r CPPSE/I ,.._.. A I N \ t

~~~ATAS I

~\t'

>. ,

-,

~

;.1:. An~Di$e di...·e i·i'} ,1 I/.f'

'~". ~' ~~ 2.8 ~~',': i:r@~~n~@rr<~~~m,~?6'~~j;' . ,~./

~ 'F~ggmenf@$ de. Ré~trl~ã@ Utiniz@~do

a Re'a~ioem' Cad~5~da Po!Smerase) ..,"1(PCR-RFi.P) ; ·J.;ft~'J

'"tI :~.~ -.. ' -'"I

1M~,':..j

~lj •• J'g~:

~;

~,~

t1

~í:- r PROCI-2001.00165REG2001SP-2001.00165

.J''' ....

,1"r~:;",'\. )..

l ..•...." L ,:J

Luciana Correia de Almeida Regitano / . ir-I

Introdu~ãoA presença de variações nas se-

qüências de DNA que criam ou eli-minam sítios de reconhecimentopara endonucleases de restrição re-sulta nos polimorfismos de compri-mento de fragmentos de restrição ou9Fl P ~0()inglês, Besuiciion Freqmoa:Length Po/ymorphism). Nos euca-riotos superiores, esses polimorfis-mos foram originalmente descritosutilizando a técnica de Southern Blotseguida de hibridização com umasonda para revelar apenas os frag-montes complementares. A técnicaé discutida em maior detalhe nocapítulo 2.

Com o desenvolvimento da técni-ca de reação em cadeia da poli-merase (PCR) novos procedimentospara a análise de RFLPs passarama ser utilizados. A principal vantagemda análise de polimorfismos de res-trição utilizando a PCR (PCR -RFLP), quando comparada à técni-ca original, é o fato de que apenas osegmento de DNA que abriga o sítiopolimórfico de restrição é amplifica-do para posterior análise. Como re-sultado, após a clivagem com a en-zima de restrição apropriada, umnúmero limitado de fragmentos sãoobtidos, que podem ser facilmentediscriminados de acordo com otamanho.

Protocolo de PCR - RFLPO primeiro passo para a análise

de PCR - RFLP é a amplificação dosegmento do gene ou seqüência de

188\....,.

DNA, em que se encontra o sítiopolirnórfico de restrição. Para tanto,realiza-se a PCR utilizando primerscomplementares às seqüências queflanqueiam essa região. A seguir, édescrito um protocolo básico de PCR- RFLP.

PCROs princípios teóricos da técnica

de PCR foram descritos no capítulo2. Nesta seção serão apresentadasapenas considerações práticas so-bre a técnica.

Como a PCR é lima técnica ca-paz de detectar quantidades muitopequenas de DNA, todas as precau-ções devem ser tomadas para evitara contaminação de uma amostracom DNA de outras. Além disso,como as seqüências alvo são copia-das de maneira exponencial, existetambém o risco de contaminaçãodas reações com produtos de rea-ções de PCR anteriores. Para inici-ar o preparo da reação, recomenda-se que a superfície de trabalho sejacuidadosamente limpa. Costuma-sedividir os estoques de reagentes es-pecíficos para PCR (solução dedNTPs, tampão, primers) em alíquo-tas, de modo a assegurar que, ocor-rendo uma contaminação, apenas afração em uso precise ser descarta-da. Antes de manipular as alíquotasde reagentes e de primers para pre-parar a reação, as amostras de DNAdevem ser retiradas do freezer e co-locadas em um local distante da ban-cada de trabalho. Em cada reação,coloca-se um controle negativo(branco) para monitorar possíveis

1.\j

i

1

contaminações. Esse controle con-tém todos os reagentes necessáriosà reação menos o DNA molde, queé substituído por igual volume deágua.

O uso de ponteiras com barreirascontra aerossóis é uma prática efici-ente mas muito cara para trabalhosem larga escala. Ern nosso labora-tório sua utilização restringe-se à pre-paração de alíquotas de reagentese estoques de primers.

Protocolo básico de PCR:

• Descrever as amostras de DNAa serem amplificadas, roservan-do uma reação a mais para ocontrole negativo.

• Tirar o DNA do freezer.

• Limpar a bancada.

• Lavar as mãos e colocar luvasnovas.

