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Page 1: Atividade da celulase de leveduras isoladas de frutos de ... · Debariomyces, Hanseniaspora, Hansenula, Kloeckera ... 5.Quinta autora é Professora Adjunta do Departamento de Micologia,

Atividade da celulase de leveduras isoladas de frutos de meloeiro

Thiago Maykel Lima Cruz1, Fabíola Maria Marques do Couto2, Gisely Santana de França3, Delson Laranjeira4, Rejane Pereira Neves5

________________1. Primeiro Autor é Professor Adjunto do Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Bento Gonçalves, 9500, prédio 43423, sala 209, Porto Alegre, RS, CEP 91501-970. E-mail: autor@instituição.br2. Segundo Autor é Professor Adjunto do Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Bento Gonçalves, 9500, prédio 43423, sala 209, Porto Alegre, RS, CEP 91501-970.3. Terceiro Autor é Professor Adjunto do Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Bento Gonçalves, 9500, prédio 43423, sala 209, Porto Alegre, RS, CEP 91501-970. Apoio financeiro: CAPES e CNPq.

Introdução

Enzimas são catalisadores biológicos que aumentam a velocidade das reações bioquímicas. Descobertas na segunda metade do século XIX, desde então, elas têm sido amplamente utilizadas em diversos processos industriais [2,3,7].

Na natureza grande parte da atividade enzimáticanecessária para o aproveitamento da matéria orgânica é realizada por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. Dentre as leveduras, os gêneros Candida, Debariomyces, Hanseniaspora, Hansenula, Kloeckera, Pichia, Metschnikowia, Schizosacharomyces, Torulaspora e Zygosacharomyces se destacam comopotenciais para a produção de várias enzimas como celulases, glicosidases, pectinases, lipases, proteases, xilanase entre outras [4,5,11]. Pelo fato da maioria das espécies não apresentarem características patogênicas, as leveduras podem ser bastante utilizadas na indústria [8].

As indústrias de alimentos, papel e celulose, biocombustível, têxtil, farmacêutica, medicina, química fina, agroindústria e de alimentação animal e silagem vem aplicando a tecnologia enzimática para redução de custos operacionais, aumento da qualidade e aprimorando processos diminuindo assim impactos ambientais [1,10].

Diante do exposto acima, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade da celulase de leveduras isoladas de três tipos de frutos de meloeiro (Cucumis melo L.)

Material e métodos

O experimento foi conduzido no Laboratório de Fungos do Solo do Departamento de Agronomia/Área de Fitossanidade da Universidade Federal Rural de Pernambuco.

A. Isolamento das leveduras

No isolamento das leveduras, adaptou-se a metodologia usada por Michereff et al. [6]. Os isolados de leveduras foram obtidos a partir da superfície desementes e de frutos de meloeiro do tipo Honeydew,

Cantaloupe e Pele de sapo, que não apresentavam sintomas de doença.

Para o isolamento de leveduras da superfície dos frutos, foram retirados fragmentos de 11 mm de diâmetro da casca. Esses fragmentos foram imersos em tubos de ensaio (5 fragmentos por tubo) contendo 10 mL de água de torneira esterilizada (ATE) adicionada de cloranfenicol (50 mg/L), sendo que cada tubo continha fragmentos de apenas um tipo de fruto. Em seguida, os tubos foram submetidos à agitação em banho de ultra-som durante 10 minutos e, após agitação em “vórtex”, foi efetuada uma diluição (10-1). A partir dessa diluição, foram distribuídas alíquotas de 0,1 mL em placas de Petri contendo meio Sabouraud-Agar(Dextrose – 40 g/L; Peptona – 10 g/L; Agar – 17 g/L)suplementado com extrato de levedura (1,5 g/L) e adicionado de cloranfenicol (50 mg/L), e com o auxílio de uma alça de Drigalski este volume foi uniformemente espalhado na superfície do meio. Num intervalo de 72 horas (incubação à temperatura de 25 2 oC), as colônias isoladas que surgiram foram repicadas para outras placas. No isolamento das leveduras a partir de sementes seguiu-se o mesmo procedimento explicado a cima, sendo imersas, no caso, 20 sementes por tubo.

