.

Aos meus colegas de Mestrado, pela amizade e convivncia ao longo do mesmo.

Aos meus pais, pelo carinho, dedicao e apoio incondicionais, pelo contributo nico e

essencial minha formao e pelo incentivo ao conhecimento e valorizao pessoal.

Ao Nuno Cascais, pelo amor, pacincia e apoio incondicionais e pela motivao na minha

realizao pessoal.

A todos que, de alguma forma, colaboraram na realizao deste trabalho.

Resumo

iii

Resumo

O principal objectivo do trabalho apresentado na presente dissertao foi a

implementao de um sistema lab-on-valve (LOV) associado ao conceito de bead

injection aplicado extraco em fase slida de compostos fenlicos presentes em

amostras alimentares, seguida pela quantificao atravs do mtodo de Folin-Ciocalteu.

Foi desenvolvido um ciclo analtico automtico contendo as principais etapas do processo

de extraco em fase slida, incluindo neste caso tambm a formao da coluna de

adsorvente OASISTM HLB num dos canais do dispositivo LOV. Foi efectuada a avaliao

da reteno dos compostos na coluna utilizando o cido glhico como composto modelo.

Neste caso foi avaliada a influncia da composio da matriz da amostra e da soluo

transportadora usada na remoo da matriz. Tambm foi avaliada a eficincia da eluio

recorrendo a distintos eluentes. A utilizao de padres acidificados com HCl 10 mM, o

uso de gua com transportador e a utilizao da soluo eluente composta por metanol

50% (v/v) + hidrxido de sdio 10 mM foram as condies escolhidas para posterior

aplicao amostras.

O procedimento automtico desenvolvido foi aplicado a outros compostos fenlicos

(cido cafeico, galhato de octilo, quercetina e cido tnico), a um composto no-fenlico

(cido ascrbico), reactivo e quantificvel pelo mtodo de Folin-Ciocalteu, e a amostras

de vinho tinto e sumo de laranja. Os resultados obtidos para os compostos testados

evidenciaram a reteno selectiva dos compostos fenlicos e a no-reteno do cido

ascrbico, tendo sido possvel estimar a contribuio dos compostos fenlicos na

capacidade redutora das amostras atravs do mtodo de Folin-Ciocalteu.

Palavras-chave : compostos fenlicos, extraco em fase slida, sistema automtico lab-

on-valve, mtodo de Folin-Ciocalteu

Abstract

iv

Abstract

The main objective of the work presented in this dissertation was the development of a

lab-on valve (LOV) system associating the bead injection concept for application to solid

phase extraction of phenolic compounds in food samples, followed by their quantification

using the Folin-Ciocalteu method.

An analytical cycle comprising the main steps present on solid phase extraction protocols

was implemented, including also the on-line formation of OASISTM HLB sorbent column

inside one of the channels of LOV device. The retention of phenolic compounds on this

sorbent was evaluated using gallic acid as model analyte under different sample matrix

and carrier solution compositions. Elution efficiency was also assessed for different

eluents. Application to samples was attained using standard solutions prepared in HCl 10

mM, water as carrier and methanol 50% (v/v) + sodium hydroxide 10 mM as eluent.

The automatic protocol was applied to several phenolic compounds (caffeic acid,

octylgallate, quercetin and tannic acid), to a non-phenolic compound (ascorbic acid),

which reacts with and can be quantified by Folin-Ciocalteu method, and also to red wine

and orange juice samples. Results obtained showed that phenolic compounds were

retained selectively and ascorbic acid was not retained, which allowed the estimation of

phenolics contribution to the Folin-Ciocalteu reducing index for antioxidant assessment.

Keywords : phenolic compounds, solid phase extraction, automatic system lab-on-valve,

Folin-Ciocalteu method

ndice

v

ndice

Abreviaturas e smbolos.................................................................................................... x

1. Introduo ..................................................................................................................... 2

1.1. Extraco em fase slida ......................................................................................... 2

1.2. Automatizao da extraco em fase slida recorrendo a sistemas lab-on-valve

associados ao conceito bead injection ............................................................................ 4

1.2.1. Sistemas lab-on-valve ......................................................................................... 5

1.2.2. Conceito bead injection ....................................................................................... 6

1.3. Determinao da capacidade antioxidante............................................................... 9

1.3.1. Mtodos baseados na capacidade antioxidante total ............................................. 9

1.3.2. Capacidade antioxidante baseada no mtodo de Folin-Ciocalteu ........................ 11

1.4. Enquadramento e objectivos .................................................................................. 12

2. Material e mtodos...................................................................................................... 14

2.1. Reagentes e solues............................................................................................ 14

2.1.1. Solues usadas na preparao das amostras/padres...................................... 14

2.1.2. Preparao das solues padro......................................................................... 15

2.1.3. Preparao das amostras .................................................................................... 16

2.1.4. Solues usadas no sistema LOV-BI ................................................................... 16

2.1.5. Solues usadas no mtodo Folin-Ciocalteu ....................................................... 16

2.2. Instrumentao .................................................................................................... 17

2.3. Procedimento automtico de extraco em fase slida ....................................... 19

2.3.1. Formao da coluna extractora e condicionamento do adsorvente...................... 20

2.3.2. Carregamento da amostra e remoo da matriz .................................................. 21

ndice

vi

2.3.3. Eluio dos compostos retidos no adsorvente ..................................................... 22

2.3.4. Descarte das partculas de OasisTM HLB ............................................................. 23

2.4. Procedimento para avaliao da capacidade redutora pelo mtodo de Folin-

Ciocalteu ......................................................................................................................... 24

3. Resultados e discusso............................................................................................... 26

3.1. Implementao do protocolo de extraco em fase slida no sistema BI-LOV .... 26

3.2. Estudo das condies do processo de extraco................................................. 28

3.2.1. Estudo do perfil de no-reteno (breakthrough)............................................... 28

3.2.2. Estudo da composio do eluente ....................................................................... 40

3.3. Aplicao do procedimento de extraco automtica .......................................... 48

3.3.1. Aplicao a compostos puros .............................................................................. 48

3.3.2. Aplicao a amostras........................................................................................... 55

4. Concluses ................................................................................................................. 61

5. Referncias Bibliogrficas ........................................................................................... 64

ndice de figuras

vii

ndice de figuras

Figura 1.1. Dispositivo Lab-on-valve ............................................................................ 6

Figura 1.2. Representao esquemtica do sistema hifenizado MSFIA-HPLC ............... 8

Figura 2.1. Montagem laboratorial do sistema de fluxo................................................. 17

Figura 2.2. Mdulos LOV e multi-seringa...................................................................... 18

Figura 2.3. Leitor de micro-placas e computador .......................................................... 19

Figura 2.4. Vista pormenorizada da vlvula LOV e respectivas portas/canais .............. 20

Figura 3.1. Representao da percentagem de no-reteno (breakthrough) do cido

glhico em funo da alimentao de alquotas consecutivas de 1000 L contendo 20

mg L-1 de cido glhico ................................................................................................... 30

Figura 3.2. Representao da percentagem de no-reteno (breakthrough) do cido

glhico em funo da alimentao de alquotas consecutivas de 1000 L contendo 5 mg

L-1 de cido glhico ......................................................................................................... 34

ndice de tabelas

viii

ndice de tabelas

Tabela 1.1. Principais caractersticas dos mtodos especficos para radicais estveis e

no biolgicos e para avaliao da capacidade de reduo total .................................... 11

Tabela 2.1. Protocolo experimental do carregamento das partculas adsorventes e

condicionamento da coluna............................................................................................. 21

Tabela 2.2. Protocolo experimental do carregamento da amostra e remoo da matriz

........................................................................................................................................ 22

Tabela 2.3. Protocolo experimental da eluio dos compostos retidos no adsorvente... 23

Tabela 2.4. Protocolo experimental correspondente ao descarte das partculas de

OasisTM HLB e limpeza do canal da coluna..................................................................... 23

Tabela 3.1. Resumo das variveis estudadas na experincia para a determinao do

perfil de pr-eluio (breakthrough) de uma soluo contendo 20 mg L-1 de cido

glhico......... ................................................................................................................... 29

Tabela 3.2. Valores de concentrao de cido glhico (mg L-1) obtidos para cada uma

das alquotas recolhidas nos ensaios A a E referentes ao estudo da pr-eluio

observada para uma soluo padro contendo 20 mg L-1 de cido glhico..................... 29

Tabela 3.3. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) que no foi retido

durante a alimentao da coluna de adsorvente com 5 alquotas sucessivas de 1000 L

de uma soluo de cido glhico 20 mg L-1..................................................................... 30

Tabela 3.4. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) pr-eluda durante a

operao de remoo da matriz da amostra e para a massa de cido glhico (g) eluda

com uma alquota de 300 L de metanol, resultantes da alimentao de uma soluo de

20 mg L-1 ......................................................................................................................... 31


das alquotas recolhidas nos ensaios A-E referentes ao estudo da pr-eluio

observada para uma soluo padro contendo 5 mg L-1 de cido glhico....................... 33

ndice de tabelas

ix



de uma soluo de cido glhico 5 mg L-1....................................................................... 34

Tabela 3.7. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) pr-eluda durante a

operao de remoo da matriz da amostra e para a massa de cido glhico (g) eluda

com uma alquota de 300 L de metanol, resultantes da alimentao de uma soluo de

5 mg L-1 ........................................................................................................................... 35


das alquotas recolhidas nos ensaios B e E referentes ao estudo da pr-eluio

observada para uma soluo padro contendo 5 mg L-1 de cido glhico....................... 36



de uma soluo de cido glhico 5 mg L-1 para os ensaios B e E ................................... 36

