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ipen AUTARQUIA ASSOCIADA Agrave UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
ANAacuteLISE MECAcircNICA DE REacuteGUAS OacuteSSEAS ESTERILIZADAS
POR RADIACcedilAtildeO GAMA PARA USO EM BANCOS DE TECIDOS
LUIS OTAacuteVIO CARVALHO KOSMISKAS
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear-Aplicaccedilotildees
Orientadora Dra Motildenica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
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I INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGEacuteTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada a Universidade de Satildeo Paulo
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
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Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciencias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear - Aplicaccedilotildees
Orientadora Mocircnica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGEacuteTICAS E NUCLEARES Autarquia associada a Universidade de Satildeo Paulo
Anaacutelise mecaacutenica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear - Aplicaccedilotildees
Orientadora Mocircnica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
Agradecimentos
Agradeccedilo a todos aqueles que direta ou indiretamente auxiliaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Dra Mocircnica Beatriz Mathor sem a qual este trabalho nunca poderia ter sido realizado
Ao Dr Luis Filipe P C de Lima pelo auxiacutelio prestado no uso do Dynamical Mechanical Analizer
Ao Dr Luiz Vicente Gomes Tarelho por ceder o uso da Isomet durante os estaacutegios iniciais de desenvolvimento deste projeto
Agrave Cynara Viterbo Montoya pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de estatiacutestica e pelo grande suporte
Ao Joseacute Jorge Ambiel pelo auxilio no desenvolvimento dos dispositivos de suporte das amostras
Ao setor DPF do IPEN especialmente a Joseacute Carlos Sabino Jose Maria Jardim Joaquim Moreira dos Santos Gilson Carlos Victorino e Marcos do Santos pela contribuiccedilatildeo profissional na execuccedilatildeo dos suportes
Ao Dr Eddy S Pino pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de ensaios biomecaacutenicos
Ao Dr Joseacute Eduardo Manzoli pelo auxiacutelio na aacuterea de mecacircnica e pelo grande interesse demonstrado neste trabalho
Ao Djalma Batista Dias pelo auxiacutelio teacutecnico nos ensaios biomecaacutenicos
Ao Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -CTR - IpenCNEN-SP na pessoa do Dr Wilson P Calvo e aos colegas do centro pela utilizaccedilatildeo dos equipamentos disponibilidade e auxiacutelio durante a realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao CNPq pela bolsa de Mestrado
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
RESUMO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees dada a
natureza da sua aplicaccedilatildeo Dentre os meacutetodos desenvolvidos para
esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo ionizante tem sido amplamente empregada por
inuacutemeros setores da aacuterea de sauacutede pela sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A problemaacutetica da utilizaccedilatildeo
da radiaccedilatildeo ionizante em materiais de origem humana contudo vai aleacutem
da questatildeo de sua eficaacutecia como esterilizante incluindo as possiacuteveis
alteraccedilotildees na estrutura do material de escolha Desta forma no presente
trabalho buscou-se avaliar qual a extensatildeo das alteraccedilotildees biomecaacutenicas
causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais especificamente
avaliamos as alteraccedilotildees no moacutedulo de elasticidade tensatildeo de ruptura e
porcentagem de deformaccedilatildeo que decorrem do processo de irradiaccedilatildeo
Como modelo de eleiccedilatildeo foram escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da
diaacutefase de feacutemures bovinos simulando as condiccedilotildees de ossos humanos
armazenados em Bancos de Tecidos Bioloacutegicos Estas foram congeladas a
-70degC e expostas a doses crescentes de radiaccedilatildeo gama (O 125 25 e 50
kGy) Durante o trabalho foi desenvolvido um sistema de cortes para
obtenccedilatildeo de amostras precisas e homogecircneas Os resultados demonstram
que haacute uma diferenccedila significativa entre as caracteriacutesticas observadas
com o aumento da dose de radiaccedilatildeo
SSAtildeOM^MLIacuteif^B^HUCLEARSP-^^
Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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I INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGEacuteTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada a Universidade de Satildeo Paulo
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
L I V R O
iquest25htuuml j
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciencias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear - Aplicaccedilotildees
Orientadora Mocircnica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGEacuteTICAS E NUCLEARES Autarquia associada a Universidade de Satildeo Paulo
Anaacutelise mecaacutenica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear - Aplicaccedilotildees
Orientadora Mocircnica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
Agradecimentos
Agradeccedilo a todos aqueles que direta ou indiretamente auxiliaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Dra Mocircnica Beatriz Mathor sem a qual este trabalho nunca poderia ter sido realizado
Ao Dr Luis Filipe P C de Lima pelo auxiacutelio prestado no uso do Dynamical Mechanical Analizer
Ao Dr Luiz Vicente Gomes Tarelho por ceder o uso da Isomet durante os estaacutegios iniciais de desenvolvimento deste projeto
Agrave Cynara Viterbo Montoya pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de estatiacutestica e pelo grande suporte
Ao Joseacute Jorge Ambiel pelo auxilio no desenvolvimento dos dispositivos de suporte das amostras
Ao setor DPF do IPEN especialmente a Joseacute Carlos Sabino Jose Maria Jardim Joaquim Moreira dos Santos Gilson Carlos Victorino e Marcos do Santos pela contribuiccedilatildeo profissional na execuccedilatildeo dos suportes
Ao Dr Eddy S Pino pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de ensaios biomecaacutenicos
Ao Dr Joseacute Eduardo Manzoli pelo auxiacutelio na aacuterea de mecacircnica e pelo grande interesse demonstrado neste trabalho
Ao Djalma Batista Dias pelo auxiacutelio teacutecnico nos ensaios biomecaacutenicos
Ao Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -CTR - IpenCNEN-SP na pessoa do Dr Wilson P Calvo e aos colegas do centro pela utilizaccedilatildeo dos equipamentos disponibilidade e auxiacutelio durante a realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao CNPq pela bolsa de Mestrado
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
RESUMO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees dada a
natureza da sua aplicaccedilatildeo Dentre os meacutetodos desenvolvidos para
esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo ionizante tem sido amplamente empregada por
inuacutemeros setores da aacuterea de sauacutede pela sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A problemaacutetica da utilizaccedilatildeo
da radiaccedilatildeo ionizante em materiais de origem humana contudo vai aleacutem
da questatildeo de sua eficaacutecia como esterilizante incluindo as possiacuteveis
alteraccedilotildees na estrutura do material de escolha Desta forma no presente
trabalho buscou-se avaliar qual a extensatildeo das alteraccedilotildees biomecaacutenicas
causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais especificamente
avaliamos as alteraccedilotildees no moacutedulo de elasticidade tensatildeo de ruptura e
porcentagem de deformaccedilatildeo que decorrem do processo de irradiaccedilatildeo
Como modelo de eleiccedilatildeo foram escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da
diaacutefase de feacutemures bovinos simulando as condiccedilotildees de ossos humanos
armazenados em Bancos de Tecidos Bioloacutegicos Estas foram congeladas a
-70degC e expostas a doses crescentes de radiaccedilatildeo gama (O 125 25 e 50
kGy) Durante o trabalho foi desenvolvido um sistema de cortes para
obtenccedilatildeo de amostras precisas e homogecircneas Os resultados demonstram
que haacute uma diferenccedila significativa entre as caracteriacutesticas observadas
com o aumento da dose de radiaccedilatildeo
SSAtildeOM^MLIacuteif^B^HUCLEARSP-^^
Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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Anaacutelise mecaacutenica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear - Aplicaccedilotildees
Orientadora Mocircnica Beatriz Mathor
Satildeo Paulo 2007
Agradecimentos
Agradeccedilo a todos aqueles que direta ou indiretamente auxiliaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Dra Mocircnica Beatriz Mathor sem a qual este trabalho nunca poderia ter sido realizado
Ao Dr Luis Filipe P C de Lima pelo auxiacutelio prestado no uso do Dynamical Mechanical Analizer
Ao Dr Luiz Vicente Gomes Tarelho por ceder o uso da Isomet durante os estaacutegios iniciais de desenvolvimento deste projeto
Agrave Cynara Viterbo Montoya pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de estatiacutestica e pelo grande suporte
Ao Joseacute Jorge Ambiel pelo auxilio no desenvolvimento dos dispositivos de suporte das amostras
Ao setor DPF do IPEN especialmente a Joseacute Carlos Sabino Jose Maria Jardim Joaquim Moreira dos Santos Gilson Carlos Victorino e Marcos do Santos pela contribuiccedilatildeo profissional na execuccedilatildeo dos suportes
Ao Dr Eddy S Pino pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de ensaios biomecaacutenicos
Ao Dr Joseacute Eduardo Manzoli pelo auxiacutelio na aacuterea de mecacircnica e pelo grande interesse demonstrado neste trabalho
Ao Djalma Batista Dias pelo auxiacutelio teacutecnico nos ensaios biomecaacutenicos
Ao Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -CTR - IpenCNEN-SP na pessoa do Dr Wilson P Calvo e aos colegas do centro pela utilizaccedilatildeo dos equipamentos disponibilidade e auxiacutelio durante a realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao CNPq pela bolsa de Mestrado
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
RESUMO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees dada a
natureza da sua aplicaccedilatildeo Dentre os meacutetodos desenvolvidos para
esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo ionizante tem sido amplamente empregada por
inuacutemeros setores da aacuterea de sauacutede pela sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A problemaacutetica da utilizaccedilatildeo
da radiaccedilatildeo ionizante em materiais de origem humana contudo vai aleacutem
da questatildeo de sua eficaacutecia como esterilizante incluindo as possiacuteveis
alteraccedilotildees na estrutura do material de escolha Desta forma no presente
trabalho buscou-se avaliar qual a extensatildeo das alteraccedilotildees biomecaacutenicas
causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais especificamente
avaliamos as alteraccedilotildees no moacutedulo de elasticidade tensatildeo de ruptura e
porcentagem de deformaccedilatildeo que decorrem do processo de irradiaccedilatildeo
Como modelo de eleiccedilatildeo foram escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da
diaacutefase de feacutemures bovinos simulando as condiccedilotildees de ossos humanos
armazenados em Bancos de Tecidos Bioloacutegicos Estas foram congeladas a
-70degC e expostas a doses crescentes de radiaccedilatildeo gama (O 125 25 e 50
kGy) Durante o trabalho foi desenvolvido um sistema de cortes para
obtenccedilatildeo de amostras precisas e homogecircneas Os resultados demonstram
que haacute uma diferenccedila significativa entre as caracteriacutesticas observadas
com o aumento da dose de radiaccedilatildeo
SSAtildeOM^MLIacuteif^B^HUCLEARSP-^^
Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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Agradecimentos
Agradeccedilo a todos aqueles que direta ou indiretamente auxiliaram na realizaccedilatildeo deste trabalho
