FUNDAO EDUCACIONAL BARRIGA VERDE FEBAVE CENTRO UNIVERSITRIO BARRIGA VERDE UNIBAVE CURSO: FARMCIADISCIPLINA: CONTROLE DE QUALIDADE 8 FASECAMPUS: ORLEANSPROFESSOR: (Msc.) JOS LUIS MLLER

VALIDAO DE MTODOS ANALTICOSELABORAO DE POPS (AULA 01)

Contedo1- Planejamento de validao2- Como proceder para determinar as caractersticas de desempenho de mtodos2.1- Aplicabilidade2.2- Faixa de trabalho2.3- Linearidade2.4- Sensibilidade2.5- Limite de deteco2.6- Limite de determinao/quantificao2.7- Exatido/recuperao2.8- Preciso2.8.1- Repetitividade2.8.2- Preciso intermediria2.8.3- Reprodutibilidade2.9- Seletividade2.10- Robustez

VALIDAO

Processo atravs do qual estudos de laboratrio so utilizados para garantir que o mtodo em questo atenda s exigncias desejadas

PORQUE VALIDAR?

A validao do mtodo feita para garantir que a metodologia analtica exata, reprodutvel e flexvel sobre uma faixa especfica que uma substncia ser analisada.

Tipo de mtodoFDA. International Conference on Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability. Federal Register. V. 60 (40) p. 11260-11262, March, 1995.

ProcedimentoAnalticoIdentificaoTesteQuantitativo ImpurezaEnsaio-limiteDoseamentoExatidoNoSimNoSimPrecisoRepetitividadePrecisoIntermediriaNo

NoSim

SimNo

NoSim

SimEspecificidadeSimSimSimSimLDNoNoSimNoLQNoSimNoNoLinearidadeNoSimNoSimFaixa NoSimNoSim

Parmetros de desempenho analtico a serem avaliadosAplicabilidadeFaixa de trabalho Linearidade SensibilidadeLimite de detecoLimite de determinao/quantificaoPreciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade)Exatido/Taxa de recuperaoSeletividadeRobustez

AplicabilidadeDeterminar para qual ou quais matrizes e analitos o mtodo analtico serviria;Identidade do analito, incluindo especificao onde apropriado (p. ex: arsnio total),Faixa de concentrao coberta pela validao (p. ex: 0 50 mg/kg),Uma especificao da faixa de matrizes do material teste coberta pela validao (p. ex: frutos do mar),Descrever o equipamento, reagentes, procedimento (incluir variao permissvel p. ex: aquecer 1005C por 305min), procedimento de calibrao e qualidade e, precauo de segurana especial necessria,A aplicao pretendida e sua incerteza crtica (p. ex: anlise de alimento para monitoramento). A incerteza padro u(c) do resultado c deveria ser < 0,1 x c.THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Faixa de trabalho

A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um dcimo a dobro do limite de restrio (LR)

0,1 . LR FT 2 . LRFRAUNHOFER INSTITUT FR LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG Guide for testing of analytical method for the determination of monomers in foods simulants and polymers. Mnchen. 3p. M&T Project Development of methods of analysis. Printed papers.

Linearidade a habilidade das respostas analticas serem diretamente proporcionais s concentraes das substncias em estudo. Ser verificada analisando em triplicata solues padro com 6 ou mais concentraes diferentes, dispostas em um intervalo estabelecido pela faixa de trabalho. Os valores encontrados para confeco da curva analtica tm que estar livres de valores aberrantes e os mesmos devem apresentar homocedasticidade.

Procedimento para determinao da linearidadeComo o limite de restrio estabelecido pela Resoluo 105 de 19-05-1999 da ANVISA/MS de 0,25% m/m de estireno na massa plstica, a faixa de trabalho de 0,025 a 0,50% m/m

0,025 FT 0,50% m/m

Procedimento para determinao da linearidadeConsiderando a massa tomada da amostra de 300mg, a faixa de concentrao na alquota analisada seria de 7,5 a 150mg/L. Por praticidade, fez-se a faixa de 10 a 150mg/L

Preparo da soluo me

Pesou-se 0,1066g de estireno com 99% de pureza. Diluiu-se esta massa em balo volumtrico de 100mL com n-heptano. Considerando a pureza do estireno 99%, o procedimento resultou em soluo com concentrao de 1,055mg/mL

Preparo da solues de trabalho

Solues de trabalho Com pipetas volumtricas, tomou-se alquotas da soluo me para preparo das solues de trabalho. Todas as alquotas foram avolumadas a 100mL com n-heptano

Volumes tomados da soluo me e concentrao das solues de trabalhoVolume Tomado (mL) 0 1 2 5 10

Concentrao (mg/L) 0,00 10,55 21,10 52,75 105,5

Preparo da curva analtica

Os pontos de concentrao das solues de trabalho foram analisados no cromatgrafo. As reas dos picos correspondentes ao tempo de reteno do estireno em relao aos pontos de concentrao foram medidos e, uma curva analtica foi construda a partir das reas com seus correspondentes pontos de concentrao das solues de trabalho

Determinao da estabilidade da soluo meDe semana em semana retiramos uma alquota de 5mL da soluo me de estireno em heptano e avolumamos com heptano para 100mL em balo volumtrico. Tomamos uma alquota desta soluo e injetamos em cromatgrafo a gs. Observamos se o resultado da concentrao obtida semelhante ao obtido inicialmente na confeco da curva analtica