Tabela 3.10. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) pr-eluda durante

a operao de remoo da matriz da amostra e para a massa de cido glhico (g)

eluda com uma alquota de 300 L de metanol, resultantes da alimentao de uma

soluo de 5 mg L-1 nos ensaios B e E ........................................................................... 37


das alquotas recolhidas nos ensaios B e E, realizados em triplicado, referentes ao

estudo da pr-eluio observada para uma soluo padro contendo 5 mg L-1 de cido

glhico............................................................................................................................. 38



de uma soluo de cido glhico 5 mg L-1 para os ensaios B e E, realizados em

triplicado.......................................................................................................................... 39

Tabela 3.13. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) pr-eluda durante

a operao de remoo da matriz da amostra e para a massa de cido glhico (g)

eluda com uma alquota de 300 L de metanol .............................................................. 39


das alquotas recolhidas nos ensaios B, G e H, realizados em duplicado, referentes ao

ndice de tabelas

x

estudo da composio do eluente aplicado a uma soluo padro contendo 5 mg L-1 de

cido glhico ................................................................................................................... 42

Tabela 3.15. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) eluda com duas

alquota de 300 L de metanol (ensaio B), metanol 50% (v/v) + NH4OH 5% (v/v) (ensaio

G) e metanol 50% (v/v) (ensaio H) .................................................................................. 43




cido glhico. A um dos ensaios (acid.) foi adicionado HCl imediatamente aps a

eluio da coluna extractora............................................................................................ 44

Tabela 3.17. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) eluda com a

primeira alquota de 300 L de metanol (ensaio B), metanol 50% (v/v) + NH4OH 5%(v/v)

(ensaio G) e metanol 50% (v/v) (ensaio H), incluindo ou no cido logo a seguir

eluio............................................................................................................................. 45




cido glhico. A um dos ensaios (acid.) foi adicionado HCl imediatamente aps a

eluio da coluna extractora (repetio).......................................................................... 47


primeira alquota de 300 L de metanol (ensaio B), metanol 50% (v/v) + NH4OH 5%(v/v)

(ensaio G) e metanol 50% (v/v) (ensaio H), incluindo ou no cido logo a seguir

eluio (repetio)........................................................................................................... 48


das alquotas recolhidas para o processamento das solues padro A-D, realizados

em duplicado................................................................................................................... 49


primeira alquota de 300 L de eluente para solues padro com diferentes

concentraes de cido glhico ...................................................................................... 50

ndice de tabelas

xi

Tabela 3.22. Valores de concentrao de cido cafeico (mg L-1) obtidos para cada uma

das alquotas recolhidas nos ensaios realizados em triplicado referentes a este

composto ........................................................................................................................ 51

Tabela 3.23. Valores de concentrao de galhato de octilo (mg L-1) obtidos para cada

uma das alquotas recolhidas nos ensaios realizados em triplicado referentes a este

composto ........................................................................................................................ 51

Tabela 3.24. Valores de concentrao de quercetina (mg L-1) obtidos para cada uma


composto ........................................................................................................................ 51

Tabela 3.25. Valores de concentrao de cido tnico (mg L-1) obtidos para cada uma


composto ........................................................................................................................ 52

Tabela 3.26. Valores de concentrao de cido ascrbico (mg L-1) obtidos para cada

uma das alquotas recolhidas nos ensaios realizados em triplicado referentes a este

composto ........................................................................................................................ 52

Tabela 3.27. Valores calculados para a massa dos compostos testados (g) nas vrias

etapas do procedimento de extraco em fase slida ..................................................... 54

Tabela 3.28. Valores de concentrao em equivalentes de cido glhico (mg L-1)

obtidos para cada uma das alquotas recolhidas nos ensaios realizados em triplicado

referentes amostra A.................................................................................................... 56



referentes amostra B.................................................................................................... 56



referentes amostra C.................................................................................................... 57



referentes amostra D.................................................................................................... 57

ndice de tabelas

xii



referentes amostra E.................................................................................................... 57



referentes amostra F .................................................................................................... 58

Tabela 3.34. Valores calculados para a massa equivalente em cido glhico (g) para

as amostras testadas nas vrias etapas do procedimento de extraco em fase slida . 59

Abreviaturas e smbolos

xiii


ABTS 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)

BI bead injection

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

DPR desvio-padro relativo

E1/2 potencial de oxidao

EC concentrao eficiente

Etc. et cetera

FC Folin-Ciocalteu

FIA anlise por injeco em fluxo (do ingls flow injection analysis)

FRAP poder frrico de reduo antioxidante (do ingls ferric reducing antioxidant power)

HPLC cromatografia lquida de alta eficincia (do ingls high-performance liquid

chromatography)

KD coeficiente de distribuio

Ia intensidade da corrente andica

LD limite de deteco

LOV lab-on-valve

MSFIA anlise por injeco em fluxo baseada em multi-seringa (do ingls multisyringe

flow injection analysis)

n.a. no aplicvel

n.d. no detectvel

PTFE politetrafluoroetileno

R coeficiente de correlao

RSE eficincia de captao do radical (do ingls radical scavenging efficiency)


xiv

RNS espcies reactivas de azoto (do ingls reactive nitrogen species)

ROS espcies reactivas de oxignio (do ingls reactive oxigen species)

SIA sistema de anlise por injeco sequencial (do ingls sequential injection analysis)

SPE extraco em fase slida (do ingls solid-phase extraction)

TEAC capacidade antioxidante de equivalentes de Trolox. (do ingls Trolox equivalent

antioxidant capacity)

Introduo

Introduo

2

1. Introduo

Quando colocado um problema na rea da qumica analtica e a soluo envolve a

anlise de uma ou mais amostras, atravs de um ou vrios mtodos e recorrendo a

determinados equipamentos, estas amostras tm, antes de mais, uma composio

muitas vezes desconhecida. Por outro lado, pode-se dizer que qualquer amostra

complexa, constituda por diversos compostos qumicos e o seu aspecto fsico poder ser

varivel. Os analitos existentes na amostra e que so objecto de estudo podero tambm

estar em quantidades variveis e desconhecidas. de todo o interesse encontrar uma

forma de os separar de possveis compostos interferentes e/ou de os pr-concentrar,

para que o sinal analtico obtido atravs do mtodo de determinao corresponda

claramente ao(s) analito(s) em estudo e seja, tanto quanto possvel, detectvel e

quantificvel.

Neste contexto, a preparao prvia da amostra deveras importante e dever ter em

conta os seguintes aspectos: natureza das amostras (quer em termos de complexidade,

quer em termos do estado fsico), analitos de interesse e a sua concentrao prevista na

amostra, o mtodo de anlise e respectivo limite de deteco, alm da preciso e da

exactido pretendidas [1]. Existem diversos mtodos de tratamento de amostras, tais

como lavagem, secagem, moagem, filtrao, cromatografia preparativa, extraco

lquido-lquido, diluio, solubilizao, dilise, extraco em fase slida, entre outros. O

tratamento seleccionado depende do estado inicial da amostra, do tipo de amostra, dos

analitos em estudo, do mtodo de determinao e dever ser executado com rigor, para

que no ocorram erros devido a perdas ou contaminaes.

Tendo em conta o assunto desenvolvido nesta dissertao, a extraco em fase slida

como tratamento para preparao da amostra previamente etapa de determinao, e

tambm a automatizao deste tratamento atravs da associao do sistema lab-on-

valve ao conceito bead injection (LOV-BI) sero particularizadas nas seces 1.1 e 1.2.

Na seco 1.3 sero discutidos os procedimentos para determinar a capacidade

antioxidante, tambm objecto de estudo deste trabalho, e na seco 1.4 sero

clarificados os objectivos propostos neste trabalho.

1.1. Extraco em fase slida

A extraco em fase slida com aplicao analtica surgiu apenas na dcada de 70 do

sculo passado, apesar da sua existncia remontar poca medieval, onde j se

Introduo

3

utilizaria este conceito para extrair fragrncias volteis das ptalas de rosa, incorporando-

as em parafina [2]. Esta tcnica de preparao consiste num processo que envolve a

passagem de uma soluo que contm o composto de interesse atravs de uma coluna

empacotada com uma fase slida. O composto de interesse vai distribuir-se entre a

amostra no estado lquido e a fase slida (sendo adsorvido na sua superfcie) atingindo-

se, assim, um equilbrio. Este equilbrio pode ser traduzido por um coeficiente de

distribuio (KD), que corresponde fraco que ficou adsorvida na fase slida sobre a

fraco do analito que permaneceu na soluo, ou seja, ser o quociente entre a

actividade do analito adsorvido e a actividade do analito presente na soluo, ou ainda, a

concentrao do analito adsorvido sobre a concentrao do analito na soluo [2].

etapa de total adsoro na fase slida, d-se o nome de reteno. Aps a concretizao

desta etapa, segue-se a eluio, que consiste na dessoro do analito, ou seja, a sua

remoo da fase slida e posterior recolha para a anlise. Para tal, recorre-se a uma

soluo denominada solvente de eluio ou eluente, qual o analito tem mais afinidade

qumica e que arrastar o mesmo para o recipiente de recolha colocado sada da

coluna. Este eluente pode ser um reagente orgnico ou aquoso, mesmo quando a

amostra aquosa, pois estes no entram em contacto directo durante a extraco em

fase slida. No entanto, se a matriz e possveis interferentes tiverem ficado retidos na

fase slida, estes podero tambm ser eludos e, desta forma, influenciarem

significativamente os resultados analticos. Realiza-se, neste caso, uma etapa intermdia

de limpeza, entre a reteno e a eluio, utilizando para o efeito uma soluo de lavagem

apropriada, que ir arrastar os compostos interferentes e eliminar a matriz. Assim sendo,

os objectivos desta tcnica preparativa so: concentrao do(s) analito(s), remoo dos

compostos indesejveis da amostra (etapa de limpeza, ou do ingls clean-up) e

remoo da matriz da amostra [2].

importante referir que a extraco em fase slida raramente utilizada sem recorrer a

outros tratamentos, nomeadamente a diluio ou ajuste de pH da amostra. No entanto,

esta tcnica permite reduzir substancialmente outros tratamentos que seriam necessrios

para isolar os compostos-alvo e que so mais morosos, tal como a dilise ou a extraco

lquido-lquido.