Agrave Dra Mocircnica Beatriz Mathor sem a qual este trabalho nunca poderia ter sido realizado
Ao Dr Luis Filipe P C de Lima pelo auxiacutelio prestado no uso do Dynamical Mechanical Analizer
Ao Dr Luiz Vicente Gomes Tarelho por ceder o uso da Isomet durante os estaacutegios iniciais de desenvolvimento deste projeto
Agrave Cynara Viterbo Montoya pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de estatiacutestica e pelo grande suporte
Ao Joseacute Jorge Ambiel pelo auxilio no desenvolvimento dos dispositivos de suporte das amostras
Ao setor DPF do IPEN especialmente a Joseacute Carlos Sabino Jose Maria Jardim Joaquim Moreira dos Santos Gilson Carlos Victorino e Marcos do Santos pela contribuiccedilatildeo profissional na execuccedilatildeo dos suportes
Ao Dr Eddy S Pino pelos conselhos e auxiacutelio na aacuterea de ensaios biomecaacutenicos
Ao Dr Joseacute Eduardo Manzoli pelo auxiacutelio na aacuterea de mecacircnica e pelo grande interesse demonstrado neste trabalho
Ao Djalma Batista Dias pelo auxiacutelio teacutecnico nos ensaios biomecaacutenicos
Ao Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -CTR - IpenCNEN-SP na pessoa do Dr Wilson P Calvo e aos colegas do centro pela utilizaccedilatildeo dos equipamentos disponibilidade e auxiacutelio durante a realizaccedilatildeo deste trabalho
Ao CNPq pela bolsa de Mestrado
Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
RESUMO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees dada a
natureza da sua aplicaccedilatildeo Dentre os meacutetodos desenvolvidos para
esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo ionizante tem sido amplamente empregada por
inuacutemeros setores da aacuterea de sauacutede pela sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A problemaacutetica da utilizaccedilatildeo
da radiaccedilatildeo ionizante em materiais de origem humana contudo vai aleacutem
da questatildeo de sua eficaacutecia como esterilizante incluindo as possiacuteveis
alteraccedilotildees na estrutura do material de escolha Desta forma no presente
trabalho buscou-se avaliar qual a extensatildeo das alteraccedilotildees biomecaacutenicas
causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais especificamente
avaliamos as alteraccedilotildees no moacutedulo de elasticidade tensatildeo de ruptura e
porcentagem de deformaccedilatildeo que decorrem do processo de irradiaccedilatildeo
Como modelo de eleiccedilatildeo foram escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da
diaacutefase de feacutemures bovinos simulando as condiccedilotildees de ossos humanos
armazenados em Bancos de Tecidos Bioloacutegicos Estas foram congeladas a
-70degC e expostas a doses crescentes de radiaccedilatildeo gama (O 125 25 e 50
kGy) Durante o trabalho foi desenvolvido um sistema de cortes para
obtenccedilatildeo de amostras precisas e homogecircneas Os resultados demonstram
que haacute uma diferenccedila significativa entre as caracteriacutesticas observadas
com o aumento da dose de radiaccedilatildeo
SSAtildeOM^MLIacuteif^B^HUCLEARSP-^^
Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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Anaacutelise mecacircnica de reacuteguas oacutesseas esterilizadas por radiaccedilatildeo gama para uso em Bancos de Tecidos
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
RESUMO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees dada a
natureza da sua aplicaccedilatildeo Dentre os meacutetodos desenvolvidos para
esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo ionizante tem sido amplamente empregada por
inuacutemeros setores da aacuterea de sauacutede pela sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A problemaacutetica da utilizaccedilatildeo
da radiaccedilatildeo ionizante em materiais de origem humana contudo vai aleacutem
da questatildeo de sua eficaacutecia como esterilizante incluindo as possiacuteveis
alteraccedilotildees na estrutura do material de escolha Desta forma no presente
trabalho buscou-se avaliar qual a extensatildeo das alteraccedilotildees biomecaacutenicas
causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais especificamente
avaliamos as alteraccedilotildees no moacutedulo de elasticidade tensatildeo de ruptura e
porcentagem de deformaccedilatildeo que decorrem do processo de irradiaccedilatildeo
Como modelo de eleiccedilatildeo foram escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da
diaacutefase de feacutemures bovinos simulando as condiccedilotildees de ossos humanos
armazenados em Bancos de Tecidos Bioloacutegicos Estas foram congeladas a
-70degC e expostas a doses crescentes de radiaccedilatildeo gama (O 125 25 e 50
kGy) Durante o trabalho foi desenvolvido um sistema de cortes para
obtenccedilatildeo de amostras precisas e homogecircneas Os resultados demonstram
que haacute uma diferenccedila significativa entre as caracteriacutesticas observadas
com o aumento da dose de radiaccedilatildeo
SSAtildeOM^MLIacuteif^B^HUCLEARSP-^^
Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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Mechanical analysis of bone rulers sterilized by gama radiation for use in Tissue Banks
Luis Otavio Carvalho Kosmiskas
ABSTRACT
In the production process of health care products
contamination must be considered as one of the principal hazards to be
avoided Among the developed methods for sterilization ionizing radiation
has largely been used by many sectors in health care area as it is efficient
in eliminating biological contaminants of several origins The difficulty of
deploying ionizing radiation in materials of human origin though
includes which possible alterations it might cause in human tissue In the
present work the extension of the biomechanical alteration generated by
radiation in bone tissue was evaluated by biomechanical methods More
specifically we evaluated alterations to the elastic modulus rupture
tension and percentage of deformation that are thought to be a
consequence of the sterilization process As a research model bovine
femur struts obtained from the diaphysis were used The struts were
frozen in a temperature of -70 degC and irradiated with crescent doses of
gamma radiation (0 125 25 e 50 kGy) During this work a cutting
system to obtain precision samples to use in such essays was developed
As results show that there is a significant different between the analyzed
characteristics in the different doses of radiation
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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42
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SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 1 2 OBJETIVOS 4 3 REVISAtildeO DA LITERATURA 5
31 Tecido oacutesseo 5 32 Bancos de Tecidos 8 33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo 11 34 Radiaccedilatildeo Ionizante 16 35 Biomecacircnica 18
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 21 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 23
41 Materiais 23 42 Comitecirc de Eacutetica 23 43 Meacutetodos 23
431 Processamento dos ossos 23 432 Irradiaccedilatildeo 24 433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 25 434 Caacutelculo teoacuterico da dose 26 435 Anaacutelise mecanodinacircmica 26
5 RESULTADOS 29 51 Processamento dos ossos 29 52 Irradiaccedilatildeo 29 53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 30
531 Caacutelculo teoacuterico da dose 30 54 Anaacutelise mecanodinacircmica 30
541 Suportes para cortes 30 542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis) 32 543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 33 544 Anaacutelise Estatiacutestica 34
6 DISCUSSAtildeO 36 6 DISCUSSAtildeO 36
61 Processamento dos ossos 36 62 Irradiaccedilatildeo 36 63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica 36 64 Anaacutelise biomecacircnica 37
641 Obtenccedilatildeo das amostras 37 642 DMA 38 643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo 38 644 Anaacutelise estatiacutestica 38
66 Consideraccedilotildees gerais 39 7 CONCLUSOtildeES 40 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 41
1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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1 INTRODUCcedilAtildeO
Ao se trabalhar com materiais para a aacuterea de sauacutede uma das
principais consideraccedilotildees eacute evitar possiacuteveis contaminaccedilotildees (RUTALA ocircs
WEBER 2004) dada a natureza da sua aplicaccedilatildeo Com o objetivo de se
evitar tais ocorrecircncias inuacutemeras teacutecnicas que visam diminuir ou eliminar
as mesmas foram desenvolvidas com a eficaacutecia dos resultados obtidos
variando muito dependendo do material a ser tratado e o objetivo da
aplicaccedilatildeo (BLOCK 1991)
Dentre os meacutetodos desenvolvidos para esterilizaccedilatildeo a radiaccedilatildeo
ionizante tem sido amplamente empregada por inuacutemeros setores da aacuterea
de sauacutede (SILVERMAN 1991) dada sua eficaacutecia em eliminar
contaminantes bioloacutegicos de diversas origens A preferecircncia pela utilizaccedilatildeo
desta teacutecnica estaacute relacionada a alguns fatores tais como a facilidade do
procedimento desde que se tenha acesso aacutes instalaccedilotildees necessaacuterias pelo
fato desse natildeo implicar em alteraccedilotildees significativas do material aleacutem de
ser efetuada apoacutes a embalagem final (DZIEDZIC-GOCLAWSKA et al
2005)
Em se tratando de materiais de origem humana tais como
sangue e tecidos a problemaacutetica da contaminaccedilatildeo atinge em novo
patamar como a maioria destes produtos tem acesso direto a corrente
sanguumliacutenea eou oacutergatildeos vitais a toleracircncia frente agrave contaminaccedilatildeo deve ser
inexistente (RUTALA 85 WEBER 2004) As consequumlecircncias da esterilizaccedilatildeo
ineficaz satildeo inuacutemeras e podem variar desde a inutilizaccedilatildeo e perda do
material ateacute o desenvolvimento de um grave quadro infeccioso no
paciente
Levando em conta tais consideraccedilotildees houve uma tendecircncia ao
uso das radiaccedilotildees ionizantes para esterilizaccedilatildeo de materiais de origem
humana Tais procedimentos jaacute vecircm sendo empregados (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA et al 2005) poreacutem existe uma relaccedilatildeo complexa entre a
dose de radiaccedilatildeo utilizada com o objetivo de esterilizar o tecido a natureza
da carga microbioloacutegica presente as alteraccedilotildees que podem ser causadas
no material pela exposiccedilatildeo acirc radiaccedilatildeo e as implicaccedilotildees finais quanto ao
uso
Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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Vaacuterios estudos vecircm sendo feitos com o objetivo de avaliar os
provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante em tecidos bioloacutegicos (BOURROUL
2004 DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2005) O grupo de Tecidos Bioloacutegicos do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em conjunto com o
Banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Cliacutenicas da
Faculdade de Medicina da USP (HC-FMUSP) vem desenvolvendo desde o
ano de 2000 estudos relacionados com estes efeitos mais especificamente
com enxertos de pele (BOURROUL 2004) Dando continuidade a estes
estudos o grupo vem avaliando os provaacuteveis efeitos da radiaccedilatildeo ionizante
em outros tecidos bioloacutegicos
Aleacutem disso a Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica (lAEA
do inglecircs International Atomic Energy Agency) tem promovido e prestado
suporte ao uso da radiaccedilatildeo ionizante para esterilizaccedilatildeo tendo fornecido
suporte teacutecnico cientiacutefico e financeiro a tais projetos (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000)
Desta forma no presente trabalho buscaremos avaliar qual a
extensatildeo das alteraccedilotildees causadas pela radiaccedilatildeo em tecidos oacutesseos Mais
especificamente estaremos avaliando as alteraccedilotildees mecaacutenicas que
decorrem deste processo de irradiaccedilatildeo Como modelo de eleiccedilatildeo foram
escolhidas reacuteguas oacutesseas retiradas da diaacutefase de feacutemures Tais reacuteguas satildeo
empregadas na praacutetica ciriirgica ortopeacutedica como substitutos para