Determinao da faixa de trabalho

Faixa de trabalho a faixa de concentrao do analito na amostra que apresenta resposta linear com a concentrao

A faixa de trabalho(conc. na alquota de anlise 10,55-105,5 mg/L) possibilitou detectar o estireno dentro dos limites de interesse e a resposta do detector do cromatgrafo conservou-se linear, que foi de 0,035 a 0,35 % m/m concentrao na amostra

SensibilidadeDescreve quanto a resposta varia com a variao da concentrao do analito. Pode ser expressa como a inclinao da curva analtica (coeficiente angular), expresso pala equao S=dx/dc, onde:dx=variao da resposta, dc=variao da concentrao medida ao mesmo tempo que testa a linearidadeDepende da natureza do analito e da tcnica de deteco

BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.

Limite de deteco LD a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser detectada com um certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Determinao do limite de detecoO limite de deteco foi determinado analisando 6 vezes a menor concentrao da curva analtica, e o desvio padro foi multiplicado por 3, este limite referente a alquota de anlise. Tem que se considerar o procedimento do mtodo para se determinar o limite de deteco do mtodo. Desvio padro: igual a raiz quadrada positiva da varincia e tem a mesma dimensao da mdia aritmtica

S = 1/(n-1)[xi X(mdio)]2

THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

Limite de determinao/quantificao LQ a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental

Limite de quantificao LQ

Geralmente o mais baixo ponto da curva analtica no deve ser determinado por extrapolao

UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation Service. www.ukas.com

Preciso

Repetitividade

Preciso intermediria

Reprodutibilidade

Repetitividade o grau de concordncia entre resultados de anlises individuais quando o procedimento aplicado repetidamente mltiplas anlises de uma mesma amostra homognea, em idnticas condies de teste.

Determinao da repetividadeUm mnimo de 9 determinaes cobrindo a faixa especfica para o procedimento (p. ex: 3 concentraes/3 replicatas cada, menor, intermediria e maior); ou

Um mnimo de 6 determinaes a 100 % de concentrao teste

Calcular o desvio padro, o desvio padro relativo ou coeficiente de variao ou a varincia.

GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

Preciso intermediriaExpressa as variaes dentro de um laboratrio, como: dias diferentes, analistas diferentes, mtodos diferentes, ou equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou padro, definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou mais)

Determinao da preciso intermediriaOs resultados dos dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo equipamento, mesmas concentraes e mesma metodologia, devero ser o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hiptese a ser afirmada que o resultado obtido em diferentes dias so significativamente iguais.Hiptese a ser testada: Ho: 1= 2Teste t T=( - xmed)/s.(n)-1 onde: =valor de referncia, xmed=mdia dos valores dos resultados de anlise, n=nmero de resultados de anlise e s=desvio padroO valor crtico (tabelado) varia em funo do grau de liberdade () e do nvel de confiana, sendo que. = n 1 Se: ttab > tcalcHo aceitattab< tcalcHo rejeitada

Reprodutibilidade

o grau de concordncia entre os resultados das medies de um mesmo mesurando, efetuadas sob condies variadas de medio(VIM).A reprodutibilidade no um componente de validao de mtodo executado por um nico laboratrio, obtido em relao aos dados de validao obtidos atravs de comparao interlaboratorial (INMETRO, 2002).

INMETRO. Orientaes sobre validao de mtodos de ensaio qumicos. DOQ-CGCRE-008, reviso:00-outubro 2002.VIM Vocabulrio Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.

Exatido

a concordncia dos valores experimentais com o valor verdadeiro X

Taxa de Recuperao a relao entre o resultado experimental obtido depois da anlise de uma amostra, fortificada com uma quantidade conhecida do analito, e o valor terico desta quantidade fortificada

Determinao da taxa de recuperaoA taxa de recuperao ser calculada pela diviso entre o resultado da concentrao mdia experimental e a concentrao terica multiplicada por 100.

Taxa recuperao=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.

Seletividade a interferncia por outra substncia, que no seja o analito de interesse, na medio pelo detector

Determinao da seletividade

Analisa-se trs vezes a soluo de estireno em heptano na concentrao de (10,55mg/L) e depois analisa-se trs vezes uma amostra que apresente na alquota de anlise uma concentrao prxima a concentrao de (10,55mg/L) e depois calcula-se o teste de igualdade de duas mdias de amostras independentes (t)

Determinao da seletividadeO clculo do valor de t quando se comparam mdias de duas amostras diferentes dado pela expresso

t =

2121/1/1nnSaxx+-

Determinao da seletividadeSa a estimativa do desvio padro agregado, calculado a partir das estimativas dos desvios-padres das duas amostras

Sa=

Robustez

a capacidade de um mtodo de no ser afetado por uma pequena e deliberada modificao em seus parmetros

Determinao da robustezResultados das amostras a 48 e 120 h

DEHA % m/m DEHP % m/m

48 120 h 48 120 h

0,286 0,306 9,43 10,12 0,270 0,325 9,13 10,95 0,276 0,329 9,28 10,99

Determinao da robustez pelo teste tResultados da mesma amostra nos tempos de contato de 48 e 120 horas

Plastificantes DEHA DEHPDesvio padro das diferenas 0,020 0,624(%m/m) Teste de igualdade de duas mdias 3,760 3,910(%m/m)T tabelado 4,303 4,303