Existem diversos adsorventes que se podem utilizar, dependendo da aplicao

pretendida, tais como: slica, alumina (utilizados principalmente antes da cromatografia

lquida de alta eficincia), grafite e adsorventes polimricos [2]. Estes ltimos so

materiais totalmente orgnicos, obtidos a partir da polimerizao de um composto, como,

por exemplo, o estireno. No final, obtm-se um adsorvente esfrico que adequado para

Introduo

4

a extraco em fase slida. A principal vantagem destes materiais polimricos consiste

na sua capacidade de suportar condies extremas de pH, o que no possvel com

adsorventes de slica. Vrios materiais polimricos funcionalizados que possuem

propriedades apolares tm sido sintetizados nas duas ltimas dcadas, como o caso da

OasisTM (Waters Inc. Milford, Massachusetts). Estes oferecem uma forte reteno para

compostos de elevada polaridade, tais como os fenlicos, que so objecto de estudo

deste trabalho.

Actualmente existe uma grande variedade de adsorventes comercialmente disponveis,

empacotados em cartuchos, colunas ou mesmo em microplacas com 96 poos. As

quantidades de adsorvente existente em cada um destes dispositivos so distintas e

adequadas a determinados volumes de amostra. A automatizao do processo de

extraco em fase slida geralmente baseada na utilizao de estaes robticas, que

requerem um investimento financeiro elevado em termos de aquisio e manuteno, ou

recorre ao acoplamento em linha de colunas ao equipamento de cromatografia lquida [3].

Neste ltimo caso, a eluio efectuada com a fase mvel e o adsorvente no

renovado entre amostras, o que suscita problemas relacionados com a possvel

contaminao entre amostras consecutivas [4].

1.2. Automatizao da extraco em fase slida recorrendo a sistemas lab-on-valve

associados ao conceito bead injection

De todas as etapas da sequncia analtica, a etapa de tratamento da amostra , sem

dvida, a que mais interesse suscita no controlo de erros analticos pelo elevado registo

de ocorrncia dos mesmos. Para alm disso, a etapa mais morosa e que consome

mais recursos (reagentes, horas de trabalho do operador). Por estas razes, desejvel

que durante esta etapa ocorra uma menor interveno do operador, um menor nmero

de operaes possvel e uma maior celeridade em todo o processo de modo a evitar a

perda de analito e degradao da amostra. Neste contexto, as tcnicas de fluxo

baseadas na anlise por injeco em fluxo (FIA, do ingls flow injection analysis) [5]

possibilitaram a automatizao de algumas, seno todas, etapas do tratamento da

amostra [6,7].

A partir da introduo dos computadores nos laboratrios durante a dcada de 90, a

tcnica FIA evoluiu para a anlise por injeco sequencial (SIA, do ingls sequential

injection analysis) [8], baseada no conceito de um canal nico, central, a partir de onde

as solues so distribudas para canais perifricos atravs da inverso do fluxo do

Introduo

5

transportador. A miniaturizao da tcnica SIA originou os sistemas LOV, particularizados

na seco seguinte.

1.2.1. Sistemas lab-on-valve

No sentido de automatizar etapas do procedimento analtico e de manipular solues

numa escala microfludica, foram propostos os sistemas LOV (do ingls lab-on-valve)

em 2000 [9]. Estes sistemas permitem a manipulao precisa de volumes da ordem dos

microlitros (1 20 L) e o acoplamento do detector directamente pea atravs da

utilizao de fibras pticas [10] ou elctrodos [11]. Estes sistemas baseiam-se na

utilizao de uma pea monoltica com microcanais gravados na mesma, ajustada ao

rotor de uma vlvula de seleco comercial de um sistema SIA, onde possvel

programar o sentido do fluxo, e a quantidade e o caudal de manipulao das solues

(Figura 1.1). Amostra e reagente(s) so aspirados atravs da vlvula de seleco para

um reactor de armazenamento (do ingls holding coil), onde ocorre a mistura e reaco.

Aps inverso do fluxo, a mistura enviada para o detector onde ser analisada ou para

outro dispositivo colocado numa das portas perifricas. O uso de uma vlvula multi-

posicional possibilita o acesso a diversas portas perifricas, s quais podero estar

ligados os reservatrios com reagentes e amostra, o detector, ou outros dispositivos. Esta

proximidade entre a zona de mistura entre reagente e amostra e o detector facilita a

aplicao de volumes reduzidos, minimizando a disperso e a aplicao em micro-escala

de reaces j usadas noutros sistemas em fluxo, sem perda de sensibilidade. Uma

caracterstica relevante destes sistemas a reduo do consumo de reagentes e de

resduos gerado que possibilita uma diminuio dos custos operacionais. Outra

caracterstica relevante dos sistemas lab-on-valve a de que podem ser associados ao

conceito de bead injection, particularizado na seco seguinte.

Introduo

6

Figura 1.1. Dispositivo Lab-on-valve posicionado numa vlvula de seleco de 6 portas [9]. Copyright The

Royal Society of Chemistry 2000

1.2.2. Conceito bead injection

Conforme mencionado anteriormente, os sistemas lab-on-valve transpuseram a

manipulao de solues para uma escala micro-fludica e, associado a estes sistemas,

est frequentemente o conceito bead injection. Apresentado em 1999, atravs da

utilizao de uma clula de fluxo dedicada (do ingls jet ring cell), consiste na

manipulao de suspenses de partculas (10 200 m) no interior dos sistemas de

fluxo, partculas estas que podem servir como veculos de reagentes ou de grupos

funcionais [12]. Um dos aspectos mais relevantes est relacionado com a utilizao

renovvel desta fase slida, dado que possvel introduzir as partculas suspensas numa

das portas laterais do sistema LOV, formando uma micro-coluna de fase slida in situ

por restrio fsica da sada do canal atravs de um filtro ou tubo estreito de material

inerte. Esta coluna pode ser usada para extraco/pr-concentrao de compostos

presentes na amostra [13], como reactores contendo clulas vivas [14] ou mesmo como

fase estacionria para cromatografia de imuno-afinidade [15].

A extraco em fase slida sem dvida uma tcnica de tratamento de amostra

frequentemente automatizada recorrendo a tcnicas de fluxo, dada a sua elevada

capacidade de separao e pr-concentrao e consumo mnimo de solventes orgnicos.

No entanto, as colunas empacotadas reutilizveis utilizadas convencionalmente

Introduo

7

apresentam diversos problemas j mencionados, tais como a contaminao entre

amostras consecutivas (efeito carry-over), contraco ou expanso do leito de

adsorvente, perda dos grupos responsveis pela reteno do analito e, finalmente,

adsoro de espcies interferentes. Estes inconvenientes podem ser eliminados

recorrendo ao uso de colunas renovveis, atravs do conceito de bead injection, onde a

fase slida pode ser renovada em cada ciclo analtico [16].

De modo a garantir a reprodutibilidade das partculas slidas no sistema automtico,

imperativo assegurar a homogeneidade do tamanho e da utilizao de partculas com

forma esfrica, sendo por isso difcil a utilizao de colunas empacotadas com fase

reversa C18 ou de slica gel, dada a irregularidade da forma das partculas e na

distribuio de tamanhos. No entanto, o uso de agarose ou de alguns polmeros

comerciais, como por exemplo o OasisTM, exequvel pela sua forma e tamanho

uniforme. Recentemente, foram propostas novas estratgias para a manipulao da fase

slida no interior dos micro-canais do dispositivo LOV que permitem o uso de qualquer

tipo de adsorvente, independentemente da sua forma ou regularidade do tamanho da

partcula [17]. Neste caso, a aplicao de um passo de ressuspenso antes da recolha da

fase slida para o canal central revelou-se fulcral para a obteno de um empacotamento

posterior repetvel num dos canais laterais do dispositivo LOV.

Os sistemas de fluxo baseados em LOV-BI tm demonstrado um potencial significativo

na anlise ambiental, nomeadamente na remoo da matriz em lixiviados [18,19] e

enriquecimento do analito alvo [19,20], atravs de micro-colunas empacotadas numa das

portas da vlvula multiposicional. A aplicao rea alimentar tem sido mais limitada,

existindo vrios exemplos da aplicao dos sistemas LOV rea alimentar [21-23], mas

apenas uma aplicao recente conjugando LOV e BI [24].

Em 2010 foi proposto um mtodo hifenizado, engoblando um sistema LOV-BI e

cromatografia lquida de alta eficincia para determinao de riboflavina em alimentos,

nomeadamente amostras de leite infantil, fgado de porco e bebidas energticas [24]. Foi

implementada a extraco em fase slida como tratamento prvio da amostra recorrendo

a um polmero de impresso molecular comercial, selectivo riboflavina. O procedimento

automtico foi baseado no conceito de bead injection, executado num dispositivo lab-

on-valve (LOV) e utilizando como unidade de propulso uma bureta multi-seringa para

manuseamento das solues e da suspenso de fase slida, conforme representado na

Figura 1.2. O protocolo para preparao da amostra consistiu na formao de uma micro-

coluna num dos canais laterais do dispositivo LOV, por onde a amostra foi percolada,

ocorrendo a reteno da riboflavina. Seguiu-se a eluio deste composto com 50% (v/v)

Introduo

8

metanol/gua + 1% (v/v) cido actico, sendo o eluato diludo em linha com gua

(proporo 1:2) antes da introduo na ala de injeco da vlvula do cromatgrafo.