algumas proacuteteses em cirurgias reconstrutivas (HADDAD 06 DUNCAN
2003)
Contudo a utilizaccedilatildeo de ossos humanos para pesquisa eacute restrita
devido aacute prioridade destes para utilizaccedilatildeo em transplantes Tendo em vista
a necessidade de um desenvolvimento inicial da metodologia para avaliar
a adequaccedilatildeo dos ossos apoacutes o tratamento com radiaccedilatildeo e que tal
desenvolvimento estaria consumindo ossos necessaacuterios para transplante
optou-se pela utilizaccedilatildeo de ossos bovinos durante este trabalho Tal
desenvolvimento estaacute de acordo com o estabelecido na Portaria ndeg 263 de
31 de marccedilo de 1999 que em seu artigo 1deg estabelece que A utilizaccedilatildeo de
tecidos oacutergatildeos ou partes do corpo humano para fins cientiacuteficos somente
seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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seraacute permitida depois de esgotadas as possibilidades de sua utilizaccedilatildeo em
transplantes
Anaacutelises posteriores com ossos humanos seratildeo necessaacuterias para
a validaccedilatildeo dos resultados obtidos com ossos bovinos Contudo estima-se
uma reduccedilatildeo significativa na quantidade de material utilizada graccedilas aacute
padronizaccedilatildeo atingida no atual estudo
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram
Desenvolver um sistema de cortes precisos para preparaccedilatildeo
de amostras originaacuterias de ossos
Avaliaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade dos ossos bovinos
congelados comparando-se irradiados e natildeo irradiados
3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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3 REVISAtildeO DA LITERATURA
31 Tecido oacutesseo
O tecido oacutesseo eacute uma especializaccedilatildeo do tecido conjuntivo tendo
como principal caracteriacutestica a mineralizaccedilatildeo da matriz extracelular
importante para as funccedilotildees de proteccedilatildeo de oacutergatildeos internos e sustentaccedilatildeo
relacionadas com este tecido A mineralizaccedilatildeo tambeacutem tem papel
importante na homeostase jaacute que os ossos satildeo fonte de armazenamento de
minerais (DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) As populaccedilotildees celulares que
compotildee este tecido satildeo
mdash Osteoblastos Satildeo a base originaacuteria da maioria das ceacutelulas
que compotildees o tecido oacutesseo sendo responsaacuteveis pela produccedilatildeo da matriz
oacutessea natildeo mineralizada (osteoacuteide) Tem origem em ceacutelulas mesenquimais
natildeo diferenciadas presentes na medula endoacutesteo perioacutesteo e nos canais
oacutesseos (DOWNEY 85 SIEGEL 2006)
mdash Ceacutelulas de revestimento ou de superfiacutecie Uma das possiacuteveis
evoluccedilotildees do osteoblasto muitas vezes referido como osteoacutecitos de
superfiacutecie ou osteoblastos em repouso dado seu estado relativamente
inativo metabolicamente A funccedilatildeo exata destas ceacutelulas ainda natildeo foi
esclarecida poreacutem existem inuacutemeras conjecturas (DOWNEY 86 SIEGEL
2006) Alguns autores sugerem que estas ceacutelulas sejam responsaacuteveis pela
regulaccedilatildeo do crescimento dos cristais de hidroxiapatita ou atuem como
barreira entre a matriz oacutessea e o liacutequido extracelular (MARKS 85 POPPOF
1988) Jaacute BUCKWALTER et al 1996 apud DOWNEY 8s SIEGEL 2006
sugere que estas ceacutelulas atuem na remoccedilatildeo do osteoacuteide para accedilatildeo dos
osteoclastos
mdash Osteoacutecitos Estima-se que mais de 90 das ceacutelulas oacutesseas
sejam osteoacutecitos Estes por sua vez satildeo originados de osteoblastos que
foram envolvidos pela matriz oacutessea Por causa da natureza da matriz
oacutessea os osteoacutecitos se encontram em lacunas desmineralizadas
conectadas por canaliacuteculos os quais conteacutem prolongamentos
citoplasmaacuteticos dos osteoacutecitos Tais prolongamentos permitem que estas
ceacutelulas se comuniquem formando uma rede Isso se torna importante
dado que natildeo haacute difusatildeo de nutrientes pela matriz e a rede exerce um
papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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papel decisivo no processo de alimentaccedilatildeo celular Aleacutem disso existem
indiacutecios de que a rede celular responda a estiacutemulos mecacircnicos e assim
coordene o processo de remodelamento (KLEIN-NULEND et al 2005)
mdash Osteoclastos Ceacutelulas gigantes multinucleadas originaacuterias de
precursores da linhagem de macroacutefagos responsaacuteveis pela reabsorccedilatildeo da
matriz oacutessea A reabsorccedilatildeo tem papel importante na homeostase pois
permite a disponibilizaccedilatildeo de minerais para o organismo Os mecanismos
efetores da reabsorccedilatildeo estatildeo relacionados com a adesatildeo do osteoclasto a
regiotildees exposta da matriz oacutessea Nestas regiotildees o osteoclasto eacute capaz de
gerar uma zona isolada de baixo pH onde satildeo liberadas enzimas
proteoliacuteticas A accedilatildeo conjunta do pH aacutecido e destas enzimas leva a
dissoluccedilatildeo e posterior reabsorccedilatildeo da matriz oacutessea (ROSS 85 CHRISTIANO
2006)
Estas ceacutelulas por sua vez podem se organizar em duas
estruturas oacutesseas distintas o osso compacto (cortical) e o osso esponjoso
(trabecular) como pode ser observado na Figura 01 O osso compacto eacute de
maior presenccedila no corpo humano aparecendo em 80 do esqueleto
maduro (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) O osso esponjoso pode ser
encontrado nas extremidades dos ossos longos envoltos por uma fina
camada de osso compacto
Osso esponjoso
Osso compacto
Figura 01 Macromorfologia do tecido oacutesseo observada na extremidade
proximal do feacutemur (BONE CURRICULUM 2005)
As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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As estruturas oacutesseas podem ainda ser compostas por osso
primaacuterio (tranccedilado) ou osso secundaacuterio (lamelar) O osso primaacuterio aparece
durante o estaacutegio embrionaacuterio e eacute totalmente reposto pelo osso secundaacuterio
em torno dos 4-5 anos em humanos Em indiviacuteduos adultos poreacutem
pode-se encontrar osso primaacuterio no iniacutecio da recuperaccedilatildeo de fraturas
(CROCl et al 2003) dentro das suturas cranianas e placas epifisaacuterias
(DOWNEY Ocirc5 SIEGEL 2006) A organizaccedilatildeo final dos ossos compacto e
esponjoso pode ser observada na figura 02
Compact Bone amp Spongy (Cancellous Bone)
Lacunae containing osteocytes
Lameliae
Canaliculi mdash
Osteon
Periosteum
Osteon of compact bone
Trabeculaeof spongy bone
aversian canai
Volkmanns canal
Figura 02 Organizaccedilatildeo do tecido oacutesseo (WIKIPEDIA 2006)
Apesar de sua aparecircncia riacutegida o tecido oacutesseo estaacute em constante
mudanccedila ou remodelaccedilatildeo Tal remodelaccedilatildeo visa reconstruir o tecido para
que esse se adequumle as necessidades de traccedilatildeo resistecircncia e nutriccedilatildeo
impostas ao organismo (DOWNEY 86 SIEGEL 2006) A efetivaccedilatildeo do
processo de remodelaccedilatildeo se daacute pela accedilatildeo conjunta das ceacutelulas oacutesseas
sendo o iniacutecio do processo dado pela exposiccedilatildeo da matriz oacutessea decorrente
da retraccedilatildeo das ceacutelulas de revestimento Paralelamente ocorre migraccedilatildeo
dos osteoclastos para a regiatildeo de matriz exposta e o comeccedilo da reabsorccedilatildeo
da matriz com formaccedilatildeo de uma lacuna (Lacuna de Howship) Numa
uacuteltima etapa os osteoblastos ocupam a regiatildeo de reabsorccedilatildeo e iniciam a
produccedilatildeo de osteoacuteide a qual seraacute mineralizada apoacutes 10 dias (GOUVEIA
2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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42
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2004) A regulaccedilatildeo deste processo eacute basicamente hormonal poreacutem ainda
existem duacutevidas quanto aos exatos mecanismos (KLEIN-NULEND et al
2005)
A constante adaptaccedilatildeo eacute importante para a recuperaccedilatildeo de
fraturas ou de procedimentos ciruacutergicos (CROCI et al 2003) No caso
especiacutefico dos transplantes oacutesseos a remodelaccedilatildeo se apresenta como o
mecanismo responsaacutevel pela incorporaccedilatildeo do enxerto pelo paciente
permitindo assim a substituiccedilatildeo do material enxertado por osso do proacuteprio
paciente (NATHER 2001)
Existem duas fontes possiacuteveis para os enxertos o proacuteprio
paciente (enxerto autoacutegeno) ou doadores (enxerto aloacutegeno) O padratildeo
ouro para transplante eacute sem duacutevida alguma o enxerto autoacutegeno jaacute que
este permite a utilizaccedilatildeo de material do proacuteprio paciente e no caso de
ossos permite o uso de enxertos vascularizados Estas duas condiccedilotildees
levam a uma recuperaccedilatildeo mais raacutepida (KNESER et al 2006) Contudo o
uso de enxertos autoacutegenos sacrifica tecidos de outras partes do corpo do
paciente e satildeo problemaacuteticos em casos em que reconstruccedilatildeo eacute massiva ou
repetida (HADDAD 2000) Uma outra possibilidade para transplantes estaacute
na utilizaccedilatildeo de enxertos originaacuterios de doadores vivos ou mortos
(aloacutegenos) Tais enxertos satildeo mais praacuteticos para a utilizaccedilatildeo tendo em
vista que como satildeo obtidos de doadores podem vir na quantidade e no
formato requeridos pelo meacutedico e natildeo provocam maiores injuacuterias ao
paciente A integraccedilatildeo do tecido nesses casos eacute um pouco mais lenta
devido agrave falta de vascularizaccedilatildeo inicial (HADDAD 2000)
32 Bancos de Tecidos
O aparecimento formal dos bancos de tecidos ocorreu agrave
aproximadamente 60 anos nos Estados Unidos e em alguns paiacuteses da
Europa (MONIG 85 VON VERSEN 2000) O surgimento dos bancos
acompanha o crescimento na demanda de tecidos humanos para uso em
procedimentos ciruacutergicos e foi responsaacutevel pelo aumento do uso rotineiro
de enxertos aloacutegenos (GALEA amp KERNEY 2005)
Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
86 MATHOR 2006)
Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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Inicialmente o uso de tecidos era desorganizado sem criteacuterios
globais ou regulatoacuterios sendo norteado pelas necessidades pontuais dos
meacutedicos ou de pesquisadores O aumento na demanda e a conscientizaccedilatildeo
no uso de material de origem humana contudo levaram a necessidade de
criaccedilatildeo de normas e procedimentos para seleccedilatildeo de doadores ablaccedilatildeo
estocagem e uso destes tecidos (MONIG amp VON VERSEN 2000 HERSON
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Atualmente existem diversos oacutergatildeos locais e internacional que
regulam o funcionamento dos bancos como por exemplo American
Association of Tissue Banks - AATB nos Estados Unidos e European
Association of Tissue Banks - EATB na Europa No Brasil a Agecircncia
Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (AN VISA) fiscaliza e controla o
funcionamento dos bancos assim como o uso de tecidos em transplantes
como determinado pelas seguintes legislaccedilotildees (HERSON et al 2002)
- Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que Dispotildee sobre a
remoccedilatildeo de oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de
transplante e tratamento e daacute outras providecircncias
- Decreto ndeg 2268 de 30 de junho de 1997 que Regulamenta a
Lei ndeg 9434 de 04 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento e daacute outras providecircncias
- Portaria ndeg 3407 de 05 de agosto de 1998 que Aprova o
Regulamento Teacutecnico sobre as atividades de transplantes e dispotildee sobre a
Coordenaccedilatildeo Nacional de Transplantes
- Lei ndeg 10211 de 23 de marccedilo de 2001 que Altera dispositivos
da Lei ndeg 9434 de 4 de fevereiro de 1997 que dispotildee sobre a remoccedilatildeo de
oacutergatildeos tecidos e partes do corpo humano para fins de transplante e
tratamento