• Retirar do freezer o resfriador debancada (benchtop cooten e osreagentes (menos a Taq DNApo/imerase).

Tabela 1. Composição do E-mix.

• Identificar os tubos ou a placaque receberão a reação. No casode placa, identificar em um mapaseparado a amostra correspon-dente a cada cavidade da placa.

• Preparar uma mistura de reação(E-mix) contendo os componen-tes descritos na Tabela 1. Consi-derar sempre 2% a mais no vo-lume final calculado para o núme-ro de amostras a serem analisa-das. Se utilizar pipetador multi-canal, aumentar a margem para5%.

• Distribuir 20 ul, do [-mix em ca-da tubo.

• Adicionar 100 a 200 ng de DNA,em um volume de 5 IlL, ao res-pectivo tubo. No tubo de controlenegativo (branco) colocar 51lL deágua.

• Colocar os tubos no equipamen-to termociclador, selecionando oprograma desejado (Fig. 1).

Componentes Concentração final1 amostra 24 amostras + 2%

H,OMilliQ 15,401lL 376,991lL

10x PCR Buffer'" 2,50 pl. 61,20pL 20 mM Tris-HCI, 50 mM KCI

MgCl, (50 mM) 0,751lL 18,361lL 1,5 mM

DNTP (20 mM)(') 0,251lL 6,121lL 200 11M

Primer up (20 11M) 0,5OIlL 12,241lL 0,40 11M

Primer down (20 11M) 0,5OIlL 12,241lL 0,40 11M

Taq (5 U/IlL) 0,1OIlL 2,451lL 0,02 U/IlL

"'200 mM Tris- HCI (pH 84). 500 mM KCI.", Mistura dos quatro desoxinucleosideos trifosfatados (dAlP; dCTP; dG I P e dTTP). a 20 mM cada.

189'!) )

'li

d

[3D ciclos [

94.01~94:0 72.0/72.0rY 1 30'~/ ~

55.0 IX)

30'

Fig. 1. Exemplo de programa.

Ao final do programa, o resultadoda reação pode ser verificado apli-cando 5 IlL de cada amostra em gelde agarose a 1%. A preparação dogel é detalhada no subtítulo eletro-forese em gel de agarose.

F'ligestéio do DNA 'comendonuclease de reslri~ão

Endonucleases de restrição sãoenzimas que cortam a molécula deDNA de uma maneira dependente deseqüência. As enzimas do tipo 11, umsubgrupo de endonucieases, reco-nhecem pequenas seqüências deDNA, geralmente compostas de 4 a6 nucieotídeos, e efetuam a clivagemna molécula dentro ou próximo des-sa seqüência de reconhecimento.Por exemplo, a enzima Kpn I corta amolécula de DNA na seqüência:

5'GGTAC..l-3'

3' crc A T G G 5'

A digestão ou ciivagem do DNAcom endonuclease de restrição é umprocedimento básico em biologiamolecular, com diversas aplicações.No caso específico do RFLP, permi-te a identificação de diferenças en-tre os indivíduos quanto ao número eposição dos sítios de restrição emuma determinada molécula de DNA.

A reação de clivagem depende dealguns parâmetros, entre os quais, apureza do DNA a ser digerido. A pre-sença de contaminantes como pro-teínas, fenol, clorofórmio, etanol,SDS (dodecil sulfato de sócio), EDTA(ácido etileno diamino tetra-acético),além da alta concentração de sais,pode causar ;:: iniuiç50 ela atividadeenzimática. A contaminação comDNases também pode ser crítica.Normalmente, o tampão de armaze-namento elo DNA contém EDTA, quecomplexa-se ao Mg2+,inibindo a ati-vidade das DNases. Essa atividadepode S0r resícbeloclda quando o DNJ\é colocado na presença de tampão daendonuclease de restrição, resultandoem degradação do mesmo.