Figura 1.2. Representao esquemtica do sistema hifenizado MSFIA-HPLC [24]. detector de dodos; A, ar;

B, canal para descarte das partculas slidas; BS, suspenso das partculas slidas em solvente de

condicionamento; C, transportador (H2O); CC, canal central; CS, solvente de condicionamento (50% v/v

MeOH/H2O); D, diluente (H2O); EL, eluente (50% v/v MEOH/H2O + 1% v/v CH3COOH); HC, reactor de

armazenamento (holding coil); HPLC, cromatgrafo lquido de alta eficincia; IV, vlvula de injeco; L1,

ligao (8 cm); L2, ligao (44 cm); LOV, lab-on-valve; MC, coluna cromatogrfica monoltica; MS, multi-

seringa; P, bomba; Sa, soluo de amostra/padro; Si, seringa; Vi, vlvula de comutao de trs vias (linha a

tracejado corresponde posio off e linha slida corresponde posio on); W, esgoto. Copyright 2010

Springer-Verlag.

Introduo

9

As caractersticas da metodologia proposta permitiram um elevado controlo dos

diferentes passos no protocolo de extraco, o que essencial para promoo das

interaces selectivas nas cavidades do polmero de impresso molecular. Foi possvel

extrair e quantificar a riboflavina em diferentes amostras alimentares no intervalo entre

0,450 e 5,00 mg L-1 aps o processamento de um volume de amostras de 1,0 mL sem

qualquer pr-tratamento inicial. Para as amostras de leite infantil, o limite de deteco

(LD) e o limite de quantificao (LQ) foram 0,05 e 0,17 mg L-1, respectivamente. O

mtodo foi aplicado com sucesso a dois materiais de referncia certificados e a

repetibilidade obtida foi elevada (DPR < 5,5 %). O protocolo de preparao e extraco

da amostra acoplado posterior anlise cromatogrfica constituem um sistema simples,

econmico e que proporciona um ritmo de determinao de seis amostras h-1.

1.3. Determinao da capacidade antioxidante

1.3.1. Mtodos baseados na capacidade antioxidante total

Os antioxidantes, incluindo os compostos polifenlicos, as vitaminas E e C e os

carotenides, so considerados nutrientes eficientes na preveno de doenas

relacionadas com o stress oxidativo. Este factor despertou o interesse da comunidade

cientfica, tendo j sido publicados diversos artigos cientficos relacionados, sendo que,

na ltima dcada este nmero quase que quadruplicou [25]. O significado lato da palavra

antioxidante uma substncia que impede oxidao ou inibe reaces promovidas pelo

oxignio e perxido, etc., mas para a bioqumica e medicina, os antioxidantes so

enzimas ou outros compostos endgenos, como a glutationa na forma reduzida, ou

outros compostos oriundos da dieta, como a vitamina E ou o -caroteno, que so

capazes de eliminar os efeitos nocivos da oxidao de tecidos animais, enquanto que na

rea alimentar so considerados substncias presentes nos alimentos que diminuem

significativamente os efeitos adversos de espcies reactivas, como as espcies reactivas

de oxignio e azoto (ROS do ingls reactive oxygen species e RNS do ingls reactive

nitrogen species), na funo fisiolgica normal dos humanos [25]. A formao de

espcies reactivas (ROS e RNS) causa deteriorao de produtos alimentares e j foi

relacionada com a gnese de diversas patologias, tais como a aterosclerose, a

inflamao crnica e alguns tipos de cancro, entre outras [26].

Introduo

10

A determinao da capacidade antioxidante e dos constituintes dos alimentares

responsveis por esta actividade passou a ser um assunto de elevado interesse em

investigao. No entanto, a determinao de cada composto antioxidante e o seu estudo

individual demasiado dispendioso e pouco eficiente devido complexidade das

matrizes alimentares [25]. de todo o interesse conceber um mtodo que seja prtico,

eficiente e rpido para quantificar a capacidade antioxidante. Existem variados mtodos

para determinao deste parmetro, sendo que estes diferem entre si em termos de

mecanismos de reaco, espcies oxidativas alvo, condies de reaco e a forma em

que os resultados so expressos [27]. Embora os mtodos separativos como a

electrofrese capilar e a cromatografia lquida de alta eficincia, acoplados a detectores

multi-dimensionais como UV com varrimento de dodos ou espectrometria de massa,

sejam tcnicas poderosas para o isolamento e identificao de compostos fenlicos em

amostras complexas, a aplicao para a estimativa do contedo fenlico total pode ser

imprecisa [28]. Para alm disso, so tcnicas morosas, dispendiosas e no so

adequadas para determinaes de rotina. Visto que a capacidade antioxidante total est

dependente de diversos factores recomendvel que se usem vrios mtodos que

avaliem diferentes aspectos do comportamento antioxidante para produzir um perfil

antioxidante completo. tambm vantajoso seleccionar mtodos que estejam validados e

padronizados com resultados publicados comparveis na literatura.

Em termos gerais os mtodos podem dividir-se em dois grandes grupos: (i) mtodos

especficos para espcies com relevncia biolgica, envolvendo espcies reactivas de

oxignio e de azoto e (ii) mtodos para avaliao da capacidade redutora baseada na

transferncia de electres. Este ltimo grupo rene mtodos que recorrem a espcies

radicalares, no biolgicas e estveis, tais como o ABTS+ (catio radical 2,2-azinobis-(3-

etilbenzotiazolina-6-sulfonato)) [29] ou o DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo)

[30,31]. Neste ltimo grupo tambm esto representados os mtodos que medem a

capacidade redutora total atravs de reaces redox (mtodo FRAP, do ingls ferric

reducing antioxidant power) [32,33] e o mtodo de Folin-Ciocalteu (FC) [34,35]) ou

atravs da aplicao de mtodos electroqumicos [36,37]. As principais caractersticas

destes mtodos esto descritas na tabela 1.1.

Introduo

11

Tabela 1.1. Principais caractersticas dos mtodos especficos para radicais estveis e no biolgicos e para

avaliao da capacidade de reduo total [27].

Mtodo Princpio da medio Quantificao

ABTS+/TEAC

O radical catio ABTS+ reduzido por antioxidantes, causando uma

diminuio da absorvncia a 414 ou 734 nm

Equivalentes de Trolox (M), equivalentes de cido ascrbico

(mg/100 mL ou 100 g)

DPPH O radical DPPH reduzido por antioxidantes, originando uma

diminuio da absorvncia a 515 nm

Equivalentes de EC50, RSE, Trolox (M), equivalentes de

cido ascrbico (mg/100 mL ou 100 g)

FRAP

O complexo frrico 2,4,6-tripiridil-s-triazina reduzido por antioxidantes,

causando um aumento de absorvncia a 593 nm

Equivalentes de ies ferro, equivalentes de cido ascrbico

Folin-Ciocalteu

Os complexos de tungstnio-molibdato so reduzidos por

antioxidantes, causando um aumento de absorvncia a 750 nm

Equivalentes de cido glhico (mg L-1)

Capacidade de reduo electroqumica total

A intensidade da corrente andica aumentada devido oxidao dos

compostos antioxidantes na superfcie do eltrodo

Potencial de oxidao (E1/2), intensidade da corrente andica (Ia), rea abaixo da onda andica

Nota: ABTS+ catio radical 2,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), DPPH radical 2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo, EC50 concentrao eficiente, FRAP (do ingls ferric reducing antioxidant power) poder de

reduo antioxidante frrica, RSE (do ingls radical scavenging efficiency) eficincia de sequestro radicalar,

TEAC (do ingls Trolox equivalent antioxidant capacity) capacidade antioxidante de equivalentes de Trolox.

1.3.2. Capacidade antioxidante baseada no mtodo de Folin-Ciocalteu

O reagente de Folin-Ciocalteu (FC) no tem uma natureza qumica bem definida, mas

sabe-se que constitudo por complexos cidos de fosfomolibdnio/fosfotungstnio [35] e

a qumica que est por detrs do mtodo de Folin-Ciocalteu baseia-se na transferncia

de electres em meio alcalino dos compostos fenlicos e outras espcies redutoras para

o molibdnio, originando complexos azuis que podem ser detectados por

espectrofotometria a um comprimento de onda situado no intervalo 750-765 nm [34].

Geralmente o cido glhico usado como composto padro, sendo os resultados

expressos em equivalentes de cido glhico, em mg L-1. O reagente FC no especfico

para os compostos fenlicos, visto que pode ser reduzido por diversos compostos no

fenlicos, como por exemplo as aminas aromticas, o dixido de enxofre, o cido

ascrbico, entre outros, e por esta razo no aplicvel para a determinao de

contedo total fenlico, a no ser que se removam ou eliminem as espcies interferentes

[34,38]. Apesar desta indicao qumica, muito frequente encontrar nas revistas

Introduo

12

cientficas peridicas da rea da Qumica Alimentar artigos em que o mtodo de Folin-

Ciocalteu usado para a determinao da quantidade total de compostos fenlicos.

Na realidade R. L. Prior e co-autores propuseram o mtodo Folin-Ciocalteu como mtodo

de referncia para avaliao da capacidade antioxidante total [38]. Num trabalho recente,

a capacidade de reduo do FC aplicada numa grande quantidade de bebidas (72) foi

comparada com o mtodo TEAC e obteve-se uma boa correlao (R > 0,9) para vinhos

tintos, infuses de ervas e de chs e cervejas [27]. Este apenas um estudo entre muitos

que correlacionam favoravelmente o mtodo de Folin-Ciocalteu com outros

frequentemente utilizados para a avaliao da capacidade antioxidante.

1.4. Enquadramento e objectivos

O objectivo principal do trabalho a determinao de compostos fenlicos como

contribuintes para a capacidade antioxidante em amostras alimentares. Conforme

mencionado na seco anterior, o mtodo de Folin-Ciocalteu frequentemente aplicado

de forma incorrecta determinao do contedo total de compostos fenlicos em

amostras alimentares. Recentemente, foi proposto um mtodo que permite a aplicao

desta reaco determinao de compostos fenlicos recorrendo extraco em fase

slida para remoo de interferentes, tendo sido aplicado a amostras de urina [39].