- Portaria ndeg 1686 de 20 de setembro de 2002 que Aprova na
forma do Anexo I desta Portaria as Normas para Autorizaccedilatildeo de
Funcionamento e Cadastramento de Bancos de Tecidos
Musculoesqueleacuteticos pelo Sistema Uacutenico de Saiide
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Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
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diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
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natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
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em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
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Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
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se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
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mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
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ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
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nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
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tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
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sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
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deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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10
Aleacutem da regulaccedilatildeo legal muitos bancos de tecidos optam pela
adesatildeo a um sistema de gestatildeo da qualidade tendo em vista os benefiacutecios
natildeo soacute quanto ao controle de processos mas tambeacutem agraves consequumlentes
diminuiccedilotildees nos custos a oportunidade de melhorias teacutecnicas e uma
melhor adequaccedilatildeo as necessidades dos meacutedicos (MONIG 85 VON VERSEN
2000 HERSON amp MATHOR 2006)
As obrigaccedilotildees dos Bancos de Tecidos envolvem garantir e manter
as condiccedilotildees de uso dos tecidos para transplantes (HERSON et al 2001)
Para tanto existe um processo inicial de seleccedilatildeo de doadores baseado em
estudo do histoacuterico meacutedico e social do doador anaacutelise de exames
soroloacutegicos e de dados do prontuaacuterio de internaccedilatildeo aleacutem de exame fiacutesico
Durante esta fase procura-se excluir aqueles que apresentavam
mdash doenccedilas transmissiacuteveis graves tais como AIDS Hepatite B ou
C Doenccedila de Chagas Siacutefilis como alguns exemplos
mdash comportamento de risco exemplificado pelo uso de drogas
injetaacuteveis ou comportamento promiacutescuo
mdash faixa etaacuteria inadequada para obtenccedilatildeo de tecidos adequados
para suo (menor de 15 e maior de 60 anos)
mdash qualquer caracteriacutestica natildeo determinada que possa
representar risco como cicatrizes de origem desconhecida lesotildees
cutaacuteneas suspeitas e hepatomegalia por exemplo (HERSON et al 2002)
Caso seja aceita a doaccedilatildeo a retirada dos tecidos eacute feita por uma
equipe meacutedica treinada em ambiente esteacuteril e com a retirada estrateacutegica
ou recolocaccedilatildeo de proacutetese no local visando assim natildeo soacute evitar a
contaminaccedilatildeo e a obtenccedilatildeo de enxertos adequados como tambeacutem
preservar a integridade da aparecircncia do doador como estabelecido pelo
Decreto ndeg 226897
A uacuteltima etapa antes do armazenamento final do tecido envolve o
processamento deste As exigecircncias de processamento variam de acordo
com o tecido obtido (HERSON et al 2002 e VASTEL et al 2004) poreacutem
sempre deveriam envolver a aplicaccedilatildeo de um meacutetodo de esterilizaccedilatildeo Esta
esterilizaccedilatildeo visa garantir a seguranccedila do uso do enxerto
I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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I l
o primeiro paracircmetro a ser considerado durante a esterilizaccedilatildeo eacute
a carga microbioloacutegica inicial presente A determinaccedilatildeo desta carga nos
tecidos eacute um passo importante pois com base nesses dados pode-se
delimitar os paracircmetros dos passos seguintes de esterilizaccedilatildeo tendo em
vista que cargas menores natildeo necessitam de processamento mais extremo
para atingir os limites aceitaacuteveis (Security Assurance Levei -SAL) para uso
de aloenxertos de 10-6 UFCs (unidades formadoras de colocircnia) O SAL eacute
um valor derivado das curvas de morte dos microrganismos e representa a
chance de se encontra um microrganismo viaacutevel no caso esta chance eacute de
uma e um milhatildeo (YUSOF 2001a)
33 Meacutetodos de esterilizaccedilatildeo
Os meacutetodos de esterilizaccedilatildeo podem ter natureza variaacutevel sendo
fiacutesicos quiacutemicos ou eventualmente uma combinaccedilatildeo de ambos Cada
meacutetodo possui caracteriacutesticas proacuteprias as quais definem o espectro de
accedilatildeo e aplicaccedilatildeo (RUSSEL 1991) Isto implica em que dependendo dos
microorganismos a serem eliminados eou da aplicaccedilatildeo do produto a ser
esterilizado os diversos meacutetodos daratildeo resultados variados e assim deve-
se ter em mente qual o objetivo final do processo para escolher o meacutetodo
mais adequado (RUTALA 06 WEBER 2004) Outro ponto importante a
considerar eacute se o produto a ser esterilizado natildeo seraacute afetado
adversamente seja direta ou indiretamente durante o processo Este tipo
de consideraccedilatildeo evita desperdiacutecio de material perda de rendimento em
procedimentos e mais importante para produtos da aacuterea de sauacutede vaacuterias
complicaccedilotildees para o paciente
Alguns exemplos de meacutetodos de esterilizaccedilatildeo atualmente
empregados satildeo
mdash Calor O emprego do calor como meacutetodo de esterilizaccedilatildeo jaacute foi
consagrado Dentre as formas possiacuteveis estatildeo o calor uacutemido associado
com vapor de aacutegua ou apenas aacutegua em ebuliccedilatildeo e o calor seco onde haacute
transferecircncia teacutermica direta para o material Ambas as formas vecircem largo
emprego na aacuterea da sauacutede O calor uacutemido atua nas interfaces onde ocorre
contato do material com o vaporliacutequido e assim sua eficaacutecia esta
12
diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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42
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diretamente relacionada com o acesso ao material Uma vez que se tenha
acesso a esterilizaccedilatildeo ocorre de maneira raacutepida eficaz e relativamente
barata Jaacute a eficaacutecia do calor seco depende apenas da garantia que o
material a ser esterilizado tenha atingido a temperatura correta jaacute que a
transferecircncia de energia eacute direta Isto torna o meacutetodo lento e demorado de
maneira geral aleacutem do fato de serem necessaacuterias temperaturas mais
elevadas do que as do calor uacutemido A principal desvantagem em ambos os
casos se daacute pelo proacuteprio mecanismo de accedilatildeo o calor pode danificar ou
alterar as propriedades de alguns produtos como por exemplo alguns
suplementos alimentares (JOSLYN 1991) No caso de tecidos bioloacutegicos o
uso do calor natildeo eacute recomendado tendo em vista que as temperaturas
envolvidas satildeo suficientes para causar alteraccedilotildees nestes (PHILIPS 1997)
mdash Filtraccedilatildeo Sem duacutevida um dos meacutetodos mais antigos de
esterilizaccedilatildeo a filtraccedilatildeo eacute empregada como meacutetodo de separaccedilatildeo desde a
antiguidade poreacutem os primeiros filtros desenhados para remoccedilatildeo de
bacteacuterias datam de 1884 e eram fabricados em vidro Com o
desenvolvimento dos conhecimentos teacutecnicos sobre fabricaccedilatildeo e sobre os
microorganismos houve tambeacutem um desenvolvimento na qualidade e
eficaacutecia dos filtros Atualmente se utilizam membranas de celulose de
porosidade conhecida que usualmente variam de 045 a 022 |um A
dimensatildeo dos poros eacute importante na filtraccedilatildeo pois a separaccedilatildeo dos
microorganismos se daacute por uma barreira fiacutesica que reteacutem partiacuteculas
maiores que o tamanho do poro (LEVY 86 LEAHY 1991) As dimensotildees dos
poros acima satildeo suficientes para reter bacteacuterias fungos e leveduras e tem
aplicaccedilatildeo corrente nas induacutestrias Contudo a eliminaccedilatildeo de viacuterus requer
filtros de 15-40 nm e eacute extremamente importante para produtos derivados
de plasma humano (KLEIN 2005) A filtraccedilatildeo eacute normalmente uma teacutecnica
barata e simples poreacutem a aplicaccedilatildeo estaacute limitada agravequeles produtos
passiacuteveis de serem filtrados tais como soluccedilotildees liacutequidos ou gases (LEVY 85
LEAHY 1991)
mdash Oacutexido de etileno (ETO) Agente quiacutemico descoberto em 1859
muito eficiente na esterilizaccedilatildeo de produtos e tem sido empregado na
forma de vapor na aacuterea meacutedica devido a seu alto poder de penetraccedilatildeo
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natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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13
natildeo ser corrosivo para maioria dos materiais e de ser aplicado a baixas
temperaturas O mecanismo de accedilatildeo do ETO se daacute pela alquilaccedilatildeo de
compostos no interior dos microorganismos principalmente a guanina e a
adenina presente no DNA Por esta razatildeo o ETO eacute extremamente eficiente
na eliminaccedilatildeo da maioria dos microorganismos seja na forma vegetativa
ou de esporos Existem poreacutem limitaccedilotildees quanto ao uso do ETO
inicialmente o vapor de ETO eacute explosivo quanto atinge a concentraccedilatildeo de
3 no ar aleacutem disso o composto eacute toacutexico potencialmente canceriacutegeno
teratogecircnico mutagecircnico e neurotoacutexico Tendo em vista tais limitaccedilotildees a
utilizaccedilatildeo de materiais esterilizados por ETO requer uma seacuterie de passos
de seguranccedila Jaacute embutido no processo de esterilizaccedilatildeo haacute uma etapa de
aeraccedilatildeo que visa retirar o vapor e seus possiacuteveis subprodutos presentes
no equipamento Tal etapa pode consistir apenas na circulaccedilatildeo de ar
esteacuteril ou na combinaccedilatildeo de ciclos de vaacutecuo A duraccedilatildeo da aeraccedilatildeo pode
variar de algumas horas a um dia dependendo das caracteriacutesticas dos
materiais esterilizados Aleacutem dessa etapa eacute imprescindiacutevel que o vapor jaacute
utilizado de ETO seja tratado antes de ser eliminado para o ambiente O
tratamento muitas vezes consiste na reaccedilatildeo do vapor com aacutegua para
formaccedilatildeo de etileno glicol O uso de EPI (Equipamento de Proteccedilatildeo
Individual) por todos os envolvidos no processo de esterilizaccedilatildeo eacute
obrigatoacuterio para evitar ao maacuteximo a exposiccedilatildeo ao ETO Durante o processo
de esterilizaccedilatildeo podem ser formados subprodutos na presenccedila de iacuteons
cloro (etileno cloridrina) ou de aacutegua (etileno glicol) tais compostos tambeacutem
satildeo toacutexicos e de difiacutecil remoccedilatildeo Tendo em vista o contato direto que certos
produtos meacutedicos e tecidos transplantados tem com a corrente sanguumliacutenea
e os oacutergatildeos dos pacientes ambos natildeo devem ser esterilizados com ETO jaacute
que os resiacuteduos deixados por tal processo mesmo com os cuidados para
reduccedilatildeo e diminuiccedilatildeo destes apresentam riscos ao paciente devido a seus
possiacuteveis efeitos toacutexicos(POSSARl 2003a)
mdash Vapor de formaldeiacutedo O emprego do vapor de formaldeiacutedo
surgiu como uma das alternativas ao uso do ETO A accedilatildeo sobre
microorganismos deste composto eacute conhecida dede 1888 e os primeiros
estudos sobre a eficaacutecia na forma de vapor datam de 1906 Poreacutem apenas
Cuumlmsk) - ^^^^ hiuumlCLEARSP-IPEM
14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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14
