1. Fundamentos de Engenharia Gentica Curso de Biomedicina Prof. Dr. Eduardo Honda Porto Velho - RO 2008

2. Dogma Central da Biologia Molecular 3. O que Engenharia Gentica?

um conjunto de tecnologias que permitem a manipulao (modificao) de material genticoin vitro

Tambm conhecida comoTecnologia do DNA Recombinante

Inclui o isolamento, cpia e multiplicao de genes, recombinao de genes, ou DNA de diferentes espcies, e transferncia de genes de uma espcie para outra, contornando o processo reprodutivo

4. Clonagem Molecular

Para se estudar um determinado gene que codifica uma protena ou RNA preciso isol-lo.

Clonagem= fazer vrias cpias idnticas

Clonagem de DNA isolar um fragmento especfico de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replic-lo, e fazer milhes de cpias idnticas

5. Clonagem Molecular Isolamento de Novos organismos que produzem enzimas de interesse Biotecnolgico. 6. Clonagem Molecular- Isolamento Gnico Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA. 7. Isolamento do DNA- PCR Desnaturao do DNA Fita-Dupla 8. Isolamento do DNA- PCR Aps vrios ciclos... Amplificao do Fragmento gnico desejado !!! 9. Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA

As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material gentico de um organismo clonado em umvetor

Tipos:

A) Genmica: - clonado diretamente do genoma.

B) cDNA:- feita a partir de mRNA .

10. 11. Isolamento de DNA- Biblioteca genmica

Extrao do DNA Genmico;

Clivagem com enzimas de restrio;

Ligao dos Fragmentos nos vetores;

Transformao Celular;

Replicao do vetor.

12. Biblioteca de cDNA - mRNA de um tipo celular especfico;- primer de oligo dT e transcriptase reversa; - DNA Polimerase I e dNTPs;- Clonagem em um vetor de escolha 13. Clonagem Molecular- Requerimentos

Mtodo para clivar o DNA alvo;

Mtodo para juntar 2 molculas de DNA covalentemente (inserto + vetor)- LIGAO!

Clula hospedeira;

Mtodo para introduzir molculas de DNA para dentro da clula hospedeira que as possa duplicar;

Mtodo para selecionar molculas de DNA quimrico ou recombinantes;

Mtodos para oscreeningda caracterstica procurada.

14. Gerao de molculas recombinantes - Clonagem Molecular - 15. CLONAGEM 16. Ligao de extremidades compatveis 17. Stio Mltiplode Clonagem (Polylinker) 18. As endonucleases de Restrio Clonagem Orientada 19. As Ferramentas

1) Enzimas

2) Vetores

3) Clulas hospedeiras

20. ENZIMAS 21. Enzimas de Restrio

So endonucleases que clivam o DNA em seqncias especficas chamadas stio de restrio.

Quebram a ligao fosfodister

Os stios de restrio so, geralmente, seqncias palindrmicas (mesma seqncia nos dois sentidos)

22. Enzymes for DNA manipulation restriction enzymes Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html 23. Enzimas de Restrio

Endonucleases stio-especficas isoladas de procariotos

Protegem a bactria do ataque de vrus (fagos)

Protegem seu prprio DNA metilando-o no stio de restrio

Enzimas do tipo II so as mais utilizadas em Biologia Molecular

Eco RI metilase 24. DNA Ligase

Promover a unio de molculas de DNA pela formao de uma ligao fosfodister entre uma extremidade 3-OH e outra 5-PO 4.

25. 26. DNA Polimerases

Polimerizam a molcula de DNAapartir de uma extremidade 3-OH e usando uma das fitas do DNA como molde.

Exe:Taqpolimerase

27. Transcriptase reversa

Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA

Isolada dos retrovrus

Aplicao: sntese de cDNA

28. VETORES 29. Os Vetores

So molculas de DNA que iro propagar o DNA clonado.