Dado que tal procedimento no est descrito para a rea alimentar, pretende-se a

implementao do mesmo recorrendo a um sistema automtico baseado em LOV-BI que

seja capaz de separar os compostos fenlicos presentes em amostras alimentares para

posterior quantificao atravs do mtodo de Folin-Ciocalteu. Pretende-se tambm

avaliar o contedo em termos percentuais de compostos fenlicos que contribuem para a

capacidade redutora total estimada pelo mtodo de Folin-Ciocalteu, obtida pela anlise

directa de amostras atravs deste mtodo.

Material e mtodos

14

2. Material e mtodos

Nesta seco descrevem-se os procedimentos utilizados na preparao de solues

necessrias para a execuo experimental da metodologia analtica, bem como o

equipamento utilizado na montagem do sistema de fluxo. Tambm descrito em detalhe

o protocolo adoptado para o procedimento automtico de extraco em fase slida.

2.1. Reagentes e solues

Na preparao das solues utilizaram-se reagentes de qualidade pro analisis sem

qualquer tratamento ou purificao adicional.

Para a preparao de solues aquosas utilizou-se gua ultra-pura (resistividade superior

a 18 M cm).

As solues padro foram obtidas por pesagem rigorosa do respectivo reagente slido

numa balana analtica (modelo AG 285, Mettler Toledo), seguida de dissoluo do

mesmo em solvente adequado e subsequente diluio, em bales volumtrico.

Os padres utilizados na construo das curvas de calibrao foram obtidos por diluio

rigorosa, em gua ultra-pura, da soluo padro mais concentrada, usando micro-pipeta

regularmente calibrada (modelo LABMATE, HTL) e bales volumtricos.

Quando necessrio, ajustou-se o pH das solues utilizando para o efeito um

milivoltmetro da marca Crison (Allela, Spain), modelo pH-meter GLP 22, equipado com

um elctrodo de vidro da mesma marca, modelo 52-02.

Todas as solues utilizadas no sistema de fluxo foram previamente desgaseificadas no

ultra-sons.

2.1.1. Solues usadas na preparao das amostras/padres

- Soluo de cido clordrico 0,6 M: diluiram-se 5,9 mL de cido clordrico a 32% (m/V)

em 100 mL de gua, numa proveta.

- Soluo de cido clordrico 10 mM: diluiram-se 4,2 mL de cido clordrico 0,6 M at um

volume total de 250 mL, utilizando gua como solvente.

15

- Soluo de cido clordrico 5 mM: diluiram-se 25 mL de cido clordrico 10 mM at um

volume total de 50 mL, utilizando gua como solvente.

2.1.2. Preparao das solues padro

- Soluo me padro de cido glhico 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de cido

glhico em cerca de 10 mL de gua, subsequentemente transferidos para um balo

volumtrico de 50 mL, cujo volume foi completo com gua. Esta soluo foi preparada

mensalmente.

- Soluo me padro de cido cafeico 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de cido

cafeico em cerca de 10 mL de uma soluo 50% (v/v) etanol/gua ultra-pura

subsequentemente transferidos para um balo volumtrico de 50 mL, cujo volume foi

completo com o mesmo solvente.

- Soluo me padro de galhato de octilo 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de

galhato de octilo em cerca de 10 mL de uma soluo 50% (v/v) etanol/gua ultra-pura



- Soluo me padro de quercetina 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de quercetina

em cerca de 10 mL de etanol, subsequentemente transferidos para um balo volumtrico

de 50 mL, cujo volume foi completo com o mesmo solvente.

- Soluo me padro de cido tnico 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de cido

tnico em cerca de 10 mL de uma soluo 50% (v/v) etanol/gua ultra-pura



- Soluo me padro de cido ascrbico 500 mg L-1: dissolveram-se 25,00 mg de cido

ascrbico em cerca de 10 mL de gua, subsequentemente transferidos para um balo

volumtrico de 50 mL, cujo volume foi completo com gua.

- Solues padro de cido glhico, cido cafeico, galhato de octilo, quercetina, cido

tnico e cido ascrbico (5 mg L-1): Pipetaram-se 250 L da soluo me padro do

respectivo composto (500 mg L-1) com uma micro-pipeta e diluiu-se at marca num

balo volumtrico de 25 mL, com cido clordrico 10 mM.

16

2.1.3. Preparao das amostras

- Amostra de vinho (1:20): pipetou-se 1,00 mL da amostra de vinho para um balo

volumtrico de 20 mL, cujo volume foi completo com cido clordrico 10 mM.

- Amostra de vinho (1:500): pipetou-se 2,00 mL da amostra de vinho diluda previamente

(1:20) para um balo volumtrico de 50 mL , cujo volume foi completo com cido

clordrico 10 mM.

- Amostra de sumo (1:50): pipetou-se 1,00 mL da amostra de sumo para um balo

volumtrico de 50 mL, cujo volume foi completo com cido clordrico 10 mM.

2.1.4. Solues usadas no sistema LOV-BI

- Suspenso de OasisTM HLB (Waters Inc. Milford, Massachusetts): 100 mg de OasisTM

HLB em 1000 L de metanol.

- Soluo de metanol 50% (v/v): misturaram-se volumes iguais (10 mL) de gua e

metanol.

- Soluo de amonaco 10% (v/v): diluiram-se 10 mL de soluo comercial de amonaco

25% (m/v) numa proveta de 100 mL usando gua como solvente.

- Soluo de metanol 50% (v/v) e hidrxido de amnio 5% (v/v): misturaram-se volumes

iguais (10 mL) de metanol p.a. e soluo de amonaco 10% (v/v).

- Soluo de hidrxido de sdio 0,5 M: dissolveram-se 2,0 g de hidrxido de sdio em

100 mL de gua.

- Soluo de hidrxido de sdio 10 mM: diluiram-se 2,0 mL da soluo de hidrxido de

sdio 0,5 M numa proveta de 100 mL usando gua como solvente.

- Soluo de metanol 50% (v/v) e /hidrxido de sdio 5 mM: misturaram-se volumes

iguais (10 mL) de metanol p.a. e soluo de hidrxido de sdio 10 mM.

2.1.5. Solues usadas no mtodo Folin-Ciocalteu

- Soluo de Folin-Ciocalteu (1:5): diluiram-se 5,0 mL da soluo comercial de Folin-

Ciocalteu (2 N em acidez) num balo volumtrico de 25 mL usando gua como solvente.

17

- Soluo de hidrxido de sdio 0,35 M: dissolveram-se 1,4 g de hidrxido de sdio em

100 mL de gua.

- Soluo tampo de carbonato de sdio (60 g L-1): Dissolveram-se 6,0 g de carbonato de

sdio em 100 mL de gua e ajustou-se o pH para 10,0 por adio gota a gota de cido

clordrico concentrado.

2.2. Instrumentao

A montagem referente ao sistema de fluxo constituda por um mdulo multi-seringa, por

um mdulo LOV e por um computador, cujo software (construdo em QuickBasic 4.5)

permite controlar os dois mdulos referidos atravs de uma interface do tipo RS232

(Figura 2.1).

Figura 2.1. Montagem laboratorial do sistema de fluxo constituda pelos mdulos multi-seringa e da lab-on-

valve e pelo computador.

O mdulo multi-seringa da marca Crison (Allela, Spain, modelo BU 4 S) e est

equipado com uma seringa de vidro (Microliter, Hamilton) na posio 3 com capacidade

de 2500 L e mbolos e ligadores em politetrafluoroetileno (PTFE do ingls

18

polytetrafluoroethylene). O mbolo da seringa percorre na totalidade 10000 passos,

fixando o volume mnimo dispensado/aspirado em 0,25 L (Figura 2.2). As restantes

posies do mdulo multi-seringa no foram utilizadas.

O mdulo LOV, tambm da marca Crison (modelo VA 2 SW), contm duas vlvulas de

seleco de oito portas. Numa das vlvulas foi retirada a pea exterior mvel, tendo sido

esta substituda por uma pea monoltica constituda por polieterimida com 10

microcanais gravados na mesma (Ideia.M., Porto, Portugal), ajustada ao rotor da vlvula

modificada (Figuras 2.2 e 2.3).

A tubagem utilizada no sistema de fluxo e na ligao das portas aos recipientes de

solues em PTFE (Omnifit, Cambridge, UK), com dimetro interno de 0,8 mm. O tubo

que constitui o reactor de armazenamento, que estabelece a ligao entre os mdulos

LOV e multi-seringa tambm em PTFE e tem dimetro interno de 1,6 mm (Figuras 2.2 e

2.3). Outros ligadores, utilizados nas portas do dispositivo LOV ou na vlvula solenide

do mdulo multi-seringa, tambm so em PTFE.

Figura 2.2. Mdulos LOV e multi-seringa usados para a extraco de compostos fenlicos.

19

As leituras de absorvncia oriundas da aplicao do mtodo de Folin-Ciocalteu foram

efectuadas num leitor de micro-placas (Synergy HT, Bio-Tek, Winooski VT), ao qual

esteve associado o software de aquisio e registo de dados Gen5 1.08 (Figura 2.3).

Figura 2.3. Leitor de micro-placas e computador.