em 1966 foi desenvolvida uma teacutecnica que permitisse o uso do vapor de
formaldeiacutedo em baixas temperaturas A teacutecnica conhecida por LTSF (do
inglecircs Low Temperature Steam and Folmaldehyde Sterilization) permite o
uso do vapor de formaldeiacutedo a 2 entre 56-60degC A atuaccedilatildeo sobre
microorganismos eacute semelhante a do ETO alquilando proteiacutenas e aacutecidos
nucleicos no interior dos microorganismos De maneira geral o LTSF eacute
superior ao ETO sendo mais econocircmico de mais faacutecil utilizaccedilatildeo e mais
saudaacutevel para o meio ambiente e para a equipe que o utiliza A principal
limitaccedilatildeo contudo se encontra no fato que materiais que absorvam o
formaldeiacutedo em grandes quantidades natildeo poderem ser esterilizados por
esta teacutecnica jaacute que haacute uma enorme dificuldade em eliminar o produto
impregnado (POSSARI 2003b)
mdash Plasma de peroacutexido de hidrogecircnio Como descrito pelo proacuteprio
nome esta teacutecnica se baseia na associaccedilatildeo de vapor de peroacutexido de
hidrogecircnio com plasma de baixa temperatura Tal tecnologia data dos
anos 80 tendo sido aprovada pelo FDA (Food and Drug Administration)
apenas em 1993 O mecanismo de accedilatildeo de esterilizaccedilatildeo por plasma de
peroacutexido de hidrogecircnio se daacute pela formaccedilatildeo de radicais livres os quais
reagem inespecificamente com inuacutemeros compostos celulares e levam a
uma inativaccedilatildeo eficiente de esporos bacteacuterias e viacuterus Em comparaccedilatildeo
com o ETO este meacutetodo natildeo eacute toacutexico jaacute que os subprodutos principais satildeo
aacutegua e oxigecircnio Poreacutem haacute a necessidade de se investir em embalagens
especiais para os produtos estes natildeo podem conter compostos que
absorvam o peroacutexido tais como celulose e derivados e a penetraccedilatildeo natildeo eacute
ideal (POSSARI 2005)
mdash Radiaccedilatildeo UV A radiaccedilatildeo UV (ultra-violeta) eacute a parte do
espectro eletromagneacutetico que se encontra entre 15 nm e 400 nm poreacutem a
regiatildeo de interesse nos processos de esterilizaccedilatildeo vai de 220 ateacute 300 nm
(SHECHMEISTER 1991) Tal radiaccedilatildeo tem sido amplamente utilizada
como agente para esterilizaccedilatildeo de aacutegua sendo eficiente contra bacteacuterias e
(oo)cistos (ANDERSON et al 2003) O mecanismo de accedilatildeo da radiaccedilatildeo UV
envolve principalmente a formaccedilatildeo de diacutemeros de timina no DNA os
quais tem efeito letal sobre o microrganismo
15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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15
Figura 03 Formaccedilatildeo de diacutemeros de timina pela radiaccedilatildeo UV (STILLMAN
2000)
Outros eventos tambeacutem estatildeo associados com a irradiaccedilatildeo UV
poreacutem seus efeitos sobre o microrganismo ainda natildeo satildeo claros Tal
radiaccedilatildeo tem uma aplicaccedilatildeo maior na esterilizaccedilatildeo de ar aacutegua ou
superfiacutecies dada sua baixa penetrabilidade Uma limitaccedilatildeo do uso eacute que
pode ocorrer uma recuperaccedilatildeo do microrganismo quando este eacute exposto agrave
luz visiacutevel ou proacutexima ao visiacutevel pois ocorre uma fotoreativaccedilatildeo dos
produtos danificados levando a recuperaccedilatildeo dos microrganismos
(SHECHMEISTER 1991)
mdash Radiaccedilatildeo ionizante O uso da radiaccedilatildeo ionizante permite a
esterilizaccedilatildeo de materiais em baixas temperaturas inclusive do material
congelado (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000) A radiaccedilatildeo tem dois
mecanismos de accedilatildeo um efeito direto sobre as moleacuteculas dos
microrganismos quebrando lesando ou fundindo as estruturas
principalmente do DNA e outro efeito indireto causado pela formaccedilatildeo de
radicais livres com a radioacutelise da aacutegua Tais radicais interagem com
moleacuteculas biologicamente importantes em uma reaccedilatildeo em cadeia
causando inuacutemeros danos ao microrganismo e culminando com a morte
deste (YUSOF 2001b) As principais vantagens do uso da radiaccedilatildeo
ionizante estatildeo na sua boa penetrabilidade na mateacuteria (especialmente em
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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YUSOF N Effect of Radiation on Microorganisms - Mechanism of Radiation Sterilization In NATHER A (Ed) The Scientific Basis of Tissue Transplantation - Advances in Tissue Banking vol5 1 ^ ^d Singapura World Scientific Printers 2001b p 342-357
16
se tratando de raios y) que permite um acesso maior ao locais
contaminados aleacutem de minimizar a manipulaccedilatildeo do material jaacute que natildeo
haacute necessidade de abertura ou troca das embalagens na sua eficaacutecia em
eliminar microrganismos e no fato de natildeo gerar quaisquer resiacuteduos
Contudo o uso da radiaccedilatildeo ainda eacute restrito devido agrave natureza das
instalaccedilotildees necessaacuterias para tal uso e pelo pouco conhecimento do que
altas doses de radiaccedilatildeo podem gerar de alteraccedilotildees na maioria dos
materiais bioloacutegicos (DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
O principal paracircmetro para a avaliaccedilatildeo da eficaacutecia de um
processo em reduzir uma dada carga microbioloacutegica eacute estabelecido pelo
valor Dio que eacute o valor necessaacuterio de exposiccedilatildeo para reduzir a populaccedilatildeo
total de microrganismos em 90 ou um log O valor Dio eacute obtido se
avaliando uma curva semilogaritmica de dose-reposta onde satildeo cruzados
os dados de dose pela diminuiccedilatildeo da populaccedilatildeo A unidade deste valor
varia de acordo com o processo empregado jaacute que o fator envolvido no
sucesso pode variar e de acordo com o microrganismo tendo em vista que
a resistecircncia a um dado processo varia de acordo com a espeacutecie (PFLUG 85
HOLCOMB 1991) No caso da radiaccedilatildeo ionizante o valor Dio eacute expresso
em dose absorvida cuja unidade eacute o Gray (Gy) (DZIEDZIC-GOCLAWSKA
2000) e em meacutedia eacute de 25 kGy levando-se em conta os esporos mais
resistentes a radiaccedilatildeo (ARCAL 2002)
34 Radiaccedilatildeo Ionizante
A eficaacutecia da radiaccedilatildeo ionizante na inativaccedilatildeo de
microorganismos eacute conhecida desde 1886 quando foram realizados por
Roentgen experimentos com raios-X A primeira observaccedilatildeo da accedilatildeo de
partiacuteculas beta e de raios gama produzidos por isoacutetopos naturais em
diferentes materiais e em tecidos foi feita por Pierre e Marie Currie (1899)
Em 1929 (apud HERSON amp MATHOR 2006) Marie Curie publicou um
trabalho teoacuterico sobre a inativaccedilatildeo de bacteacuterias por radiaccedilatildeo
Radiaccedilatildeo ionizante eacute toda aquela capaz de gerar iacuteons pelo
deslocamento de eleacutetrons de moleacuteculas e aacutetomos (DAHLAN 2001)
Existem dois grupos
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mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
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ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
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nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
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tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
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sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
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deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
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interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
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Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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17
mdash partiacuteculas de alta energia tais como partiacuteculas a (alfa) e P
(beta) poacutesitrons e necircutrons sendo estas obtidas pela desintegraccedilatildeo
radioativa de isoacutetopos ou no caso especiacutefico de partiacuteculas (i e poacutesitrons
gerados por equipamentos especiacuteficos De todas estas os necircutrons
possuem a capacidade extra de induzir radioatividade (SILVERMAN 1991)
mdash ondas eletromagneacuteticas com pequeno comprimento de onda e
grande energia como radiaccedilatildeo y (gama) obtida de radioisoacutetopos e raios X
gerados por maquinaacuterio (DAHLAN 2001)
A quantidade de radiaccedilatildeo absorvida pela mateacuteria pode ser
mensurada e a unidade no Sistema Internacional utilizada para esta
grandeza eacute o Gray (Gy) que corresponde a 1 joulequilograma (INMETRO
2003) A medida de dose eacute importante pois muitos efeitos desencadeados
pela radiaccedilatildeo nocivos ou natildeo tecircm caracteriacutestica dose-dependente
(DZIEDZIC-GOCLAWSKA 2000)
Os iacuteons e eleacutetrons formados pela radiaccedilatildeo ionizante satildeo capazes
de gerar radicais livres altamente reativos os quais podem desencadear
reaccedilotildees quiacutemicas com outros compostos que eventualmente estejam
presentes ou mesmo entre si (DAHLAN 2001 SILVERMAN 2001) Tais
interaccedilotildees podem levar a alteraccedilotildees nas propriedades fiacutesicas e quiacutemicas
dos materiais (p ex JARRY et al 2002 OLIVEIRA et al 2005) Contudo
estas alteraccedilotildees podem ser desejaacuteveis como visto em OTAGURO et al
(2004) e CHMIELESWSKI (2005)
A ionizaccedilatildeo gera um fenoacutemeno em meio aquoso ou rico em aacutegua
a aacutegua passa por um processo de radioacutelise com formaccedilatildeo de inuacutemeras
espeacutecies reativas Tal radioacutelise estaacute esquematizada a seguir
18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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18
ionizing Radiation -
excited wator
H 0
H O
R E
radicagravekf
Radiolysis of water H 0 |Aienal971 |
Figura 04 Radioacutelise da aacutegua Os radicais livres formados se encontram
em vermelho na figura Esquema proposto por Arena (apud SCARR 2005)
Esta situaccedilatildeo eacute importante quando se analisa a interaccedilatildeo da
radiaccedilatildeo ionizante com organismos vivos os quais satildeo compostos em
grande parte por aacutegua Nestes casos inuacutemeros efeitos danosos podem vir
a ocorrer da interaccedilatildeo dos radicais livres com moleacuteculas biologicamente
importantes tais como DNA e lipiacutedeos de membrana (YUSOF 2001b)
35 Biomecacircnica
Existem diversas definiccedilotildees para biomecacircnica poreacutem natildeo haacute um
enunciado geral sobre quais sejam exatamente seus objetos de estudo Em
parte a biomecacircnica pode ser definida como o estudo da mecacircnica das
coisas vivas (LAPEDES D apud BATISTA 2001) Este conceito em si eacute
apesar de tecnicamente correto pobre e natildeo vislumbra todos as possiacuteveis
aplicaccedilotildees desta ciecircncia Uma definiccedilatildeo corrente eacute que a biomecacircnica eacute
a ciecircncia de movimento que descreve o movimento do corpo humano
utilizando os meacutetodos da mecacircnica (BARROW 85 BROWN apud
BATISTA 2001) Tal definiccedilatildeo eacute uma das visotildees aplicaacuteveis sobre a
biomecacircnica e eacute comumente empregada na medicina fisioterapia e
educaccedilatildeo fiacutesica Ela leva em conta conceitos praacuteticos e de aplicaccedilatildeo direta
19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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19
nas aacutereas envolvidas Para o presente estudo contudo foi levada em
conta a seguinte definiccedilatildeo Biomecaacutenica eacute o estudo e a anaacutelise da
mecaacutenica dos organismos vivos O estudo e a anaacutelise pode ser feita em
diversos niacuteveis do molecular na qual biomateriais moleculares tais como
colaacutegeno e elastina saacuteo considerados ao macroscoacutepico seguindo toda
gama ateacute o niacutevel dos tecidos e oacutergatildeos (WIKIPEDIA 2006b) Sob esta luz eacute
possiacutevel enquadrar dentro do objeto de estudo da biomecaacutenica as
propriedades dos biomateriais que compotildee o corpo tais como os ossos
Estes considerando sua composiccedilatildeo satildeo definidos como
compoacutesitos que satildeo materiais formados por duas ou mais fases distintas
