aula pratica fermentaÇao 2011

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TECNOLOGIADAFERMENTAO Boas Prticas de Laboratrio (BPL) Good Laboratory Practice (GLP)

TODAS as prticas devem ser realizadas utilizando as BPL. Como qualquer outra atividade de laboratrio, todas as investigaes exigem que o usurio adote as BPL. Aqui so dadas notas resumidas para auxiliar os envolvidos nas vrias atividades prticas a conduzi-las de forma segura. Lembre que antes de realizar qualquer atividade prtica, uma avaliao de risco deve ser realizada para garantir mnimo perigo para todos envolvidos. Se existir qualquer dvida sobre a avaliao de riscos, consultar o professor ou instrutor. Microbiologia segura

As atividades prticas selecionadas e os microrganismos sugeridos apresentam risco mnimo quando seguida as BPL. Portanto, essencial observar as BPL em microbiologia quando trabalhar com qualquer tipo de microrganismo. Existem cinco reas essenciais que devem ser consideradas para trabalhar com investigaes prticas em microbiolgicas:

Preparo e esterilizao de equipamentos e meios de cultura. Preparo da cultura microbiolgica como cultura estoque para investigaes posteriores e inculo para a presente investigao. Inocular no meio a cultura preparada Incubao das culturas e amostragem durante o crescimento Esterilizao e descarte seguro de descontaminao de dos equipamentos todas as culturas e

Habilidade de boa organizao e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade realizada de forma segura e com sucesso.

Proteo Alimento ou bebida no deve ser armazenado ou consumido em um laboratrio de microbiologia. As mos devem ser lavadas com sabo

desinfetante depois de manejar culturas microbiolgicas e sempre que sair do laboratrio. Para garantir que qualquer ferida, corte ou arranhes no sejam infectados ou sejam fonte de contaminao, proteg-los com material a prova de gua ou usar luvas cirrgicas descartveis. Habilidade de boa organizao e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade realizada de forma segura e com sucesso.

Segurana pessoal geral Cada indivduo realizando as prticas sugeridas ou qualquer outra investigao responsvel pela sua prpria segurana e tambm pela segurana de outros que podem ser afetados pelo seu trabalho (outros estudantes, tcnicos e professores). O indivduo deve incluir no planejamento e realizao destas investigaes uma avaliao de riscos para avaliar qualquer perigo que a avaliao possa possuir e maneiras de minimiz-los. Tcnica assptica Equipamento e meio estreis devem ser utilizados para transferncia e cultura de microrganismos. Tcnica assptica deve ser observada sempre que micorganismos so transferidos de um recipiente para outro. Equipamentos contaminados devem ser preferencialmente esterilizados por calor podendo ser incinerado ou autoclavado. Um desinfetante qumico adequado deve ser utilizado, mas este no pode garantir a completa esterilizao. Segurana eltrica Cuidado deve ser tomado para que nenhum lquido entre em contato com a tomada eltrica. Antes de ligar qualquer equipamento verifique se a corrente eltrica adequada ao equipamento.

PRTICA 1FATORES QUE INTERFEREM NO PROCESSO FERMENTATIVO

EXPERIMENTO 1 Uma das melhores formas de aprender alguma coisa fazendo esta coisa! Por isso, os experimentos selecionados o ajudaro a entender melhor os fenmenos envolvidos no processo de fermentao. Aps realizar os experimentos, responda os questionrios propostos. Pois assim, voc poder identificar quais so as suas dvidas e procurar solucion-las. Experimento n 1 - Observao Microscpica Com a realizao deste experimento voc poder entender melhor como as leveduras se desenvolvem, a influncia do meio no seu crescimento, entre outros aspectos importantes envolvidos no processo de fermentao. Material necessrio:1) 2) 3) 4) 5)

3 Frascos colheres (uma pequena e outra grande) Fermento biolgico (fabricao de po) Acar gua morna (20 - 25C) e gua gelada (5 C)

Procedimento: 1) Primeiramente, numere os 3 frascos. 2) Frasco 1: coloque uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua morna 3) Frasco 2: coloque uma colher (pequena) rasa de acar , uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua morna 4) Frasco 3: coloque uma colher (pequena) rasa de acar , uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de gua gelada (5) Houve alguma mudana com o decorrer do tempo? O frasco n 2 apresentou os mesmos resultados dos outros dois? Voc saberia explicar este comportamento? O que a fermentao de fato? Que reaes ocorrem

durante o processo fermentativo? Quais os responsveis pelas alteraes nos frascos? O Que Voc Aprendeu com o Experimento 1?

Aps a realizao deste experimento, voc dever ser capaz de : 1) explicar a importncia do acar, da gua e do fermento na fermentao. Logo, tambm saber explicar a influncia do meio no qual a fermentao se desenvolve.