Outros parâmetros a serem con-siderados são a temperatura ótimade reação, que pode variar de 37°Ca 65°C, dependendo da enzima, e acomposição do tampão de reação.Os tampões de reação contêm nor-malmente Tris HCI, cloreto de sódioou de potássio, um antioxidantecomo o ditriotreitol (DTI) ou o 2-mer-captoetanol e um cátion divalente,normalmente o Mg2+.Algumas enzi-mas são extremamente sensíveis àconcentração de íons sódio ou potás-sio, enquanto outras retêm a ativida-de em uma ampla faixa de concen-tração desses íons. Os tampões ade-quados para cada enzima normal-mente são fomecidos pelos fabrican-tes, junto com a enzima, mas é pos-sível prepará-Ios no laboratório deacordo com a descrição encontradano catálogo do fabricante. A obser-vação das condições ideais para

[I

t1

ifI

t

reação de cada enzima é importan-te não apenas para a obtenção damáxima atividade mas também paragarantir a especificidade da reação.Algumas enzimas podem apresentaratividade anômala (star activity), istoé, cortar a molécula de DNA em se-qüências "semelhantes" ao sítio derestrição.

O tempo de reação depende daquantidade de enzima e de substrato.Em condições ideais, uma unidadede enzima digere um micrograma deDNA em 1 hora. Normalmente, o tem-po de incubação varia de 30 minu-tos a 3 horas, sendo que algumasenzimas podem reter a atividade emtampão de reação após 4 a 5 horas.

A seguir, apresentamos o protoco-lo de rotina do Laboratório de Biotec-nologia Animal do CPPSE para adigestão de produtos de PCR emanálise de RFLP.

Digestão do produtode amplifica~ão deK-caseína com a enzimade restri~ão Hin/l

• Descrever as amostras que se-rão tratadas.

• Identificar um tubo de 0,5 mL poramostra.

• Preparar uma mistura de reação,Enzyme mixture (E-mix) contendoos componentes a seguir. Consi-derar sempre 2% a mais no volu-me final calculado para o númerode amostras a serem analisadas,como mostra o exemplo a seguir:

E-mix 1X E-mix 24X + 2%

Água Milli Q 1,45 ~L

10X Reacl 2 (I) 1,30 ul,

Hinf I (5 U I flL) 0,25 ul,

Total 3 ~L

35,50 ~L

31,82 flL

6,12 ul,

73,44 flL

"'500 mM Tris·HCI (pH 8.0). 100 mM NaCI.

• Distribuir 3,0 J..lLdo E-mix emcada tubo de 0,5 mL.

• Adicionar 10 J..lLde DNA amplifi-cado, homogeneizando com amistura de enzima do fundo dotubo. Caso haja formação de es-puma ou ootículas na parede dotubo, centrifugue rapidamente(usar a opção pulse da microcen-trífuga).

• Incubar a temperatura indicadapara a enzima por 3 horas.

• Resolver os produtos de digestãopor eletroforese em gel de aga-rose a 3% (p/v) (Fig.2).

603310234194118

Fig. 2. Padrão do restrtcâo do produlo deamplificação de um segmento de 350 pbdo gene da x-caselna digerido com a en-zima Hinf I. 1. Controle negativo da reaçãode PCR; 2. Produto de amplificação nãodigerido; 3 e 5. Produto da digestão deheterozigotos AS; 4 e 7. Produto da diqes-lão de homozigotosAA; 6. Produtoda digestãode homozigotos SS; e B. Padrão de lamanho0X174RF·Haelll. Os tamanhos dos íraqrnen-tos do padrão em pares de bases são indi-cados à direita.

elroforese em!I de agaroseA separação de uma população

! moléculas ou fragmentos de DNAuma etapa geralmente presenteis procedimentos de biologiaolecular, Entre os métodos dispo-,eis, a eletroforese tem sido o mé-:io mais utilizado, devido à ~Lla::'Im-cidade e flexibilidade, tanto para.cionarnento analítico quanto paraocedirnentos preparativos.

Eletroforese é o termo utilizadora descrever o movimento de íons1 solução como conseqüência dalicaçáo de um campo elétr ico.; primeiros processos de eletrofo-se eram realizados com os íons'es em solução, sendo posterior-mte modificados pela introdução de1 suporte inerte (papel, ágar, aga-ie, poliacrilamida, etc.). Nessascon-:ões, a velocidade de migração é~tada pela força de filtração impos-oelos poros da matriz (suporte).

No caso específico dos ácidoscléicos, essa migração ocorre emeção ao pólo positivo (cátodo),Ia vez que o esqueleto de fosfatolfere à essas moléculas carga elé-a negativa. A relação entre a car-e a massa molecular é constante,forma que a velocidade de migra-) acaba sendo determinada pelolanho da molécula de ácido nu-ico.