Os isolados foram repicados para tubos de ensaio contendo o mesmo meio citado anteriormente, e conservados em óleo mineral à temperatura ambiente (28 +2ºC).

B. Atividade da celulase

Nesse teste, foram usados 46 isolados de leveduras, com 72 horas de idade, cultivados em meio Sabouraud-Agar suplementado com extrato de levedura (1,5 g/L) e adicionado de cloranfenicol (50 mg/L). A partir desses cultivos foram preparadas as suspensões dos isolados, na concentração de 1,0 x 106 células/mL. Dessas suspensões foram retiradas 25 µL e depositadas em poços de 4 mm de diâmetro feito no centro de placas de Petri (1 poço por placa), de 7 cm de diâmetro, contendo meio sintético com carboximetilcelulose (CMC) como única fonte de carbono(KCl – 3,8 g; K2HPO4 – 2,0 g; MgSO4 7H2O – 0,1 g; (NH4)2SO4 – 1,0 g; extrato de malte – 0,6 g; CMC – 10 g/L; Agar – 16 g). As placas foram incubadas em câmara B.O.D. (Biochemical oxygen demand) a 28ºC e fotoperíodo 12 horas claro/12 horas escuro por 5 dias e, após esse período, submetidas a choque térmico por 16

1.Primeiro autor é aluno de Mestrado em Fitopatologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manuel de Medeiros, s/n, Bairro Dois Irmãos, CEP-52171-900, Recife-PE. E-mail: [email protected] autora é aluna de Doutorado em Biologia de Fungos, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Nelson Chaves s/n, CEP. 50670-420Recife-PE. E-mail: [email protected] autora é aluna de Engenharia Agronômica, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manuel de Medeiros, s/n, Bairro Dois Irmãos, CEP-52171-900, Recife-PE. E-mail: [email protected] autor é Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Dom Manuel de Medeiros, s/n, Bairro Dois Irmãos, CEP-52171-900, Recife-PE. E-mail: [email protected] autora é Professora Adjunta do Departamento de Micologia, Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Nelson Chaves s/n, CEP 50670-420, Recife-PE. E-mail: [email protected]

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horas a 50ºC. Após serem retiradas da câmara B.O.D., Após esse período, foram adicionados 5 mL de solução corante de vermelho congo (0,025%) em tampão Tris HCl 0,1 M, pH 8,0. Após 30 min a solução foi descartada e as culturas foram lavadas com 5 mL de solução de NaCl 0,5 M neste mesmo tampão. Esse procedimento permitiu a revelação, no meio de cultura, do halo de degradação do substrato (CMC) proporcionado pela atividade da celulase. O Índice enzimático (IE) foi calculado através da seguinte fórmula: IE=(h+c)/c; onde h+c representa o diâmetro do halo de degradação do substrato mais o diâmetro da colônia, e c representa o diâmetro da colônia. Cada isolado testado foi considerado como sendo um tratamento. Foram utilizados três repetições para cada tratamento, sendo cada repetição composta por uma placa de Petri.

C. Análise estatísticaOs dados obtidos foram submetidos à análise de

variância para comparação das médias pelo teste de Scott-Knot (P≤0,05), utilizando o programa SAEG® 9.0.

Resultados e Discussão

Foram obtidos, no total, 46 isolados de leveduras, sendo 26 isolados de frutos do tipo Cantaloupe, 9 isolados do tipo Honeydew e 11 isolados do tipo Pele de Sapo.

Dezoito isolados apresentaram atividade da celulase, havendo diferenças significativas entre eles (Tabela 1).O isolado CC2 foi o que apresentou maior IE (2,97), destacando-se dos demais (Figura 1A), seguido pelo isolado CC4 (2,25). No outro extremo, o isolado CC8 apresentou o menor IE (1,16) (Figura 1B).

A zona mais clara ao redor das colônias corresponde ao halo indicador da degradação do CMC, observada em 39% dos isolados testados. Segundo Teather & Wood [12], o índice enzimático (IE) pode ser utilizado como uma medida útil para selecionar linhagens dentro de uma mesma espécie ou como um parâmetro simples e rápido para selecionar mutantes, o que foi verificadocom sucesso, por esses mesmos autores, em linhagens de bactérias.