2) perceber que o processo fermentativo pode ser afetado por diversos fatores que alteram a velocidade em que este ocorre. Voc saberia dizer quais so estes fatores?

EXPERIMENTO 2:ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO DE UMA POPULAO DE LEVEDURA

1. REFERENCIAL TERICO: Acompanhar a curva de crescimento em meio liquido, em cultura descontinua, de uma populao da levedura Saccharomyces cerevisiae. O crescimento da cultura de levedura ser conduzido em agitador orbital (agitao constante de 250 rpm - rotaes por minuto), temperatura constante de 25C. A curva de crescimento ser obtida com base na determinao espectrofotomtrica da Densidade ptica (DO) da cultura, medida no comprimento de onda de 640nm (DO640nm), ao longo do tempo de incubao. Pretende-se determinar a taxa especfica de crescimento e o tempo de duplicaao da cultura de levedura nas condies ensaiadas. Curva de crescimento microbiano O crescimento microbiano frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de uma populao de um determinado microrganismo, em sistema fechado ou em batch (cultura em descontnuo). Neste caso, um meio de cultura liquido contendo os nutrientes necessrios ao crescimento celular inoculado com uma populao de clulas viveis do microrganismo e incubado em condies ambientais favorveis sua multiplicao. Se acompanharmos o crescimento da populao de clulas ao longo do tempo e representarmos graficamente o logaritmo do nmero de clulas por unidade de volume (ou, da Densidade ptica da cultura, D.O, ou da concentrao da Biomassa Microbiana, X) em funo do tempo, obter-se- uma curva caracterstica, como ilustrado na figura abaixo, que exibe as vrias fases do crescimento microbiano em descontnuo e cujo significado descrito abaixo.

Fases do crescimento em cultura descontnua Fase de latncia (ou "LAG") Durante o perodo de tempo que se segue inoculao do meio de cultura, as clulas dos microrganismos tm normalmente que se adaptar ao novo meio. Durante este perodo inicial, pode no ocorrer multiplicao celular. Durante este perodo verifica-se, por exemplo, a sntese de novas enzimas. Estas podem ser necessrias sntese de compostos essenciais ao crescimento e que no se encontrem presentes no meio de cultura ou para a hidrlise ou metabolizao dos compostos presentes e que so as nicas fontes de carbono a que o organismo no se encontra adaptado. Esta fase dita de latncia pode ter uma durao mais ou menos extensa de acordo com o estado fisiolgico da cultura usada como inculo e as condies de crescimento. Por exemplo, a presena de um percentual elevado de clulas no-viveis no inculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial difcil de metabolizar ou a incubao em condies ambientais de estresse a que o organismo no se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latncia extensas. Fase exponencial Aps um curto perodo de acelerao, a taxa de crescimento da populao microbiana torna-se constante, isto , as clulas sofrem diviso e o seu nmero duplica aps um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase, em que todos os nutrientes esto presentes em excesso, os microrganismos dividem-se e a populao cresce com uma taxa especfica de crescimento mxima que depende do potencial gentico do microrganismo, da composio do meio de cultura e das condies de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de gua, etc.).

Fase de desacelerao Durante esta fase ocorre um declnio da taxa especfica mxima crescimento, em resultado da diminuio para valores limitantes crescimento da concentrao de um ou mais nutrientes essenciais metabolismo celular e/ou do aumento da concentrao de produtos metabolismo txicos para as clulas. Fase estacionria Na fase estacionria o esgotamento de um nutriente essencial e/ou a acumulao de produtos inibidores do metabolismo provoca a parada de diviso da populao. No entanto, em carncia de nutrientes, as clulas podem manter-se viveis durante perodos de tempo mais ou menos longos, custa das reservas endgenas, que usam em processos de manuteno. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declnio da concentrao de clulas viveis durante a fase de morte celular. Fase de morte Durante a fase de morte ocorre a perda irreversvel da capacidade de diviso celular (morte celular), o que origina um decrscimo da concentrao de clulas viveis na populao microbiana ao longo do tempo. Como realizar a curva de crescimento de uma populao microbiana Para acompanhar e traar a curva de crescimento de uma populao microbiana necessrio fazer a avaliao quantitativa da evoluo da concentrao de clulas ao longo do tempo. Esta avaliao pode basear-se em mtodos diretos ou indiretos. Mtodos Diretos: contagem de clulas totais; contagem de clulas viveis; determinao da biomassa seca. Mtodos indiretos: Anlise espectrofotomtrica da Densidade ptica (D.O.) da cultura Na prtica, o crescimento geralmente acompanhado com base na determinao da Densidade ptica da cultura, da concentrao de clulas (totais ou viveis) ou da massa celular (biomassa). de do ao do

Contagem de clulas totais Este mtodo baseia-se no preenchimento de uma cavidade situada entre u