A. eletroforese em agarose temo um dos métodos de eleição'a a separação de fragmentos deIA com tamanho entre 0,5 e 25 kb.condições de separação devem

atender a alguns critérios, de modoa permitir a resolução adequada,entre eles, a concentração de agaro-se (Tabela 2). Outros fatores impor-tantes são a corrente e a capacida-de de tamponamento das soluçõesutilizadas. Neste capítulo apresenta-mos um protocolo básico para análi-se do produto: de PCR c fraqrnen-tos de restrição em gel de agarose.

Tabela 2. Limites de eficiência da separa-ção de DNA em diferentes concentraçõesdeagarose.

Concentraçãode agarose110 gel (%)

Separação demoléculas dp. DNA (kb).

Limites de eficência

0,30,60,70,91.21,5

3-4 (')

60 - 5,020 - 1,010 - 0.87 - 0,56 - 0,43 - 0,20,5 - 0,01

'''Agarose de baixo ponto de fusão.Fonte: Adaptado de Ausubel et aI. (1988).

Preparo do gel de agarose:

• Pesar a quantidade de agarosenecessária para a separaçãodos fragmentos de acordo coma Tabela 2.

• Adicionar a um frasco erfenmeyercontendo o volume necessário detampão TBE 1 X. O volume deveser calculado para obter um gelcom 3 a 6 mm de espessura.

• Aquecer em forno de microon-das até iniciar a ebulição (apro-ximadamente 20 sego em potên-cia alta para um gel de 30 mL).Retirar do forno de microondase verificar se toda a agarose está

!II•I

liquefeita, Caso sejam verifica-dos grumos (percebe-se pelarefringência distinta do restanteda solução), aquecer por algunssegundos adicionais. Deixar es-friar até atingir aproximadamen-te 50ºC a 60ºC.

• Adicionar a quantidade necessá-ria de solução de brorneto doetídio a 10 mg/mL para obter umaconcentração final de 0,4 ~lg/mLdegel.

O Brometo de etídio é um poten-X te agente mutaqênico. Utilizar

luvas e máscara para preparar aS.jl''';cJ,' estoque c nl;->.JJiculr r lY;

géis.

• Verter a agarose sobre o molde,colocar o pente (um ou dois, de-pendendo da necessidade), dei-xar solidificar e montar o sistemana cuba de eletroforese, submer-gindo em tampão TBE 1X.

• Aplicar 5 JlL de cada amostraamplificada previamente mistura-dos a 1 JlL de tampão da amos-tra (Ioading buffet). Se a amos-tra for produto de digestão, apli-car 10 JlL de amostra e 2 JlL deloading buffer. Incluir um padrãode peso molecular de modo apermitir a estimativa do tamanhodas moléculas observadas nasamostras. Esses padrões sãodisponíveis comercialmente,mas também podem ser produ-zidos pela digestão, com uma oumais enzimas de restrição, deplasmídios bem caracterizados.

• Submeter o sistema a uma vol-tagem constante na faixa de 2 a

5 V/cm (considerando a distân-cia entre os eletrodos).

• Visualizar os resultados sob lu:ultravioleta a uma potência mai-or do que 2.500 !lW/cm2• Normal-mente utiliza-se um transilumi-nador, mas uma lâmpada porta-til (luz incidente) pode sar tarnbémutilizada. A documentação poceser feita com filme polaróide 667(ASA 30000) utilizando filtro 1,,-ranja (Kodak Wratten #23A). Ocusto de cada fotografia pelarei-de é relativamente alto. A utiliza-ção de equipamentos digitais defotodocurnentuçào tem sido UIJ1:\alternativa mais econômica,que permite o acoplamento asoftwares de análise de imagens.Um exemplo de análise de RFLPem gel de agarose é apresenta-do na Fig. 2_

~ A luz ultravioleta produz queinnX duras severas. Utilize máscara e

óculos de proteção adequados.

Soluções

Tampão da amostra (Loading Buffer)6 X concentrado

Bromophenol Blue

Xileno Cianol

Glicerol

0,25%

0,25%

30,00% v!vArmazenar a 4'C

TBE 10 X concentrado

Tris

Ácido Bórico

0,89 M

0,89 M

0,02 MEDTA

193)