Caractersticas desejadas:

Habilidade de se duplicar na clula hospedeira;

Marca gentica para selecionar a clula contendo o vetor (resistncia a drogas ou marcas auxotrficas);

Stios de clonagem nicos.

30. Tipos de vetores

Plasmdios

Bacterifagos (fagos)

Cosmdios

Cromossomos artificiais de levedura (YAC)

Vetores especiais para plantas, clulas de insetos e mamferos

31. Plasmdios

Molculas de DNA fita dupla circulares e de replicao autnoma (ORI);

Tm marcas de seleo para resistncia a antibiticos ou complementao auxotrfica.

32. 33. 34. Sequncias de DNA de um vetor de expresso deE. coli 35. Vetores de expresso 36. Transformao Bacteriana Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html Clulas podem ser selecionados em placas com antibitico. Alguns plasmdios utilizam o gene da B-galactosidase. 37. O gene da beta-galactosidase interrompido quando um fragmento de DNA clonado. O substrato "X-gal fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto a enzima est ativa. As colnias brancas na presena de X-gal significa a presena de DNA recombinante no plasmidio. 38. 39. Clonagem de um fragmento de DNA exgeno emE. coliusando o pBR322 como vetor 40. Clonagem de um fragmento de DNA exgeno emE. coliusando o pBR322 como vetor 41. Bacterifagos

Infectam clulas deE. colie o DNA se duplica na clula hospedeira.

Ex: Fago

42. O Ciclo de vida de um bacterifago 43. Vetores baseados no fago

Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessrios para integrao/exciso para serem substitudos por DNA exgeno e formar um genoma de 50 Kb que empacotadoin vitro .

Genomas maiores ou menores no so empacotados.

Ciclo ltico compulsrio

44. Clonando no Fago 45. Cosmdios

So plasmdios contendo as extremidas cosdo fago

Capacidade de clonagem: 40 Kb

46. 47. 48. Cromossomos artificiais 49. CLULAS HOSPEDEIRAS 50. Clulas hospedeiras

Caractersticas:

Permitir a duplicao do vetor;

Permitir a seleo do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia);

No pode representar perigo ao meio ambiente;

No deve modificar o DNA exgeno;

Podem ser procariotos ( E. coli ) ou eucariotos (leveduras, clulas vegetais, cultura de clulas de insetos e mamferos).

51. Mtodos de introduo do DNA na clula hospedeira

Transformao com cloreto de clcio (bactrias);

Transduo (fagos empacotadosin vitro );

Transfeco (clulas de mamferos);

Eletroporao (leveduras e bactrias);

Biolstica ou bombardeamento (plantas);

Microinjeo (ovos e ocitos).

52.

O canho gnico uma nova forma de transformao celular.

Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolstica

Inserindo genes nas clulas 53. Adapted from Human Genetics, Ricki Lewis Microinjeo 54. Transformao Bacteriana Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html Clulas podem ser selecionados em placas com antibitico. Alguns plasmdios utilizam o gene da B-galactosidase. 55. Clonando no Fago 56. Seleo de clones recombinantes

• resistncia e sensibilidade a antibiticos;

• requerimentos nutricionais (auxotrofia);

• formao de placas de lise

57. Screening Identificao de um clone de interesse - hibridao com sonda radioativa - anticorpo especfico 58. Aplicaes daEngenharia Gentica 59.

Anlise da estrutura/funo de genes

Produo de protenas de interesse industrial e teraputico

Engenharia proteica

Criao de organismos transgnicos

Terapia gnica

Diagnstico molecular (doenas parasitrias e genticas)

Teste de paternidade / medicina forense

Arqueologia molecular / evoluo

60. Plantas Transgnicas 61. 62. Animais Transgnicos 63. 64. Microinjeo de DNA no ncleo de ovo fertilizado de camundongo - gene do fator de crescimento humano 65. Biofrmacos Recombinantes 66. 67. 68. Terapia Gnica 69. Adio do geneteraputico Substituio do geneteraputico 70. Uso de vrus 71.