2.3. Procedimento automtico de extraco em fase slida

A vlvula LOV-BI apresenta 10 portas (Figura 3.4). Na porta/canal 1 onde so retidas

as partculas que constituem a fase slida, ocorrendo o empacotamento das mesmas e a

formao da coluna, atravs da qual passa a amostra e ficam retidos os compostos

fenlicos, e na qual se far a recolha das alquotas a analisar. As partculas slidas so

OasisTM HLB, com tamanho mdio de 30 m e tamanho de poro de 80 . A amostra

enviada para o sistema atravs da porta 2. O ar entra no sistema pela porta 3 (que

constituda por dois canais interligados). Na porta 4 est encaixada uma ponta de micro-

pipeta onde colocada a suspenso das partculas de OasisTM HLB para posterior

aspirao das mesmas e envio para a porta 1. Na porta 5 est o recipiente com o

solvente de condicionamento das partculas slidas (50 % metanol/50 % gua). A porta 6

est livre e foi fechada na sua extremidade com uma pea adequada. O eluente

20

aspirado atravs da porta 7. Na porta 8 foi colocado o esgoto. Entre as portas 6 e 7 est

a porta c, que corresponde ao canal central e que est ligada ao reactor de

armazenamento e, consequentemente, seringa do mdulo multi-seringa. Nas seces

seguintes feita uma descrio detalhada de todo o protocolo experimental aplicado para

a extraco em fase slida dos compostos fenlicos.

Figura 2.4. Vista pormenorizada da vlvula LOV e respectivas portas/canais. Porta 1, coluna de extraco em

fase slida; porta 2, amostra; porta 3 (dupla), ar; porta 4, reservatrio da fase slida; porta 5, solvente de

condicionamento; porta 6, no utilizada, encontrando-se fechada; porta 7, eluente; porta 8, esgoto; porta c,

canal central.

2.3.1. Formao da coluna extractora e condicionamento do adsorvente

Primeiramente aspiram-se 550 L do solvente de condicionamento (50% (v/v)

metanol/gua) a um caudal de 2,5 mL min-1, ligando o canal central porta 5. Inverte-se o

sentido da seringa para propulso e enviam-se 125 L do solvente de condicionamento

para a porta 4, onde se encontra a suspenso de partculas OasisTM, e faz-se a

ressuspenso das mesmas a um caudal de 5 mL min-1. De seguida, invertendo o sentido

do movimento da seringa, enche-se a mesma com um volume de 1050 L de

transportador (gua ultra-pura) a um caudal de 5 mL min-1, aspirando directamente do

recipiente de transportador. Aspiram-se seguidamente 175 L da suspenso das

21

partculas slidas a um caudal de 0,5 mL min-1 e, aps mudana do canal central para a

porta 1 e inverso do sentido do fluxo, enviam-se 1000 L a um caudal de 2 mL min-1,

formando e condicionando assim a coluna. As partculas excedentes so enviadas para o

esgoto (porta 8) a um caudal de 5 mL min-1. Na tabela 2.1 apresenta-se um resumo do

protocolo experimental referente ao carregamento das partculas adsorventes e

condicionamento da coluna.

Tabela 2.1. Protocolo experimental do carregamento das partculas adsorventes e condicionamento da

coluna.

Descrio Porta Volume Caudal Sentido Posio

Aspirao metanol (50%) 5 550 2,5 a 1

Ressuspenso dos beads 4 125 5 b 1

Enchimento das seringas 4 1050 5 a 0

Aspirao dos beads 4 175 0,5 a 1

Formao e condicionamento da coluna 1 1000 2 b 1

Rejeio dos beads em excesso 8 650 5 b 1

2.3.2. Carregamento da amostra e remoo da matriz

Aps ligao do canal central porta 3, aspiram-se 250 L de ar a um caudal de 2 mL

min-1 para o reactor de armazenamento. De seguida, muda-se para a porta 2 e aspiram-

se 1000 L de amostra a um caudal de 2 mL min-1 tambm para o reactor de

armazenamento. O passo seguinte o de enviar, aps inverso do fluxo, 150 L do

transportador directamente para o reservatrio do mesmo, para posicionamento da

seringa. O canal central ligado porta 1 e enviam-se 1100 L de amostra e ar a um

caudal de 1 mL min-1, fazendo ainda a recolha da primeira alquota para um eppendorf

que ser selado no final com pelcula plstica. Enche-se a seringa com 1500 L

directamente a partir do reservatrio do transportador e, ligando o canal central porta 8,

lava-se o canal central, fazendo passar o volume aspirado de transportador para o

esgoto. Realiza-se, ento, a reposio da seringa com 500 L de transportador a um

caudal de 5 mL min-1 e envia-se o mesmo volume a um caudal de 2 mL min-1 para o canal

da porta 1, removendo assim a matriz da amostra. Neste passo inicia-se a recolha da

segunda alquota. Mantendo o eppendorf no canal 1, faz-se uma paragem do sistema

durante cerca de 15 segundos. De seguida, aspiram-se 300 L de ar a um caudal de 5

mL min-1, ligando o canal central porta 3, e invertendo o sentido da seringa, enviam-se

200 L de ar para a porta 1, terminando a recolha da segunda alquota. Os 100 L que

restam so enviados directamente para o reservatrio do transportador posicionando,

assim, a seringa. Os passos realizados neste ciclo esto apresentados na tabela 3.2.

22

Tabela 2.2. Protocolo experimental do carregamento da amostra e remoo da matriz.


Aspirao do ar 3 250 2 a 1

Aspirao da amostra 2 1000 2 a 1

Dummy step 2 150 5 b 0

Envio amostra para a coluna 1 1100 1 b 1

Enchimento da seringa 1 1500 5 a 0

Lavagem do canal central 8 1500 5 b 1

Reposio da seringa 1 500 5 a 0

Remoo da matriz 1 500 2 b 1

Paragem do sistema 1 1250 5 e 1


Envio do ar 1 200 1 b 1

Posicionamento do pisto 1 100 5 b 0

2.3.3. Eluio dos compostos retidos no adsorvente

Em primeiro lugar, enchem-se as seringas directamente a partir do reservatrio do

transportador com um volume de 1150 L a um caudal de 5 mL min-1. De seguida, move-

se o canal central para a porta 3 e aspiram-se 200 L de ar (2 mL min-1). Aspiram-se,

ento, 300 L de eluente a um caudal de 2 mL min-1 a partir da ligao porta 7.

Mantendo o canal central na porta 7, enviam-se 250 L de transportador a 5 mL min-1

directamente para o reservatrio do mesmo. Seguidamente, inicia-se a eluio e recolha

da terceira alquota para um eppendorf, enviando para o canal da porta 1 um volume da

mistura eluente/ar de 400 L a 0,5 mL min-1. Segue-se uma paragem do sistema durante

15 segundos para aguardar a recolha de todo o volume da mistura eluente/analitos e no

final, pipetam-se 200 L deste volume para outro eppendorf com 200 L de cido

clordrico a uma concentrao de 5 mM, neutralizando, deste modo, a alquota recolhida.

Move-se o canal central para a porta 8 e enviam-se os 1000 L excedentes para o esgoto

a um caudal de 5 mL min-1. Este ciclo repetido e obtm-se a quarta alquota

correspondente segunda eluio dos analitos, que eventualmente no tenham sido

eludos da primeira vez. Na tabela 2.3 apresenta-se o programa experimental da eluio

dos analitos.

23

Tabela 2.3. Protocolo experimental da eluio dos compostos retidos no adsorvente.




Aspirao do eluente 7 300 2 a 1

Dummy step 7 250 5 b 0

Eluio do analito 1 400 0,5 b 1

Paragem do sistema 1 1250 5 e 1

Lavagem do canal central 8 1000 5 b 1

2.3.4. Descarte das partculas de OasisTM HLB

Aspiram-se 1000 L de transportador directamente do reservatrio a um caudal de 5 mL

min-1 para enchimento da seringa. De seguida, move-se o canal central para a porta 5 e

so aspirados 250 L do solvente de condicionamento a 2,5 mL min-1. Invertendo o

sentido da seringa e ligando o canal central porta 1, enviam-se 200 L do solvente

aspirado a um caudal de 2 mL min-1 para humedecimento das partculas de OasisTM HLB

empacotadas. Invertendo novamente o sentido, aspiram-se as partculas de OasisTM HLB

empacotadas para o reactor de armazenamento, num volume total de 500 L a um

caudal de 5 mL min-1. Segue-se o descarte de 1350 L da suspenso de partculas a 5

mL min-1, mudando o canal central para a porta 8 (esgoto) e invertendo o sentido da

seringa para propulso. O canal central desloca-se para a porta 1 e os restantes 200 L

so enviados para o canal para realizar a limpeza do mesmo. A descrio dos passos

referentes ao descarte das partculas de OasisTM HLB e limpeza do canal da coluna

apresenta-se na tabela 2.4.

O sistema encontra-se, ento, preparado para a execuo de uma nova experincia.

Tabela 2.4. Protocolo experimental correspondente ao descarte das partculas de OasisTM HLB e limpeza do

canal da coluna.



Aspirao de metanol (50%) 5 250 2,5 a 1

Envio de metanol sobre a fase slida 1 200 2 b 1

Aspirao da fase slida 1 500 5 a 1

Descarte da fase slida 8 1350 5 b 1

Limpeza do canal da coluna 1 200 2 b 1

24

2.4. Procedimento para avaliao da capacidade redutora pelo mtodo de Folin-Ciocalteu

A avaliao da capacidade antioxidante redutora total e a quantificao dos compostos

fenlicos foram realizadas com base no mtodo de Folin-Ciocalteu realizado de forma

clssica [34], e tambm com base no mtodo de Folin-Ciocalteu modificado [40]. O

primeiro mtodo consiste na leitura da absorvncia dos 96 poos de uma micro-placa,

num leitor apropriado a um comprimento de onda de 760 nm, durante 2 horas, fazendo

leituras de 10 em 10 minutos e temperatura ambiente. O mtodo modificado

semelhante ao primeiro, exceptuando o facto da leitura da micro-placa ser realizada

durante 10 minutos, com leituras espaadas de 1 minuto, visto que a reaco ocorre de

uma forma mais clere dada a utilizao de um valor de pH mais elevado no meio

reaccional. A micro-placa foi preparada colocando em cada poo 50 L da amostra ou da

soluo do padro ou do respectivo branco (solvente da soluo em causa), conforme o

caso, em cada poo e adicionando de seguida 50 L do reagente de Folin-Ciocalteu

diludo 1:5. Seguidamente adicionam-se 100 L da soluo de hidrxido de sdio 0,350

M (mtodo de Folin-Ciocalteu modificado) ou carbonato de sdio 60 g L-1 (mtodo de

Folin-Ciocalteu). Para cada amostra, soluo padro ou branco, fizeram-se 4 rplicas

dentro do mesmo ensaio. A absorvncia do complexo formado , ento, monitorizada

durante 2 horas (de 10 em 10 minutos) ou durante 10 minutos, de minuto a minuto,

consoante o mtodo seleccionado.