No caso especiacutefico satildeo trecircs fases aquosa orgaacutenica e mineral A fase
aquosa eacute essencialmente a aacutegua presente no liacutequido intersticial e sua
funccedilatildeo exata natildeo eacute clara (YAMASHITA et al 2001) A fase orgacircnica eacute
composta principalmente por colaacutegeno tipo I que eacute composto por uma
tripla heacutelice de cadeias polipeptiacutedicas organizadas na forma de fibrilas
Estas fibrilas estatildeo precisamente organizadas sobrepostas e em sentidos
opostos entre camadas mantendo o espaccedilo constante entre as fibrilas
adjacentes Muitas ligaccedilotildees cruzadas entre as moleacuteculas satildeo formadas
formando uma estrutura estaacutevel e porosa (DOWNEY 85 SIEGEL 2006) Tal
estrutura eacute responsaacutevel pela elasticidade dos ossos (YAMASHITA et al
2001) A fase mineral eacute composta por hidroxiapatita e fornece ao osso
rigidez necessaacuteria para suas funccedilotildees (DOWNEY 8amp SIEGEL 2006)
As caracteriacutesticas mecacircnicas de um material podem ser
mensuradas para tanto existem alguns conceitos de referecircncia a serem
considerados No caso de ossos duas definiccedilotildees satildeo importantes a de
tensatildeo (stress) e deformaccedilatildeo (strain) A tensatildeo em ensaios mecacircnicos eacute
definida como forccedila sobre unidade de aacuterea e pode ser classificada como
compressiva que quando aplicada diminuiacute o tamanho do material
tensora se aumentar o tamanho do material ou de cisalhamento quando
promove o deslizamento de uma regiatildeo do material em relaccedilatildeo agrave outra A
sua unidade eacute o Pascal (Pa) este em unidades mais elementares eacute definido
como a forccedila em Newtons (N) aplicada sobre uma aacuterea em metros
quadrados (m^) Em um sistema bioloacutegico normalmente as trecircs forccedilas de
20
tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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tensatildeo estatildeo sendo aplicadas simultaneamente A deformaccedilatildeo eacute definida
como a porcentagem de alteraccedilatildeo no comprimento de um material ou
seja quanto do comprimento original foi alterado
A relaccedilatildeo dessas duas constantes pode ser observada na curva
de resposta tiacutepica de um ensaio universal de tensatildeo-deformaccedilatildeo como
visto abaixo (Fig 05)
Ponto de ruptura
Deformaccedilatildeo
Figura 05 Exemplo de curva de tensatildeo deformaccedilatildeo (baseado em DOWNEY
85 SIEGEL 2006)
Muitas informaccedilotildees podem ser retiradas da curva de tensatildeo-
deformaccedilatildeo De imediato tal curva pode ser dividida em duas regiotildees a de
deformaccedilatildeo elaacutestica e a de deformaccedilatildeo plaacutestica (DOWNEY 85 SIEGEL
2006)
A regiatildeo de deformaccedilatildeo elaacutestica corresponde agrave aacuterea sobre a
curva onde haacute linearidade de resposta Em tal regiatildeo o material se
comporta como uma mola se deformando linearmente de acordo com a
forccedila aplicada e retornando a sua forma original ao se retirar a tensatildeo A
inclinaccedilatildeo da curva na regiatildeo elaacutestica eacute chamada de moacutedulo elaacutestico ou
moacutedulo de Young Tal moacutedulo eacute a medida da rigidez intriacutenseca do
material A rigidez pode variar de acordo com o indiviacuteduo por exemplo haacute
uma diferenccedila entre a rigidez oacutessea de um atleta e de uma pessoa
21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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21
sedentaacuteria contudo o moacutedulo de elasticidade eacute proacuteximo tendo em vista
que este eacute caracteriacutestico para cada material (TURNER 85 BURR 1993)
Em alguns casos haacute uma diferenccedila de comportamento elaacutestico
do material dependendo da direccedilatildeo em que a forccedila eacute aplicada neste Tais
materiais satildeo conhecidos como anisotroacutepicos e tal caracteriacutestica eacute comum
em compoacutesitos de origem bioloacutegica tais como madeira e ossos Materiais
cujas propriedades natildeo variam com a direccedilatildeo satildeo conhecidos como
isotroacutepicos (TURNER 85 BURR 1993) No caso de ossos a direccedilatildeo
preferencial varia se o osso eacute cortical ou trabecular Considerando-se
ossos corticais a direccedilatildeo preferencial de resistecircncia ecirc a longitudinal
enquanto para o osso trabecular a direccedilatildeo preferencial eacute paralela ao
sistema trabecular O comportamento em ambos os casos condiz com a
funccedilatildeo de sustentaccedilatildeo exercida pelo esqueleto jaacute que corresponde a
direccedilatildeo da forccedila que eacute exercida quando o indiviacuteduo estaacute ereto (DOWNEY 85
SIEGEL 2006)
Haacute um ponto de transiccedilatildeo no qual o material passa de uma
deformaccedilatildeo elaacutestica para uma deformaccedilatildeo plaacutestica que eacute permanente
independente da presenccedila contiacutenua de forccedila aplicada e estaacute relacionada
com a deformaccedilatildeo quebra ou alteraccedilatildeo na microestrutura do material
Este ponto eacute chamado de ponto de limite de escoamento na curva tensatildeo-
deformaccedilatildeo Tal ponto corresponde atilde tensatildeo aplicada que leva a
deformaccedilatildeo plaacutestica A aplicaccedilatildeo de tensatildeo apoacutes este ponto pode levar a
quebra ou ruptura do material ao se atingir o ponto de ruptura (TURNER
86 BURR 1993) Uma aplicaccedilatildeo desse conceito pode ser utilizada em
ossos Quando se aplica uma tensatildeo que corresponda a tal ponto tem-se
a ocorrecircncia de uma fratura (DOWNEY 86 SIEGL 2006)
351 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
O DMA permite a determinaccedilatildeo quantitativa das propriedades
mecacircnicas de uma amostra ao submetecirc-la a uma carga oscilante em uma
dada frequumlecircncia temperatura e durante um tempo determinado A
aplicaccedilatildeo da carga tem por objetivo gerar uma deformaccedilatildeo p r e shy
determinada na amostra e a relaccedilatildeo entre a forccedila exercida para atingir tal
22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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22
deformaccedilatildeo e as dimensotildees da amostra permitem obter a quantificaccedilatildeo
das caracteriacutesticas biomecatildenicas
Os resultados obtidos com o DMA se encontram na porccedilatildeo
inicial da curva de tensatildeo-deformaccedilatildeo jatilde que as deformaccedilotildees causadas
satildeo normalmente muito pequenas em relaccedilatildeo atildes dimensotildees do material
Esta teacutecnica eacute assim interessante pois natildeo eacute destrutiva e permite que as
amostras sejam re-analisadas ou utilizadas em outras teacutecnicas
A anaacutelise dinacircmica representa uma situaccedilatildeo mais semelhante
agravequela observada em seres vivos jaacute que nesses casos as tensotildees aplicadas
satildeo decorrentes do movimento e assim variaacuteveis Aleacutem disso a maioria
das fraturas ocorre em condiccedilotildees de aplicaccedilatildeo dinaacutemica de forccedilas
(YAMASHITA et al 2001)
O graacutefico abaixo mostra um exemplo de curva obtida pelo
meacutetodo de DMA
4440 1
4420
bdquo 4400 j
pound ]
o 4380 i 4360
4340
4320
4300
4280
4260
020
bull 020 i
I 019
I I i ois s
ogt
018 i I 017 I
1 017
016 4 5 6 7
Tempo (minutos)
10
Modulo de elasticidade bull - Tangente delta
Figura 06 Exemplo de curva obtida com a DMA (baseado em resultados
obtidos)
Tal curva apresenta a variaccedilatildeo do moacutedulo de elasticidade em
funccedilatildeo do tempo de ensaio A curva que aparece juntamente com aquela
referente ao moacutedulo representa a tangente delta Tal tangente eacute a
quantificaccedilatildeo da energia dissipada pelo material durante o ensaio
dinacircmico
23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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23
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Materiais
Foram utilizados feacutemures bovinos adquiridos em frigoriacuteficos para
simulaccedilatildeo do processamento dos ossos de acordo com os requerimentos
especiacuteficos para o armazenamento a -70degC e para posterior irradiaccedilatildeo
(ISO-GUIDE 11137 revisatildeo 2006)
A irradiaccedilatildeo das amostras foi feita no Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees - IPEN em fonte de Co^o (Gamacell)
Todos os demais reagentes utilizados foram de qualidade Proacute-
Analisis e a aacutegua foi de qualidade Milli-Q
O resiacuteduo de material bioloacutegico natildeo patogecircnico foi inativado com
hipoclorito de soacutedio colocado em sacos brancos e depositado no lixo
bioloacutegico localizado na parte externa do bioteacuterio do IPEN Sendo que o
material foi obtido em frigoriacuteficos autorizados para venda ao consumidor
natildeo existiu a possibilidade de contaminaccedilatildeo patogecircnica portanto natildeo
houve a necessidade do material ser autoclavado antes do descarte no lixo
bioloacutegico
42 Comitecirc de Eacutetica
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em
Pesquisa do IPEN e se encontra registrado sob o nuacutemero de identificaccedilatildeo
081CEP-IPENSP
43 Meacutetodos
431 Processamento dos ossos
Todos os ossos bovinos analisados durante esse estudo foram
submetidos a um processo inicial de limpeza visando assim diminuir sua
contaminaccedilatildeo inicial e retirar todas as partes moles associadas ao osso
O processo de limpeza se iniciou com a raspagem das partes
moles e a retirada da medula oacutessea utilizando-se um bisturiacute para tanto
Apoacutes a raspagem inicial os ossos foram imersos em aacutegua
destilada para a retirada de sangue que estivesse presente em seu
24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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24
interior e para facilitar as subsequumlentes raspagens de residuos A imersatildeo
teve a duraccedilatildeo de 30 minutos
A raspagem e a imersatildeo em aacutegua destilada foram repetidas trecircs
vezes cada buscando uma maior eficiecircncia na limpeza
A etapa final consistiu em um banho em peroacutexido de hidrogecircnio
10 volumes durante duas horas Tal banho serve como uma etapa de
reduccedilatildeo da carga microbioloacutegica alecircm de atuar como agente clarificante
Apoacutes o banho em peroacutexido os ossos foram embalados um a um
de acordo com as normas de embalagem para produtos a serem irradiados
(embalagens duplas plaacutesticas apirogecircnicas natildeo permeaacuteveis ao ar e a
aacutegua passiacuteveis de irradiaccedilatildeo identificadas e datadas) A estocagem se deu
em freezer a uma temperatura de -70degC (ISO-GUIDE 11607 revisatildeo
2006)
432 Irradiaccedilatildeo
Para as anaacutelises de alteraccedilotildees induzidas pela radiaccedilatildeo as
amostras foram irradiadas em um irradiador de Cobalto-60 tipo
Gammacell com atividade no momento das anaacutelises de 49094 Ci e taxa
de dose de 406 kGyh (dimensotildees internas de 20 cm de altura x 145 cm
de diacircmetro)
Figura 07 Gammacell
Como controles de dose foram utilizados dosiacutemetros polimeacutericos
Red Perspex (5-50 kGy)
25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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25
As doses avaliadas foram de 125 25 e 50 kGy Tais doses
foram escolhidas devido a sua utilizaccedilatildeo na rotina (DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2000) em concordacircncia com as normas vigentes (ISO-
GUIDE 11607-1) e por se buscar linearidade para as posteriores anaacutelises
Como controle negativo foram utilizadas amostras natildeo irradiadas mas
submetidas agraves mesmas condiccedilotildees de processamento embalagem e
estocagem Todas as amostras foram irradiadas em gelo seco com o intuito
de mantecirc-las o mais proacuteximo das condiccedilotildees de estocagem e evitar
quaisquer interferecircncias decorrentes da variaccedilatildeo de temperatura Os
dosiacutemetros foram colocados na face interna e externa dos ossos com
intuito de se prever a dose obtida no interior dos ossos
433 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
Para esta anaacutelise foram utilizados aneacuteis feitos a partir de cortes
transversais de um feacutemur bovino Foram empregados quatro discos cada
