aula 7 dosagem microbiologica

Dosagem Microbiológica de Antibióticos e Fatores

de Crescimento.

Introdução

9000-8000 a.c.

A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupação;

Há situações em que a margem entre a dose ineficaz do ponto de vista terapêutico e uma dose tóxica é relativamente pequena;

Há que se considerar também, o aspecto econômico, assim como o de falsificações com moléculas estruturalmente similares;

A quantificação da substância ativa demanda sempre no emprego de uma avaliação comparativa, frente a um padrão biológico de referência;

Pode ser empregado um ensaio macrobiológico ou direto, como o ensaio de insulina empregando camundongos, ou ainda microbiológico ou indireto, como o ensaio de estreptomicina e tetraciclina;

Introdução

9000-8000 a.c.

No segundo caso os dois métodos mais usados são de difusão em ágar (ou em placas) e o turbidimétrico (ou de tubos), prestando-se particularmente à determinação do teor de antibióticos e fatores de crescimento;

O método de difusão em ágar relaciona o tamanho da zona de exibição (fatores de crescimento) ou inibição (antibiótico) com a dose da substância ensaiada e é mais comumente empregado para determinação de antibióticos;

Ensaio de Difusão em Ágar

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O ensaio por difusão, desenvolvido para antibióticos, é um método físico, no qual um microrganismo é usado como revelador;

O método de difusão emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema de mono ou bicamada, através do qual a substância-teste se difunde;

Muitas das variações observadas são causadas pela negligência dos aspectos físico-químicos, e não por variações biológicas;


9000-8000 a.c.

A solução-teste é aplicada sobre a superfície deste meio, em uma área restrita, e as placas são então encubadas;

O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde tenha ocorrido a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição do crescimento;

Formação de zonas de inibição (x) do crescimento microbiano, decorrente da difusão de antibiótico, em ágar contido na placa (difusão radial) e tubos (difusão linear);


Formação da Zona de Inibição de Crescimento

A aplicação de conhecimentos de difusão para avaliação de potência de antibióticos exige padronização de condições, pois há que conciliar os fenômenos físicos (difusão) e biológicos (microrganismo sensível, meio de cultura, incubação), a fim de que a distância de difusão seja medida experimentalmente, após a revelação sob a forma de zona ou halo de inibição de crescimento;

Isto significa que o microrganismo teve seu crescimento inibido em função da concentração de antimicrobiano difundido ser capaz de impedir o seu desenvolvimento, em oposição ao restante do meio de cultura;

A necessidade do dimensionamento das zonas de inibição de crescimento conduz à exigência de inóculo com população microbiana homogênea. Assim, foi possível a determinação teórica dos valores de diâmetro para diferentes concentrações do antibiótico;

Importância da padronização

A principal melhora na orientação laboratorial dos antibiogramas nas últimas décadas provém do desenvolvimento de procedimentos padrões;

É importante aderir aos protocolos para obter resultados passíveis de reprodução;

Fatores importantes do Antibiograma:

• Meio de crescimento: O caldo de cultura e o ágar Mueller-Hinton foram escolhidos para as bactérias aeróbicas e anaeróbicas facultativas;

Fatores importantes do antibiograma

• pH: Deve estar entre 7,2 e 7,4 a temperatura ambiente. O pH do meio em caldo de cultura pode ser testado diretamente com um eletrodo de pH, e o meio do ágar pode ser testado pela maceração de ágar suficiente, de modo que a ponta do eletrodo possa ser imersa;

• Soro: O grau de ligação dos antibióticos às proteínas apresenta grande variação. Podem ser obtidos valores diferentes se for adicionado soro ao meio;


• Concentração [ ] de cátions: A concentração de cátions divalentes Ca2+ e Mg2+ afeta os resultados da sensibilidade quando são testadas determinadas combinações de espécies bacterianas e antibióticos;

Pseudomonas aeruginosa Reação cruzada

Alguns lotes do ágar Mueller-Hinton podem na verdade apresentar concentração anormalmente alta desses cátions, de modo que são produzidas pequenas zonas inibidoras quando P. aeruginosa é testado com aminoglicosídeos;


• Concentração [ ] de cátions:

Quando os microrganismos estão crescendo em meio deficiente em cátions, a permeabilidade da parede celular aos antibióticos aminoglicosídeos e a outros compostos aumenta;

Assim, os microrganismos são mais sensíveis à ação dos aminoglicosídios, produzindo [ ] inibitória mínima falsamente baixa ou grandes zonas inibidoras;

O caldo de cultura Mueller-Hinton apresenta [ ]s muito baixas de cátions divalentes e deve ser suplementado para concentrações fisiológicas;


• Atmosfera: O ágar ou caldo de cultura é incubado em uma incubadora em ar ambiente. Uma incubadora com CO2 não deve ser utilizada para testes de rotina. O ácido carbônico formado na superfície do ágar ou no caldo pode causar redução do pH;

Nos laboratórios com pequena carga de trabalho e onde existe apenas incubadora de CO2, é aceitável colocar as placas ou tubos de sensibilidade em uma jarra selada;


• Temperatura: As placas e os tubos devem ser incubados rotineiramente a 35ºC. Quando em temperaturas mais altas, a detecção de estafilococos resistentes a oxacilina fica comprometida. Se houver suspeita de resistência contra oxacilina e não houver manifestações em 35ºC, as placas ou tubos podem ser incubados a 30ºC;


• Inóculo: É, em geral, preparado a partir do caldo de cultura que foi incubado por 4 a 6 horas, quando o crescimento é considerado em fase logarítmica;

Devem ser coletadas amostras de várias colônias de aspecto semelhante para diminuir a variação na população bacteriana;

A densidade da suspensão é ajustada para aproximadamente 108 CFU/ml;

Escala de McFarlandÉ preparado adicionando-se 0,5 ml de 0,048M BaCl2 (1,175% p/v BaCl2•H2O) a 99,5 ml de 0,36N H2SO4. Alíquotas de 4 a 6 ml do padrão de turbidez do BaSO4 são distribuídas em tubos de mesmo tamanho, fechado com tampa de rosca, firmemente selados e armazenados, no escuro, a temperatura ambiente;Comumente o grau de turbidez no caldo de cultura é comparado com o padrão, visualizando os dois contra um fundo branco no qual foram desenhadas linhas pretas;


• Agentes Antimicrobianos: Discos impregnados com antimicrobianos devem ser armazenados a -20ºC ou menos em condição anidrosa. Os fabricantes de discos precisam controlar rigorosamente a concentração dos agentes antimicrobianos nos discos para 60-120% do teor declarado; a variação existente é em geral consideravelmente menor;


• Agentes Antimicrobianos: Um pequeno estoque pode ser mantido em temperaturas de refrigerador em um dessecador;

Os discos sempre devem ser aquecidos até à temperatura ambiente antes de se abrir o dessecador, de modo que a condensação da umidade do ar não reidrate parcialmente os discos.;

Teste de sensibilidade em Macrodiluição em

Caldo de CulturaEsteve entre os primeiros testes a serem desenvolvidos e ainda serve como método de referência;

Teste de sensibilidade por Diluição em Ágar

É o segundo método de referência, foi adaptado com sucesso para uso rotineiro nos grandes laboratórios avaliando apenas as [ ]s escolhidas dos antimicrobianos;

Teste de sensibilidade por Difusão em Disco

Assim que o disco impregnado com agente antimicrobiano entra em contato com a superfície úmida do ágar, a água é absorvida pelo filtro de papel e o agente antimicrobiano se difunde para o meio circulante;

Interpretação dos Resultados

OBRIGADO

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