Foram construdas curvas de calibrao entre 2,5 e 37,5 mg L-1 de cido glhico,

procedendo-se a um ajuste linear da relao entre a absorvncia e a concentrao de

cido glhico. Em alguns casos foi necessrio proceder a um ajuste polinomial (2 ordem)

utilizando apenas os valores obtidos para as concentraes iguais ou inferiores a 10 mg

L-1.

Resultados e Discusso

Resultados e discusso

26

3. Resultados e discusso

3.1. Implementao do protocolo de extraco em fase slida no sistema BI-LOV

A extraco em fase slida tem como princpio a passagem de uma soluo que contm

o(s) analito(s) em estudo, atravs de um adsorvente em fase slida, empacotado numa

coluna, no qual ficaro retidos o(s) analito(s) enquanto que a matriz e interferentes sero

removidos. Posteriormente, o(s) analito(s) sero arrastados pelo eluente e recolhidos

para anlise. No sistema automtico, a fase slida no empacotada, mas est

suspensa num solvente adequado, o metanol, numa das portas laterais do sistema.

Primeiramente aspira-se o solvente de condicionamento e envia-se parte deste para a

porta onde est a suspenso com a fase slida. Este passo necessrio para eliminar

possveis aglomerados de partculas slidas que se tenham formado e facilitar a sua

aspirao. O caudal dever ser o mais alto possvel sem que cause sobrepresso na

montagem fsica, fixado neste caso a 5 mL min-1, para que ocorra a agitao das

partculas suspensas. O volume aspirado da suspenso deve ser suficiente para

preencher completamente todo o canal onde se forma a coluna. Inicialmente, o volume

de aspirao da suspenso era 60 L mas este revelou-se insuficiente para preencher o

canal, tendo sido e aumentado para 125 L. Com este volume o canal ficava visivelmente

todo preenchido mas a quantidade de partculas slidas no foi repetvel entre

experincias, facto que se traduziu numa baixa repetibilidade dos resultados obtidos na

quantificao dos compostos fenlicos. Assim, este valor foi aumentado para 175 L e foi

possvel preencher completamente o canal da coluna e ainda uma parte do canal central.

Este excedente de fase slida descartado para o esgoto atravs do envio de

transportador (gua) utilizando o caudal mximo de forma a agilizar este passo. Por outro

lado, importante salientar que o caudal de envio da suspenso de fase slida dever

ser baixo para que no ocorra sobrepresso do sistema e consequentemente perdas de

soluo pelas outras portas. Utilizando este processo para o empacotamento do

adsorvente, possvel obter colunas contendo 17,2 0,7 mg de OASISTM HLB [17].

No procedimento envolvendo colunas empacotadas convencionalmente, estas devem ser

condicionadas com um solvente de condicionamento apropriado, fazendo passar um

determinado volume do solvente atravs da coluna, de modo a humedecer a fase slida e

a ocupar todos os interstcios de ar existentes entre as partculas. No caso da coluna

empacotada no micro-canal do dispositivo LOV, a coluna j est humedecida, sendo

apenas necessrio eliminar a poro de solvente orgnico (metanol) existente no meio de


27

ressuspenso e condicionamento. Tal efectuado pela passagem de cerca de 500 L de

gua no penltimo passo desta parte do protocolo automtico. Considerando todos os

passos descritos na tabela 2.1, esta parte do ciclo de preparao da amostra demora

cerca de 1,5 minutos.

A etapa seguinte do ciclo analtico engloba o envio da amostra para a coluna e

eliminao da matriz. Este o ciclo que demora mais tempo (cerca de 3,5 minutos) pelo

facto de se enviar um volume considervel de amostra (1000 L) para a coluna a um

caudal relativamente baixo (1 mL min-1) e por ser o que tem maior nmero de passos. O

primeiro passo consiste em aspirar ar para evitar a acumulao de vestgios de amostra

nas tubagens e no transportador, eliminando assim contaminaes entre experincias. O

caudal de aspirao do ar no dever ser elevado para, mais uma vez, acautelar

sobrepresso no sistema. A amostra tambm aspirada a um caudal relativamente baixo

para no haver formao de bolhas. Durante o envio da amostra atravs da coluna,

recolhida a primeira alquota analisada pelo mtodo de Folin-Ciocalteu de forma a

quantificar o(s) composto(s) no-retido(s) no adsorvente. Antes de proceder remoo

da matriz necessrio eliminar restos de amostra existentes no canal central para o

esgoto. A remoo da matriz realizada enviando transportador (gua) que eliminar os

compostos no retidos na coluna, tal como na extraco em fase slida realizada de

forma convencional. O caudal deste passo tambm dever ser baixo para no causar

sobrepresso no sistema de fluxo. Segue-se uma paragem do fluxo durante 15

segundos. Aspira-se novamente ar e envia-se o mesmo atravs da coluna com vista a

eliminar completamente vestgios de matriz e gua que estivessem no canal, para que

estes no interfiram no passo da eluio. Durante estes dois passos recolhida a

alquota contendo o(s) composto(s) eventualmente pr-eludos, quantificados

posteriormente pelo mtodo de Folin-Ciocalteu.

O ciclo de eluio dos compostos retidos no adsorvente inicia-se com o enchimento da

seringa e a aspirao do ar e de eluente. O ar ter como funo ajudar recuperao

total do volume de eluente enviado atravs da coluna, e o caudal deve ser o mais baixo

possvel para evitar sobrepresso do sistema. Durante estes passos efectuada a

recolha do eluato para posterior determinao dos compostos retidos atravs do mtodo

de Folin-Ciocalteu. Existe tambm uma paragem do fluxo durante 15 segundos e o

volume que resta na seringa enviado para o esgoto para limpeza do canal central. A

durao deste ciclo de cerca de 2 minutos.

O ltimo ciclo o da remoo da fase slida do micro-canal situado no dispositivo LOV.

Primeiramente necessrio humedecer novamente a fase slida com o solvente de


28

condicionamento, de forma a facilitar a sua remoo. Aspira-se ento a fase slida

humedecida e envia-se para o esgoto. Durante a aspirao da fase slida dever ser

colocado um gobel com metanol na extremidade do canal 1 para ajudar total remoo

da mesma e impedindo a sua secagem. No final dever ser enviada gua pelo canal para

limpeza do mesmo e para preparar o sistema para a extraco da prxima amostra. A

durao deste ciclo de cerca de meio minuto.

3.2. Estudo das condies do processo de extraco

3.2.1. Estudo do perfil de no-reteno (breakthrough)

Esta experincia teve como objectivo o estudo do perfil de no-reteno (breakthrough)

de um composto fenlico modelo, neste caso o cido glhico, em diferentes condies de

alimentao da amostra. Para o efeito, foi utilizada uma soluo padro de cido glhico

(20 mg L-1) preparada em trs solventes diferentes: soluo tampo de cido

actico/acetato de sdio 10 mM a pH 4,5 (ensaios A e D), HCl 10 mM (ensaios B e E) e

gua (ensaio C). Tambm foi objectivo desta experincia avaliar o efeito do transportador

na pr-eluio do composto-alvo durante a etapa de remoo da matriz, tendo sido

usados gua (ensaios A, B e C) ou HCl 10 mM (ensaios D e E) como

transportador/soluo de lavagem. O eluente foi o mesmo em todos os ensaios: 100%

metanol. O ciclo de carregamento da amostra foi realizado cinco vezes, de onde se

recolheram as alquotas 1 a 5 e de seguida procedeu-se remoo da matriz (alquota

6). O ciclo de eluio realizou-se apenas uma vez e recolheu-se a alquota 7. Esta

informao est resumida nas tabelas 3.1 e 3.2.

As concentraes das solues padro usadas como amostra foram obtidas a partir da

anlise directa dos padres utilizando a metodologia de Folin-Ciocalteu modificada

implementada no leitor de micro-placas, tendo sido obtidos os valores de 20,7 mg L-1

(soluo tampo de CH3COOH/NaCH3COO 10 mM a pH 4,5), 21,6 mg L-1 (HCl 10 mM) e

20,5 mg L-1 (gua). Os valores obtidos para a concentrao de cido glhico em cada

alquota obtida esto indicados na tabela 3.2. A partir destes valores foi calculada a

massa no-retida por cada 1000 L de amostra alimentada coluna (tabela 3.3), a

massa pr-eluda durante o passo de remoo da matriz da amostra (tabela 3.4) e a

massa eluda por passagem do eluente (tabela 3.4). Estes valores foram calculados por

multiplicao da concentrao obtida pelo volume recolhido para cada alquota. As


29

percentagens correspondentes foram calculadas atravs do balano mssico, a partir da

concentrao e dos volumes das solues padro usadas.

Tabela 3.1. Resumo das variveis estudadas na experincia para a determinao do perfil de pr-eluio

(breakthrough) de uma soluo contendo 20 mg L-1 de cido glhico.

Ensaio

A B C D E

Solvente da amostra soluo tampo de CH3COOH/NaCH3COO 10 mM a pH 4,5

HCl 10 mM

gua

Transportador usado HCl 10 mM

gua

Tabela 3.2. Valores de concentrao de cido glhico (mg L-1) obtidos para cada uma das alquotas

recolhidas nos ensaios A a E referentes ao estudo da pr-eluio observada para uma soluo padro

contendo 20 mg L-1 de cido glhico.