um correspondendo a uma dose a ser analisada Esses discos foram
processados e irradiados como descrito anteriormente Uma das amostras
natildeo foi irradiada com o intuito de determinar a carga microbioloacutegica
inicial
Apoacutes o processamento em capela de fluxo laminar as amostras
foram imersas em 100 ml de soluccedilatildeo salina esteacuteril dentro das embalagens
originais e em seguida novamente lacradas A seguir todas as amostras
foram agitadas em agitador orbital agrave temperatura ambiente em uma
velocidade de 150 rpm por 10 minutos Tal procedimento visa retirar os
microorganismos presentes na amostra para posterior contagem
Apoacutes a agitaccedilatildeo as amostras foram abertas novamente em
capela de fluxo laminar e foram preparadas de acordo com o seguinte
padratildeo paras a amostra natildeo irradiada foi feita diluiccedilatildeo decimal em salina
do extrato obtido partindo de 10deg ateacute 10-6 Paras a amostra irradiada com
125 kGy foi feita diluiccedilatildeo decimal de 10deg ateacute 10-^ Jaacute para as amostras de
25 kGy e 50 kGy natildeo foi feita diluiccedilatildeo do extrato para contagem Apoacutes as
diluiccedilotildees as amostras foram passadas individualmente por membranas
filtrantes com poro de 045 um
26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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26
As membranas filtrantes empregadas para as diluiccedilotildees foram
divididas ao meio para se avaliar o crescimento de fungos em Aacutegar
Sabouraud e bacteacuterias em TSA (Aacutegar Peptona Caseiacutena - Tripticase Soy
Agar) As amostras foram encubadas em estufa 25degC (Sabouraud) e 32degC
(TSA) e analisadas durante sete dias A avaliaccedilatildeo foi feita com a contagem
das colocircnias (UFCs) ao final do tempo de encubaccedilatildeo e o caacutelculo de UFCs
total foi feito escolhendo as contagens nas placas onde se desenvolveram
colocircnias em niimero proacuteximo de 100 quando possiacutevel tirando a meacutedia
entre os nuacutemeros obtidos para fungos e bacteacuterias e se multiplicando pela
diluiccedilatildeo
434 Caacutelculo teoacuterico da dose
De posse da carga microbioloacutegica inicial foi calculada a dose
teoacuterica necessaacuteria para se atingir o valor de 10-6 UFCs determinado como
seguranccedila Tal valor foi obtido segundo a seguinte foacutermula
Onde Dt eacute a dose teoacuterica para se atingir o SAL de 10-6 Dio eacute o
valor de referecircncia para contaminaccedilatildeo por esporos lO^ontageni obtida eacute a
potecircncia de 10 encontrada durante a contagem de UFCs
Os valores de empregados foram a contagem obtida na
determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica (lO^ontagein obtida) g o valor de
referecircncia de 25 kGy para Dio (ARCAL 2002)
435 Anaacutelise mecanodinacircmica
4351 Suportes para cortes
Para minimizar os erros decorrentes do uso de amostras
heterogecircneas para anaacutelise foram desenvolvidos dois suportes para o corte
dos ossos Tais suportes foram desenhados avaliando os processos que
seriam utilizados para obtenccedilatildeo das amostras ou seja cortes com serras
circulares e discos
Para os cortes feitos com serra utilizou-se uma frezadora Romi
F-20 com serra circular de 2 mm de espessura e 80 mm de raio Tais
27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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27
cortes foram feitos em sentido longitudinal do osso e tiveram por objetivo
facilitar a proacutexima fase de cortes
Os cortes com disco foram feitos em um equipamento Isomet
Low Speed Saw (Buehler) equipado com disco especiacutefico para corte de
ossos (modelo Diamond Wafering Blade series 15HC Diamond ndeg 11-
4244) Com este conjunto obtiveram-se os cortes finais os quais
necessitavam maior precisatildeo em seu paralalelismo e maior lisura
As dimensotildees almejadas para as amostras foram 40-50mm x
05-1 mm X 4mm (comprimento x espessura x largura) as quais satildeo
adequadas para a anaacutelise biomecaacutenica por DMA
4352 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
Para a anaacutelise de ossos optou-se por utilizar a teacutecnica de flexatildeo
em trecircs pontos [threepoint bending) como exemplificado na figura abaixo
Figura 08 Teacutecnica de flexatildeo em trecircs pontos (NETZSCH 2006)
O caacutelculo do moacutedulo de Young (E) eacute obtido de acordo com a seguinte
foacutermula
4bIacute a
Onde E eacute moacutedulo de Young 1 eacute distacircncia entre os suportes
b eacute a largura da amostra h eacute a espessura desta F eacute a forccedila aplicada
e a eacute a amplitude de deformaccedilatildeo
Como condiccedilotildees de anaacutelise foi estabelecido que se aplicariacutea uma
deformaccedilatildeo de 60|Lim (a = 60ium) a uma frequumlecircncia de IHz a temperatura
de 36 + 1degC Todas as amostras foram analisadas com os suportes a urna
distacircncia de 40mm (1 = 40) Todos as anaacutelises foram feitas em um intervalo
de 10 minutos com leituras tomadas a cada minuto
28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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28
Foram obtidos tambeacutem os valores da tangente delta para as
amostras analisadas
4353 Ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo foram feitos em uma
Maacutequina de Ensaios Universal (Instron) Durante este ensaio foram
avaliadas a tensatildeo de ruptura e a porcentagem de deformaccedilatildeo das
dimensotildees originais sofridas As condiccedilotildees de ensaio foram um
afastamento entre as garras de 10 mm deslocamento de 2 mmmin e
temperatura de 23 degC e umidade relativa de 50 A anaacutelise dos dados foi
feita com o softw^are fornecido pelo fabricante do equipamento
Foram avaliadas as doses de O kGy 125 kGy 25 kGy e 50 kGy
e as amostras utilizadas foram as mesmas dos ensaios de DMA sendo que
estas foram lixadas para conferir um formato de haltegraveres mais compatiacutevel
com os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo
4354 Anaacutelise estatiacutestica dos resultados
A anaacutelise estatiacutestica foi feita com o programa Minitab (versatildeo
14)
Foi analisada a distribuiccedilatildeo normal dos valores obtidos para as
amostras de O kGy com as leituras tanto do moacutedulo de elasticidade
quanto da tangente delta para avaliar o perfil no qual estas se encaixavam
para anaacutelise
Apoacutes esta analise optou-se pela utilizaccedilatildeo do teste natildeo-
parameacutetrico de Kruskall-Wallis para anaacutelise de amostras procedentes de
uma mesma populaccedilatildeo seguindo os criteacuterios estabelecidos por CAMPOS
2000 Para a comparaccedilatildeo das amostras utilizou-se a meacutedia das dez
medidas obtidas para cada ponto para anaacutelise O erro considerado para
validaccedilatildeo da hipoacutetese nula foi de 5 (p=005)
29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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29
5 RESULTADOS
51 Processamento dos ossos
Os ossos foram processados e embalados como descrito nos
materiais e meacutetodos obtendo-se amostras para anaacutelise como observado
na figura abaixo
m
Figura 09 Ossos processados
52 Irradiaccedilatildeo
A dosimetria gerou o seguinte resultado
Tabela 01 Dosimetria Dose solicitada (kGy) Posiccedilatildeo do dosiacutemetro Dote
125 Lateral externa 132 125
Lateral interna 125
25 Lateral externa 261 25
Lateral interna 255
50 Lateral externa 506 50
Lateral interna 501
30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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30
53 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
O resultado das cargas microbioloacutegicas encontradas nas
amostras de ossos bovinos submetidas ao processamento e posterior
irradiaccedilatildeo se encontra abaixo na TAB02
Tabela 02 Carga microbioloacutegica obtida Natildeo irradiados
(1 3kGy) 125kGy 25kGy SOkGy
N UFC NdegUFC Ndeg UFC NdegUFC Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab Dil TSA Sab 10laquo Inc Inc 100 0 0 100 0 0 100 0 0 10-1 Inc Inc 10-1 0 0 10-2 Inc Inc 10-2 0 0 10-3 297 Inc 10-4 22 24 UFCs totais 10-5 5 1 46 X 105 10-6 0 0
Legenda Dil = diluiccedilatildeo Inc = incontaacuteveis
531 Caacutelculo teoacuterico da dose
Ao se substituir os valor na foacutermula obteve-se uma dose de 275
kGy de dose para esterilizaccedilatildeo com um SAL 10-6 e uma dose de 125 kGy
para esterilizaccedilatildeo sem limite de seguranccedila
54 Anaacutelise mecanodinacircmica
541 Suportes para cortes
Apoacutes a anaacutelise das dimensotildees do equipamento foram
desenhados os seguintes projetos
W
Figura 10 Projeto de suporte - Frezadora
31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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31
^
Figura 11 Projeto de suporte - Isomet
Os quais geraram os seguintes suportes
Figura 12 Suporte para frezadora
Figura 13 Suporte para Isomet
32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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32
As amostras obtidas podem ser observadas na figura abaixo
Figura 14 Amostras para anaacutelise biomecacircnica
As dimensotildees das amostras obtidas variaram de acordo com a
tabela abaixo
Tabela 03 Dimensotildees das amostras para anaacutelise biomecacircnica Amostras Dimensotildees (mm) Desvio Padratildeo (mm)
Reacuteguas Largura 41 02
Reacuteguas
Espessura 07 02
542 DMA (Dynamical Mechanical Analysis)
As meacutedias dos resultados obtido com as leituras estatildeo
apresentados nas tabelas abaixo
Tabela 04 Moacutedulo de elasticidade Dose Moacutedulo de Tangente Nuacutemero de Leituras por (kGy) elasticidade (GPa) delta amostras amostra
0 2834 010 8 10 125 2876 007 8 10 25 3144 005 7 10 50 2270 004 8 10
543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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543 Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
As amostras para os ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo apresentaram o seguinte aspecto
33
abaixo
Figura 15 Amostra para ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo
Os ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo geram os seguintes resultados
Tabela 05 Meacutedia dos resultados obtidos no ensaio de tensatildeo x deformaccedilatildeo Dose (kGy) Tensatildeo de
Ruptura (MPa) -Deformaccedilatildeo () - Meacutedia
Nuacutemero de amostras
0 7066 2416 4 125 10024 1989 4 25 6048 1737 4 50 5330 1432 4
34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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34
544 Anaacutelise Estatiacutestica
A anaacutelise da distribuiccedilatildeo normal gerou os seguintes graacuteficos
Distribuiccedilatildeo Normal - Amostra O icGy
I
999
99
95
90
80 70 60 50 40 30 20
10
5
1-
01
Mean 35430 StDev 9065
N 80 AD 3719
P-Value lt0005
lOoOtildeOtilde 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Modulo de Elasticidade
Figura 16 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para Moacutedulo de Elasticidade
Distribuiccedilatildeo Normal - O kGy 999
99
95
90
80 70 60 50-40 30 20
10
5-
1 -
01
Mean 01013 StDev 005302
N 80
AD 3318
P-Value lt0005
-01 00 01 Tangente delta
02 03
Figura 17 Distribuiccedilatildeo Normal das Amostras de O kGy para tangente delta
35
A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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A anaacutelise estatiacutestica gerou as seguintes tabelas
Tabela 06 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Moacutedulo de Elasticidade
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 3360 216 125 8 2187 110 25 7 3170 196 50 8 2582 123
p=0048
Tabela 07 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tangente Delta
Dose (kGy)
N Mediana Rank meacutedio
0 8 009 236 125 8 005 191 25 7 004 124 50 8 004 84
p = 0004
Tabela 08 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Tensatildeo de Rup tura
Dose (kGyiuml
N Tensatildeo de raptara
(MPa) - Mediana Rank Meacutedio
0 4 7680 100 125 4 10327 138 25 4 5448 58 50 4 5458 45
p = 0024
Tabela 09 Anaacutelise de Kruskal-Wallis para Deformaccedilatildeo Dose (kGY)
N Deformaccedilatildeo () -
Mediana Rank Meacutedio
0 4 2429 145 125 4 2021 94 25 4 1762 66 50 4 1427 35
p = 0009
36
6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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6 DISCUSSAtildeO