Não foi verificado formação de halo em 28 isolados (61%). Segundo Ruegger & Tauk-Tornisielo [9], a visualização do halo depende de vários fatores, além da composição do meio de cultura. Algumas substâncias químicas do meio de cultura podem interferir no corante proporcionando resultados falso-positivos, ou ainda provocar sua precipitação ou inibir a ligação deste aos polissacarídeos.

Agradecimentos

A Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Referências[1] AGBLERVOR, F.A.; WEBER J. 2004. Microbubble fermentation

of Trichoderma reesei for celullase production. Proc. Biochesm., 40: 669-679.

[2] BRUHLMANN, F.; LEUPIN, M.; ERISMANN, K.H.; FIECHTER, A. 2000. Enzymatic degumming of ramie bast fibers. J. Biotechnol., 76: 43–50.

[3] GAMA, F.M; MOTA, M.; BASTOS, M.; DOURADO F. 2002. Studies on the properties of celluclast/Eudragit L-100 conjugate. J. Biotechn., 99: 121-131.

[4] GONZÁLEZ, J.A.; GALLARDO, C.S.; POMBAR, A; REGO, P.; RODRÍGUEZ, L.A. 2001. Determination of enzimatic activities in ecotypic Saccharomyces and non-Saccharomyces yeasts. Eletr. J. Agri. Food Chem.

[5] MANZANARES, P., ROJAS, V., GENOVÊS, S. & VALLÉS, S. 2000. A preliminary search for anthocyanin-b-D-glucosidaseactivity in non-Saccharomyces wine yeasts. Intern. J. Food Scien. Techn., 35: 95-103.

[6] MICHEREFF, S. J.; SILVA, J. B.; SILVEIRA, N. S. S.; PEDROSA, R. A.; MARIANO, R. L. R.; TAVARES, L. A.; TAVARES, S. C. C. H. 1997. Postharvest biocontrol of Lasiodiplodia rot of mango fruits by saprophytic yeasts. Arquivos de Biologia e Tecnologia, 40: 29-37.

[7] MOLINA, S. M. G.; PELISSARI, F.; VITORELLO, C. B. M. 2001. Screening and genetic improvement of pectinolytic fungi for degumming of textile fibers. Braz. J. Microb., 32: 320 - 326.

[8] RODRIGUES, A. N.; SANT’ANNA, E. S. 2001. Efeito do cloreto de sódio na produção de proteínas (Saccharomyces cerevisiae) em fermentação semi-sólida. Ciênc. Tecnol. Aliment., 21: 63-66.

[9] RUEGGER, M.J.S.; TAUK-TORNISIELO, S.M. 2004. Atividade da celulase de fungos isolados do solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil. Revista Brasil. Bot., 27: 205-211.

[10] SHENG, J. 1998. Imobilization of celullase using acrylamide grafited acrylonitrile copolymer membranes. J. memb. Scie. 155: 101-106.

[11] SILVA, E.G., BORGES, M.F., MEDINA, C., PICCOLI, R.H. & SCHWAN, R.F. 2005. Pectinolytic enzymes secreted by yeasts from tropical fruits. FEMS Yeast Research, 5: 859-865.

[12] TEATHER, R.M. & WOOD, P.J. 1982. Use of congo redpolysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and Environmental Microbiology43:777-780.

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Tabela 1. Atividade da celulase de 18 isolados de leveduras oriundas de frutos de meloeiro dos tipos Honeydew,

Cantaloupe e Pele de sapo

Isolado Índice enzimático* (IE)

CC2 2,97 A

CC4 2,25 B

CPS3 1,85 C

CC21 1,83 C

CC15 1,79 C

CPS5 1,72 C

CC9 1,66 C

CC7 1,55 C

CC6 1,50 D

CP7 1,43 D

CC1 1,42 D

CC13 1,39 D

CC3 1,38 D

CA12 1,36 D

CC1 1,31 D

CC27 1,22 D

CC23 1,20 D

CC8 1,16 E

C. V. (%) = 12,67

*Média de três repetições. Médias seguidas pela mesma letra, não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (P≤0,05).

Figura 1. Halo produzido no meio de cultura, revelado com solução vermelho congo (0,025%), indicando a assimilação do substrato (CMC) devido a atividade da celulase dos isolados CC2 (A) e CC8 (B).

A B