Ensaio

alquota descrio volume (L)

A B C D E

1 amostra alimentada (1)

1000 8,2 0,2 2,6 0,3 6,3 0,3 8,9 0,3 4,5 0,1


1000 15,9 0,3 9,0 0,6 14,1 0,3 16,1 0,3 13, 4 0,4


1000 18,6 0,2 15,0 0,1 17,3 0,4 18,9 0,3 18 ,3 0,2


1000 19,1 0,5 17,8 0,2 18,5 0,3 19,5 0,4 19 ,4 0,5


1000 19,2 0,2 18,6 0,4 18,8 0,2 18,6 0,7 14 ,2 0,2

6 transportador usado na remoo da matriz

500 11,5 0,1 24,2 0,4 16,0 0,2 7,5 0,2 13,9 0,2

7 eluente 300 35,4 0,7 65,4 1,7 36,6 0,4 38,0 1,2 45,8 0,9


30

Tabela 3.3. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) que no foi retido durante a alimentao

da coluna de adsorvente com 5 alquotas sucessivas de 1000 L de uma soluo de cido glhico 20 mg L-1.

Tambm so apresentados os valores correspondentes massa total no-retida, massa total retida aps a

passagem das 5 alquotas de padro e a percentagem de cido glhico no-retido por alquota (valores entre

parentses).

massa no-retida ensaio massa alimentada

coluna por alquota

alquota 1 alquota 2 alquota 3 alquota 4 alquota 5

massa total no-retida

massa total

retida

A 20,7 8,2

(39,6%)

15,9

(76,8%)

18,6

(89,9%)

19,1

(92,3%)

19,2

(92,8%)

81,0 22,5

B 21,6 2,6

(12,0%)

9,0

(41,7%)

15,0

(69,4%)

17,8

(82,4%)

18,6

(86,1%)

63,0 45,0

C 20,5 6,3

(30,7%)

14,1

(68,8%)

17,3

(84,4%)

18,5

(90,2%)

18,8

(91,7%)

75,0 27,5

D 20,7 8,9

(43,0%)

16,1

(77,8%)

18,9

(91,3%)

19,5

(94,2%)

18,6

(89,9%)

82,0 21,5

E 21,6 4,5

(20,8%)

13,4

(62,0%)

18,3

(84,7%)

19,4

(89,8%)

14,2

(65,7%)

69,8 38,2

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5

alquota

% m

assa

no

ret

ida

A

B

C

D

E

Figura 3.1. Representao da percentagem de no-reteno (breakthrough) do cido glhico em funo da

alimentao de alquotas consecutivas de 1000 L contendo 20 mg L-1 de cido glhico.


31

Tabela 3.4. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) pr-eluda durante a operao de

remoo da matriz da amostra e para a massa de cido glhico (g) eluda com uma alquota de 300 L de

metanol, resultantes da alimentao de uma soluo de 20 mg L-1.

remoo da matriz eluio

ensaio massa total

retida massa

pr-eluda % pr-eluio

massa remanescente no adsorvente

massa eluda

% eluio massa no-recuperada

A 22,5 5,7 25,3 16,8 10,6 63,1 6,2

B 45,0 12,1 26,9 32,9 19,6 59,6 13,3

C 27,5 8,0 29,1 19,5 11,0 56,4 8,5

D 21,5 3,8 17,7 17,7 11,4 64,4 6,3

E 38,2 7,0 18,3 31,2 13,7 43,9 17,5

A partir dos resultados apresentados na tabela 3.3 e na figura 3.1, possvel verificar a

existncia da no-reteno de parte ou da quase totalidade (percentagem de

breakthrough > 90%) do cido glhico alimentado coluna de extraco em fase slida.

Verifica-se uma percentagem de no-reteno superior a 40% a partir da alimentao da

2 alquota de 1000 L, independentemente da matriz da soluo amostra, indiciando

uma possvel saturao da fase slida. De qualquer forma, analisando a massa total

retida (tabela A3, ltima coluna), foram obtidos valores mais elevados para os ensaios B

e E (45,0 e 38,2 g) quando comparados com os outros ensaios (22,5, 27,5 e 21,5 g

para os ensaios A, C e D, respectivamente), indicando que a matriz HCl 10 mM poder

oferecer melhores condies para a reteno do analito.

importante salientar que a massa no-retida na alquota 5 do ensaio E (tabela 3.3)

poder estar afectada de algum erro na quantificao, dado ser improvvel que ocorra

uma diminuio da massa no-retida com o aumento do volume de amostra alimentado

coluna de extraco em fase slida. Desta forma os resultados obtidos para este ensaio

devem ser interpretados com cautela.

Tambm foi observada a ocorrncia de pr-eluio na etapa de lavagem da coluna com

soluo transportadora para a remoo da matriz da amostra. Foram obtidas

percentagens de pr-eluio entre 17,7 e 29,1% (tabela 3.4), no sendo possvel atribuir

uma tendncia de acordo com a soluo transportadora utilizada. Quanto etapa de

eluio, foram obtidas percentagens de eluio semelhantes, entre 56,4 e 64,4%


32

(exceptuando ensaio E, pelas razes indicadas anteriormente), dado que foi utilizado o

mesmo eluente (metanol 100%) em todos os ensaios.

Tendo em conta a possvel saturao do adsorvente usado por utilizao de uma soluo

demasiado concentrada de cido glhico, a experincia anterior foi repetida utilizando

solues padro de cido glhico a 5 mg L-1 (tabela 3.1). Conforme indicado

anteriormente, as concentraes das solues padro usadas como amostra foram

obtidas a partir da anlise directa dos padres utilizando a metodologia de Folin-Ciocalteu

modificada implementada no leitor de microplacas, tendo sido obtidos os valores de 4,93

mg L-1 (soluo tampo de CH3COOH/NaCH3COO 10 mM a pH 4,5), 5,04 mg L-1 (HCl 10

mM) e 5,10 mg L-1 (gua). Os valores obtidos para a concentrao de cido glhico em

cada alquota obtida esto indicados na tabela 3.5. A partir destes valores foi calculada a

massa no-retida por cada 1000 L de amostra alimentada coluna (tabela 3.6), a

massa pr-eluda durante o passo de remoo da matriz da amostra (tabela 3.7) e a

massa eluda por passagem do eluente (tabela 3.7), neste caso realizada em dois passos

consecutivos. As percentagens correspondentes foram calculadas atravs do balano

mssico, conforme indicado anteriormente.

A partir dos resultados apresentados na Tabela 3.6 e na Figura 3.2, verificou-se uma

melhor reteno do cido glhico preparado em HCl 10 mM, com ausncia de

breakthrough nas duas primeiras alquotas. Quando o transportador usado foi gua,

obteve-se uma percentagem de breakthrough < 2%, detectada apenas na ltima

alquota. No caso da soluo preparada em tampo cido actico/acetato de sdio, no

ocorreu breakthrough apenas na 1 alquota de amostra, tendo se verificado um

aumento sucessivo da massa no-retida nas alquotas consecutivas. Para a soluo

preparada em gua, foi obtida uma percentagem de massa no-retida de 46,5% logo na

primeira alquota, sendo este valor acrescido nas alquotas subsequentes. Estes

resultados esto de acordo com a natureza qumica do adsorvente utilizado e do

composto modelo escolhido. Sabendo que as interaces que ocorrem com a fase slida

so maioritariamente hidrofbicas, e que o pKa do grupo carboxilo na molcula de cido

glhico 4,24 [41], esta molcula encontra-se totalmente sob a forma protonada na

soluo de HCl 10 mM, parcialmente ionizada na soluo tampo a pH 4,5 e totalmente

ionizada quando preparada em gua, justificando um rendimento superior na reteno

observada para as solues que apresentam maior quantidade de molculas sob a forma

protonada. No foi observada uma influncia clara do transportador nesta fase do ciclo de

extraco dado que, ao comparar os ensaios B com E e A com D, no identificada uma

tendncia de melhoria com qualquer um dos transportadores testados.


33

Tabela 3.5. Valores de concentrao de cido glhico (mg L-1) obtidos para cada uma das alquotas

recolhidas nos ensaios A-E referentes ao estudo da pr-eluio observada para uma soluo padro

contendo 5 mg L-1 de cido glhico.

Ensaio

alquota descrio volume (L)

A B C D E


1000 < LD < LD 2,37 0,13 < LD < LD


1000 1,44 0,15 < LD 3,23 0,11 0,52 0,13 < LD


1000 3,15 0,17 < LD 3,58 0,10 2,37 0,18 0,31 0,06


1000 4,27 0,15 < LD 4,17 0,17 3,90 0,10 1,40 0,13


1000 4,38 0,18 0,08 0,06 4,38 0,09 4,37 0,2 1 2,73 0,13

6 transportador usado na remoo da matriz

500 3,10 0,07 2,81 0,04 2,62 0,11 1,77 0,06 3,63 0,17

7 eluente (1) 300 25,0 0,3 61,8 0,4 16,4 0,6 37,9 0,5 53,4 0,4

8 eluente (2) 300 < LD < LD < LD < LD < LD


34

Tabela 3.6. Valores calculados para a massa de cido glhico (g) que no foi retido durante a alimentao

da coluna de adsorvente com 5 alquotas sucessivas de 1000 L de uma soluo de cido glhico 5 mg L-1.

Tambm so apresentados os valores correspondentes massa total no-retida, massa total retida aps a

passagem das 5 alquotas de padro e a percentagem de cido glhico no-retido por alquota (valores entre

parentses).

massa no-retida ensaio massa alimentada

coluna por alquota

alquota 1 alquota 2 alquota 3 alquota 4 alquota 5

massa total no-retida

massa total

retida

A 4,93 < LD 1,44

(29,2%)

3,15

(63,9%)

4,27

(8

automatização do processo de extracção em fase sólida para ... · automatização do processo...

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