61 Processamento dos ossos
O processamento dos ossos armazenados em Bancos de tecidos
bioloacutegicos eacute essencial para a preparaccedilatildeo dos enxertos para seu uso (Fig
09 p 29) Aleacutem da retirada de partes moles natildeo essenciais para o
transplante o processamento ajuda a diminuir a carga microbioloacutegica
inicial devido agrave combinaccedilatildeo de processo quiacutemico (banhos com peroacutexido de
hidrogecircnio) e fiacutesico (raspagem) A padronizaccedilatildeo na embalagem serve como
passo essencial de garantia de esterilidade durante a estocagem para
aumentar a vida uacutetil do produto jaacute que atua como barreira fiacutesica para
evitar uma contaminaccedilatildeo natura (OLIVEIRA et al 2005) Todos os
procedimentos de processamento e embalagem do material buscaram
simular a rotina de Bancos de tecidos bioloacutegicos (HERSON et al 2002)
62 Irradiaccedilatildeo
A principal preocupaccedilatildeo quando se avalia um meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo eacute se este seraacute capaz de exercer sua atividade na amostra
como um todo garantindo assim que natildeo haja focos onde possiacuteveis
contaminantes possam se proteger e desenvolver (RUSSEL 1991) No
modelo avaliado pode-se comprovar que houve penetraccedilatildeo homogecircnea da
radiaccedilatildeo em todo o osso como visto pela pouca diferenccedila entre as doses
obtidas nas faces externa e interna (TAB 01 p 29)
A irradiaccedilatildeo das amostras eacute o ponto chave de todo o processo A
garantia da eficaacutecia desta em relaccedilatildeo agrave dose empregada e a penetraccedilatildeo
homogecircnea permitem o uso seguro em pacientes alem de assegurar a
validade dos meacutetodos empregados
63 Determinaccedilatildeo da carga microbioloacutegica
No atual trabalho natildeo se visou avaliar a eficaacutecia da radiaccedilatildeo
como agente de diminuiccedilatildeo da carga microbioloacutegica jaacute que tais dados se
encontram demonstrados na literatura (SILVERMAN 1991 DZIEDZIC-
GOCLAWSKA 2005) Poreacutem eacute necessaacuteria uma avaliaccedilatildeo da adequaccedilatildeo
das doses empregadas nesse estudo quanto a sua aplicaccedilatildeo praacutetica e a
37
relevacircncia dos dados obtidos Primeiramente foi necessaacuterio comprovar
que partimos de amostras com contaminaccedilotildees iniciais compatiacuteveis com a
possibilidade de radioesterilizaccedilacirco (vide Bancos de Tecidos paacutegina 11)
para que nossos resultados dos testes biomecaacutenicos fossem confiaacuteveis
mesmo nas amostras natildeo irradiadas tendo obtido meacutedias de 46 x 10^
UFC Por outro lado foram efetuadas as determinaccedilotildees de carga
microbioloacutegica nas amostras irradiadas com diferentes doses para verificar
a eficiecircncia do procedimento de irradiaccedilatildeo (PHILLIPS 1997) confirmando
um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
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um decreacutescimo na UFC jaacute na primeira dose avaliada confirmando o valor
teoacuterico de 125 kGy suficiente para reduzir a populaccedilatildeo em 5 logs e obter
zero UFC (TAB 02 p 30) Caso estes valores natildeo coincidissem com os
valores teoacutericos jaacute seria um motivo para natildeo continuidade do processo
antes de uma revisatildeo total do mesmo
Desta forma ao se considerar a carga microbioloacutegica inicial de
46x105 UFCs a dose de 125 kGy foi suficiente levando-se em conta um
valor teoacuterico de 25 kGy para o valor de Dio
O valor teoacuterico para esterilizaccedilatildeo de 275 kGy obtido dentro dos
limites de seguranccedila preconizados (SAL 10^) leva em conta apenas
bacteacuterias e fungos os quais satildeo mais sensiacuteveis a radiaccedilatildeo do que viacuterus
(PRUSS et al 2002) Dada a seleccedilatildeo inicial de doadores requerida para
doaccedilatildeo (HERSON 2002) muitas vezes natildeo se faz necessaacuterio considerar
tais contaminantes contudo a possibilidade de aumento de dose
permitiria um descarte menor de doadores e assim disponibilizaria mais
ossos para uso em transplante Faz-se necessaacuterio entretanto uma
avaliaccedilatildeo especiacutefica de amostras contaminadas com viacuterus para que se
possa determinar a eficaacutecia e seguranccedila do processo de esterilizaccedilatildeo
nestes casos
64 Anaacutelise biomecacircnica
641 Obtenccedilatildeo das amostras
Ao se trabalhar com material de origem bioloacutegica deve-se levar
em consideraccedilatildeo que existe uma variaccedilatildeo nas caracteriacutesticas do material
tanto aqueles obtidos de um mesmo indiviacuteduo quanto aqueles obtidos de
38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
p 32) foram semelhantes aqueles previamente descritos na literatura
(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
41
REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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38
um grupo de indiviacuteduos semelhantes Com este intuito todo o trabalho de
obtenccedilatildeo das amostras (vide Fig 14 p 32) pelo desenvolvimento de um
sistema de suportes e cortes (vide Fig 10 na p 30 e Fig 11 na p 31)
serve ao objetivo de diminuir as variaacuteveis intriacutensecas do tipo de material
analisado Desta forma ao se conseguir amostras mais homogecircneas seria
possiacutevel diminuir o erro a ser levado em conta na anaacutelise dos resultados
As dimensotildees obtidas para as amostras (vide TAB03 p32)
apresentam uma variaccedilatildeo pequena e bem proacutexima dos valores objetivados
para anaacutelise demonstrando a eficaacutecia do sistema de cortes desenvolvido
em fornecer amostras com pouca variaccedilatildeo O comprimento natildeo foi
analisado tendo em vista que seu real valor em nada influencia os
resultados Os limites estabelecidos para este paracircmetro se devem linica e
exclusivamente agraves dimensotildees miacutenimas de separaccedilatildeo dos suportes (40
mm) e o comprimento maacuteximo da caacutemara de anaacutelise do equipamento
utilizado
642 DMA
Os valores encontrados para o moacutedulo de elasticidade (TAB 04
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(REILLY et al 1974) Estes autores poreacutem se valeram de outro meacutetodo
para avaliar o moacutedulo de elasticidade (tensatildeo-elongaccedilatildeo) A semelhanccedila
entre os valores serve como paracircmetro de confirmaccedilatildeo dos resultados
obtidos
643 Ensaio de Tensatildeo x Elongaccedilatildeo
Os dados obtidos com os testes de tensatildeo x elongaccedilatildeo
permitiram avaliar a tensatildeo maacutexima a qual as amostras puderam ser
submetidas antes da quebra e o quanto estas se deformaram ateacute que se
atingisse a quebra Os valores obtidos em meacutedia estatildeo na TAB05
644 Anaacutelise estatiacutestica
A anaacutelise de distribuiccedilatildeo normal dos valores de moacutedulo de
elasticidade e de tangente delta (Fig 16 e Fig 17 p 33) evidencia que tais
valores natildeo apresentam uma distribuiccedilatildeo normal tiacutepica tendo em vista
que os pontos analisados se encontram muitos dispersos pelo graacutefico Tal
39
perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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perfil suscita o uso de testes natildeo-parameacutetricos para a anaacutelise estatiacutestica
dos dados como feito neste trabalho As TAB05 e a TAB06 (p34)
apresentam os resultados obtidos da anaacutelise comparativa entre os valores
de moacutedulo de elasticidade e tangente delta e os valores p apresentados
(p=0048 e p=0004) demonstram que haacute uma diferenccedila estatisticamente
significante entre os resultados obtidos Tal dado contudo natildeo descarta
totalmente a utilizaccedilatildeo de altas doses de radiaccedilatildeo para esterilizaccedilatildeo Haacute a
necessidade poreacutem de se avaliar se tais alteraccedilotildees influenciam o enxerto
in vivo e se estas natildeo podem ser levadas em conta durante a recuperaccedilatildeo
do enxerto Assim sendo no caso da praacutetica de Bancos de Tecidos deve-se
informar o meacutedico dessas alteraccedilotildees e cabe a este entatildeo definir se tais
ossos se aplicam ou natildeo em sua utilizaccedilatildeo praacutetica
Jaacute no caso dos ensaios de tensatildeo x deformaccedilatildeo pela anaacutelise
estatiacutestica foi evidenciada uma diferenccedila entre as amostras para tensatildeo
de ruptura (p = 0024) e entre a deformaccedilatildeo sofrida por estas (p=0009)
Ao se considerar a situaccedilatildeo in vivo tal condiccedilatildeo natildeo ocorre normalmente
no caso de fraturas (YAMASHITA el at 2001) contudo a diferenccedila
significativa na tensatildeo de ruptura pode significar que in vivo haacute uma
possibilidade de se atingir as condiccedilotildees necessaacuterias para que ocorra uma
fratura apenas com a tensatildeo gerada pela movimentaccedilatildeo usual do paciente
(TURNER 85 BURR 1993)
66 Consideraccedilotildees gerais
O moacutedulo obtido para ossos bovinos difere daquele descrito para
ossos humanos (REILLY 1974 YAMASHITA et al 2001) contudo como
descrito na Introduccedilatildeo (p 3) o presente estudo serve como base para
estudos futuros a serem realizados com ossos humanos
4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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4d
7 CONCLUSOtildeES
O uso da radiaccedilatildeo ionizante na esterilizaccedilatildeo de enxertos oacutesseos eacute
uma opccedilatildeo viaacutevel e interessante tanto do ponto de vista praacutetico dado sua
facilidade de aplicaccedilatildeo do ponto de vista econocircmico tendo em vista o
baixo custo relativo envolvido no processo quanto do ponto de vista
social pois permite uma esterilizaccedilatildeo sem resiacuteduos toacutexicos para o
ambiente para o paciente e para o corpo meacutedico aleacutem de abrir caminho
para esterilizaccedilatildeo de material considerado improacuteprio para transplante
O sistema para cortes desenvolvido neste trabalho permite a
obtenccedilatildeo de amostras homogeacuteneas Tal sistema pode ser utilizado para
inuacutemeras aplicaccedilotildees que envolvam cortes para preparaccedilatildeo de material
para anaacutelise precisa De posse das amostras a avaliaccedilatildeo do moacutedulo de
elasticidade se tornou mais acessiacutevel e com menor tendecircncia aacute variaccedilatildeo
intra-amostras
Com relaccedilatildeo as alteraccedilotildees nas caracteriacutesticas mecacircnicas estas
necessitam de uma avaliaccedilatildeo de seu impacto in vivo para comprovaccedilatildeo de
ateacute que ponto estas influenciam na recuperaccedilatildeo do paciente e podem
servir com criteacuterio para natildeo utilizaccedilatildeo de doses maiores as quais
possibilitariam a inclusatildeo de doadores anteriormente descartados na
triagem por exemplo
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STILLMAN J Occidental College Molecular Biology Home Page Mantido por Grace Fisher-Adams 2000 Apresenta conteuacutedo sobre biologia molecular com figuras ilustrativas Disponiacutevel em lt http departmentsoxyedu biology Stillman bi221 mobio mainhtmlgt Acesso em 24052006
TURNER CH 86 BURR DB Basic Biomechanical Measurements of Bone A Tutorial Bone v 14 p 595-608 1993
VASTEL L MEUNIER A SINEY H SEDEL L COURPIED J-P Effects of different sterilization processing methods on the mechanical properties of human cancellous bones Biomateriais v 25 p 2105-2110 2004
WIKIPEDIA banco de dados Disponiacutevel em lt httpenwikipediaorgu^ikiBonegt Acesso em 11052006
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YAMASHITA J FURMAN BR RAWLS HR WANG X AGRAWAL C M The use of dynamic mechanical analysis to assess the viscoelastics properties of human cortical bone Journal of Biomedical Material Research v 58 p 47-53 2001
YUSOF N Bioburden Estimation in Relation to Sterilization In NATHER A (Ed) The Scientific Basis of Tissue Transplantation - Advances in Tissue Banking vol5 l^t Ed Singapura World Scientific Printers 2001a p 200-211
YUSOF N Effect of Radiation on Microorganisms - Mechanism of Radiation Sterilization In NATHER A (Ed) The Scientific Basis of Tissue Transplantation - Advances in Tissue Banking vol5 1 ^ ^d Singapura World Scientific Printers 2001b p 342-357
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