aula 6 reagentes marcados - t cnicas · reagentes marcados detectam / quantificam diretamente a...
TRANSCRIPT
1
Reagentes MarcadosDetectam / quantificam diretamente a ligação Ag – Ac
Pro. Fernando Ananias
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
substrato (incolor)
� Qualitativos� Quantitativos
� Direto = Ag� Indireto = Ac
Ac marcados com Enzimas + + = CORAg
Fosfatase alcalinaPeroxidaseB-galactosidase
2
ELISA
ELISA Indireto (detectar Ac)
ELISA Direto ou Sanduíche (detectar Ag)
3
ELISA Competitivo
� Aplicações do ELISA:� Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesq uisa
� Vantagens:� Teste de alta sensibilidade� Permite quantificar Ag ou Ac das amostras� Seguros e de baixo custo
4
Imunofluorescência
5
luzλ
Ac + fluorocromo Ac + Fluorocromo
λ
rrrrghtghtghtght
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Reagentes secundários:
�Anticorpo secundário marcado com fluorocromo�proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs
6
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE Ficoeritrina (FE) VERMELHA
Aplicações:
• Identificar subpopulações de linfócitos• Identificar espécies bacterianas• localização de hormônios• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA• Teste qualitativo
Fc
7
Citometria de Fluxo
� Separação de células ativadas por fluorescência� Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)� Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente� Teste qualitativo e quantitativo
CD 4
CD 18
CD 125
CD 147
� Tamanho� Granulosidade� Fluorescência
8
CD4
CD8
CD20
Aplicações:
� Determinar o tipo e n o de céls. sanguíneas brancas
� isolar populações celulares
� distribuição de céls de acordo com a densidade dos Ag
� o tamanho celular.
� Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes
HIV , Leucemias
9
2) Transferência para membrana de nitrocelulose
10
5) Revelação
11
Western Blotting
• Eletroforese de proteínas• Diferença de tamanho (PM)• Mobilidade da proteína• Detecção Ag ou Ac
12